You are on page 1of 10

Metode Immunohistokimia

Metode Immunohistokimia
Makhyan Jibril Al Farabi*
*Program Study Master Biomedik, FKUB
1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Imunohistokimia merupakan suatu ara pemeriksaan untuk mengukur dera!at imunitas
atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan !aringan" Pe#arnaan sediaan !aringan
menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selan!utnya
dapat dideteksi dengan ara dilabel dengan en$im,isotop, fluoropore,atau coloidal gel. Untuk
mempela!ari mor%ologi sel, sel dalam !aringan di%iksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan
di&isualisasikan denganmikroskop elektron atau mikroskop ahaya '(antam, )**+, -eknik
imunohistokimia dapat digunakan
untuk mempela!ari distribusi en$im yang spesi%ik pada struktur sel intak 'normal.lengkap,,me
ndeteksikomponen sel, biomakromolekul seperti protein, karbohidrat '/ehr et al., 0111,"
2engan demikian, maka sangat penting sekali untuk memahami teknik imunohistokimia guna
penelitian yang berkaitan dengan pengukuran ekspresi protein, karbohidrat maupun antigen
lain di permukaan maupun di dalam sel"
1.2. Tuuan
Untuk mengetahui proses pelaksanaan metode immunohistokimia
2. TIN!AUAN PU"TA#A
Imunohistokimia merupakan proses untuk mendeteksi antigen 'protein, karbohidrat,
dsb, pada sel dari !aringan dengan prinsip reaksi antibody yang berikatan terhadap antigen
pada !aringan" 3ama imunohistokimia diambil dari nama 4immune5 yang menun!ukkan
bah#a prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan antibody dan 4histo5 menun!ukkan
!aringan seara mikroskopis" Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan
mengidenti%ikasi karakteristik dari e&en seluler seperti proses proli%erasi sel, apoptosis sel"
Imunohistokimia !uga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui
distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai maam !aringan
pada tubuh" '(amos67ara, )**8," Untuk mem&isualisasikan hasil interaksi antara antigen dan
antibody dapat dilakukan dengan berbagai maam ara, dimana ara yang paling sering
digunakan ialah dengan kon!ugasi antibody dengan en$im seperti peroksidase" Selain itu !uga
bias digunakan %luorophore seperi %luoresin atau rhodamin" Untuk mempela!ari mor%ologi
sel, sel dalam !aringan di%iksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan di&isualisasikan
dengan mikroskop elektron atau mikroskop ahaya '(antam, )**+,
Seara garis besar, untuk metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode
diret maupun indiret" 2imana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibody yang
digunakan, yakni9
Metode 2iret
Metode imunohistokimia diret menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan
berikatan langsung dengan antigen target seara langsung
Metode Indiret
Metode imunohistokimia indiret menggunakan antibody primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan !uga antibody sekunder yang sudah memiliki label dan akan
bereaksi dengan Ig: dari antibody primer"
$. MET%DE
(angkaian pemeriksaan Immunohistokimia dimaulai dengan pengambilan sampel lalu
pembuatan para%%in blok" Setelah itu dilakukan pe#arnaan imunohistokimia" Berikut
periniannya 9
a. Pem&uatan 'ara((in &lo)k
0" Jaringan diui dengan PBS
)" 2i%iksasi dengan %ormalin 0*;
+" 2ilakukan dehidrasi menggunakan alohol bertingkat '+*;, 8*;, <*;, =*;, 1>; dan
absolute,
?" @learing menggunakan Ailol ) kali, masing6masing >* menit"
8" In%iltrasi menggunakan para%%in lunak selama >* menit pada suhu ?=
*
@"
>" Blok dalam para%%in keras pada etakan dan diamkan selama sehari"
<" -empelkan" Pada holder dilakukan pemotongan setebal ?6> mm dengan rotary mirotome"
=" Mounting pada ob!ek dengan gelatin 8;
&. Proses de'ara(inisasi
0" Slide direndam Ailol ) kali, masing6masing selama 8 menit"
)" (ehidrasi menggunakan alohol bertingkat '+*;, 8*;, <*;, =*;, 1>; dan absolute,
masing6masing 8 menit
+" Bilas dengan dB)C selama 8 menit
). Proses imunohistokimia terhada' eN%"
0" Slide preparat diui dengan PBS pB <,?
)" Aplikasikan +; h)o) 'dao, In, selama 0* menit"
+" @ui dengan PBS pB <,? selama 8 menit + kali
?" Bloking menggunakan serum ); BSA 'Sigma USA, selama >* menit '0;,
8" Inkubasi dengan antibody primer mouse monolonal &am60 human absorbed semalam pada
suhu ?*@ '090**,
>" @ui dengan PBS pB <,? selama 8 menit + kali
<" -etesi dengan anti body sekunder berlabel biotin 'Santa @rus, dan inkubasi selama 0 !am
'09)**,
=" @ui dengan PBS pB <,? selama 8 menit + kali
1" -etesi dengan SA6BKP 'Strep A&idin horse radis peroAidase, '2ako,In, selama ?* menit
'098**,
0*" @ui dengan PBS pB <,? selama 8 menit + kali
00" Aplikasikan romogen untuk B(P yaitu 2AB '2iamono Ben$idine, '2ao,In,
0)" Bilas dengan B
)
C
0+" @ui dengan PBS pB <,? selama 8 menit + kali
0?" @ounter straining dengan mayer BematoAilen 'lab 7ision, selama 0* menit
08" @ui dengan tap Dater
0>" Kering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta o&er :lass
d. Pem&uatan media
Larutan PB"
a" 3a B
)
PC
?
) B
)
C ),? gram
b" 3a
)
BPC
?
0,) gram
" KB
)
PC
?
*,< gram
d" K@I >,= gram
Pem&uatan
6 2ilarutkan ke + bahan tersebut dengan aEuadest sampai 0 /
6 2iletakkan di atas magneti stirrer agar homogen
6 2iukur pada pB <,?" 2istrilisasi
6 Simpan disuhu dingin
6 Jika ingin dienerkan, ambil 0** , tambahkan 1** m/ AEuades
*. HA"IL
+. #E"IMPULAN
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bah#a imunohistokimia
merupakan metode semi6kuantitati% yang berman%aat untuk mempela!ari distribusi en$im
yang spesi%ik pada struktur sel intak 'normal.lengkap,, biomakromolekul seperti protein,
karbohidrat dengan prinsip prinsip immunoassay"
DA,TA- PU"TA#A
/ehr S, Kot$ka J, Berkner A, Klein F, Sietho%% @, Knebel B, 3oelle 7, BrGning J@, Klein BD,
Meyer BF, Krone D, MGller6Dieland 2" 0111. Identification of tyrosine phosphorylation
sites in human Gab-1 protein by EGF receptor kinase in vitro. Biohemistry" Jan
8H+='0,908061"
(amos67ara, JA" )**8" "echnical !spects of Immunohistochemistry". 7et Pathol ?) '?,9 ?*8I?)>"
doi90*"0+8?.&p"?)6?6?*8" PMI2 0>**>>*0"
(antam, Fedik A" )**+" Metode Immunologi" Airlangga Uni&ersity Press" Surabaya" 0?86088
imunohistokimia
IMUNOHISTOKIMIA (IHK)
Pendahuluan
Imunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan
biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu
dengan menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang
diberi label. Dengan menggunakan imunohistokimia, kita dapat melihat distribusi dan
lokalisasi dari komponen seluler spesifik diantara sel dan jaringan lain di sekitarnya
dengan menggunakan mikroskop cahaya biasa. Komponen seluler tersebut dapat
terlihat karena kompleks antigen-antibodi yang sudah dilabel akan memberikan
warna yang berbeda dari sekitarnya.
Imunohistokimia dibagi menjadi 2 metode, yaitu metode direct dan indirect.
Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan
dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut.
molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau
enim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna
pada jaringan tersebut. !elanjutnya dalah metode indirect, pada metode ini antibodi
spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak
dilakukan modifikasi pada antibodi ini. "amun diperlukan antibodi lain yang dapat
berikatan dengan antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. #ntibodi
sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut.
!etiap $ antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari $ antibodi sekunder, oleh
karena itu, setelah diberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada
jaringan tersebut.
%angkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu
preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk
membentuk preparat jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample
terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya
menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan
pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom,
deparafinisasi dan antigen retrie&al untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking
dari protein tidak spesifik lain. !ampel labeling adalah pemberian bahan-bahan
untuk dapat mewarnai preparat. !ampel labeling terdiri dari imunodeteksi
menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan
counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.
Tujuan
$. 'elatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan Imunohistokimia
2. 'elihat sel kanker pada preparat jaringan buli-buli dari hasil Imunohistokimia
Metode
(ari pertama
$. Deparaffinisasi
a. )eteskan *ylol 2+$, menit
b. )eteskan ethanol absolute $+- menit
c. )eteskan ethanol .,/ $+- menit
d. )eteskan ethanol 0,/ $+- menit
e. )eteskan ethanol 1,/ $+- menit
f. )eteskan !terile a2uades 3+- menit
2. !lide siap untuk dilakukan Imunohistokimia 4
a. Dicuci P5! steril 3+- menit
b. Dikeringkan dengan tissue
c. Ditambah (262 3/ dalam methanol inkubasi $- sampai dengan 2,menit
d. Dicuci P5! steril3+- menit
3. 5locking unspesifik protein 4
a. Ditambah ,,2-- triton-+$,, dalam blocking buffer 5!# selama $ jam pada suhu
ruang
b. Dicuci dengan P5! steril 3+- menit
7. Inkubasi antibodi primer 4
a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer 5!#
b. Inkubasi semalam pada 789
c. Dicuci P5! steril 3+- menit
(ari kedua
$. Inkubasi antibodi sekunder 4
a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi :, menit pada suhu kamar ;walapun
menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya<
b. Dicuci P5! steril 3+- menit
2. Inkubasi !#(=P 4
a. Ditambah !#(=P kit, inkubasi 7, menit pada suhu kamar
b. Dicuci P5! steril 3+- menit
c. Dicuci akuades steril 3+- menit
3. #plikasi kromagen D#5 ;dipilih D#5 karena lebih awet< 4
a. Ditambah ;D#5 4buffer D#5 > $4-,<, inkubasi 2, menit pada suhu kamar
b. Dicuci P5! steril 3+- menit diaminobenidine
7. 9ounterstain dengan mayer hemato+ilen 4
a. Ditambah ;mayer 4 tap water >$4$,<, inkubasi --$, menit pada suhu kamar
b. Dicuci tap water steril 3+- menit
c. Dikeringkan anginkan
-. 'ounting dengan entellan
Dikeringkan anginkan
:. #mati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop

Hasil

?ambar hasi Imunohistokimia
Dari Imunohistokimia pada preparat jaringan buli-buli yang diperkirakan terdapat sel
kanker, sel kanker tersebut akan terwarnai dengan warna coklat. Dari preparat
pertama didapatkan sedikit warna coklat, sehingga diperkirakan hanya ada sedikit
jumlah sel kanker, sedangkan pada preparat kedua dan ketiga terdapat banyak
warna coklat sehingga diperkirakan ada banyak sel kanker pada jaringan buli-buli
tersebut.
Diskusi
Pada pelatihan penelitian ini langkah-langkah Imunohistokimia sudah dilakukan
dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur
Imunohistokimia ini. "amun proses preparasi sampel tidak seluruhnya dilakukan
oleh peserta. Preparasi sampel terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar,
fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan
parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan
menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrie&al untuk membebaskan
epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Peserta pelatihan
memulai pada saat preparat sampel sudah dilakukan deparafinisasi, sehingga hanya
proses bloking protein tidak spesifik dari proses preparasi sampel saja yang
dilakukan oleh peserta. "amun telah dilakukan penjelasan secara rinci dari laboran
biomedik tentang preparasi sampel. Proses antigen retrie&al diperlukan setelah
dilakukan deparafinisasi karena proses tersebut akan membuat epitop dari jaringan
tersebut lebih terlihat atau lebih dominan dibandingkan dengan tidak dilakukan
antigen retrie&al sehingga nantinya antibodi primer yang diberikan akan dapat
mengenali epitopnya dengan baik. !elanjutnya dilakukan bloking protein tidak
spesifik, hal ini bertujuan untuk menutupi sisi protein lain, sehingga anti bodi tidak
mengenali protein lain yang tidak dimaksud. (al ini dapat mengurangi bias.
Pelatihan penelitian ini menggunakan teknik Imunohistokimia secara indirect.
Pada proses selanjutnya adalah sampel labeling yang terdiri dari imunodeteksi
menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan
counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. #ntibodi primer yang
digunakan adalah antibodi yang spesifik terhadap protein sel kanker buli-buli.
!etelah diberikan antibodi primer, preparat dicuci, sehingga antibodi primer yang
tidak berikatan akan terbuang. 5erikutnya diberikan antibodi sekunder yang spesifik
terhadap antibodi primer, sehingga antibodi sekunder ini akan berikatan dengan
antibodi primer. #ntibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul
indikator pada antibodi tersebut. Pada pelatihan penelitian ini, molekul indikator yang
digunakan adalah !#(=P yang berikatan dengan (
2
6
2
. !etiap $ antibodi primer
dapat dikenali oleh lebih dari $ antibodi sekunder yang memiliki !#(=P. !elanjutnya
diberikan kromagen diaminobenidine ;D#5<. D#5 ini akan bereaksi dengan (
2
6
2
yang terdapat pada !#(#=P antibodi sekunder dan akan dihasilkan produk reaksi
berwarna coklat yang dapat kita lihat. 6leh karena lebih dari $ antibadi sekunder
yang berikatan dengan antibidi primer, maka D#5 yang bereaksi dengan (
2
6
2
akan
semakin banyak dan akan menghasilkan warna yang lebih jelas dibandingkan
dengan metode direct yang tidak menggunakan antibodi sekunder. Proses terakhir
adalah counterstaining, yaitu memberikan warna lain pada jaringan yang tidak
terwarnai oleh proses Imunohistokimia. Pada pelatihan penelitian ini menggunakan
mayer hemato+ilen sebagai counterstaining yang nantinya akan memberikan warna
kebiruan pada jaringan lainnya. 9ounterstaining bertujuan untuk memberikan warna
kontras terhadap hasil Imunohistikimia, sehingga jaringan berwarna coklat dapat
terlihat jelas dibandingkan dengan jaringan sekitarnya. Pada hasil Imunohistokimia
dari pelatihan penelitian ini, terlihat adanya sel kanker yang terwarna coklat diantara
jaringan lain yang berwarna kebiruan.
Kesimpulan
$. 'ahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur Imunohistokimia dengan baik
sehingga diperoleh preparat jaringan buli-buli dengan adanya warna coklat pada
pelatihan prosedur Imunohistokimia ini.
2. Pada preparat jaringan buli-buli yang dilakukan Imunohistokimia menggunakan
antibodi spesifik terhadap sel kanker buli-buli, terlihat adanya jaringan berwarna
coklat yang menunjukkan sel kanker pada jaringan tersebut dengan menggunakan
mikroskop cahaya.