You are on page 1of 15

Pewarnaan Sel

1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi
dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.!!").
#elihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. $ntuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama dalam penelitian%penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.!!").
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa akti& dari pewarnaan yang disebut kromogen. 'erjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
'eknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku ((ay.!!))
*leh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian%bagian bakteri.
Dasar teori
. mikroorganisme
#ikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai mor&ologi, struktur dan si&at%si&at yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel%sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidenti&ikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
+al tersebut juga ber&ungsi untuk mengetahui si&at &isiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
#ikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. ,lasan inilah yang menyebabkan -at warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. .at warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan -at warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan in&eksi yang mengandung -at
pati dan granula &os&at. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme
disebut pewarnaan di&erensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positi& dan
gram negati&. Pewarnaan di&erensial lainnya ialah pewarnaan -iehl neelsen yang memilihkan
bakterinya menjadi kelompok%kelompok tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro.!!").
Pengenalan bentuk mikroba (mor&ologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (+adiutomo. !!/). Pada umumnya bakteri
bersi&at tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai -at
warna (0aluyo, 1//)).
'ujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran ja-ad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi
ja-ad terhadap pewarna yang diberikan sehingga si&at &isik atau kimia ja-ad dapat diketahui
(+adiutomo. !!/).
#etode pengecatan pertama kali ditemukan oleh 2hristian 3ram pada tahun ""). Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positi& dan bakteri
gram negati4e. 5ang didasarkan dari reaksi atau si&at bakteri terhadap cat tersebut. 6eaksi atau
si&at bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak
bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti #ycoplasma sp
(0aluyo, 1//)).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 1) jam). $mumnya -at warna yang
digunakan adalah garam%garam yang dibangun oleh ion%ion yang bermuatan positi& dan negati&
dimana salah satu ion tersebut berwarna. .at warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu -at
pewarna yang bersi&at asam dan basa. 7ika ion yang mengandung warna adalah ion positi& maka
-at warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negati& maka -at warna tersebut disebut pewarna negati& (+adiutomo. !!/).
.at warna yang digunakan dalam pewarnaan bersi&at basa dan asam. Pada -at warna basa
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromo&or dan memiliki muatan
positi&. Sebaliknya, pada -at warna asam bagian yang berperan memberikan -at warna
mempunyai muatan negati& -at warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negati&
banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan
positi& pada -at warna basa akan berkaitan dengan muatan negati& dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.!!").
.at warna asam yang bermuatan negati& la-imnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya diman&aatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun
biasanya diman&aatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. .at warna asam yang
bermuatan negati& ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negati& yang terdapat pada struktur
sel. Kadangkala -at warna negati& digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positi&,
perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat -at warna terhadap struktur sel dapat berubah
bergantung pada p+ sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.!!").
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan
positi& dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan -at warna basa yang yang bermuatan
positi& maupun -at warna asam yang bermuatan negati&. Sebaliknya pada pewarnaan negati& latar
belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.!!")
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. $lasan ini
kemudian di&iksasi. 7umlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga
dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari
bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.!!).
$ntuk pewarnaan yang mengamati mor&ologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah pembuatan preparat ulas dilakukan &iksasi diikuti oleh pewarnaan. 8iksasi dapat
dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
8iksasi digunakan untuk 9
. #engamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
1. #elekatkan bakteri pada glass objek
:. #ematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam -at warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. (a-im, prosedur pewarnaan ini menggunakan
-at warna basa seperti seperti crystal 4iolet, biru metilen, karbol &uchsin basa, sa&ranin atau hijau
malakit. Kadang kala digunakan -at warna negati& untuk pewarnaan sederhana 9 -at warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo ((ay.!!)).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri
dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat
juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( sta&ilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari ) atau "
(saranae) ((ay.!!)).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan -at warna yang bersi&at basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negati&, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek..at warna tidak akan mewarnai bakteri, akan
tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam ((ay.!!)).
#etode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark
yang bernama 2hristian 3ram pada tahun ""). #enemukan metode pewarnaan secara tidak
sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positi&
dan bakteri gram negati4e. 5ang didasarkan dari reaksi atau si&at bakteri terhadap cat tersebut.
6eaksi atau si&at bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan
gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
#ycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan di&erensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap
penting d
alam pencirian dan identi&ikasi bakteri ((ay,!!))
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur
1)%)" jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding%dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan -at warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
lartan pemucat. ;ni berarti bahwa bakteri gram positi& dengan dinding sel yang rusak tidak lagi
dapat memertahankan crystal 4iolet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negati& ((ay,!!))
2irri%ciri gram negati4e9
− Struktur dinding selnya tipis, sekitar /%)<mm, berlapis tiga atau multi layer
− Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (%11=), peptidoglikan terdapat dalam lapisan
kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit /= dari berat kering, tidak mengandung asam
laktat.
− Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
− 'idak resisten terhadap gangguan &isik
2iri%ciri bakteri gram positi&9
− Struktur dindingnya tebal
− Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
− Bersi&at lebih rentan terhadap senyawa penisilin
− Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh -at%-at warna seperti ungu Kristal
− Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
− (ebih resisten terhadap gangguan &isik.
Pengecatan gram dilakukan dalam ) tahap. 5aitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal 4iolet) berwarna ungu
b. Pengintensi&an cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna sa&ranin
Banyak seenyawa organic berwarna (-at warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan
gram untuk 9
− #engamati dengan baik mor&ologi mikroorganisme secara kasar
− #engidenti&ikasi bagian%bagian structural sel mikroorganisme
− #embantu mengidenti&ikasi atau membedakan organisme yang serupa
Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa yaitu dengan
cara%cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung,menggunakan kondensor medan
gelap dan lain%lain.'etapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk
melihat bagian%bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan.
#elihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan
suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. *leh karena
itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian%penelitian mikrobiologi (Dwijoseputro, 1//<).

.1 Macam –macam pewarnaan
,. Pewarnaan negati&
Pada pewarnaan ini merupakan pewarnaan tidak langsung karena yang di warnai adalah
latar belakangnya, sedangkan bakerinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. .at warna yang di
gunakan adalah nigrosin.
B. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan -at warna yang tunggal
bertujuan untuk mengindenti&ikasi mor&ologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini -at warna yang
kami gunakan adalah gentiana 4iolet.
2. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas di gunakan untuk mengidenti&ikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah ter&iksasi di kenai larutan%larutan berikut -at pewaraan Kristal 4iolet, larutan yodium,
larutan akohol(bahan pemucat) dan -at pewarnaan tandinganya berupa -at warna sa&ranin atau
air &ucshin. #etode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark +ans 2hristian
3ram ("<:%!:") yang mengembangkan teknik ini pada tahun "") untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram posit& dan bakteri gram negati&. Bakteri garam
positi& akan memprtahankan -at pewarna kristal 4iolet dan karenanya akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. ,dapun bakteri gram negati& akan kehilangan -at pewarna Kristal
4iolet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi -at pewarna tandingnya yaitu dengan -at
pewarn air &ucshin atau sa&ranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelc-ar, 1//>).
Bakteri gram positi& adalah bakeri yang mempertahankan -at warna metal ungu sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop
sedangkan bakteri gram negati& akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasi&ikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri .Bakteri gram negati& adalah bakteri yang tidak mempertahankan -at metal ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram%positi& akan mempertaahankan warna ungu gelap setelah
di cuci dengan alkohol.
Sementara bakteri gram%negati& tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan
penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram%
negati& menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasi&ikasikan kedua tipe bakteri ini perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies
organisme inang, si&at pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding
sel gram%negati& terutama lapisan lipopolisakarida (Pelc-ar, 1//>).
D. Pewaranaan spora? &lagel
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai &ungsi yang sama sepertti kristal
amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu
&ase di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap &aktor
luar yang tidak menguntungnkan. @ndospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh
dinding yang tebal yang sangat re&rakti&, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies
basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh
dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel 4egetati&. Aamun pada beberapa tahapan
di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma 4egetati&nya yang
di maksudkan untuk menjadi spora (Pelc-ar, 1//>).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. +al ini tergantung oleh
spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel
induk. (etak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya tidaklah sama bagai semua
spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk ditengah%tengah sel, yang
kedua adalah terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat
ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan -at%-at
yang timbul sebagai -at%-at pertukaran -at bertimbun%timbun dan &aktor%&aktor luar lainya
merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu
oleh &aktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium
yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk spora%
spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan. #ula%mula air
meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya
keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. 'etapi juga dapat terjadi di tengah%tengah
spora. +al ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di
tengah%tengah maka masing%masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung
bakteri (Pelc-ar, 1//).
1.3 Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan akteri !eagai erikut"
. 8iksasi
8iksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel
bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi
gugusan reakti& (A+
:
B
) membuat sel%sel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah
a4initas, &iksasi dapat dilakukan secara &isik atau dengan bahan kimia.
1. Peluntur -at warna
Peluntur -at warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan
mikroskop. Pada umumnya, sel%sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan
warnanya. Sedangkan sel%sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.
:. Substrata
#erupakan -at warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa%senyawa tertentu.
*leh karena itu, senyawa%senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat
akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis -at warna yang diserap oleh sel, maka dapat
dibedakan tiga macam sel yaitu9 sel%sel asido&il, basodill dan sudano&il.
). ;ntensi&ikasi warna
.at warna dapat diintensi&ikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu -at kimia
yang dapat menyebabkan sel%sel bakteri dapat diwarnai lebih intensi& karena -at warna terikat
lebih kuat daripada jaringan sel. #ordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan
basa. #ordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan -at%-at warna basa. Sedangkan mordan
basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion -at warna asam.
<. .at warna penutup atau -at warna lawan
.at warna lawan adalah suatu -at warna basa yang berbeda warnanya dengan -at warna
mula%mula yang digunakan. 3unanya adalah untuk memberikan warna pada sel%sel yang berbeda
warnanya dengan -at warna mula%mula. .at warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan
dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel%sel yang tidak menyerap -at warna utama
(Sutedjo, !!).
BAB ##
$#%&A'A% P'S$A(A
Bakteri merupakan organisme prokariot. $mumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk
tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran ./// C
atau lebih (0aluyo, 1//)). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies
dapat berukuran // kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan
makhluk hidup dengan ukuran antara /, sampai /,: Dm. Bentuk bakteri bermacam E macam
yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan
suatu -at pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel indi4idu bakteri dapat berbentuk
seperti bola?elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelc-ar F 2han, 1//>).
)Pewarnaan akteri
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan 4akuola, menghasilkan si&at%si&at &isik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan -at warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
'eknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan di&erensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad% jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis,
atau olesan, yang sudah di&iksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel%sel mikroba atau bagian%bagian sel mikroba disebut teknik
pewarnaan di&erensial (Pelc-ar F 2han, 1//>).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan 3ram terbagi dua golongan, yaitu9 3ram
positi& , bila warna -at pewarna pertama (karbol gentian 4iolet) tetap bertahan, dengan demikian
warna se bakteri tampak ungu tuaG dan 3ram negati&, bila warna -at pewarna pertama tidak
bertahan (luntur) kemudian tercat oleh -at pewarna tandingannya, misal9 air &uchsin, sa&ranin,
dan oleh -at pewarna tandingan lainnya. (6a-ali, !">)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu 3ram positi& dan 3ram negati& ialah
setelah diberi -at pewarna &enomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding
sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang pentingG dinding
sel bakteri 3ram negati& pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri 3ram positi&.
Presentasi kandungan lipid bakteri 3ram negati& lebih tinggi daripada 3ram positi&.
Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol
mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat.
Denagn demikian, kompleks karbol gentian 4iolet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri 3ram
negati& terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan
permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri 3ram negati& kandungan
peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri
gram posii&. Pori%pori dalam peptidoglikan bakteri 3ram negati& tetap masih cukup besar untuk
dapat disari keluar kompleks karbol gentian 4iolet dan lugol. Selautnya, bila sel%sel 3ram psiti&
diperlakukan dngan liso-im untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut
protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian 4iolet dan lugol.
'etapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur
dinding sel bakteri 3ram positi& itu yag menjadi tempat tertahannya -at pewarna pertama yaitu
karbol gentian 4iolet. (6a-ali, !">)
*at warna
.at warna adalah senyawa kimia berupa garam%garam yang salah satu ionnya berwarna.
3aramm terdiri dari ion bermuatan positi& dan ion bermuatan negati&. Senyawa%senyawa kimia
ini berguna untuk membedakan bakteri%bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel%sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. 7ika warna terletak pada
muatan positi& dari -at warna, maka disebut -at warna basa. 7ika warna terdapat pada ion negati&,
maka disebut -at warna asam. 2ontoh -at warna basa adalah methylen blue, sa&ranin, netral red,
dan lain%lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah 2l
%
, S*
)
%
, 2+
:
2**
%
, 2**+2**. .at
warna asam umumnya mempunyai si&at dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma
sel sedangkan -at warna basa mudah bereaksi dengan bagian%bagian inti sel. Pewarnaan bakteri
dipengaruhi oleh &aktor%&aktor seperti 9 &iksasi, peluntur warna, substrat, intensi&ikasi pewarnaan
dan penggunaan -at warna penutup (Sutedjo, !!).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa akti& dari pewarna yang disebut kromogen. ;katan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. 'erdapat tiga
mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan di&erensial dan pewarnaan
gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan di&erensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang
paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri ($msl, 1//").
.at pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positi& dan ion negati&, salah satu di
antaranya berwarna. Pada -at warna yang bersi&at basa, warna terdapat pada ion positi& (-at
pewarna
B
2l
%
) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negati& (-at pewarna
%
Aa
B
).
+ubungan antara bakteri dengan -at pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh
adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. 7adi, jika bakteri itu diwarnai,
muatan negati& dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positi& -at pewarna basa,
Kristal 4iolet, sa&ranin dan metilin blue adalah beberapa -at pewarna basa yang biasa digunakan.
Sebaliknya -at pewarna asam ditolak oleh muatan negati& bakteri menyeluruh. 7adi, mewarnai
bakteri dengan -at pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar
belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Holk F
0heeler, !!:).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun "") oleh seorang dokter kebangsaan Denmark
2hristian 3ram (membuat -at pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna
di&&erensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok &isiologi, yang akan
memudahkan untuk identi&ikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi
pewarna kristal 4iolet, setelah menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium,
setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol !<= selama :/ detik,
kemudian dibilas dan diberi pewarna sa&ranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama
menit. .at pewarna kristal 4iolet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks.
Beberapa bakteri akan melepaskan -at pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa
bakteri yang lain -at pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol !<=. Bakteri gram
positi& akan terwarna ungu (kristal 4iolet) dan bakteri gram negati& akan terwarna merah
(sa&ranin) ($msl, 1//").
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan 3ram dan
.iehl‐Aelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui mor&ologi, struktur, dan karakteristik
bakteri. Pewarnaan 3ram dapat mengidenti&ikasi penyakit in&eksi. Prosedur pewarnaan 3ram
dimulai dengan pemberian kristal 4iolet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua
bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri 3ram positi& membentuk
kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan sa&ranin, bakteri 3ram positi&
akan berwarna ungu. 2ontoh bakteri 3ram positi& adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus,
2lostridia, 2orynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan
bakteri 3ram negati& akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian sa&ranin akan memberikan
warna merah pada bakteri 3ram negati&. 2ontoh bakteri 3ram negati4e adalah Aeisseria,
Klebesiella, Hellonella, Shigella, Salmonella, +emophillus, dll (2appuccino F Sherman, !":).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan ) jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positi& dan bakteri gram negati&. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. 6eagen pertama disebut warna dasar,
berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. 6eagen kedua disebut bahan
pencuci warna (decolorizing agent). 'ercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan
tercuci. 6eagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. (arutan yang biasa
dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan sa&ranin ('racy, 1//<).
'eori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri
3ram negati&. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan
membesar dan tidak mengikat pewarna. +al ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna.
Sedangkan bakteri 3ram positi& akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. +al ini
akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri 3ram
positi& memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak :/ lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri 3ram negati& hanya
memiliki ‐1 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih
besar. Pewarnaan 3ram terdiri atas 3ram , (4iolet) (Kristal 4iolet, ,alkohol, ,mmonium
oksalat, ,Iuades), 3ram B (cokelat) (;odium, Kalium iodide, ,Iuades), 3ram 2 (,seton,
,lcohol), 3ram D (merah) (Sa&ranin, ,lcohol, ,Iuades) (#adigan, 1//:).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut9
pewarnaan sederhana, pewarnaan di&&erensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu 9 pewarnaan &lagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan
Aeisser (granula 4olutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negati&
(3o-ali, 1//!)
+A,$A- P'S$A(A
2appuccino, 7., 3., F Aatalie., S, !":, Microbiology A Laboratory Manual, ,ddison%0esley
Publishing 2ompany 9 Aew 5ork.
3o-ali, ,mir, 1//!, Pewarnaan Gram, http9??www.go-ali.blogspot.com? gram?pewarnaan%gram%
prinsip.html . Diakses pada tanggal ) ,pril 1/1.
+adiotomo, 6atna Siri., !!/, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. 7akarta 9 Pt 3ramedia.
(ay, B.0, !!), Analisis Mikroba di Laboratorium, P' 6aja 3ra&indo Persada 9 7akarta.
#adigan, #.', 1//:, Brock Biology o Microorganism, Pearson @ducation 9 inc. $nited State o& ,merica.
Pelc-ar, #. 7., 2han, @.2.S, 1//>, !lements o Microbiology. #c 3raw +ill Book 2ompany 9 Aew
5ork.
6a-ali, $., !">, Mikrobiologi Dasar, 7atinangor9 8#;P, $AP,D.
Sutedjo, #., !!, Mikrobiologi "ana#, 6ineka 2ipta. 7akarta.
'racy, 1//<, Gram $taining, www.tracy.k1.ca.us? thsad4bio? pd&s? gram=1/stain.pd&, Diakses pada
tanggal ) ,pril 1/1.
$msl, 1//", $taining Bacteria, www.umsl.edu ?Jmicrobes?pd&? stainingbacteria.pd&, Diakses pada tanggal
) ,pril 1/1.
Holk F 0heeler, !!:, Mikrobiologi Dasar. Penerbit @rlangga 9 7akarta

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 1//<. Dasar%Dasar Mikrobiologi. 7akarta 9 Djambatan.
Pelc-ar, #.7.1//>. Dasar%Dasar Mikrobiologi. 7akarta 9 $; Press.
Sutedjo, #.!!. Mikrobiologi "ana#. 7akarta 9 6hineka 2ipta.
Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobioo!i, Maa"! # Dja$bata"
%adiuto$o. 199&. Mikrobioo!i Dasar 'iid (. 'akarta# )ra"!!a
*a+, ,ibia"a.-.199..A"aisis Mikroba di *aboratoriu$.'akarta # Rajawai
Sutedjo, Mu Mu+a"i.1991.Mikrobioo!i Ta"a/.'akarta # Ri"eka 0ipta
-au+o, ud. 1&&.. Mikrobioo!i U$u$.Maa"! # UMM Press