Tesis de Grado - Final

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE FACULTAD DE INGENIERA TESIS DE GRADO: Determinacin de la condicin ptima para la produccin de biomasa de Cryptoccocus
victoriae NPCC 1263 mediante diseo experimental.
Tesista: Carrera: Legajo: Directora: Ao: Lugar de trabajo:
HEINE, Sebastin. Ingeniera Qumica 109599 Dra. Marcela Sangorrn 2013 Grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de levaduras. Departamento de Qumica, Facultad de Ingeniera. Instituto Multidisciplinario de Investigacin y Desarrollo de la Patagonia Norte (IDEPA) Universidad Nacional del Comahue-CONICET
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE - Facultad de Ingeniera
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Agradecimientos
A mi familia, por haber sido un soporte fundamental a lo largo de mi carrera universitaria.
A mi novia, por saber respetar mis tiempos y por darme fuerzas continuamente para seguir adelante.
A mi tutora Marcela Sangorrn, por ser mi gua durante este proyecto y por dedicar parte de su tiempo para que esto sea posible.
A todo el equipo que forma parte del laboratorio de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras, por su buen trato y por su continua enseanza.
A la facultad de ingeniera y al Instituto multidisciplinario de Investigacin y Desarrollo de la Patagonia Norte (IDEPA), por haberme abierto las puertas de sus instalaciones y por proveer el equipamiento y material necesario para la realizacin de este proyecto.
Al personal docente y a la Universidad Nacional del Comahue en general, por haber participado mi formacin acadmica y social.
A todos aquellos que colaboraron de alguna manera en la elaboracin de este proyecto.
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INDICE RESUMEN ABSTRACT KEYWORDS INTRODUCCIN 1. Produccin de peras 1.1 Cadena frutcola 2. Produccin orgnica 3. Podredumbres de postcosecha en peras. 4. Uso de pesticidas 5. Control biolgico 6. Importancia de optimizar la produccin de biomasa 7. Diseo estadstico de experimentos 8. Superficies de respuesta 7.1 Metodologa de superficies de respuesta (MSR) 7.2 Diseo central compuesto 7.3 Diseo compacto 7.4 Diseo central compuesto centrado en las caras 9. Melaza como medio de cultivo 10. Cintica de cultivo por lotes (batch) 10.1 Parmetros de produccin 10.2 Reactor batch 15 16 3 5 6 6 8 9 11 1 iv v v
OBJETIVOS MATERIALES Y MTODOS 1. Material biolgico 2. Equipamiento 3. Medio de cultivo 3.1 Preparacin 4. Diseo experimental
19 20 20 20 20
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5. Codificacin de variables 6. Crecimiento microbiano a pequea escala 6.1 Preparacin del inculo 6.2 Experiencias en Erlenmeyer 6.3 Medicin de azcares totales 7. Modelado del crecimiento 8. Anlisis estadstico: superficie de respuesta 9. Produccin de biomasa en reactor de 20 L 9.1 Preparacin del inculo: 9.2 Condiciones de cultivo en el reactor: 9.3 Curva de crecimiento 9.4 Obtencin de la biomasa 9.5 Cuantificacin de la biomasa obtenida 9.6 Detalles del reactor.
21 22
23 24 24
RESULTADOS 1. Modelado del crecimiento 2. Superficie de respuesta 2.1 Modelos 3. Produccin de biomasa a nivel reactor 3.1 Curvas de crecimiento en reactor
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DISCUSIN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA PAGINAS WEB ANEXOS I ANEXO II
40 43 44 49 50 68
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RESUMEN
Argentina es la primera exportadora de peras del Hemisferio Sur y la quinta en manzanas a nivel mundial. El hecho de que la produccin de fruta se concentre en determinados perodos y que la demanda se realice durante todo el ao, obliga a conservar la misma para regular su oferta. Durante esta conservacin la fruta es susceptible a diferentes enfermedades fngicas causando podredumbres. Las podredumbres ms frecuentes corresponden a infecciones por hongos filamentosos como el moho azul producido por Penicillium expansum y al moho gris producido por Botrytis cinerea. En la actualidad existe una fuerte demanda social por una vida saludable, con alimentos naturales y una gran preocupacin por la preservacin del ambiente. En este contexto, el Control Biolgico resulta como una de las alternativas ms prometedoras para la sustitucin de los fungicidas, en particular por las ventajas que presenta en cuanto a la sustentabilidad ambiental. El grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras seleccion dos levaduras antagonistas (con potencial aplicacin en control biolgico): Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 y Pichia membranifaciens NPCC 1250. Con el fin de mejorar la produccin de biomasa de la levadura antagonista C. victoriae NPCC 1263 se buscaron las condiciones ptimas de crecimiento en un volumen pequeo de 250 ml con 100 ml de medio y posteriormente se realiz el cambio de escala de la mejor condicin establecida en un reactor de 20 L. La optimizacin se realiz aplicando un Diseo Estadstico Experimental (DEE). Se eligi un diseo central compuesto centrado en las caras para evaluar diferentes concentraciones de Melaza, temperaturas de cultivo, niveles de agitacin y diferentes concentraciones de fuente de nitrgeno, obteniendo como resultado una influencia predominante de la temperatura y de la fuente de carbono en el crecimiento de la levadura. Los resultados fueron ajustados a una regresin polinomial obtenindose una superficie de respuesta de las variables significativas que permiten explicar el crecimiento de biomasa para la pequea escala. La condicin ptima obtenida a pequea escala temperatura 13C, agitacin 120 rpm, urea 0,2 g/L y concentracin de melaza 6,4 g/L (mezcla compleja obtenida como subproducto de la elaboracin de azcar de caa compuesta principalmente por sacarosa, monosacridos, sales y otros compuestos slidos solubles) se reprodujo en reactor de 20 litros cuyos resultados fueron comparados a modo de determinar la desviacin existente entre la produccin a diferentes escalas
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ABSTRACT Argentina is the leading pears exporter of Southern Hemisphere and the fifth worldwide apples exporter. The fact that fruit production concentrates in certain periods and demand is made throughout the year, force fruit to be stored to regulate their offer. During conservation fruit is susceptible to several fungal diseases causing rot. Most common decay correspond to "blue mold" produced by Penicillium expansum and "gray mold" produced by Botrytis cinerea. Nowadays, a strong social demand for healthy natural food and great concern for environment preservation exist. In this context, biological control is one of the most promising alternatives to replace fungicides, particularly due to the advantages in terms of environmental sustainability. Yeast Biodiversity and Biotechnology group selected two antagonists yeast: Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 and Pichia membranifaciens NPCC 1250. In order to improve biomass production of the antagonist C. victoriae NPCC 1263 yeast, the optimal growth conditions were reached in a small volume (250 mL flask containing 100 mL of medium) and then the best condition was scaled in a 20 L reactor. The optimization was performed using Statistical Experimental Design (SED). Face-centered Design was chosen to evaluate different molasses culture concentrations, temperature, agitation levels and nitrogen source concentrations, resulting in a considerable influence of temperature and carbon source in yeast growth. Results were adjusted to a surface response achieving a polynomial regression of the significant variables which explain biomass growth at small scale. The optimal condition obtained at small scale (6.4 molasses g / L, temperature 13 C, agitation 120 rpm, urea 0.2 g / L) was reproduced in a 20 liter reactor and results were compared to determine deviation between output at different scales.
KEYWORDS: Optimization, face centered design, surface response, Statistical Experimental Design, molasses, biomass, Cryptoccocus victoriae, biological control.
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INTRODUCCIN. 1. PRODUCCION DE PERAS Argentina es la primera exportadora de peras del Hemisferio Sur y la quinta en manzanas a nivel mundial. Esto constituye la principal actividad econmica en la provincia de Ro Negro y una de las ms importantes en la provincia de Neuqun, que en conjunto representan la mitad de las exportaciones de fruta fresca del pas, representando anualmente un promedio de 460.000 toneladas de peras y 280.000 toneladas de manzanas. Esto convierte al pas en un gran proveedor del mercado mundial. En los ltimos aos se observa en estos valles un incremento paulatino en las superficies destinadas a perales y una disminucin en las cultivadas con manzanos (Altube et al, 2007). El rea productiva es de 50.000 hectreas implantadas con frutales, 85% en Ro Negro y 15% en Neuqun, con unos 4.000 productores, 260 establecimientos de acondicionamiento y empaque, 220 establecimientos frigorficos, y 11 empresas que elaboran jugo concentrado. En conjunto generan 50.000 puestos de trabajo directos y 15.000 indirectos y tienen gran relevancia en la estructura socioeconmica de las dos provincias, fundamentalmente en la ocupacin de mano de obra (CAFI, 2013).
1.1
Cadena frutcola:
La cadena frutcola de peras y manzanas est integrada principalmente por las siguientes etapas (Figura 1): Produccin: En la regin se utilizan los sistemas de produccin frutcola convencional y orgnica. En el sistema de produccin convencional, el control de plagas y enfermedades tradicionalmente se basa en la aplicacin de agroqumicos a campo, fungicidas de sntesis y antiescaldantes en la postcosecha. En cuanto al sistema de produccin orgnica, se plantean estrategias de manejo preventivo, en que slo se utilizan productos de origen ecolgico (biopesticidas) y se aplican estrictas medidas de higiene y desinfeccin con hipoclorito de sodio en las plantas de empaque y las cmaras frigorficas (SENASA, 2007; CAFI, 2008). Empaque: Consiste en la clasificacin de la fruta ingresada a las plantas industriales, en base a criterios de calidad (sanidad del fruto, tamao, y color) y posteriormente el envasado en distintos tipos de contenedores de acuerdo al destino de la fruta
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Conservacin: Desde el momento en que la fruta es cosechada, es indispensable contar con una cadena de fro que garantice la adecuada conservacin de la misma. En la regin frutcola de peras y manzanas existen importantes inversiones en plantas frigorficas de fro convencional y de atmsfera controlada. De esta forma puede mantenerse el producto en adecuadas condiciones de calidad y sanidad para poder ser comercializado en los distintos momentos del ao, dependiendo de las variedades que se trate, como as tambin de los distintos mercados de destino. El uso de atmsfera controlada posibilita el almacenamiento de la pera durante perodos de hasta 9 meses para retrasar su comercializacin y obtener mejores precios (Graell et al, 2003).
Comercializacin: La fruticultura de pepita de la regin del Valle de Ro Negro y Neuqun, siempre ha tenido un fuerte perfil exportador. Los principales destinos de las exportaciones son la Unin Europea, Rusia, Brasil, y Estados Unidos, exportndose hoy a ms de 50 pases. En el caso de las exportaciones de ultramar, la regin ha alcanzado un significativo desarrollo logstico que permite hoy integrar la cadena hasta la salida de los buques y contenedores, con fuertes inversiones en transporte terrestre y una profesionalizada organizacin de los puertos de San Antonio Este y Baha Blanca (CAFI, 2008) .
Figura 1. Cadena productiva de peras y manzanas (COFECYT, 2013).

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2. PRODUCCIN ORGNICA: La agricultura orgnica forma parte de una vasta gama de metodologas que apoyan la proteccin del medio ambiente. Los sistemas de produccin orgnica se basan en normas de produccin especficas y precisas cuya finalidad es lograr agroecosistemas ptimos, que sean sostenibles desde el punto de vista social, ecolgico y econmico. Argentina cuenta con ventajas naturales y competitivas para la produccin de alimentos orgnicos, y con ello est en condiciones de incrementar la oferta y contribuir a satisfacer la demanda de productos orgnicos, no slo a nivel de produccin de materias primas agroalimenticias, sino tambin de productos con distintos grados de transformacin. La produccin agropecuaria argentina se ha caracterizado por la utilizacin de un bajo nivel de agroqumicos, y si bien en los ltimos aos ha aumentado su utilizacin, no llega a niveles comparables a los de los pases desarrollados. Adems, el paso de la agricultura
convencional a la produccin orgnica no suele plantear a los productores mayores dificultades, debido al modo de produccin convencional sin uso de agroqumicos, y por las caractersticas agroecolgicas de las zonas de produccin. La extensin y fertilidad natural de los suelos, la abundancia de tierras vrgenes y el escaso empleo de insumos qumicos en las prcticas agrcolas convencionales permite que los agricultores pasen a la produccin orgnica sin necesidad de introducir importantes ajustes a sus mtodos de explotacin .(SENASA, 2009) En este contexto se presenta en Figura 1 la evolucin de la superficie destinada a la produccin orgnica en Argentina a lo largo de los ltimos aos observndose un incremento del 600% desde 1995 y 2011 (SENASA, 2001, 2009, 2013).
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Figura 2: Superficie de cultivosorgnicos cosechados en Argentina.
En tablas 1 y 2 se observa el incremento tanto de la superficie implantada con frutales de peras y manzanas como el incremento de las exportaciones de dichos productos en la ltima dcada.
Tabla 1: Superficie implantada con frutales de pera y manzana en Rio Negro y Neuqun (ha)
Ao 2000 2008 2012 Orgnica Manz y pera 800 2600 3068 % 1,85 5,57 6,49 Peras 17300 22500 23800 Convencional Manzanas 26000 24200 23500 Total 43300 46700 47300
Tabla 2: Exportacin de manzanas y peras (Tn)

Ao 2000 2008 2012 Orgnica Manz y pera 10800 36000 32000 % 1,80 5,75 4,97 Peras 350000 413949 429626 Convencional Manzanas 250000 212623 214426 Total 600000 626572 644052
El sector de productos orgnicos cuenta con la ventaja, respecto de los tradicionales, de que se est manifestando un gran crecimiento de la oferta de productos orgnicos elaborados en el mundo. Por lo cual, en la Argentina queda abierta la posibilidad de desarrollar un amplio potencial de productos de alto valor para ser colocados en los mercados demandantes.
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En conclusin, si bien el sector se viene desarrollando desde hace varios aos, en nuestro pas existen amplias posibilidades de incrementar y diversificar la produccin debido a una gran demanda insatisfecha y al potencial de produccin que se observa (SENASA, 2009). 3. PODREDUMBRES DE POSTCOSECHA EN PERAS.
El hecho de que la produccin de fruta se concentre en determinados perodos y que la demanda se realice durante todo el ao, obliga a conservar la misma para regular su oferta. Como todo producto perecedero, esta requiere de tecnologas adecuadas que permitan el mantenimiento de sus caractersticas organolpticas y su apariencia durante el tiempo de conservacin (febrero a septiembre) (Mondino et al, 2006). No obstante, durante esta conservacin la fruta es susceptible a diferentes enfermedades fngicas que se desarrollan invadiendo los tejidos y causando podredumbres por diferentes especies de hongos filamentosos (Barkai et al, 2001). Una de las condiciones que favorecen el desarrollo de podredumbre son las heridas en los frutos ya que constituyen la va de entrada de los patgenos de postcosecha. Es por ello que resulta de gran importancia minimizar la ocurrencia de heridas mediante prcticas cuidadosas de cosecha y manipuleo de la fruta en la postcosecha (Vero et al, 2004). Las podredumbres ms importantes de manzana y pera en postcosecha corresponden al moho azul producido por Penicillium expansum y al moho gris producido por Botrytis cinerea (Figura 3 y 4).
A B
Figura 3: Morfologa de los patgenos. A: P. expansum 1x. B: P. expansum. C: B. cinerea 1x. D: B. cinerea 400x. -5-
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Figura 4: Podredumbre en peras. A: Moho gris producido por B. cinerea. B: Moho azul producido por P. expansum (Sosa, 2010).
4. USO DE PESTICIDAS. Tradicionalmente, el uso de fungicidas sintticos ha sido la primera medida en el control de estas enfermedades. Sin embargo, esta medida est siendo actualmente reevaluada debido a los problemas de toxicidad provocados para el hombre, a las restricciones impuestas por los mercados importadores y a la aparicin de cepas resistentes a los fungicidas utilizados. Segn la U.S. National Academy of Sciences, un 60% de los fungicidas usados habitualmente presentan riesgos oncognicos para los consumidores (Leverentz et al, 2002). Los contenidos mximos de residuos de fungicidas permitidos han sido establecidos a nivel mundial por diferentes directrices, que representan en muchos casos una barrera para el comercio y en especial para las exportaciones de nuestra fruta al resto de los pases.
5. CONTROL BIOLGICO. El biocontrol consiste en la aplicacin de microrganismos naturales o modificados, para reducir los efectos de microorganismos indeseables que daan la fruta. Los microrganismos antagonistas comprenden cualquier organismo que interfiera en la supervivencia o el
desarrollo de los patgenos (Ezziyyany et al, 2006). En la actualidad existe una fuerte demanda social por una vida saludable, con alimentos naturales y una gran preocupacin por la preservacin del ambiente. De este modo, para poder dar respuestas a estas demandas se desarrollan, en la mayora de los pases, distintos programas de Produccin Integrada y de Buenas Prcticas Agrcolas. En este contexto, el
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Control Biolgico resulta como una de las alternativas ms prometedoras para la sustitucin de los fungicidas en particular por las ventajas que presenta en cuanto a la sustentabilidad ambiental. Los ambientes donde se conservan los frutos de postcosecha presentan caractersticas favorables para el desarrollo y aplicacin prctica de mtodos de Control Biolgico (Mari et al, 2003), ya que son ambientes reducidos y con condiciones controladas. El elevado valor agregado de los productos cosechados determina la viabilidad de desarrollo de mtodos de control ms elaborados, que no seran econmicamente aplicables a campo (Wilson et al, 1992; Janisiewicz et al, 2005). Los esfuerzos de investigacin se enfocan en la bsqueda de microorganismos epfitos, capaces de controlar a los patgenos por medio de reduccin del inculo o por el bloqueo de una o varias etapas de su ciclo infeccioso utilizando distintos mecanismos de accin (Spadaro et al, 2004; Mondito et al, 2006). Los agentes de control biolgico (ACB) no tienen un nico modo de accin y esta propiedad es frecuentemente una caracterstica a seleccionar cuando se desea obtener un microorganismo con estos fines. El riesgo de resistencia por parte del hongo se reduce si el antagonista acta por varios mecanismos, o si se emplean combinaciones de antagonistas cada uno con diferente modo de accin (Conway et al, 2007). Existen varios mecanismos posibles de accin para los antagonistas de uso en postcosecha, entre los que se encuentran: la produccin de antibiticos, de enzimas hidrolticas y de toxinas killer; la competencia por nutrientes o espacio; el parasitismo y la induccin de resistencia del husped (Sparado et al, 2002; Freulund et al, 2002; Calvo et al, 2007; Reuveni et al, 2007). Las levaduras son organismos ideales paras ser usadas como antagonistas debido a que: 1) pueden ser aisladas de los mismos alimentos que se quieren preservar; 2) pueden utilizar un amplio rango de nutrientes y muchas pueden crecer a baja actividad de agua, bajos niveles de oxgeno y baja temperatura; 3) son genticamente estables y efectivas en bajas cantidades; 4) tienen capacidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas y 5) no son patgenas y no producen esporas alergnicas, micotoxinas u otros metabolitos que puedan comprometer la salud humana (Wan et al, 2005). Esta estrategia, propuesta a mediados del siglo XX, est an hoy en desarrollo. En los ltimos aos se ha intensificado la investigacin en el campo del Control Biolgico de las enfermedades de postcosecha en fruta; dentro de los cuales podemos destacar los realizados sobre manzana y pera , frutos de carozo, ctricos y pltanos empleando levaduras como ACB
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(Sharma et al, 2009; Janisiewicz et al, 2010; Teixido et al, 2011). Entre las especies de levaduras ms empleadas como organismos antagonistas se destacan: Candida saitoana, Debaryomyces hansenii, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula glutinis, Metschnikowia pulcherrima y Pichia anomala (Droby et al, 2009; Jijakli et al, 2011). Existen en la
actualidad por lo menos cuatro productos comerciales cuyo principio activo es un microorganismo antagonista para su uso como biocontrolador de enfermedades de frutas en postcosecha. No obstante, en nuestro pas, an no se han registrado formulados comerciales cuyo ingrediente activo sean levaduras para su uso como ACB. Han dificultado su uso el elevado costo de la importacin del producto y la inconsistente respuesta que se ha observado cuando stos son probados en regiones distintas a las de su origen. La seleccin apropiada de microorganismos ACB determina en gran medida el xito de los programas de desarrollo de sistemas de control biolgico. Diferentes estrategias de bsqueda y seleccin del ACB ms apropiado han sido utilizadas a nivel mundial. Sin embargo las ms prometedoras resultan ser aquellas en las que los ACB son aislados en lugares en donde no ocurre enfermedad en presencia de patgeno y en un ambiente favorable al desarrollo de la misma, como son las cmaras frigorficas de conservacin. Cabe esperar que en ese mbito est actuando algn tipo de biocontrol natural que permite que la fruta se conserve libre de podredumbre durante varios meses de conservacin. El grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras comenz a estudiar levaduras como ACB desde el ao 2007 (Robiglio et al, 2011). A partir de estos trabajos dos levaduras antagonistas fueron seleccionadas: Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 y Pichia membranifaciens NPCC 1250 (Lutz et al, 2011, 2012). Estas levaduras fueron aplicadas en peras a escala comercial, obteniendo resultados muy alentadores, con un 80% de reduccin de las podredumbres a los 140 das de conservacin (Sangorrn et al, 2012). El uso de estas dos levaduras se ha patentado por el CONICET y la Universidad Nacional del Comahue en marzo del 2012 (20120101053).
6. IMPORTANCIA DE OPTIMIZAR LA PRODUCCIN DE BIOMASA. Para cumplir con los objetivos planteados por el equipo de investigacin y con perspectivas del uso de estas levaduras como biocontrol a nivel comercial e industrial, se pretende encontrar las condiciones ptimas de crecimiento que permitan obtener la mxima biomasa reduciendo tiempos y costos de produccin. Por otro lado, en un futuro se debera evaluar si la
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levadura en esta condicin optimizada ha
conservado o mejorando simultneamente la
actividad antagonista. Se propone utilizar melaza proveniente de la caa de azcar y urea como base del sustrato debido a sus bajos costos. Tradicionalmente, las condiciones de cultivo han sido optimizadas por la estrategia de modificar una variable a la vez, es decir cambiando un factor mientras otros se mantienen constantes (Arevalo 1998, Abadas et al, 2003). Aunque esta estrategia es sencilla y no requiere un anlisis estadstico, s requiere un gran nmero de experiencias y las interacciones entre los factores son ignoradas (Costa et al, 2002; Patio et al, 2005). En contraste, los diseos experimentales basados en estadstica son aproximaciones ms eficientes que pueden llevarse a cabo con un gran nmero de variables en simultneo y se puede estimar la interaccin entre estas variables (Daz et al, 2005). Actualmente esta tcnica se utiliza ampliamente por investigadores para optimizar los componentes de un medio de cultivo, ya que es una herramienta eficiente que permite el desarrollo de modelos matemticos empricos (Abadas et al, 2003; Pelinsky et al, 2012; Daz et al, 2005; Nikel et al, 2005; Wang et al, 2011; Abadas et al, 2003).
7. DISEO ESTADSTICO DE EXPERIMENTOS: Se podra definir el Diseo Estadstico de Experimentos (DEE), tambin denominado diseo experimental, como una metodologa basada en tiles matemticos y estadsticos cuyo objetivo es ayudar al experimentador a: 1. Seleccionar la estrategia experimental ptima que permita obtener la informacin buscada con el mnimo coste. 2. Evaluar los resultados experimentales obtenidos, garantizando la mxima fiabilidad en las conclusiones que se obtengan (Ferr et al, 2013). En un diseo experimental se manipulan deliberadamente una o ms variables vinculadas a las causas (que influencian en el sistema), para medir el efecto que tienen en otra variable de inters. El diseo experimental prescribe en una serie de pautas relativas: qu variables hay que manipular, de qu manera, cuntas veces hay que repetir el experimento y en qu orden para poder establecer con un grado de confianza predefinido la necesidad de una presunta relacin de causa-efecto. El mtodo tradicional de experimentacin, el que quizs surge de forma ms intuitiva para estudiar un sistema, consiste en variar-un-factor-cada-vez (VUFCV): a partir de unas
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condiciones iniciales, se realizan experimentos en los cuales todos los factores se mantienen constantes excepto el que se est estudiando. De este modo, la variacin de la respuesta se puede atribuir a la variacin del factor, por lo tanto revela el efecto de ese factor. La estrategia experimental VUFCV presenta inconvenientes importantes cuando existe interaccin entre factores: No informa sobre como un factor interacta con los otros factores o como estas interacciones afectan a la respuesta, con lo cual slo se obtiene una comprensin limitada de los efectos de los factores. No proporciona la posicin del ptimo. El experimentador percibe que se ha llegado al ptimo porque cambiando un factor cada vez la respuesta no mejora, pero se puede encontrar lejos del ptimo real (Figura 5). Aunque se puede reiniciar la experimentacin partiendo del ptimo encontrado, esta solucin es extremadamente ineficiente cuando se deben estudiar muchos factores a muchos valores distintos, puesto que el mtodo VUFCV requerira demasiados experimentos y demasiado tiempo.
Figura 5: Limitacin del mtodo VUFCV. Se observa que el ptimo encontrado difiere del ptimo real (Ferr et al, 2001).
El DEE proporciona el marco matemtico para cambiar todos los factores simultneamente y obtener la informacin buscada con un nmero reducido de experimentos, es decir con la mxima eficiencia. El DEE conduce a una planificacin con menos experimentos que el mtodo VUFCV para obtener un conocimiento equivalente.
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Segn Ferr et al (2001) la aplicacin del diseo de experimentos requiere considerar las siguientes etapas o procedimientos: 1. Comprender el problema y definir claramente el objetivo. 2. Identificar los factores que potencialmente podran influir en la funcin objetivo y los valores que stos pueden tomar. 3. Establecer una estrategia experimental, llamada plan de experimentacin. 4. Efectuar los experimentos con los valores de los factores decididos en el punto 3 para obtener los valores de las respuestas estudiadas. 5. Interpretar los resultados. Si es necesario, volver a la etapa 1.
8. SUPERFICIES DE RESPUESTA. La forma de la funcin (fx) que determina la relacin entre los factores y la variable respuesta es en general desconocida. Por ello el primer objetivo del Mtodo de Superficie de respuesta (MSR) consiste en establecer experimentalmente una aproximacin apropiada de la fx. Para ello, se propone un modelo de ecuacin, generalmente polinmico, en los k factores X1, X2,..., Xk y se selecciona un conjunto de tratamientos sobre los que realizar las observaciones experimentales. Estas se utilizarn tanto para obtener estimaciones de los coeficientes en el modelo propuesto (por ejemplo, a travs del mtodo de mnimos cuadrados) como para obtener una estimacin de la variacin del error experimental (para lo que es necesario tener al menos 2 observaciones por cada tratamiento). Se realizan, entonces, contrastes sobre las estimaciones de los parmetros y sobre el ajuste del modelo y si el modelo se considera adecuado, puede utilizarse como funcin de aproximacin. La MSR es una tcnica secuencial. A menudo, la estimacin inicial de las condiciones ptimas de operacin est alejada del ptimo real, as que el objetivo es, usando un mtodo lo ms simple y menos costoso posible, moverse rpidamente hacia las cercanas del ptimo. Los polinomios usados ms frecuentemente como funciones de aproximacin son los de rdenes uno y dos, que nos proporcionan los siguientes modelos:
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En la construccin de modelos de superficies de respuesta, es muy comn la codificacin de los valores reales de los niveles de los factores, pues las distancias medidas sobre los ejes de las variables codificadas en el espacio k-dimensional se convierten en estndar. Esto ltimo facilita considerablemente los clculos que deben llevarse a cabo para obtener el modelo de aproximacin e incrementa el ajuste en la estimacin de los coeficientes. Dicha codificacin se realiza segn:
(Ec. 3)
Donde xi corresponde a la variable codificada, Xi corresponde al valor real de la variable independiente, Xo es el valor real de la variable independiente en el punto central y corresponde al paso o diferencia entre los extremos y el punto central. A los extremos de cada factor le correspondern los valores + 1 y -1 mientras que el punto central asumir el valor 0. El punto central es tomado como valor de partida para definir el rango que tomarn los factores a ser estudiados.
8.1 Metodologa de superficie de respuesta (MSR) La eleccin de un diseo adecuado del experimento es fundamental para modelar y explorar la MSR usada para ajustar a un modelo polinmico el conjunto de datos recogidos en los puntos del diseo. As pues, sera deseable que el diseo tenga determinadas caractersticas que sirvan al inters del experimento: 1. Generar una distribucin razonable de puntos, por tanto de informacin en toda la regin de inters, pero utilizando el menor nmero posible de puntos experimentales. 2. Asegurar que para cada punto x, el valor ajustado, (x), est tan cerca como sea posible del valor real, Y(x). 3. Permitir la deteccin de falta de ajuste en el modelo.
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4. Permitir la ejecucin de los experimentos en bloques. 5. Proporcionar una estimacin interna de la varianza del error. 6. Asegurar simplicidad en los clculos de las estimaciones de los parmetros del modelo.
Adems de las propiedades mencionadas, sera muy conveniente que el diseo elegido fuera ortogonal y/o invariante por rotacin. Un diseo ortogonal es aquel en el que los trminos del modelo ajustado son incorrelados, por tanto tambin las estimaciones de los parmetros lo son, en cuyo caso la varianza de la respuesta esperada en cualquier punto de la regin experimental se puede expresar como la suma ponderada de las varianzas de los parmetros estimados del modelo. Por otro lado, en un diseo invariante por rotacin la varianza de f(x), que depende de la situacin del punto x, es funcin nicamente de la distancia del punto al centro del diseo, lo que significa que es la misma en todos los puntos equidistantes del centro del diseo. Teniendo en cuenta que el objetivo de la MSR es la optimizacin de la respuesta y que se desconoce la localizacin del ptimo antes de ejecutar el experimento, esta propiedad resulta muy interesante puesto que garantiza que el diseo proporcionar estimaciones igualmente precisas en todas las direcciones.
8.2 Diseo central compuesto Por todas las propiedades que verifican los diseos compuestos centrales (DCC) son posiblemente los ms utilizados para ajustar superficies de respuesta de segundo orden. La Figura 6 muestra que un DCC consiste en: 1. Parte factorial: un diseo factorial 2k, completo o fraccional, en el que los niveles estn codificados en la forma habitual como 1, 2. n0 ( 1) puntos centrales, 3. Parte axial: dos puntos axiales en los ejes correspondientes a cada uno de los factores, situados a una distancia del centro del diseo (puntos estrella). Por lo tanto el nmero total de puntos del diseo es N = 2k + 2k + n0. (Fernandez et al, 2001)
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Figura 6: TIPOS DE DISEOS CENTRALES. A. Diseo central circunscripto (CCC) > 1. B: Diseo central centrado en las caras (FCC) =1. B: Diseo central inscripto (CCI) <1
En principio, los DCC as definidos no tienen por qu ser ni ortogonales ni invariantes por rotacin (rotables). Se convierten en invariantes por rotacin mediante una eleccin adecuada del valor de , que debe depender del nmero de puntos de la parte factorial del diseo para conseguirlo. Por otro lado, a travs de una eleccin apropiada de n0 el diseo puede hacerse ortogonal o incluso de precisin uniforme. Este permite mayor proteccin que un diseo ortogonal contra el sesgo de los coeficientes de regresin producido por la presencia de trminos de orden mayor que 2 en la superficie real. Se muestra a continuacin una Tabla con los valores que deben tomar y n, segn el nmero de factores del modelo, para que el diseo correspondiente sea ortogonal o de precisin uniforme (Tabla 1). Tabla 3: DCC para k factores segn se desee un diseo ortogonal o de precisin uniforme.
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8.3 Diseo compacto: Los diseos centrales compuestos estndar para ajustar una superficie de respuesta de segundo orden tienen por lo general una gran cantidad de puntos, en especial cuando k es grande. En algunas circunstancias es deseable reducir el nmero de puntos tanto como se pueda, de manera tal que se siga manteniendo la capacidad de determinar los parmetros del modelo (Draper et al, 1990). Cuando la experimentacin resulta costosa, difcil y demandante de tiempo el diseo compacto puede ser una buena opcin. El uso de este mtodo puede resultar til cuando se tienen 4 o ms variables y se encuentra disponible en los paquetes estadsticos. Es una buena opcin cuando se desea realizar un estudio preliminar disminuyendo costos y tiempos.
8.4 Diseo central compuesto centrado en las caras Una variante del DCC es el diseo centrado en las caras, en el cual toma el valor 1. En este diseo los puntos estrella se localizan en los centros de las caras del cubo. Esta variante del diseo central compuesto se emplea ocasionalmente, debido a que slo propone tres niveles de cada factor. Este diseo tiene la desventaja de que no es rotable. Este tipo de diseo provee una calidad relativamente alta en las predicciones dentro del espacio de diseo y no requiere el uso de puntos fuera del rango original de diseo. A pesar que este diseo otorga una menor precisin de estimacin de los coeficientes cuadrticos puros, es recomendado para utilizarse cuando la regin de operatividad comprende la regin completa de inters o cuando no existe la posibilidad de operar fuera de los extremos de la regin de diseo.
9. MELAZA COMO MEDIO DE CULTIVO La melaza es una mezcla compleja obtenida como subproducto de la elaboracin de azcar de caa. Contiene sacarosa, monosacridos, sales y otros compuestos slidos solubles en lcali que normalmente estn presentes en el jugo de caa as como los formados durante el proceso de manufactura del azcar. La composicin de la melaza es muy heterognea y puede variar considerablemente dependiendo de la variedad de caa de azcar, suelo, clima, periodo de cultivo, eficiencia de
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la operacin de la fbrica, sistema de ebullicin del azcar, tipo y capacidad de evaporadores, etc. Se caracteriza por tener grados Brix entre 68 y 75% y un pH entre un 5 y 6. AZUCARES: Los principales azucares en la melaza son sacarosa, glucosa o dextrosa y fructosa o levulosa. En general las melazas contienen un 68% de sacarosa, un 6% de fructosa y un 4% de glucosa, expresados en gramos de azcar cada 100 g. de melaza. Su contenido de glucosa y fructosa puede variar a causa de la hidrlisis de la sacarosa a causa de distintas condiciones de pH y temperatura. NO AZCARES: Otros compuestos encontrados en la melaza representan
aproximadamente un 33 % de sustancias inorgnicas (Fe, Na, Ca, Mg, Zn, As, Cd, Hg, Pb, Cl, etc). El 42 % corresponde a sustancias nitrogenadas (aminocidos, pptidos, colorantes) y el 25% restante a sustancias orgnicas libres de nitrgeno (cidos carboxlicos, fenoles, alcoholes, steres, vitaminas, gomas, etc) (Fajardo et al, 2007).
10. CINTICA DE CULTIVO POR LOTES (batch) Los procesos de cultivo por lote o Batch pueden considerarse como sistemas cerrados. A tiempo cero, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin en general no se adiciona nada, excepto oxgeno y en algunos casos antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las clulas (Fajardo et al, 2007). A continuacin se detalla en Figura 7, la forma tpica de un crecimiento por lote. La forma caracterstica de esta curva, se da siempre que se cumplan ciertas condiciones: que el cultivo sea por lotes, que todas las clulas que componen la poblacin se reproduzcan a intervalos regulares, que no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y que la composicin del medio sea simple, en especial en cuanto a las fuentes de carbono y nitrgeno (Acevedo et. al, 2002).
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Figura 7: Curva de crecimiento en cultivo por lotes.
Durante el cultivo se pueden distinguir las siguientes zonas o fases: a- Fase lag o de latencia: el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. b- Fase de crecimiento exponencial o logartmico: las clulas se reproducen a la mxima velocidad posible de acuerdo a las condiciones ambientales existentes, por no existir limitacin de nutrientes. c- Fase estacionaria: no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. d- Fase de muerte o decaimiento: el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial. Se presenta en aquellos cultivos en los que se inducen enzimas autolticas en condiciones de inanicin. 10.1 Parmetros de produccin: Rendimiento de un nutriente en clulas (Yx/s): para el estudio cuantitativo de los procesos de fermentacin, resulta conveniente definir el rendimiento de un nutriente en clulas, como la masa celular obtenida ( ) por unidad de nutriente consumido (S):
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Productividad volumtrica (Qx): es la cantidad de biomasa (X) obtenida por unidad de tiempo (t) y volumen (V). Adems de los rendimientos, se debe tener en cuenta el tiempo en el cual se alcanza cierta conversin, ya que no es lo mismo obtener cierta cantidad de biomasa en un corto tiempo que en uno prolongado.
10.2 REACTOR EN BATCH El reactor, es sin duda uno de los equipos fundamentales de la microbiologa industrial: es el recipiente donde se realiza el cultivo y su diseo debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las funciones que cumple el reactor pueden resumirse del siguiente modo: a. Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo, a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin. b. Mantener constante y homognea la temperatura. c. Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes. d. Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo e. El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado (Ertola R. pgina WEB)
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OBJETIVOS:
Tomando como punto de partida lo mencionado anteriormente se detallan los objetivos que se pretende alcanzar en este proyecto:
Objetivo general:
Determinacin de la condicin ptima de crecimiento para la produccin de biomasa de Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 mediante diseo experimental.
Objetivos especficos:
Determinacin de la condicin ptima de crecimiento para la produccin de biomasa de la levadura Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 empleando herramientas de diseo experimental. Evaluacin de cuatro variables fundamentales para su crecimiento. Aprendizaje del manejo de tcnicas de laboratorio y uso de equipamiento disponible. Utilizacin de programas estadsticos aplicados al modelado de crecimientos microbiolgicos. Produccin de biomasa en reactor de 20 litros en la condicin ptima establecida por diseo experimental Anlisis y discusin de los resultados obtenidos.
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MATERIALES Y MTODOS 1. MATERIAL BIOLGICO Levadura Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 asilada en cmaras frigorficas de la regin por el grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras (Lutz et al, 2012).
2. EQUIPAMIENTO Centrfuga refrigerada de alta velocidad Sorvall RC 5C Plus Microscopio Nikon Eclipse 80i Incubadoras Bambi modificadas con control de Temperatura Estufa de esterilizacin Autoclave tipo chamberland marca VZ 50litros Agitadores orbitales Vicking Shaker Pro Arcano TS2000A JeioTech SK300 Espectrofotmetro PG Instrument T60 Reactor Batch de acero inoxidable (capacidad 20 litros) Balanza Refractmetro Ref 103 0-32brix Electrodo de oxgeno disuelto
3. MEDIO DE CULTIVO: Con el objetivo de utilizar una fuente de nutrientes econmica, se decidi emplear melaza de caa como medio de cultivo para la produccin de Cryptococus victoriae. Como fuente de nitrgeno para aadir a la melaza se utiliz urea granulada debido a su bajo costo.
4. DISEO EXPERIMENTAL Se eligi estudiar cuatro variables influyentes en el crecimiento microbiano: temperatura, aireacin, nivel de fuente nitrogenada (urea) y carbonada (melaza) condicin ptima que permita maximizar la produccin de biomasa. Para la seleccin de las variables y el rango de implementacin se tomaron como punto de partida las condiciones de produccin utilizadas por el equipo de investigacin (melaza 12,8% m/v urea 0,6 g/L a 20C).
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para
encontrar la
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Se utilizaron tres concentraciones de melaza ( 6,4 %, 12,8% y 19,4%), las cuales fueron necesarias para modelar el crecimiento a partir de melaza industrial tomando como punto de partida el valor central 12,8 % m/v. Dicho valor corresponde aproximadamente a 10 gramos de azcares totales por cada 100 mL. Se prepararon varios frascos con las concentraciones mencionadas, a partir de los cuales se fraccionaron los distintos Erlenmeyers con 100 ml de melaza a los diferentes porcentajes, a los cuales se adicion de urea (0,2 g/L; 0,6 g/L; 1 g/L). Todo el material fue autoclavado durante 20 minutos a 1 atm de presin manomtrica.
5. CODIFICACIN DE VARIABLES Para realizar los clculos estadsticos, las variables fueron codificadas de la siguiente manera (Tabla 4): (Ec. 3)
Donde xi corresponde a la variable codificada, Xi corresponde al valor real de la variable independiente, Xo es el valor real de la variable independiente en el punto central y corresponde al paso o diferencia entre los extremos y el punto central.
Tabla 4: Factores codificados segn DCC y codificacin de los niveles usados Factores valores codificados Estrella -1 urea (g/L) melaza (% m/v) temperatura (C) rpm 0,2 6,4 13 120 Bajo -1 0,2 6,4 13 120 Centro 0 0,6 12,8 20 150 Alto 1 1 19,2 27 180 Estrella 1 1 19,2 27 180
Los efectos de las cuatro variables fueron testeados utilizando un diseo central compacto con puntos estrellas centrados en las caras con 2 repeticiones en el centro. A continuacin se detallan las distintas experiencias que fueron realizadas para obtener la superficie de
respuesta (MSR). Dichas corridas fueron determinadas con el paquete estadstico STATISTICA 7.0 (Tabla 5).
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Tabla 5: Corridas experimentales a realizar para obtener la superficie de respuesta segn DCC para 4 factores
4 factor central composite,nc=8 ns=8 n0=2 Standard Urea Melaza T( C) RP M Run (g/L) (g/100mL ) 1 1,0 19,2 27 120 2 1,0 19,2 13 120 3 1,0 6,4 27 180 4 0,2 19,2 13 180 5 1,0 6,4 13 180 6 0,2 6,4 27 120 7 0,2 19,2 27 180 8 0,2 6,4 13 120 9 0,2 12,8 20 150 10 1,0 12,8 20 150 11 0,6 6,4 20 150 12 0,6 19,2 20 150 13 0,6 12,8 13 150 14 0,6 12,8 27 150 15 0,6 12,8 20 120 16 0,6 12,8 20 180 17 (C) 0,6 12,8 20 150 18 (C) 0,6 12,8 20 150
6. CRECIMIENTO MICROBIANO PEQUEA ESCALA 6.1 Preparacin del inculo: La preparacin del inoculo se realiz a la temperatura, agitacin y medio de cultivo correspondiente a la corrida experimental. Se inocul una anzada de levadura fresca, cultivada inicialmente en Agar GPY (Extracto de levadura 5 g/L, Peptona 5 g/L, Glucosa 40 g/L, Agar 20 g/L) en 5mL de medio. Las distintas condiciones de temperatura se lograron utilizando incubadoras de cultivo previamente calibradas. La agitacin se llev a cabo mediante agitadores orbitales programados a la velocidad (rpm) correspondiente de cada experiencia.
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Se cultiv el inculo a la temperatura y agitacin correspondiente segn la corrida experimental (nmero de experiencia) durante 24h. Posteriormente se realiz un recuento en cmara de Neubauer para cuantificar las clulas por mL.
6.2 Experiencias en Erlenmeyer: Cada corrida experimental fue preparada en Erlenmeyers de 250 mL con 100 mL del medio correspondiente, las mismas fueron inoculadas con 1x105 clulas por mL de inculo fresco. La curva de crecimiento de cada corrida experimental se determin por densidad ptica a 640nm, desde el inicio hasta alcanzar la fase estacionaria. El cultivo fue centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos para separar las clulas de levadura del medio de cultivo. Esta operacin fue repetida 3 veces con agua destilada (lavado). La biomasa obtenida fue colocada dentro de una estufa a 70 C en recipientes previamente pesados para obtener su peso seco. Los datos de peso seco vs. Absorbancia a 640 nm se utilizaron para realizar curva de calibracin y determinar el crecimiento de C. victoriae en gramos por mililitro de medio. Medicin de azcares totales: De cada experiencia en Erlenmeyer se tomaron muestras tanto al inicio como al final con el objetivo de cuantificar el consumo de azcar de cada fermentacin. Se utiliz refractmetro de mano para poder medir azcares totales en las muestras (grados Brix). Oxigenacin: Al inicio de cada corrida experimental, se midi el oxgeno disuelto (mg/L) en el medio de cultivo para luego reproducir esa concentracin de oxgeno disuelto a nivel reactor.
7. MODELADO DEL CRECIMIENTO Para cada experiencia se determinaron los parmetros de crecimiento (Mximo valor alcanzado, velocidad especfica de crecimiento y duracin de fase lag) ajustando los datos experimentales al modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al, 1990), cuya ecuacin se detalla a continuacin:
((
)))
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En esta ecuacin Y = ln (DO/DOo); DO corresponde a la densidad ptica a un tiempo t; DOo es la densidad ptica a tiempo inicial. A= ln (DOmax /DOo); DOmax representa el mximo valor de crecimiento alcanzado expresado en densidad ptica. La variable l corresponde a la duracin de la fase lag (h) y es la velocidad mxima de crecimiento (h-1).
Los datos correspondientes a cada experiencia fueron ajustados mediante una estimacin no lineal minimizando la suma de las desviaciones al cuadrado de los valores observados de la variable dependiente respecto a los predichos por el modelo. Los clculos fueron realizados utilizando el paquete estadstico STATISTICA 7.0.
8. ANLISIS ESTADSTICO: SUPERFICIE DE RESPUESTA Para analizar los resultados del diseo experimental, se utiliz la metodologa de Superficie de Respuesta (MSR). La duracin de la fase lag (l), velocidad especfica () y el valor mximo (A) obtenidos en cada corrida del diseo experimental fueron ajustados a una superficie de respuesta que posee la siguiente forma:
Donde Y es la variable predicha por el modelo; xi y xj son las variables codificadas influyentes en la respuesta; coeficientes de regresin lineal; es el coeficiente del trmino independiente; son los coeficientes de regresin cuadrticos y son los son los
coeficientes que explican la interaccin entre dos variables. Los coeficientes significativos pueden ser interpretados como el incremento o disminucin de la variable de respuesta cuando la variable dependiente cambia una unidad y se evidencian estadsticamente cuando p < 0,05.
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9. PRODUCCIN DE BIOMASA EN REACTOR DE 20 L: Una vez establecida la condicin ptima a escala Erlenmeyer, se procedi a reproducir dicha condicin en un reactor batch de 20 litros. 9.1 Preparacin del inculo: A continuacin se detallan los pasos seguidos para inocular el reactor: Se realiz un inculo inicial de 105 clulas por mL en dos Erlenmeyers de 250 mL con 100 mL de medio fresco de melaza con urea a temperatura y rpm establecidas en la optimizacin. Durante la fase exponencial de dichos cultivos, se inocul su contenido en dos Erlenmeyers de 2 L con 900mL de medio fresco. Cuando los cultivos de 1000 mL alcanzaron su fase exponencial, se inocul su contenido en el reactor, previamente esterilizado con 18 litros de medio. 9.2 Condiciones de cultivo en el reactor: La temperatura de cultivo en el reactor y composicin qumica del medio de cultivo se determin de acuerdo a las caractersticas propuestas por el modelado para obtener altos valores de biomasa. Para lograr reproducir la oxigenacin obtenida con las diferentes rpm en los agitadores orbitales para la escala Erlenmeyer, se cuantific el oxgeno disuelto a las distintas velocidades de agitacin. Con estos datos, cuando se escal el cultivo al reactor se igualaron los mg/L de oxgeno disuelto del reactor ajustando las rpm del motor a la condicin ptima para la produccin de biomasa obtenida en los Erlenmeyers Debido a la formacin de espuma a altas velocidades de agitacin (rpm mayores a 200), fue necesario utilizar un antiespumante para evitar su formacin. Se agregaron aproximadamente 2 mL de un antiespumante industrial. 9.3 Curva de crecimiento: Se tomaron muestras del reactor cada 24 hs aproximadamente, en las que se midi densidad ptica a 640 nm en espectrofotmetro. El cultivo se detuvo al detectar inicio de fase estacionaria. Tambin se cuantific en las muestras el contenido de azcar (grados Brix) a lo largo del cultivo utilizando un refractmetro de mano.
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9.4 Obtencin de la biomasa: El medio de cultivo fue centrifugado durante 10 minutos y 5000 rpm a 4C para separar la biomasa del medio. Se realiz un centrifugado inicial y 3 lavados con agua estril utilizando tubos de 250 mL previamente esterilizados. La biomasa obtenida fue utilizada para preparar una solucin concentrada de 1 litro que fue almacenada en heladera a 4C. 9.5 Cuantificacin de la biomasa obtenida: La biomasa seca fue determinada por la tcnica gravimtrica. Se tomaron muestras de 5 mL de solucin que fueron colocadas en estufa a 70 C hasta obtener un peso constante, que permiti obtener su peso seco y calcular la produccin obtenida (gramos de levadura seca / litro de medio). Adicionalmente se realiz un recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando mtodo de diluciones seriadas.
9.6 Detalles del reactor: A continuacin se enumeran los elementos bsicos del reactor (ANEXO II):
Cuerpo: Recipiente de acero inoxidable que contiene el cultivo y constituye la barrera fsica entre el ambiente externo y el microorganismo de estudio.
Aireador: El aire inyectado por el extremo superior del tanque ingresa hasta el fondo del mismo y es distribuido por una corona compuesta por mltiples orificios que esparcen el aire en forma de burbujas de manera uniforme sobre toda la seccin. Para este trabajo se dispone de un aireador de pecera que bombea el gas hacia el interior del recipiente y un filtro para mantener la condicin de esterilidad del cultivo.
Agitador: Distribuye las clulas de manera uniforme en todo el reactor evitando su sedimentacin. Permite que las burbujas de aire que ingresan al sistema se distribuyan y difundan hacia el medio de cultivo. El sistema de agitacin est formado por un rotor que distribuye el aire dentro del sistema, un motor elctrico que aporta la potencia necesaria y un eje trasmisor que trasmite la potencia del motor hacia el agitador. La velocidad de agitacin es controlada mediante una caja reguladora
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conectada con el motor. Para mejorar la eficiencia de la agitacin se dispone de placas deflectoras en el interior del cuerpo del reactor con el objetivo de generar una mayor turbulencia que favorezca la difusin del oxgeno hacia el seno del lquido.
Antiespumante: La espuma producida por desnaturalizacin de las protenas reduce la superficie de contacto del oxgeno con la levadura, disminuyendo el crecimiento de las mismas. Adems puede volcar parte del contenido del reactor a travs de la salida de aire y causar la eliminacin del cultivo al medio externo. Los antiespumantes son tensioactivos que reducen la tensin superficial de la espuma y la dispersa. Su eficacia vara en funcin de las condiciones de la fermentacin, composicin del medio, cepa etapa de crecimiento y configuracin de la va de aireacin del reactor (Arvalo, 1998).
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RESULTADOS Con el fin de mejorar la produccin de biomasa de la levadura antagonista se buscaron las condiciones ptimas de crecimiento en un volumen pequeo y posteriormente se realiz el cambio de escala de la mejor condicin establecida en un reactor de 20 L. La optimizacin se realiz aplicando un Diseo Estadstico Experimental. Se eligi un diseo central compuesto centrado en las caras (DFCC) para evaluar diferentes concentraciones de melaza, temperaturas de cultivo, niveles de agitacin y diferentes concentraciones de nitrgeno. Luego de la determinacin de los parmetros de crecimiento de la levadura C. victoriae en las 18 condiciones obtenidas por DEE, se concluy que existe una influencia predominante de la temperatura y de la fuente de carbono en el crecimiento de la levadura. Los resultados fueron ajustados a una superficie de respuesta obtenindose una regresin polinomial de las variables significativas que permiten explicar el crecimiento de biomasa para la pequea escala. La condicin ptima obtenida a pequea escala se reprodujo en reactor de 20 litros cuyos resultados fueron comparados a modo de determinar la desviacin existente entre la produccin a diferentes escalas. Dado que para poder escalar el factor de la agitacin es necesario encontrar una forma de relacionar las rpm del agitador orbital (escala pequea) con las del reactor (escala mayor) se procedi a cuantificar el oxgeno disuelto en los medios de cultivos al tiempo inicial de la curva de crecimiento. El oxgeno disuelto fue cuantificado a escala Erlenmeyer para los diferentes medios
propuestos y condiciones de agitacin propuestas por el diseo. Se puede observar que a medida que aumenta la agitacin y disminuye la concentracin de medio, la cantidad de oxgeno disuelto es mayor (Tabla 6).
Tabla 6: Oxgeno disuelto en funcin de concentracin de melaza y velocidad de agitacin. Oxgeno disuelto (mg/L) melaza (g/100mL) 0 rpm 120 rpm 150 rpm 180rpm 6,40 4,51 7,65 7,00 8,05 12,80 2,68 4,60 5,84 6,80 19,20 2,32 3,01 4,52 6,80
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1. MODELADO DEL CRECIMIENTO Los parmetros de crecimiento obtenidos para las diferentes corridas experimentales son mostrados en Tabla 7 y el detalle de datos de cada condicin se muestra en el ANEXO I. Tabla 7: Parmetros obtenidos del crecimiento de C. victoriae. Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 urea (g/L) 1 1 1 0,2 1 0,2 0,2 0,2 0,6 0,2 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 melaza (% ) 19,2 19,2 6,4 19,2 6,4 6,4 19,2 6,4 12,8 12,8 12,8 6,4 19,2 12,8 12,8 12,8 12,8 12,8 T (C) 27 13 27 13 13 27 27 13 20 20 20 20 20 13 27 20 20 20
Agitacin
Parmetros* A 0,927 1,897 2,605 2,701 3,979 2,195 1,974 3,256 1,915 2,314 1,666 2,941 0,946 2,098 2,001 1,348 2,267 2,345 0,022 0,027 0,074 0,029 0,068 0,040 0,028 0,047 0,034 0,033 0,035 0,096 0,041 0,033 0,019 0,033 0,041 0,031 l 48,11 34,92 21,43 29,28 19,19 24,59 56,32 22,19 32,53 33,24 33,66 14,31 18,73 44,33 29,64 34,52 19,30 16,57
(rpm) 120 120 180 180 180 120 180 120 150 150 150 150 150 150 150 120 180 150
Consumo Azcar (%)
16,32 6,25 7,14 23,44 16,67 42,86 89,47 33,33 14,55 22,73 25,00 25,00 12,50 18,18 63,64 18,18 14,05 33,10
*Velocidad especfica de crecimiento (), Mximo valor alcanzado de la curva de crecimiento (A) y fase lag (l) de las curvas de crecimiento modeladas por Gompertz.
Se obtuvieron resultados de fase lag (l) que oscilan entre las 14,31 y 56,32 horas. Con respecto a las velocidades especficas (), estas varan desde 0,019 y 0,096 h -1 mientras que los valores mximos alcanzados de A se encuentran entre 0,927 y 3,979. El consumo de azcares en porcentaje vara entre 6% a 89% para las distintas experiencias (Tabla 7). Se determin el rendimiento de nutriente en clulas (Yx/s) que relaciona el cociente entre la biomasa obtenida (X) y el sustrato consumido (S) (Tabla 8). Los mayores rendimientos obtenidos (0,35 y 0,33) corresponden a las experiencias 5 y 8. Como se observa ms adelante en esta seccin, las condiciones de temperatura y concentracin de melaza corresponden a la condicin ptima obtenida utilizando el diseo experimental.
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Tabla 8: Coeficiente de rendimiento (Yx/s ) para el crecimiento de C. victoriae. Experiencia Biomasa X Consumo sustrato S Yx/s (g/L) (Bx) 1 2,42 3,1 0,08 2 2,72 1,0 0,28 3 4,13 2,0 0,21 4 4,98 3,8 0,14 6,90 2,0 5 0,35 6 2,85 3,0 0,10 7 5,50 17,0 0,03 6,50 2,0 8 0,33 9 3,39 1,6 0,22 10 4,33 2,5 0,18 11 2,94 2,8 0,11 12 3,47 1,5 0,24 13 2,27 2,0 0,12 14 3,69 2,0 0,19 15 6,00 7,0 0,09 16 2,52 2,0 0,13 17 4,00 2,0 0,21 18 3,88 1,9 0,21
2. SUPERFICIE DE RESPUESTA El modelado de las curvas experimentales fue analizado mediante el DCC centrado en las caras. En el caso del parmetro , puede observarse la existencia de 2 factores con una influencia significativa en la respuesta (p <0,05). Estos factores corresponden a la temperatura, que present un efecto lineal y decreciente; y la concentracin de melaza, con efecto lineal decreciente y cuadrtico descendiente (Tabla 9). Si bien el p valor para la temperatura (0,052) es mayor a 0,05 se considera como significativo para los fines de este trabajo. No se observa influencia significativa para la concentracin de urea y velocidad de agitacin (rpm), as como tambin para la interaccin entre los factores. El coeficiente de determinacin (R2) para la velocidad especfica de crecimiento fue de 0,978 indicando que un 97,8% de la variabilidad de la respuesta puede explicarse por el modelo (Figura 8).
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Tesis de grado
Tabla 9: Efectos estimados para parmetro de las curvas de crecimiento. Coeff. Std.Err. 0,0025 0,0044 0,0039 0,0044 0,0039 0,0020 0,0039 0,0044 0,0039 0,0049 0,0022 0,0049 0,0022 0,0049 0,0022 p 0,0007 0,8502 0,3727 0,0207 0,0100 0,4038 0,0520 0,4291 0,8495 0,4717 0,6393 0,4555 0,7689 0,3891 0,4092 -95,% 0,029 -0,013 -0,016 -0,034 0,010 -0,008 -0,025 -0,010 -0,013 -0,020 -0,006 -0,020 -0,008 -0,020 -0,005 +95,% 0,044 0,015 0,008 -0,006 0,035 0,004 0,000 0,018 0,012 0,012 0,008 0,011 0,006 0,011 0,009
Mean/Interc. 0,0366 (1)urea (g/l)(L) 0,0009 urea (g/l)(Q) -0,0041 (2)melaza (g/100mL)(L) -0,0196 melaza (g/100mL)(Q) 0,0227 (3)T(C)(L) -0,0019 T(C)(Q) -0,0122 (4)rpm (L) 0,0040 rpm (Q) -0,0008 1L by 2L -0,0040 1L by 3L 0,0011 1L by 4L -0,0042 2L by 3L -0,0007 2L by 4L -0,0049 3L by 4L 0,0021 L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.
Valores observados vs predichos P armetro:

0,11 0,10 0,09
Valores predichos
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
Valores observados
Figura 8: Valores observados vs valores predichos por el modelo para . R2 = 0,978. Para el parmetro A (mximo valor alcanzado de la curva de crecimiento) se observ la existencia de 2 factores con una influencia significativa en la respuesta (p <0,05). Estos factores corresponden a temperatura, que present un efecto lineal y decreciente; y a la
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Tesis de grado
melaza, con efecto lineal decreciente (Tabla 10). Si bien el p valor para la temperatura (0,053) es mayor a 0,05, se considera como significativo para los fines de este trabajo. No se observa influencia significativa para la concentracin de urea y velocidad de agitacin (rpm), as como tambin para la interaccin entre los factores. El coeficiente de determinacin (R2) para el valor mximo de crecimiento A fue de 0,945 indicando que un 94,5% de la variabilidad de la respuesta puede explicarse por el modelo (Figura 9). Tabla 10: Efectos estimados para el parmetro A de las curvas de crecimiento de C. victoriae. A Coeff. Std.Err. p -95,% +95,% Mean/Interc. 1,933 (1)urea (g/l)(L) -0,324 urea (g/l)(Q) 0,123 (2)melaza (g/100mL)(L) -1,166 melaza (g/100mL)(Q) 0,246 (3)T(C)(L) -0,423 T(C)(Q) 0,183 (4)rpm (L) 0,460 rpm (Q) -0,059 1L by 2L 0,087 1L by 3L -0,069 1L by 4L -0,599 2L by 3L 0,092 2L by 4L -0,234 3L by 4L -0,009 L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.
4,5 4,0 3,5
0,173 0,305 0,271 0,305 0,271 0,136 0,271 0,305 0,271 0,341 0,152 0,341 0,152 0,341 0,152
0,002 0,366 0,680 0,031 0,432 0,053 0,549 0,229 0,842 0,816 0,680 0,177 0,588 0,541 0,958
1,383 -1,294 -0,740 -2,136 -0,618 -0,857 -0,681 -0,511 -0,923 -0,998 -0,554 -1,684 -0,393 -1,319 -0,494
2,482 0,646 0,987 -0,196 1,109 0,011 1,046 1,430 0,804 1,171 0,416 0,485 0,577 0,850 0,476
Valores observados vs Predichos Parametro A
3,0 Valores predichos 2,5 2,0 1,5 1,0
0,5 0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Valores observados
Figura. 9: Valores observados vs valores predichos por el modelo para A. R2 = 0,945.

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Tesis de grado
En cuanto al parmetro fase lag (l) de las curvas de crecimiento no se hall influencia significativa para ninguno de los factores analizados (Tabla 11). El p valor fue mayor a 0,05 en todos los casos y el coeficiente de determinacin (R2) para la fase lag fue de 0,823 (Figura 10). Tabla 11: Efectos estimados para el parmetro lag de las curvas de crecimiento. lag Coeff. Std.Err. p -95,% Mean/Interc. 26,27 4,65 0,011 11,47 (1)urea (g/l)(L) 0,21 8,21 0,981 -25,91 urea (g/l)(Q) 6,61 7,31 0,432 -16,65 (2)melaza (g/100mL)(L) 2,84 8,21 0,752 -23,29 melaza (g/100mL)(Q) -10,95 7,31 0,231 -34,21 (3)T(C)(L) 3,02 3,67 0,471 -8,66 T(C)(Q) 10,15 7,31 0,259 -13,11 (4)rpm (L) -7,61 8,21 0,422 -33,74 rpm (Q) 0,07 7,31 0,993 -23,19 1L by 2L -7,16 9,18 0,492 -36,37 1L by 3L -1,75 4,10 0,699 -14,81 1L by 4L -7,31 9,18 0,484 -36,52 2L by 3L 4,45 4,10 0,358 -8,61 2L by 4L 1,30 9,18 0,896 -27,91 3L by 4L 1,71 4,10 0,705 -11,35 L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.
+95,% 41,06 26,34 29,87 28,97 12,31 14,70 33,41 18,51 23,33 22,05 11,31 21,90 17,51 30,51 14,78
Valores observados vs. Valores predichos Parmetro Lag

60 55 50 45
Valores predic hos
40 35 30 25 20 15 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Valores observados
Figura 10: Valores observados vs valores predichos por el modelo para fase lag. R2 = 0,945.
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Tesis de grado
2.1 MODELOS: Teniendo en cuenta los factores significativos mencionados anteriormente, se presentan las ecuaciones que describen el crecimiento de la levadura, tanto para la velocidad especfica como para el mximo valor alcanzado:
En dichas ecuaciones x1 y x2 corresponden a la concentracin de melaza y a la temperatura en forma codificada respectivamente. Los valores mximos alcanzados as como tambin las mayores velocidades especficas se obtienen en los niveles ms bajos de temperatura y concentracin de melaza como puede observarse en las superficies y curvas de nivel correspondientes (Figura 11, 12, 13 y 14)
4 3,5 3 2,5 A 2 1,5 1 0,5 0 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 1 -1
3,5-4 3-3,5 2,5-3 2-2,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1 0-0,5
-0,8 -0,2 Niveles de 0,4 Melaza
Niveles de Temperatura
Figura 11: Superficie de Respuesta para A en funcin de temperatura y concentracin de melaza codificadas
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Tesis de grado
-1 -0,8 Niveles de Melaza -0,6

3-4 2-3 1-2 0-1
-0,4
-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -0,2 -0,4 -0,6 Niveles de Temperatura -0,8 0,8 0,6 0,4 0,2 -1
Figura. 12: Curva de nivel para A en funcin de temperatura y concentracin de melaza codificadas
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1 1 0,3 Niveles de Melaza -0,4
0,07-0,08 0,06-0,07 0,05-0,06 0,04-0,05 0,03-0,04 0,02-0,03 0,01-0,02 0-0,01
Niveles de Temperatura
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Tesis de grado
Figura. 13: Superficie de Respuesta para en funcin de temperatura y concentracin de melaza codificadas
-1 -0,8 Niveles de melaza -0,6 -0,4 -0,2 0,04-0,06 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0,02-0,04 0-0,02
0,06-0,08
1
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1 Niveles de Temperatura
Figura. 14: Curva de nivel para A en funcin de temperatura y concentracin de melaza codificadas.
3. PRODUCCIN DE BIOMASA A NIVEL REACTOR: En la etapa final del trabajo, se reprodujeron en el reactor de 20 L las condiciones ptimas obtenidas mediante anlisis estadstico a escala Erlenmeyer. Las condiciones
seleccionadas fueron: temperatura 13C, concentracin de melaza 6,4 %, urea 0,2 g/L y oxgeno disuelto 7,65 mg/L. Para reproducir la oxigenacin en la condicin ptima obtenida en escala Erlenmeyer (7,65 mg/L), se midi el oxgeno disuelto en el medio de cultivo seleccionado dentro del reactor a distintas velocidades de agitacin. Para cada velocidad de agitacin se tomaron medidas tanto en aireacin baja como en alta (Tabla 12).
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Tesis de grado
Tabla 12: Oxgeno disuelto en funcin de la velocidad de agitacin y aireacin. rpm 50 70 120 160 190 260 270 Oxgeno disuelto (mg/mL) Baja Alta 1,42 1,83 2,26 3,58 3,4 5,34 5 7,38 7 8,46 7,9 espuma 8,02
En ambos casos se observa una tendencia lineal de aumento en la oxigenacin respecto a la velocidad de agitacin (Figura 15). Tambin se observa mayor oxigenacin cuanto mayor es la aireacin (modo High). Sin embargo a elevadas rpm, se observ la formacin de espuma en el medio de cultivo. Se decidi emplear para el reactor a una velocidad de 200 rpm y aireacin baja.
a- Baja
8
ox dis (mg/l)
ox dis (mg/l)
b- Alta
10
y = 0,0456x - 0,0675 R = 0,9864
6 4
y = 0,0372x - 0,5687 R = 0,9643
8 6 4
2
0 0 50 100 RPM 150 200
2
0 0 50 100
RPM
150
200
Figura 15: Oxgeno disuelto (mg/mL) en funcin de velocidad de agitacin (rpm). a- Aireacin baja. b- Aireacin alta.
3.1 Curvas de crecimiento en reactor: La condicin de crecimiento que se obtuvo a partir del proceso de optimizacin fue reproducida (escalada) en un reactor de 20L en dos ensayos. Los parmetros obtenidos fueron promediados para construir la curva de crecimiento as como tambin la curva de
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Tesis de grado
consumo de azcar (Figura 16). En Tabla 13 se muestran los resultados obtenidos para cada produccin. Los parmetros de crecimiento fueron en promedio: Velocidad especfica () 0,148 h-1, Valor mximo (A) 2,307 y fase lag 11,65 h.
3 2,5 2 Y 1,5 1 Y Conc. De azcar 6 5 4 b r 3 i x 2
0,5
0 0 50 100 t (hs)
1
0
150
200
Figura. 16: Curva de crecimiento modelada para C. victoriae y su respectivo consumo de azcar.
Tabla 13: Produccin de biomasa en reactor de 20 L Parmetros A (h-1) lag (h) Biomasa (g/L) Viabilidad (UFC/mL) 1er PRODUCCN 2,337 0,045 5,238 5,067 3,2.107 2da PRODUCCIN 2,277 0,250 17,873 5,945 2,1.107 PROMEDIO 2,307 0,148 11,555 5,506 2,65.107
Los parmetros obtenidos fueron comparados con aquellos determinados en escala Erlenmeyer para la experiencia 8 que fue la seleccionada (Tabla 14). Se observa una mayor velocidad especfica de crecimiento promedio (0,148 h-1) y una menor duracin de la fase lag (11,55 hs.). Si bien los rdenes de magnitud se corresponden, el valor mximo alcanzado (2,307) y biomasa obtenida (5,506 g/L) fueron menores a los del modelo en escala Erlenmeyer. El rendimiento Yx/s es similar en ambos casos (del orden del 30%) as como tambin la productividad volumtrica Qx.
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Tesis de grado
Tabla 14: Parmetros de crecimiento en las dos escalas evaluadas. ERLENMEYER REACTOR Parmetros A Lag Biomasa (g/L) Consumo Azcar (%) Yx/s Qx (g L h )
-1 -1
100mL 3,256 0,047 22,194 6,500 33% 0,34 0,043
20L 2,307 0,148 11,555 5,506 36% 0,28 0,045
Yx/s (rendimiento de nutriente en culas); Qx (productividad volumtrica de biomasa)
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Tesis de grado
DISCUSIN
Se realiz un trabajo de optimizacin en pequea escala para la levadura Cryptoccocus victoriae aislada de cmaras frigorficas de la regin, con el objetivo de su posterior uso como agente de biocontrol. Luego de su optimizacin, se reprodujo dicha condicin a mayor escala con xito, ya que se obtuvieron valores comparables de biomasa en ambos casos.
De acuerdo a los resultados obtenidos en el diseo experimental se observa que el valor mximo alcanzado de biomasa (A) y la velocidad especfica de crecimiento () dependen inversamente de la temperatura y la concentracin de melaza. Debido a que la levadura fue aislada de cmaras frigorficas, resulta lgico que a temperaturas menores, mejore su crecimiento.
La biomasa obtenida en este trabajo mediante la optimizacin en frasco pequeo fue de 6,5 g/L, duplicando la biomasa que se obtena en las condiciones sin optimizar que se empleaban anteriormente (Sangorrn et al, 2012). El orden de magnitud de la biomasa en este trabajo es similar a la observada en la optimizacin de otras levaduras, aunque estos valores dependen de la especie de levadura evaluada. Daz et al, (2005) para Pichia onychis reportan una biomasa seca de 6,3 g/L en cultivos de 25 mL. Por otro lado para la levadura Rhodosporidium paludigenum en optimizaciones realizadas en volmenes de 50 mL la mxima biomasa fue de 16 g/L (Wang et al, 2011). La concentracin obtenida de la levadura C. victoriae NPCC 1263 fue de 2,75x107 UFC/mL en el reactor de 20L, cuyo peso seco fue de 5,5 g/L. Respecto al cambio de escala en el reactor, la produccin de biomasa obtenida (5,5 g) se corresponde con la obtenida en pequea escala aunque existe una desviacin negativa de aproximadamente 15% respecto a la
produccin en pequea escala (6,5g). Sin embargo en el reactor se observan velocidades especficas de crecimiento mayores que las obtenidas en pequea escala. La biomasa obtenida es menor a los valores obtenidos en trabajos similares con reactores que emplearon melaza de caa. En el caso de R. paludigenum, en 6L de cultivo se obtuvo 19 g/L de biomasa (Wang et al, 2011) y con Candida sake 8 108 UFC/mL en 5 L de cultivo (Abadas et al, 2003).
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Tesis de grado
Se obtuvieron valores similares de consumo de azcares totales (34%), de rendimiento (Yx/s= 0,3) y de productividad (Qx= 0,04 g L-1h-1) tanto en pequea como en mayor escala. Los valores de Yx/s se encuentran levemente por debajo de los valores recomendados en bibliografa (0,40-0,85 g/g; Ward 1989; Acevedo et. al, 2002). La productividad obtenida fue menor a los valores tericos definidos para levaduras en general en de reactor (5,2 g L-1h-1; Ward 1989). Esto puede deberse a los elevados tiempos de crecimiento de Cryptoccocus victoriae, ya que requiere 130 h para llegar a la fase estacionaria. Pelinsky et al, (2012) obtuvo para Lachancea thermotolerans un rendimiento mximo Yx/s= 0,2 y Qx entre 0,8 y 1 g L-1 h-1 tanto en bioreactor como en frascos.
Si bien este mtodo sirvi para mejorar las condiciones de crecimiento y lograr una mayor cantidad de biomasa, el ptimo se encuentra ubicado en uno de los extremos del dominio experimental. Por lo tanto es posible que la condicin ptima se encuentre a una temperatura y concentracin de melaza an menor, ya que la tendencia de las correlaciones no muestran un mximo en el rango de temperaturas (27C a 13C) y concentraciones evaluadas (16,2% a 6,4%). Se sugiere redefinir el dominio experimental hacia valores menores de temperatura y concentracin de melaza, as como tambin extender el dominio respecto a la concentracin de urea y agitacin de modo que pueda percibirse algn efecto en dichos factores. En trabajos futuros podra mejorar el Yx/s y la Qx al encontrar un nuevo ptimo de produccin de biomasa.
La formacin de espuma en la escala de reactor a elevada velocidad de agitacin hizo que fuera necesario agregar un antiespumante. Por lo tanto tambin ser necesario incluir el efecto de dicha variable a las corridas experimentales en un futuro.
Debido a la limitacin en cuanto al tiempo y recursos disponibles, se opt por un diseo compacto centrado en las caras. De esta manera, se logr una aproximacin al ptimo con un menor nmero de corridas experimentales y utilizando nicamente 3 niveles de cada factor. Si bien se sacrific exactitud en el clculo de los coeficientes de interaccin, se ahorr un importante tiempo y cantidad de recursos respecto al diseo central estndar. Para obtener un modelo ms exacto, con rotabilidad y detectar la influencia de algn factor no detectado en el
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Tesis de grado
presente trabajo, se propone utilizar un modelo central compuesto circunscripto estndar (no compacto) trabajando en 5 niveles de cada factor y aumentando el nmero de ensayos.
Luego de la optimizacin, deber evaluarse la viabilidad y actividad antagnica de la levadura en heridas, as como tambin se deber probar diferentes metodologas de formulacin (lquida o liofilizada), para obtener un producto que mantenga o mejore la efectividad del ACB, facilitando su manejo y aplicacin. Tomando como base el medio optimizado, se debern evaluar en un futuro diferentes condiciones de cultivo, de tal forma que se obtengan levaduras pre-adaptadas a las posteriores condiciones de stress, capaces de sobrevivir en mayor grado a la liofilizacin y/o al stress oxidativo de colonizar las heridas de las frutas a proteger (Teixid et al, 2011).
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Tesis de grado
CONCLUSIONES Se optimiz la produccin de la levadura Cryptoccocus victoriae en pequea escala para el dominio de los factores propuestos utilizando diseo estadstico. La condicin ptima para el medio de cultivo es de 13 C, 6,4 g/L de melaza, 150 rpm, y 0,2 g/L de urea. Quedaron sentadas las bases para una posterior optimizacin que ample el rango o dominio de experimentacin orientado hacia menores valores de temperatura y concentraciones de melaza as como tambin la inclusin del efecto del antiespumante. Se realiz con xito la produccin de biomasa de la condicin ptima en reactor de 20L obtenindose valores semejantes a la pequea escala. Si bien la biomasa obtenida fue menor en un 15% a la obtenida en pequea escala, se observ una mayor velocidad especfica de crecimiento. El coeficiente de rendimiento (Ys/x) y
productividad (Qx) fueron aproximadamente iguales en ambas escalas. Los valores obtenidos de biomasa seca y viabilidad (UFC/ml) son comparables con resultados obtenidos en otros trabajos para otras especies de levadura en melaza de caa de azcar (Daz et al, 2005; Wang et al, 2011; Abadas et al, 2003).
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Tesis de grado
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Tesis de grado
ANEXO I: A continuacin se detallan los parmetros de crecimiento obtenidos para las diferentes curvas de crecimiento de la levadura C. victoriae NPCC 1263 (corridas experimentales) en pequea escala utilizando el modelo de Gompertz Modificado. Tabla 1a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 1 FECHA 02/11/2012 05/11/2012 05/11/2012 06/11/2012 06/11/2012 07/11/2012 07/11/2012 HORA 16 10 17 10 16 10 15 t 0 66 73 90 96 114 120 DO 4,14 6,00 7,30 8,95 9,08 10,30 10,20 Y=ln (DO/DOo) 0,00 0,37 0,57 0,77 0,79 0,91 0,90
Tabla 1b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N1. R2= 0,99. Parmetro A M L Estimado 0,92732 0,02189 48,11187 Error estndar 0,032553 0,003197 3,367482 Nivel p 0,00001 0,00238 0,00014 Conf (95%) 0,837 0,013 38,762 Conf (+95%) 1,0177 0,0308 57,4615
EXPERIENCIA N 1
1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0 -0,20 50 100 t (hs) 150 200
Figura 1: Curva de crecimiento para Exp. N 1.

- 50 -
Tesis de grado
Tabla 2a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 2 FECHA 18/09/2012 19/09/2012 20/09/2012 21/09/2012 21/09/2012 22/09/2012 22/09/2012 HORA 12 16 16,3 10 16,3 9 15 t (hs) 0 16 40,5 58,5 65 82 88 DO 3,285 3,35 4,11 6,04 7,23 11,7 11,8 Y=ln (DO/DOo) 0,000 0,020 0,224 0,609 0,789 1,270 1,279
Tabla 2b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N2. R2= 0,99. Parmetro A M L Estimado 1,89713 0,02658 34,91736 Error estndar Nivel p 0,299118 0,002024 2,086892 0,00317 0,00019 0,00007 Conf (-95%) 1,06664 0,02097 29,12321 Conf (+95%) 2,727 0,032 40,71
Experiencia N2
2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0 50 100 t (hs) 150 200
- 51 -
Tesis de grado
Tabla 3a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 3 FECHA 06/11/2012 07/11/2012 08/11/2012 09/11/2012 09/11/2012 10/11/2012 11/11/2012 12/11/2012 HORA 12 10 8 9 17 17 10 10 t 0 22 44 69 77 101 118 142 DO 1,51 1,8 7,78 18,1 17 17,4 19,1 26 Y=ln (DO/DOo) 0 0,175677014 1,639446687 2,483802287 2,421103693 2,444360555 2,537578684 2,845986887
Experieincia N 3
3 2,5 2 1,5
y
1
0,5
0 -0,5 0 50 t (hs) 100 150
- 52 -
Tesis de grado
Tabla 4a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 4 FECHA 29/08/2012 29/08/2012 30/08/2012 30/08/2012 31/08/2012 31/08/2012 01/09/2012 03/09/2012 04/09/2012 05/09/2012 06/09/2012 HORA 11 17.30 9 17.30 9.30 16.30 18 13 9 9 8.30 t 0 6,5 16,5 25 41 48 73,5 116,5 136,5 160,5 184 DO 2,835 3,26 3,095 3,05 3,745 5,09 11,6 23,1 28 40 40,1 Y=ln (DO/DOo) 0 0,139685258 0,087745969 0,073099653 0,27837968 0,585235893 1,408963161 2,09779068 2,290162573 2,646837517 2,649334397
Tabla 4b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N4. R2= 0,99. Parmetro A M L Estimado 2,70120 0,02905 29,27734 Error estndar 0,103271 0,002722 3,356469 Nivel p 0,00000 0,00001 0,00002 Conf (-95%) 2,4630536 0,02277791 21,5373094 Conf (+95%) 2,93934085 0,03533011 37,0173743
Experiencia N 4
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 t (hs) 150 200 250

- 53 -
Tesis de grado
Tabla 5a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 5 FECHA 29/08/2012 29/08/2012 30/08/2012 30/08/2012 31/08/2012 31/08/2012 01/09/2012 03/09/2012 04/09/2012 05/09/2012 06/09/2012 HORA 11 17.30 9 17.30 9.30 16.30 18 13 9 9 8.30 t 0 6,5 16,5 25 41 48 73,5 116,5 136,5 160,5 184 DO 0,99 1,275 1,245 1,4 4,37 7,64 23 46 43,7 58,9 55,3 Y=ln (DO/DOo) 0 0,252996514 0,229185866 0,346522572 1,484813345 2,043447939 3,145544552 3,838691732 3,787398438 4,085891427 4,022823244
E5
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 t (hs) 150 200

- 54 -
Tesis de grado
Tabla 6a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 6 FECHA 02/11/2012 05/11/2012 05/11/2012 06/11/2012 06/11/2012 07/11/2012 07/11/2012 HORA 16 10 17 10 16 10 15 t 0 66 73 90 96 114 120 DO 1,28 6 7,3 9,1 9,75 10,91 10,84 Y=ln (DO/DOo) 0 1,544899391 1,74101427 1,961414336 2,030407207 2,142819722 2,136382918
Experiencia N 6
2,5 2 1,5
Y
1 0,5 0 0 50 100 t(hs) 150 200
- 55 -
Tesis de grado
Tabla 7a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 7 FECHA 06/11/2012 07/11/2012 08/11/2012 09/11/2012 09/11/2012 10/11/2012 11/11/2012 12/11/2012 13/12/2012 HORA 12 10 8 9 17 17 10 10 8 t 0 22 44 69 77 101 118 142 164 20 21,8 32,3 37,5 1,341320995 1,427498692 1,820655952 1,969929655 DO 5,23 5,58 6,51 6,98 Y=ln (DO/DOo) 0 0,064777498 0,218928178 0,288637639
Experiencia N 7
2,5 2 1,5
Y
1 0,5
0
0 50 100 t (hs) 150 200

- 56 -
Tesis de grado
Tabla 8a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 8 FECHA 18/12/2012 19/12/2012 19/12/2012 19/12/2012 20/12/2012 20/12/2012 21/12/2012 22/12/2012 23/12/2012 24/12/2012 25/12/2012 26/12/2012 27/12/2012 HORA 16:30 10:00 13:30 17:00 10:30 16:00 10:00 10:00 09:00 11:00 10:00 11:00 10:00 t 0 16,5 20 23,5 41 46,5 64,5 88,5 111,5 137,5 160,5 185,5 208,5 DO 1,16 1,27 1,32 1,41 2,83 3,75 8,02 17,8 20,6 24,1 26,6 28,5 34,8 Y=ln (DO/DOo) 0 0,0905969 0,12921173 0,1951697 0,89185671 1,17333583 1,93351842 2,73077845 2,87687107 3,03379184 3,13249121 3,20148408 3,40119738
Tabla 8b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N8. R2= 0,99.
Parmetro A M L
Estimado 3,25596 0,04668 22,19387
Error estndar Nivel p 0,043047 0,002728 1,802568 0,000000 0,000000 0,000000
Conf (-95%) 3,16121 0,04068 18,22644
Conf (+95%) 3,35070 0,05269 26,16129
Experiencia N 8
3,5 3 2,5 2
Y
1,5 1 0,5
0
0 50 100 t (hs) 150 200 250

- 57 -
Tesis de grado
Tabla 9a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 9 FECHA 21/08/2012 22/08/2012 22/08/2012 23/08/2012 23/08/2012 24/08/2012 24/08/2012 25/08/2012 27/08/2012 27/08/2012 28/08/2012 HORA 16.30 9.30 17.30 10 17.30 9.30 16.30 14 9.30 16.30 16.30 t 0 17 25 42 49,5 65,5 72,5 94 137,5 144,5 168,5 DO 2,32 2,345 2,3 2,895 4,35 7,725 8,67 9,57 16,2 15,6 16,3 Y=ln (DO/DOo) 0 0,010718216 -0,008658063 0,221417925 0,628608659 1,202894637 1,318301605 1,41706602 1,943444057 1,905703729 1,949597922
Experiencia N 9
2,5 2 1,5
Y
1 0,5
0
0 50 100 t (hs) 150 200

- 58 -
Tesis de grado
Tabla 10a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 10 FECHA 21/08/2012 22/08/2012 22/08/2012 23/08/2012 23/08/2012 24/08/2012 24/08/2012 25/08/2012 27/08/2012 27/08/2012 28/08/2012 HORA 16.30 9.30 17.30 10 17.30 9.30 16.30 14 9.30 16.30 16.30 t 0 17 25 42 49,5 65,5 72,5 94 137,5 144,5 168,5 DO 2,47 2,39 2,365 2,95 4,61 8,37 9,38 11,33 24,4 23,7 24,15 Y=ln (DO/DOo) 0 -0,032924785 -0,043440129 0,17758702 0,624009706 1,220435734 1,334361612 1,523235924 2,290364982 2,261256898 2,280066229
Experiencia N 10
2,5 2
1,5
1 0,5 0
0
-0,5
50
100
t (hs)
150
200

- 59 -
Tesis de grado
Tabla 11a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 11 FECHA 21/08/2012 22/08/2012 22/08/2012 23/08/2012 23/08/2012 24/08/2012 24/08/2012 25/08/2012 27/08/2012 27/08/2012 28/08/2012 HORA 16.30 9.30 17.30 10 17.30 9.30 16.30 14 9.30 16.30 16.30 t 0 17 25 42 49,5 65,5 72,5 94 137,5 144,5 168,5 DO 2,315 2,465 2,47 2,785 4,22 7,505 8,165 8,24 13 12,75 12,6 Y=ln (DO/DOo) 0 0,06278212 0,064808463 0,184838186 0,600425441 1,176159778 1,260447039 1,269590656 1,72553967 1,706121584 1,694287126
Experiencia N 11
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 t (hs) 150 200

- 60 -
Tesis de grado
Tabla 12a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 12 FECHA 18/09/2012 19/09/2012 20/09/2012 21/09/2012 21/09/2012 22/09/2012 HORA 12 16 16,3 10 16,3 9 t 0 16 40,5 58,5 65 82 DO 0,96 1,28 8,97 16,8 15,6 19 Y=ln (DO/DOo) 0 0,287682072 2,234707671 2,862200881 2,788092909 2,985260974
Experiencia N 12
3,5 3 2,5 2
Y
1,5 1 0,5 0
20
40
t (hs)
60
80
100
- 61 -
Tesis de grado
Tabla 13a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 13 FECHA 18/09/2012 19/09/2012 20/09/2012 21/09/2012 21/09/2012 HORA 12 16 16,3 10 16,3 t 0 16 40,5 58,5 65 DO 3,22 3,3 6,92 8,32 8,02 Y=ln (DO/DOo) 0 0,024541109 0,76503441 0,949280895 0,912557062
Experiencia N 13
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 t (hs) 60 80 100
- 62 -
Tesis de grado
Tabla 14a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 14 FECHA 07/09/2012 10/09/2012 10/09/2012 11/09/2012 11/09/2012 12/09/2012 12/09/2012 13/09/2012 13/09/2012 14/09/2012 14/09/2012 HORA 17 11 19 10.30 18.30 9 15 9.30 16.30 10.30 16 t 0 42 49 64,5 72,5 88 94 113,5 120,5 138,5 144 DO 2,67 2,89 3,41 5,56 6,42 8,77 12,7 18,9 18,8 17,1 19,1 Y=ln (DO/DOo) 0 0,07917803 0,244633819 0,733519636 0,877339645 1,189258334 1,559523521 1,95708345 1,951778397 1,856999991 1,967609863
Experiencia N 14
2,5 2 1,5
Y
1 0,5
0
0 50 100 t (hs) 150 200

- 63 -
Tesis de grado
Tabla 15a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 15 FECHA 06/11/2012 07/11/2012 08/11/2012 09/11/2012 09/11/2012 10/11/2012 11/11/2012 12/11/2012 HORA 12 10 8 9 17 17 10 10 t 0 22 44 69 77 101 118 142 DO 2,72 3,18 6,51 8,06 11,8 30,2 36,2 42,3 Y=ln (DO/DOo) 0 0,156249316 0,872707576 1,086281676 1,467467651 2,407210044 2,588427239 2,744155206
Experiencia N 15
3,5 3 2,5 2 Y
1,5
1 0,5 0 0 50 100 t (hs) 150 200 250
- 64 -
Tesis de grado
Tabla 16a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 16 FECHA 21/08/2012 22/08/2012 22/08/2012 23/08/2012 23/08/2012 24/08/2012 24/08/2012 25/08/2012 27/08/2012 27/08/2012 28/08/2012 HORA 16.30 9.30 17.30 10 17.30 9.30 16.30 14 9.30 16.30 16.30 t 0 17 25 42 49,5 65,5 72,5 94 137,5 144,5 168,5 DO 2,4 2,275 2,435 2,89 4,225 6,41 6,97 7,88 9,74 9,4 9,25 Y=ln (DO/DOo) 0 -0,053488685 0,014478019 0,185787765 0,565550523 0,982390534 1,066146487 1,188859167 1,40077238 1,365240952 1,349154814
Tabla 16b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N16. R2= 0,99. Parmetro A M L Estimado 1,34825 0,03317 34,51968 Error estndar Nivel p 0,031874 0,003555 2,174626 1,0753E-10 1,4201E-05 2,4825E-07 Conf (-95%) 1,27474495 0,02497501 29,5049789 Conf (+95%) 1,42174611 0,04137177 39,5343726
Experiencia N 16
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2
0
0 50 100 t (hs) 150 200

- 65 -
Tesis de grado
Tabla 17a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 17 FECHA 14/08/2012 15/08/2012 15/08/2012 16/08/2012 16/08/2012 17/08/2012 17/08/2012 18/08/2012 19/08/2012 20/08/2012 21/08/2012 HORA 16 9.30 16 9.30 17.30 10 17 14 18 13 16 t 0 17,5 24 41,5 49,5 65,8 72,8 93,8 121,8 145,8 172,8 DO 2 2,3 3 4 7,15 13 12,5 17,3 17,05 18,5 20 Y=ln (DO/DOo) 0 0,139761942 0,405465108 0,693147181 1,273965176 1,871802177 1,832581464 2,157559321 2,143003023 2,224623552 2,302585093
Tabla 17b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N17. R2= 0,99. Parmetro A M L Estimado 2,26730 0,04115 19,29665 Error estndar Nivel p 0,067938 0,004561 3,166596 7,0932E-10 1,8214E-05 0,00029145 Conf (-95%) 2,11063912 0,03062812 11,9944683 Conf (+95%) 2,4239686 0,05166363 26,5988353
Experiencia N 17
2,5 2 1,5
Y
1 0,5
0
0 50 100 t (hs) 150 200

- 66 -
Tesis de grado
Tabla 18a: Medicin de densidad ptica correspondientes a experiencia N 18 FECHA 14/08/2012 15/08/2012 15/08/2012 16/08/2012 16/08/2012 17/08/2012 17/08/2012 18/08/2012 19/08/2012 20/08/2012 21/08/2012 HORA 16 9.30 16 9.30 17.30 10 17 14 18 13 16 t 0 17,5 24 41,5 49,5 65,8 72,8 93,8 121,8 145,8 172,8 DO 1,7 1,8 2 4,5 5 7,8 7,4 10,9 17,2 17,4 17 Y=ln (DO/DOo) 0 0,057158414 0,162518929 0,973449146 1,078809661 1,523495483 1,470851749 1,858134538 2,314281133 2,325841955 2,302585093
Tabla 18b: Parmetros de crecimiento correspondientes a Exp. N18. R2= 0,99. Parmetro Estimado Error estndar Nivel p Conf (-95%) Conf (+95%)
A M L
2,34523 0,03104 16,57189
0,095205 0,003609 4,185538
7,8801E-09 2,588E-05 0,00418101
2,12569006 0,02271233 6,92002002
2,56477674 0,03935827 26,2237577
Experiencia N 18
2,5 2 1,5
Y
1
0,5
0 0 50 100 t (hs) 150 200
Figura 18: Curva de crecimiento para Exp. N 1

- 67 -
Tesis de grado
ANEXO II: Se presentan fotos del reactor utilizado indicando sus partes.
Motor y eje trasmisor Filtro
Toma Muestras
Aireador
Figura 1: Vista exterior del reactor en funcionamiento.
Difusor de aire Agitador
Tapa del reactor
Entrada de aire
Figura 2: Tapa del reactor y vista interna del sistema de agitacin.

- 68 -
Tesis de grado
Bafles deflectores
Cuerpo del reactor
Figura 3: Vista interior del cuerpo con sus bafles deflectores.
- 69 -
Tesis de grado
Figura 4: Nomenclatura y razones recomendables para el diseo de un fermentador segn los criterios propuestos por Acevedo et al, 2002.
- 70 -

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE FACULTAD DE INGENIERA TESIS DE GRADO: Determinacin de la condicin ptima para la produccin de biomasa de Cryptoccocus

victoriae NPCC 1263 mediante diseo experimental.

Tesista: Carrera: Legajo: Directora: Ao: Lugar de trabajo:

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A mi familia, por haber sido un soporte fundamental a lo largo de mi carrera universitaria.

A todos aquellos que colaboraron de alguna manera en la elaboracin de este proyecto.

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DISCUSIN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA PAGINAS WEB ANEXOS I ANEXO II

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Figura 1. Cadena productiva de peras y manzanas (COFECYT, 2013).

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Figura 2: Superficie de cultivosorgnicos cosechados en Argentina.

Tabla 2: Exportacin de manzanas y peras (Tn)

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levadura en esta condicin optimizada ha

conservado o mejorando simultneamente la

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Figura 7: Curva de crecimiento en cultivo por lotes.

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Consumo Azcar (%)

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Valores observados vs predichos P armetro:

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,01

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Valores observados vs Predichos Parametro A

3,0 Valores predichos 2,5 2,0 1,5 1,0

Figura. 9: Valores observados vs valores predichos por el modelo para A. R2 = 0,945.

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Valores observados vs. Valores predichos Parmetro Lag

Valores predic hos

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3,5-4 3-3,5 2,5-3 2-2,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1 0-0,5

-0,8 -0,2 Niveles de 0,4 Melaza

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-1 -0,8 Niveles de Melaza -0,6

0,07-0,08 0,06-0,07 0,05-0,06 0,04-0,05 0,03-0,04 0,02-0,03 0,01-0,02 0-0,01