You are on page 1of 9

Osmoza invers

Osmoza invers se bazeaz pe procesul de osmoz. Pentru a intelege procesul de osmoza sa consideram doua solutii de macromolecule, una concentrata cealalta diluata separate printr-o membrana semipermeabila. Osmoza implic micarea selectiv a solventului (apa) din partea mai diluat spre latura mai concentrat. Ca rezultat solventul ce trece in solutia mai concentrata o va dilua si nivelele din cele doua capilare se vor diferentia , mai inalt fiind cel in care a trecut solventul. Cresterea nivelului in capilar va determina o crestere a presiunii in aceasta solutie si va incetini procesul de dilutie pana la echilibrarea presiunilor cand trecerea solventului se opreste. ceasta presiune ce poate fi masurata e!perimental se numeste presiune osmotica. "n procesul de osmoz invers prin aplicarea unei presiuni asupra solu#iei mai concentrate se for#eaz trecerea apei $n sens invers spre solu#ia diluat (fig.).

%ig. &chema de func#ionare a procesului de osmoz invers 'esi procesul de osmoza inversa era folosit doar in industria vinului in prezent este inteles si larg folosit in diferite domenii. Prin osmoz invers pot fi concentra#i to#i compuii care au o greutate molecular mai mare de ()* + ,)* 'altoni aa cum sunt- bacteriile, sruri organice, glucide, proteine, coloran#i, sruri etc. 'eoarece cei mai mul#i dintre contaminan#i nu trec prin membrane specifice o dat cu apa, prin acest procedeu se poate ob#ine ap pur. .embranele utilizate $n mod obinuit $n acest scop sunt realizate din celuloz + triacetat, celuloz + diacetat sau membrane realizate din poliamide aromatice. .embranele utilizate pentru osmoza invers sunt mult mai restrictive dec/t cele utilizate pentru ultrafiltare.
(

Prin particularit#ile sale osmoza invers este deosebit de important pentru purificarea apei fiind utilizat $n tehnicile moderne aplicabile $n acest scop. 'ei ultrafiltrarea i osmoza invers sunt similare ele sunt diferen#iate prin unele criterii cum sunt cele prezentate $n tabelul nr. 0abel Criterii care diferen#iaz ultrafiltrarea de osmoza invers (Pr1ve, P i colab., (232) Criteriu 'imensiunea particulelor re#inute Presiunea osmotic Presiunea de lucru Procese principale Ultrafiltrare Osmoza invers 4reutate molecular 4reutate molecular >(*** < )** + (*** negli5abil Considerabil, poate a5unge la 3** + (*** 67cm, , P/n la (** 67cm .ai mare de (** 67cm, i poate a5unge la ()** 67cm, &eparare dup 0ransport prin difuzie8 dimensiunea molecular8 materialul membranei efectul de sit8 materialul poate afecta propriet#ile membranei nu are nici o de transport. influen# caracteristica important fiind dimensiunea porilor.

Gel-filtrarea
:n purificarea enzimelor un loc important este ocupat de procesele de cromatografie. Cromatografia reprezinta o familie de tehnici de separare bazata pe diferitele interactiuni ale biomoleculelor cu cele doua faze- stationara si mobila. sa cum sugereaza si denumirea, faza stationara reprezinta o faza fi!a, imobila, iar faza mobila este un lichid sau un gaz care trece prin faza stationara si preia, elueaza, %ig. ( 9eprezentarea unui proces de cele doua faze permite separarea lor datorita cromatografie lichida vitezelor lor de miscare, de iesire din coloana cromatografica. .etodele, tehnicile cromatografice sunt e!trem de numeroase, de variate. Purificarea biomoleculelor, a
,

moleculele. :nteractia diferita a moleculelor cu

proteinelor in special, se realizeaza in in mare masura prin metode cromatografice pe coloana, utilizandu-se un lichid ca faza mobila. &chema generala a unei separari printr-o coloana cromatografica este prezentata in fig.(. Cele mai utilizate tehnici pentru purificarea enzimelor, proteinelor, sunt tehnicile de gel filtrare, cromatografia de schimb ionic si cromatografia de afinitate. Gel filtrarea (4%) denumita si Cromatografia de permeaie prin gel (4PC) sau Cromatografia de excludere moleculara (&;C) folosete aa numitele site moleculare sau site structurale. .etoda se bazeaza pe diferentele de marime si structura ale biomoleculelor. .oleculele mici intr $n porii matricei fiind re#inute $n faza sta#ionar $n timp ce moleculele mari trec prin coloan cu viteze diferite $n func#ie de greutatea lor molecular i structura lor (fig.,.). &epararea depinde de dimensiunea i de forma moleculelor, dar si de structura gelului i a porilor care depind la randul lor de gradul de $mbibare a gelului. Prin aceast metod se pot separa la scar enzime, acizi nucleici, carbohidra#i i peptide. ;ste o metoda foarte potrivita pentru bioproduii sensibili la schimbari de p<, ioni metalici, cofactori sau conditii severe de mediu. Pentru acest tip de separari paturile cromatografice trebuie sa fie poroase si inerte. 'eoarece matricea acestor paturi este constituita in ma5oritatea cazurilor dintr-un gel inert inalt hidratat metoda este cel mai adesea filtrare. cunoscuta ca gel

%ig., &epararea prin cromatografie de permeatie 4elurile obisnuite pentru formarea fazei stationare, utilizate in acest scop, sunt formate
=

din dextran, agaroza sau poliacrilamida. 4radul de legare incrucisata a particulelor de gel vor determina diametrul porilor si domeniul de fractionare al biomoleculelor de diferite marimi.

por

.atricea legata

incrucisat

Particulele de gel, indiferent de natura lor se obtin prin legarea incrucisata a unor monomeri specifici. re loc o polimerizare sau copolimerizare $ntr-o re#ea tridimensional. Procesul se mai numeste si reticulare. 4elurile formate din de!tran sau poliacrilamida pot separa si molecule globulare cu o greutate moleculara in 5ur de 3**.*** daltoni in timp ce gelurile de agaroza avand o porozitate mai mare pot separa si molecule, comple!e macromoleculare, de cateva milioane daltoni. Cateva dintre cele mai utilizate geluri sunt prezentate in tabelul nr> 0abel > Denumirea matricei &ephade! 4-(*( &ephade! 4-)*( &ephade! 4-(**( &ephacr?l &-,** <9( &ephade! 4-,**( Cio-4el P-,, Cio-4el P-(*, Cio-4el P-B*, Cio-4el P-()*, Cio-4el P-=**, Dltrogel c )A= Dltrogel c AA= Dltrogel c =A= &epharose BC( &epharose ,C( Cio-4el -), Cio-4el -()*,
Absorbanta
(

0ipuri de geluri utilizate in gel filtrare. Tipul de gel Domeniul de fractionare pentru peptide si proteine globulare de!tran )* + @** ()** + =**** A*** + ()**** )*** + ,)**** )*** + B***** poliacrilamida (** + (3** ()** + ,**** =*** + B**** ()*** + ()**** B**** + A***** poliacrilamida7agaroza B*** + @**** (,*** + (=**** ,**** + A***** agaroza (**** + A****** @**** + A******* (**** + )****** (****** + ()*******
.olecule cu greutate mare .olecule cu greutate intermediara .olecule cu greutate mica .olecule ce interactioneaza cu mediul

E marca mersham Pharmacia Ciotech8 ,E marca Cio-9ad Faboratories, :6C8 =E marca Pharmacia FGC.

Pentru realizarea gel filtrarii, faza stationara formata din gelul realizat prin amestecarea particulelor sferice de gel uscat + matricea poroasa in forma de particule sferice + cu
V0 Ve Vt Vt-V0 V ! V"

:n5ectia probei

tamponul, potrivit proteinei care trebuie separata8 se lasa un timp adecvat cu agitare din timp in timp pentru imbibare si apoi amestecul este turnat in coloana aleasa. 'upa spalarea si echilibrarea gelului cu tamponul adecvat se obtine asa numitul pat cromatografic. Operatia de realizare a patului cromatografic se numeste impachetarea patului. 0amponul cu care se echilibreaza patul va umple porii matricei si spatiul dintre particule. Fichidul din interiorul porilor este adesea considerat faza stationara si este in echilibru cu lichidul dinafara particulelor considerat faza mobila. 'eoarece aceasta metoda se bazeaza pe dimensiunea moleculelor ce se separa, trebuie specificat ca probele sunt eluate in mod isocratic adica nu este necesar sa se utilizeze tampoane diferite in timpul procesului de separare. 'e asemenea la sfarsitul procesului de separare spalarea coloanei se realizeaza cu acelasi tampon pentru indepartarea tuturor moleculelor care ar fi putut fi retinute pe coloana si pregatirea acesteia pentru un nou proces. 9ezultatele unei gel filtrari se e!prima de obicei ca un profil de elutie sau o cromatograma care arata variatia in concentratia biomoleculelor (in ma5oritatea cazurilor ca absorbanta in DH la
,3*

nm) din proba ca eluenti in ordinea greutatii lor moleculare, primele

fiind biomoleculele cu masa cea mai mare.

Absorbanta

:n5ectia probei

.olecule cu greutate mare

Parametrii ce caracterizeaza un proces de gel filtrare si in general un proces


intermediara

.olecule cu greutate

%ig>

cromatografic, suntHt E volumul total al coloanei8


t H* E volumul spatiului gol, volumul liber accesibil tuturor moleculelor sau volumul fazei V e

V0

.olecule cu greutate mica

Vt-V0

.olecule ce interactioneaza cu mediul

V ! V"

mobile8 reprezinta in 5ur de =)I din volumul total al coloanei8 Hi E volumul intern al particulelor, accesibil doar moleculelor mici si sarurilor in functie de dimensiunea porilor si moleculelor8 este definit si ca volumul fazei stationare, Hs. 'eoarece in practica este dificil de determinat, acest volum este uzual considerat a fiHs E Hi E Ht + H*. 'in aceasta relatie se observa ca volumul fazei stationare include si volumul materialului solid din care este realizata matricea. Hg E volumul particulelor de gel imbibate ce formeaza matricea coloanei. He E volumul de elutie este volumul de solvent cu care este eluat un component din stratul cromatografic. cest volum este usor de determinat din cromatograma dar nu defineste complet comportarea unei probe deoarece va varia cu volumul total al patului cromatografic si cu modul in care a fost coloana impachetata. Poate fi calculat cu a5utorul relatiei- He E H*J GavHi. Gd E este definita ca fractia fazei stationare care este disponibila pentru difuzia unor specii moleculare sau este coeficientul de distributie a speciei moleculare intre faza stationara si cea mobilaGdE
Ve V* Ve V* E Vt V* Vg Vi

GavEcoeficientul de distributie mediu al probei intre faza mobila si cea stationara si care caracterizeaza mai bine elutia unei probe8 poate fi definit si ca fractia fazei stationare efective, disponibila pentru difuzia unei specii moleculare (*KG avK(). cest coeficient se calculeaza prin relatia- GavE(He + H*) 7 (Ht + H*). 'e fapt Gav nu este un coeficient real de partitie dar pentru un mediu dat e!ista un raport constat intre acesta si adevaratul coefficient de partitie, Gav-Gd, raport care este independent de natura si concentratia moleculei de interes. :n aceste relatii He este determinat de e!emplu prin masuratori de activitate sau din cromatograma, H* se masora prin elutia Lblue de!tranuluiM (. rN(*B), iar Ht este fie calculat geometric (Or,P: - unde r este raza coloanei, iar : inaltimea patului cromatografic) fie determinat prin elutia unor molecule mici ca de e!emplu acetona. 4radul de separare dintre diferitele macromolecule7molecule depinde de o serie de factori- volumul probei, raportul dintre volumul probei si volumul coloanei, dimensiunile coloanei, dimensiunea particulelor de gel, distributia particulelor, densitatea patului cromatografic, dimensiunea porilor din particule, viteza de curgere, vascozitatea probei si solventului.
B

;ficienta, succesul unei gel filtrari depinde in primul rand de conditiile alese astfel incat sa se realizeze o selectivitate suficienta si picuri cat mai inguste si fara efecte de asimetrie, varfuri asimetrice Lcu coadM sau LfrontaleM, capacitate de separare slaba sau elutii tarzii. &eparabilitatea a dou componente este caracterizat prin Rezoluia cromatografic RS i se e!prim prin,(V, V( ) (W( + W , )

9s E

H(, H, reprezinta volumele de elutie a doua varfuri adiacente8 Q (, Q, largimile la baza varfurilor respective8 (H, - H() distanta dintre cele (W( + W , ) doua varfuri8 reprezinta media largimi bazelor celor doua , varfuri.

Parametrii utilizati pentru e!primarea rezolutiei sunt reprezentati in fig.. (H, + H()

Q(

Q,

%ig>. 9ezolu#ia a dou v/rfuri cromatografice ceast rezolu#ie reprezint o punte $ntre teorie i practic, i caracterizeaz succesul unei separri. cest concept de rezolu#ie se aplic oricrei metode cromatografice ce se limiteaz la v/rfuri de tip 4auss. legerea celui mai potrivit gel pentru separarea unor biomolecule se realizeaza prin asa numita curba de selectivitate pentru fiecare matrice posibil a fi utilizata intr-un proces de gel filtrare. 'aca se se efectueaza un grafic raportand G av fata de logaritmul greutatii moleculare a unor proteine standard se obtine curba de selectivitate pentru fiecare mediu utilizat pentu gel filtrare. ceste curbe se folosec pentru alegerea celui mai potrivit mediu pentru o separare data. :n cazul unei alegeri corespunzatoare a mediului de filtrare si a conditiilor de lucru pentru anumite proteine curba obtinuta este o dreapta (fig ). :n general curba de selectivitate este liniara pe un domeniu al valorilor G av intre *,( si *,@. ceasta parte a curbei este utilizata pentru determinarea domeniului de fractionare pentru un gel.

%ig.....9elatia dintre Gav si logaritmul masei moleculare. 'omeniul de fractionare defineste pentru un gel domeniul de mase moleculare care au acces partial la porii matricei. 'in curba de selectivitate se poate de asemenea determina si limita de excludere care arata dimensiunea moleculelor care pot fi eluate cu volumul liber accesibil tuturor moleculelor sau volumul spatiului gol. 4el filtrarea este utilizata mai ales la nivel de laborator sau pilot dar poate fi utilizata in anumite cazuri si la scara mare. plicatiile gel filtrarii pot fi preparativa de fractionare a amestecurilor proteice (volumul probelor trebuie sa fie mai mic de )I din Ht), de indepartare a sarurilor din solutiile proteice (volumul probelor pana la ,) + =*I din Ht) si analitic de determinare a maselor moleculare a proteinelor. :n cazul ultimului e!emplu se folosesc proteine marRer cu mase moleculare cunoscute si se raporteaza Gav, Gd, He sau He7H* fata de logaritmul maselor moleculare a proteinelor standard. &e prefera insa raportarea fata de G av deoarece este mai putin sensibil la erorile ce pot fi introduse ca rezultat a variatiilor in timpul prepararii coloanei si dimensiunilor coloanei si nu necesita o determinare indoielnica a H i asa cum este necesar pentru G d. Dn e!emplu a unei astfel de curbe obtinuta prin utilizarea a diferite proteine marRer este prezentata in fig...

%ig>. (din 4el %iltration + Principles and .ethods, mersham Ciosciences, ;dition l, (3-(*,,-(3)