Nova Nurfauziawati

240210100003
Kelompok 11A
V. HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase
Tabung [S] A V =
A
t(s)

1/S
(x)
1/V
(y)
11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281
12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286
13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597
14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90
15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852

Hasil regresi kalkulator :
A =715,55
B =-16351,79
A =
1
Imox

715,55 =
1
Imox

Vmax =1,398x10
-3
B =
Km
Imox

-16351,79 =
Km
1,398x103

Km =-22,852



0
200
400
600
800
1000
0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033
1/V
1/S
Kurva standar untuk larutan glukosa dengan
perlakuan reagen Benedict
Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
VI. PEMBAHASAN

Invertase dikenal sebagai -fructofuranoside fructohydrolase merupakan
sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa
(gula invert). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi karbon (C) pada proses
fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk karbohidrat yang
mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al .1996).
Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan
tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak
penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir
Saccharomyces cereviceae. Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti,
dan secara komersil banyak dijual dipasaran. Khamir atau Yeast merupakan
mikroorganisme uniseluler berbentuk ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya
5-10 kali lebih besar dari bakteri. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan
temperatur 30C (Bergamasco et al. 2000).
Pada praktikum kali ini diawali dengan pemurnian enzim fruktofuranosidase
kemudian hidrolisis sukrosa dengan -enzm dan uji benedict. Langkah-langkah
yang dilakukan dalam pemurnian enzim fruktofuranosidase ialah sebanyak 0,5
gram yeast dihaluskan kemudian ditambahkan 50 ml buffer pH 4,7 kemudian
dilakukan sentrifius dan diambil filtratnya. Untuk melakukan hidrolisis sukrosa,
maka sukrosa, ditambahkan akuadest dan buffer dengan jumlah tertentu.
Kemudian campuran tersebut dipanaskan pada suhu 37
0
C selama 5 menit. Lalu
sebanyak 2 ml suspensi yeast 1% di tambahkan ke dalam campuran tersebut dan
campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37
0
C selama 6 menit. Suhu tersebut di
atur agar tidak terlalu panas, karena suhu yang terlalu panas maka
mikroorganisme penghasil enzim intervase akan mati, sehingga enzim tidak akan
diperoleh. Setelah selesai masa inkubasi, larutan tersebut ditambahkan 1 ml
NaOH 1%. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan
enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka
perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di
Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Fungsi dari penambahan
NaOH ini adalah untuk membantu proses pemecahan sukrosa.
Satu unit aktivitas enzim merupakan banyaknya mol gula pereduksi yang
dihasilkan oleh 1 ml enzim pada setiap menit (Bayramolu et al., 2003). Gula
invert merupakan campuran antara glukosa dan fruktosa yang diperoleh dari hasil
hidrolisisi sukrosa. Sukrosa bukan merupakan gula pereduksi sedangkan glukosa
dan fruktosa merupakan gula pereduksi, maka dari itu pada praktikum ini
dilakukan uji benedict. Uji benedict ini digunakan untuk membedakan gula
reduksi berdasarkan ion cupri dalam suasana alkalis dengan indicator yaitu adanya
perubahan warna khususnya menjadi merah bata, bila kadar gula reduksinya lebih
rendah maka akan tampak warna biru, hijau, merah atau merah kekuningan.
Pengujian ini berdasarkan dari reduksi Cu
2+
menjadi Cu
+
oleh karbohidrat yang
mempunyai gugus aldehid (-CHO) atau keton bebas (-CO-). Hal ini dilakukan
untuk mencegah terjadinya pengendapan CaCO
3
dalam larutan Na-karbonat pada
larutan benedict. Pereaksi kupri sulfat, natrium sitrat, dan natrium karbonat.
Monosakarida segera mereduksi senyawa-senyawa pengoksidasi seperti
ferisianida, gen peroksida, atau ion kupri (Cu
2+
). Pada reaksi seperti ini, gula
direduksi pada gugus karbonil dan senyawa pengoksidasi menjadi tereduksi.
Adapun reaksi yang berlangsung sebagai berikut.
O O

RCH +Cu
2+
2OH
-
RCOH +Cu
2
O
Gula Pereduksi Endapan Merah Bata
Adapun struktur dari glukosa dan sukrosa adalah sebagai berikut:






Gambar1. Struktur glukosa dan fruktosa

Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
Untuk melakukan uji benedict ini maka sebanyak 3 ml larutan yang
diperoleh dari hasil hidrolisis sukrosa tersebut ditambahkan 1 ml benedict
kemudian dipanaskan pada suhu 96
0
C selama 2 menit untuk memperjelas warna
yang menunjukkan adanya gula invert. Setelah dipanaskan maka larutan tersebut
didinginkan dengan hasil berupa larutan berwarna hijau. Semakin tinggi
konsentrasi gula invert maka warna hijau semakin dominan. Agar absorbansinya
dapat diukur oleh spektrofotometer maka larutan tersebut diencerkan terlebih
dahulu dengan cara menambahkan aquadest lalu dikocok sehingga warna yang
dihasilkan tidak terlalu pekat dan menjadi hijau muda. Setelah itu, larutan hasil
pengenceran dipindahkan ke dalam kuvet untuk dilakukan pengukuran
absorbansinya dengan menggunakan 630 nm.
Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase
Tabung [S] A V =
A
t(s)

1/S
(x)
1/V
(y)
11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281
12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286
13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597
14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90
15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2011

Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi atau A untuk
setiap tabung berbeda. Semakin rendah nilai S maka semakin tinggi nilai A dan
semakin tinggi pula nilai V. Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-
Menten tertentu, dimana nilai Km dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah
substrat yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan efisien. Dengan
mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi
penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat
menjadi produk. Laju reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai optimum dan
Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
berkurang saat suhunya maksimum. Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat
dengan meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982).
J ika dibuat hubungan antara laju (V) dengan konsentrasi substrat (S) maka
penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi dikarenakan
aktivitas enzim invertase semakin besar. Akan tetapi pada batas konsentrasi
tertentu tidak akan terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi
substrat diperbesar dikarenakan enzim sudah jenuh dengan substratnya. Atau
dengan kata lain tidak terdapat lagi sisi aktif enzim karena hampir semua enzim
telah membentuk kompleks enzim-substrat [ES]. Harga Vm dan Km dapat
ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk (Lehninger, 1997),
sebagai berikut:
1
I
0
=
1
I
m
+
K
m
I
m
.
1
[S]


Penentuan kinetika enzim intervase (Vmax dan Km) didasarkan pada plot
grafik hubungan antara konsentrasi enzim dan substrat (Fayyaz et al. 1995; Dinu,
2001). Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversikan menjadi 1/V dan
1/[S] seperti pada tabel 1 di atas. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang
didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver Burk, dengan cara:
Bahwa dari persamaan:
1
I
=
1
I
mox
+
K
m
I
mox
.
1
[S]
di atas, Bila
1
I
=Y dan
1
[S]
=X, maka
rumusnyadapat ditulis menjadi: Y =a +bX, sehingga: a =
1
I
mox
dan b =
K
m
I
mox

Dengan demikian, bila harga
1
I
mox
diketahuimaka nilai Vmaks didapat, begitu
pula nilai Kmakan juga didapat dari persamaan b
K
m
I
mox
.
Berdasarkan persamaan tersebut dan dengan menggunakan data yang
diperoleh dari praktikum maka diperoleh kurva standar untuk larutan glukosa
dengan perlakuan benedict sebagai berikut:
Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A

Berdasarkan kurva hubungan
1
V
dengan
1
[S]
untuk larutan glukosa dengan
perlakuan reagen benedict di atas, maka diperoleh intersep sebesar 715,55 dan
nilai slope sebesar -16351,79 sehingga diperoleh persamaan regresi Y=715,55 -
16351,79x, dengan demikian diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10
-3

mol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852. Nilai R
2
dari kurva di atas adalah
0,4794. Hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar baik karena hampir
mendekati +1 dimana titik-titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.
Aktivitas enzim invertase yang mula-mula meningkat secara signifikan
sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak signifikan setelah
konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi
enzimatisakan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan
tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap.
Pada kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat bertambah lagi
dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks) (Wiesman,
1989).
Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat kinetika
enzim lain, Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya
telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari
kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten).
Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan
tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz (1995)
menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas
enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menjadi
0
200
400
600
800
1000
0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033
1/V
1/[S]
Kurva standar untuk larutan glukosa dengan
perlakuan reagen Benedict
Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan
lingkungan dan kekuatan ion. Pada percobaan kali ini didapat Vmax mendekati
nol artinya reaksi berjalan sangat lambat. Serta didapatkan Km bernilai negatif
artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai Vmax sangat
sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan sangat lambat.



























Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
VII. KESIMPULAN

Invertase dikenal sebagai -fructofuranoside fructohydrolase merupakan
sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan
glukosa (gula invert).
Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung
khamir Saccharomyces ceriviseae.
Untuk menentukan konstanta Michaelis-Menten (Km) maka dilakukan
pemurnian enzim fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan
-enzm dan uji benedict.
Dari hasil praktikum diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10
-3

mol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852.
Vmax mendekati nol artinya reaksi berjalan sangat lambat.
Km bernilai negatif artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk
mencapai Vmax sangat sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan
sangat lambat.
















Nova Nurfauziawati
240210100003
Kelompok 11A
DAFTAR PUSTAKA

Bayramolu, G., Akgol, S., bulut, A., Denizli, A. And Yakup, A.M. (2003),
Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2-
hydroxyethyl methacrylate and glicidyl methacrylate, Biochemical
Engineering Journal, 14: 117-126

Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, ZaninGM. 2000. Characterization of free
andimmobilized invertase regarding activity andenergy of activation.
Brazilian Journal of Chemical Engineering: 873-880

Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at
the cell andtissue leve1 is coordinated with sucrose sink-tosource transitions
in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029

Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acidand pectins by
polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :397-
402

Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB,J inap S. 1995. Kinetics of papaya
pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 :129-135

Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.Amaize vacuolar invertase ,
IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity anddiurnal
modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. J ilidke-1. Maggy Thenawidjaja;
penerjemah.Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.Erlangga: Jakarta

Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New
York: EllisHoward.