You are on page 1of 9

Separarea, extractia enzimelor

O extracie, separare, o purificare de succes, este determinat, pentru o enzim, o substan, de evaluarea corect a proprietilor specifice ale acesteia. Pentru alegerea procesului de separare trebuie sa se tina cont in primul rand de sursa enzimatica si de principalele caracteristici majore ale enzimelor, ce pot fi exploatate n procesele de separare si anume: dimensiunea; sarcina electric; solubilitatea i prezena unor situsuri specifice de legare.

Procesele, etapele fiecarui proces, utilizate pentru separarea, extracia i dac este cazul purificarea unei enzime, trebuie astfel alese nc!t s fie c!t mai convenabile pentru enzima de interes. Pentru realizarea unei extracii, indiferent dac este vorba de omogenat global sau din fracii subcelulare si indifferent de natura sursei, prima etap este omogenizarea total sau parial a sursei. O schem general ce trebuie urmat n acest scop este prezentat n fig nr.:" #n funcie de natura sursei, metodele de omogenizare sunt diferite. Extracia enzimelor din sngele mamiferelor . $!ngele poate fi pstrat n mai multe feluri. %ajoritatea enzimelor rm!n n stare activ pentru o perioad de cel puin o lun, dac la " ml s!nge se adaug &,"' ml de amestec acid ( citrat ( dextroz )*+,-, cu un coninut de &,. g de acid citric, /,/ g de citrat trisodic i /,0' g de dextroz la "&& ml soluie. *mestecul *+, trebuie adugat c1iar dac s!ngele a fost prelevat pe anticoagulani de tipul 1eparinei sau 2,3* ( ului. $!ngele cu *+, poate fi pstrat la temperaturi cuprinse ntre 4/ & i 45&+. #ng1earea acestuia poate inactiva unele enzime, ca de exemplu lactat de1idrogenaza. Pentru a obine ser, s!ngele este prelevat n absena anticoagulanilor n tuburi de sticl. ,up formarea c1eagului de s!nge, se centrifug1eaz, supernatantul limpede fiind serul.

Fluide de ori%ine animala sau &e%etala

Culturi micro'iene
Enzime exocelulare Enzime endocelulare

esuturi,or%ane animale si &e%etale


omo%enizare

"recipitarea/indepartarea Componentelor nedorite #ex. cazeina, hematii$

Separare lichid/solid

Or%anite celulare

esut, or%an inte%ral

lichide Separare lichid/solid

solide Separarea or%anitelor, omo%enizare partiala si (ractionare

solide

lichide

omo%enizare/dezinte%rare celulara

DESEURI

Separare lichid/solid

lichide

solide

Indepartarea acizilor nucleici DESEURI

CONCEN R!RE

"uri(icare

CONDI ION!RE

"RODUS

6ig. " $c1ema general a etapelor implicate n extracia i purificarea enzimelor 2

Fluide

Metode de omogenizare a microorganismelor 2nzimele biosintetizate de microorganisme sunt de dou feluri : exocelulare i endocelulare. 2nzimele exocelulare sunt eliberate de microorganisme n mediul de cultur, izolarea acestora realiz!ndu7se printr7o filtrare a mediului. 8zolarea enzimelor endocelulare este mai dificil datorit pereilor celulari duri ai microroganismelor. 9uperea pereilor celulari se poate realiza prin utilizarea unor metode severe de dezintegrare cum ar fi: sonicarea; mojararea n prezena agenilor abrazivi perioade lungi de timp; agitarea n prezena perlelor de sticl; ng1e ( dezg1e repetat; aplicarea unor presiuni mari )6renc1 press-.

:radul de rupere al pereilor celulari poate fi monitorizat prin examinare microscopic. ,ac suspensia celulelor dezintegrate conine agregate gelatinoase de acizi nucleici este indicat sonicarea acestora nainte de centrifugare. Pe l!ng problemele ridicate de prezena peretelui celular dur, drojdiile i ali fungi conin cantiti mari de enzime proteolitice. *cest dezavantaj poate fi minimalizat prin selecia sau construcia unor mutante deficitare n producia de proteinaze sau prin represarea sintezei acestora prin cre terea pe medii care nu conin substraturi proteice. ,ac acest lucru nu este posibil este necesar adugarea de in1ibitori ai proteinazelor )ex. azida de sodiu-. Metode de omogenizare a esuturilor mamiferelor Omogenizarea esuturilor mamiferelor este relativ u oar deoarece cele mai multe dintre acestea nu au pereii celulari rigizi. 2xtraciile se realizeaz n mod obligatoriu din esuturi proaspete sau pstrate la ( .&&+. 8nainte de pstrare esuturile proaspete trebuie ng1eate rapid n azot lic1id )7 ";5 &+-. #nainte de a fi prelucrate<omogenizate este necesar ca probele de esut s fie splate cu o soluie salin de concentraie ",.= pentru ndeprtarea s!ngelui contaminant.

#n mod obi nuit esutul este tiat n buci mici, mrunit apoi omogenizat cu ajutorul unor aparate numite omogenizatoare de tip >aring ?lender sau Potter72lve1jem. #n general esuturile mai tari, cum sunt mu c1ii sc1eletici sau cei ai inimii, sunt tocate i omogenizate cu aparate de tip >aring ?lender care este prevzut cu cuite metalice. @esuturile moi, cum sunt cele de ficat sau creier sunt omogenizate cu aparate de tip Potter72lve1jem. *cesta este format dintr7un pistil de 3eflon sau sticl care este ata at la o tij de metal i introdus ntr7un vas de sticl grunjos pe interior. #n spaiul ngust dintre sticl i pistil se introduce o cantitate corespunztoare de esut i mediu de extracie. Pistilul este rotit rapid )n medie cu "&&& rpm-, mi care care determin dezintegrarea esuturilor i celulelor. Omogenizrile cu astfel de aparate trebuie realizate la rece pentru a preveni nclzirea probelor. 2xtracia enzimelor prin procesul de omogenizare se realizeaz n cele mai multe cazuri timp de A& de minute. Omogenatul obinut este centrifugat si extractul clar obinut este extractul proteic total (EPT). Pentru realizarea unei extractii prin omogenizare se folosesc medii extractive. %ediile de extracie utilizate sunt diverse i se aleg n funcie de esutul ce se omogenizeaz de natura enzimei i de localizarea intracelular a enzimei de interes. 3aria ionica a mediilor de extractie se alege in functie de solubilitatea enzimeleor de interes. *stfel enzimele u or solubile se extrag n medii cu trii ionice mici )de exemplu creatin Binaza din mu c1i este extras cu o soluie de C+l &,&" %-, iar cele mai greu solubile in medii cu trii ionice mari. #n cazul n care se dore te dezintegrarea organitelor subcelulare se utilizeaz medii de extracie izotonice . $oluiile izotonice realizeaz aceia i presiune osmotic ca cea datorat coninutului celular i conin in general &,A moli D E7" specii dizolvate. *stfel de soluii sunt cele de za1aroz sau manitol tamponate cu 3ris F3ris)1idroximetil-aminometan-G sau Hepes Facid 07)/71idroxietil-7"7piperazinetan sulfonicG la pH I J,0.

3ris

Hepes

Knele enzime nu pot fi eliberate n mediu dup dezintegrare cu ajutorul omogenizatoarelor. ,e exemplu mitocondriile nu sunt dezintegrate complet prin astfel de metode. #n astfel de situaii se procedeaz fie la sonicare pe perioade de timp de p!n la " minut, fie la adiia unor cantiti mici de detergeni )3riton L7"&&, deoxicolat de sodiu-. ,e exemplu 3riton L7"&& n concentraie de &,"= )M<v- cre te solubilizarea '7nucleotidazei i adenozin Binazei din multe esuturi. Knele enzime exist n esuturile animale sub forme interconvertibile, dintre care unele sunt mai puin active. #n astfel de cazuri se recomand alegerea mediului si conditiilor de extractie adecvate pentru obinerea formei active. ,e exemplu, forma activ a glicogen fosforilazei, forma a, poate fi obinut dac extracia se realizeaz la pH I 5,/ i n prezena *3P ( ului, %g/4, +a/4 i 67. #n aceste condiii fosforilaza fosfataza, enzima care converte te forma a la forma inactiv b, este in1ibata, iar fosforilaza Binaza, enzim care catalizeaz conversia la forma a este activat. 6osforilaza b poate fi extras n prezena activatorului su alosteric *%P7ul. Metode de omogenizare a materialelor biologice vegetale 2xtracia enzimelor din plante ridic probleme speciale datorit: prezenei peretelui celulozic tare; volumului mare ocupat de vacuole; concentraiilor mari de pigmeni i compu i fenolici; a concentraiilor mici de proteine. contaminare cu acizi nucleici

Pentru spargerea peretilor celulozici tari se folosesc metode de omogenizare dure. 9uperea vacuolelor conduce la eliberarea proteinazelor i la scderea pH ( ului extractului dac acesta nu este tamponat corespunztor. Pentru evitarea efectelor nedorite se utilizeaza procedee funcie de esutul vegetal ales ca surs biologic. O mare problema in cazul plantelor sunt compu ii fenolici, care n prezena oxigenului, sub aciunea unor enzime numite fenoloxidaze, sunt transformai n pigmeni polimerici. *ce ti 5 i medii de extracie diferite n

pigmeni pot adsorbi i inactiva unele enzime din extracte. Pentru a minimaliza aceste efecte si av!nd n vedere c fenoloxidazele sunt active numai n prezena oxigenului este convenabil ca extractele sa se prepare la rece i n atmosfer de N /, mai ales in cazul esuturilor plantelor lemnoase. Prin ng1eare n azot lic1id nainte de dezintegrare acestea devin fragile i u or de mcinat. ,aca tesuturile sunt moi sau nu avem azot lic1id, in mod obisnuit se adaug n mediile de extracie,: / ( mercaptoetanol, substan care in1ib fenoloxidazele i un polimer de tipul polivinilpirolidon care adsoarbe polimerii fenolici.

H$7+H/7+H/7OH / ( mercaptoetanol
Observatie +ontaminarea 2P3 ( ului cu acizi nucleici poate fi estimat prin msurarea absorbiei la /5& i la /.& nm. ,ac raportul absorbanelor se apropie de valoarea ", contaminarea cu acizi nucleici este mare.

polivinilpirolidon

8nteraciile proteine ( acizi nucleici pot fi slbite prin cre terea triei ionice a mediului si ca un rezultat precipitare fie a acizilor nucleici fie a proteinelor. *cizii nucleici pot fi ndeprtai prin metode de precipitare cu sulfat de protamin )concentraie final de &,/ ( &,0 g la "&& ml-, streptomicin )concentraie final de " ( / g la "&& ml- sau %n+l/ )'& m%-. O alt alternativ este adiia de deoxiribonucleaz 8 )"& g<ml-, enzim care degradeaz *,N7ul. Proteinele se precipita in general prin intermediul sulfatului de amoniu p!n la o concentraie de &,/ %. ,up realizarea extraciei sulfatul trebuie ndeprtat din mediu acest lucru efectu!ndu7se de obicei prin dializ.

Izolarea organitelor celulare


8zolarea organitelor celulare este necesar atunci c!nd enzima de interes are o localizare intracelular. *v!nd n vedere faptul c, formele moleculare ale enzimelor pot avea proprieti cinetice gse te. i moleculare diferite, studiul uneia dintre forme, cu o localizare intracelular caracteristic, nu poate fi realizat dec!t prin separarea fraciei subcelulare n care aceasta se

*u fost puse la punct mai multe procedee de separare a organitelor celulare dintre acestea cele mai utilizate fiind: $epararea organitelor celulare prin centrifugare difereniat $epararea organitelor celulare prin centrifugare izopicnic

Separarea organitelor celulare prin centrifugare difereniat. ,upa liza peretilor celulari, organitele celulare din depozitele celulare ale microorganismelor sau esuturile animale<vegetale pot fi separate prin cre terea treptat a forei centrifugale. #n aceast te1nic fraciile sedimentate la diferite valori ale forei centrifugale aplicate, conin diferite organite celulare. $edimentarea diferitelor componente ale unui amestec, intr7un camp centrifugal se poate caracteriza prin ecuatia:

in care: v I viteza de sedimentare; d I diametrul particulelor; O$ I densitatea particulelor; Ol I densitatea solutiei; P I viteza angulara )in radiani, s7"-; r I raza sistemului de rotatie; 6$ I factor de corectie pentru interactiile particulelor si obstructionarea depunerii. Q I vascozitatea cinematica; R I factor geometric ce caracterizeaza particulele )pentru particulele sferice este egal cu "-; Pentru o separare cat mai completa sedimentele obinute sunt reluate n tampon i

resedimentate. 9epetarea acestor operaii de / ( A ori pentru fiecare fracie n parte, conduce 7

la o mai bun separare a organitelor celulare, in special a nucleilor, mitocondriilor

microzomilor )microzomii apar ca urmare a ruperii reticulului endoplasmatic prin procedeul de dezintegrare celular aplicat-. Procedeul nu conduce la o bun separare a mitocondriilor de lizozomi, ntruc!t aceste formaiuni au mase i densiti foarte apropiate. O modalitate de a realiza o bun separare a lizozomilor de mitocondriile din ficatul de obolan const n injectarea animalului nainte de sacrificare cu 3riton >9 "AA; )detergent anionic, sare de sodium a unui alc1il aril poliester sulfat- sau cu aur coloidal. +ele dou substane sunt fagocitate de lizozomi, cauz!nd cre terea, densitilor lizozomilor i implicit separarea lor de mitocondrii. Kn model general de separare a organitelor celulare este prezentat in fig.nr./

Ce lule dezinte%rate Centrifugare la 600 g , 0minute

$edim ent #Nuclei$

$uperna tant )%itocondrii, lizozo mi, microzomi, ribozomi, fractia solubilaCe ntrifugarela 000 g, 0 minute

$ediment #)itocondrii, lizozomi$

$uperna tant )%icrozomi, ribozom i, fractia solubilaCentrifugare la 00.0 00 g ! ore

$edim ent #)icrozomi, ri'ozomi$

$up ernatant #Fractia solu'ila$

6ig./ $c1ema generala de separare a organitelor celulare prin centrifugare diferentiata . Observatie
2xprimarea conditiilor de centrifugare se poate face prin "orta centrifugala relativa (#C"), exprimata prin unitati de gravitatie )g-, sau prin viteza (rotatii pe minut)(#P$). 9elatia de transformare dintre 9+6 si 9P% este: g I )","".x"&7'- 9 $/ unde g este forta centrifugala, 9 raza rotorului in cm si $ viteza centrifugii in rotatii per minut.

8ntegritatea organitelor obinute se poate evalua prin studii de microscopie electronic. Puritatea organitelor celulare separate poate fi testat bioc1imic, prin determinarea activitii enzimelor marBer specifice pentru fiecare formaiune intracelular. ,e exemplu, prezenta unei activiti succinat de1idrogenazice, enzim exclusiv mitocondrial, n preparatele nucleare, indic o contaminare a acestora cu mitocondrii. ,e exemplu unele enzime mar%er sunt pentru: Nuclei: *,N nucleotidiltransferaza i nicotinamid7nucleotid adeniltransferaza; %itocondrii: succinat de1idrogenaza i citocrom c oxidaza; 9eticul endoplasmatic: glucozo 57fosfataza; Eizozomi: fosfataza acid i ribonucleaza; Peroxizomi: catalaza; +itosol: glucozo 57fosfat de1idrogenaza, lactat de1idrogenaza i 57fosfofructoBinaza. Separarea organitelor celulare prin centrifugare izopicnic #n aceast te1nic organitele celulare sunt separate prin centrifugare n gradient de densitate. :radientul de densitate se realizeaz cu ajutorul unui mediu, numit Percoll, cel mai usor de obtinut de la firma suedez P1armacia. Percollul const din particule coloidale de silicagel, cu diametrul cuprins ntre "' i A& nm, acoperite cu polivinilpirolidon. +u ajutorul Percoll7ului se pot forma gradiente de densitate cuprinse ntre ",& i ",A mg<ml, pe un interval de pH cuprins ntre ',' i "&. Salori de pH sub ',' i prezena ionilor bivaleni determin gelificarea matricei de silicagel. :radientele necesare separrii organitelor pot fi create, fie printr7o cre tere regulat a densitii )linear sau sigmoidal-, fie printr7o cre tere n trepte a densitii. Percoll7ul poate fi separat de organitele purificate prin centrifugare timp de / ore la "&&.&&&g, organitele rm!n!nd plasate deasupra sedimentului format. ,atorit faptului c Percoll7ul este un mediu care mpr tie lumina, n evaluarea activitilor enzimatice n prezena acestuia sunt preferate metodele de fluorescen n detrimentul celor spectrofotometrice.