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com/ DETERMINACION DE LAS PROPIEDADES QUIMICAS DE LAS PROTEINAS

I.

INTRODUCCION: Se considera a las proteínas como polímeros biológicos de aminoácidos. En las proteínas existen 20 tipos de aminoácidos diferentes los cuales están en un número y secuencia determinados por el código genético. Con respecto a su tamaño, las proteínas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variación de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la más simple la estructura primaria y la más compleja la estructura cuaternaria cuya conformación depende de diferentes fuerzas químicas de atracción y repulsión que son ejercidas sobre la estructura molecular de la proteína y por lo tanto son responsables de su estabilidad. Por convención se acepta dividir a las proteínas en dos grupos: proteínas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades químicas y físicas. Sin embargo, para los fines que se persiguen en esta practica se les mencionara en forma general. Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son: La fuerza iónica del medio, el pH. La temperatura y la constante dieléctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la proteína responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan drásticamente que desnaturaliza a la proteína. Por fortuna, en nuestro organismo, la variación de tales factores es mínima por lo que son imperceptibles los cambios en la proteína.

II.

OBJETIVOS: Al término de esta práctica, el alumno será capaz de describir y demostrar de manera cualitativa las propiedades químicas de las proteínas en base a los siguientes aspectos:

1. Solubilidad de las proteínas.

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ 2. Las propiedades electroquímicas de las proteínas. 3. El efecto ácido-básico en la solubilidad de las proteínas.

III. FUNDAMENTO TEORICO: En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (Todas globulares). La caseína representa el 80% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida, hay varios tipos de caseína, estas proteínas precipitan del líquido cuando esta toma un pH ácido. El pH en el que precipitan las proteínas se denomina punto isoeléctrico (pI), ya que se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que la partículas se agregan. Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos, y así cada proteína tendrá un pI diferente.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita:

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2 http://laultimapitada.blogspot.com/

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La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche.

IV. METODOLOGIA Y METODOS: A. Materiales y equipos • • • • • • • • • • • • 10 tubos de ensayos de 10 X 150 mm 1 pipeta de 10 ml. 5 pipetas de 5 ml. 1 pipeta de 5 ml. 1 gradilla Agua destilada Acido Acético: 0.01 N, 0.1 N y 1.0 N20 ml. Etanol 30 ml. Éter Etílico 250 ml. de Leche Fresca Termómetro Calentador Eléctrico Cintas para Medir pH.

B. Métodos • Construcción de Gráficos Elaborar una gráfica con los valores obtenidos de pH y Solubilidad.

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ V. PROCEDIMIENTO: A. Aislamiento de la caseína: (se hará previo a la práctica) Caliente en un vaso de precipitados 150 ml de agua destilada a 38 º C, añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 2 M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). Deje sedimentar, decante y filtre sobre papel de filtro rápido, luego lave el precipitado con 20 ml de etanol en el mismo filtro y seque el precipitado colocando varias toallas de papel absorbente. Coloque el precipitado en un vaso de precipitados pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico, filtre nuevamente. Deseche el sobrenadante y queda un precipitado blanco de fácil manipulación.

B. Preparación de la caseína: Coloque 250 mg de caseína en un erlenmeyer de 150ml, agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 0.1N; agite hasta lograr una solución total de la caseína. Una vez disuelta la caseína, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien. La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. pI de la caseína: En diez tubos de ensayos limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos según la siguiente tabla:

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4 5.8 Ac. Acético 0.01N 0.62 1.25 0 0 0 0 0 0 0 0 Ac. Acético 0.1 0 0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 0 0 Ac. Acético 1.0N 0 0 0 0 0 0 0 0 1.6 3.2

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH 5.7 5.5 4.8 4.5 4.4 4.6 3.5 2.8 2.4 2.2

Confirme el valor de pH resultante de cada tubo con un potenciómetro o con papel indicador universal. Luego agregue a cada tubo 1ml de la solución de caseína, agite inmediatamente el contenido del tubo y déjelo reposar durante 20 minutos. Utilizando el espectrofotómetro, determinar la absorbancia.

VI. RESULTADOS: A. Tabla de datos

Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH 5.7 5.5 4.8 4.5 4.4 4.6 3.5 2.8 2.4 2.2 Absorbancia 0.057 0.056 0.059 0.056 0.059 0.059 0.055 0.045 0.035 0.034

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Gráfico 1: Representación en dispersión de la Absorbancia de la caseína en función del pH

Absorbancia de la Caseína en Función del pH 0,07 0,06 0,05 Absorvancia 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 1 2 3 pH 4 5 6

Gráfico 2: Representación esquemática de la Absorbancia de la caseína en función del pH

Absorbancia de la Caseína en Función del pH 0,07 0,06 0,05 Absorbancia 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 1 2 3 pH 4 5 6

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ VII. DISCUSIONES: 1. La página http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/2496/3/det+proteina.pdf manifiesta lo siguiente: “La caseína es una proteína de la leche, del tipo fosfoproteína. Representa cerca del 77% al 82% de las proteínas de la leche…”

Esto ayuda a entender porque esta sustancia era muy sensible a los cambios de temperatura, acidez o basicidad.

2. En la página http://72.14.209.104/search?q=cache:kckEAoOx_MsJ:www.upo.es/depa/webd ex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf+caseina+punto+isoe lectrico&hl=es&ct=clnk&cd=10&gl=pe menciona que: “La propiedad

característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita”. Este principio fue el utilizado en el laboratorio para obtener la caseína, para lo cual se agregó acido acético a la muestra de leche, obteniendo una masa blanca e inodora. 3. Jean Claude Cheftel - Jean Lous Cuq – Denis Lorient en “Proteínas Alimentarías”. Editorial Acribia S.A. Zaragoza (España), afirman que: “Se puede hacer precipitar la proteína (caseína) que contiene la leche, acidificando el medio y logrará regenerarla aplicando un compuesto alcalí…”

Con esto se explica el ¿porque?, al agregar NaOH 0.1N, la caseína (en ese momento una masa sólida), se hizo soluble; ya que el Hidroxido de Sodio es una base (se reponía las condiciones iniciales de la leche).

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ 4. Según la página: http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/2496/3/det+proteina.pdf, manifiesta lo siguiente: “El punto Isoeléctrico (o pH isoeléctrico) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a que hay menos repulsiones intermoleculares, por lo que precipita”.

Este es un dato curioso, ya que en la práctica se halló un valor de punto Isoeléctrico igual a ese dato (4.6= Pi), con lo cual nos podemos afirmar que estuvimos realizando la practica de manera adecuada. 5. En la Página: http://www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html, menciona que:”El método turbidimetríco empleado se basa en la medida de la turbidez de una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con soluciones de turbidez conocida. Se sabe que la absorbancia de un analito solubilizado es proporcional a su concentración (Ley de Beer). Por lo tanto, es de esperar que no se registren valores de absorbancia de una proteína en su punto isoeléctrico, pues no se encontraría como soluto. Por el contrario es posible analizar la absorbancia de la misma en soluciones de pH superiores o inferiores al isoeléctrico, obteniéndose dos posibles relaciones lineales”. Por este motivo fue que se usó el espectrofotómetro para analizar la solubilidad en las muestras.

6. Con los datos obtenidos del laboratorio, solubilidad y pH, de la muestra de caseína se llegó a elaborar una gráfica. De donde podemos resaltar que: la trayectoria de la línea era una especie de función logarítmica, hasta que llega al pH 4.5 y sufre una caída, considerando que el punto isoeléctrico es a pH 4.6 y con las teorías anteriores, se hace la siguiente suposición: Que la caseina permanece soluble cuando el pH es demasiado elevado y se precipita al llegar a 4.5 (cercano al 4.6) y retorna a soluble cuando el pH continua ascendiendo.

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ VIII. CONCLUSIONES: 1. Se puede obtener la caseína que se halla en la leche (en forma de sal cálcica), acidificando el medio y así provocar su precipitación.

2. La caseína es una proteína de la leche.

3. La caseína se dispersa bien en un medio alcalino.

4. En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

5. Se puede obtener el punto Isoeléctrico mediante el pH y los datos de la solubilidad.

6. Mientras más lípidos contenga un producto, la muestra será más insoluble.

7. Según la gráfica obtenida con los datos de laboratorio: A mayor pH en una muestra, mayor será la solubilidad.

IX. BIBLIOGRAFIA: 1. http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/2496/3/det+proteina.pdf 2. http://72.14.209.104/search?q=cache:kckEAoOx_MsJ:www.upo.es/depa/webd ex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf+caseina+punto+iso electrico&hl=es&ct=clnk&cd=10&gl=pe 3. www.quiminet.com.mx 4. http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica 3FQB.pdf 5. Proteínas alimentarías. Jean Claude Cheftel - Jean Lous Cuq – Denis Lorient. Editorial Acribia S.A. Zaragoza (España). 6. http://www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html http://laultimapitada.blogspot.com/

Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ X. CUESTIONARIO:

1. De que factores depende la solubilidad de una proteína en el agua.

La solubilidad de una proteína depende de los siguientes factores: •

De su composición en aminoácidos: una proteína rica en aminoácidos polares es, en general, aminoácidos hidrofóbicos. más hidrosoluble que una proteína rica en

• •

De su estructura tridimensional: las proteínas fibrosas son, en general, menos solubles que las globulares. Del entorno de la propia proteína: La temperatura, la constante dieléctrica del medio, el pH del mismo y la fuerza iónica son los principales factores ambientales que influyen en la solubilidad de una proteína.

La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al ionizarse, establecen enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de agua. Así, cuando una proteína se solubiliza queda recubierta de una capa de moléculas de agua (capa de solvatación) que impide que se pueda unir a otras proteínas lo cual provocaría su precipitación (insolubilización). Esta propiedad es la que hace posible la hidratación de los tejidos de los seres vivos.

2. Explique como afecta un cambio en la constante dieléctrica del agua a la solubilidad de una proteína.

En primer lugar, el agua, que es un disolvente polar, produce un efecto que llamamos apantallamiento, y que se debe a que cada macromolécula iónica aparece rodeada por un conjunto de "dipolos" de agua, debilitando así la posible interacción electrostática entre dos macromoléculas cargadas. Pero si además en la disolución existen iones, procedentes por ejemplo de sales disueltas, éstos van a interaccionar con aquellas macromoléculas iónicas cuya carga sea de signo opuesto, formando lo que se conoce como http://laultimapitada.blogspot.com/

Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ atmósfera contraiónica. Como consecuencia aparece un apantallamiento aún mayor que el producido por el agua, y por lo tanto una reducción mayor de las interacciones de tipo electrostático entre macromoléculas iónicas. Dicho de otro modo, las fuerzas de atracción electrostáticas se expresan a través de la ley de Coulomb, que nos dice que dichas fuerzas son inversamente proporcionales a una propiedad del medio que separa las cargas llamada constante dieléctrica. La constante dieléctrica del medio es mayor cuanto mayor sea su polaridad. El agua, que es un disolvente muy polar, tiene una constante dieléctrica grande, por lo que la fuerza de interacción electrostática entre moléculas cargadas en medio acuoso es menor que en otros disolventes menos polares. La constante dieléctrica será mayor aún, y las interacciones electrostáticas serán menores, en un medio acuoso con una concentración salina elevada.

3. Qué relación existe entre el punto isolelectrico y la solubilidad de una proteína.

La relación que existe es que si el pH se encuentra por debajo o encima del Punto Isoeléctrico, la proteína tendera a ser soluble.

4. Consulte la importancia industrial de la caseína

La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales (usada desde la antigüedad por los egipcios) y en el apresto de tejidos, La clarificación de vinos, La elaboración de preparados farmacéuticos Y la fabricación de plásticos.

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Para obtener más trabajos e informaciones visita: http://laultimapitada.blogspot.com/ 5. ¿Cuál es el valor del Punto Isoeléctrico de la caseína?

El punto Isoeléctrico (o pH isoeléctrico) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a que hay menos repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. El precipitado es de color blanco parecido a queso cottage el cual como la mayoría de quesos esta compuesta por este

6. Averigüe el valor del punto isoeléctrico de tres proteínas de interés.

La albúmina (proteína del huevo) tienen un punto isoeléctrico de 4.8. Una de las lipasas extracelulares mostró un punto isoeléctrico (pI) de 5,7 La albúmina (proteína del huevo) tienen un punto isoeléctrico de 4.8. • • Actina: pH: 4.7 Miosina: pH. 5.4

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