You are on page 1of 15

Laporan pewarnaan gram

A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena
hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa).
Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini
dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk
sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi
dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan
Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative
akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan
tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria,
2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-
4%)
Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap
penisilin
Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK)
Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif
kompleks
Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan pewarna utama karbol
fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti
dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk
menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan
erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam
etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-
aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat
menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-
asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya
pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian
dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit.
Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air
yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan
dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan
dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).


4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri
seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus
Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus
hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif
dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia.
Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga
pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan
tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora
sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam
tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk
presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).



A. Alat dan Bahan
NO Alat Jumlah Bahan

1

Jarum ose

1
Biakan murni B.
cereus dan
E.coli pada
medium NA
yang berumur
24 jam
2 Pembakar
spirtus
1 Aquades steril
3 Kaca preparat 1 Larutan huckers
crystal violet
4 Pipet tetes 1 Larutan mordan
lugol iodine
5 Mikroskop 1 Larutan alkohol
96%
6 Gelas kimia 3 Larutan safranin
7 Kaca objek 1
8 Tabung reaksi 1

B.
Kaca Objek
Cara Kerja

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol
Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
Ditetesi aquades

Jarum ose


Dibakar sampai merah
Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus


Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).
Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.


Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
Diamati dibawah mikrosko
A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi
Bakteri yang telah di ambil kemudian di
simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu
difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas
karena bisa merusak sel bakteri.
Gambar 2. Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet.
Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan
selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Hasilnya terdapat warna
ungu pada kaca objek.
Gambar 3. Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai
terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca
objek tetap berwarna ungu akibat dari
tetesan violet.
Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri
ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan
selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Setelah dicuci, warna
ungu pada kaca objek menghilang akibat
penambahan dari alkohol.
Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah warna ungu pada bakteri hilang,
kemudian bakteri ditetesi safranin sampai
terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir.
Hasilnya, bakteri yang dihasilkan
berwarna merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini
didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri
gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet
bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada
bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat
sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada
pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol
terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol
yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih
kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik.
Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme).
Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar,
maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna.
Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah
itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau
pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama
setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non
target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan
sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah
ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri
dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama
sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan
menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang
diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air
dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan
diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika
terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau
merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.


B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan gram negatif dan
bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.



Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11
November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M.
Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil
Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November 2010.


Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium








Laporan Mikrobiologi Pewarnaan
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai
stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung
(Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna
juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan
senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik
pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

1.2 Tujuan
Untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
Untuk mengetahui perbedaan gram positif dan gram negatif
Untuk mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri
Untuk mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan pewarnaan


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu
pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi
ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme
disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan
bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah
satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan
mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan
gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya
menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu
agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini
disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan
adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur
dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau
kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini.
Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang
didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang
diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam
yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat
warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung
warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna
adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang
berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat
warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu
proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme,
namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan
dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap
struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam
prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam
yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme
diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup
penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi.
Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya
sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat
terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila
terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan
preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan
preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara
mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti
crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna
negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo
(Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk
melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat
(coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada
coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan
(diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan
diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri.
Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama
Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini.
Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang
didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat
berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam.
Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak
sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna
dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel
yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif
(Lay,1994)
Cirri-ciri gram negative:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah
dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
Struktur dindingnya tebal
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk
pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa









BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN

3.1.Waktu dan Tempat
Praktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan dan cara-cara pewarnaan yang dilaksanakan hari Rabu, 6
April 2011 pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda.
3.2. Alat dan Bahan
3.3. Cara Kerja


BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1. Tabel hasil pengamatan pewarnaan
No. Teknik Pewarnaan Pengamatan
1. Pewarnaan Sederhana Keterangan :
Perbesaran 400
Berwarna Ungu
Berbentuk basil
2. Pewarnaan Negatif Keterangan :
Perbesaran 400
Berwarna Kuning
Berbentuk coccus
3. Pewarnaan Gram Keterangan :
Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk basil
Gram negatif
4. Pewarnaan Spora Keterangan :
Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk coccus

4.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini
dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin ,
dan safranin(lay ,1994).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana
bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode
perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan
melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif)
(Lay.1994).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah
dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah.
Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang
digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam
hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu
pada Bacillus subtitulis (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang
dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan zat
warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya (Lay.1994)
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan
perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan
safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel
vegetatifnya (Lay.1994)
Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur
pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan
untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik
tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai
histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan
obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran
nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta
penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme
yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan
metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya
oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif
dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode
biasa.
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air.
Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum,
dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai
conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain
klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast.
Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya
identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara
keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga
digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan
menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).
Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan bentuk basil dan
berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri,
ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap
dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah
dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora yang
menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan
yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk coccus pada perbesaran 400
di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel
bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati,
dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga
dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air




BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana
dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya
Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,pewarnaan spora dan
perwarnaan kapsul
Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol fuchsin, crystal
violet, nigrosin, malachite green, lugols iodida, dan safranin.
5.2 Saran
Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti pewarnaan kapsul, basil tahan asam,
dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam metode pewarnaan lebih banyak
mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.




















LAPORAN MIKROBIOLOGI: Pewarnaan Bakteri Gram Positif dan Negatif
Dasar :
Pewarnaan gram adalah pewarnaan yang menggunakan 2 jenis zat warna yang dilakukan secara bertingkat. Sifat gram
terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kima dinding sel dan membran sitoplasma.


Tujuan :
1. Untuk membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram positif dan gram negatif.
2. Untuk mempermudah pengamatan terhadap sifat-sifat setiap jenis bakteri gram.

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan:
1. Kaca alas steril 9. Labu Semprot
2. Pensil glass 10. Label
3. Ose 11. kapas
4. Tabung reaksi
5. Pembakar spirtus
6. Pinset
7. Kertas saring
8. Korek api


Bahan yang digunakan :
1. Biakan bakteri
2. Larutan Fisiologis 0,85%
3. Zat warna Kristal violet
4. Lugol
5. Karbol fuchsin
6. Minyak imersi

Cara kerja :
1. Dipersiapkan meja kerja yang steril.
2. Dipersiapkan kaca alas yang steril.
3. Kaca alas dibersihkan dengan kapas yang telah disemprot dengan Alkohol.
4. Kaca alas difiksasi diatas spirtus.
5. Kaca alas dibagi 3 dengan pencil glass,posisi kaca alas dibalik.
6. Ose dipijarkan,didinginkan dengan LF.
7. Ose dimasukan ke tabung suspensi (diambil 1 mata ose).
8. Disebarkan ke kaca alas,ke 3 bagian (dibuat ulasan tipis).
9. Kaca alas difiksasi kembali,hingga kering.
10. Hasil preparat ditetesi dengan KVAO, didiamkan selama 30.
11. Zat warna KVAO,dibuang.
12. Preparat ditetesi dengan Lugol, didiamkan selama 30.
13. Kemudian Lugol tersebut dibuang.
14. Kaca alas dicelupkan beberapa kali kedalam larutan Aseton Iodine, selama 30.
15. Kaca alas dibilas dengan air suling, sampai tetesan terakhir bening.
16. Preparat ditetesi dengan zat warna Karbol fuchsin,dddiamkan selama 30.
17. Kaca alas dibilas kembali dengan air suling.
18. Kaca alas dikeringkan dengan kertas saring.
19. Amati preparat dengan mikroskop, lensa objektif 100 dengan ditetesi minyak imersi.
20. Gambar hasil pewarnaan Gram.

NOTE :
a. Bakteri Gram Positif berwarna Violet (Ungu)
b. Bakteri Gram Negatif berwarna Merah.

Bagan Kerja :




Pengamatan :

Ket :

Lensa okuler : 10x

Lensa objektif : 100x

Pembesaran : 1000x

Lapang pandang : Transparan

Bentuk sel : stapilococcus, diplobacillus, triplobacillus, monococcus

Warna sel : ungu(+), merah(-)

Zat warna : Kristal violet, lugol, karbol fuchsin

Sumber : suspense bakteri

Umur : 24 jam

Pembahasan :

Pewarnaan Gram yaitu Pewarnaan bertingkat yang menggunakan 2 jenis zat warna.Pewarnaan Gram bertujuan untuk
membedakan bakteri-bakteri gram positif dan gram negatif.

Pewarnaan Gram dikembangkan oleh CHRISTIAN GRAM (1884). Tahapan pewarnaan Gram,yaitu:

1. Pewarnaan I (Zat warna Positif).

2. Intensifikasi warna dengan Lugol.

3. Dekolorisasi dengan Aseton Iodine.

4. Pewarnaan II (Zat warna negatif)



Bakteri Gram positif yaitu segolongan bakteri-bakteri yang mempertahankan persenyawaan Iodine kompleks setelah
dekolorisasi sedangkan Bakteri Gram negatif yaitu segolongan bakteri yang melepaskan persenyawaan Iodine kompleks setelah
dekolorisasi tetapi mengikat zat warna berikutnya.


Sifat Gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasmanya. Dinding sel dan
membran sitoplasma bakteri-bakteri gram positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks zat warna KVAO,
sedangkan pada bakteri Gram negatif afinitasnya sangat kecil.


Pada waktu pemberian warna, KVAO menembus sel-sel bakteri positif maupun sel bakteri gram negatif.Pada sel bakteri
gram positif zat-zat ini membentuk suatu senyawa yang sukar larut,juga tidak larut pada saat dekolorisasi (Aseton Iodine).
Hal ini tidak terjadi pada bakteri gram negatif,akibatnya zat warna awal dapat dilepaskan.Pemberian zat warna berikutnya
yang kemudian diikat oleh bakteri gram negatif,sedangkan bakteri gram positif tetap mempertahankan warna
awalnya.Sehingga warnanya kontas terhadap zat warna pertama.

Perbedaan sifat gram positif dan negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi masih tergantung pada factor-faktor yang
dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram,yaitu:

1. Perubahan keasaman.

2. Penyimpangan cara pengecatan.

3. Faktor medium.

4. Umur bakteri.

5. Perlakuan khusus.



Fungsi larutan Lugol,yaitu:

1. Meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri.

2. Untuk memperjelas zat warna.
3. Mempersulit kelarutan zat warna