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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Serie de Normas Tcnicas N 39
Lima - 2003
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD
Subcomit Editor
Ministro
Dr. lvaro Vidal Rivadeneyra
Presidente
Dra. Ada Palacios Ramrez
Viceministro
Econ. Carlos Rodrguez Cervantes
Secretario tcnico
Dr. Csar Cabezas Snchez
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jefe
Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga
Miembros
Q.F. Zulema Arvalo Chong
Dr. Jorge Barnaby Rodrguez
Dr. Zuo Burstein Alva
Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto
Dr. Alfredo Guilln Oneeglio
Dr. Csar Nquira Velarde
Q.F Rosa Mendoza Yanavilca
Dra. Frine Samalvides Cuba
Dr. Vctor Surez Moreno
Subjefe
Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez
Centro Nacional de Salud Pblica
Dra. Susana Zurita Macalup
Directora General
Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin
Dr. Napolen Chvez Villanueva
Director General
Centro Nacional de Control de Calidad
Dra. Rosa Guevara Ormeo
Directora General
Editor
Dr. Leonid Lecca Garca
Asistente Editorial
Lic. Daniel Crdenas Rojas
Secretaria
Srta. Roco Sols Agurto
MPR-CNSP-016
1726-4634
Versin impresa
Direccin:
Instituto Nacional de Salud
Cpac Yupanqui 1400. Lima 11, Per.
Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162
E-mail: revmedex@ins.gob.pe
Pgina web: www.ins.gob.pe
Editor: Dr. Leonid Lecca Garca
E-mail: llecca@ins.gob.pe
ELABORACIN:
Blgo. Carlos Augusto Ybar Varas
Divisin de Biologa Molecular
Centro Nacional de Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
Lima-Per
MPR-CNSP-016
AGRADECIMIENTO:
Blgo. Roger Caldern Espinoza
Blgo. Carlos Padilla Rojas
Blgo. Christian Baldeviano Vidaln
Blgo. Omar Cceres Rey
Blga. Gisely Hijar Guerra
Blga. Elizabeth Snchez Roman
Divisin de Biologa Molecular
Centro Nacional de Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
MPR-CNSP-016
II
CONTENIDO
1
1
1
1
3
5
7
7
7
7
8
11
12
12
13
16
17
19
III
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Electroforesis bidimensional
Electroforesis de capilaridad
Electroforesis en campo pulsado (PFEG)
SECCIN 6:
6.1
6.2
6.3
5.7
5.8
SECCIN 5:
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
MPR-CNSP-016
SECCIN 4:
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
GENERALIDADES
Objetivo
Campo de aplicacin
Abreviaturas y definiciones
SECCIN 1:
1.1
1.2
1.3
INTRODUCCIN
21
21
21
22
25
27
28
30
32
35
35
35
36
37
37
37
37
IV
ANEXO F:
ANEXO E:
MPR-CNSP-016
ANEXO D:
ANEXO C:
UNIDADES Y FRMULAS
ANEXO B:
ANEXO A:
ANEXOS
BIBLIOGRAFA
Bromuro de etidio
Agarosa
Poliacrilamida al 30%
Agua destilada
Equipos de laboratorio
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
37
38
38
38
38
39
41
43
43
49
51
53
55
59
INTRODUCCIN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas.
Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a
observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao
o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de
fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de
las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas.
En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la
electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos electroforticos que presentan
ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis bidimensional para un anlisis ms sofisticado de las
protenas etc.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda
una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros.
El presente manual de procedimientos es la recopilacin de protocolos actualizados por los investigadores de la
Divisin de Biologa Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, adems de los
procedimientos tcnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparacin de soluciones de
electroforesis, unidades y frmulas bsicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que
deben considerarse durante la manipulacin de los reactivos.
MPR-CNSP-016
SECCIN 1
GENERALIDADES
1.1
OBJETIVO
Establecer los procedimientos de la tcnica de electroforesis de ADN y protenas para ser difundidas
en la red de laboratorios.
1.2
CAMPO DE APLICACIN
Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen anlisis y determinacin de ADN y protenas en
general.
1.3
ABREVIATURAS Y DEFINICIONES
1.3.1
1.3.2
1.3.3
kDa: kilodaltons.
1.3.4
nM: nanomolar.
1.3.5
1.3.6
1.3.7
1.3.8
pg: picogramo.
1.3.9
1.3.10
L: microlitro.
1.3.11
M: micromolar.
1.3.12
1.3.13
cido ribonucleico: molcula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo
fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimtico a nivel de ADN y durante la sntesis de
protenas.
1.3.14
aminocido: pequeas molculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su
conjunto forman la estructura de las protenas.
1.3.15
anfoterismo: propiedad de las protenas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,
dependiendo del pH y su punto isolctrico (pI).
MPR-CNSP-016
1.3.16
densidad ptica: unidad de medida de absorcin de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad
de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.
1.3.17
1.3.18
electroforesis: tcnica utilizada para separar partculas coloidales tales como protenas o cidos
nuclicos a travs una matriz slida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamao y
carga elctrica mediante la aplicacin de un campo elctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
1.3.19
1.3.20
1.3.21
estructura primaria de protenas: se refiere a la estructura lineal formada por la unin secuencial
de aminocidos.
1.3.22
1.3.23
1.3.24
grado biologa molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como
nucleasas, proteasas o pirgenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas
moleculares.
1.3.25
1.3.26
marcador estndar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados
para determinar el tamao de una molcula de ADN de inters por comparacin despus de una
electroforesis.
1.3.27
pares de bases: cada par de nucletidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra
de ADN.
1.3.28
PCR: polimerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa; reaccin enzimtica in vitro
por el cual mediante mltiples ciclos de denaturacin, alineamiento y extensin se sintetizan grandes
cantidades de una regin gentica especfica.
1.3.29
plsmido: molculas de ADN circular que se encuentran en la mayora de bacterias y otros organismos
procariontes y que pueden llevar informacin gentica para el organismo que lo alberga.
1.3.30
polimerizacin: accin qumica por el cual las molculas de acrilamida y bisacrilamida forman un
entramado a manera de malla por la accin de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia
gelatinosa.
1.3.31
MPR-CNSP-016
SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1
Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la caracterstica
de ser txicos, irritantes, corrosivos, cancergenos, mutagnicos y neurotxicos, por lo tanto el
investigador siempre deber usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos (Ver ms adelante lista de estos reactivos).
2.2
La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualizacin de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W
de potencia ocasiona graves daos oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deber contar
con una lmina de policarbonato transparente ubicada entre la lmpara y el punto de observacin.
Adems, deber usar lentes de proteccin contra rayos UV del mismo material.
2.3
El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga elctrica. Aunque
la mayora de cmaras de electroforesis han sido diseadas para evitar el contacto directo con la
electricidad, el operador deber asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al
momento de manipular el equipo.
2.4
El proceso de ebullicin de las protenas en bao mara a 100C deber realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes
a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.
MPR-CNSP-016
MPR-CNSP-016
SECCIN 3
MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR
3.1
El investigador deber usar guantes de ltex mientras se encuentre trabajando con ADN y protenas.
Este paso ayudar a evitar la degradacin de las biomolculas por accin de las nucleasas o proteasas
presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitar que el laboratorista se
exponga ante algn posible riesgo de intoxicacin por material infeccioso.
3.2
El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genmico y los productos
de amplificacin pueden ser almacenados a 4C, mientras que el ADN plasmdico a - 20C. Las
protenas deben ser conservadas a -80C o en su defecto a -20C. Todas las muestras biolgicas
deben ser repartidas en alcuotas y en volmenes pequeos para evitar etapas de descongelamiento
o congelamiento drsticos que ocasionaran un eventual deterioro de las molculas.
3.3
3.4
Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con
las molculas de ADN sean nuevas y estriles, a fin de evitar una posible contaminacin de la muestra
con nucleasas. Es importante sealar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre
y cuando estn libres de restos orgnicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121C
a 1,5 psi). Con respecto a la manipulacin de las protenas, no se exige el uso de puntas nuevas
pero s se recomienda esterilizarlas previamente.
3.5
Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten
con un certificado de calidad que garantice su precisin y calibracin (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN
12650).
3.6
Los reactivos a usarse durante los procesos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos y protenas
deben tener grado "biologa molecular" para asegurar el xito del procedimiento. El uso combinado
de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
MPR-CNSP-016
MPR-CNSP-016
SECCIN 4
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS
4.1
OBJETIVO
Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de protenas.
4.2
MATERIALES
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
Gradillas de plstico.
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
4.2.13
4.2.14
Agua bidestilada.
4.2.15
4.2.16
4.3
4.3.1
4.3.2
Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis parten del mismo principio tcnico, hemos
representado grficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este
equipo (Figuras N 1-4).
MPR-CNSP-016
4.3.3
En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
4.3.3.1
Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara.
4.3.3.2
Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible
pero resistente (generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los espaciadores es determinar el
grosor del gel.
4.3.3.3
Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarn las muestras
4.3.3.4
Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores,
a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema
4.3.3.5
El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos
sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser
conectados. En otras cmaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el
investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.
4.3.3.6
Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades
del investigador.
Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya ensamblada deber estar ubicada sobre
una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se
vierte la solucin del gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la generacin
de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar la distorsin del perfil de las bandas de las protenas
al final de la electroforesis.
4.4
4.4.1
MPR-CNSP-016
Ctodo
Vidrio grande
Anodo
Peine
Vidrio chico
Tanque de electroforesis
vertical
Espaciadores
Fuente de Poder
Soporte
Voltmetros
Ganchos o prensas
Reguladores de
voltaje
Base de jebe
Electrodos
Interruptor
Peine
Peine
Espaciadores
Vidrio
grande
1 - 5 cm
Vidrio chico
Figura N 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cmara de electroforesis vertical
MPR-CNSP-016
Peine
Ganchos o
prensas
Soporte
Presin
Base de jebe
5. Colocar peine y dejar polimerizar
Peine
3. Aadir butanol
Dejar gelificando
MPR-CNSP-016
10
nodo
Ctodo
Buffer de
electroforesis
Fuente de poder
Tanque de electroforesis
vertical
4.5
4.5.1
Fundamento terico
El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a
migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso
molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo.
4.5.2
Procedimiento
4.5.2.1
4.5.2.2
Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea horizontal en el
vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por
debajo de los dientes del peine (Figura N 2)
4.5.2.3
Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades,
mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
4.5.2.4
Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados en caso de trabajar con geles pequeos
de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La
concentracin de poliacrilamida a usar depender de las necesidades del operador.
4.5.2.5
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno,
tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
MPR-CNSP-016
11
4.5.2.6
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada.
Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 L) sobre la solucin de
poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin.
4.5.2.7
Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin
la solucin de poliacrilamida remanente.
4.5.2.8
Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con
agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.
4.6
4.6.1
Fundamento terico
El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las
protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este proceso
permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis.
4.6.2
Procedimiento
4.6.2.1
4.6.2.2
4.6.2.3
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solucin.
4.6.2.4
Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya polimerizado.
Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos
de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4.6.2.5
Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control
de la polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo.
4.6.2.6
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
4.7
4.7.1
Objetivo
Someter las muestras de protenas a procesos qumicos y fsicos que permitan su ptimo
fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.7.2
Materiales
4.7.2.1
MPR-CNSP-016
12
4.7.2.2
4.7.2.3
Guantes.
4.7.2.4
Cocinilla de asbesto.
4.7.2.5
4.7.2.6
4.7.2.7
4.7.2.8
4.7.3
4.7.4
Procedimiento
4.7.4.1
Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporcin 3:1
(tres partes de la muestra y una de buffer).
4.7.4.2
Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura
de 100 C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro
de un recipiente o vaso de precipitacin con agua hirviendo.
4.7.4.3
4.7.4.4
Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitacin y centrifugarlos por diez segundos
a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta
el proceso de electroforesis.
4.8
ELECTROFORESIS
4.8.1
Objetivo
Fraccionar las protenas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un
campo elctrico.
4.8.2
Materiales
4.8.2.1
4.8.2.2
MPR-CNSP-016
13
4.8.2.3
Fuente de poder.
4.8.2.4
4.8.2.5
Guantes.
4.8.2.6
4.8.2.7
4.8.2.8
4.8.3
4.8.4
Procedimiento
4.8.4.1
Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradacin de las molculas por
la accin de las proteasas presentes en la mano.
4.8.4.2
4.8.4.3
4.8.4.4
Considerar el uso de un marcador estndar de protenas para la medicin del peso molecular de la
muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la protena, excepto cuando
se trate de un marcador previamente teido en que el que se obviar el uso del buffer de la
muestra.
4.8.4.5
Una vez finalizada la colocacin de las protenas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa
y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
4.8.4.6
4.8.4.7
Para el clculo del voltaje es importante conocer la distancia en centmetros del gel desde la parte
superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitir
determinar el voltaje total. El voltaje ptimo depender de la naturaleza de la molcula de ADN que
se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
4.8.4.8
MPR-CNSP-016
14
4.8.4.9
Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una lnea azul por el colorante
del buffer) haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel.
4.8.4.10
Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.
4.8.4.11
Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separacin de
los vidrios que contienen el gel.
4.8.4.12
4.8.4.13
Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientacin para
ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
4.8.4.14
Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frgil
y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentracin. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de esptula para levantarlo por una de las puntas. Coger el
gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
4.8.4.15
El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser
reciclado hasta cinco veces, despus de los cuales se deber preparar una nueva solucin dado que
puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
4.8.4.16
Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergentes
especiales que puedan ser fcilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y
secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37C.
CTODO
NODO
e-
e-
e-
e-
a
Buffer de
resolucin
c
b
Gel de
empacamiento
d
e
e-
e-
Gel de
resolucin
Buffer de
resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 5. Interior de una cmara de electroforesis vertical en operacin: a) Durante la colocacin de la muestra en el pocillo del
gel, b) Despus de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las protenas, c, d y e) las protenas
migran hacia el nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
(e-)= electrones
MPR-CNSP-016
15
4.9
4.9.1
Objetivo
Visualizar las protenas en el gel de poliacrilamida.
4.9.2
Materiales
4.9.2.1
4.9.2.2
4.9.2.3
4.9.2.4
4.9.2.5
4.9.2.6
4.9.2.7
Agua destilada.
4.9.2.8
Guantes.
4.9.3
4.9.4
Procedimiento
4.9.4.1
Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algn tipo de contacto con los
reactivos.
4.9.4.2
4.9.4.3
Evitar la coloracin del gel por ms de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido
fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretincin que impedira la visualizacin de
las protenas.
MPR-CNSP-016
16
4.9.4.4
4.9.4.5
Cubrir el gel teido con solucin de decoloracin rpida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solucin
decolorante rpida y aadir un segundo volumen de la misma solucin hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solucin de decoloracin rpida y aadir la solucin decolorante
lenta. Dejar destiendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solucin por
una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiendo hasta que las bandas de las protenas
puedan ser apreciadas claramente.
4.9.4.6
Finalizada la remocin del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para
poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vaco o
manualmente.
4.9.5
4.9.5.1
Remojar el gel teido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotacin
suave.
4.9.5.2
4.9.5.3
Cubrir el gel con un segundo celofn previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo
"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 das.
4.9.5.4
Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofn que contiene el gel.
4.9.5.5
4.10
Interpretacin de resultados
4.10.1
Las protenas fijadas en geles de poliacrilamida y teidas con azul brillante de coomasie se observan
como bandas azules de diferentes pesos moleculares.
4.10.2
El peso molecular de una protena se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser
determinado comparando la banda con un patrn de protenas estndar de peso conocido denominado
marcador de peso molecular.
4.10.3
La distribucin de las protenas depende de la concentracin del gel, por lo tanto, el operador deber
seleccionar el marcador de peso molecular ms adecuado.
4.10.4
Algunas protenas suelen migrar anmalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilacin, fosforilacin y acetlizacin, las cuales podran retardar la
migracin de las muestras.
MPR-CNSP-016
17
4.10.5
Las protenas degradadas (desnaturalizacin de las protenas por causa de un agente qumico
catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con protenas de menor peso molecular (Figuras N 6 y 7)
1
Figura N 6. Electroforesis de protenas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:
concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 g de protena. Carriles 6 y 7: protenas degradadas.
97,4 66 -
45
31
21,5 -
MPR-CNSP-016
18
4.11
4.11.1
4.11.2
Temperatura
Depende bsicamente del voltaje de la electroforesis, la concentracin de sales (poder de
conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa"
o smiling (Figura N 8).
Figura N 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para protenas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extrada de Internet.
(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
4.11.3
MPR-CNSP-016
19
a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo elctrico, la migracin
de las protenas en el gel depender bsicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar
este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las protenas aprovechando sus propiedades
anfotricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las protenas, a fin de
favorecer la separacin de sta nicamente por su peso molecular.
4.11.4
4.11.4.1
Las protenas tienen caractersticas moleculares que actan como factores intrnsecos durante la
electroforesis alterando su migracin y generando bandas de diferentes tamaos, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerizacin y formacin de complejos con otro tipo de molculas generan
modificaciones en el tamao de la protena dando pesos moleculares aparentes en el momento del
anlisis.
4.11.4.2
MPR-CNSP-016
20
SECCIN 5
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN
5.1
OBJETIVO GENERAL
Conocer los procedimientos bsicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.
5.2
ELECTROFORESIS VERTICAL
5.2.1
Objetivo
Conocer el procedimiento tcnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.
5.2.2
Materiales
5.2.2.1
5.2.2.2
5.2.2.3
5.2.2.4
5.2.2.5
5.2.2.6
5.2.2.7
Poliacrilamida al 30%.
5.2.2.8
APS al 10%.
5.2.2.9
TEMED.
5.2.3
5.2.4
5.2.4.1
El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este
sistema, a diferencia de la electroforesis para protenas, no utiliza un gel de empacamiento y los
componentes del gel de resolucin son totalmente diferentes.
5.2.4.2
Procedimiento
a.
MPR-CNSP-016
21
b.
No ser necesario marcar el lmite hasta donde ser vertida la poliacrilamida, debido a que el gel
usado es continuo.
c.
d.
Aproximadamente 5 mL de la solucin debern ser preparado en caso de trabajar con geles pequeos
(aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La
concentracin de poliacrilamida para ADN depender de los objetivos de trabajo del operador.
e.
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.
f.
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.
Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando con papel toalla los
restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
g.
Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control
la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo.
h.
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
5.3
5.3.1
Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de poliacrilamida.
5.3.2
Materiales
5.3.2.1
5.3.2.2
Cmara de electroforesis.
5.3.2.3
Fuente de poder.
5.3.2.4
Poliacrilamida al 30%.
5.3.2.5
TEMED.
5.3.2.6
APS 10%.
5.3.2.7
5.3.2.8
5.3.2.9
Guantes.
5.3.2.10
5.3.2.11
MPR-CNSP-016
22
5.3.2.12
5.3.3
5.3.4
Procedimiento
5.3.4.1
Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las muestras, los reactivos y el equipo.
5.3.4.2
Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos
tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo
negativo que sern conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis
para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente saturados de buffer.
5.3.4.3
Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volmenes de solucin que contiene
el cido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de
muestra 6X. Aadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alcuotas, de acuerdo al nmero
de muestras que se colocarn en los pocillos, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina
(Figura N 10). Acto seguido, aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las
alcuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
5.3.4.4
NODO
e-
e-
e-
eA
Punta de la
micropipeta
depositando la
muestra en el pocillo
Buffer de
resolucin
Banda de ADN
ee-
Gel de resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 9. Interior de una cmara de electroforesis vertical para ADN en operacin. A: Durante el depsito de la muestra de ADN
mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicacin del voltaje y migracin del ADN a travs del gel poliacrilamida. E: Las molculas
de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiiendo el ADN con bromuro de
etidio y aplicando luz ultravioleta.
MPR-CNSP-016
23
Micropipeta
Lmina extensible
de parafina
Alcuotas de buffer
de la muestra
Figura N 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lmina extensible de parafina antes de colocar las
muestras en el gel de electroforesis.
5.3.4.5
Considerar el uso de un marcador de peso molecular estndar de ADN para la determinacin del
peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.
5.3.4.6
Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.3.4.7
5.3.4.8
5.3.4.9
Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por
el operador (este proceso debe ser estandarizado).
5.3.4.10
5.3.4.11
Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la
separacin de los vidrios que contienen el gel.
5.3.4.12
Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, pues
el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlo
nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de esptula para
levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tincin
en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).
5.3.4.13
Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergente que
no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente
o en una estufa a 37 C.
MPR-CNSP-016
24
5.3.4.14
5.4
5.4.1
Objetivo
Realizar la electroforesis de molculas de ADN mayores de 100 pb.
5.4.2
Materiales
5.4.2.1
5.4.2.2
5.4.2.3
5.4.3
5.4.3.1
5.4.3.2
5.4.3.3
Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en bao mara hasta que alcance una temperatura entre
50C y 60C.
5.4.3.4
Aadir agarosa en un volumen dependiente del tamao de la cmara (20mL-25 mL son suficientes
para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente
insertados (Figura N 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.
5.4.3.5
Despus que la agarosa haya quedado completamente solidificada, aadir el buffer de electroforesis
TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N 12). Posteriormente empezar a colocar las
muestras (Figuras N 10,13 y 14).
Agarosa
MPR-CNSP-016
25
Pocillo
0.5 - 1 cm.
Tanque 1
Tanque 2
Gel de agarosa
Cmara de
electroforesis
Fuente de
poder
NODO
Buffer de corrida
CTODO
MPR-CNSP-016
26
5.5
ELECTROFORESIS DE ADN
5.5.1
Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de agarosa.
5.5.2
Materiales
5.5.2.1
5.5.2.2
Fuente de poder.
5.5.2.3
5.5.2.4
5.5.2.5
Guantes.
5.5.2.6
5.5.2.7
5.5.2.8
5.5.2.9
5.5.2.10
5.5.3
5.5.4
Procedimiento
5.5.4.1
Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones, las muestras y el equipo.
5.5.4.2
Mezclar cinco volmenes de solucin conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X.
Para realizar la mezcla, aadir 1 volmen de buffer de muestra, repartidos en alcuotas de acuerdo al
nmero de muestras a cargar, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina (Figura N 10).
Aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la
muestra y mezclar totalmente.
5.5.4.3
5.5.4.4
Considerar el uso de un marcador estndar de ADN para la medicin del peso molecular de la muestra.
Dicho marcador tambin debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentra
previamente mezclado con el buffer.
MPR-CNSP-016
27
5.5.4.5
Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.5.4.6
5.5.4.7
Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las molculas de ADN que se va a separar. Para
el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos
entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genmico y plasmdico (>2kb) se recomienda aplicar
valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en la
seccin 5.8.
5.5.4.8
Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posicin adoptada por los indicadores azul de
bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posicin permitie que el investigador tenga
una idea de la ubicacin aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante
que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolucin de
ADN.
5.5.4.9
Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definen
dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migracin. Ambos colores, azul y verde
corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el
buffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de
manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol
se comporta como un fragmento de 300 pb.
5.5.4.10
Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por
el investigador.
5.5.4.11
Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
5.5.4.12
El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguiente
procedimiento. Limpiar la cmara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar a
temperatura ambiente.
5.6
5.6.1
Objetivo
Visualizar molculas de ADN por coloracin con bromuro de etidio.
5.6.2
Materiales
5.6.2.1
5.6.2.2
Transiluminador.
5.6.2.3
Guantes.
5.6.2.4
Agua destilada.
MPR-CNSP-016
28
5.6.3
5.6.4
Procedimiento
5.6.4.1
5.6.4.2
5.6.4.3
Devolver la solucin de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con
abundante agua.
5.6.4.4
Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.
5.6.4.5
5.6.4.6
5.6.5
Interpretacin de resultados
5.6.5.1
Las molculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de
etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las molculas de ADN que
son ms grandes, generalmente migran ms retardadamente que las molculas de menor peso
(Figura N 15).
1
40001000500
Figura N 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2
y 3: molculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.
MPR-CNSP-016
29
5.6.5.2
Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estndar de peso molecular
conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximada
el nmero de pares de bases de la molcula a analizar. Estos marcadores comerciales adems
pueden ser tiles como controles positivos del sistema de visualizacin del ADN, principalmente
cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), o
para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (clculos cualitativos de concentracin
de ADN), etc.
5.6.6
5.6.6.1
Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solucin con papel filtro Whatman N 1.
5.6.6.2
Aadir 300 mg de carbn activado sobre el papel filtro y filtrar la solucin de bromuro usado sobre el
carbn.
5.6.6.3
5.6.6.4
5.6.6.5
Eliminar el carbn de un ao de antigedad as como los geles de agarosa teidos con bromuro de
etidio en bolsas de plstico de bioseguridad.
5.6.6.6
Incinerar.
5.7
5.7.1
Ventajas y desventajas
5.7.1.1
De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a travs del mtodo de
tincin con plata. La ventaja de este mtodo es que es de dos a cinco veces ms sensible que el
bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos txico. Del mismo
modo, puede teir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.
5.7.1.2
Entre las desventajas que tiene este mtodo es que tambin utiliza reactivos peligrosos, como el
formaldehdo, y requiere el uso de solucin de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas
que con el tiempo resultara muy costoso.
5.7.1.3
Es importante sealar que el mtodo de tincin con plata tambin puede ser aplicado para la
visualizacin de protenas usando un protocolo similar que no ser descrito en este manual. Para el
caso de las protenas, la sensibilidad del mtodo es de 10 a 50 veces ms alto que usando azul
brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipptido).
5.7.1.4
En general, el proceso de tincin con plata surge como una buena alternativa para la visualizacin de
ADN y protenas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchos
casos es necesario estandarizar las condiciones.
5.7.2
Materiales
5.7.2.1
Guantes.
MPR-CNSP-016
30
5.7.2.2
5.7.2.3
5.7.2.4
Agua bidestilada.
5.7.2.5
5.7.2.6
5.7.2.7
5.7.2.8
5.7.2.9
5.7.2.10
5.7.3.
Procedimiento
5.7.3.1
5.7.3.2
Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solucin de fijacin e incubar en agitacin
constante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solucin de fijacin, en
reposo durante toda la noche.
5.7.3.3
5.7.3.4
Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operacin
tres veces.
5.7.3.5
Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lmina de plstico o placa petri por 10 a 20
segundos).
5.7.3.6
5.7.3.7
5.7.3.8
5.7.3.9
5.7.3.10
Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solucin fra (4C -8C) de
reactivo de parada o detencin y dejar en agitacin hasta que no aparezcan ms burbujas.
5.7.3.11
MPR-CNSP-016
31
10
11
12
Figura N 16. Gel de poliacrilamida teido con plata para la visualizacin de molculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular.
Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.
5.8
5.8.1
5.8.2
Concentracin de la agarosa
Una molcula de ADN migrar y se distribuir de modo diferente a medida que vare la concentracin
de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenmeno se puede explicar matemticamente mediante
la siguiente frmula:
log = log o - Krt
Donde logm es el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN, t es la concentracin de la
agarosa, mo es la libre movilidad electrofortica del ADN y Kr es el coeficiente de retraso relacionado
a las propiedades del gel y del tamao y forma de las molculas que se desplazan (Anexo B).
5.8.3
MPR-CNSP-016
32
Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parmetros fsicos como la
fuerza inica del buffer, el voltaje aplicado o la concentracin misma de agarosa (Figura N 17).
5.8.4
Voltaje aplicado
Este parmetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilizacin de las molculas
de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo elctrico
(aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las molculas de ADN de alto peso molecular
pero de manera indistinta. Ello genera que las molculas no se separen completamente unas de
otras pese a aumentar la velocidad de la electroforsis. En consecuencia, se recomienda no aplicar
ms de 5V/cm para molculas de ADN mayores de 2 Kb.
23130941665574361-
ADN circular
relajado
ADN circular
enrollado
23222027-
ADN
superenrollado
Figura N 17. Electroforesis de ADN plasmdico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcador
de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plsmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plsmido en agarosa al 1%.
Carril 4: Plsmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmdico. En el
carril 3 se puede apreciar una menor concentracin de ADN.
5.8.5
MPR-CNSP-016
33
sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la
direccin del campo elctrico, las molculas ms grandes de 100 kb se autoalinearn, alterarn su
migracin y se podrn separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de
electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel
Electrophoresis), y es bastante usado para la separacin de molculas de ADN de grandes tamaos
(por encima de 100 kb).
5.8.6
5.8.7
5.8.8
MPR-CNSP-016
34
SECCIN 6
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Nuevos protocolos y tcnicas basadas en la electroforesis de ADN y protenas, han venido apareciendo
en los ltimos aos. Mencionaremos brevemente los ms importantes:
6.1
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
6.1.1
6.1.2
Figura N 18. Electroforesis en dos dimensiones de protenas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/
parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).
6.2
ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD
6.2.1
Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de slica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de slica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un dimetro
de 25 a 100 m y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.
6.2.2
El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo elctrico, donde el calor generado es
eficientemente disipado gracias a la accin de los pequeos capilares. Para este propsito, el buffer
utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales
oxidrilos. Con ayuda de corriente elctrica se generar un flujo de protones hacia el ctodo, proceso
conocido como flujo endo-osmtico.
MPR-CNSP-016
35
6.2.3
Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de molculas entre las cuales tenemos:
protenas, pptidos, aminocidos, cidos nucleicos, iones inorgnicos, bases orgnicas, cidos
orgnicos y clulas en general.
6.2.4
nodo (+)
Ctodo (-)
Buffer
Buffer
Foto-receptor
Computadora
con registrador
E = V/d
Figura N 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo elctrico, V = voltaje, d= distancia). La
figura es una versin modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html
6.3
MPR-CNSP-016
36
SECCIN 7
VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS
7.1
GENERALIDADES
7.1.1
Se recomienda que los equipos utilizados en biologa molecular cuenten con un certificado de calidad
avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el ptimo funcionamiento de las pruebas
moleculares.
7.1.2
Asimismo, los reactivos que se empleen debern ser de grado biologa molecular a fin de asegurar
resultados satisfactorios despus de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que
exigen mantenerse en refrigeracin, debern ser evaluados por el propio investigador que los adquiri
antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condiciones
de refrigeracin, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente,
la polimerizacin no debe demorar ms de media hora.
7.1.3
7.1.4
7.2
7.2.1
Tanto el buffer de electroforesis para protenas como de ADN, debern ser preparados adecuadamente
y renovados en forma peridica. En tal sentido, se recomienda preparar solucin stock de buffer de
electroforesis concentrado 10 veces para protenas (Anexo A) 50 veces para ADN (Anexo A). Este
paso permite conservar la reproducibilidad del experimento.
7.3
PERSULFATO DE AMONIO
7.3.1
En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscpico, es decir, suele
hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deber realizarse un control peridico del frasco que lo contiene
a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la prdida de sus propiedades qumicas
durante el proceso de polimerizacin.
7.3.2
Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni
que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando
APS al 10% y verificar que la polimerizacin no demore por ms de media hora.
7.3.3
Para evitar la hidratacin del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa
con lmina extensible de parafina.
7.4
BROMURO DE ETIDIO
7.4.1
La solucin de trabajo (1 g/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solucin,
forrar el frasco con papel aluminio y rotular.
MPR-CNSP-016
37
7.4.2
La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50
pg (Seccin 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualizacin de la mnima
concentracin de ADN permitir determinar la calidad ptima del bromuro de etidio.
7.4.3
El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la prdida de sus propiedades fluorescentes
por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.
7.5
AGAROSA
7.5.1
7.5.2
De otro lado tambin se recomienda, verificar la presencia de residuos extraos en la solucin ya que
pueden interferir con el anlisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, ser
necesario preparar una nueva solucin a fin de superar este inconveniente.
7.6
POLIACRILAMIDA AL 30%
Esta solucin de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposicin a la luz
y el cambio de temperatura fcilmente deterioran su calidad.
7.7
AGUA DESTILADA
7.7.1
En biologa molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener ptimos
resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para
protena y ADN, as como tambin para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Si
el investigador cuenta con un equipo de destilacin asegrese que el agua presente una resistividad
elctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mnima concentracin
de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).
7.8
EQUIPOS DE LABORATORIO
7.8.1
Los equipos que se usan en biologa molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento
preventivo continuo por lo menos una vez al ao. Este proceso deber ser realizado por personal
tcnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compaa fabricante.
MPR-CNSP-016
38
SECCIN 8
REGISTROS Y ARCHIVOS
Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes
pasos:
8.1
Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado con
la luz UV, tomar una fotografa con una cmara fotogrfica resistente a este tipo de luz.
8.2
En caso de no ser posible tomar una fotografa, tratar de dibujar con un lpiz el resultado lo ms
parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plstico para cuaderno,
colocarlo sobre la lmina de proteccin de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio.
8.3
Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede
realizarse usando una cmara fotogrfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tincin con plata y
secar el gel para su posterior anlisis y registro. Para el caso de protenas teidas con azul brillante
de ccomasie tambin se recomienda secar el gel.
8.4
MPR-CNSP-016
39
ESQUEMA N 1
RESULTADOS EXPERIMENTO N_________
FECHA: _______________
OBJETIVO DEL
EXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________
CONCENTRACIN DEL GEL:
CARRIL 1: _________________________________
CARRIL 2: _________________________________
CARRIL 3: _________________________________
CARRIL 4: _________________________________
CARRIL 5: _________________________________
CARRIL 6: _________________________________
CARRIL 7: _________________________________
CARRIL 8: _________________________________
CARRIL 9: _________________________________
CARRIL 10: _________________________________
CARRIL 11: _________________________________
CARRIL 12: _________________________________
CARRIL 13: _________________________________
CARRIL 14:_________________________________
OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________
MPR-CNSP-016
40
BIBLIOGRAFA
Andrews, A. T. Electrophoresis of nucleic acids. In: Essential Molecular Biology. A Practical Approach.
New York: T. A. Oxford University Press Ed. Brown; 1991.
Berg G, Garfin D. Protein and nucleic acid blotting and inmunobiochemical detection. Biotechniques
1985; 3: 276.
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Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular cell biology. 2nd ed. New York: Scientific American
Books; 1990.
Instituto Nacional de Salud. Normas de Bioseguridad. 2 ed. Lima: Instituto National de Salud.
2002. Serie de Normas Tcnicas N 18.
Maizel RM, Blexter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens parasite genes. A laboratory
manual for molecular parasitology. Cambridge: Cambridge University Press; 1992.
Montoya Y, Len C, Nolasco O, Talledo M, Padilla C, Velarde M, et al. Gua de prctica del curso
terico-prctico: WESTERN BLOT y ELISA. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1999.
Purves WK, Orians GH, Heller HC, Sadava D. Life: the science of biology. 5th ed. Massachusetts:
Sinauer Associates Inc.; 1997.
Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology 3th ed. London: Ed. Consultant; 1993.
Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Gel electrophoresis DNA and molecular cloning. In: Molecular
cloning a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Westermeier R. Electrophoresis in practice. VHC Publishers Inc. New York. 1993. 277 pp.
Egelhofer V, Giavalisco P, Eickhoff H, Horn M, Przewieslik T, Theiss D, et al. Large-gel twodimensional electrophoresis-matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass
spectrometry: an analytical challenge for studying complex protein mixtures. Electrophoresis 2001;
22: 2844-55.
MPR-CNSP-016
41
MPR-CNSP-016
42
ANEXOS
ANEXO A
A.1
A.1.1
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
1 mg
Concentracin final
0,125 M
2.5 %
25 %
25 %
0,1 mg/mL
3,038 gr
15,01 gr
1 gr
Concentracin final
0,25 M
2M
1%
29,2 gr
0,8 gr
30 gr
Concentracin final
29,2%
0,8%
30%
Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N 1
y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft.
A.1.4
A.1.5
MPR-CNSP-016
43
A.1.6
A.1.7
BUTANOL-AGUA
Mezclar un volumen de butanol ms un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superior
de la mezcla.
A.1.8
GEL AL 6
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
COMPONENTES DE LA SOLUCIN
GEL AL 8%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
5 mL
2,6
1,0
1,3
0,05
0,025
0,0025
5 mL
20 mL
10,6
4,0
5,0
0,2
0,1
0,01
20mL
4,6
2,7
2,5
0,1
0,05
0,05
6,9
4,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
9,3
5,3
5,0
0,2
0,1
0,01
1,9
4,0
5,9
7,9
1,7
3,3
5,0
6,7
1,3
2,5
3,8
5,0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,025
0,05
0,075
0,1
0,0025
0,05
0,0075
0,01
VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN
GEL AL 12%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
MPR-CNSP-016
15 mL
7,9
3,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
15 mL
2,3
1,3
1,3
0,05
0,025
0,0025
GEL AL 10%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
10 mL
5,3
2,0
2,5
0,1
0,05
0,05
10 mL
1,6
2,0
1,3
0,05
0,025
0,0025
44
3,3
4,0
2,5
0,1
0,05
0,05
4,9
6,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
6,6
8,0
5,0
0,2
0,1
0,01
GEL AL 15%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
A.1.9
1,1
2,5
1,3
0,05
0,025
0,0025
3,4
7,5
3,8
0,15
0,075
0,0075
4,6
10,0
5,0
0,2
0,1
0,01
A.1.10
2,3
5,0
2,5
0,1
0,05
0,05
3 mL
1,1
2,5
1,3
0,05
0,025
0.0025
4 Ml
2,3
5,0
2,5
0,1
0,05
0.05
6 mL
3,4
7,5
3,8
0,15
0,075
0.0075
8 mL
4,6
10,0
5,0
0,2
0,1
0.01
A.1.11
A.1.12
A.1.13
A.1.14
SDS 10%
Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N de
NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada.
Calentar a 68 C para disolver completamente el SDS.
MPR-CNSP-016
45
A.2
A.2.1
Cantidad
54 g
27,5 g
20 Ml
Concentracin final
0,45 M
0,45 M
0,01 M
Cantidad
242 g
571 Ml
100 Ml
Concentracin final
1,9 M
57,1%
0,05 M
Cantidad
25 mg
25 mg
4g
Concentracin final
0,25% w/v
0,25% w/v
40% w/v
A.2.4
3,5%
5,0%
8,0%
10%
12,0%
20%
11,6
16,6
26,6
33,3
40,0
66,6
Agua bidestilada
67,7
62,7
52,7
46,0
39,3
12,7
TBE 5X
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
APS
0,7
0,7
0,7
0,70
0,7
0,7
Acrilamida/bisacrilamida
al 30%
46
A.2.5
A.2.6
A.2.7
A.2.8
A.2.9
A.2.10
MPR-CNSP-016
47
MPR-CNSP-016
48
ANEXO B
B.1
UNIDADES Y FRMULAS
B.1.1
B.1.2
B.1.3
Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentraciones
de geles de poliacrilamida
Rango de separacin
efectiva en pb
Acrilamida
(% peso/volumen)
3,5
5,0
8,0
12,0
15,0
20,0
1000 - 2000
80 - 500
40 - 200
60 - 400
25 - 150
6 - 100
Xilene
Cianol FF (*)
Azul de
bromofenol (*)
460
260
160
70
60
45
100
65
45
20
15
12
(*) Los nmeros dados son los tamaos aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de
cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989)
B.1.4
MPR-CNSP-016
49
B.1.5
15
10
16 - 68
7,5
36 - 94
5,0
MPR-CNSP-016
12 - 43
57 - 212
50
ANEXO C
C.1
Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos
hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabn y
abundante agua.
Si hubo inhalacin, trasladarse inmediatamente hacia un rea donde haya aire fresco.
C.2
REACTIVO
CARACTERISTICA
Acrilamida
Agarosa
Azul de bromofenol
Bisacrilamida
Bromuro de etidio
Butanol
Dodecil sulfato de sodio (SDS)
EDTA
Glicerol
Glicina
Mercaptoetanol
Metanol
Persulfato de amonio
Sucrosa
TEMED
Tris
Xilene cianol
MPR-CNSP-016
51
MPR-CNSP-016
52
MPR-CNSP-016
53
Solucin (es)
Problema
Pocillos de los geles de poliacrilamida mal Mala homogeneizacin del APS y el TEMED en la Realizar la mezcla del APS y el TEMED con
polimerizados.
solucin de poliacrilamida.APS al 10% con ms de movimiento de rotacin lento y suave sin hacer
una semana de antigedad.
burbujas.
Preparar nueva solucin de trabajo de APS al 10%
Problema
ANEXO D
MPR-CNSP-016
54
ANEXO E
E.1
E.1.1
Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solucin stock de TAE 50X
Solucin
Si se toma un volumen inicial de la solucin stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con
agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. Cmo calcular dicho volumen?
Se tiene los siguientes datos:
Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentracin inicial 1 (C1) = 10X
Volumen final 2 (V2)= 500 mL
Concentracin final 2 (C2) = 1X
Aplicando el siguiente factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2
y reemplazando valores se tiene:
V1(50X) = (1X)(500 mL)
Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda:
V1= 10 mL
Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada
E.1.2
V1 = (1X)(250 mL)
50X
V1 = 5 mL
Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego aadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de
250 mL con agua bidestilada.
MPR-CNSP-016
55
E.1.3
E.1.4
Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentracin de 1g/l a partir de una solucin
stock de 10 mg/mL.
Solucin
En este caso tambin usar la frmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1)
Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 g/L
Convirtiendo 10 mg/mL a g/L:
En 10 mg hay 10 000 g. En 1 mL hay 1000 L. Dividiendo:
10 000 g = 10 g/L = C1
1000 L
Reemplazando en (1)
V1 (10 g/L) = (1 g/L)(100 mL)
V1 = 10 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con
990 mL de agua bidestilada.
E.1.5
Preparar 50 mL de una solucin de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol
Solucin
El EDTA es un agente quelante cuya presentacin comercial es en forma de polvo. En consecuencia,
debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solucin de 0,5 M.
Aplicando la siguiente frmula:
W = M x PM x V.........................(a)
Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso
molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros.
Datos:
PM del EDTA = 336,2 g/Mol.
Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro.
Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt):
1 Lt contiene 1000 mL
x Lt habr en 50 mL
MPR-CNSP-016
56
E.1.7
Qu volumen de una solucin stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumen
de 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8?
Solucin
Aplicando la frmula y reemplazando valores:
V1 x C1 = C2 x V2
(V1 ) (5M) = (1,5M) (250 mL)
V1 = 75 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 75 mL de Tris 5M pH= 8,8.
E.1.8
MPR-CNSP-016
57
MPR-CNSP-016
58
ANEXO F
F.1
F.1.1
ELECTROFORESIS EN GENERAL:
DNA Electrophoresis.
http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm.
Polyacrilamide gel electrophoresis (Page):
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact
Electroforesis vertical:
http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf
Electrophoresis lecture notes.
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF.
Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html
Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images
to correct for geometric distortions of the spot pattern.
http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf
F.1.2
BIOSEGURIDAD:
F.1.3
UNIDADES Y FRMULAS:
Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma,
Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu.
http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html
F.1.4
PROTEMICA:
MPR-CNSP-016
59
MPR-CNSP-016
60