Curs TSCB 2007 2008

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII
i

CUPRINS

Capitolul 1. Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez 1

1.1. Caracteristicile proceselor biotehnologice 3
1.2. Fazele unui proces biotehnologic 7
1.3. Sinteza schemelor tehnologice de prelucrare n aval de bioreactor 7
1.4. Criterii principale pentru o prelucrare eficient n aval de bioreactor 15

Capitolul 2. Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 18

2.1. Condiionarea lichidului de fermentaie prin floculare i coagulare 18
2.2. Separarea prin sedimentare gravitaional 21
2.3. Separarea prin filtrare 24
2.3.1. Mecanismul filtrrii 24
2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbunatire a filtrrii 26
2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare 27
2.4. Separarea prin centrifugare 35
2.4.1. Bazele teoretice ale sedimentrii n cmp de fore centrifugal 35
2.4.2. Tipuri de centrifuge utilizate n procesele de bioseparare 38
2.4.3. Aplicaii ale separrii centrifugale n biotehnologii 44
2.4.3.1. Separarea drojdiilor 44
2.4.3.2. Separarea bacteriilor 46
2.4.3.3. Separarea celulelor animale 47
2.4.3.4. Separarea resturilor celulare 48
2.4.3.5. Recuperarea i splarea corpilor de incluziune 48
2.4.3.6. Fracionarea plasmei umane 49
2.5. Separarea prin microfiltrare 51
2.6. Centrifugare sau microfiltrare ? 52

Capitolul 3. Dezagregarea masei celulare 53

3.1. Susceptibilitatea la rupere a celulelor 53
Cuprins

ii
3.1.1. Celule animale 53
3.1.2. Celule vegetale 54
3.1.3. Fungii i drojdii 55
3.1.4. Bacterii 55
3.2. Metode de dezagregare a celulelor 57
3.2.1. Metode mecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 58
3.2.1.1. Forfecarea lichidului cu ajutorul ultrasunetelor 58
3.2.1.2. Forfecarea lichidului prin agitare mecanic 59
3.2.1.3. Forfecarea lichidului prin presurizare 60
3.2.1.4. Forfecarea fazei solide prin mcinare 63
3.2.1.5. Forfecarea fazei solide prin presurizare 66
3.2.2. Metode nemecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 67
3.2.2.1. Dezagregarea celulelor prin deshidratare 67
3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode fizice 67
3.2.2.3. Permeabilizarea celulelor prin metode chimice 68
3.2.2.4. Permeabilizarea celulelor prin metode enzimatice 69
3.3. Influena dezagregrii asupra proceselor ulterioare de separare 71

Capitolul 4. Separarea prin extracie 73

4.1. Extracia fizic lichid lichid 74
4.1.1. Aspecte generale privind extracia lichid lichid 74
4.1.2. Aspecte particulare ale extraciei lichid lichid n bioprocese 75
4.1.2.1. Solveni de extracie 76
4.1.2.2. Echipamente de extracie 77
4.1.2.2.1. Extractoare centrifugale 78
4.1.2.2.2. Extractoare rotative cu agitare 83
4.1.2.2.3. Extractoare cu talere pulsate 84
4.1.2.2.4. Alte echipamente de extracie 85
4.1.3. Aplicaii ale extraciei lichid lichid n bioprocese 86
4.1.3.1. Extracia antibioticelor 88
4.1.3.2. Extracia alcoolilor 90
4.1.3.3. Extracia acizilor carboxilici 90
4.2. Extracia n sisteme apoase bifazice 92
4.2.1. Formarea sistemelor apoase bifazice 92
4.2.2. Mecanismul extraciei biopolimerilor 95
4.2.3. Proiectarea procesului de extracie n sisteme apoase bifazice 98
4.2.4. Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice 100
4.2.5. Procesul tehnologic de extracie n sisteme apoase bifazice 101

iii
4.2.6. Recuperarea chimicalelor i reducerea costurilor 103
4.2.7. Transpunerea la scar a extraciei n sisteme apoase bifazice 104
4.2.8. Aspecte economice ale extraciei n sisteme apoase bifazice 105
4.3. Extracia cu micele inverse 107
4.3.1. Formarea i proprietile micelelor inverse 107
4.3.2. Mecanismul extraciei n micele inverse 113
4.3.3.
Factorii care influeneaz transferul biomoleculelor n micelele
inverse
115
4.3.4. Reextracia din micele inverse 117
4.3.5. Procesul tehnologic de extracie cu micele inverse 119
4.3.6. Aplicaii ale extraciei cu micele inverse 121
4.3.6.1. Extracia cu micele inverse n prezena masei celulare 121
4.3.6.2. Izolarea i renaturarea proteinelor 122
4.3.6.3. Sinteza proteinelor n micele inverse 122
4.4. Extracia cu afroni 125
4.5. Extracia reactiv 127
4.5.1. Mecanismul extraciei reactive 128
4.5.2. Ageni de extracie 132
4.5.2.1. Derivai organofosforici 134
4.5.2.2. Amine cu mas molecular ridicat 135
4.5.2.3. Compui macrociclici 137
4.5.2.4. Sinergismul agenilor de extracie 140
4.5.3. Echipamente pentru extraci reactiv 141
4.5.3.1. Instalaii cu uniti distincte amestector decantor 141
4.5.3.2. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic 142
4.5.3.3. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic 142
4.5.3.4. Alte tipuri de extractoare 143
4.5.4. Extracia reactiv a produilor de biosintez 143
4.5.4.1. Extracia acizilor carboxilici 143
4.5.4.1.1. Extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici 144
4.5.4.1.2. Extracia acizilor carboxilici cu amine 145
4.5.4.2. Extracia aminoacizilor 151
4.5.4.2.1. Extracia aminoacizilor cu derivai organofosforici 152
4.5.4.2.2. Extracia aminoacizilor cu amine 154
4.5.4.2.3. Extracia aminoacizilor cu eteri-coroan i calixarene 156
4.5.4.3. Extracia antibioticelor 159
4.5.4.4. Alte aplicaii ale extraciei reactive 162
4.5.4.4.1. Extracia acizilor organici din produse naturale 162
4.5.4.4.2. Extracia vitaminelor 164
Cuprins

iv
4.5.4.4.3. Extracia selectiv a enantiomerilor 167
4.6. Extracia cu membrane lichide 175
4.6.1.


1

1. Etapele i caracteristicile
proceselor de biosintez

Noiunea de biotehnologie nu nseamn acelai lucru pentru toat lumea. Unii vd
biotehnologia reprezentnd toate formele de cercetare biologic, fie c este vorb de
fabricarea brnzei, obinerea berii sau tehnologia ADN-ului recombinat. Alii consider
c biotehnologie nseamn doar tehnici biologice moderne (ADN recombinat, tehnologii
de hibridizare, anticorpi monoclonali). n timp ce unii consider biotehnologia drept un
nou set de unelte n ldia cu scule a biologilor, pe Wall Street biotehnologia
reprezint doar o surs de noi oportuniti i de riscuri financiare.
O definiie destul de ampl consider biotehnologia ca fiind orice tehnic ce
utilizeaz organisme vii sau pri ale acestora pentru a elabora sau modifica produse,
pentru a mbunti plante sau animale, ori pentru a dezvolta microrganisme cu
utilizri specifice. O a doua definiie mai restrns definete biotehnologia drept
utilizarea industrial a ADN recombinat, a fuziunii celulare i a noilor tehnici de
bioprelucrare [1]. O definiie nc actual este cea adoptat n 1978 de ctre Federaia
European de Biologie: utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i ingineriei n
scopul obinerii unei aplicaii tehnologice (industriale), cu ajutorul microrganismelor,
culturilor de celule i a prilor componente ale acestora [2]. Cuvntul biotehnologie
provine din grecescul bios, care nseamn via (din care provine i biologia =
tiina vieii) i din tehnologie, care la rndul su provine tot din limba greac,
technos = meteug + logos = tiin.
Utilizarea microorganismelor pentru a transforma materialele de origine vegetal
sau animal n produse alimentare fermentate este cunoscut nc din antichitate. De
atunci biotehnologiile au evoluat i s-au diversificat, la ora actual fabricndu-se un
numr enorm de produse, de la relativ ieftinii solveni organici i bio-etanol, pn la
produse costisitoare ca antibiotice, proteine terapeutice, vaccinuri, hormoni, etc.
Un proces biotehnologic (bioproces) necesit o abordare pluri- i interdisciplinar.
Punerea la punct a unui bioproces industrial necesit o strns colaborare ntre
specialiti din domeniul biochimiei, geneticii, enzimologiei, microbiologiei, ingineriei
Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez

2
biochimice. Aceast abordare este evident dac ne uitm la etapele de dezvoltare
necesare unui proces industrial de obinere a unui produs pe baz de ADN recombinat:
insulin, hormon de cretere, interferon (fig. 1.1).
1. Biochimicale
2. Tesut animal
5. Gena
6. Portiune de
cromozom
7. Gena taiata
din cromozom
10. Inserare in
microorganism
9. Plasmida
recombinata
11. Multiplicarea
plasmidei si
inglobarea genei
12. Diviziunea
celulara
13. Cultura la scara redusa
14. Bioreactor de laborator
15. Bioreactor pilot
16. Instalatia industriala
17. Recuperarea produsului
18. Conditionare, ambalare
si comercializare
3. Microorganism
(ex: E. coli)
4. Plasmida
8. Plasmida
sectionata
1 12: GENETICA
12 14: MICROBIOLOGIE
14 18: INGINERIE DE PROCES

Figura 1.1. Etapele de dezvoltare ale unui bioproces pentru producerea i
comercializarea unui bioprodus pe baz de ADN recombinat [3]

Un proces biotehnologic este un proces complex, format din mai multe procese
tehnologice componente. Dintre procesele tehnologice componente nu trebuie s
lipseasc procesul esenial, respectiv procesul biochimic. Aa cum ntr-un proces
tehnologic din industria chimic trebuie s existe cel puin un proces chimic, proces care
implic transformri de substan la nivel molecular, i n procesul biotehnologic va
exista cel puin un proces biochimic, n care transformrile de substan la nivel
molecular decurg la nivelul unui organism viu (microbian, vegetal sau animal) sau al
unei poriuni din acesta (enzim). ntre un proces chimic i un proces biochimic nu
exist deosebiri fundamentale. n ambele exist o transformare fundamental la nivel
molecular (reacia chimic, respectiv reacia biochimic) nsoit de procese de transfer
de mas sau de energie (fig. 2.1).
Fenomene
de transfer
REACTIE
CHIMICA
Fenomene
de transfer
REACTII
BIOCHIMICE

Figura 1.2. Asemnri ntre procesul chimic i procesul biochimic
Proces biochimic
Proces chimic

3
1.1. CARACTERISTICILE PROCESELOR BIOTEHNOLOGICE

Faa de alte procese tehnologice ntlnite n industriile de proces, bioprocesele
prezint o serie de particulariti, cum ar fi [2 - 4]:
- capaciti de producie foarte variate: de la 20 milioane t/an (etanol) pn la mai
puin de 20 kg/an (insulin, interferon, anticorpi monoclonali) tab. 1.1;
- produsele de biosintez se gsesc deseori ntr-o concentraie foarte sczut n
masa de reacie evacuat din bioreactor (lichidul de fermentaie);
- separarea produsului se realizeaz n mai multe etape, acest lucru ducnd la
creterea costurilor; costul separrii poate atinge n unele cazuri 90 % din costul
total al procesului biotehnologic (tab. 1.2);
- lichidele de fermentaie au comportare de fluid nenewtonian; acest lucru necesit
o abordare specific n proiectarea echipamentelor n care se realizeaz procese
de transfer de impuls, cldur i mas;
- produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular mare, sunt labile
termic i chimic, sunt sensibile la fore de forfecare i la tensiuni interfaciale
ridicate; acest lucru face ca procedeele clasice de separare (distilarea, de
exemplu) s nu poat fi utilizate;
- n lichidele rezultate n bioprocese, alturi de produsul util exist o serie de
compui secundari (impuriti) ale cror caracteristici fizice i chimice sunt
similare cu ale produsului util; asemnarea proprietilor face foarte dificil
separarea;
- produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular ridicat, prezint o
mobilitate foarte redus.

Tabelul 1.1. Produse majore obinute prin biotehnologii [5]
Produsul de fermentaie Tipul de organism utilizat
Producie mondial
[kg/an]
Solveni organici
- etanol (fr utilizri alimentare) Saccharomyces cerevisiae 2 x 10
10
- aceton / butanol Clostridium acetobutylicum 2 x 10
6
(butanol)
Biomas
- culturi starter i drojdii pentru
industria alimentar i agricultur
Bacterii lactice sau drojdie de
panificaie
5 x 10
8
- proteine monocelulare Pseudomonas methylotrophus sau
Candida utilis
(0,5 1) x 10
8
Acizi organici
- acid citric Aspergillus niger (2 3) x 10
8
- acid gluconic Aspergillus niger 5 x 10
7
- acid lactic Lactobacillus delbrueckii 2 x 10
7
- acid itaconic Aspergillus itaconicus
Aminoacizi
- acid L-glutamic Corynebacterium glutamicum 3 x 10
8
- L-lisin Brevibacterium flavum 3 x 10
7
- L-fenilalanin Corynebacterium glutamicum 2 x 10
6
- L-arginin Brevibacterium flavum 2 x 10
6
- ali aminoacizi Corynebacterium spp. 1 x 10
6


4
Transformri microbiene
- steroizi Rhizopus arrhizus
- D-sorbitol n L-sorboz (la
fabricarea vitaminei C)
Acetobacter suboxydans 4 x 10
7
Antibiotice
- peniciline Penicillium chrysogenum (3 4) x 10
7
- cefalosporine Cephalosporium acremonium 1 x 10
7
- tetracicline Streptomyces aureofaciens 1 x 10
7
- macrolidice (eritromicina) Streptomyces erythreus 2 x 10
6
- polipeptidice (gramicidina) Bacillus brevis 1 x 10
6
- aminoglicozidice (streptomicina) Streptomyces griseus
- aromatice (griseofulvina) Penicillium griseofulvum
Polizaharide extracelulare
- xanthan Xanthomonas campestris 5 x 10
6
- dextran Leuconostoc mesenteroides
Nucleotide
- 5 guanozin monofosfat Brevibacterium ammoniagenes 1 x 10
5
Enzime
- proteaze Bacillus spp. 6 x 10
5
- -amilaze Bacillus amyloliquefaciens 4 x 10
5
- glucoamilaze Aspergillus niger 4 x 10
5

- glucozizomeraz Bacillus coagulans 1 x 10
5
- pectinaze Aspergillus niger 1 x 10
4
- renin Mucor miehei sau drojdie recombinat 1 x 10
4

- total alte enzime 5 x 10
4

Vitamine
- B
12
Propionibacterium shermanii sau
Pseudomonas denitrificans
1 x 10
4
- riboflavin Eremothecium ashbyii
Alcaloizi Ergot Claviceps paspali 5 x 10
3
Pigmeni
- shikonin Lithospermum erythrorhizon 60
- -caroten Blakeslea trispora
Vaccinuri
- antidifteric Corynebacterium diphtheriae < 50
- antitetanos Clostridium tetani
- antipertussis (tuse convulsiv) Bordetella pertussis
- antipoliomielitic virui activi atenuai crescui n rinichi
de maimu sau n celulele diploide
umane

- antirubeolic virui activi atenuai crescui n rinichi
de pui de hamster

- antihepatic B antigen de suprafa evideniat n
drojdia recombinat

Proteine terapeutice < 20
- insulin Escherichia coli recombinat
- hormonul creterii Escherichia coli recombinat sau celule
de mamifere recombinate

- eritropoietin celule de mamifere recombinate
- factorul VIII-C celule de mamifere recombinate
- activatorul plasminogen de esut celule de mamifere recombinate
- interferonul
2
Escherichia coli recombinat
Anticorpi monoclonali Celule Hybridoma < 20
Insecticide
- spori bacterieni Bacillus thuringiensis
- spori de fungi Hirsutella thompsonii

5
Datele din tab. 1.1 nu sunt exhaustive: nu au fost incluse procesele de epurare a
apelor uzate, de bioremediere a solurilor poluate, biolixivierea minereurilor sau
procesele clasice de fabricare a unor produse alimentare tradiionale: iaurt, pine, bere,
vin, oet.

Tabelul 1.2. Costul separrii bioproduselor ca fraciune din costul total de producie
Sursa Produsul
Costul separrii
(% din costul total)
Celule de biomas de drojdie Proteine monocelulare, extract de drojdie 5
Produse de mare tonaj Acid citric, lactic, malic 10 50
Enzime extracelulare Amilaze, proteaze 10
Penicilin 20 50
Antibiotice
Antibiotice noi 60
Enzime/proteine intracelulare Insulin, interferon 90

Produsele de biosintez se prezint n forme diverse i provin din surse variate.
Ele pot fi molecule de diferite dimensiuni, de la metabolii organici cu mas molecular
mic (etanol, acid citric, antibiotice), pn la peptide i proteine (insulin, anticorpi,
enzime) sau molecule bazate pe nucleotide (ARN, plasmide ADN). Aceste produse pot
fi metabolii ai microorganismelor, celulelor vegetale sau animale; pot reprezenta
produsul unei reacii enzimatice sau al unei sinteze peptidice sau pot fi, pur i simplu,
componente ale unei surse naturale: snge, lapte sau esut vegetal. Dac sursa
produsului este un microorganism, acesta se poate regsi excretat n mediul de cultur,
se poate acumula n citoplasma sau periplasma celulelor sau poate forma corpi de
incluziune agregate mari de proteine denaturate care se gsesc n interiorul bacteriei.
Concentraia produselor de biosintez poate varia pe o plaj foarte larg de
valori: de la sute de g/L (etanol, acid citric) la mg/L (anticorpi recombinai) sau chiar
g/L n cazul factorilor de coagulare ai sngelui. Dac n cazul produselor aflate n
concentraie ridicat izolarea/purificarea nu pune probleme deosebite, putndu-se
realiza prin intermediul operaiilor unitare clasice utilizate n industriile de proces (de
ex. separarea i concentrarea etanolului prin distilare), n cazul produselor aflate n
concentraii sczute, alturi de cantiti considerabile de impuriti, cum este cazul
factorilor de snge, anticorpilor monoclonali sau proteinelor recombinate, separarea i
purificarea este mult mai dificil i evident mai costisitoare. n general, ponderea
costului purificrii n costurile totale de producie depinde de concentraia produsului n
mediul de cultur, reprezentnd ntre 5 i 90 % din costurile totale (tab. 1.2). Ca o
consecin a acestui fapt, se poate constata c exist o relaie direct ntre preul de
vnzare al produselor de biosintez, pre care reflect costurile de producie, i
concentraia bioprodusului n mediul de cultur (fig. 1.3).
Cerinele de puritate ale produselor de biosintez sunt diferite. n funcie de
destinaia acestora este stabilit nivelul maxim acceptabil de impuriti, precum i natura
acestora. Produsele terapeutice de uz uman vor avea cele mai mari exigene de puritate,
n timp ce enzimele industriale se situeaz la polul opus (fig. 1.4). n tab. 1.3 se prezint
un exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinate.
Produsele de biosintez sunt caracterizate prin randamentul de obinere, puritate,
activitate specific, noiuni definite astfel:

6
[%] 100
separare de procesul in alimentata produs de masa
separata produs de masa
Randament = (1.1)
[%] 100
lor) impuritati (masa produs) de (masa
produs de masa
Puritate
+
= (1.2)

=
g
UAB

produsului masa
biologica activitate de unitati
specifica a Activitate (1.3)
Pre de vnzare, $/kg
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a
i
n
i
i
a
l
,

k
g
/
m
3
Aminoacizi
Antibiotice
Enzime ind.
Enzime de diagnostic/cercetare
Anticorpi monoclonali
Enzime terapeutice

Figura 1.3. Relaia dintre concentraia produsului n materialul de pornire i preul
de vnzare [6]

Tabelul 1.3. Exemplu de reglementare a
compoziiei unei proteine terapeutice
recombinate
Puritate > 99 %
Agregate < 1 %
Proteine din celula gazd < 1 ppm
Acizi nucleici
(majoritar ADN)
< 100 pg
per doz

Endotoxine < 5 UE*
per kg mas
corporal

Virui > 12 log
reducere

Celule i particule nedectabile
Substana solubil < 1 ppm
Figura 1.4. Cerine de puritate pentru
diverse enzime [7]
*UE = uniti de endotoxine

7
1.2. FAZELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC

Un proces biotehnologic industrial, cuprinde, de regul, urmtoarele procese
componente principale: selecia microorganismelor (celulelor), pregtirea mediului de
cultur, procesul biochimic propriu-zis, recuperarea (capturarea) produsului urmat de
separarea, purificarea i condiionarea acestuia (fig. 1.5). n funcie de poziia acestor
procese fa de procesul biochimic propriu-zis, care decurge n bioreactor, ele pot fi
incluse fie n prelucrarea n amonte de bioreactor (upstream processing), fie n
prelucrarea n aval de acesta (downstream processing).
Pregtirea mediului
de cultur
Selecionarea
microorganismelor
BIOPROCES
SEPARAREA
PRODUSULUI
UTIL
CONDIIONAREA
PRODUSULUI
AMBALARE BIOPRODUS
CAPTURAREA
PRODUSULUI
UTIL
PURIFICAREA
PRODUSULUI
UTIL
UPSTREAM PROCESSING DOWNSTREAM PROCESSING

Figura 1.5. Fazele principale ale unui proces biotehnologic industrial

Prelucrarea masei de reacie n aval de bioreactor este dictat de numeroi
factori, doi dintre acetia fiind fundamentali: natura produsului de biosintez obinut i
faza n care se gsete acesta n urma procesului de biosintez. n funcie de aceti
factori, la care se adaug cerinele de puritate, se sintetizeaz schema tehnologic de
separare care asigur obinerea produsului dorit n condiii de eficien economic
(respectiv cu costuri totale minime).

1.3. SINTEZA SCHEMELOR TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE N
AVAL DE BIOREACTOR

Elaborarea unei scheme de flux tehnologic pentru recuperarea i purificarea unui
produs de biosintez este un proces creativ, bazat pe experiena i imaginaia inginerului
de proces. Dei exist ncercri de transpunere a experienei acumulate n programe de
calculator, sub forma sistemelor expert, majoritatea inginerilor cu experien se bazeaz

8
pe cteva reguli de bun sim tehnic, cunoscute i ca reguli euristice. Cteva dintre
aceste reguli sunt enumerate n continuare [8]:
1. Iniial se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare;
2. Iniial se ndeprteaz impuritatea cel mai uor de separat;
3. Cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit;
4. Se alege acel proces de separare care face apel la diferena maxim ntre
proprietatile produsului i proprietile impuritilor;
5. Se aleg i se introduc alternativ n schema de separare procese care utilizeaz
diferite fore motoare pentru realizarea separrii.

n funcie de dimensiuni i de masa molecular, produsele de biosintez pot fi
molecule de mici dimensiuni (solveni organici, chimicale fine, antibiotice, hormoni,
aminoacizi, vitamine), molecule de dimensiuni mari (proteine, polizaharide, acizi
nucleici) sau produse particulate (celule, spori, lipozomi, particule subcelulare). Tab. 1.4
prezint o clasificare a produselor de biosintez n conformitate cu acest criteriu.

Tabelul 1.4. Categorii principale de produse de biosintez
n funcie de mrimea acestora [7]
Produsul Exemple Masa molecular (Da) Raza tipic
Zaharuri 200 600 0,5 nm
Aminoacizi 60 200 0,5 nm
Vitamine 300 600 1 2 nm
Molecule mici
Acizi organici 30 300 0,5 nm
Proteine 10
3
10
6
3 10 nm
Polizaharide 10
4
10
7
4 20 nm Molecule mari
Acizi nucleici 10
3
10
10
2 1000 nm
*
Ribozomi 25 nm
Virui 100 nm
Bacterii 1 m
Celule de drojdii 4 m
Produse particulate
Celule animale 10 m
*
- piese singulare de ADN genetic pot avea dimensiuni desfurate de ordinul mm, n funcie de
procedeul de izolare; diametrul elicii duble a ADN este de 2,5 nm.

Produsele obinute prin biosintez pot fi excretate de ctre celule, gsindu-se n
lichidul de fermentaie: acestea sunt produsele extracelulare. Aproape toate produsele
cu mas molecular mic i multe produse cu mas molecular mare sunt produse
extracelulare. Recuperarea i purificarea acestora este relativ simpl, datorit cantitii
reduse de impuriti existente n faza lichid n care se afl aceste produse de biosintez.
Dac produsul biosintetizat rmne in interiorul celulei, vorbim despre un produs
intracelular. Astfel de produse sunt, de exemplu, proteinele eucariote recombinate
produse de ctre microrganismele procariote. Produsele intracelulare se acumuleaz n
celule fie sub form nativ, fie sub form denaturat, caz n care, de cele mai multe ori
formeaz corpi de incluziune. n alte cazuri, produsul biosintezei este celula nsi.
Tabelul 1.5 prezint cteva exemple de diverse tipuri de produse de biosintez.


9
Tabelul 1.5. Clasificarea produselor de biosintez n funcie de faza n care se gsesc
Tip de produs Exemple Concentraie [g/L]
Extracelular alcooli, acizi organici
aminoacizi, enzime, antibiotice
100
20
Intracelular proteine pe baz de ADN recombinat 10
Celula nsi drojdie de panificaie, proteine monocelulare 30

Indiferent de faza n care se gsete produsul util, prima etap n prelucrarea n
aval de bioreactor este separarea masei celulare de lichidul de fermentaie (se aplic
regula euristic nr. 1: se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare).
Acest lucru fiind stabilit, prelucrarea ulterioar va merge pe una din cele trei ci redate
n fig. 1.6, n funcie de faza n care se gsete produsul biosintetizat. n majoritatea
cazurilor, biosepararea se realizeaz n patru trepte. Obiectivele i operaiile unitare
utilizate n fiecare treapt sunt redate n tab. 1.6.
RECUPERARE PURIFICARE
PRODUS
EXTRA-
CELULAR
RECUPERARE PURIFICARE
PRODUS
INTRA-
CELULAR
SEPARARE
LICHID-SOLID
F
E
R
M
E
N
T
A
R
E
Supernatant
Celule
DEZAGREGARE
CELULE
PRODUS
CELULAR
RESTURI
CELULARE

Figura 1.6. Schema general de prelucrare n aval de bioreactor

Tabelul 1.6. Obiective i operaii unitare tipice la biosepararea n patru trepte
Treapta Obiective Operaii unitare tipice
Separare
insolubile
- ndeprtarea celulelor, resturilor celulare i a
impuritilor insolubile
- reducerea volumului de prelucrat
- filtrare
- sedimentare
- extracie
- adsorbie
Izolare
produs
- ndeprtarea componentelor cu proprieti diferite de ale
produsului
- reducerea volumului de prelucrat
- extracie
- adsorbie
- ultrafiltrare
- precipitare
Purificare
primar
- ndeprtarea componentelor cu proprieti similare cu ale
produsului
- cromatografie
- metode bazate pe afinitate
- cristalizare fracionat
- precipitare fracionat
Purificare
avansat
- ndeprtarea lichidelor
- trecerea produsului n form cristalin
- uscare
- cristalizare


10
O structur generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor este redat n fig. 1.7.
Pentru fiecare tip de produs (extracelular sau intracelular) exist mai multe alternative
de prelucrare. Alegerea unei alternative de prelucrare i selectarea operaiei (operaiilor)
unitare corespunztoare se face innd cont de proprietile produsului, proprietile
impuritilor i de proprietile microorganismelor, celulelor sau esuturilor
productoare. Sinteza procesului tehnologic de separare va consta n alegerea
succesiunii operaiilor n conformitate cu cele 5 reguli euristice prezentate anterior, pe
baza structurii redate n fig. 1.7. Majoritatea bioproceselor, n special n cazul obinerii
produselor de mic tonaj i de valoare ridicat, sunt concepute pentru a fi conduse n
regim discontinuu. Procesele continue de bioseparare sunt utilizate n cazul produselor
de valoare relativ redus, fabricate n cantiti considerabile: etanol, butanol, acizi
organici, etc.
RECUPERAREA PRIMAR reprezint prima etap a procesului de
prelucrare n aval de bioreactor, etap n care are loc o oarecare purificare i o reducere
a volumului de material supus prelucrrii. Aa cum reiese din fig. 1.7, alegerea cii de
urmate depinde de locul n care se gsete produsul, respectiv dac acesta este
intracelular sau extracelular.
n cazul produselor intracelulare, prima etap de purificare o reprezint
recoltarea celulelor, respectiv ndeprtarea lichidului extracelular. Pentru realizarea
acestui proces se face apel fie la centrifugare, fie la filtrarea membranar (att micro-
ct i ultrafiltrare). Centrifugarea este avantajoas n cazul microorganismelor de
dimensiuni mari i cu densitate ridicat ( > 2 m, > 1,03 g/cm
3
), cum este cazul
drojdiilor. Pentru microorganisme mai mici se pot utiliza diverse tehnici de coagulare
pentru a mri dimensiunea particulelor care sedimenteaz. Filtrarea membranar este
avantajoas pentru recoltarea celulelor mici i uoare. Pierderile tipice de celule prin
centrifugare sunt cuprinse ntre 1 i 5%. Filtrarea membranar asigur o recuperare
practic integral a celulelor, aceasta n cazul n care nu se produce dezagregarea
celulelor sau sfierea membranei acestora.
Dezagregarea celulelor este de regul al doilea pas n separarea produselor
intracelulare. Scopul acestei operaii este de a deschide celulele gazd i de a elibera
produsul intracelular. Dezagregarea bacteriilor i a drojdiilor se realizeaz fie n
omogenizatoare de nalt presiune, fie n mori cu bile. Pentru capaciti mari (de civa
m
3
/h) numai omogenizatoarele sunt eficiente economic. Pentru eliberarea produselor
periplasmatice acumulate ntre membrana celular i peretele celular se utilizeaz
adeseori ocul osmotic. naintea dezagregrii, concentratul de celule este deseori diluat
cu un tampon litic al crui rol este de a minimiza denaturarea produsului dup
eliberarea sa din celul. Pentru microorganismele greu de dezagregat sunt necesare
treceri multiple prin omogenizator, la presiuni de 50 100 MPa. Trecerile multiple sunt
necesare i pentru eliberarea produilor care formeaz corpi de incluziune. Suplimentar
are loc fragmentarea resturilor celulare n particule foarte mici, facilitndu-se astfel
separarea ulterioar a corpilor de incluziune de resturile celulare. n aceast etap are
loc o oarecare degradare a produselor proteice datorit forfecrii puternice i a oxidrii.
ndeprtarea resturilor celulare se realizeaz de regul prin centrifugare sau
microfiltrare. Alte opiuni posibile sunt separarea n filtre rotative sub vid sau n filtre
pres, filtrarea n adncime, extracia sau cromatografia de adsorbie n strat expandat
(cromatografie ASE).

11
BIOREACTOR
Centrifugare
Microfiltrare
Ultrafiltrare
Omogenizare
Mcinare cu bile
oc osmotic
Centrifugare
Microfiltrare
Filtre la vid
Filtre pres
Filtrare la vid
Centrifugare
Microfiltrare
Ultrafiltrare
Filtre pres
Filtre lumnare
Flotaie
Soluii apoase bifazice

Solveni organici
Adsorbie strat expandat
Adsorbie discontinu
Fluide supercritice
Micele inverse
Distilare extractiv
Dizolvare
Rempturire
Ultrafiltrare
Evaporare
Osmoz invers
Precipitare
Cristalizare
Extracie
Adsorbie
Distilare
Cromatografie
Diafiltrare
Electrodializ
Electroforez
Atomizare
Congelare
Uscare n tvi
CONCENTRARE
RECOLTARE CELULE
DEZAGREGARE CELULE
NDEPRTARE
RESTURI CELULARE
RENATURARE
PURIFICARE FINAL
DESHIDRATARE
(NDEPRTARE
SOLVENT)
EXTRACIA PRODUSULUI
NDEPRTARE
BIOMAS
Produse intracelulare
Produse extracelulare
Corpi de
incluziune
Pentru forma solid final
Se cere puritate ridicat Se cere puritate sczut
R
E
C
U
P
E
R
A
R
E
P
R
I
M
A
R
R
E
C
U
P
E
R
A
R
E
I
N
T
E
R
M
E
D
I
A
R
P
U
R
I
F
I
C
A
R
E
F
I
N
A
L

Figura 1.7. Schema-bloc generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor [9]


12
Dac produsul este solubil, el este recuperat n timpul ndeprtrii resturilor
celulare fie n faza uoar a unei centrifuge, fie n permeatul unui filtru. Centrifugarea
asigur doar ndeprtarea resturilor celulare mari (cu un diametru Stokes de peste 0,5
m), aa c dup centrifugare este necesar o finisare a separrii prin filtrare. n caz
contrar, resturile celulare mici rmase n faza lichid pot provoca probleme serioase n
etapele ulterioare de prelucrare n cazul separrilor cromatografice, de ex. Pentru
finisarea separrii se pot folosi diverse tipuri de filtre (n strat adnc, pres, lumnare,
rotative sub vid, microfiltre membranare, etc.). Aceste filtre pot fi utilizate pentru
ndeprtarea resturilor celulare i fr o centrifugare prealabil a suspensiei.
Dac produsul este insolubil i formeaz corpi de incluziune, el va trebui mai
nti separat de resturile celulare, apoi dizolvat i renaturat (a se vedea cazul insulinei,
de ex.). Din fericire, corpii de incluziune sunt uzual de diametru mare (0,3 1,0 m) i
au densitate ridicat (1,3 1,5 g/cm
3
), putndu-se separa uor de resturile celulare ntr-o
centrifug separatoare cu talere. Corpii de incluziune se regsesc n faza grea colectat
din centrifug, n timp ce resturile celulare rmn n faza uoar. Faza grea este uzual
resuspendat i re-centrifugat de 2 3 ori, pentru a asigura o puritate corespunztoare
corpilor de incluziune. Resuspendarea se realizeaz ntr-o soluie diluat de detergent
pentru a facilita ndeprtarea altor contaminani. Se regleaz pH-ul i tria ionic a
soluiei astfel nct s se reduc hidrofobicitatea resturilor celulare i s se uureze
trecerea lor n faza uoar. O puritate final a produsului mai mare de 70% n aceast
etap reprezint un lucru comun.
Separarea produsului de resturile celulare se poate face i prin extracie i/sau
adsorbie. Pentru extracia produselor cu mas molecular mic (antibiotice, de ex.) se
folosesc frecvent solveni organici, iar recuperarea proteinelor se poate realiza folosind
sisteme apoase bifazice (SAB). Separarea produsului de resturile celulare i
concentrarea simultan a acestuia se poate realiza prin tehnici de adsorbie, putndu-se
folosi diveri adsorbani: schimbtori de ioni, adsorbani de afinitate, de schimbare de
faz, etc. Acest tip de purificare necesit amestecarea suspensiei cu coninut de resturi
celulare cu un adsorbant ntr-un recipient cu agitare. Dup adsorbie este necesar o
etap de splare care are drept scop ndeprtarea impuritilor i a resturilor celulare.
Mai recent se utilizeaz cromatografia ASE pentru separarea proteinelor de resturile
celulare. Suspensia este pompat ascendent prin stratul expandat. Proteina int este
legat de adsorbant n timp ce resturile celulare i ali contaminani trec prin strat fr a
se reine. O etap de splare ndeprteaz materialul slab reinut. Dup splare se
realizeaz eluia de pe adsorbant, urmat de o purificare avansat.
n cazul produselor extarcelulare, prima etap n procesul de separare o
reprezint ndeprtarea biomasei, care n acest caz este impuritatea aflat n cantitatea
cea mai mare. Aceast etap se realizeaz utiliznd una sau mai multe dintre
urmtoarele operaii unitare: filtrarea n filtre rotative la vid, centrifugarea n centrifuge
cu discuri sau centrifuge decantoare, filtrarea n filtre pres, ultrafiltrarea, flotaia, etc.
ntruct fiecare operaie unitar prezint avantaje i dezavantaje pentru diverse produse
i microorganisme, e dificil de selectat operaia optim pentru un sistem dat.
Filtrarea n filtre rotative la vid, n special cu utilizarea unui strat de adjuvant,
este metoda clasic cea mai utilizat pentru ndeprtarea organismelor micelare. Aceste
echipamente pot fi exploatate continuu pentru perioade lungi de timp i, n plus, debitele
de filtrat prelucrate sunt mari: peste 200 L/(m
2
.h), pn la 1000 L/(m
2
.h). Dezavantajul

13
principal al acestor utilaje este problema depozitrii amestecului de biomas i adjuvant,
acesta din urm fiind adugat ntr-o cantitate cel puin egal cu biomasa. Reglementrile
severe de mediu fac costisitoare depozitarea acestor materiale.
Centrifugarea n centrifuge separatoare cu talere sau n centrifuge decantoare,
se utilizeaz frecvent n instalaiile de capacitate mare. Centrifugele separatoare
lucreaz la turaii mai ridicate, putnd ndeprta microorganisme mai mici i mai uoare.
Performanele centrifugelor decantoare pot fi mbuntite prin adaosuri de ageni de
coagulare. ntruct nu necesit adaos de adjuvant, centrifugarea este mai avantajoas
dect filtrarea n filtre rotative sub vid. Uzual, pasta de biomas rezultat la centrifugare
conine ntre 40 i 60% v/v lichid extracelular. Pentru recuperarea produsului dizolvat,
pasta este de regul splat i apoi recentrifugat.
Filtrarea membranar (micro- i ultrafiltrare) permite trecerea n permeat a
produsului extracelular, reinnd n concentrat biomasa i alte componente particulate.
Concentrarea este uzual urmat de diafiltrare, n vederea creterii randamentului de
recuperare a produsului. Filtrele cu membran sunt utilizate n special n recuperarea
produilor cu mas molecular redus, cum ar fi antibioticele din miceliu. Pentru
produii cu mas molecular mare, aplicaiile sunt limitate la cazurile n care cantitatea
de solide este mai redus dect n cazul culturilor celulare.
RECUPERAREA INTERMEDIAR, care urmeaz recuperrii primare, are
drept scop concentrarea i purificarea produsului. Dac produsul este solubil, etapa de
recuperare intermediar o reprezint concentrarea. n cazul produselor denaturate
insolubile, etapa de recuperare intermediar const n dizolvarea i renaturarea
(rempturirea) produsului, urmat ulterior de concentrare i purificare.
Concentrarea produsului este o etap necesar ntruct dup separarea
primar, produsul se gsete, de regul, ntr-o soluie diluat. Reducerea volumului prin
concentrare este n concordan cu regulile euristice 1 i 2. Dintre posibilitile de
concentrare se pot meniona ultrafiltrarea, osmoza invers, evaporarea, adsorbia,
precipitarea, extracia i distilarea.
Ultrafiltrarea este utilizat n mod extensiv pentru concentrarea soluiilor de
proteine. Masa molecular de tiere a membranei este aleas astfel nct s fie reinut
produsul, n timp ce impuritile nedorite (de regul solubile i cu mase moleculare
mici) s poat trece prin membran n fluxul de permeat. n comparaie cu evaporarea,
ultrafiltrarea are avantajul operrii la temperaturi sczute i posibilitatea ndeprtrii
impuritilor solubile. Parametrii tipici de operare sunt o cdere de presiune trans-
membranar de 0,2 0,5 kPa i un debit mediu specific de 20 L/(m
2
.h).
Osmoza invers necesit membrane cu dimensiuni ale porilor mai mici, pentru a
putea face posibil concentrarea produselor cu mase molrculare mai mici: antibiotice,
anumii aminoacizi, etc.
Evaporarea poate fi utilizat cu condiia asigurrii condiiilor blnde de
prelucrare, pentru a nu periclita produsul. Se utilizeaz evaporatoare rotative cu film
subire, operate la temperaturi relativ coborte (40 50 C), sub vid. n comparaie cu
ultrafiltrarea, evaporarea prezint dezavantajul lipsei oricrui fel de purificare n timpul
concentrrii, avnd ns avantajul obinerii unor soluii cu o concentraie mai ridicat i
pe acela al posibilitii prelucrrii comode a unor volume mari de soluie.

14
Precipitarea este o modalitate de concentrare i purificare frecvent utilizat
pentru fraciunile proteice din snge, sau pentru acidul citric, de ex. Pentru precipitarea
compusului dorit, n soluie se pot aduga sruri, solveni sau polimeri, sau se poate
modifica pH-ul, tria ionic sau temperatura soluiei. De multe ori precipitarea apare ca
etap urmtoare extraciei realizate prin intermediul soluiilor apoase bifazice de
polimer/sare (PEG i fosfat de potasiu, de ex.). Cnd produsul se recupereaz n faza
bogat n polimer precipitarea se realizeaz prin adaos suplimentar de polimer n
soluie. Din punct de vedere economic se recomand recuperarea i reciclarea agenilor
de precipitare. Procesul de precipitare se poate utiliza i pentru ndeprtarea
impuritilor. De ex., acizii nucleici pot fi ndeprtai prin precipitare cu sulfat de
mangan i streptomicin sulfat.
Distilarea este utilizat n cazul concentrrii i purificrii solvenilor organici
care nu se degradeaz sub influen temperaturii: etanol, acid acetic, etc.
Renaturarea produsului este necesar atunci cnd acesta se gsete sub form
de corpi de incluziune. Proteinele eucariote sintetizate de ctre microorganismele
procariote formeaz corpi de incluziune insolubili n celula gazd. Acetia pot fi
dizolvai utiliznd soluii de haotropi
1
puternici, cum ar fi clorhidratul de guanidin (6
M) sau ureea, n prezena unui agent reductor ca 2-mercaptoetanol (0,5 M) sau
ditiotrietol (50 mM). Proteina dizolvat este lsat apoi s-i reia conformaia original,
ndeprtnd agenii haotropi prin diafiltrare sau cromatografie i dilund soluia pn la
o concentraie total de protein de 20 50 mg/L. Diluia este necesar pentru
minimizarea interaciunilor intermoleculare care pot aprea n timpul rempturirii i pot
conduce la inactivarea produsului. Procesul de rempturire este finalizat prin adaosul
de mici cantiti de glutation n form redus (2 5 mM) i oxidat (1 2 mM), urmat
de incubarea timp de 5 10 ore la 35 40 C.
PURIFICAREA FINAL ine cont de cerinele de puritate ale produsului
obinut. De regul produsele farmaceutice (antibiotice, hormoni, etc.) necesit o puritate
ridicat, n timp ce produsele industriale (enzime pentru detergeni, solveni, acizi
organici, etc.) necesit o puritate relativ sczut, ce poate fi asigurat prin deshidratare
sau, mai general, prin ndeprtarea solventului. Pentru produsele de nalt puritate, etapa
de purificare final implic o combinaie de etape de cromatografie i de filtrare, iar
dac produsul finit este necesar n form solid, aceste etape sunt urmate de o
deshidratare sau ndeprtare a solventului.
Cromatografia se realizeaz de regul ctre sfritul procesului global de
bioseparare, n conformitate cu regula euristic nr. 3: cea mai dificil i mai costisitoare
separare se realizeaz la sfrit. n cazul produselor biologice cu valoare ridicat, pn
la aplicarea separrilor cromatografice s-a ndeprtat deja cea mai mare parte a
impuritilor, concomitent cu reducerea de 50 100 de ori a volumului de prelucrat,
ajungndu-se la un influent cu 1 5% (m/v) coninut de proteine la intrarea n unitatea
de separare cromatografic. Progresele recentele ale cromatografiei ASE permit
utilizarea etapei cromatografice de separare n etapa de recuperare primar, deoarece

1
Haotropismul (din cuvintele greceti chaos = dezordine, haos, confuzie i tropos = form) este
proprietatea anumitor substane, de regul ioni (tiocianat, perclorat, guanidin), de a destructura
proteinele, de a promova solubilitatea unor substane nepolare n solveni polari, n general de a modifica
structura apei, proteinelor, organismelor vii, permind realizarea unor procese care altfel nu ar fi posibile.
n contrast cu haotropismul este cunoscut cosmotropismul [10, 11].

15
aceast tehnic cromatografic permite captura, concentrarea i purificarea produsului
direct din lichidul de fermentaie care conine celule, resturi celulare i alte particule
solide. n consecin, cromatografia ASE are potenialul de a elimina etapele
preliminare de separare a biomasei sau a resturilor celulare sau de concentrare a
produsului.
O secven de mai multe etape de separare cromatografic este necesar de
regul pentru atingerea gradului de puritate cerut, iar aceste etape se aleg n
conformitate cu regulile euristice 4 i 5. De ex., n concordan cu regula euristic nr. 5,
o etap de separare prin schimb ionic nu trebuie s fie urmat de o alt etap de separare
de acelai tip, ci de o etap de separare bazat pe o alt for motoare: cromatografie de
afinitate sau de inversie a fazelor.
Etapele de filtrare membranar se intercaleaz de regul ntre separrile
cromatografice, n vederea modificrii tamponului sau pentru concentrarea soluiilor
diluate de produs.
Deshidratarea sau ndeprtarea solventului se realizeaz prin uscare. Atunci
cnd produsele suport temperaturi de 50 100 C se poate utiliza uscarea prin
pulverizare, uscarea n strat fluidizat sau uscarea n strat fix. Dac produsele sunt
termolabile se utilizeaz uscarea prin congelare (aa-numita frreeze drying).
Echipamentele necesare pentru realizarea procesului implic costuri ridicate de investiii
i se recomand evitarea, pe ct posibil, a utilizrii sale.
Cu titlu exemplificativ, n fig. 1.8 sunt prezentate schemele tehnologice de
obinere a dou bioproduse: sinteza, separarea i purificarea unui compus extracelular,
cu valoare relativ sczut i cerine de puritate obinuite acidul citric (fig. 1.8 a);
sinteza, separarea i purificarea unui compus intracelular, cu valoare ridicat i cerine
calitative nalte insulina (fig. 1.8 b). Se poate remarca diferena de complexitate ntre
cele dou procese, precum i numrul net superior de etape de separare i purificar n
cazul producerii insulinei.

1.4. CRITERII PRINCIPALE PENTRU O PRELUCRARE EFICIENT
N AVAL DE BIOREACTOR

Aa cum s-a artat anterior, inginerul de proces are de ales ntre diverse ci de
prelucrare a masei de reacie. Pentru fiecare cale de prelucrare exist mai multe operaii
unitare posibil de aplicat, iar fiecare operaie unitar se poate realiza n cteva tipuri de
echipamente. Pe lng regulile euristice enunate n capitolul precedent, este util de tiut
c:
- dac produsul are o valoare de piaa ridicat, gradul de recuperare trebuie s fie ct
mai ridicat;
- echipamentele alese trebuie s aib o fiabilitate ct mai nalt;
- numrul etapelor de prelucrare trebuie redus la minimum, n acest mod scznd
costurile de investiii i de exploatare;
- procesul ales trebuie s asigure o reducere de volum considerabil de la bulionul de
fermentare iniial pn la fluidul din faza final de recuperare a produsului: o
reducere cu minimum trei ordine de mrime (1000 : 1) ar fi rezonabil;

16
Etapa de fermentare
Etapa de recuperare
Etapa de izolare

a Biosinteza acidului citric
Etapa de fermentare
Etapa de recuperare primar
Etapa de reacie
Etapa de purificare final

b Biosinteza insulinei
Figura 1.8. Scheme tehnologice pentru obinerea produselor de biosintez ntr-o
form comercializabil [8]

17
- prelucrarea trebuie s conduca la un bulion epuizat final uor de reciclat, pentru a
face posibil recuperarea nutrienilor neconsumai;
- prelucrarea n aval de bioreactor trebuie nceput imediat ce bulionul prsete
seciunea de fermentare; orice ntarziere sau stocare necesit vase de stocare
costisitoare, existnd i posibilitatea deteriorrii sau contaminrii produsului din
bulion;
- ntrucat n majoritatea proceselor biotehnologice concentraia produsului este
sczut, costul pe unitate de volum de bulion procesat n recuperarea primar va
avea o pondere nsemnat n costul final de producie.

Alegerea metodei de recuperare este influenat i de alte criterii, cum ar fi: locul
i starea n care se afl produsul, concentraia produsului, proprietile fizico-chimice
ale produsului, aplicaiile acestuia, cerinele de minim puritate, caracteristicile fizico-
chimice ale impuritilor, preul de pia al produsului, etc.

Tabelul 1.7. Categorii de produse de biosintez
Caracteristici Produse low-tech Produse high-tech
Producie mare (peste 1.10
4
kg/an) mic (sub 1.10
4
kg/an)
Valoare de pia mic (sub 100 USD/kg) mare (peste 1000 USD/kg)
Puritate cerut mic (maximum 90 95 %) mare (uzual peste 99 %)
Costuri de separare mici (sub 50% din costurile totale) mari (pn la 90% din costurile totale)
Etape de separare puine numeroase
Tehnologia de separare clasic, fr probleme deosebite sofisticat
Exemple solveni (etanol, butanol, aceton)
acizi organici
aminoacizi
proteine monocelulare
enzime industriale
antibiotice
vitamine
pigmeni
enzime de diagnoz
enzime terapeutice
vaccinuri
proteine terapeutice

Produsele obinute prin biosintez pot fi ncadrate n dou mari categorii (tab.
1.7). n prima categorie intr produsele care se obin n cantiti mari, au o valoare de
pia relativ sczut i nu necesit o puritate prea ridicat: etanol, butanol, aceton, acizi
organici, proteine monocelulare, enzime industriale, antibiotice. Separarea i purificarea
acestor produse se poate realiza folosind o succesiune de operaii unitare clasice,
cunoscute i aplicate frecvent n industriile de proces: filtrare, centrifugare, flotaie,
extracie cu solveni, adsorbie, precipitare, evaporare, uscare, etc. n a doua categorie
sunt incluse produsele care se obin n cantiti mult mai reduse, au o valoare de pia
ridicat i necesit o purificare avansat: vitamine, pigmeni, enzime de diagnoz i
terapeutice, vaccinuri, proteine terapeutice, etc. Pentru separarea i purificarea acestor
produse, operaiile unitare clasice nu sunt suficiente, fcndu-se apel la o serie de
tehnici noi, de cele mai multe ori concepute iniial pentru operare la scar de laborator i
uletrior transpuse la scar industrial: ultracentrifugare, dezagregare mecanic,
precipitare fracionat, cromatografie n strat fix, ultrafiltrare, dializ, diafiltrare,
osmoz invers, liofilizare, etc.

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

18

2. Separarea masei celulare
de lichidul de fermentaie

Fie c este vorba de recoltarea celulelor sau de ndeprtarea biomasei, dup
cum produsul dorit este intra- sau extracelular (vezi fig. 1.7), acesta este primul proces
de prelucrare n aval de bioreactor, al crui scop este de a reine acea faz care conine
produsul util, concomitent cu reducerea considerabil a volumului de prelucrat, prin
ndeprtarea celeilalte faze. Pentru separarea celulelor de lichidul de fermentaie avem
la ndemn cel puin cinci tehnici de separare: sedimentarea, filtrarea, centrifugarea,
ciclonarea i microfiltrarea. Suplimentar, flocularea celulelor poate fi utilizat pentru
mbuntirea eficienei tuturor acestor tehnici.

2.1. CONDIIONAREA LICHIDULUI DE FERMENTAIE PRIN
FLOCULARE I COAGULARE

Pentru facilitarea proceselor ulterioare de separare a masei celulare de lichidul
de fermentaie este util aglomerarea particulelor celulare n agregate mari, uor
separabile. n absena floculrii sau coagulrii, sedimentarea gravitaional a
particulelor celulare i subcelulare decurge foarte lent (tab 2.1).

Tabelul 2.1. Timpul de sedimentare natural al diferitelor particule
Tipul
particulei
Diametrul particulei
[m]
Suprafaa specific
[m
2
/m
3
]
Durata de
sedimentare
Bacterii 1 6 000 000 8 zile
0,1 60 000 000 2 ani
Coloizi 0,01 600 000 000 20 ani
0,001 6 000 000 000 200 ani

Flocularea este definit ca fiind fenomenul de agregare a particulelor solide,
indus de adaosul unui polimer, n timp ce coagularea se refer la o agregare indus de

19
ctre fore de atracie electrostatice sau de tip van der Waals care apar ntre particule
(fig. 2.1) [12]. Agregarea celulelor a fost definit drept aglomerarea acestora n scopul
formrii unor asociaii multicelulare stabile i consistente, sub influena anumitor
condiii fiziologice [13].
Din punctul de vedere al
inginerului biotehnolog, distincia dintre
coagulare, agregare, floculare i
aglomerare, nu este ntotdeauna clar.
Cuvinte ca: agregate, flocoane,
aglomerate, clustere, sunt deseori
utilizate drept sinonime. Ele se refer la
un ansamblu de celule individuale,
format din celule iniial libere sau prin
absena dispersiei celulare, sub
influena anumitor condiii fiziologice,
sau dup adugarea anumitor ageni n
mediu.
n fig. 2.2 se prezint dou din
mecanismele principale care produc
aglomerarea celulelor. n primul caz
(fig. 2.2 a) aglomerarea se datoreaz
formei naturale a celulelor, care
prezint diveri apendici. Aceti apendici depesc bariera energetic (reprezentat
punctat) care ine la distan celulele, permindu-le astfel apropierea i asociere. n al
doilea caz, agentul de floculare (polimerul reprezentat prin linia curb) se ataeaz de
celul (fig. 2.2 b). Dac tria ionic a soluiei este suficient de sczut, raza de repulsie
(bariera energetic reprezentat punctat) se micoreaz, permind formarea punilor de
polimer ntre celule (fig. 2.2 c).

a b c
Figura 2.2. Mecanisme principale de aglomerare a celulelor:
a prin apendici; b, c prin puni de polimer

n cazul separrii celulelor prin centrifugare, flocularea ar trebui s conduc la
formarea unor flocoane cu rezisten mecanic sporit. n producerea microalgelor,
metoda cea mai economic de recoltare s-a dovedit a fi flocularea chimic urmat de
sedimentare, flotaie sau filtrare [14].
E
E
S
energie van der Waals
energie electrostatic
energie rezultant
barierenergetic
distan

Figura 2.1. Diagrama energetic a
suspensiilor coloidale

20
Pentru aglomerare se pot utiliza particule coloidale, sruri, polimeri solubili, sau
combinaii ale acestora. Eficiena aglomerrii poate fi hotrtor influenat de tria
ionic a soluiei. La creterea triei ionice, eficiena aglomerrii scade dramatic.
Celulele de Saccharomices cerevisiae formeaz flocoane n prezena particulelor
submicronice de Al(OH)
3
ncrcate pozitiv. De asemenea, pentru obinerea de flocoane
din celule sau resturi celulare de S. cerevisiae i Escherichia coli se pot utiliza particule
de polimer organic ncrcate pozitiv (de ex. polistiren-divinilbenzen cu grupri de
amoniu cuaternar la suprafa, avnd diametrul particulelor de 0,27 m) [15].
Electroliii simpli favorizeaz coagularea particulelor prin comprimarea stratului
dublu electric care nconjoar particulele coloidale. Efectul cel mai puternic l au ionii
metalici cu sarcin mare (Al
3+
, Fe
3+
), a cror tendin de adsorbie este mai mare. Mai
mult, prin hidroliz aceti ioni formeaz compleci polinucleari hidroxo, ncrcai
pozitiv, care au capacitatea de a inversa sarcina superficial a coloizilor. Concentraia
ionilor metalici trebuie s fie suficient de mare pentru a putea comprima stratul dublu
electric. O supradozare poate duce ns la inversarea sarcinii particulelor coloidale i la
restabilizarea lor.
Polimerii solubili folosii pentru aglomerare sunt fie polimeri sintetici, fie
biopolimeri de origine natural. Polimerii sintetici folosii ca floculani pot fi anionici
(acrilamide i copolimeri acizi), cationici (copolimeri ai acrilamidei cu metacrilatul sau
acrilatul de dimetil-aminoetil) i neionici (poliacrilamida PAA). Dintre acetia, PAA
i derivaii si sunt folosii pe scar larg, datorit economicitii i eficacitii lor [16].
ntruct monomerul acrilamid are proprieti puternic neurotoxice i cangerigene, se
fac eforturi pentru gsirea unor nlocuitori mai siguri, biodegradabili, cu un impact mai
redus asupra sntii umane i asupra mediului nconjurtor. Astfel, s-a constatat c
anumite microorganisme (Rhodococcus erythropolis) provoac flocularea celulelor de
drojdii, de E. coli, de nmol activ, de Microcystis aeruginosa, etc. Procesul este efectiv
la pH = 3 5, i este considerabil mbuntit prin adaos de ioni de Ca
2+
[17, 18].
Polizaharidele sintetizate i excretate de Paecilomyces provoac flocularea E. coli la pH
= 4 8 i trii ionice de 0,0001 0,1 M [19].
Fa de polimerii sintetici, chitosanul, un polimer natural derivat din chitin,
componentul majoritar al exoscheletului crustaceelor, prezint cteva avantaje:
monomerii nu sunt toxici, poate fi sterilizat termic fr degradare, este biodegradabil.
La pH acid este solubil, gsindu-se sub form de lanuri liniare (datorit repulsiei dintre
gruprile aminice ncrcate electric, NH
3
+
), n timp ce la pH alcalin (peste 7,9, punctul
de neutralizare) tinde s se ncolceasc i s precipite. Chitosanul poate fi folosit n
flocularea E. coli, Euglena gracilis, sau n separarea selectiv a -D-galactozidazei de
resturile celulare i acizii nucleici provenii prin dezintegrarea celulelor de E. coli [20].
Utilizarea adaosurilor pentru aglomerare prezint i o serie de dezavantaje,
dintre care pot fi menionate: (1) cunoaterea insuficient a mecanismelor care provoac
aglomerarea, ceea ce nseamn un control redus al procesului, (2) fermentaia avnd loc
n arje, caracteristicile suspensiei pot varia de la o arj la alta, astfel nct comportarea
la adugare de floculani poate fi nepredictibil, (3) de cele mai multe ori floculanii
adaugai sunt incompatibili cu procesul de fermentare, fcndu-se astfel imposibil
recircularea nutrienilor neconsumai din lichidul de fermentaie, (4) flocoanele formate
sunt instabile, putnd fi degradate prin forfecare, (5) procedura este puin aplicabil
deeurilor celulare, (6) apar costuri suplimentare.

21
Flocularea poate fi controlat i de ctre factori genetici. Astfel, adugarea de
amidon la o suspensie de E. coli a condus la formarea unor flocoane bacteriene,
permind ulterior o separare foarte eficient a celulelor prin sedimentare. Flocularea a
depins de un receptor maltoporin pentru amidon aflat la suprafaa celulei. Expresia
acestui receptor maltoporin poate fi controlat genetic, astfel nct prezena sa la
suprafaa celulei s fie independent de proprietile suprafeei.
Agregarea amidono-dependent a celulelor este potenial aplicabil i altor
microorganisme care rspund urmtoarelor cerine: (1) prezint receptori pentru
amidon, (2) suprafaa celular nu este mascat de un strat de protein sau polizaharid,
(3) celula nu produce enzime amilolitice extracelulare. Utilizarea amidonului n
recoltarea celulelor bacteriene ofer cteva avantaje: (1) legarea de celule este rapid,
(2) amidonul este netoxic, (3) spre deosebire de floculanii ncrcai electric, nu
afecteaz pH-ul, iar legarea sa este efectiv n condiiile de pH n care au loc de regul
procesele de fermentaie, (4) este un produs ieftin, (50 este uor separabil de bacterii,
dac acest lucru este necesar [21].

2.2. SEPARAREA PRIN SEDIMENTARE GRAVITAIONAL

Sedimentarea gravitaional, ca proces de separare a celulelor de faza lichid,
este aplicat n diverse procese de biosintez sau de bioseparare: (1) producerea
proteinelor terapeutice sau de diagnoz din celule de mamifere, (2) atingerea unor
concentraii ridicate de celule n fermentatoarele continue prin recircularea celulelor, (3)
tratarea biologic a apelor uzate sau a deeurilor, (4) producerea berii, (5) studiul
diverselor tipuri de celule implicate n rspunsul imunologic, (6) recoltarea celulelor
obinute n micropurttori sau n culturi celulare n suspensie [22].
Utilizarea sedimentrii gravitaionale n separarea celulelor prezint o serie de
aspecte particulare, i anume:
- Sedimentarea ca proces de separare este o tehnic blnd. Acest lucru este important
n biologia celular, cnd capacitile funcionale ale celulelor izolate nu trebuie
alterate n timpul separrii.
- Se preteaz foarte bine la manipularea aseptic. Echipamentele sunt uor de
asamblat, curat i sterilizat.
- Din punct de vedere practic, sedimentarea neajutat poate fi prea lent dac
vitezele de sedimentare sunt mici. La scar industrial, durata prea mare a
procesului poate periclita creterea microbian sau poate accelera degradri
enzimatice nedorite.
- n forma ei cea mai simpl, sedimentarea gravitaional poate fi cea mai ieftin
tehnic de separare a celulelor.
- Este o operaie simpl i fezabil. Spre deosebire de centrifugare, de ex., nu necesit
o pregtire special a personalului de exploatare.

Ca regul general, sedimentarea gravitaional poate fi utilizat pentru separare
dac diametrul celulelor depete 1 m. La dimensiuni mai mici ale particulelor
trebuiesc avute n vedere alte opiuni: centrifugare, ultracentrifugare, filtrare, separare
membranar.

22
Civa factori mai importani influeneaz sedimentarea gravitaional a
celulelor ntr-o faz lichid, i anume:
- diferena dintre densitatea celulei (
c
) i densitatea mediului lichid nconjurtor (
l
);
- densitatea fazei lichide (
l
);
- mrimea, forma i concentraia celulelor;
- viscozitatea fazei lichide (
l
).
Legtura dintre aceti factori este dat de expresia vitezei de sedimentare n
regim laminar (Re < 1), cunoscut i ca legea lui Stokes modificat:
g d v
c
l
l c

=
2
0
) (
18
1

(2.1)
n care d
c
reprezint diametrul celulelor, iar g acceleraia gravitaional, ceilali termeni
avnd semnificaia prezentat anterior. Pentru mrirea vitezei de sedimentare se poate
actiona prin mrirea diferenei de densitate ntre celule i faza lichid, prin creterea
mrimii particulelor care sedimenteaz (floculare, coagulare, agregare), sau prin
micorarea viscozitii fazei lichide.
n multe separri la scar industrial, viteza de sedimentare a celulelor este prea
sczut, datorit faptului c celulele biologice i agregatele celulare au densiti mici.
Deoarece viteza de sedimentare este direct proporional cu diferena de densitate ntre
celule i faza lichid, modificarea densitii fazei lichide poate accelera separarea. Dac,
de ex., avem de separat un amestec de dou tipuri de celule avnd densiti diferite (1,05
g/cm
3
i 1,1 g/cm
3
), prin mrirea densitii fazei lichide (care se poate realiza prin adaos
de ficoll, ser bovin fetal, albumin) se mrete raportul dintre vitezele relative de
sedimentare ale celor dou tipuri de celule, ducnd la mbuntirea separrii (fig. 2.3).
Pornind de la aceast observaie se poate utiliza un gradient de densitate n faza lichid
n care are loc sedimentarea, realizndu-se aa-numita sedimentare izocinetic.

Densitatea fazei lichide [g/cm
3
]
R
a
p
o
r
t
u
l
v
i
t
e
z
e
l
o
r
d
e

s
e
d
i
m
e
n
t
a
r
e

Figura 2.3. Efectul densitii fazei lichide
asupra raportului vitezelor de sedimentare
Tabelul 2.2. Distana parcurs n
timp de 1 h de o particul sferic
(
c
= 2,0 g/cm
3
) printr-un lichid
(
l
= 1,0 g/cm
3
) la 298 K
Raza particulei
[nm]
Distana
parcurs
0,1 0,08 nm
1,0 8 nm
10 0,8 m
100 80 m
1000 8 mm

n tab. 2.2 s-a calculat distana ipotetic parcurs ntr-o or de o celul sferic cu
densitatea de 2,0 g/cm
3
care sedimenteaz ntr-un lichid de densitate 1,0 g/cm
3
. Datele

23
din tab. 2.3 ofer o idee asupra dimensiunilor tipice ale diverselor tipuri de celule
ntlnite n practic.

Tabelul 2.3. Dimensiuni tipice ale unor celule
Tipul de celul Dimensiuni [nm]
Virui bacterieni 0,08
Bacterii 0,1 2,5
Celule de drojdie 2 10
Globule roii umane (eritrocite) 6 8
Globule albe umane (leucocite) 8 12
Fungii filamentoase 10 40
Celule de ficat uman 30
Celule vegetale 10 100
Protozoare (paramecium, didinium) 100 200

Teoretic, viteza de sedimentare este direct proporional cu ptratul diametrului
celulelor. Orice mrire a diametrului agregatelor celulare va duce la creterea
considerabil a vitezei de sedimentare. Creterea real nu este cea dat de legea lui
Stokes, ci mai redus: n cazul agregatelor celulare poroase de nmol activat s-a
constatat o mrire a vitezei de sedimentare proporional cu d
0,55
[23].
Viteza de sedimentare este invers proporional cu viscozitatea fazei lichide.
ntruct viscozitatea nu variaz liniar cu concentraia, o diluare cu 25 50% poate
conduce la o descretere mai mare a viscozitii, ducnd la creterea vitezei de
sedimentare. Dac dimpotriv se dorete ncetinirea sedimentrii celulelor, se pot
aduga n faza lichid substane care mresc viscozitatea (de ex., soluii de 4% dextran
cu masa molecular medie de 500 kDa).
n aplicaiile industriale, sedimentarea gravitaional se realizeaz de regul n
rezervoare de sedimentare specifice. Acestea sunt prevzute cu un racord de alimentare,
un racord de evacuare sau de preaplin i un racord pentru evacuarea materialului
sedimentat. Exist i alte echipamente care pot fi foarte eficiente n anumite situaii. Un
astfel de echipament, care utilizeaz un dispozitiv nclinat, format din plci paralele,
este redat n fig. 2.4 [24]. Acest
dispozitiv este utilizat pentru
recircularea celulelor n procesele
continue de de cultur a celulelor
sau de fermentare. Concepia
aparatului permite nu numai
obinerea unor densiti ridicate
de mas celular n fermentator,
ci i o modalitate eficient de
reinere selectiv a celulelor.

Alimentare
cu suspensia
de celule
Evacuare
faza
lichid
Dispozitiv de
sedimentare
Conducta de retur pentru celulele sedimentate
(Dac dispozitivul este cuplat cu un bioreactor,
aceast conduct alimenteaz partea superioar
sau lateral a bioreactorului)

Figura 2.4. Dispozitiv nclinat pentru sedimentarea
celulelor

24
2.3. SEPARAREA PRIN FILTRARE

n filtrare, particulele solide sunt separate din amestecul solid-fluid, fornd
fluidul s treac printr-un material sau strat filtrant care reine particulele solide.
Solidele rmn pe filtru sub forma unei turte de filtrare, opunnd o rezisten
suplimentar procesului ulterior de filtrare.

2.3.1. Mecanismul filtrrii

Ca operaie unitar, filtrarea este rezultatul a trei procese elementare [25]: (1)
sedimentarea proces prin care particulele solide se depun pe stratul/suprafaa filtrant
ca ntr-un decantor, (2) cernerea sunt reinute acele particule solide care au
dimensiuni mai mari dect dimensiunile porilor stratului/suprafeei filtrante, (3)
adsorbia particulele mai mici dect deschiderea porilor stratului/suprafeei filtrante
sunt reinute prin fore de suprafa n interiorul porilor, provocnd colmatarea
(nfundarea) filtrului. n funcie de proprietile materialului filtrant, unul dintre aceste
procese elementare poate deveni determinant n filtrare, astfel nct putem vorbi despre
filtrare n adncime, filtrare superficial, filtrare cu efect de sit [26].

a. c. b.
Figura 2.5. Tipuri de filtrare n conformitate cu mecanismul filtrrii:
a filtrare n adncime; b filtrare superficial; c filtrare cu efect de sit

Filtrele n adncime (fig. 2.5 a) sunt constituite din materiale fibroase,
granulare sau sinterizate care produc o structur poroas aleatoare. Cnd o suspensie
traverseaz filtrul, particulele solide devin captive n structura tortuoas a canalelor de
curgere. Particulele sunt reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic n
matricea materialului filtrant. Astfel de filtre se confecioneaz din bumbac, rayon,
polipropilen, celuloz sau fibr de sticl.
Filtrele superficiale (fig. 2.5 b) sunt constituite din mai multe straturi suprapuse
de sticl sau microfibre polimerice. n timpul filtrrii, particulele mai mari dect spaiile
din matricea filtrului sunt reinute n special la suprafaa filtrului. Particulele mai mici
pot fi capturate n interiorul matricii. Particulele mari sunt reinute ca urmare a efectului
de sitare, cele mici fiind reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic. Filtrele
superficiale se confecioneaz din materiale polimerice, hrtie armat cu rini sau cu
fibr de sticl.
Filtrele sit (fig. 2.5 c) au o matrice poroas cu structur geometric regulat, n
care particulele sunt reinute ca urmare a efectului de cernere. Particulele mici i

25
microorganismele mai mari dect dimensiunile porilor sunt reinute la suprafa.
Procesul de filtrare este absolut, ntruct nici o particul mai mare dect diametrul
porilor filtrului nu este lsat s treac. Astfel de filtre sunt membranele utilizate n
separrile submicronice i macromoleculare din biotehnologii. Structura materialului
filtrant este mai rigid, iar fabricarea acestor materiale este mai bine controlat dect n
cazul altor tipuri de filtre.
Fa de suprafaa filtrant faza fluid poate curge perpendicular sau tangenial.
La curgerea perpendicular (fig. 2.6 b) particulele solide se depun pe suprafaa filtrant,
grosimea stratului depus crete n timpul filtrrii, opunnd o rezisten din ce n ce mai
mare la curgere. La un moment dat rezistena stratului de precipitate depus este att de
mare nct filtrarea devine neeconomic i este necesar ndeprtarea particulelor
depuse, curirea i regenerarea suprafeei filtrante. Aceast modalitate de filtrare este
ntlnit n majoritatea echipamentelor clasice de filtrare i se numete filtrare fr
ieire (dead-end filtration). La curgerea tangenial (fig 2.6 a) fluidul care nainteaz
paralel cu suprafaa filtrant provoac forfecri care limiteaz creterea stratului de
precipitat. Aceast modalitate de filtrare este ntlnit n procesele de separare prin
membrane i se numete filtrare n curent ncruciat (cross flow filtration). O mic
parte a fluidului alimentat traverseaz membrana, formnd aa-numitul filtrat sau
permeat; restul fluidului este reinut sub form de retenat sau concentrat. Retenatul este
recirculat peste membran pn cnd acesta ndeplinete condiiile cerute de
concentraie [27].
Alimentare
Alimentare
Filtrat
Filtrat
Filtrat
Concentrat
a b

Figura 2.6. Reprezentarea schematic a filtrrii:
a curgere tangenial pe suprafaa filtrant (cross-flow filtration)
b curgere perpendicular pe suprafaa filtrant (dead-end filtration)

Uurina filtrrii depinde de proprietile solidului i ale fluidului; separarea prin
filtrare a solidelor cristaline necompresibile din lichide cu viscozitate redus este o
operaie relativ simpl. Separarea prin filtrare a masei celulare de lichidele de
fermentaie este n schimb o operaie dificil, att din cauza dimensiunilor reduse ale
celulelor, ct i din cauza comportrii nenewtoniene a lichidelor de fermentaie.
Factorul determinant l reprezint ns natura masei celulare; aceasta poate avea caracter
fibros, mucilaginos sau de past. Majoritatea celulelor microbiene formeaz precipitate
compresibile, a cror porozitate scade pe msur ce filtrarea avanseaz.

26
2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbuntire a filtrrii

Filtrarea este o operaie care decurge n regim dinamic, nestaionar. ntruct
procesul de filtrare este influenat de un numr foarte mare de factori, o teorie a filtrrii
simpl i concomitent util din punct de vedere practic nu poate fi dezvoltat. Teoriile
simple existente (teoria filtrului ideal, teoria filtrrii prin stratul de precipitat, teoria
filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n considerare a suportului), completate cu
determinri experimentale, servesc la proiectarea filtrelor i la conducerea raional a
filtrrii.
n conformitate cu teoria filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n
considerare a suportului [25], n cazul filtrrii la cdere de presiune constant volumul
specific de filtrat poate fi determinat pe baza ecuaiei:
t V V
S S
= + 2
2
(2.2)
n care V
S
[m
3
/m
2
] este volumul de filtrat V [m
3
] care n timpul t [s] trece printr-un m
2
de
suprafa filtrant, este coeficientul de rezisten al materialului filtrant [m
2
/s], iar
este coeficientul de rezisten al precipitatului [m
3
/m
2
]. Dac rezistena materialului
filtrant este mult mai mic dect rezistena stratului de precipitat, iar stratul de precipitat
este incompresibil, ecuaia (2.2) devine [4]:
t
C r
P
t
A
V
V
S
S

= =
2
2
2
(2.3)
n care V [m
3
] este volumul de filtrat colectat n timpul t [s], A este aria suprafeei
filtrante [m
2
], P este diferena de presiune de pe feele filtrului [Pa], este viscozitatea
fazei lichide [Pa.s], r este rezistena specific a stratului de precipitat [m/kg], iar C
S
este
coninutul de faz solid din suspensia supus filtrrii [kg/m
3
].
Rezistena specific a stratului de precipitat este independent de P dac
precipitatul este incompresibil. Pentru precipitate compresibile:
( )
s
P r r = ' (2.4)
s reprezentnd compresibilitatea precipitatului. Compresibilitatea are valoarea 0 pentru
precipitate rigide, incompresibile i apropiat de 1 n cazul materialelor puternic
compresibile, aa cum sunt cele rezultate la filtrarea lichidelor de fermentaie.
Rezistena specific a stratului de precipitat este funcie de proprietile particulelor din
strat:

p
r

=
3
2
) 1 (
(2.5)
unde este factorul de form al particulelor [adimensional], este suprafaa specific a
particulelor [m
2
/m
3
], este porozitatea (fracia de goluri) a stratului de precipitat
[m
3
/m
3
], iar
p
este densitatea particulelor [kg/m
3
]. Pentru precipitatele compresibile,
att ct i sunt funcie de cderea de presiune prin strat.
Viteza filtrrii este exprimat uzual prin debitul de filtrat colectat. Ecuaia (2.3)
pus sub forma (2.6):

27

V C r
P A
t
V
m
S
V

= =
2
2
[m
3
/s] (2.6)
ne arat c debitul de filtrat (m
V
) este direct proporional cu ptratul ariei suprafeei
filtrante, i este invers proporional cu rezistena specific a stratului de precipitat,
viscozitatea fazei lichide, volumul i concentraia suspensiei. Pe baza acestei ecuaii se
pot stabili o serie de msuri care pot fi luate pentru mbuntirea procesului de filtrare
al unei suspensii date [3]:
- Creterea ariei suprafeei filtrante, A. Dei viteza de filtrare crete cu ptratul
suprafeei filtrante, creterea lui A necesit instalarea unor echipamente mai mari,
mrindu-se astfel cheltuielile de investiii.
- Creterea valorii diferenei de presiune pe feele filtrului, P. Soluia este valabil
numai n cazul precipitatelor necompresibile. n cazul precipitatelor compresibile
sau a precipitatelor cristaline sub form de ace sau plci, creterea P va conduce la
nrutirea filtrrii. Pentru precipitatele compresibile (cum sunt marea majoritate a
precipitatelor obinute din suspensii de mas celular), este necesar reducerea
compresibilitii precipitatului, prin adugare de adjuvani de filtrare.
- Reducerea masei precipitatului, C
S
= m
p
/V. La filtrarea n filtre rotative continue,
acest lucru se realizeaz prin reducerea grosimii stratului de precipitat depus pe
tambur la fiecare rotaie a acestuia i prin plasarea racletei care ndeprteaz
precipitatul ct mai aproape de tambur, astfel nct pe pnza filtrant s rmn un
strat de reziduu solid minim.
- Reducerea viscozitii fazei lichide, . Dac viscozitatea iniial a suspensiei este
foarte ridicat, diluarea poate conduce la reducerea viscozitii. Nu se recomand
reducerea viscozitii prin mrirea temperaturii suspensiei, deoarece majoritatea
lichidelor de fermentaie nu suport temperaturi ridicate fr o degradare termic a
produselor.
- Reducerea rezistenei specifice a stratului de precipitat, r. Pe baza ecuaiei (2.5),
mijloacele posibile de micorare a valorii lui r sunt:
o Creterea porozitii, . Porozitatea scade pe msur ce are loc filtrarea
celulelor. Reducerea acestui efect se poate realiza utiliznd adjuvani.
o Reducerea valorii factorului de form, . n cazul suspensiilor de micelii,
morfologia celulelor se poate schimba modificnd condiiile de fermentare.
o Reducerea suprafeei specifice a particulelor, . Creterea dimensiunilor medii
ale particulelor i minimizarea variaiilor n mrimea particulelor conduce la
scderea lui . Acest efect se poate atinge prin schimbarea condiiilor de
fermentare sau prin condiionarea suspensiei (adaosuri de floculani i/sau
coagulani) nainte de filtrare.

2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare

Filtrarea lichidelor de fermentaie care conin mas celular cu caracter fibros
(culturi de fungi din clasele Aspergillus i Penicillium) este o operaie relativ uoar,
miceliul necolmatnd materialul filtrant i desprinzndu-se uor de pe acesta. La nivel

28
de operare industrial se recomand filtrele rotative cu vid (filtrele Oliver), echipamente
care confer o suprafaa mare de filtrare, posibiliti de splare a miceliului pe filtru
pentru recuperarea avansat a produselor utile i n plus se preteaz la automatizare [3,
4].
A B
biomas
lichid de
fermentaie
lichid de
splare
5

Figura 2.7. Filtru celular rotativ cu vid (Oliver)
A seciune transversal; B seciune longitudinal
1 tambur rotativ; 2 celule; 3 material filtrant; 4 tuburi de legtur ntre celule i capul de
distribuie; 5 arbore; 6 roat dinat de acionare; 7 cap de distribuie; 8 raclet pentru
desprinderea precipitatului; 9 cuv; 10 agitator pendular; 11 racord pentru alimentarea lichidului
de splare; 12 racord pentru alimentarea lichidului de fermentaie (suspensia de mas celular).

Un filtru rotativ cu vid (fig. 2.7) este alctuit dintr-un tambur rotativ (1) cu
lungimea de 1 4,5 m i diametrul de 0,5 3 m, construit din 2 cilindri orizontali
coaxiali. Tamburul se rotete lent (0,1 2 rpm) fiind paial imersat ntr-o cuv (9) n
care este alimentat i agitat (10) lichidul de fermentaie. Cilindrul exterior este perforat
i acoperit cu material filtrant (3), iar spaiul dintre cilindri este mprit, prin perei
radiali, n 6 12 celule etane (2) care funcioneaz succesiv i independent ca nite
filtre nuce. Celulele sunt legate, prin intermediul unui cap de distribuie (7) i a tuburilor
de legtur (4), de conductele de vid sau aer comprimat. Suprafaa tamburului este
mprit n mai multe zone corespunztoare operaiilor de filtrare (a d), deshidratare
(e, f), splare (g), deshidratare dup splare (h j), ndeprtare a stratului de miceliu (l)
i regenerare a suprafeei filtrante (m). n timpul unei rotaii a tamburului, fiecare celul
trece succesiv prin toate aceste zone. Capul de distribuie asigur crearea vacuumului n
zonele de filtrare (a d), splare (g) i deshidratare (e, f, h j) i insuflarea de aer
comprimat n zonele de ndeprtare a miceliului de pe filtru (l) i dezobturare a porilor
suprafeei filtrante (m). Tamburul (1) are un grad diferit de scufundare n lichidul de
fermentaie supus filtrrii, n funcie de caracterul stratului filtrant i de necesitile de
splare i uscare. n obinerea antibioticelor, de ex., se utilizeaz filtre a cror adncime
de scufundare a tamburului este de pn la 50 % [28]. Dac produsul util este localizat

29
numai n faza lichid, splarea masei celulare dup filtrare nu este o operaie dificil.
Debitul i amplasarea jeturilor de ap de splare trebuie alese astfel nct s se evite
diluarea excesiv a filtratului. Miceliul de pe materialul filtrant se ndeprteaz cu
ajutorul racletei (8).
Dintre dezavantajele filtrului celular rotativ cu vid se pot meniona:
- etanarea defectuoas a celor dou discuri ale capului de distribuie;
- griparea suprafeei lefuite a discurilor prin particole de solid scpate n filtrat;
- splarea insuficient a biomasei, datorit depunerii sale ntr-un stat cu grosime
inegal, sau prin apariia fisurilor n stratul de biomas depus;
- eliminarea nesatisfctoare a apei n faza de desecare a precipitatului de biomas;
- evacuarea defectuoas a biomasei cu ajutorul racletei de desprindere.
Aceste deficiene au fost eliminate prin construcia unor utilaje mai performante,
cum ar fi filtrul Oliver perfecionat (fig. 2.8) [25]. Acesta utilizeaz un cap de distribuie
care elimin frecrile ntre suprafeele metalice. Suprafaa i grosimea biomasei depuse
pe filtru sunt uniformizate cu ajutorul unui dispozitiv cu rulori care conduc o pnz cu
rol de egalizare a grosimii, stoarcere i astupare a fisurilor n stratul de precipitat. n
locul pnzei se poate folosi un rulou de presare, apa din precipitat fiind ndeprtat mai
bine. Desprinderea precipitatului se poate face att cu ajutorul racletei, ct i prin
intermediul sforilor, lanurilor sau a unor rulouri de preluare din cauciuc.

lichid de
splare
biomas

Figura 2.8. Filtru rotativ celular cu vid perfecionat
a zon de filtrare; b zon de splare; c zon de desprindere a precipitatului.
n medalion: desprinderea precipitatului cu ajutorul ruloului de preluare

Dimensionarea filtrelor se bazeaz pe stabilirea suprafeei necesare de filtrare, A.
n cazul filtrelor aflate curent n exploatare, aceasta variaz ntre 5 i 40 m
2
[4, 25].

30
Pentru o durat t a filtrrii impuse, cunoscndu-se fora motoare a filtrrii (P),
caracteristicile suspensiei i ale precipitatului, aria filtrului n funcie de debitul de
suspensie prelucrat se determin pe baza ecuaiei (2.3). Pentru precipitate compresibile,
valoarea V
S
obinut prin calcul se corecteaz prin nmulire cu coeficienii K
1
i K
2
:
P K
C
K V K K V
S
calculat S corectat S
= = =
2 1 2 1
;
50
: unde ) ( ) ( (2.7)
Pentru filtrele rotative continue, t reprezint durata unui ciclu de filtrare,
putndu-se calcula cu relaia:
[s]
100
1
=
n
t (2.8)
n care n reprezint turaia filtrului (s
-1
), iar reprezint gradul de scufundare al filtrului
n mediul supus filtrrii (%).
Viteza de filtrare se determin n funcie de volumul de filtrat obinut pe unitatea
de suprafa de filtrare ntr-un ciclu de filtrare:

t
V
v
corectat S
f
) (
= [m
3
/(m
2
.s)] (2.9)
Valorile vitezei de filtrare calculate n acest mod sunt apropiate de valorile
experimentale prezentate n tab. 2.4 [4].

Tabelul 2.4. Viteza de filtrare a unor lichide de fermentaie [4]
Caracteristicile
filtratului
Lichid de
fermentaie
(produs)
C
S

[kg/m
3
]
[Pa.s]
r
[m/kg]
Tipul filtrului
v
f

[L/(m
2
.h)]
Penicillium
(peniciline G i V)
50 10,3 3,1.10
11
filtru rotativ cu vid
filtru rotativ cu strat adjuvant
238 - 256
1413 - 1848
Streptomyces 28 3,92 1,6.10
14
filtru pres 12,5
S. kanamyceticus
(kanamicina)
filtru rotativ cu strat adjuvant 87
S. fradiae
(neomicina)
filtru rotativ cu strat adjuvant 130
S. lincolnensis
(lincomicina)
18,5 9,8 3,5.10
12
filtru pres
filtru rotativ cu strat adjuvant
58
380
Bacillus subtilis
(proteaze)
filtru rotativ cu strat adjuvant 109 - 435
Hidrolizat de drojdii filtru rotativ cu strat adjuvant 304

Tabelul 2.5. Viteza de filtrare a lichidelor de fermentaie a P. Chrysogenum
(P = 0,054 MPa, = 40 %)
Viteza medie de filtrare, v
f
[L/((m
2
.h)] la
r [m/kg]
n = 1 rpm n = 2 rpm n = 3 rpm n = 4 rpm n = 5 rpm
2.10
11
1140 740 617 530 407
3.10
11
875 615 500 342 390
5.10
11
606 432 356 306 375


31
n funcie de viteza de filtrare se determin turaia optim a tamburului, la
diferite valori ale rezistenei precipitatului depus (r) i ale gradului de scufundare a
filtrului n suspensie (). n tab. 2.5 este prezentat dependena dintre viteza de filtrare,
r i pentru filtrarea lichidelor de fermentaie ale P. Chrysogenum, la biosinteza
penicilinelor G i V.
Pentru capaciti de producie mici se pot utiliza i filtrele pres, care
acumuleaz treptat biomasa i sunt deschise periodic pentru ndeprtarea precipitatului.
Aceste filtre sunt operate n regim discontinuu i de regul ndeprtarea precipitatului
este operaia cea mai costisitoare i mai greoaie, necesitnd munca manual. Recent au
fost introduse n practic filtrele presurizate Larox, care funcioneaz n regim
pseudocontinuu i se preteaz la automatizare pe scar larg.
Un astfel de filtru este alctuit din mai multe uniti de filtrare identice (fig. 2.9),
amplasate pe nlime, prin care trece o band filtrant fr sfrit ghidat prin
intermediul unor role de capt. Fiecare unitate de filtrare este alctuit din trei camere
amplasate una peste alta. Camera superioar este separat de camera intermediar prin
intermediul unei membrane elastice, n timp ce camera intermediar este separat de
camera inferioar de ctre pnza filtrant.
1
2
3
4
5
6
7
8

Figura 2.9. Unitate de filtrare a unui filtru presurizat Larox
1 camera superioar; 2 camera intermediar; 3 camera inferioar; 4 pnza filtrant; 5
membran elastic; 6 racord de alimentare cu ap sub presiune; 7 racord de alimentare cu
suspensie/ap de splare/aer comprimat; 8 racord de evacuare a filtratului.

n forma sa cea mai complet, procesul de filtrare decurge n ase etape
succesive. Toate unitile de filtrare lucreaz simultan, fiecare dintre ele gsindu-se n
aceeai etap a filtrrii. n prima etap, de filtrare propriu-zis, se umple camera
intermediar cu suspensia supus filtrrii. Sub aciunea forei gravitaionale, faza solid
se depune pe banda filtrant, iar lichidul trece prin aceasta, ptrunznd n camera
inferioar, de unde este evacuat. n a doua etap, de stoarcere a precipitatului, n camera
superioar se introduce ap sub presiune. Aceasta deformeaz membrana elastic
provocnd stoarcerea mecanic a precipitatului aflat n camera intermediar. n a treia
etap, de splare, n timp ce apa sub presiune este evacuat din camera superioar, n
camera intermediar se introduce peste precipitat ap pentru splarea precipitatului.
Aceasta se poate colecta mpreun cu filtratul sau separat. A patra etap const n

32
stoarcerea precipitatului splat, prin pompare de ap sub presiune n camera superioar,
deasupra membranei elastice. Etapa a cincea o reprezint uscarea precipitatului. Pe
msur ce apa sub presiune prsete camera superioar, n camera intermediar se
introduce aer comprimat deasupra precipitatului. Aerul trece prin stratul depus pe filtru
realiznd uscarea. A asea i ultima etap este cea de descrcare a precipitatului. Toate
unitile de filtrare se deschid, iar pnza filtrant execut o micare de deplasare fiind
ghidat de rolele de capt exterioare. La trecerea pnzei peste role, sub aciunea forei
gravitaionale, sau prin intermediul unor raclete, precipitatul se desprinde de pe pnz i
cade pe un dispozitiv colector. Pnza filtrant este splat automat. Dup ce pnza
filtrant a avansat de la o unitate de filtrare la alta, unitile se nchid i se reia ciclul de
filtrare. Etapele procesului de filtrare sunt redate n fig. 2.10. Principalele caracteristici
ale acestor filtre sunt redate n tab. 2.6.

Tabelul 2.6. Caracteristici constructive ale filtrelor presurizate Larox [29]
Caracteristica Valoare
Suprafa filtrant 1,6 144 m
2

Capacitate maxim 150 t/h substan uscat
Presiune de operare max. 1,6 MPa
Putere consumat:
- uniti de 9,5 38 m
2
18,5 kW (5,5 15 kW pentru presare diafragme)

- uniti de 48 144 m
2
86 kW (diafragme acionate pneumatic)

Utilizarea filtrelor presurizate Larox n industria produselor de biosintez a
condus la realizarea de economii importante, n special prin creterea gradului de
recuperare al filtratului. S-au redus de asemenea cu pn la 50% pierderile de miceliu,
iar randamentele de recuperare au crescut de la 94 la 98 %, pe fondul scderii costurilor
de filtrare.
Separarea masei celulare din lichidele de fermentaie ale bacteriilor,
actinomicetelor, a hidrolizatelor celulare se face mult mai dificil dect n cazul
biomaselor fibroase. Aceasta se explic prin caracterul mucilaginos al masei celulare
care obtureaz rapid porii materialelor filtrante. n acelai timp, trebuie remarcat
dezavantajul creat de nestandardizarea mediilor de cultur, manifestat prin inconstana
de la o arj la alta a principalilor parametri care determin filtrabilitatea: coninutul de
suspensii, viscozitatea, caracteristicile biomasei, coninutul de proteine, etc [4].
ntruct ncercrile de separare a antibioticelor cu schimbtori de ioni direct din
suspensia celular, utilizarea centrifugelor sau a filtrelor pres nu au dat rezultatele
scontate, s-a ajuns la concluzia c rezolvarea problemei filtrrii lichidelor de fermentaie
trebuie nceput cu modificarea radical a caracteristicilor de filtrabilitate a acestora, n
scopul mririi vitezei de filtrare i a pierderilor de produse utile.
n scopul mririi vitezei de filtrare, lichidele de fermentaie se supun unor
tratamente preliminare termice, acide sau cu ali ageni chimici, n scopul coagulrii
moleculelor proteice i a agregrii biomasei, cu sau fr adugarea suplimentar a unor
materiale cu rol de strat adjuvant (materiale poroase obinute din diferite roci vulcanice:

33
perlit, supercel, dicalit, sau din resturi ale exoscheletelor diatomitelor: kieselgur).
Alegerea metodei de prelucrare preliminar este determinat de caracteristicile
lichidului de fermentaie, de natura produsului biosintetizat (stabilitate chimic i
termic), precum i de caracteristicile precipitatelor formate.

Filtrat
Filtrat
Filtrat
Filtrat
Filtrat
Precipitat
Precipitat
Suspensie
Ap sub
presiune
Ap sub
presiune
Ap sub
presiune
Ap sub
presiune
Ap de
splare
Aer
comprimat
1. Filtrare
2. Stoarcere
3. Splare
4. Stoarcere
post-splare
5. Uscare
6. Evacuare
precipitat
Figura 2.10. Etapele procesului de filtrare ntr-un filtru presurizat Larox

34
Adjuvanii de filtrare se pot aduga fie nainte de filtrarea lichidului de
fermentaie, formnd un strat care previne blocarea porilor materialului filtrant de ctre
masa celular fie prin amestecare direct cu lichidul de fermentaie (fig. 2.11). Aceast
ultim metod se recomand doar dac produsul util este extracelular. Adaosul de
adjuvani mrete costul filtrrii, cantitatea minim de adjuvant stabilindu-se
experimental (fig. 2.12). Kieselgurul adsoarbe lichid, i ca urmare, dac produsul util se
gsete n faza lichid, vor aprea pierderi suplimentare. Alt dezavantaj este acela c
dei adjuvanii mresc viteza de filtrare, limpiditatea filtratului scade. Apar probleme
suplimentare i cu depozitarea precipitatului: biomasa cu coninut de kieselgur, de ex.,
nu poate fi utilizatn hrana animalelor dect dup ndeprtarea adjuvantului.
Direcia de
curgere a
lichidului de
fermentaie
Filtrat
Pnza filtrant
Adjuvant adugat n
lichidul de fermentaie
Adjuvant adugat anterior
filtrrii lichidului de fermentaie
Precipitat format din masa
celular i adjuvant

Durata filtrrii, minute
P
r
o
d
u
c
t
i
v
i
t
a
t
e
a
f
i
l
t
r
u
l
u
i
,

L
/
m
2
fr kieselgur
kieselgur fin
kieselgur
mijlociu
kieselgur
mare
Figura 2.11. Utilizarea adjuvanilor n
filtrarea lichidelor de fermentaie [3]
Figura 2.12. Efectul adaosului de kieselgur
asupra productivitii filtrrii [25]

Prin coagulare, rezistena stratului depus i rezistena total (rezistena stratului
+ rezistena materialului filtrant care are depunerile reinute n pori) se reduc
semnificativ (cu circa 2 ordine de mrime: de la 10
13
10
14
la 10
11
10
12
). Reducerea
rezistenelor la filtrare a permis utilizarea filtrelor continue de tipul filtrelor rotative cu
vid i cu strat adjuvant, a cror vitez de filtrare este de 100 300 L/(m
2
.h) [4]. Un
astfel de filtru este filtrul cu rennoirea suprafeei de filtrare. Acesta este un filtru
Oliver prevzut cu un cuit cu avansare micrometric, care n timpul funcionrii se
deplaseaz ndeprtnd biomasa depus mpreun cu stratul superficial de adjuvant.
Depunerea stratului de adjuvant (dicalit de calitate medie i grosier) pe
materialul filtrant (sit metalic cu ochiuri de 150 200 m sau estur sintetic) se
realizeaz naintea nceperii operaiei de filtrare a biomasei. n timpul depunerii
adjuvantului, viteza de filtrare se regleaz cu ajutorul vidului astfel nct n 45 60 min
s se depun un strat gros de 20 100 mm. Apoi se regleaz viteza de naintare a
cuitului micrometric, care s corespund unei deplasri de 0,15 0,45 mm n timpul

35
unei rotaii complete a tamburului. n cuva filtrului se introduce lichidul de fermentaie,
n prealabil tratat chimic sau termic, i se filtreaz pna cnd pe suprafaa tamburului
rmne un strat de adjuvant cu grosimea de 5 8 mm. Un ciclu de filtrare dureaz 6
24 h. Durata ciclului de filtrare se poate calcula cu relaia:

n h
h h
t
f i

=
60
(2.10)
n care t este durata ciclului de filtrare [h], h
i
i h
f
sunt respectiv grosimea iniial i
final a stratului de adjuvant [mm], h este adncimea ptrunderii cuitului micrometric
la o rotaie a tamburului [mm], iar n este turaia tamburului [rot/min].
Turaia tamburului influeneaz semnificativ procesul de filtrare. O dublare a
turaiei, de la 0,5 la 1,0 rot/min conduce la dublarea aproape a vitezei de filtrare. Cea
mai important cretere a vitezei de filtrare pentru biomasele bacteriene i
actinomicetice se produce la turaii de 0,5 0,66 rot/min. La mrirea turaiei de la 0,66
la 1,0 rot/min, ritmul de cretere a vitezei de filtrare se diminueaz, iar consumul de
adjuvant crete cu 0,1%. Nu se recomand creterea turaiei peste 1,0 rot/min ntruct
stratul de biomas nu se deshidrateaz suficient, datorit micorrii duratei etapelor de
uscare [4].

2.4. SEPARAREA PRIN CENTRIFUGARE

Centrifugarea este o tehnic de lucru care permite realizarea unor procese de
separare (sedimentare, filtrare, spargerea emulsiilor, extracie, etc.) ntr-un cmp de
fore centrifugal, procese care uneori sunt dificil sau chiar imposibil de realizat numai
sub aciunea gravitaiei. Acest capitol trateaz numai procesele i aplicaiile referitoare
la sedimentarea n cmp de fore centrifugal.
n biotehnologii, centrifugarea are numeroase aplicaii: separarea masei celulare
din lichidele de fermentaie, ndeprtarea resturilor celulare, colectarea precipitatelor,
prepararea unor medii de fermentare, separarea diferitelor tipuri de celule, extracia
diverilor componeni (alcaloizi, arome, uleiuri eseniale din plante, antibiotice din
lichidul de fermentaie, steroizi, proteine), etc. Prima aplicaie a separrii centrifugale n
industria alimentar a fost n procesul de smntnire a laptelui, iar n biotehnologie la
recoltarea masei celulare n fabricarea drojdiei de panificaie.

2.4.1. Bazele teoretice ale sedimentrii n cmp de fore centrifugal

Fora centrifug, ca i gravitaia este o for masic. Dac o particul de mas m
se rotete cu o vitez unghiular la o raz r fa de centrul de rotaie, asupra acesteia
se manifest o fora centrifug F
C
= m
2
r orientat n direcie radial. Prin analogie cu
expresia forei gravitaionale, F
G
= mg, acceleraia centrifugal este
2
r. n centrifugele
de sedimentare,
2
r >> g, astfel nct forele gravitaionale se pot neglija. Raportul
dintre fora centrifug i fora gravitaional:

g
r m
F
F
z
G
C

= =
2
(2.11)

36
denumit i factor de eficacitate, este utilizat deseori ca o msur a puterii de separare a
unei centrifuge.
Fora centrifug este suficient de mare pentru a contracara forele browniene de
difuziune, care, n sedimentarea gravitaional, ncetinesc sau chiar mpiedic depunerea
particulelor foarte fine. Deoarece eficiena separrii este n principal afectat de
comportarea celor mai mici particule din sistem, iar aceste particule au de obicei numere
Reynolds mici (deplasarea lor fiind n domeniul curgerii viscoase), se poate considera
c sedimentarea decurge n regim laminar, iar deplasarea acestor particule decurge n
conformitate cu legea lui Stokes. n conformitate cu aceasta, viteza de sedimentare a
particulelor sferice n cmp de fore centrifugal este:
( ) r n d r d v
c
l
l c
c
l
l c
C

=
2 2 2 2
0
) (
9
2 ) (
18
1

(2.12)
n care
c
,
l
,
l
, d
c
au aceleai semnificaii ca i n ecuaia (2.1), este viteza
unghiular a tamburului centrifugei [rad/s], r este distana pe care o parcurge particula
de la suprafaa lichidului pn la peretele tamburului, iar n este turaia centrifugei
[rot/s]. Comparnd ecuaiile (2.1) i (2.12) se poate scrie c:
z v
g
r
v v
G G C
=
=
0
2
0 0

(2.13)
adic viteza de sedimentare n cmp centrifugal este de z ori mai mare dect n cmp
gravitaional. n centrifugele industriale, z variaz ntre 300 i 16 000; pentru centrifuge
mici de laborator z poate atinge i 500 000 [30].
Sedimentarea are loc prin
deplasarea particulei dinspre centrul de
rotaie ctre peretele tamburului (fig.
2.13). Creterea vitezei de deplasare a
particulei va mbunti sedimentarea.
Din ecuaia (2.12) se poate observa c
viteza particulei ntr-o centrifug dat
poate fi crescut prin:
- creterea vitezei () respectiv
turaiei (n) centrifugei;
- creterea diametrului particulei, d
c
;
- creterea diferenei de densitate
dintre particul i lichid
c

l
;
- scderea viscozitii fazei lichide
l
.
Durata sedimentrii, respectiv
timpul necesr ca o particul s ajung
de la suprafaa lichidului (r
1
) pn la
peretele tamburului (r
2
) se poate
calcula prin integrarea expresiei vitezei
de sedimentare:

= =
2
1
2 2
0
2 2
0
) (
18
1

) (
18
1
r
r
c
l
l c
t
c
l
l c
C
dr r d dt r d
dt
dr
v

(2.14)
alimentare
suspensie
axa de rotaie
deversare
lichid
suprafaa
lichidului
peretele
tamburului
traiectoriile
particulelor
solide
1
2

Figura 2.13. Separarea particulelor solide
ntr-o centrifug tubular continu

37
Integrnd ecuaia (2.14) se obine timpul necesar sedimentrii particulelor de
diametru d
c
:
( )
1
2
2 2
ln
18
r
r
d
t
l c c
l

=

(2.15)
Cu ct particulele sunt mai mici, cu att timpul necesar sedimentrii lor este mai
mare. Pentru atingerea duratei necesare sedimentrii, centrifugele discontinue sunt
operate un timp cel puin egal cu durata sedimentrii. n cazul centrifugelor continue,
atingerea duratei necesare sedimentrii, respectiv creterea timpului, se face prin
micorarea debitului de alimentare cu suspensie. La un timp de sedimentare dat, se
poate calcula diametrul minim al particulelor care sedimenteaz. Pentru centrifuge
tubulare discontinue, diametrul minim al particulelor care sedimenteaz este:

( ) t
r
r
d
l c
l
m

1
2
ln 2
3
(2.16)
iar pentru centrifuge tubulare continue:

( ) ( )
2
1
2
2
1
2
ln
2 3
r r
r
r
L
m
d
V
l c
l
m
(2.17)
n care m
V
este debitul de alimentare cu suspensie [m
3
/s], iar L este lungimea tamburului
centrifugei [m].
Performanele centrifugelor de diferite mrimi pot fi comparate prin intermediul
factorului sigma, , concept introdus de ctre Ambler n 1952 [31]. Ca sens fizic,
reprezint aria transversal echivalent a unui decantor gravitaional care ar produce
acelai efect de sedimentare ca i centrifuga [3, 25]. Pentru centrifugele continue:

G
V
v
m
0
2
= (2.18)
unde m
V
este debitul de alimentare cu suspensie [m
3
/s], iar v
0G
este viteza de
sedimentare n cmp gravitaional. Pentru mai multe centrifuge, de construcie
asemenea, care separ aceeai suspensie (v
0G
= constant):
const 2
0
1 2
= = =
G
V
V
v
m
m
L (2.19)
ecuaie care servete pentru compararea centrifugelor i pentru transpunerea model
prototip; se recomand ca scara de transpunere s nu fie mai mare de 2 [25].
Ecuaiile pentru evaluarea factorului sigma depind de tipul constructiv al
centrifugei. Pentru centrifugele cu talere conice [31]:

( )
( )
3
1
3
2
2
tan 3
1 2
r r
g
N

(2.20)
n care, pe lng termenii definii anterior, N reprezint numrul de talere, r
2
i r
1

reprezint respectiv raza exterioar i cea interioar a talerului [m], iar este unghiul la
vrf al talerului conic.

38
Pentru centrifuge tubulare, ecuaia (2.21) permite calculul factorului sigma cu o
eroare de pn la 4% [32, 33]:
( )
g
r L
r r
g
L
2 2
2
1
2
2
2
2
3

= +

=

(2.21)
n care L este lungimea tamburului, r
1
este raza la suprafaa lichidului, iar r
2
este raza
peretelui interior al tamburului. Deoarece ntr-o centrifug tubular r
1
i r
2
au valori
apropiate, se pot nlocui cu o raz medie r.
Pentru centrifugele decantoare continue cu transportor elicoidal se poate utiliza
ecuaia [34, 35]:

+ +
+
=
4
4 3
2
1
2
3
2
1 1 2
2
2
2
2
1
2
2 1
2
r r r r
L r r L
g
(2.22)
n care r
1
i r
2
reprezint respectiv raza interioar a lichidului i raza interioar a
tamburului, L
1
este lungimea prii cilindrice a tamburului, iar L
2
este lungimea prii
conice a acestuia.
ntruct ecuaiile (2.20) (2.22)
sunt valabile pentru condiii ideale de
operare, utilizarea lor pentru compararea
diferitelor echipamente trebuie ntotdeauna
nsoit i de teste experimentale, prin
acestea evideniindu-se influena formei i
mrimii particulelor, a aglomerrii
particulelor, a distribuiei neuniforme a
curgerii n centrifug asupra performanelor centrifugelor. Date experimentale
generalizate au permis stabilirea unor factori de eficien (tab. 2.7) care corecteaz
ecuaia (2.18):
( ) =
G real V
v m
0
(2.23)

2.4.2. Tipuri de centrifuge utilizate n procesele de bioseparare

n funcie de forma constructiv a tamburului centrifugei i de modul de evacuare
a fazei solide, exist cinci tipuri principale de centrifuge de sedimentare (fig. 2.14) [35].
Centrifuga tubular. Din ecuaiile (2.11) (2.13) rezult c factorul de
eficacitate al centrifugelor crete cu raza rotorului i cu ptratul turaiei; pe de alt parte,
solicitarea mecanic a peretelui crete cu ptratul razei i cu ptratul turaiei [25]. Ca
urmare a acestor dou rezultate, centrifugele cu eficaciti nalte sunt caracterizate
constructiv printr-un tambur cilindric cu diametru mic, care se rotete cu turaie foarte
mare. Rotorul tubular, antrenat la partea superioar de un electromotor, este nchis la
ambele capete (pentru centrifugele discontinue) sau deschis (pentru centrifugele
continue fig. 2.15). Rotorul este nchis ntr-o manta de protecie, care asigur i
alimentarea cu suspensie la partea inferioar, precum i evacuarea produselor la
partea superioar. Lichidul evacuat este pompat printr-un disc distribuitor, pentru a evita
formarea aerosolilor sau a spumei. Pentru ndeprtarea fazei solide acumulate la
Tabelul 2.7. Factorul de eficien
pentru diferite tipuri de centrifuge [36]
Tipul de
centrifug
Factorul de
eficien [%]
Cu talere conice 45 73
Decantoare 54 67
Tubular 90 98

39
periferie, centrifuga trebuie oprit i demontat. Diametrul tamburului poate ajunge
pn la 130 mm, putnd reine pn la 6 L de faz solid. n modelele industriale,
factorul de eficacitate poate ajunge pn la 20 000 [37]. Aceste echipamente sunt
utilizate frecvent n bioprocese, pentru separarea de vaccinuri, snge, baterii, etc.

Centrifuga tubular
Centrifuga cu camere
Centrifuga cu co neperforat
Centrifuga decantoare cu
transportor elicoidal
Centrifuga cu talere
Tipuri de centrifuge de sedimentare
Cu reinerea fazei solide
Cu evacuarea fazei solide
Cu duze de evacuare a fazei solide
operare discontinu
descrcare intermitent
descrcare continu
operare i descrcare
continu
operare semicontinu,
descrcare intermitent
operare discontinu,
descrcare manual
Figura 2.14. Clasificarea centrifugelor de sedimentare [35]

Centrifuga cu camere. Aceast centrifug utilizeaz un tambur nchis divizat n
mai multe compartimente/camere (2 6) cilindrice verticale, pe care suspensia i
parcurge consecutiv. innd seama de razele camerelor, acestea au factorul de
eficacitate cresctor, de la interior spre exterior. Se poate realiza astfel o centrifugare
fracionat, solidele de dimensiuni mari depunndu-se n camerele interioare, iar cele
fine n camerele exterioare. n fig. 2.16 este prezentat o astfel de centrifug cu
funtionare semicontinu: alimentarea cu suspensie i evacuarea decantatului sunt
continue, iar ndeprtarea sedimentului este discontinu, necesitnd dezasamblarea
centrifugei. Decantatul este evacuat prin intermediul unei pompe centripete (dispozitiv
cu pipe similar unei pompe centrifuge cu funcionare invers: carcasa se rotete iar
rotorul este staionar) care transform energia cinetic a lichidului la evacuare n for
de presiune. Eficiena unei astfel de centrifuge este ridicat, datorit timpului de
staionare ridical al lichidului n utilaj. Curirea este n schimb dificil, fapt care
limiteaz concentraia suspensiei iniiale la 4 5 % v/v faz solid. Astfel de centrifuge
lucreaz la 4500 8500 rot/min, putnd prelucra debite de 2,5 10 m
3
/h, la un diametru
al tamburului de 335 615 mm, avnd o capacitate de reinere a solidelor de pn la 75
L [35]. Unele modele includ canale de rcire n interiorul pereilor tamburului, o manta
de rcire exterioar i rcire a pompei centripete [37]. Sunt utilizate n special n
industria alimentar pentru clarificare berii, vinului sau a sucurilor de fructe.

40
1
2
3
4
5
6
suspensie/emulsie
faza
grea
faza
uoar

alimentare suspensie
evacuare lichid centrifugat evacuare lichid centrifugat
1
2
3
4
Figura 2.15. Centrifug tubular
1 arbore; 2 tambur tubular; 3
alimentare cu emulsie/suspensie; 4
disc distribuitor; 5 evacuare faz grea;
6 evacuare faz uoar.
Figura 2.16. Centrifug cu camere
1 arbore; 2 alimentare suspensie; 3 perei cilindrici
formnd camere; 4 dispozitiv cu pipe pentru evacuarea
lichidului centrifugat.

Centrifuga decantoare cu transportor elicoidal. Este echipat cu un tambur
conic sau cilindro-conic orizontal avnd un raport lungime : diametru de 1,5 : 3,5.
Tamburul conine un transportor elicoidal care se rotete n aceeai direcie, dar cu o
vitez uor diferit (5 100 rot/min). n aceste echipamente, forele centrifuge sunt mai
mici dect n alte tipuri constructive; la turaii de 1600 6000 rot/min, factorul de
eficacitate poate ajunge pn la maximum 5000. Construciile speciale pot atinge un
factor de eficacitate de pn la 10 000 [37].
Centrifuga din fig. 2.17 b este alctuit dintr-un tambur conic exterior i un
tambur cilindric, coaxial, interior, mprit n trei compartimente, dintre care cele dou
din stnga au guri pe peretele lateral. Pe peretele exterior al tamburului cilindric este
fixat un transportor elicoidal care se rotete solidar cu acesta, dar cu o turaie ceva mai
mic. Suspensia este alimentat printr-un tub axial n compartimentul din mijloc al
tamburului cilindric i este separat, prin centrifugare, n dou faze. Faza lichid se
adun la baza conului tamburului exterior, de unde deverseaz, prin deschiderile
laterale, spre racordul de evacuare. Sedimentul este preluat de pe pereii tamburului
conic de ctre transportorul elicoidal i este deplasat ctre vrful conului. n drumul su,
sedimentul este splat de ctre lichidul de splare adus n compartimentul din stnga al
tamburului interior. Lichidul de splare se amestec i iese mpreun cu lichidul din
suspensia iniial.

41
solide lichid
ap de
splare
solide
lichid
suspensie
1
2
3
4
5 6
9
a. b.
Figura 2.17. Centrifug decantoare cu transportor elicoidal
a cu tambur cilindro-conic; b cu tambur conic.
1 arbore tubular pentru rotirea tamburului exterior; 2 tambur exterior (cilindro-conic sau conic); 3
arbore tubular pentru rotirea tamburului cilindric interior; 4 alimentarea suspensiei; 6 intrarea apei
de splare; 7 suprafaa lichidului separat; 8 deschideri reglabile pentru deversarea lichidului; 9
deschideri pentru evacuarea sedimentului.

Centrifuga cu talere (separatorul cu talere) a fost conceput cu scopul de a
micora distana parcurs de fazele suspensiilor sau emulsiilor. Prin table subiri, de
form conic, se mparte volumul lichidului din centrifug ntr-un numr mare de
straturi conice, nuntrul crora se face separarea fazelor. Faza grea se ndreapt spre
exterior, ajunge la faa interioar a conului imediat superior pe care coboar spre
periferia centrifugei i mai departe ctre dispozitivul de colectare i evacuare. Faza
uoar se ndreapt spre centru, pe faa superioar a conului inferior i este condus
separat ctre un alt dispozitiv de colectare i evacuare (fig. 2.18). n timpul centrifugrii,
concentraia lichidului dintre talere variaz continuu de la concentraie mic n faza
uoar (n apropierea prii centrale) la concentraie mare n faz grea (la periferie).
Lichidul alimentat ntre discuri nu trebuie s deranjeze acest echilibru al concentraiilor;
pentru aceasta discurile au orificii mari de alimentare n dreptul locului unde
concentraia iniial a emulsiei/suspensiei corespunde concentraiei locale dintre discuri
(practic locul orificiilor se plaseaz astfel nct faza care trebuie s rezulte n puritate
mai mare s parcurg o distana mai mare ntre discuri).
Amestecul supus separrii coboar prin tubul central i intr, de jos n sus, prin
orificiile de alimentare din discuri n spaiul dintre acestea. Dup separare, faza uoar
este colectat lng tubul central, iar faza grea la periferia tamburului. Pentru a evita
curirea frecvent a fazei solide, operaie care necesit oprirea i demontarea, aceste
centrifuge se utilizeaz la concentraii reduse de faz solid (sub 1 % v/v). Capacitatea
tipic de reinere de solide este de 5 20 L. Sunt utilizate pe scar larg pentru
separarea grsimilor din lapte.
Pentru suspensii cu coninut mai ridicat de faz solid se folosesc centrifuge cu
descrcare intermitent sau continu a fazei solide. Centrifuga cu descrcare
intermitent a solidelor (fig. 2.19 a) este prevzut cu un numr de deschideri periferice
nchise cu valve. Deschiderea valvelor se face prin intermediul unui mecanism controlat
fie de un temporizator, fie de un senzor al grosimii stratului de sediment. Astfel de
echipamente sunt folosite pentru suspensii care conin 2 6% v/v faz solid, sau pentru
suspensii n care faza solid are tendina de sfrmare sau dezagregare la solicitri prin
forfecare mari. Sunt utilizate pentru limpezirea diferitelor sucuri i extracte alimentare.

42
Flocularea particulelor Coalescena picturilor
Alimentare
Faza grea
Faza uoar
Alimentare
Solide
Faza grea
Faza uoar

Figura 2.18. Centrifug cu talere cu reinerea fazei solide

evacuare lichid limpede
solide
evacuare lichid
limpede
solide
mecanism pentru deschiderea
gurilor de evacuare a solidului
a. b.
duze pentru
evacuarea solidului
Figura 2.19. Centrifuge cu talere: a cu descrcarea intermitent a fazei solide;
b cu duze pentru descrcarea fazei solide.

43
Descrcarea continu a fazei solide sub form de nmol este posibil prin
intermediul unor duze de evacuare amplasate simetric la periferia diametrului maxim al
tamburului (fig. 2.19 b). Numrul i dimensiunile acesor duze sunt corelate astfel nct
s se evite nfundarea acumularea fazei solide i nfundarea, dar i pentru meninerea
unei concentraii rezonabile a nmolului evacuat. Uzual o astfel de centrifug are 12
24 duze cu deschiderea de 0,75 2 mm. Unele variante constructive permit recircularea
parial a nmolului evacuat, splarea nainte de evacuare, etc. [35].
Centrifuga cu descrcare sub presiune a concentratului. Suspensiile de
drojdii, bacterii, precum i unele precipitate proteice au o comportare pseudoplastic:
viscozitatea aparent scade cu creterea vitezei de forfecare. Ca urmare a acestui fapt ele
pot curge prin tuburi i canale chiar la concentraii ridicate. Concentratul adunat la
periferia tamburului (fig. 2.20) este mpins de presiunea lichidului de alimentare, prin
intermediul unor duze, ctre pompa centripet aflat la partea inferioar a rotorului.
Aceasta preia concentratul i l evacueaz prin axul centrifugei. Aceste centrifuge sunt
utilizabile numai pentru fluide pseudoplastice care nu mai au i alt fel de particule n
componen.
concentrat de celule
evacuare decantat
(faza uoar)
duze colectare concentrat pomp centripet
rotor
tambur
discuri
carcas
alimentare cu suspensie
concentrat de celule
(faza grea)
lichid de cultur
pompe peristaltice
tuburi de legtur
manon de protecie
insert de unic folosin
Figura 2.20. Centrifug cu descrcare sub
presiune a concentratului de celule
Figura 2.21. Insert de unic folosin
utilizat n centrifugele Centritech

Centrifuga Centritech este prevzut n rotor cu un insert din plastic de unic
folosin (fig. 2.21), n care lichidul de alimentare este introdus la partea superioar, iar
lichidul centrifugat iese pe la partea superioar a captului opus al insertului. Faza grea
(concentratul de celule) este evacuat intermitent prin ieirea de la partea inferioar.
Aceast centrifug, cu un factor de separare de maximum 100 este utilizat pentru
separarea celulelor animale din lichidul de cultur [38].
n tabelul 2.8 sunt prezentate caracteristicile principale ale centrifugelor utilizate
n procesele de bioseparare.


44
Tabelul 2.8. Caracteristici ale separatoarelor centrifugale utilizate n biotehnologii
Tip
Descr-
carea
solidului
*
Debit
ali-
mentare
[L/h]
Coninut
de solide
[% vol.]
Debit
solide
[L/h]
Factor
[m
2
]
Factor
efica-
citate z
Aspect
solide
**

Tubular M
20
7000
< 1 0
1400
4500
< 31000 PC
Cu camere M
100
20000
< 5 0 < 9000 PC
Decantoare cu
transportor
elicoidal
C
20
120000
5 50 < 50000
400
25000
< 10000 NGS
Cu talere M
20
100000
< 1 0
1000
300000
< 10000 PC
Cu talere, des-
crcare radial
I
20
100000
< 25 < 3000
1.000
170.000
< 14500 NGF
Cu talere, des-
crcare axial
I
1000
150000
< 15 < 1000
110000
220000
< 15000 NGF
Cu talere, des-
crcare cu
duze
C
300
250000
2 30
3000
60000
35000
180.000
< 11000 NS
Cu talere, des-
crcare sub
presiune
***

C
1000
180000
4 30
150
40000
69000
180000
< 15000 NGF
Centritech
****
I 5 100 < 1 < 15 na < 100 NFS
(*) M manual; I intermitent; C continuu;
(**) PC past consistent; NGS nmol gros semisolid; NGF nmol gros fluid; NS nmol
subire; NFS nmol foarte subire;
(***) Numai pentru crem de agregate monocelulare;
(****) Numai pentru celule animale.

2.4.3. Aplicaii ale separrii centrifugale n biotehnologii

Cea mai important utilizare a centrifugelor n biotehnologii este recoltarea
celulelor, indiferent dac produsul este extracelular, intracelular sau este chiar celula
nsi (fig. 2.22). n aval de recoltare, numrul aplicaiilor centrifugelor crete. Ele se
pot utiliza pentru clasare (sortare dup dimensiuni), deshidratare, extracie lichid
lichid, recuperarea precipitatelor. Aplicaiile prezentate mai jos nu sunt exhaustive, fiind
date doar cu titlu exemplificativ; practic exist nenumrate variante de procese de
separare n aval de bioreactor care implic i tehnici de centrifugare.

2.4.3.1. Separarea drojdiilor

Concentrarea drojdiei de panificaie s-a numrat printre primele aplicaii ale
centrifugelor cu talere. La ora actual se utilizeaz centrifuge cu descrcare prin duze,
sub presiune, a cremei de drojdie. Debitele vehiculate sunt printre cele mai mari din
biotehnologii, pn la 150 m
3
/h lichid de fermentaie, cu pn la 25 % v/v celule de
drojdie. Drojdia este apoi splat pentru creterea duratei de via. Raportul m
V
/ (ec.
2.19) este de circa 2.10
-7
m/s, la o reducere de 99,9% a numrului de celule.

45
Produse extracelulare
Corpi de incluziune Produse intracelulare
Figura 2.22. Utilizarea separatoarelor centrifugale pentru recoltarea celulelor

n fabricile de bere, centrifugele sunt
utilizate n mai multe etape ale procesului
tehnologic. Dup fermentare, berea tnr
conine pn la 80.10
6
celule/mL (2% v/v),
pentru clarificarea ei fiind folosite
centrifuge cu talere cu descrcare radial a
fazei solide, prevzute cu dispozitive
speciale de evacuare, pentru evitarea
contactului cu atmosfera. Debitele
vehiculate sunt de circa 75 m
3
/h. nainte
de filtrarea final a berii, coninutul de
mas celular al acesteia este mai redus,
putndu-se utiliza centrifuge cu capaciti
mai mici de reinere a fazei solide (fig.
2.23). Forma dispozitivului de intrare
permite o accelerare treptat blnd, care
favorizeaz separarea proteinelor sensibile

Figura 2.23. Centrifug din industria berii
1 alimentare lichid; 2 distribuitor de accelerare;
3 talere; 4 pomp centripet; 5 fund culisant;
6 orificii evacuare solide; 7 arbore.

46
la forfecare. Tamburul are o singur ieire pentru faza lichid, la partea superioar,
printr-o pomp centripet ncorporat. Solidele sunt evacuate radial. Scopul primar fiind
cel al ndeprtrii celulelor, raportul m
V
/ este de circa 5.10
-8
m/s. Debitul unor astfel de
centrifuge, utilizate i n vinificaie la limpezirea mustului nainte de fermentaie i la
limpezirea final a vinului, este de pn la 45 m
3
/h. Acest tip de centrifuge, n
construcie septic, poate fi utilizat i n tehnologia ADN recombinat [37].

2.4.3.2. Separarea bacteriilor

n biotehnologiile moderne, pentru recoltarea bacteriilor se utilizeaz centrifuge
cu discuri, cu evacuare sub presiune a masei celulare sau centrifuge decantoare. Pentru
microorganisme avnd dimensiuni de circa 1 m se utilizeaz centrifuge cu descrcare
axial. Dac concentraia solidelor este mare, necesitnd o frecven de descrcare la
mai puin de 60 s, se utilizeaz centrifuge cu descrcare radial, mai costisitoare. Pentru
suspensiile curate se poate utiliza centrifuga cu descrcare continu sub presiune
prezentat n fig. 2.20. O valoare tipic m
V
/ pentru o recuperare de 99% a E. Coli K12
este de 10
-8
m/s.
Celulele de Corynebacterium, de dimensiuni ceva mai mari, ntlnite n biosinteza
aminoacizilor, pot fi separate n centrifuge cu duze de descrcare sub presiune a
solidelor, iar miceliile de Actinomyces se pot recolta cu centrifuge cu descrcare radial.
Ca i n centrifugele cu duze, celulele sunt splate, cel mai adesea n dou trepte, pentru
mbuntirea randamentului.
Sunt cazuri cnd diluarea i resepararea nu este posibil datorit fragilitii
celulelor, care s-ar putea rupe, compromind astfel etapele ulterioare de prelucrare.
Pentru evitarea scderii randamentului, celulele trebuie recoltate la o umiditate minim.
n aceste condiii se preteaz utilizarea centrifugelor decantoare. Valorile sczute ale
acestor echipamente fac obligatorie flocularea celulelor nainte de recoltare. Adaosul de
polimeri conduce la o eficien a separrii de 98 99% la rapoarte m
V
/ de 3.10
-7
pentru
un lichid de fermentaie cu un coninut de 12 15 % v/v Bacillus subtilis lipsit de spori.
Coninutul de substan uscat (SU) al concentratului este de 27 28 % la z = 3200.
Rezultatul este comparabil cu al centrifugelor cu duze sau cu descrcare intermitent a
fazei solide care dau concentrate cu circa 15% mas bacterian.
Capacitatea centrifugelor decantoare de a obine produse cu un coninut ridicat de
SU este utilizat pentru concentrarea fazei solide provenite de la centrifugele cu duze
sau de la unitile de ultrafiltrare a lichidelor de fermentaie de la biosinteza
aminoacizilor sau antibioticelor. Avantajul const n mbuntirea randamentelor i
reducerea costurilor cu depozitarea deeurilor.
n cazul produciei de proteine monocelulare din hidrocarburi sau derivai ai
acestora, bacteriile sunt preconcentrate pn la circa 6% SU n centrifuge cu duze de
mare capacitate, iar apoi sunt floculate. Biomasa este apoi deshidratat pn la circa
30% SU n centrifuge decantoare, dup care este granulat i apoi uscat. Faza lichid
rezultat din centrifuga decantoare este limpezit n separatoare de mare vitez i
trimis la sterilizare mpreun cu lichidul limpede din faza de preconcentrare. De la
sterilizare lichidul este recirculat n fermentator [39].


47
2.4.3.3. Separarea celulelor animale

n comparaie cu alte tipuri de celule, celulele animale au o vitez de cretere
mai redus, sunt susceptibile la infecii prin numeroi virui, i, datorit cvasiabsenei
peretelui celular, sunt mult mai fragile i deci sensibile la prelucrarea prin procedeele
convenionale.
Rolul centrifugrii n biotehnologia celulelor animale este n primul rnd acela
de a separa fazele rezultate din bioreactor (fig. 2.24). Centrifugele sunt folosite fie
pentru limpezirea masei de celule scoase din bioreactorul discontinuu, fie pentru
reinerea masei celulare pentru prelucrare ulterioar, n cazul operrii continue.
Realizarea acestor operaii depinde de faza n care se afl produsul util (intra- sau
extracelular).
Supernatant liber
de celule pentru
prelucrare n
aval de bioreactor
Bucl bioreactor
preparare inocul
Iniiere cultur
Bucl bioreactor
producie
Reciclare celule viabile > 99%
Reciclare celule viabile > 99%
Figura 2.24. Sistem de centrifuge integrat n biotehnologia celulelor animale

a b c

Figura 2.25. Centrifuge adaptate prelucrrii celulelor animale: a alimentare
uzual; b alimentare hidroermetic; c evacuare prin duze VisCon

Datorit fragilitii acestor celule, centrifugele utilizate sunt adaptate special
prelucrrii acestora. ntruct celulele animale sunt mai sensibile la forfecare dect
bacteriile sau drojdiile, dispozitivele de alimentare cu suspensie de celule i cele de
evacuarea masei celulare ale centrifugelor sunt modificate (fig. 2.25). Alimentarea se
face printr-un dispozitiv hidroermetic care evit supunerea celulelor la fore de

48
forfercare mari, prin alimentarea masei celulare sub nivelul de lichid existent deja n
centrifug. Fa de separatoarele centrifugale convenionale cu duze pentru evacuarea
solidelor, duzele VisCon patentate de Westfalia AG nu sunt amplasate la periferia
tamburului, n zona cea mai deprtat de axa de rotaie, ci pe o circumferin mai mic,
nuntrul tamburului. n aceast zon, forele de presiune sunt mai reduse, celulele fiind
supuse unor fore de forfecare mai mici.
Centrifugele utilizate pentru separarea celulelor animale au de regul factori de
eficacitate ridicai (pn la 20 000), posibiliti de curire i sterilizare fr a fi necesar
demontarea (CIP
1
i SIP
2
) i metode specifice pentru evacuarea materialului celular
acumulat n tambur. Se utilizeaz echipamente cu capaciti de prelucrare de 10 600
L/h (instalaii de laborator i semipilot), dar i de 1 15 m
3
/h (instalaii pilot i
industriale) [40]. Se utilizeaz ns i centrifuge cu factori de eficacitate mici (250
300), cum sunt centrifugele Centritech, de ex.
Pentru separarea celulelor animale exist i alte opiuni n afar de centrifugare:
filtrarea tangenial, filtrarea n filtre rotitoare, separarea n dispozitive nclinate de
sedimentare, mai mult sau mai puin dezavantajoase.

2.4.3.4. Separarea resturilor celulare

n cazurile n care produsele intracelulare nu formeaz corpi de incluziune,
resturile celulare se ndeprteaz, de regul, imediat dup dezagregarea celulelor.
Separarea este dificil, datorit faptului c prin dezagregare rezult particule foarte fine,
de 0,2 0,5 m, i, n plus, viscozitatea sistemului este uzual ridicat. Diluarea
suspensiei reduce viscozitatea, dar raportul m
V
/ reprezint doar 5 10% din valoarea
pentru celule ntregi. Este necesar utilizarea centrifugelor cu turaii ridicate, cu
evacuarea (continu sau intermitent) a solidelor. Acolo unde este posibil, se recomand
flocularea resturilor celulare, n acest mod raportul m
V
/ putndu-se mri cu cel puin un
ordin de mrime. De exemplu, prin flocularea resturilor celulare de drojdii cu borax, se
pot ndeprta circa 80% din acestea ntr-o centrifug decantoare (la nivel de instalaie
pilot), la o valoare m
V
/ de 4.10
-4
m/s [37].

2.4.3.5. Recuperarea i splarea corpilor de incluziune

n cazul n care produsul activ intracelular formeaz corpi de incluziune, este
preferabil ndeprtarea resturilor celulare i a celorlai componeni celulari nainte de
urmtoarea etap de prelucrare. Corpii de incluziune au o vitez de sedimentare mai
ridicat dect resturile celulare, astfel nct ntr-o centrifug de clasare corpii de
incluziune vor fi reinui, n timp ce resturile celulare vor prsi echipamentul odat cu
faza lichid (fig. 2.26). Exist o interdependen puternic ntre metoda de omogenizare
(numrul de treceri prin omogenizator, de ex. vezi i capitolul urmtor) i distribuia
dup dimensiuni a particulelor rezultate pe de o parte i uurina splrii corpilor de
incluziune pe de alt parte [41]. Exist o valoare optim a numrului de treceri.

1
CIP cleaning in place = curire pe loc (fr demontare)
2
SIP sterilization in place = sterilizare pe loc (fr demontare)

49
Separarea prin clasare nu este total, fiind necesar repetarea operaiei. Aceasta se face
fie prin resuspendarea corpilor de incluziune separai, n cazul operrii discontinue, fie
prin alimentarea continu simultan a concentratului de corpi de incluziune i a apei
ntr-un rezervor de alimentare prevzut cu o bun amestecare, continund operaia pn
la obinerea puritii dorite. Se utilizeaz centrifuge cu descrcare axial, sau mai bine
radial a fazei solide, la un raport m
V
/ = (12).10
-8
m/s. n vederea reducerii
consumurilor de reactivi n etapele urmtoare, separarea final se face prin deshidratare,
ntr-o centrifug decantoare la m
V
/ = 2.10
-6
m/s [37].

Figura 2.26. Separarea corpilor de incluziune prin clasare centrifugal n procesul
de obinere a hormonilor (insulina)

2.4.3.6. Fracionarea plasmei umane

Proteinele din plasma sangvin sunt separate prin procese fizice i chimice, bazate
pe modificarea selectiv a trei parametri care afecteaz solubilitatea proteinelor n ap:
temperatur, pH i concentraia alcoolului.
Sngele uman const din faza roie i plasma limpede. Faza roie (cca. 40% din
snge) este separat cu centrifuge speciale direct n punga de colectare de la donator.
Plasma rmas este congelat i apoi trecut la fracionare. Doar 5% din plasm este
alctuit din produi utili, restul fiind ap i electrolii (fig. 2.27). De aici pot fi extrai
numeroi componeni valoroi. mediat dup congelare, din crioprecipitatul rezultat se
pot separa concentratul de Factor VIII i complexul protrombinic. Plasma rmas este
trecut la fracionare cu etanol prin procedeul Cohn (fig. 2.28), unde se recupereaz prin
precipitare fraciunile individuale: fibrinogen, alfa, beta i gama globuline, albumine.
Dup fracionare, proteinele se prelucreaz cu metode specifice, nainte de a fi utilizate
n diverse domenii: chirurgie, tratarea infeciilor, reducerea deficitului proteic,
malnutriie, etc.


50
Figura 2.27. Compoziia sngelui uman

La fracionarea prin procedeul Cohn este necesar meninerea temperaturii n
intervalul 3 6 C. Pentru aceasta se folosesc centrifuge cu camere cu capaciti
ntre 60 1000 L/h, prevzute cu rcire tripl: (1) rcirea direct a tamburului, pentru
ndeprtarea cldurii generate de frecarea aerului de tamburul care se rotete; (2) rcirea
prii superioare a carcasei pentru preluarea cldurii agentului de rcire care rcete
tamburul; (3) rcirea capacului pentru ndeprtarea cldurii din partea superioar a
tamburului i din inelul de etanare (fig. 2.29). Soluia salin utilizat ca agent de rcire
este alimentat la 20 C. Cu acest sistem de rcire se poate asigura un control al
temperaturii cu o precizie de 0,3 C.
Figura 2.28. Fracionarea plasmei sangvine prin procedeul Cohn

Una dintre noutile aprute n fracionarea sngelui uman o reprezint
manipularea etan a solidelor. Un bun exemplu este hiperconcentratorul HyCon produs
de Wesfalia AG, o centrifug la care mecanismul de antrenare (motor i reductor) i

51
centrifuga propriu-zis (tamburul i sistemul de evacuare a solidelor) sunt separate
ermetic ntre ele prin inele de etanare cu gaz i sunt amplasate n ncperi diferite,
centrifuga propriu-zis aflndu-se ntr-o ncpere steril amplasat sub ncperea
(nesteril) n care se gsete antrenarea [42].
generare
cldur
disipare
cldur
(maxim)
rcire capac
rcire carcas
rcire tambur
frecarea
agentului de
rcire de
tambur
frecarea
aerului de
tambur

Figura 2.29. Centrifug cu camere prevzut cu circuite de rcire
Q
in1
cldur generat prin frecarea tamburului cu aerul; Q
in2
cldur generat prin frecarea
lichidului de rcire de tambur; Q
out1
cldur preluat de agentul de rcire a tamburului; Q
out2
cldur
preluat de agentul de rcire a carcasei; Q
out2
cldur preluat de agentul de rcire a capacului.
1 alimentare centrifug; 2 evacuare lichid limpede; 3 pomp centripet; 4 intrare agent de rcire
capac; 5 ieire agent de rcire capac; 6 ieire agent de rcire carcas; 7 cptueal exterioar
demontabil; 8 intrare agent de rcire carcas; 9 ieire agent de rcire tambur; 10 intrare agent de
rcire tambur; 11 cptueal interioar demontabil; 12 insert sub form de clopot.

O alt perfecionare const n rcirea tamburului centrifugei cu azot lichid, fapt
care permite o mai bun ndeprtare a cldurii generate prin frecare, i un control mai
bun al temperaturii.

2.5. Separarea prin microfiltrare

Microfiltrarea, ultrafiltrarea i osmoza invers sunt procese de membran
nrudite, diferena dintre acestea fiind mrimea particulelor care pot fi reinute (fig.
2.30). Particulele solide aflate n suspensie reinute prin microfiltrare au dimensiuni
cuprinse ntre 0,1 i 10 m, n aceast categorie intrnd o serie de virui, bacterii, celule
animale i vegetale.
Membranele pentru microfiltrare pot fi ncadrate, n funcie de mecanismul
filtrrii (fig. 2.5), fie n categoria filtrelor n adncime, fie n categoria filtrelor cu efect
de sit. De obicei membranele de filtrare n adncime se utilizeaz pentru filtrarea fr
ieire (dead-end filtration), acestea putnd reine o cantitate mai mare de solide.

52
diametrul porilor
filtrare
convenional
microfiltrare
ultrafiltrare
osmoz invers

Figura 2.30. Mrimea particulelor reinute prin diferite procese de filtrare [43]

2.6. Centrifugare sau microfiltrare ?

Dup apariia microfiltrelor sterilizabile, utilizarea microfiltrrii pentru separri
lichid-solid n biotehnologii a devenit o alternativ viabil. Ca regul general, pe
msur ce cresc dimensiunile particulelor i scara de operare, centrifugarea este mai
avantajoas dect microfiltrarea, i viceversa.
Dac, de ex., pentru separarea E. Coli dintr-un bioreactor de 200 L, microfiltrarea
este posibil, decizia aplicrii acestui procedeu de separare trebuie bine cntrit. Dac
se dorete ulterior transpunerea la o scar mai mare a procesului pot aprea probleme.
Este mult mai convenabil s se pstreze aceeai tehnologie i la scar mai mare, chiar
dac aceasta nu este tocmai alegerea optim. n multe cazuri, rspunsul la ntrebarea din
titlu l reprezint o combinaie de filtre i centrifuge.


53

3. Dezagregarea masei celulare

Dup separarea masei de celulare de lichidul de fermentaie, urmtoarea faz a
procesului tehnologic depinde de locaia produsului dorit. Dac produsul dorit este
excretat de ctre celule (etanol, acid citric, antibiotice), trebuie prelucrat lichidul de
fermentaie, biomasa fiind un produs secundar. Dac produsul rmne n interiorul
celulelor (aa cum se ntmpl n cazul enzimelor, proteinelor recombinate, etc.),
lichidul de fermentaie va fi produsul secundar, iar masa celular trebuie prelucrat n
vederea recuperrii produsului util dorit.
Pentru a izola produsele intracelulare este necesar distrugerea membranei i a
pereilor celulari, proces cunoscut drept dezagregarea celulelor (cell disruption).
Procedeul utilizat pentru dezagregarea la scar industrial depinde de o serie de factori,
ca: susceptibilitatea celulelor la rupere, caracteristicile de stabilitate ale produsului,
uurina extraciei produsului din resturile celulare, viteza metodei, costurile asociate.

3.1. SUSCEPTIBILITATEA LA RUPERE A CELULELOR

Forma i rezistena celulelor depinde n primul rnd de natura acestora. Celulele
sunt caracterizate de o mare varietate de morfologii, structuri i mrimi, depinznd de
vrst i de condiiile de cultur. Bacteriile pot aprea sub form de sfere, baghete, elici,
filamente. Fungiile pot fi de tip micelar, pseudomicelar sau unicelular. Pereii celulari
sunt responsabili de rezistena, rigiditatea i forma celulelor, acetia reprezentnd
bariera major pentru punerea n libertate a produselor intracelulare. Cunoaterea
structurii i compoziiei pereilor celulari este important n alegerea metodei de
dezagregare adoptate.

3.1.1. Celule animale

Celulele animale sunt caracterizate de lipsa pereilor celulari. Acestea prezint
doar o membran celular alctuit dintr-un strat dublu de lipide, slab sprijinit de
Capitolul 3 Dezagregarea celulelor

54
citoschelet (fig. 3.1). Lipsa unui perete celular rigid permite dezvoltarea unei mari
diversiti de celule, esuturi i organe. Tot aceast lips permite ns i o dezintegrare
uoar a unor astfel de celule. n plus, celulele animale fiind relativ mari (1 100 m),
sunt foarte vulnerabile la forfecare.

Figura 3.1. Membrana celular [44]

3.1.2. Celule vegetale

Celulele vegetale au pereii constituii din carbohidrai compleci insolubili
(celuloz i hemiceluloze), lignin i cear care nconjoar membrana plasmatic (fig.
3.2).
a
Figura 3.2. Perei celulari vegetali [45]
a structur; (b d) imagine microscopic a peretelui celular pentru: castan de
ap (b), cartof (c), morcov (d)
b
c
d
1 m

55
Microfibrilele celulozice care acoper membrana plasmatic ntr-o manier
ntmpltoare confer acestor celule o oarecare protecie la forfecare. Dac celulele sunt
de dimensiuni mari, vulnerabilitatea lor la forfecare crete. Proteinele din aceste celule
pot fi legate i inactivate de ctre compuii fenolici care fac parte din unitile ligninice.

3.1.3. Fungii i drojdii

Ca i celulele mamiferelor, fungiile sunt eucariote cu ADN-ul organizat n
cromozomi n interiorul nucleului. Peretele celular al fungiilor filamentoase i al
drojdiilor este compus din circa 80 90% polizaharide (fig. 3.3). n fungiile
filamentoase chitina este ncruciat cu glucani, n timp ce n fungiile inferioare i n
drojdii exist un amestec coninnd manan i glucan. Fungiile mature nu au o structur
discret a peretelui celular.
Celula de fungie Membrana si peretele celular
ergosterol
-(1,3)-glucan sintaza
manoproteine
-(1,6)-glucan
-(1,3)-glucan
chitina
membrana celulara
(strat dublu de
fosfolipide)

Figura 3.3. Structura peretelui celular al fungiilor [46]

Figura 3.4. Structura peretelui celular al drojdiilor [47, 48]

3.1.4. Bacterii

Structura pereilor celulari ai procariotelor este unic, muli dintre compui
identificai n acetia negsindu-se altundeva n natur. Exist dou tipuri structurale de
baz pentru pereii celulari care au fost studiate detaliat: cele ale bacteriilor Gram
pozitive(fig. 3.5), respectiv Gram negative (fig. 3.6). ntre cele dou tipuri de perei
celulari exist deosebiri majore. Celulele Gram pozitive apar netede la microscopia

56
electronic de baleiaj, avnd un singur strat de peptidoglucan, n timp ce cele Gram
negative au o suprafa ondulat, peretele celular fiind alctuit din trei straturi (fig. 3.6).

Figura 3.5. Bacterii Gram pozitive
A streptococ B; B strat unic de
peptidoglucan
Figura 3.6. Bacterii Gram negative
C E. Coli; D strat triplu al peretelui
celular

Celulele gram-negative prezint un strat suplimentar n exterior. Peretele gram-
pozitiv este mult mai gros dect cel gram-negativ. Ambele tipuri de perei prezint un
element comun, peptidoglucanul. Acesta este un strat gros i rigid compus din dou
straturi suprapuse de zaharuri, N-acetilglucozamin (NAG) i acid N-acetil muramic
(NAM) legate ntre ele prin puni de aminoacizi. NAM este un component specific
pereilor celulelor bacteriene, nefiind identificat altundeva n natur. Structura
schematic a pereilor celulari este redat n fig. 3.7.

Figura 3.7. Structura peretelui celular:
a bacterii gram-pozitive; b bacterii gram-negative

Diferenele dintre pereii celulari ai bacteriilor gram-pozitive i gram-negative
influeneaz hotrtor comportarea acestor bacterii; implicit i condiiile de dezagregare
necesare fiecrui tip de bacterii vor fi diferite. Tabelul 3.1 sumarizeaz diferenele dintre
cele dou tipuri de perei celulari.
Bacillus cereus Serattia marscenses
a
b

57
Tabelul 3.1. Proprietile pereilor celulari [49]
Proprietate Gram Pozitiv Gram Negativ
Grosimea peretelui, nm 20 80 10
Numrul de straturi al peretelui 1 2
Coninutul de peptidoglucan, % Peste 50 10 20
Acid teihoic n perete Da Nu
Coninut de lipide i lipoproteine, % 0 3 58
Lipopolizaharide, % 0 13
Sensibilitate la penicilin Da Mai puin
Digerat de lizozim Da Puin

Lizozima, utilizat frecvent pentru scindarea peptidoglucanilor, folosit ntr-un
mediu izotonic, va ndeprta peretele celular extern al bacteriilor gram-pozitive,
elibernd coninutul spaiului periplasmatic. Datorit stratului de lipopolizaharide,
bacteriile gram-negative sunt mai puin susceptibile la lizozim. Susceptibilitatea lor
poate fi mrit n prezen de acid etilediaminotetraacetic (EDTA), care destabilizeaz
structura lipopolizaharidelor.

3.2. METODE DE DEZAGREGARE A CELULELOR

Pentru dezagregarea celulelor, n scopul eliberrii produselor intracelulare, se
utilizeaz dou categorii de metode: mecanice i nonmecanice. Prin metodele mecanice,
peretele celular este distrus n totalitate; metodele nemecanice realizeaz doar
permeabilizarea pereilor pentru anumii produi, celula pstrndu-i individualitatea
(fig. 3.8).
Celul dezagregat
mecanic
Celul permeabilizat
nemecanic

Figura 3.8. Dezagregarea mecanic i permeabilizarea nemecanic a celulelor

O clasificare mai detaliat a metodelor de dezagregare este prezentat n schema
din fig. 3.9. Majoritatea metodelor sunt aplicabile la nivel de laborator sau pilot.

58
Celule
Dezagregare
mecanica
Dezagregare
nemecanica
Deshidratare Permeabilizare
Forfecarea
lichidului
Forfecarea
solidului
Ultrasunete
Agitare
mecanica
Presiune
Macinare
Presiune
Fizica
Chimica
Enzimatica

Figura 3.9. Clasificarea metodelor de dezagregare a celulelor

3.2.1. Metode mecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor

Aceast categorie de metode este larg utilizat, datorit productivitii ridicate i a
eficienei sporite. Principiul metodelor const n aplicarea unor tensiuni de forfecare
ridicate fie lichidului n care este dispersat masa celular, fie masei celulare nsi.
ntruct o parte din energia mecanic introdus n sistem este disipat sub form de
cldur, trebuie asigurat o rcire corespunztoare a masei celulare pentru a evita
degradarea produselor datorit nclzirii excesive.

3.2.1.1. Forfecarea lichidului cu ajutorul ultrasunetelor

Ultrasunetele cu frecvene cuprinse ntre 20 50 kHz aplicate lichidelor produc
fenomenul de cavitaie sonic. n principiu, undele de nalt frecven sunt generate
electronic, iar energia mecanic este transmis lichidului prin intermediul unei sonde
metalice care oscileaz cu aceeai frecven. Sonda este plasat n recipientul care
conine masa celular, iar oscilaiile de nalt frecven produc o presiune nalt
localizat care conduce la cavitaie i impact. Unda de oc format conduce la
dezagregarea celulelor. Dezagregarea depinde de alegerea corespunztoare a
parametrilor de lucru: pH, temperatur, tria ionic a mediului.
Ultrasonarea d bune rezultate la dezagregarea culturilor microbiene. Eliberarea
proteinelor pare a fi proporional cu consumul de putere i independent de
concentraia celulelor, iar dezagregarea celulelor crete exponenial cu timpul de
expunere la ultrasunete. Cinetica procesului este descris de ecuaia [50, 51]:
) exp( 1 kt X = (3.1)
n care t este timpul de ultrasonare, iar X este fracia de proteine eliberate. Constanta de
vitez k depinde de puterea ultrasunetelor dup o relaie de forma:

59
( )
9 , 0
0
W W k (3.2)
unde W este puterea acustic, iar W
0
reprezint puterea de cavitaie. Alte cercetri arat
c ntre constanta de vitez i puterea acustic exist o dependen liniar [51].
ntruct generarea de cldur provoac degradarea proteinelor, nu se recomand
folosirea pastelor celulare cu concentraii mai mari de 200 g/L, iar ultrasonarea se face
n etape de maximum 30 de secunde, concomitent cu meninerea pe ghea a pastei
celulare. Printre alte dezavantaje se poate meniona nivelul ridicat de zgomot n timpul
procesrii (este necesar protecia auditiv a personalului), randamentul variabil i
generarea de radicali liberi care pot reaciona cu alte molecule.
Dei procesul se poate realiza n regim continuu, aplicabilitatea la scar
industrial este limitat datorit consumurilor energetice ridicate i datorit faptului c
ultrasunetele pot provoca denaturarea proteinelor i enzimelor [4].

3.2.1.2. Forfecarea lichidului prin agitare mecanic

Metoda este utilizat n special pentru dezagregarea esuturilor, folosind mixere i
blendere de diverse construcii, difereniat pentru esuturile moi (ficat, creier, glande
endocrine) i pentru cele tari (muchi cardiac). Utilizarea amestectoarelor cu
ansamblu rotor-stator (fig. 3.10) reprezint o alt posibilitate de a provoca n lichid
tensiuni de forfecare mari.

a
b
c
d e
f g h
i j k
1
2
3
4
5
6

Figura 3.10. Agitatoare cu rotor i stator
a vedere general (1 ansamblu rotor stator; 2 tije susinere stator; 3 ax rotor; 4 flan de
prindere pe recipient; 5 cuplaj; 6 motor de antrenare rotor); b spectru de curgere n zona
agitatorului; c principiu de funcionare; d k tipuri constructive de ansambluri rotor stator.


60
3.2.1.3. Forfecarea lichidului prin presurizare

Dezagregarea se realizeaz fornd trecerea suspensiei de mas celular la
presiuni de 50 200 MPa printr-o valv cu un orificiu ngust, dup care urmeaz
depresurizare brusc, care induce n lichid o tensiune de forfecare capabil de a distruge
celulele. n plus, la ieirea din valv, celulele ntlnesc un inel de impact (fig. 3.11). Prin
lovirea acestuia, precum i datorit schimbrilor brute de direcie la trecerea prin valv
se completeaz procesul de dezagregare.

Valva Presiune
Scaunul
valvei
Scaunul
valvei
Inel de impact
Inel de impact
Suspensie
de celule
Figura 3.11. Valv de descrcare: a principiu de funcionare [3]; b seciune [52]
A dispozitiv manual de reglare a presiunii de descrcare;
B resort; C valva; D scaunul valvei; E inel de impact.

Utilaje bazate pe astfel de dispozitive sunt utilizate pentru dezagregarea celulelor
la scar industrial. Aceste utilaje sunt cunoscute sub diferite denumiri: omogenizator
de nalt presiune, omogenizator Manton-Gaulin, pres francez. Datele experimentale
arat c eficiena dezagregrii depinde mai ales de presiunea de operare i de numrul
de treceri al masei celulare prin aparat [3, 4, 53], dar i de configuraia valvelor, de
natura microorganismelor supuse dezagregrii i de compoziia mediului pe care au fost
cultivate microrganismele [4, 53, 54]. Pentru corelarea eficienei dezagregrii cu
parametrii de operare au fost propuse mai multe ecuaii. Astfel, pentru distrugerea
celulelor de S. cerevisiae, considernd c procesul de dezagregare decurge dup o
cinetic de ordinul I, cantitatea de produs intracelular eliberat poate fi calculat cu
ecuaia [55]:
P N k
X R R
R
m
m
=
1
1
ln ln (3.3)
n care R
m
este cantitatea maxim de protein care poate fi eliberat din celul, R este
cantitatea de protein eliberat dup N treceri succesive ale suspensiei de celule prin
aparat, X = R/R
m
este fracia de celule dezagregate, k este constanta de vitez a
procesului de dezagregare celular (dependent de temperatur), P este presiunea de
lucru, este un exponent care red rezistena la dezintegrare a celulelor, dependent de
tipul de organism i de condiiile de multiplicare. Pentru E. coli, = 2,2 [54], iar pentru
S. cerevisiae, = 2,9 [55].
O analiz bazat pe teoria turbulenei propune ecuaia [56]:

61

=

z
P P
R
0
exp 1 (3.4)
n care R este cantitatea de protein eliberat, P este presiunea de lucru, P
0
este
presiunea de referin, z este o constant, iar este un parametru care depinde de
concentraia celulelor.
Pentru dezagregarea E. coli ntr-un omogenizator de tip Microfluidizer (fig. 3.12),
se propune ecuaia:

P N k
X
b
=
1
1
ln (3.5)
n care exponentul b depinde de concentraia celulelor i de viteza specific de cretere a
acestora [57].

Figura 3.12. Omogenizator de nalt presiune de tip Microfluidizer [58]
1 omogenizator; 2 micrografie celule nainte de prelucrare; 3 micrografie celule dup prelucrare

Ecuaiile 3.3 3.5 includ cte un termen care indic o dependen exponenial a
gradului de dezagregare de temperatur. La fiecare cretere cu 10 MPa a cderii de
presiune prin utilaj, temperatura crete cu 2 3 C, n funcie i de concentraia
celulelor [53]. Creterea temperaturii, dei favorizeaz dezagregarea celulelor, nu este
de dorit ntruct conduce la denaturarea produselor. De accea, suspensia celular trebuie
rcit nainte i dup trecerea prin omogenizator i nu trebuie lsat s depeasc
temperatura de 30 C. Sub aceast temperatur nu s-a sesizat pierderea activitii
enzimatice sau a solubilitii proteinelor [59]. Rcirea se poate realiza fie cu azot rcit n
prealabil, fie prin injectare de dioxid de carbon n interiorul valvei [4].
Un alt dispozitiv care permite obinerea unor tensiuni de forfecare ridicate n faza
lichid care conine suspensia de mas celular este moara coloidal. Morile coloidale
sunt sunt similare din punct de vedere constructiv amestectoarelor cu ansamblu rotor
1
2
3

62
stator montate n flux. Deosebirile constau n faptul c n morile coloidale cantitatea de
fluid reinut n zona de lucru este mai mare, iar n fluid se introduce mai mult energie
per trecere. De asemenea, morile coloidale sunt prevzute cu un dispozitiv care permite
reglarea distanei dintre rotor i stator, permind astfel un control mbuntit al
vitezelor de forfecare i al timpului de retenie a materialului prelucrat n moar. n fig.
3.13 este redat o moar coloidal vertical, moara coloidal Premier. Piesa esenial a
morii este rotorul tronconic (1) care se rotete foarte rapid la distan mic i reglabil
de carcasa (2). Principalele caracteristici ale acestei mori sunt redate n tab. 3.2 [60].

Figura 3.13. Moar coloidal vertical
Premier [60]
1 rotor; 2 carcas; 3 urub reglare distan rotor
carcas; 4 alimentare; 5 evacuare; 6 roat de
transmisie.
Tabelul 3.2. Caracteristici ale
morilor coloidale Premier [60]
Mori
Caracteristica
industriale mici
Diametru maxim
rotor [mm]
150-400
75-
100
Turaie rotor
[rot/min]
3600
7200-
17000
Debit prelucrat
[m
3
/h]
max. 6,8
0,023-
0,70
Putere necesar
[kW]
max. 75 -
Distan minim
rotor-carcas
[mm]
0,04-1,0

Moara coloidal W250HB (Chemineer, Inc.) poate funciona n poziie orizontal (fig.
3.14), dar poate fi utilizat i n poziie vertical, prin adaptarea unui buncr de
alimentare cu conduct de recirculare i montarea morii propriu-zise pe un stativ
vertical. Ansamblul rotor stator poate fi cu suprafee de lucru plane sau canelate.
Principalele dezavantaje ale morilor coloidale sunt faptul c necesit o pomp
suplimentar pentru alimentare (consum suplimentar de energie) i au debite limitate.
1
2
a
b
c
1
2
3
4 5
6
7
8

Figura 3.14. Moar coloidal W250HB (Chemineer, Inc.)
a vedere de ansamblu: 1 carcasa; 2 alimentare; 3 evacuare; 4 racord pentru splare; 5
dispozitiv pentru reglarea distanei rotor-stator; 6 cuplaj; 7 motor de antrenare; 8 batiu; b
ansamblu rotor (1) stator (2) standard; c ansamblu rotor (1) stator (2) cu caneluri.

63
3.2.1.4. Forfecarea fazei solide prin mcinare

Forfecarea fazei solide prin mcinare se poate realiza n laborator n mojare cu
pistil. Operaia este manual i laborioas. Uneori, pentru facilitarea eliberrii
componentelor intracelulare, se adaug la biomaterial alumin sau nisip. O alt metod
de laborator care nu necesit munc manual este cea care utilizeaz mese scuturtoare
pe care materialul celular supus dezagregrii este amplasat n flacoane coninnd
materiale abrazive.
Metoda cea mai convenabil, att la scar de laborator, ct i n instalaiile pilot
sau industriale, este cea a mcinrii n mori cu bile. Procedeul const n amestecarea la
turaii ridicate a suspensiei de biomas cu bile confecionate din diferite materiale,
distrugerea celulelor fiind cauzat att de forele de forfecare mari, ct i de coliziunea
cu corpurile de mcinare sau cu pereii morii. Morile cu bile sunt disponibile n diferite
configuraii i capaciti, de la mori discontinue de laborator cu capacitate de 40 mL,
pn la mori continue care pot prelucra pn la 200 kg/h suspensii de drojdii sau pn la
20 kg/h suspensii de mas celular bacterian.
n principiu, o moar cu bile este alctuit dintr-o carcas cilindric orizontal sau
vertical, n interiorul creia se nvrte un agitator cu discuri dispuse concentric sau
excentric. n carcasa n care s-au introdus n prealabil corpurile de mcinare (bilele), se
introduce sub presiune pasta de celule care se supune dezagregrii. Evacuarea pastei de
celule se face printr-un dispozitiv prevzut cu site, site vibratoare sau disc rotativ, cu
rolul de a reine bilele n utilaj. Pentru prevenirea degradrii termice a masei celulare,
carcasa morii este prevzut cu o manta prin care circul un agent de rcire. Cea mai
cunoscut construcie este moara cu bile Dyno-Mill, redat n fig. 3.15.
bile suspensie fluid de rcire
1
2
3
4
5
6
7
8

Figura 3.15. Moar cu bile Dyno-Mill [53]
1 carcasa cilindric; 2 ax agitator; 3 discuri; 4 manta de rcire; 5 dispozitiv de reinere a
bilelor; 6 antrenare ax agitator; 7 manometru; 8 termometru.

64
Bilele pot fi confecionate din sticl, metal, ceramic, cu observaia c exist
anumite restricii de folosire. De exemplu, n industria alimentar i farmaceutic nu
este permis utilizarea bilelor din sticl cu coninut de plumb [4]. Prezena bilelor este
esenial: n absena lor dezagregarea celular nu are loc (fig. 3.16). Dup mcinare
timp de 10 min ntr-o moar de tip GenoGrinder, celulele de drojdie rmn intacte
(petele luminoase din fig. 3.16 a). Dup 5 min de mcinare n prezen de bile din sticl
cu diametrul de 0,4 mm, circa 30% din celule sunt dezagregate (petele ntunecate din
fig. 3.16 b). Dup alte 5 min de mcinare, aproape toate celulele au fost dezintegrate
(fig. 3.16 c) [61].

a b c
Figura 3.16. Influena bilelor asupra dezagregrii celulelor de drojdie [61]

Pentru ca o moar cu bile s fie eficient, aceasta trebuie s realizeze un grad de
dezagregare celular ct mai ridicat, cu un consum minim de energie. Aceti doi
parametrii cheie ai morilor cu bile sunt influenai de un numr foarte mare de factori,
att constructivi, ct i funcionali.
Mecanismul dezagregrii este foarte complex, dezintegrarea celulelor aprnd ca
rezultat al forfecrii att a fazei lichide, ct i a fazei solide datorit impactului bilelor
ntr-un cmp de turbulen intens. Procesul poate fi descris satisfctor de o ecuaie
cinetic de ordinul I, care pentru operarea n regim discontinuu, sau pentru operarea
continu n condiiile curgerii cu deplasare total se scrie:
t k
X R R
R
m
m
=
1
1
ln ln (3.6)
Deoarece la operarea continu exist un anumit grad de amestecare invers, un
model mai apropiat de realitate ar fi cel al n reactoare continue cu amestecare perfect
nseriate, caz n care ecuaia cinetic se scrie:

n
m
m
n
k
X R R
R

+ =

1
1
1
(3.7)
n aceste ecuaii R
m
este cantitatea maxim de protein care poate fi eliberat din
celul, R este cantitatea de protein eliberat n timpul t, X = R/R
m
este fracia de celule
dezagregate (conversia, gradul de dezintegrare), k este viteza specific a procesului de
dezagregare celular, = V/Q este timpul mediu de staionare, V este volumul liber total
al camerei de mcinare, iar Q este debitul suspensiei de celule prin moar [62].
Pe lng caracteristicile constructive ale morii (volumul i geometria camerei de
mcinare, numrul de discuri pe unitatea de volum de moar, geometria i materialul de
construcie al discurilor), gradul de dezintegrare este influenat i de parametrii de

65
operare ai morii: viteza agitatorului, concentraia masei celulare, mrimea bilelor,
concentraia bilelor, temperatura i debitul suspensiei [53].
Viteza agitatorului determin frecvena coliziunii bilelor i intensitatea
forfecrii; ca urmare, ntre anumite limite, viteza specific a dezagregrii celulare este
direct proporional cu viteza periferic a agitatorului [62]. Aceast vitez se recomand
s fie de 5 15 m/s; la valori mai mari crete puternic consumul de energie, se
genereaz mai mult cldur, se accentueaz eroziunea bilelor, iar produsele sensibile la
forfecare se pot inactiva.
Concentraia masei celulare are o influen mai complex asupra vitezei
procesului. De exemplu, la dezagregarea S. cerevisiae, variaia concentraiei masei
celulare ntre 4 20 % m/v nu influeneaz viteza procesului, confirmndu-se astfel
cinetica de ordin I. Alte cercetri au artat c dezagregarea prezint un maxim la
concentraii celulare de 35 40% (mas umed), dup care scade, scderea fiind mai
pronunat la viteze mici de agitare. Fenomenul este atribuit modificrii comportrii
reologice a suspensiei la modificarea concentraiei. Concentraia optim variaz de la
caz la caz; trebuie inut cont i de faptul c la concentraii sczute ale suspensiei celulare
cantitatea de cldur generat este mai mic, ceea ce este bine, ns consumul de putere
pe unitatea de mas de celule prelucrate este mai mare, ceea ce reprezint un dezavantaj.
La concentraii sczute (sub 5% solide) se observ o uzur avansat a morii i a bilelor.
Drept urmare, optimul se determin experimental, situndu-se ntre 30 60%, sau, mai
frecvent, ntre 40 50% (mas umed) [53].
Dimensiunile bilelor sunt dictate de mai multe considerente. De regul, viteza de
dezagregare crete cu scderea diametrului bilelor, dar tendina de plutire a bilelor
foarte mici i dificultile privind reinerea acestora n moar limiteaz diametrul minim
al bilelor utilizate la 0,2 mm n aplicaiile de laborator i la 0,4 mm n aplicaiile
industriale n regim continuu [53]. La aceeai ncrcare cu bile, exist un diametru
optim al bilelor care depinde de natura celulelor supuse dezagregrii i de localizarea
produsului dorit n interiorul celulei. Pentru dezagregarea celulelor vegetale, animale, a
drojdiilor i a sporilor bacterieni, sunt recomandate bile din silice sau zircon avnd
diametrul de 0,2 0,4 mm, n timp ce pentru dezagregarea mucegaiurilor i a fungiilor
sunt recomandate bile din silice sau sticl avnd diametrul de 0,8 1,0 mm [63]. Bilele
cu diametru mai mare sunt preferate cnd produsul este localizat n regiunea
periplasmic, n timp ce pentru produsele citoplasmice se utilizeaz bile de dimensiuni
mai mici [64].
Fracia volumic a bilelor (volumul bilelor/volumul camerei de mcinare)
influeneaz favorabil eliberarea proteinelor din celule. Fracia de bile recomandat este
de 80 90%, limita superioar fiind n general impus de consumul energetic ridicat i
de dificultile legate de ndeprtarea cldurii degajate n timpul mcinrii.
Dei temperatura influeneaz n mod favorabil viteza dezagregrii, cldura
degajat n proces trebuie ndeprtat pentru a nu se produce denaturarea sau inactivarea
produselor. Suspensia celular este rcit att la intrarea, ct i la ieirea din moar, iar
moara este prevzut cu o manta prin care circul un agent de rcire, astfel nct
procesul s se desfoare n intervalul de temperatur 5 40 C. n cazul morilor de
capaciti mari (peste 20 L), rcirea prin manta nu este suficient, fiind necesar
vehicularea agentului de rcire i prin axul i discurile agitatorului [64].

66
Efectul debitului asupra vitezei procesului ar trebui s reflecte efectul timpului de
staionare () al masei celulare n interiorul camerei de mcinare. Dac procesul decurge
dup o cinetic de ordin I, conversia la o singur trecere prin moar ar trebui s scad cu
creterea debitului. Odat cu creterea debitului, scade gradul de amestecare invers
(dispersia longitudinal), astfel nct conversia nu mai poate fi exprimat ca o funcie
simpl de debitul masei celulare. Pe de alt parte, consumul specific de putere (pe
unitatea de mas de suspensie prelucrat) scade puternic cu creterea debitului. Din
acest motiv se recomand operarea morilor cu bile la debite mari, scderea conversiei
putnd fi contracarat prin recircularea parial a suspensiei prin camera de mcinare.
Mai trebuie menionat faptul c prin creterea timpului de staionare (scderea debitului)
viscozitatea suspensiei poate s scad, ntruct forfecarea prelungit poate provoca
degradarea ADN, a crui structur este sensibil la forfecare [65].
Alte studii [66] coreleaz gradul de dezintegrare cu consumul energetic specific,
ajungnd la concluzia c valorificarea maxim a energiei introduse n moar este atins
pentru urmtoarea combinaie de parametri: bile de dimensiuni reduse, concentraii de
mas celular medii spre ridicate, viteze de agitare sczute spre medii. Aceste rezultate
pot sta la baza transpunerii la scar a procesului de dezagregare celular n mori cu bile.
n cazul combinaiei de parametri: concentraii de mas celular reduse, viteze de
agitare ridicate, bile de dimensiuni mari, gradul de dezintegrare a fost corelat cu
frecvena strii de tensiune (care este proporional cu produsul dintre viteza de agitare
i timpul de dezintegrare), iar corelaia a fost verificat experimental.
Cteva valori orientative ale consumului energetic specific pentru dezagregarea
unor microorganisme sunt redate n tab. 3.3.

Tabelul 3.3. Consumuri energetice specifice la dezagregarea
unor microorganisme n mori cu bile [4]
Microorganism
Grad de
dezintegrare [%]
Concentraia
biomasei [% s.u.]
Consum energetic
specific [J/g]
40 13,5 180
42 13,5 800
65 13,5 430
80 6,0 1960
80 11,0 900
80 16,0 900
85 10 20 930
Saccharomices cerevisiae
95 17,0 720 790
Saccharomyces carlsbergensis 95 17,0 720 790
Candida utilis 85 90 17,0 930 1190

3.2.1.5. Forfecarea fazei solide prin presurizare

Faza solid este format din pasta celular n prealabil ngheat. Prin extrudarea
acestei paste printr-un orificiu ngust, la presiuni de pn la 550 MPa, se realizeaz
dezagregarea celulelor. Datorit forelor de forfecare ridicate care apar la trecerea prin
orificiu, efectului abraziv al cristalelor de ghea, modificrii dimensiunilor cristalelor
de ghea, comportrii viscoplastice la curgerea suspensiei prin orificiu, are loc o
distrugere avansat a masei celulare. n plus, prin extruderea pastei congelate se

67
conserv calitile biologice ale produselor intracelulare obinute [4]. Productivitatea
metodei este influenat de temperatur, de natura i concentraia pastei celulare.
Pentru realizarea practic a procesului sunt cunoscute dou dispozitive: presa
Hughes i presa X. Aceste echipamente genereaz presiuni de 150 230 MPa. n timp
ce presa Hughes poate fi utilizat doar la scar de laborator n regim discontinuu, presa
X poate fi operat semicontinuu i se preteaz la transpunere la scar pentru nivele pilot
i industriale [64].

3.2.2. Metode nemecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor

Metodele nemecanice de dezagregare implic fie deshidratarea, fie liza
(permeabilizarea) fizic, chimic sau enzimatic (fig. 3.9) a pereilor celulari. Spre
deosebire de metodele mecanice, metodele nemecanice nu distrug complet peretele
celular, ci doar l permeabilizeaz, permind difuzia n exteriorul celulei a anumitor
componeni. Dei metodele nemecanice au consumuri energetice inferioare metodelor
mecanice de dezagregare a masei celulare, majoritatea lor sunt dezvoltate i aplicate la
nivel de laborator sau, cel mult, de pilot.

3.2.2.1. Dezagregarea celulelor prin deshidratare

ndeprtarea apei din celul provoac deteriorarea membranei citoplasmice,
crescndu-i astfel permeabilitatea. Deshidratarea se poate realiza prin liofilizare, uscare
prin pulverizare, uscare n aer sau uscare sub vacuum. ndeprtarea apei se poate realiza
i prin adugarea la materialul celular a unui solvent cu afinitate mare pentru ap:
etanol, metanol sau aceton.
Deshidratarea prezint dezavantajul c poate cauza denaturarea unor molecule
proteice sau a altor componeni intracelulari utili [4].

3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode fizice

Metodele fizice de permeabilizare au o eficien relativ redus, chiar dup un
numr mare de cicluri. Principalele metode utilizate sunt: tratarea termic, nghearea
dezghearea, decompresia exploziv i ocul osmotic.
Tratarea termic este utilizabil doar n cazul produselor rezistente la
temperatur, de exemplu n extracia enzimelor termostabile din bacterii. Viteza
autolizei scade cu temperatura, n funcie i de tipul de organism utilizat.
nghearea dezghearea este o tehnic n care suspensia de celule este
ngheat ntr-o baie rcit cu un amestec de CO
2
solid (zpad carbonic) i etanol, iar
apoi este dezgheat la temperatura camerei [67]. Repetnd de mai multe ori ciclul de
nghe dezghe, membranele celulare sunt distruse de ctre cristalele ascuite de ghea
care ncep s creasc din interioul celulei. Durata procesului este destul de mare, iar unii
componeni intracelulari pot fi sensibili la astfel de tratamente. Procedeul poate fi
aplicat anumitor celule microbiene i eucariote din care se elibereaz proteinele

68
periplasmice i intracelulare. Procesul este influenat de natura celulelor, temperatura
final de congelare, precum i de viteza proceselor de nclzire i de rcire. Trebuie
menionat faptul c multe organisme sunt rezistente la un astfel de tratament datorit
acumulrii intracelulare a unor compui care previn nghearea.
Decompresia exploziv (bomba celular) necesit mai nti saturarea masei
celulare cu azot sau alt gaz inert. Procesul decurge la presiuni ridicate, de pn la 175
MPa. Prin depresurizare brusc, gazul dizolvat n interiorul celulelor este eliberat rapid,
bulele de gaz formate provocnd ruperea pereilor celulari i a membranelor. Pentru a
preveni denaturarea proteinelor spumarea trebuie redus la minimum. Procesul poate fi
aplicat doar celulelor uor de dezagregat, cum sunt celulele animale. E. coli, drojdiile,
fungiile i sporii nu pot fi dezagregate corespunztor prin aceast metod [68].
ocul osmotic apare ca urmare a modificrii rapide a concentraiei srurilor din
mediu. Mecanismul distrugerii are la baz capacitatea celulelor de a echilibra rapid
concentraia lor intern cu cea a mediului extern, prin osmoz. De exemplu, celulele
sunt incubate timp de 30 min ntr-o soluie cu presiune osmotic ridicat (20%
zahaoroz, de. ex.), dup care sunt centrifugate i resuspendate n ap. Ptrunderea
rapid a apei n celul (pentru echilibrarea concentraiei interne de zaharoz 20% cu
cea extern 0%) produce o presiune hidrostatic (oc osmotic) care produce liza
celular [4, 67]. Dei insuficient pentru distrugerea celulei, ocul osmotic poate elibera
anumite proteine, sau poate fi o metod de intensificare a procesului de autoliz.
Metoda este utilizabil pentru celule vegetale, animale, precum i pentru unele bacterii
Gram negative.

3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode chimice

Permeabilizarea sau liza chimic este utilizat att pentru distrugerea pereilor
celulari, ct i pentru extracia unor componeni intracelulari. Principalul dezavantaj al
lizei chimice este introducerea n sistem a unor substane care ulterior trebuie
ndeprtate, mrindu-se astfel costurile de producie. Un alt dezavantaj l reprezint
timpul ndelungat necesar realizrii procesului.
Tratarea cu solveni organici (toluen, eter, fenil-etil alcool, dimetilsulfoxid,
metanol, etc.) conduce la formarea de canale prin membrana celular [67]. O parte din
aceti solveni pot crea probleme la separarea produselor eliberate, iar unii dintre ei sunt
toxici [4].
Compuii tensioactivi (detergeni ionici dodecilsulfat de sodiu i neionici
Triton X-100), utilizai ca atare sau n combinaie cu ageni haotropici (clorur de
guanidin, uree) sunt eficieni pentru eliberarea enzimelor legate de membrana celular.
Aciunea detergenilor este puternic influenat de pH i de temperatur. Detergenii
ionici sunt mai eficieni, ns pot determina i denaturarea moleculelor proteice
eliberate. Alte dezavantaje legate de utilizarea detergenilor sunt spumarea, precipitarea,
costul ridicat al detergenilor neionici, precum i dificultatea ndeprtrii din produsul
final [4, 64, 67].
Bazele pot fi utilizate ca ageni ieftini de extragere a enzimelor intracelulare
stabile la pH > 11, fr distrugerea peretelui celular. Metoda poate fi utilizat i la scar

69
industrial. O pretratare alcalin a celulelor slbete rezistena peretelui celular,
facilitnd dezagregarea mecanic cu consumuri energetice mai reduse [69].
Acizii realizeaz cel mai rapid hidroliza componenilor care alctuiesc pereii
celulari (6 12 h). Dei randamentele hidrolizei acide sunt ridicate, se produc pierderi
n proteine, vitamine i compui aromatici [4].
Ali compui utilizai n liza chimic sunt srurile, zaharurile, esterii acetici,
compui care induc plasmoliza, extrgnd materialul intracelular, n general fr
denaturarea acestuia. Antibioticele pot fi de asemenea utilizate pentru distrugerea
membranei celulare a unor microorganisme [4].
n general, atunci cnd se urmrete transpunerea la scar a procesului de
dezagregare celular, adugarea de ageni chimici trebuie evitat, n special n producia
substanelor proteice, n principal pentru a nu ncrca excesiv costurile, att cu
chimicalele propriu-zise, ct i cu cheltuielile de ndeprtare a acestora.

3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode enzimatice

Distrugerea pereilor celulari cu ajutorul enzimelor devine o tehnic din ce n ce
mai atractiv, datorit avantajelor pe care le prezint: (i) selectivitate ridicat pentru un
anumit produs (cu efecte benefice n izolarea i purificarea produsului); (ii) o vitez
ridicat i un randament crescut n produsul eliberat; (iii) deteriorare minim a
produsului eliberat; (iv) posibilitatea utilizrii unor condiii blnde de temperatur i
pH; (v) absena producerii de resturi celulare.
Aplicarea lizei enzimatice necesit n prealabil selectarea enzimei sau sistemului
enzimatic care s corespund scopului propus i stabilirea condiiilor n care liza este
eficient [4]. Mai mult dect orice alt tehnic, liza enzimatic necesit o bun
nelegere a detaliilor structurii fizico-chimice a pereilor celulari. Nici o enzim nu este
capabil s degradeze complet pereii celulari, datorit compoziiei complexe a acestora.
Aa cum s-a mai artat, componentul de baz al structurii pereilor celulelor bacteriene
este peptidoglucanul. n cazul bacteriilor gram-pozitive, o singur enzim poate liza
celula, dar un amestec de enzime (glucozidaze i peptidaze) acionnd sinergetic pot
ajuta liza peptidoglucanului. n cazul bacteriilor gram-negative este necesar o
pretratare cu un agent tensioactiv pentru ndeprtarea membranei exterioare.

Tabelul 3.4. Enzime importante n degradarea pereilor celulelor microbiene [53]
Organismul Enzima
Glicozidaze
Acetilmuramoil-L-alanil amidaze
Bacterii
Peptidaze
-(1,3)-glucanaze
-(1,6)-glucanaze
Mananaze
Fungii, drojdii
Chitinaze
Proteaze Alge
Celulaze

70
n tab. 3.4 sunt prezentate principalele enzime care pot ataca membrana celular a
diverselor microorganisme. Majoritatea enzimelor litice sunt active i asupra pereilor
celulelor moarte (liofilizate sau termolizate).
Principala constrngere n utilizarea lizei enzimatice este dat de costul ridicat al
enzimelor litice. Singura enzim litic disponibil la scar comercial este lizozima
extras din albuul oulor de gin. Aceasta a fost frecvent utilizat n liza unor bacterii
gram-pozitive, la o vitez de 5.10
4
UI/(kg.h) raportat la substana uscat [64]. Aceeai
enzim este utilizat i pentru liza E. coli, cunoscut drept o bacterie cu perei celulari
duri [67].
Pe lng costul ridicat al enzimelor litice, o alt problem, cea a impurificrii
produsului, face ca liza enzimatic s fie nc utilizat cu reinere. De exemplu,
enzimele derivate din ou pot provoca probleme dac urme din acestea rmn n
proteinele purificate utilizate n scop terapeutic, tiut fiind faptul c unele persoane sunt
alergice la ou [64, 67]. Enzimele extrase din drojdii sau din sistemul digestiv al
gasteropodelor nu pot fi utilizate n procese transpuse la scar ntruct sunt amestecuri
de enzime [67]. Impurificarea produsului ar putea fi evitat prin folosirea de enzime
litice imobilizate pe un suport macromolecular [4, 70, 71].
La fel ca i alte procedee de dezagregare nemecanice, liza enzimatic este un
proces lent, dar combinat cu alte metode se pot obine grade ridicate de dezagregare la
viteze convenabile. Astfel, dezagregarea C. utilis n omogenizatoare de nalt presiune a
fost mbuntit prin tratarea prealabil a celulelor cu zimolaz [65]. Celule de Bacillus
cereus pretratate cu 0,5 g celozil
1
/g celule umede la pH = 5,5 i 30 C au fost
dezagregate n proporie de 98% la o singur trecere printr-un omogenizator Manton-
Gaulin la 70 MPa. Celulele netratate au fost dezagregate doar n proporie de 40% n
aceleai condiii de lucru. Acelai tratament enzimatic a facilitat dezagregarea i n mori
cu bile [72].
Un caz particular al lizei enzimatice este autoliza, proces n care celulele i
produc singure enzimele litice. Ca proces de autodigerare, autoliza este un proces foarte
lent, care are loc ntr-o perioad de ordinul zilelor, ceea ce reprezint un inconvenient
major. Datorit acestui fapt, autoliza nu este o metod uzual pentru dezagregarea
celulelor. Autoliza drojdiilor, proces realizat la scar industrial pentru obinerea
autolizatelor de drojdie, necesit 12 24 h la 45 50 C [4]. Procesul poate fi accelerat
prin uscarea sau nghearea dezghearea prealabil a celulelor. Alte metode de
inducere a autolizei sunt plasmoliza cu ajutorul surfactanilor, solvenilor organici
(toluen sau butanol), compuilor tiolici. Procesul de autoliz este influenat i de
valoarea pH-ului, componena i concentraia mediului de cultur, stadiul de dezvoltare
a microorganismului.
Enzimele autolitice sunt importante pentru creterea i multiplicarea celulelor, dar
odat ce sunt dereglate, ele atac peptidoglucanul peretelui celular bacterian. Exist
experimentri n care, prin inginerie genetic, fie li s-a inhibat microorganismelor
capacitatea de a-i sintetiza peretele celular, fie li s-a introdus informaia genetic pentru
producerea de enzime litice [73].

1
Celozil enzim litic produs de Streptomyces coelicolor

71
3.3. INFLUENA DEZAGREGRII ASUPRA PROCESELOR
ULTERIOARE DE SEPARARE

Aa cum s-a artat i n paragraful 2.4.3.4, separarea resturilor celulare este o
operaie dificil, datorit dimensiunilor reduse ale particulelor i a viscozitii ridicate a
sistemului. Dezagregarea mecanic sau tratamentele litice produc resturi celulare de
dimensiuni uneori sub 0,1 m, foarte dificil de separat. La astfel de dimensiuni, filtrarea
i centrifugarea sunt puin eficiente.
Centrifugarea poate fi utilizat pentru separarea resturilor celulare mai mari de
0,5 m. Sub aceast valoare, n medii viscoase n special, separarea prin centrifugare nu
poate fi realizat dect eventual dup o floculare prealabil a resturilor celulare [74].
Filtrarea cu adjuvant n filtre celulare rotative este o metod utilizat pentru
separarea resturilor celulare de drojdii [53].
Microfiltrarea n curent ncruciat are avantajul c previne formarea stratului
de precipitat i nu necesit adjuvani costisitori. Dificultile care apar sunt legate de
murdrirea membranelor i de apariia polarizrii de concentraie, care contribuie la
scderea rapid a fluxului de permeat i limiteaz concentraia resturilor celulare n
retenat. Pe lng aceste dezavantaje operaionale trebuie inut cont de faptul c poate
avea loc adsorbia puternic a proteinelor pe resturile celulare, fenomenul depinznd de
concentraie, temperatur, pH i trie ionic.
Extracia n sisteme bifazice apoase este o metod atractiv pentru separarea
celulelor i resturilor celulare din soluiile de proteine, dar este costisitoare i
recuperarea reactanilor este dificil.
Alegerea metodelor de dezagregare, dar i a condiiilor de realizare a dezagregrii
reprezint o provocare: cantitatea de proteine intracelulare eliberat crete cu creterea
gradului de mrunire al resturilor celulare [75], n schimb, pe msur ce dimensiunile
resturilor celulare se micoreaz, separarea lor devine din ce n ce mai dificil [76].
Particulele submicronice trec uor n supernatant dup centrifugare, ntrzie precipitarea
fracionat i au tendina de a colmata coloanele cromatografice sau membranele
utilizate n procesele ulterioare de separare [74, 76].
Dimensiunile fragmentelor celulare rezultate la dezagregare depind i de metoda
de dezagregare folosit, precum i de parametrii procesului. ntr-un studiu comparativ a
fost observat comportarea resturilor celulare de E. coli obinute ntr-o moar cu bile,
respectiv ntr-un omogenizator de nalt presiune [77]. Dei nu s-au observat diferene
semnificative n ceea ce privete randamentul n proteine i viteza de eliberare a
acestora, caracteristicile resturilor celulare (distribuia dup mrime, separabilitatea prin
centrifugare i filtrare n adncime) au fost diferite n cele dou procedee de
dezagregare utilizate. Timpul mediu de staionare a suspensiei celulare n moara cu bile
nu afecteaz semnificativ distribuia dup mrime a resturilor celulare; n
omogenizatorul de nalt presiune, cu creterea numrului de treceri prin aparat, spectrul
dimensional al resturilor celulare se lrgete.
n cazul celulelor de drojdii, s-a stabilit c presiunea minim la care are loc
dezagregarea celulelor ntr-un omogenizator de nalt presiune este de 11,5 MPa [78],
iar dimensiunile resturilor celulare depind de condiiile de multiplicare [59].

72
n multe cazuri s-a constatat c o pretratare a masei celulare cu ageni haotropici i
detergeni, conduce la obinerea unor resturi celulare de dimensiuni mai mari dect n
absena tratrii. Pretratarea este realizat i n scopul evitrii degradrii produselor labile
eliberate din celule. Astfel, la suspensia de celule se pot aduga inhibitori de proteaze
(pentru a proteja proteinele eliberate), antioxidani (pentru evitarea oxidrii punilor
disulfidice), substane tampon (pentru meninerea pH-ului n intervalul dorit). De toate
aceste adaosuri trebuie inut cont n etapele ulterioare de izolare, separare i purificare.
Dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat a permis obinerea unui mare numr de
proteine terapeutice sub form de corpi de incluziune n citoplasma unor bacterii, n
special E. coli. Aceti corpi de incluziune sunt agregate amorfe de proteine, constnd n
polipeptide pliate greit (frecvent denaturate), cu dimensiuni mari (0,8 1,5 m) i
densiti mai ridicate (~ 1,2 1,35 kg/L) dect restul materialului celular. Pentru
solubilizarea lor n ap este necesar utilizarea de detergeni sau de ageni haotropi [79].
Procedura standard de purificare a proteinelor din corpii de incluziune ncepe cu
izolarea acestora din materialul rmas n urma dezagregrii masei celulare.
Dezagregarea cea mai bun se obine n omogenizatoare de nalt presiune. Corpii de
incluziune se separ prin centrifugare timp de 5 10 min n centrifuge de clasare cu z =
5.10
3
1.10
4
, cnd produsele solubile i resturile celulare uoare trec n supernatant
(vezi i paragraful 2.4.3.5) [79, 80]. O alternativ de separare este filtrarea membranar
n curent ncruciat [81]. Corpii de incluziune astfel separai sunt apoi splai fie cu o
soluie diluat de detergeni, fie cu un agent haotropic (uree sau clorhidrat de
guanidin). Deseori se adaug ageni reductori (ditiothreitol, -mercaptoetanol) pentru
ruperea punilor disulfidice incorecte. Proteina astfel solubilizat i redus este pregtit
pentru purificare i repliere.


73

4. Separarea prin extracie

Extracia este procesul prin care unul sau mai muli componeni dintr-un amestec
lichid omogen sau dintr-un amestec solid se separ, total sau parial, pe baza diferenei
de solubilitate a acestora n unul sau mai muli solveni. Dac amestecul iniial supus
separrii este lichid, operaia prin care se realizeaz separarea poart denumirea de
extracie lichid lichid. Dac amestecul de separat este n faz solid, operaia de
separare se numete extracie lichid solid [4, 82, 83], splare extractiv, percolare sau
lixiviere [84, 85]. n literatura de limb englez termenii ncetenii pentru cele dou
operaii unitare sunt respectiv liquid liquid extraction i leaching [86, 87].
Recomandrile IUPAC
1
prevd utilizarea tremenului de distribuie lichid lichid (liquid
liquid distribution) [88]. Dac extracia se realizeaz numai prin interaciuni de natur
fizic ntre componentul care se extrage (solut) i solventul/solvenii de extracie
discutm despre extracie fizic, iar dac ntre solut i extractant intervin i reacii
chimice discutm despre extracie reactiv [4, 89].
Agenii de extracie (solvenii) clasici se gsesc n stare lichid, dar astzi se
utilizeaz pe scar din ce n ce mai larg solveni la parametri critici sau deasupra
acestora, cnd nu se mai poate face distincia dintre starea de lichid i cea de gaz, caz n
care vorbim despre extracia cu fluide supercritice (FSC). Alte modaliti de realizare a
extraciei n procesele de bioseparare (dar nu numai) implic utilizarea diverselor tipuri
de membrane lichide (extracia prin membrane lichide sau pertracia), a fazelor apoase
nemiscibile ntre ele (extracia n sisteme apoase bifazice SAB) sau a microemulsiilor
(extracia prin micele inverse).
ntruct bazele teoretice ale procesului de extracie, calculul procesului,
echipamentele tipice utilizate i criteriile de alegere a acestora au fost discutate pe larg
n cadrul cursului de Operaii Unitare, n acest capitol se va insista doar asupra acelor
aspecte specifice utilizrii proceselor de extracie n separarea compuilor obinui prin
biosintez, sau a celor extrai din produse naturale (microbiene, vegetale, animale).

1
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) - Uniunea Internaional pentru Chimie
Pur i Aplicat
Capitolul 4 Separarea prin extracie

74
4.1. EXTRACIA FIZIC LICHID LICHID

4.1.1. Aspecte generale privind extracia lichid lichid

Se consider o soluie binar, omogen, format dintr-un dizolvant iniial A i un
solut B. Din aceast soluie, solutul B se poate separa cu ajutorului unui alt solvent S
dac: (i) S i A sunt total nemiscibili (cazul ideal) sau parial miscibili; (ii) B este solubil
n S; (iii) la echilibru, concentraia solutului B n solventul S (Y
B
) este mai mare dect
concentraia aceluiai solut B n solventul iniial A (X
B
):
Y
B
> X
B
(4.1)
Dup amestecarea soluiei de B n A cu solventul S i dup sedimentarea
amestecului, se formeaz dou straturi: un strat de extract (B dizolvat n S, cu eventuale
urme de A) i un strat de rafinat (component majoritar A, cu mai puin B dizolvat,
eventual cu urme de S), care pot fi separate pe baza diferenei de densitate (fig. 4.1).
Solutul B, solubil att n A ct i n S se repartizeaz ntre cei doi solveni dup un
coeficient de distribuie (de partiie, de repartiie):

RAFINAT de faza in B solutului conc.
EXTRACT de faza in B solutului conc.
= =
B
B
N
X
Y
K (4.2)
coeficient care, pentru sistemele ideale, respect legea de repartiie a lui Nernst (fig. 4.2)
[90]. La valori supraunitare ale coeficientului de distribuie solutul trece preponderent n
extract, n timp ce la valori subunitare ale acestuia, rmne preponderent n rafinat.
Pentru K
N
= 1, solutul B se repartizeaz n mod egal ntre cei doi solveni A i S,
separarea prin extracie nefiind posibil. Pentru scopuri practice, se consider posibil
separarea prin extracie L L atunci cnd K
N
> 3.

B + A
SOLVENT
(S)
B + S
A + B
EXTRACT
RAFINAT
Amestecator Separator
Y
B
X
B
c
a
b
a sisteme ideale: Y = KX
b, c sisteme neideale: Y = KX
n
Figura 4.1. Schema de principiu a extraciei fizice
lichid lichid
Figura 4.2. Relaie de
echilibru ntr-un sistem
cu solveni nemiscibili

Pentru realizarea extraciei L L este necesar parcurgerea urmtoarelor etape: (i)
contactarea soluiei iniiale (A + B) cu solventul S (amestecarea), (ii) solubilizarea i
difuzia solutului B n solventul S (transferul de mas al solutului), (iii) separarea celor
dou faze: extractul (E) i rafinatul (R), (iv) recuperarea solventului din extract (uzual
prin distilare); (v) desolventarea rafinatului (prin distilare sau stripare).

75
Ca operaie unitar, extracia L L este preferat distilrii atunci cnd: (i)
volatilitatea relativ a componenilor amestecului de separat este apropiat de unitate;
(ii) componentul volatil este n concentraie mare sau are cldur de vaporizare mare
(apa, de ex.); (iii) temperatura la care s-ar face rectificarea este mare; (iv) substanele de
separat sunt termolabile. Pe acest din urm considerent s-a impus extracia L L n
separarea antibioticelor, nc din perioada n care procesul nc nu era bine fundamentat
din punct de vedere teoretic.
Viteza procesului de extracie, exprimat prin cantitatea (M) sau fluxul (J) de solut
transferat:
t C A K M = (4.3)
C A K J = (4.4)
depinde de coeficienii de transfer de mas ai solutului n fiecare faz (dependen
redat prin expresia coeficientului global de transfer de mas, K), de aria interfacial de
contact ntre cele dou faze lichide (A), precum i de fora motrice a procesului
(diferena concentraiei solutului ntre soluia iniial i solvent, C). Pentru accelerarea
transferului solutului, deci pentru mrirea vitezei de extracie, se poate mri valoarea
coeficientului de transfer K (reducerea grosimii straturilor limit prin creterea
turbulenei sau prin contactarea fazelor n microcanale), se poate mri aria interfacial A
(dispersia unei faze n cealalt sub forma unor picturi de dimensiuni ct mai mici), sau
se poate mri potenialul transferului, lucrnd n condiii ct mai deprtate de cele de
echilibru, prin adugarea unor cantiti proaspete de solvent (realizarea procesului n
contracurent, n trepte, sau cu reflux de solvent).

4.1.2. Aspecte particulare ale extraciei lichid lichid n bioprocese

Printre metodele de separare i purificare utilizate n biotehnologii, metodele de
extracie lichid lichid sunt utilizate frecvent, datorit faptului c aceste metode (i) sunt
bine cunoscute i testate industrial cu succes n alte aplicaii, (ii) sunt adesea ieftine, (iii)
se preteaz la transpunerea la scar mare, n uniti cu funcionare continu [91].
Extracia L L este utilizat n special pentru separarea din mediul de cultur a unor
metabolii (alcooli, acizi carboxilici, aminoacizi, antibiotice) [92, 93], pentru prepararea
unor produse farmaceutice izolate din compui naturali sau obinute prin sintez parial
(sulfamide, fenobarbital, antihistaminice, cortizon, estrogeni, alcaloizi), pentru rafinarea
grsimilor vegetale i animale (procedeul Solexol de extracie cu propan, extracia cu
furfural), pentru extracia proteinelor din pete, extracia vitaminelor A i D din uleiul
de ficat de pete, extracia vitaminei E din uleiurile vegetale [94]. Pe msur ce scara de
operare se mrete, extracia L L devine din ce n ce mai atractiv datorit pe de o
parte faptului c problemele referitoare la transpunerea la scar sunt cunoscute i multe
dintre ele rezolvate, iar pe de alt parte datorit costurilor de investiii i exploatare mult
mai sczute comparativ cu alte metode de bioseparare, cum ar fi cromatografia de
lichide.


76
4.1.2.1. Solveni de extracie

Un solvent ideal trebuie s fie selectiv, nemiscibil cu materia prim, ieftin i uor
de recuperat, netoxic, neinflamabil i necoroziv. El nu trebuie s reacioneze ireversibil
cu solutul. Viscozitatea sa trebuie s fie sczut: astfel consumurile energetice pentru
vehiculare vor fi mai reduse i, n plus, o valoare mic a viscozitii influeneaz
favorabil coeficienii de transfer de cldur i de mas. O diferen de densitate ct mai
mare ntre solvent i materia prim mbuntete dispersia i mrete viteza de
deplasare a picturilor, favoriznd astfel transferul de mas. Tensiunea interfacial
trebuie s aib o valoare optim: la valori prea mari, dei se uureaz separarea fazelor
se ngreuneaz dispersia, n timp ce la valori prea mici exist pericolul formrii unor
emulsii stabile ntre materia prim i solvent, emulsii greu de separat.
Solvenii utilizai n bioprocese trebuie n plus s nu denatureze biomoleculele
extrase (peptide, proteine etc.). Ca regul general, cu ct biomoleculele sunt mai mari,
cu att mai complex este structura lor spaial i cu att mai mare este riscul de
denaturare. Drept urmare, peptidele mari i proteinele nu se preteaz la extracia clasic
cu solveni organici, ele separndu-se prin extracie n sisteme apoase bifazice.
Pentru extracia produselor de biosintez polare se utilizeaz alcooli, esteri,
cetone, iar pentru extracia celor nepolare eter de petrol, diclormetan, dicloretan etc. n
cazul solvenilor din prima categorie, principala problem este solubilitatea lor relativ
ridicat n mediul apos. Creterea masei moleculare a acestor compui reduce
solubilitatea lor n ap, dar mrete tendina de formare a unor emulsii stabile cu aceasta
[4].
FORMULAREA PROBLEMEI
- se identific scopul proiectrii
FORMULAREA PROBLEMEI
- se identific scopul proiectrii
Alegerea metodei i stabilirea constrngerilor
- se specific criteriile de proiectare pe baza formulrii problemei
Alegerea metodei i stabilirea constrngerilor
- se specific criteriile de proiectare pe baza formulrii problemei
Rezolvarea problemei cu ajutorul CAMD
(Computer Aided Molecular Design)
- se identific acei compui care au proprietile dorite
Rezolvarea problemei cu ajutorul CAMD
(Computer Aided Molecular Design)
- se identific acei compui care au proprietile dorite
SOLUIA:
mai muli solveni poteniali
SOLUIA:
mai muli solveni poteniali
Analiza rezultatelor i verificarea lor
- solvenii sugerai sunt analizai utiliznd unelte externe
Analiza rezultatelor i verificarea lor
- solvenii sugerai sunt analizai utiliznd unelte externe
Selectarea solventului
- verificarea final utiliznd simulri riguroase i experimentarea
Selectarea solventului
- verificarea final utiliznd simulri riguroase i experimentarea
SOLVENT
SOLVENT
candidai
promitori
soluii inacceptabile din motive
de performan, economice sau
de securitate

Figura 4.3. Algoritm pentru selectarea solvenilor [99]

77
Alegerea solventului potrivit este etapa cheie n conceperea i proiectarea unui
proces de extracie. Solventul selectat trebuie s se apropie ct mai mult de profilul
solventului ideal, n acest fel realizndu-se gradul dorit de separare ntr-un numr minim
de etape i, evident, cu costuri minime. La ora actual exist programe de calculator
care permit alegerea solventului potrivit dintr-o baz de date [95 99]. Alegerea
solventului se realizeaz printr-o abordare n mai multe etape. Mai nti se formuleaz
problema: CE trebuie separat, DIN CE amestec se efectueaz separarea, CARE este
elul final al separrii (puritatea extractului, coninutul final de solut n rafinat etc.).
Odat formulat problema, se alege metoda de rezolvare i se precizeaz eventualele
constrngeri la care este supus sistemul. Utiliznd un program de tip CAMD
1
se obine
o list a unor solveni fezabili, aranjai n ordine dup anumite criterii date. Cei mai
potrivii solveni sunt apoi analizai individual n termeni de performan, eficacitate,
eficien, impact de mediu, economicitate etc. Dac nu se gsete nici un solvent
potrivit, se revine n formularea problemei relaxnd anumite constrngeri sau lrgind
domeniul anumitor proprieti int (presiune de vapori, tensiune superficial, punct de
fierbere etc.) (fig. 4.3). n acest mod, selectarea solvenilor devine o problem de
proiectare care necesit o soluionare de tip ncercare eroare.

4.1.2.2. Echipamente de extracie

Extractoarele utilizate la nivel industrial trebuie s satisfac ntr-o ct mai mare
msur, urmtoarele deziderate: (i) eficacitate de separare ct mai mare; (ii) producie
specific (pe m
3
) ct mai mare; (iii) consum minim de energie mecanic i termic
(inclusiv cea pentru recuperarea solventului); (iv) cost redus de investiie i exploatare;
(v) adaptabilitate la condiii variate de lucru. Eficacitatea mare a extractoarelor se poate
realiza prin intensificarea transferului de mas ntr-o unitate de extracie i prin
repetarea de un numr mare de ori a acestei uniti. Intensificarea transferului se obine
prin mrirea celor trei factori ai ecuaiei (4.4).
Extractoarele pot fi clasificate dup mai multe criterii:
- n funcie de modul de contactare a fazelor:
o extractoare cu contact n trepte,
o extractoare cu contactare diferenial.
- n funcie de criteriul unitilor de extracie:
o extractoare cu uniti distincte de extracie,
o extractoare continue n contracurent.
- n funcie de modul de amestecare:
o extractoare fr agitare,
o extractoare cu agitare mecanic,
o extractoare pulsate,
o extractoare centrifugale.
O clasificare a principalelor tipuri de extractoare comerciale este prezentat n fig. 4.4.

1
CAMD Computer Aided Molecular Design proiectare molecular asistat de calculator

78
Extractoare comerciale
Contactare gravitaional a fazelor Contactare centrifugal a fazelor
Extractoare centrifugale
Podbielniak
De Laval
Quadronic
Luwesta
Robatel
Curgere indus gravitaional
Clasificare dup tipul agitrii
Coloane neagitate Coloane pulsate Coloane agitate mecanic Alte dispozitive
Coloane cu pulverizare
Coloane cu umplutur
Coloane cu talere
perforate
Coloane cu umplutur
Coloane cu talere sit
Coloane ciclice
controlate
Amestector-decantor
Dispozitive
rotative
Dispozitive
reciproce
Amestector-decantor
Coloane Scheibel
Coloana Oldshue-Rushton
Contactoare cu discuri rotative
Extractor cu discuri rotative asimetrice
Coloana Kuhni
Contactor Graesser
Contactoare rotative
cu agitare
Contactoare cu talere deplasate
alternativ pe veritical
Coloane cu talere perforate
Coloane cu talere sit i deversor
Talere cu perforaii tanate
Amestectoare statice
Extractoare cu talere
vibrate
Extractoare
ultrasonice
Extractoare cu
pompare parametric

Figura 4.4. Clasificarea extractoarelor comerciale [100]

Extractoarele utilizate n bioprocese trebuie s asigure separarea unor produse
uor degradabile, ca urmare ele trebuie s asigure viteze mari de transfer de mas n
condiiile unor timpi de contact i de separare a fazelor foarte scuri. Extractoarele
comerciale care corespund acestor exigene sunt extractoarele centrifugale, extractoarele
rotative cu agitare i extractoarele cu talere deplasate alternativ pe vertical [100].

4.1.2.2.1. Extractoare centrifugale

Extractoarele centrifugale sunt caracterizate de faptul c timpul de contactare a
fazelor este scurt, permit prelucrarea unor amestecuri avnd o diferen mic de
densitate ntre faze i care emulsioneaz uor, necesit un spaiu redus pentru amplasare.
Dezavantajele principale sunt legate de costul ridicat al acestora precum i de
ntreinerea mai pretenioas dect la alte categorii de extractoare [100]. Din punct de
vedere constructiv se mpart n dou categorii principale: extractoare cu ax orizontal i
extractoare cu ax vertical.

79
Extractorul Podbielniak (fig. 4.5) a fost primul extractor centrifugal folosit la
scar industrial, fiind introdus n practic n anii 1950 [101]. Extractorul este format
dintr-o foaie metalic nfurat n spiral n jurul unui arbore care se rotete cu 2000
5000 rot/min. Introducerea i evacuarea celor dou faze se realizeaz axial. Faza uoar
se trimite la periferia spiralei, iar faza grea se deplaseaz ctre axul extractorului.
Constructiv i funcional, acest extractor poate fi considerat drept o coloan cu talere
perforate nfurat n jurul unui arbore cilindric. Cmpul de fore centrifuge duce la
reducerea nlimii echivalente a unei trepte teoretice (IETT), precum i a timpului de
contact ntre faze. Datorit cmpului de fore centrifugal i diferenei de densitate are
loc o curgere radial, n contracurent, a celor dou faze. Productivitatea acestor
extractoare este de 2,5 10 m
3
[4], dar poate ajunge i pn la 98 m
3
/h [100].

Faza grea Faza uoar

J
H
A
B
C
D
E
F
G
b
Figura 4.5. Extractor Podbielniak
a principiu de funcionare; b seciune; c extractor pilot.
A intrare faz uoar; B ieire faz grea; C ieire faz uoar; D intrare faz grea; E zon de
contact reglabil; F, G zone de separare reglabil; J, H conducte de alimentare cu lichide; 1 capac
lateral demontabil; 2 site perforate concentrice; 3 suport; 4 carcasa rotor; 5 lagre; 6 arbore; 7
etanare; 8 racorduri pentru curire.

Extractorul Luwesta (fig. 4.6) este constituit dintr-o succesiune de regiuni de
amestecare separare, cu circulaia fazelor n contracurent. Extractorul se construiete
cu dou sau trei trepte, fiecare treapt fiind prevzut cu discuri de amestecare i conuri
de separare. Fazele se introduc i se evacueaz prin axul central, amestecarea avnd loc
la trecerea prin orificiile axului, n fiecare treapt. Solventul proaspt se introduce n
treapta inferioar, iar soluia iniial n treapta superioar. Amestecul de lichide se
separ sub aciunea forei centrifuge, iar apoi lichidele trec prin orificii diferite n ax, de
unde sunt din nou distribuite n trepte diferite [102]. Au avantajul unor productiviti
ridicate (1,25 120 m
3
/h ntr-o singur treapt), al unui timp de contact scurt (cteva
secunde) i al necesarului redus de solvent. Pe lng dezavantajele comune
extractoarelor centrifugale, mai prezint dezavantajul apariiei la periferia cilindrului
rotativ a unor presiuni locale de peste 10 MPa, care modific diagrama fazelor i
a
c

80
diagrama de echilibru, cu efecte directe asupra numrului de trepte de contact nercesare
obinerii a gradului de separare dorit [4].
Solvent
Extract
Rafinat
Soluie inial

Faza uoar
Faza grea

Figura 4.6. Extractor Luwesta [102]
1 discuri de amestecare; 2 conuri de
separare; 3 ax central.
Figura 4.7. Extractor Alfa-Laval [87]

Extractorul Alfa-Laval (fig. 4.7) este un extractor cu ax vertical, n care ambele
faze sunt alimentate sub presiune, la baza utilajului. Rotorul este format dintr-o serie de
cilindri concentrici, prevzui cu aripioare elicoidale, care formeaz o serie de treceri
sub form de spirale. Faza uoar este dirijat spre periferie, de unde curge spiralat spre
ax, circulnd n contracurent cu faza grea introdus lng axul central. Datorit curgerii
n spiral, lichidele parcurg un traseu lung de circa 25 m [87]. Extractoarele Alfa-Laval
lucreaz la debite de alimentare de 5 9 m
3
/h, raportul dintre faza apoas i solvent
fiind cuprins ntre 3:1 i 5:1, ajungnd chiar pn la 8:1 n cazul extraciei penicilinei G,
care se extrage n proporie de 96 98% [4].
Extracia se poate realiza n cmp de fore centrifugal i n separatoare
centrifugale cu discuri. Contactarea fazelor se poate realiza utiliznd amestectoare
centrifugale de sine stttoare sau integrate n partea superioar a separatorului
centrifugal. n cazul amestectoarelor centrifugale (fig. 4.8), fazele care trebuiesc
contactate sunt pompate mpreun ntr-un tambur rotativ de amestecare, unde sunt
accelerate centrifugal spre periferie, de unde amestecul este preluat de o pomp
centripet, n canalele creia are loc amestecarea intens a fazelor. Caracteristicile
amestecrii pot fi reglate prin modificarea turaiei electromotorului de antrenare a
amestectorului, mrimea picturilor i gradul de turbulen variind cu viteza de rotaie.
Amestectorul centrifugal poate fi ncorporat n separatorul centrifugal cu
discuri (fig. 4.9), cu avantajul unei construcii mai compacte [103]. Amestecul de
separat este alimentat prin racordul (1). Solventul proaspt sau extractul din treapta
anterioar (n cazul extraciei n trepte n contracurent) alimentat prin racordul (4) se
amestec cu rafinatul n pompa centripet (5). Extractul limpede este evacuat prin

81
racordul (2), iar rafinatul prin racordul (3). Amestecarea fazelor sub aciunea forei
centrifuge are loc n camera de distribuie a tamburului centrifugei (6).

Figura 4.8. Amestector centrifugal Westfalia
1 alimentare cu soluie iniial i solvent; 2 tambur de amestecare; 3 pomp
centripet; 4 evacuare amestec de lichide.

Amestectorul centrifugal poate fi cuplat i cu un separator centrifugal prevzut
cu dispozitiv de autocurire a fazei solide (fig. 4.10), caz n care se poate realiza
extracia din suspensii coninnd pn la 7% v/v faz solid [104].

Figura 4.9. Extractor centrifugal
Westfalia cu amestector ncorporat
1 alimentare; 2 evacuare faz uoar; 3
evacuare rafinat; 4 solvent proaspt sau
extract de la unitatea anterioar; 5 pomp
centripet; 6 camera de distribuie a
tamburului centrifugei.
Figura 4.10. Extractor centrifugal
Westfalia pentru suspensii, cu dispozitiv de
autocurire a fazei solide
1 alimentare suspensie + solvent; 2 evacuare
faz uoar; 3 evacuare faz grea.

n contextul tendinei actuale de integrare a proceselor, de reducere a numrului
de operaii prin folosirea unor echipamente complexe n care s se realizeze mai multe
etape ale procesului tehnologic (reacie + separare), a fost conceput extractorul-
decantor Westfalia, utilizat n extracia antibioticelor din lichidele de fermentaie, fr
filtrarea prealabil a biomasei penicilinelor (fig. 4.11).

82

Figura 4.11. Extractor-decantor Westfalia [104]
1 alimentare cu suspensie (lichid de fermentaie + miceliu); 2 alimentare cu solvent; 3 evacuare
rafinat; 4 zon de extracie n contracurent; 5 disc separator; 6 pomp centripet pentru evacuarea
extractului.

Extractorul-decantor n contracurent este o centrifug decantoare orizontal cu
tambur cilindro-conic prevzut cu un transportor elicoidal care se rotete cu o vitez mai
mic cu 32 rot/min dect tamburul. Suspensia alimentat prin racordul (1) ptrunde n
transportorul elicoidal printr-o serie de fante de distribuie practicate n acesta. Aici intr
n zona de extracie (4), curgnd n contracurent cu solventul alimentat prin racordul (2).
Rafinatul este descrcat gravitaional la captul conic al tamburului, prin racordul (3).
Faza solid este preluat de ctre transportor i descrcat gravitaional mpreun cu
rafinatul. Solventul se deplaseaz ctre captul cilindric al tamburului, fiind descrcat
sub presiune prin intermediul pompei centripete (6) [104]. Tamburul are o lungime de
0,75 m i un diametru de 0,22 m, turaia sa fiind de 5000 rot/min. Debitul de alimentare
cu lichid de fermentaie este de 1,3 2 m
3
/h, realizndu-se un grad de extracie a
antibioticelor de 97 98% [4].
Contactorul centrifugal CINC (fig. 4.12) are o construcie original care i
permite utilizarea ca unitate de extracie [105]. n principiu seamn cu centrifuga
tubular, deosebindu-se ns de aceasta prin faptul c are dou racorduri de intrare (unul
pentru soluia iniial i altul pentru solvent). Amestecarea fazelor i extracia au loc n
spaiul inelar dintre rotor i carcas, spaiu caracterizat printr-o curgere particular, de
tip Taylor Couette. Acest tip de curgere intensific transferul de mas, datorit
reducerii dispersiei axiale, prin formarea de vrtejuri Taylor [106, 107]. Separarea
fazelor are loc n interiorul rotorului, la fel ca ntr-o centrifug tubular obinuit. Prin
conectarea mai multor astfel de uniti se poate realiza procesul de extracie n mai
multe trepte, n contracurent. Astfel de uniti, cu factor de eficacitate z = 100 1000 se
construiesc pentru capaciti de prelucrare ntre 0,1 i 136 m
3
/h, cele special destinate
bioseparrilor fiind n construcie sanitar (oel inoxidabil sau Hastelloy) i prevzute cu
sistem CIP [105, 108].

83
zon inelar
de amestecare
deversor reglabil FG
colector
FG
colector
FU
deversor FU
interfa
spaiu de
vapori
rotor
intrare n rotor
carcasa
disc
distribuitor
ax
FG
FG
FU
FU
Faza uoar (FU) Faza grea (FG) Amestec
Treapta II
Treapta II
Treapta I
Treapta I
Treapta III
Treapta III
solvent
proaspt
extract rafinat
soluie
iniial

Figura 4.12. Contactor centrifugal CINC
a schem constructiv i funcional; b instalaie de extracie n trei trepte n
contracurent

4.1.2.2.2. Extractoare rotative cu agitare

Dei utilizate pe larg n procesele de extracie cu solveni, aceste dispozitive sunt
mai puin utilizate n procesele de bioseparare. n fig. 4.13 sunt prezentate principalele
extractoare rotative de tip coloan, cu agitare mecanic.
Faza grea
Faza uoar
interfa
Faza grea
Faza uoar

Figura 4.13. Extractoare rotative cu agitare
a coloan Scheibel; b contactor cu discuri rotative; c contactor cu discuri
rotative asimetrice; d coloan Khni

Coloana Scheibel este prevzut alternativ cu agitatoare cu dou pale montate pe
un ax, i cu compartimente neagitate care servesc drept zone de separare, fiind
prevzute cu site metalice deschise pentru mbuntirea coalescenei. Prezena sitelor
a b

84
implic utilizarea unor faze lichide lipsite de impuriti solide (miceliu, mas celular),
restrngndu-se astfel aria de aplicare a acestui echipament n procesele de bioseparare
[109]. Alte construcii utilizeaz icane orizontale cu sau fr site, sau agitatoare de tip
impeler [100].
Contactorul cu discuri rotative (CDR), are montate n interiorul coloanei mai
multe icane inelare apropiate, ntre care se rotesc discurile amplasate simetric pe un ax
central. Diametrul discurilor este mai mic dect deschiderea icanelor inelare. CDR
folosete aciunea de forfecare a discurilor n micare rapid de rotaie pentru dispersia
fazelor. Construcia are o seciune liber mare, ceea ce este avantajos pentru prelucrarea
unor debite mari, dar aduce dezavantajul amestecrii inverse a fazelor. O variant a
acestui echipament este coloana Oldshue Rushton, n care discurile rotative sunt
nlocuite cu agitatoare tip turbin [87, 100].
Contactorul cu discuri rotative asimetrice (CDRA) este o perfecionare a CDR,
arborele cu discuri fiind montat excentric fa de axul coloanei. Zonele de amestecare
sunt separate de cele de sedimentare prin intermediul unei icane verticale. n acest fel
se evit amestecarea invers caracteristic CDR [100]. Datorit divizrii coloanei,
capacitatea CDRA este mai mic dect cea a CDR [110].
Extractorul Khni este bazat pe pricipii similare coloanelor Scheibel. Axul
central este prevzut cu agitatoare tip turbin, turbinele fiind separate ntre ele prin
intermediul unor discuri perforate (statoare). Curgerile axiale se suprapun peste cele
radiale, crendu-se o curgere de tip vortex. Performanele acestor coloane se pot
optimiza prin modificarea diametrului turbinelor i a ariei libere a discurilor perforate
[87, 100, 102].

4.1.2.2.3. Extractoare cu talere pulsate

n aceste echipamente dispersia fazelor se realizez prin deplasarea alternativ pe
vertical sau prin vibrarea talerelor n coloan (fig. 4.14). Fa de coloanele pulsate, n
care energia este indus fazei lichide i nu amenajrilor interne, consumul energetic este
mai sczut la acelai efect de amestecare i dispersie uniform a fazelor [100].

Figura 4.14. Tipuri de talere utilizate n coloanele cu talere pulsate [111]


85
Extractorul Karr (fig. 4.15) este unul dintre cele mai cunoscute din aceast
categorie. Coloana de extracie este prevzut n interior cu o serie de talere perforate i
de icane, amplasate alternativ. Pachetul de talere este rigidizat pe circumferin cu
ajutorul unor tirani i este susinut de un ax central. Acest ax este acionat cu ajutorul
unui mecanism amplasat la partea superioar a coloanei, mecanism care confer axului
i implicit pachetului de talere o micare vertical alternativ cu amplitudine mic i
frecven mare.

a
c
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Faza grea
Faza grea
Faza uoar
Faza
uoar
b
900 mm
orificii pentru tirani
orificii
= 1,5 mm
pas = 1,75 mm
Suprafa
liber = 58%
Figura 4.15. Extractor Karr [86]
a extractor n curs de asamblare; b detalii talere; c schem de principiu.
1 ansamblu acionare talere; 2 etanare; 3 ican metalic; 4 taler perforat; 5 dispozitiv de
control interfa; 6 ican din teflon; 7 tirani i distanieri; 8 ax central i distanieri; 9 plac
superioar.

Coloanele Karr i-au gsit aplicarea n special n industria farmaceutic, n
petrochimie i n tratarea apelor reziduale. La ora actual se construiesc astfel de
extractoare de pn la 1,5 m diametru [86, 111]. Datorit suprafeei libere ridicate a
talerelor (58%) poate fi utilizat pentru extracia bioproduselor direct din mediul de
cultur, fr o prealabil separare a masei celulare [109].

4.1.2.2.4. Alte echipamente de extracie

La ora actual, procesele industriale de extracie L L sunt caracterizate de o
eficaciate crescut, cuplat cu o valoare redus a capacitii de reinere i cu valori IETT

86
ct mai mici. n coloanele de extracie de acest tip sunt folosite diverse echipamente
mecanice care asigur un grad ridicat de dispersie a unei faze n cealalt. ntr-o serie de
procese, n general procese de bioseparare (extracia antibioticelor, vitaminelor,
hormonilor, proteinelor etc.), utilizarea unei agitri agresive, impus de condiiile
hidrodinamice din acest tip de aparate, afecteaz structura sau caracteristicile produselor
obinute. De asemenea, timpul de contact prea ndelungat al solvenilor cu produsele
extrase pot induce modificri calitative nepermise att n solut ct i n solvent. n aceste
condiii este necesar minimizarea timpului de staionare al fazei disperse n aparatele
de extracie. Un astfel de deziderat poate fi atins n coloanele de extracie cu rotoare
cilindrice care, n ciuda capacitii de prelucrare reduse, au avantajul unei eficaciti
mrite, datorit regimului de curgere asigurat. n spaiul inelar ngust dintre rotoare, sau
dintre rotor i stator, datorit vitezei diferite de micare a pereilor cilindrici, curgerea
este de tip Couette Taylor. Cele dou fluide se stratific, iar la interfa apar
vrtejurile Taylor, prin intermediul crora se asigur un transfer de mas foarte intens
(fig. 4.16). Extractorul poate funciona n poziie orizontal sau vertical (fig. 4.17),
putnd fi echipat cu unul sau dou rotoare cilindrice [87, 106, 107].

vrtejuri Taylor
intrare faza grea ieire faza grea
intrare faza
uoar
ieire faza
uoar
cilindru interior
cilindru exterior
intrare
faza
grea
intrare
faza
uoar
ieire
faza
uoar
ieire
faza
grea
suport superior
suport inferior
suport inferior
inele din carbon
ax
rotor
scuturi conice
scuturi conice
coloan
icane
Figura 4.16. Schema de principiu a unui extractor
Taylor Couette bifazic [107]
Figura 4.17. Extractor cu un
rotor cilindric vertical [87]

4.1.3. Aplicaii ale extraciei fizice lichid lichid n bioprocese

Extracia fizic lichid lichid are relativ puine aplicaii n bioprocese, datorit
incompatibilitii solvenilor organici clasici cu produsele de biosintez. Dup cum
reiese din tab. 4.1, majoritatea acizilor carboxilici i aminoacizilor au valori extrem de
reduse ale coeficienilor de distribuie n solveni organici, extracia lor nefiind posibil
n acest sistem, ci doar ca extracie reactiv. Doar antibioticele se preteaz la extracia
cu solveni organici, metoda fiind aplicat la scar industrial.

87
Tabelul 4.1. Coeficieni de distribuie ai unor biocompui n solveni organici
[112, 113]
Categoria Solut Solvent K
N
Observaii
Acizi carboxilici
Acid propanoic

Acid lactic

Acid piruvic
Acid succinic

Acid fumaric

Acid maleic

Acid malic

Acid itaconic

Acid tartric

Acid citric
n-hexan
ciclohexan
MIBC*
ciclohexanon
n-butanol
MIBC
n-butanol
izobutanol
dietileter
dietileter
MIBC
n-butanol
izobutanol
dietileter
MIBC
n-butanol
izobutanol
dietileter
MIBC
izobutanol
dietileter
MIBC
izobutanol
dietileter
MIBC
izobutanol
dietileter
MIBC
n-butanol
dietileter
MIBC
n-butanol
izobutanol
0,05
0,06
2,15
3,30
3,20
0,14
0,73
0,66
0,16
0,15
0,19
1,20
0,96
1,50
1,40
3,30
4,60
0,15
0,21
0,92
0,02
0,04
0,36
0,35
0,55
1,80
0,003
0,02
0,16
0,009
0,09
0,29
0,30
25 C
Aminoacizi
Glicin
Alanin
Lizin
Acid glutamic
Acid -aminobutiric
Acid -aminocaproic
n-butanol
0,01
0,02
0,20
0,07
0,02
0,30
25 C
Antibiotice
Celesticetin
Cicloheximid
Eritromicin
Limcomicin
Gramicidin

Novobiocin

Penicilin F

Penicilin K
n-butanol
diclormetan
acetat de amil
n-butanol
benzen
cloroform - metanol
acetat de butil

acetat de amil

acetat de amil
110
23
120
0,17
0,6
17
100
0,01
32
0,06
12
0,10

pH = 4,2

pH = 7,0
pH = 10,5
pH = 4,0
pH = 6,0
pH = 4,0
pH = 6,0
* MIBC metil-izobutil-ceton


88
4.1.3.1. Extracia antibioticelor

Separarea prin extracie L L a antibioticelor se face, de regul, dup separarea
masei celulare, dar exist i procedee care permit extracia lor din lichidul de fermentare
nefiltrat sau din biomas. Extractul este purificat ulterior prin reextracie, precipitare,
cromatografie de schimb ionic, cristalizare [92]. Dac antibioticul este slab acid, avnd
un pK sczut, pH-ul utilizat n extracie trebuie sczut pn sub valoarea pK, pentru a
obine antibioticul n form acid nedisociat. Dac ns antibioticul este slab bazic, cu
pK ridicat, valoarea pH-ului trebuie crescut n timpul extraciei peste valoarea pK, n
vederea obinerii antibioticului n form bazic nedisociat. Dac solubilitatea n ap a
antibioticului este foarte ridicat, lichidul de fermentaie se satureaz cu o sare (uzual
sulfat de potasiu), care provoac cristalizarea prin salefiere a antibioticului, uurnd
extracia acestuia [92].
Valoarea pH-ului influeneaz puternic att coeficientul de distribuie, ct i
gradul de extracie. Pentru exemplificare, n tab. 4.2 se prezint variaia coeficientului
de distribuie al penicilinei G ntre ap i diveri solveni organici la diverse valori pH,
iar n tab. 4.3 gradul de extracie al penicilinelor n acetat de butil n funcie de valoarea
pH-ului fazei apoase [4].

Tabelul 4.2. Coeficieni de distribuie ai penicilinei G
n sisteme ap solvent organic la 0 C [4]
Valoarea coeficientului de distribuie, K
N

Solvent
pH = 0 pH = 4
Metil-etil-ceton 180 19
Dimetilciclohexan 160 15
Metilciclohexan 80 7
Ciclohexan 62 4
Furfurilacetat 44 4
Metil-i-butil-ceton 33 3
Dimetilftalat 30 2,7
Acetat de amil 20 1,8
Dietiloxalat 20 1,8

Tabelul 4.3. Gradul de extracie al unor peniciline i precursori de biosintez
ai acestora n acetat de butil [4]
Gradul de extracie [%]
Compus
pH = 2 pH = 3 pH = 4 pH = 5 pH = 6
Penicilina G 98 95 75 21 10
Penicilina F 100 100 97 89 39
Penicilina K 100 100 80 62 12
Acid fenilacetic 98 98 96 89 39

Dac extracia antibioticelor se face cu un solvent nepolar, cum este acetatul de
butil, gradul de extracie va fi maxim numai dac antibioticele se gsesc n soluia
apoas supus extraciei sub form nedisociat. n faza apoas, penicilinele disociaz
datorit gruprii carboxilice conform echilibrului:

+
+
[]aq
-
[]aq []aq
H COO P COOH P (4.5)

89
n care pK
a
= 2,75 pentru penicilina G i pK
a
= 2,70 pentru penicilina V. Ca urmare,
pentru a exista n stare nedisociat, pH-ul fazei apoase din care se realizeaz extracia va
trebui s fie mai mic de 2,7. Pentru grade de extracie maxime, valoarea pH trebuie s
scad sub 2 (tab. 4.3). n medii puternic acide ns, viteza de dezactivare a penicilinelor
este foarte ridicat: la pH = 1,5 i 35 C timpul de inactivare al penicilinei G este de
numai 4 minute. Ca urmare, pH-ul utilizat la extracie reprezint un compromis ntre
stabilitatea penicilinei i valoarea gradului de extracie, respectiv a coeficientului de
distribuie [114]. Pentru minimizarea timpului de meninere a penicilinei la pH sczut,
contactarea fazei apoase cu solventul de extracie se face nainte de acidulare, iar
amestecul de lichid de fermentaie-solvent este amestecat cu soluia de H
2
SO
4
4 6% n
amestectoare in-line, de mare eficien. Tot pentru stabilizarea penicilinelor extracia
decurge la temperaturi sczute (0 3 C), n extractoare cu timp de contact scurt ntre
faze (extractoare Podbielniak). Dup separarea fazelor, pentru stabilizarea produsului,
se neutralizeaz urmele de acid antrenate n faza organic prin adugare de soluie
apoas de fosfat de potasiu, carbonat sau acetat de sodiu sau potasiu, pn la atingerea
pH = 6, cnd penicilina este reextras i stabilizat sub form de sare n soluia apoas
[4, 94, 115]. Purificarea se poate realiza printr-o nou extracie la pH = 2 2,5 urmat
de neutralizare cu fosfat de potasiu 2% pn la pH = 6. Solventul epuizat este recirculat
la extracie, mpreun cu solventul recuperat din rafinat prin distilare. Impuritile
organice coextrase mpreun cu penicilina sunt ndeprtate prin adsorbie pe crbune
activ. O schem de principiu a acestui procedeu de fabricaie este redat n fig. 4.18
[115].
Lichid de
fermentaie
coninnd
penicilina
G sau V
Ap
Solvent
Acid
Miceliu
Filtrare lichid de fermentaie Extracie
Rafinat (cu solvent)
la distilare
Tratare cu C activ
C activ n solvent
Solvent
Filtrare
C activ (cu solvent
+ impuriti)
la distilare
CH
3
-COOK (Na)
n solvent
Cristalizare Filtrare cristale
Solvent +
impuriti
la distilare
Solvent
Splare cristale
Solvent + impuriti
la distilare
Filtrare i uscare cristale
Solvent
Aer cald
Penicilina
G sau V,
sare de
Na sau K
Figura 4.18. Schema de principiu a instalaiei de extracie i
purificare a penicilinelor [115]

90
4.1.3.2. Extracia alcoolilor

Etanolul i butanolul sunt cei mai importani alcooli obinui prin fermentaie din
materii prime regenerabile. Una din problemele cu care se confrunt producerea
fermentativ a etanolului este aceea a inhibrii activitii drojdiilor cnd concentraia
etanolului n lichidul de fermentaie depete 12% masice. Datorit acestui fapt
concentraia etanolului obinut prin fermentaie nu depete 5 10% vol [92]. Din
lichidul de fermentaie, calea clasic de recuperare a etanolului este distilarea. n
comparaie cu aceasta, extracia cu solveni implic cheltuieli de investiii mai mari cu
circa 60% [116]. Totui, ndeprtarea prin extracie a etanolului n timpul fermentaiei ar
permite creterea randamentului n alcool. Cercetrile sunt ndreptate spre fermentarea
extractiv in situ [117, 118]. Solventul utilizat trebuie s prezinte un coeficient de
distribuie ridicat pentru etanol, s nu formeze emulsii stabile care s ngreuneze
extracia, s nu aib efecte adverse asupra masei celulare. n literatur sunt menionai
drept posibili solveni dodecanolul, i-alcooli superiori, n-alcooli superiori, tributilfosfat,
dibutilftalat, dodecan, fluorocarburi, i-acizi carboxilici superiori [92], sisteme apoase
bifazice [119]. O instalaie de fermentare extractiv in-situ este redat n fig. 4.19 [115].
Lichidul de fermentaie este scos din bioreactor i trecut printr-o instalaie de
ultrafiltrare. Retenatul cu mas celular de la ultrafiltrare este recirculat n bioreactor,
iar permeatul este trecut n coloana de extracie, unde circul n contracurent cu
solventul. Rafinatul de la extracie este trecut printr-o coloan cu crbune activ care are
rolul de a reine urmele de solvent, dup care este recirculat n bioreactor [120].
solvent
extract
rafinat
permeat
r
e
t
e
n
a
t
fermentare ultrafiltrare extracie adsorbie
c
r
b
u
n
e
a
c
t
i
v

Figura 4.19. Instalaie de fermentare extractiv in-situ [115]

4.1.3.3. Extracia acizilor carboxilici

Acizii organici obinui prin fermentaie pot fi separai i prin extracie, un studiu
artnd c n calitate de ageni de extracie pot fi utilizai compui organici coninnd
legturi C=O, P=O, sau amine alifatice cu mas molecular mare [113].
La fabricarea acidului acetic din materii prime petroliere se formeaz alturi de
produsul dorit i cantiti semnificative de acizi formic i propionic. Un procedeu
dezvoltat de Distillers Company, procedeu care poate fi utilizat i pentru prelucrarea

91
acidului acetic obinut prin fermentare, folosete pentru separarea acidului acetic din
masa de reacie apoas extracia cu acetat de i-amil. n acest solvent acidul acetic este
extras aproape integral, mpreun cu o anumit cantitate de ap. Extractul este
deshidratat prin distilare azeotrop, utiliznd acelai solvent ca antrenant pentru ap.
Rafinatul apos de la extracie, care conine mici cantiti de acid acetic i de solvent,
este stripat n vederea recuperrii solventului i acidului, dup care este descrcat [94,
115]. Analiza economic arat c introducerea etapei de extracie aduce economii
importante n costurile de investiii i de exploatare (tab. 4.4) [121].

Tabelul 4.4. Comparaie ntre procesele de deshidratare a acidului acetic [121]
Proces
Cheltuieli
de capital
Consum
de abur
Cheltuieli de
exploatare
Distilare azeotrop 100 % 100 % 100 %
Extracie cu solveni i distilare azeotrop 40 50 % 20 42 % 50 %

Acidul citric se obine pe scar larga prin fermentaia mediilor coninnd melas,
glucoz sau zaharoz, utiliznd culturi de Aspergillus niger. Lichidul de fermentaie
rezultat conine un amestec de acizi organici (citric, aconitic, succinic, malic, fumaric)
n care acidul citric reprezint 80 95% [2]. Din acest amestec acidul citric se separ
prin precipitare cu ioni Ca
2+
. Citratul de calciu obinut este filtrat, splat, tratat cu acid
sulfuric. Soluia de acid citric separat prin filtrare de sulfatul de calciu solid este apoi
trecut la purificare (adsorbie pe crbune activ, schimbtori de ioni), concentrare prin
evaporare, cristalizare, filtrare, uscare [2, 115]. Procedeul Lurgi de fabricare evit
formarea deeului de sulfat de calciu. Dup separarea lichidului de fermentaie de masa
celular prin filtrare la vid, n faza lichid se adaug un agent de precipitare (~1 L/t acid
citric monohidrat de puritate farmaceutic) pentru ndeprtarea proteinelor i a altor
compui organici. Precipitatul format se ndeprteaz prin filtrare membranar, soluia
de acid citric fiind apoi purificat prin adsorbie pe crbune activ, schimb ionic i
concentrat prin evaporare. Din soluia concentrat acidul citric este cristalizat,
centrifugat, uscat i ambalat [122]. Acidul citric de fermentaie poate fi separat i cu
ajutorul extraciei L L, folosind ca ageni de extracie amine cu mas molecular mare
(extracie reactiv) sau extractani organofosforici. Solventul ales trebuie s aib un
coeficient de distribuie bun pentru acidul citric, dar mai mic de 10, pentru a permite
reextracia uoar cu ap, precum i o tendin redus de emulsionare. Reextracia
trebuie realizat cu ap i nu cu soluii bazice, pentru a evita formarea citrailor, fapt
care ar anula avantajele extraciei cu solveni comparativ cu procedeul clasic de
precipitare. Extracia cu tri-n-butilfosfat (TBP) dizolvat n Shellsol A este puternic
dependent de temperatur (fig. 4.20), un proces eficient realizndu-se prin extracie la
22 C, urmat de stripare cu ap la 60 C [123].
Acidul butiric, cu utilizri n industria alimentar, farmaceutic i parfumerie se
poate obine prin fermentare, ns aplicabilitatea procedeului este restrns datorit
concentraiilor reduse obinute (20 30 g/L) i datorit formrii simultane a acidului
acetic [124]. Acidul butiric st la baza unor medicamente utilizate pentru tratamentul
cancerului colorectal i al hemoglobinopatiilor [25] i este de dorit ca n astfel de
aplicaii s fie utilizat un compus obinut din produse naturale. Din amestecul de reacie
acidul butiric poate fi extras cu decanol [126].

92
Acidul lactic utilizat ca aditiv
alimentar se obine prin fermentare
folosind glucoza ca substrat. Din mediul
de cultur acesta se poate recupera prin
extracie cu izopropileter [94], ns mult
mai eficient este extracia reactiv a
acestuia.
Acizii carboxilici aromatici nu se
obin prin fermentare, ntruct ei sunt
rareori sintetizai de ctre micro-
organisme. Acidul salicilic reprezint o
excepie, el fiind sintetizat de ctre
Pseudomonas aeruginosa prin bio-
transformarea naftalinei [92]. Din
lichidul de cultur acest aminoacid
poate fi extras cu xilen, cu sau fr adaos de amine [91].

4.2. EXTRACIA N SISTEME APOASE BIFAZICE

Cu toate avantajele extraciei cu solveni fa de alte metode de separare, utilizarea
sa este limitat la extracia unor componente biologice cu structur simpl i stabilitate
relativ ridicat. Moleculele de natur proteic sunt polare, iar solubilitatea lor n solveni
organici nepolari este redus. n plus, solvenii organici pot provoca denaturri ale
substanelor proteice n timpul extraciei. Datorit acestui fapt, pentru separarea din faza
apoas a proteinelor prin extracie lichid lichid, este necesar gsirea unui solvent
care, spre deosebire de solvenii organici uzuali, s aib capacitate mare de solubilizare
pentru proteine, s nu le denatureze i s produc o tensiune interfacial sczut.
Deoarece solventul care corespunde cel mai bine acestor deziderate este chiar apa,
singura problem care rmnea de rezolvat era gsirea lacunei de miscibilitate, respectiv
a zonei n care un sistem apos devine eterogen, aprnd dou faze nemiscibile ntre ele.
Primele sisteme apoase eterogene au fost observate nc din 1896 de ctre
Beijerinck [127], n cercetrile efectuate asupra unor soluii apoase de gelatin i agar,
iar mai recent de ctre Albertsson [128], care a pus n eviden coexistena fazelor
apoase nemiscibile ntre care se pot partiiona macromolecule i diverse particule.

4.2.1. Formarea sistemelor apoase bifazice

Sistemele apoase bifazice (SAB) se pot utiliza n procesele de separare a
proteinelor prin extracie L L. Tehnica se bazeaz pe incompatibilitatea a doi polimeri
hidrofili diferii la dizolvarea lor ntr-un solvent uzual cum este apa, sau pe
incompatibilitatea dintre un polimer hidrofil i o sare anorganic.
Lacunele de miscibilitate pot aprea n diferite sisteme apoase; acestea se bazeaz
pe interaciuni polimer polimer, polimer sare, sau pe termoseparare. Un caz aparte l
reprezint extracia bazat pe afinitate, care poate fi privit i ca un proces de extracie
reactiv [129].
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a
a
c
i
d
u
l
u
i
c
i
t
r
i
c

n
e
x
t
r
a
c
t

[
g
/
L
]
Concentraia acidului citric n rafinat [g/L]
10
20
30
40
10 20 30 40 50

Figura 4.20. Izoterme de extracie a
acidului citric cu TBP [123]


93
Majoritatea polimerilor hidrofili, naturali sau sintetici, sunt solubili n ap. La
concentraii sczute ale polimerilor n soluia apoas, sistemul este omogen. La o
anumit concentraie a polimerilor, strict determinat i msurabil prin metode
turbidimetrice, se produce separarea fazelor. Valorile concentraiilor la care sistemul
devine eterogen depinde de masa molecular a polimerilor, scznd cu creterea
acesteia. Cel mai cunoscut i studiat sistem pe baz de polimeri este cel bazat pe
polietilenglicol (PEG) i dextran (fig. 4.21).
4 C 20 C
M
A
B
F

Figura 4.21. Diagrama de echilibru a sistemului PEG / Dextran la 4 i 20 C [128]

Curba care trece prin punctele AFB poart denumirea de curb binodal. Orice
punct situat sub aceast curb reprezint o soluie omogen de PEG i dextran n ap.
Punctele situate pe aceast curb reprezint rapoartele concentraiilor de PEG, respectiv
dextran, la care se produce separarea fazelor. Deasupra curbei binodale sistemul este
bifazic, fiind format din dou faze apoase nemiscibile: o faz apoas superioar, faza
uoar, bogat n PEG i o faz apoas inferioar, faza grea, bogat n dextran. n
punctul M, de exemplu, sistemul la echilibru este format din faza uoar superioar, de
compoziie corespunztoare punctului A i din faza grea inferioar de compoziie
corespunztoare punctului B. Dreapta care unete punctele A i B poart denumirea de
linie de legtur sau conod. Toate amestecurile eterogene obinute pentru proporii
ntre concentraiile PEG i dextranului situate pe aceeai conod vor avea aceeai
compoziie a fazelor, diferind doar prin volumele ocupate de aceste faze. Raportul
volumelor fazelor formate se poate exprima prin raportul dintre distanele de la punctul
corespunztor la extremitile conodei:

A M
B M
V
V
=
inf
sup
(4.6)
n care V
sup
i V
inf
reprezint volumele fazei superioare, respectiv inferioare. Punctul F
este aa-numitul punct critic, n care conoda este reprezentat de un singur punct pe
curba binodal. n acest punct, adugarea unei cantiti infinitezimale de ap conduce la
formarea a dou faze apoase nemiscibile, de volum i compoziie identice. Ca urmare,
orice component adugat va avea un coeficient de distribuie K
N
= 1, coeficientul de
distribuie reprezentnd raportul dintre concentraia componentului n faza superioar,
C
i, sup
i concentraia componentului n faza inferioar, C
i, inf
[129]:
inf ,
sup ,
i
i
N
C
C
K = (4.7)

94
Cu creterea lungimii conodei, compoziia fazelor la echilibru devine din ce n ce
mai diferit, iar coeficientul de distribuie se modific n mod corespunztor, permind
realizarea separrilor.
SAB pot fi obinute i prin amestecarea, n anumite proporii, a polimerilor cu
electrolii (fig. 4.22), acestea fiind uneori mai performante dect SAB care conin numai
polimeri [4]. Cele mai utilizate SAB sunt redate n tab. 4.5 [4].

Figura 4.22. Diagrama de echilibru a
sistemului PEG 4000 / Fosfat de potasiu
[128]
Tabelul 4.5. SAB frecvent utilizate [4]
Polietilenglicol Alcool polivinilic
Polivinilpirolidon
Dextran
Polipropilenglicol Metoxi-polietilenglicol
Polietilenglicol
Alcool polivinilic
Polivinilpirolidon
Hidroxi-propildextran
Dextran
Alcool polivinilic Metilceluloz
Hidroxi-propildextran
Dextran
Metilceluloz Hidroxi-propildextran
Dextran
Etil-hidroxiceluloz Dextran
Hidroxi-propildextran Dextran
Polipropilenglicol K
3
PO
4

Metoxi-polietilenglicol K
3
PO
4

Polietilenglicol K
3
PO
4
, MgSO
4
,
(NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
,
formiat de Na (K),
tartrat de Na (K)
Polivinilpirolidon K
3
PO
4

Pe lng sistemele polimer polimer i polimer sare exist i alte alternative de
SAB. O dezvoltare recent o constituie utilizarea detergenilor neionici cu grupri
hidrofile oxietilenice. La temperaturi sczute exist o singur faz, format din lichidul
de fermentaie i micelele de detergent, detergentul interacionnd mai ales cu proteinele
hidrofobe. La creterea temperaturii peste o anumit valoare (dependent de sistem),
apare turbiditatea care indic apariia unei faze noi. Aceast temperatur mai este
numit i punct de tulburare (cloud point). Valoarea sa depinde n special de numrul
mediu al gruprilor oxietilenice din detergent. De exemplu, un detergent C12EO5 are
punctul de tulburare la 23 25 C. Separarea fazelor, datorat hidratrii reversibile a
gruprilor polare de la extremitile moleculei conduce la formarea unei faze mbogite
n detergent i a uneia srcite n detergent. Micelele sufer un proces de agregare n
structuri laminate avnd proteina hidrofob ntr-o aa-numit faz coacervat cu un
coninut de 70 80% ap [130]. Procesul este redat schematic n fig. 4.23. Un proces
similar este i extracia cu micele inverse, discutat n subcapitolul 4.3. Anumii
copolimeri polietilen (PE) polipropilenoxid (PPO) prezint de asemenea proprietatea
de deshidratare reversibil a gruprilor oxidice ntr-un domeniu atractiv de temperatur
[131-133]. Iniial se folosete un SAB de tip polimer polimer pentru trecerea proteinei

95
n faza bogat n copolimer PE/PPO. Dup aceast prim separare, soluia de de
copolimer este nclzit deasupra punctului de tulburare, ceea ce duce la separarea
fazelor i trecerea aproape integral a proteinei n faza srac n polimer.
Protein
Micel
Detergent
Substan nedorit
Agregat protein-
tensid

Figura 4.23. Soluia apoas de detergent sub i peste punctul de tulburare [129]

4.2.2. Mecanismul extraciei biopolimerilor

Extracia biopolimerilor se realizeaz datorit interaciunilor de tip van der Waals
create ntre molecula proteic i polimerul hidrofil sau ntre gruprile proteinelor, cu
solubilizarea acestora ntr-o anumit faz [4].
Un sistem de extracie este proiectat astfel nct proteina dorit s treac n faza
superioar (PEG, de ex.), iar materialul care trebuie ndeprtat, inclusiv celulele i
resturile celulare, s treac n faza inferioar (sare sau dextran). Puterea de separare a
unui sistem este caracterizat de gradul de extracie (Y) i de factorul de separare (F),
dependeni de raportul volumelor fazelor (R) i de coeficientul de distribuie (K
N
).
Gradul de extracie n faza superioar este definit prin relaia:

+
=
+
=
N
K V
V
n n
n
Y
1
1
1
sup
inf
inf sup
sup
sup
(4.8)
n care n este numrul de moli de protein dorit n volumul fazei superioare (V
sup
),
respectiv inferioare (V
inf
). Factorul de separare este definit ca produs ntre coeficientul
de distribuie i raportul volumelor fazelor:

inf
sup
V
V
K R K F
N N
= = (4.9)
Valorile Y, K
N
i R se influeneaz reciproc. De regul, Y
sup
crete la creterea lui
K
N
la R = ct., sau la creterea lui R la K
N
= ct. (fig. 4.24). Coeficientul de distribuie K
N

nu depinde de concentraia proteinei i (c
i
), atta timp ct concentraia c
i
este mult mai
redus dect concentraia polimerilor i atta timp ct nu are loc formarea unor
compleci. Dup Bronstedt, exist o corelaie exponenial ntre K
N
i aria suprafeei
(masa molecular) a proteinei i:
T k
A
K
i
N
=

ln (4.10)

96

Figura 4.24. Interdependena dintre gradul de extracie (Y
sup
), coeficientul de
distribuie (K
N
) i raportul volumic al fazelor (R) [134]

unde este un factor dependent de potenialul chimic, A
i
este suprafaa disponibil de
interaciune, k este constanta lui Boltzmann, iar T este temperatura absolut (K). Astfel,
celulele i resturile celulare vor prezenta, chiar la valori mici, un coeficient de
distribuie tinznd spre zero ntr-o faz i spre infinit n cealalt faz, datorit valorii
ridicate a suprafeei disponibile de interaciune; metaboliii prezint valori K
N

aproximativ unitare, iar proteinele au valori K
N
cuprinse ntre 0,1 i 10. Pe baza
dependenei date de ecuaia (4.10) s-au putut izola antigenii de suprafa ai hepatitei B
(avnd mase moleculare de 1.10
6
2.10
6
Da) ca vaccin produs din culturi de drojdii
recombinante [135].
Principalii factori care influeneaz valoarea constantei de distribuie sunt:
componenii care formeaz cele dou faze, respectiv natura, concentraia i masa
molecular a polimerilor, tipul i concentraia ionilor din sistem, pH-ul, temperatura,
adaosul de ali componeni (ageni haotropici, de ex.), concentraia celulelor i a
resturilor celulare [4, 129, 136].
Solubilizarea proteinelor este dictat de hidrofobicitatea polimerilor existeni n
soluia apoas. Aceasta crete n ordinea [4]:
dextran sulfat < carboxi-metildextran < dextran < hidroxi-propildextran <
metilceluloz < alcool polivinilic < polietilenglicol < polipropilenglicol
Hidrofobicitatea unui polimer este cu att mai mare cu ct masa sa molecular
este mai mare. Datorit acestor lucruri, n sistemul PEG dextran sau PEG sare poate
fi crescut concentraia proteinei n faza superioar prin utilizarea unui PEG cu mas
molecular medie mic. Concomitent, distribuia masei moleculare a polimerului
controleaz hidrofobicitatea relativ a celor dou faze, respectiv gradul de extracie.
Datorit migrrii ionilor din fazele apoase se stabilete un, potenial electric de o
parte i de alta a interfeei de separare, acesta influennd hotrtor distribuia
macromoleculelor cu sarcin electric (proteine, acizi nucleici). O modificare minor a
concentraiei sau triei ionice poate conduce la modificri majore ale coeficientului de
distribuie, aa cum rezult i din fig. 4.25.


97
Concentraie K
3
PO
4
[% masice]
K
N
Log K
N
Concentraie NaCl [% masice]
L-2-hidroxiizocaproat dehidrogenaza
D-lactat dehidrogenaza
- amilaza
impuriti
a b

Figura 4.25. Influena compoziiei i a triei ionice a mediului asupra coeficientului
de distribuie: a partiia enzimelor n funcie de concentraia fosfatului de potasiu
[137]; b partiia -amilazei n funcie de concentraia clorurii de sodiu [136]

Concentraia proteinelor nu manifest nici un efect asupra repartiiei acestora
ntre cele dou faze doar n domeniul concentraiilor foarte reduse (sub 1 g/L), aceast
limit depinznd de tipul proteinei [4].
Valoarea pH-ului controleaz disocierea gruprilor ionizabile ale proteinelor i,
implicit distribuia acestora ntre cele dou faze. Odat cu variaia pH-ului se produc
modificri n disocierea ionilor polivaleni (PO
4
3+
), ceea ce va afecta potenialul electric
dintre faze, respectiv distribuia proteinelor. n sistemele PEG sare, de ex., s-au
constatat variaii de 2 3 ordine de mrime ale K
N
pentru intervale nguste de pH (fig.
4.26).

Figura 4.26. Distribuia -amilazei pure n sisteme apoase bifazice PEG 4000 (10%
masice) fosfat (11,5% masice) n funcie de pH [136]

Afinitatea biospecific dintre moleculele proteice i anumii liganzi (liganzi de
afinitate) ataai unuia dintre polimeri poate fi utilizat pentru mbuntirea separrii.
Ca liganzi de afinitate se utilizeaz colorani, acizi grai, glutation etc. [91, 136, 138].
Rezultate deosebite au dat i ionii compleci de Cu(II)-iminodiacetat n sisteme PEG

98
dextran sau PEG sare [139, 140]. Pentru extracia unui antibiotic glicopeptidic,
vancomicina, a fost utilizat drept ligand de afinitate D-alanil-D-alanina n sisteme PEG
8000 dextran i PEG 8000 K
3
PO
4
[141].
Sensibilitatea coeficienilor de distribuie la variaia temperaturii este redus.
Temperatura modific forma diagramelor de echilibru de faze (fig. 4.21). La scderea
temperaturii, separarea fazelor decurge la concentraii mai sczute de polimer n
sistemele PEG dextran, ceea ce nseamn un consum mai redus de polimeri, i la
temperaturi mai ridicate n sistemele PEG sare, ducnd la creterea consumului de
polimer. Temperatura modific de asemenea distribuia biomoleculelor (tab. 4.6), o
temperatur mai sczut conducnd la o mai bun separare a proteinelor ntre ele. n
conformitate cu ecuaia (4.10), scderea temperaturii conduce la creterea coeficientului
de distribuie [142]. Scderea temperaturii conduce ns la creterea viscozitii.
Utilizarea polimerilor hidrofili mbuntete stabilitatea enzimelor, astfel nct extracia
poate avea loc la temperatura camerei cu o pierdere minim a bioactivitii. Rcirea
SAB nu este necesar dect n cazul n care sunt implicate proteine foarte fragile [91].

Tabelul 4.6. Coeficientul de distribuie al lizozimei i catalazei n diverse SAB [143]
Temp. [C] K
N
lizozim K
N
catalaz Factor de separare SAB
4 0,54 0,046 11,7
25 0,44 0,063 7,0
40 0,85 0,174 4,9
12,2 % Dextran 10
8,4 % PEG 4000
4 0,35 0,014 25
25 0,31 0,016 19,4
40 0,53 0,020 26,5
10,0 % Dextran 10
5,6 % PEG 20000
4 0,65 0,22 3,0
25 0,47 0,21 2,2
40 0,98 0,43 2,3
11,3 11,5 % Dextran 500
7,9 % PEG 4000
4 0,58 0,052 11,2
25 0,36 0,042 8,6
40 0,72 0,068 10,6
10,3 % Dextran 500
7,65 % PEG 20000

4.2.3. Proiectarea procesului de extracie n sisteme apoase bifazice

Proiectarea unui proces de extracie n SAB implic mai multe etape, i anume: (i)
stabilirea caracteristicilor moleculelor proteice care trebuiesc separate; (ii) selectarea
mai multor SAB capabile de a realiza separarea componentului dorit; (iii) alegerea
dintre acestea a sistemului de extracie adecvat, n funcie de influena diverilor factori
(natura soluiei proteice iniiale, trie ionic, pH, temperatur etc); (iv) stabilirea
schemei de flux a procesului de extracie necesare pentru obinerea puritii dorite, n
condiiile eliminriicompuilor cu activitate concurent (enzime care pot transforma un
substrat ntr-un mod nedorit, de ex.).
Un component oarecare i din soluia iniial va trece n faza superioar sau n cea
inferioar, dup cum coeficientul de distribuie K
N,i
este supraunitar sau subunitar (ec.
4.7). Dac K
N,i
3, compusul i poate fi extras ntr-o singur treapt. Cnd K
N,i
este
sczut, gradul de extracie n una din faze poate fi mrit utiliznd un volum mai mare
din solventul cu afinitate mai mare pentru componentul respectiv:

99

inf , inf sup , sup
sup , sup
0 , 0
sup , sup
sup ,
i i
i
i
i
i
C V C V
C V
C V
C V
Y
+

=
= (4.11)
n care, pe lng notaiile anterioare, V
0
volumul iniial al fazei care conine
componentul i, C
i,0
concentraia componentului i n faza iniial. Analog:

inf , inf sup , sup
inf , inf
0 , 0
inf , inf
inf ,
i i
i
i
i
i
C V C V
C V
C V
C V
Y
+

=
= (4.12)
Gradul maxim de recuperare al componentului i n fiecare faz ntr-o unitate
teoretic de extracie, rezult din ecuaiile (4.11) i (4.12), mprind att numrtorul
ct i numitorul fraciei cu C
i,sup
, respectiv cu C
i,inf
:

inf , sup
inf
max inf ,
,
inf
sup
sup
max sup ,
) ( ) (
V K V
V
Y
K
V
V
V
Y
i N
i
i N
i
+
=
+
= (4.13)
Schema general de separare prin extracie cu SAB a unui amestec obinut prin
distrugerea celulelor este redat n fig. 4.27.
celule
distruse
PEG
Dextran
sau
sare
sare
Faza inferioar:
- fragmente celulare
- proteine
- acizi nucleici
- polizaharide
Faza superioar:
- produs
- proteine
impurificatoare
Faza superioar:
- PEG
- proteine
impurificatoare
Faza inferioar:
- produs

Figura 4.27. Schema general a procesului de extracie selectiv a moleculelor
proteice din lichidul intracelular

n general, atingerea unor puriti dorite se realizeaz prin 2 4 etape succesive de
separare (tab. 4.7). Componenii secundari ai soluiei iniiale (proteine, acizi nucleici,
polizaharide) sunt separai prin extracie fie n faza srii (dac sunt hidrofili), fie n faza
polimerului (dac sunt hidrofobi). n cazul n care, dup prima etap de extracie, n faza
superioar se gsete o cantitate nsemnat de componeni secundari alturi de produsul

100
util, aceast faz se supune unei noi extracii cu o soluie concentrat de sruri. n final,
moleculele proteice pot fi recuperate din soluia de sruri prin ultrafiltrare sau diafiltrare
[4].

Tabelul 4.7. Izolarea i purificarea enzimelor cu SAB [144, 145]
Enzima Organismul
Numr
de
etape
Factor de
purificare
global
Grad de
extracie
global [%]
Pullulanaz Klebsiela pneumoniae 4 6,3 70
Glucozizomeraz Streptomyces 1 2,5 86
Fumaraz Brevibacterium ammoniagenes 2 22 70
Aspartaz E. coli 3 18 82
Penicilinacilaz 3 12 75
Glucozdehidrogenaz Bacillus megaterium 3 33 83
Leucindehidrogenaz Bacillus sphaericus 2 3,1 87
Leucindehidrogenaz Bacillus cereus 2 2,4 89
Formiatdehidrogenaz Candida boidinii 4 3,8 70
D-Lactatdehidrogenaz Lactobacillus confusus 2 1,9 91
L-Hidroxi-
izocaproatdehidrogenaz

3 20 66

4.2.4. Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice

Extracia n SAB are numeroase aplicaii n separarea celulelor, organelor
celulare, proteinelor, acizilor nucleici, enzimelor intracelulare etc., att la scar de
laborator, dar i la scar pilot sau industrial. O list a biomoleculelor purificate la scar
pilot i industrial prin extracie n SAB este redat n tab. 4.7 4.8.

Tablelul 4.8. Biomolecule purificate la scar industrial prin extracie n SAB [138]
Acil-arilamidz Formiatdehidrogenaz Izopropanoldehidrogenaz
Alcooldehidrogenaz -Galactozidaz NADkinaz
-Amilaz Glucoz-6-fosfatdehidrogenaz Fosfofructokinaz
Aspartat -decarboxilaz -Glucozidaz Fosfolipaz
a/b Proteine clorofiliene Hexakinaz Fosforilaz
Cromatofori
D-2-Hidroxi-
izocaproatdehidrogenaz
Hibrid protein stafilococal A
-galactozidaz
Formaldehiddehidrogenaz Izoleucil-tRNAsintetaz Proteine din zer

Extracia n SAB utilizeaz acelei principii ca i extracia fizic L L clasic. n
consecin, se pot utiliza aceleai echipamente pentru amestecarea i separarea fazelor.
Diferena rezid n proprietile diferite ale SAB n comparaie cu cele ale sistemelor
clasice (faz apoas faz organic) ntlnite n extracia fizic L L, cea mai notabil
diferen fiind tensiunea interfacial extraordinar de sczut (tab. 4.9).

Tabelul 4.9. Proprieti fizice ale SAB [134]
Compoziia sistemului

[kg/m
3
]
sup

[mPa.s]
inf

[mPa.s]
disp

[mPa.s]

[mN/m]
Ref.
bibl.
9 % PEG 4000, 2 % dextran T-500 1010 3,0 94 3,4 - [146]
7 % PEG 4000, 1,25 % dextran brut 1046 2,7 2000 4,0 - [146]
16 % PEG 4000, 13 % fosfat 1085 12 2,1 - 1,25 [147]

101
n aplicaiile la scar mare, cele mai utilizate SAB sunt PEG dextran ap i
PEG sare ap, datorit aplicabilitii cvasigenerale, viscozitii i diferenei de
densitate acceptabile. n plus sunt netoxice i biodegradabile, fiind certificate de ctre
farmacopeele din cele mai multe ri [138]. Un dezavantaj ar fi costul ridicat al
dextranului purificat (de ordinul sutelor de dolari pe kg). Reducerea costurilor se poate
face prin nlocuire cu dextran brut, dextran brut hidrolizat sau amidon hidroxipropilic
[138, 142]. Dextranul brut conduce la o soluie cu viscozitate mai ridicat, n timp ce
dextranul hidrolizat reduce viscozitatea soluiei [142].

4.2.5. Procesul tehnologic de extracie n siateme apoase bifazice

n general, pentru purificarea proteinelor intracelulare, dup fazele de dezagregare
a celulelor, adugarea componenilor SAB (PEG, dextran, fosfat etc.) i ajustarea pH-
ului, are loc amestecarea suspensiei pentru atingerea echilibrului de faze. Amestecarea
se poate realiza fie n vase cu agitare prevzute cu icane, fie n amestectoare statice
[148]. Necesarul de energie este sczut datorit tensiunii interfaciale reduse, iar
echilibrul este atins foarte rapid, n circa 30 s, dac amestecarea asigur un regim de
curgere turbulent [149]. Separarea fazelor se poate face gravitaional sau centrifugal. Se
recomand separarea centrifugal n cazul viscozitii ridicate a sistemului, sau n cazul
diferenelor mici de densitate dintre faze [134]. Centrifugarea are avantajul suplimentar
al unor randamente mai ridicate, tiut fiind faptul c la acceleraii mari antrenarea
resturilor celulare este mai sczut.

1
2
2 2
3
3
5
5
6
6
7 7
7 7
7
suspensie
celular
PEG + sare sare
Recirculare PEG
resturi celulare
i proteine
produs
PEG i produse
secundare
faza
inferioar
4
faza
superioar

Figura 4.28. Schema procesului tehnologic de extracie a proteinelor intracelulare n
sisteme apoase bifazice [134]

Dup separarea iniial, la faza superioar se adaug o sare, pentru a genera un
nou sistem bifazic, n care proteina de interes s se gseasc n faza inferioar (fig.
4.27). Pe lng aceast tehnic, proteina din faza de polimer poate fi separat prin
centrifugare, adsorbie, ultrafiltrare sau electroforez [150]. n procesele la scar mare,
1 bioreactor;
2 pompe;
3 moar cu bile;
4 schimbtor de cldur;
5 amestectoare in-line;
6 separatoare centrifugale;
7 rezervoare.

102
concentrarea i condiionarea produsului din faza inferioar a sistemului bifazic
secundar se realizeaz prin ultrafiltrare sau diafiltrare, faza superioar fiind recirculat
[134, 151]. De asemenea, n anumite condiii, din faza inferioar a sistemului bifazic
secundar, proteina poate fi recuperat prin cromatografie de interaciune hidrofob
[129]. Un proces tehnologic tipic de extracie a unei proteine n SAB este redat n fig.
4.28.
Extracia n SAB se realizeaz de obicei n arje, ns poate fi mai economic
realizarea ei n flux continuu. n general exist trei posibiliti de prelucrare n regim
continuu (fig. 4.29): extracia n echicurent, extracia n contracurent i extracia n
curent ncruciat, fiecare dintre ele prezentnd avantaje i dezavantaje (tab. 4.10).
Pentru capaciti mari de producie, extracia n contracurent ofer un randament mai
ridicat, la un consum minim de chimicale [148].

Tabelul 4.10. Avantaje i dezavantaje ale modurilor de contactare n
extracia continu n SAB [129]
Contactare Potrivit pentru Consumuri Randament
Factor de
purificare
Echicurent K
N
sczut ca la curent ncruciat mediu mediu
Curent ncruciat K
N
ridicat ca la echicurent cel mai sczut cel mai ridicat
Contracurent K
N
sczut cele mai sczute cel mai ridicat cel mai sczut

a b
c

Figura 4.29. Modaliti de contactare a fazelor n extracia n SAB:
a echicurent; b curent ncruciat; c contracurent.

Pentru o purificare avansat a biomoleculelor extrase este necesar realizarea
extraciei n mai multe trepte. Nu toate echipamentele de extracie L L sunt potrivite
extraciei cu SAB, mai ales atunci cnd proprietile celor dou faze sunt prea
asemntoare, ori cnd tensiunea interfacial este prea redus. Pentru extracia n trepte
cu SAB au fost testate baterii de amestectoare decantoare, coloane Khni [152],
extractoare centrifugale Podbielniak [153], coloane cu pulverizare [154, 155], coloane
cu talere sit [156], coloane cu umplutur [157], toate putnd fi exploatate cu succes cu
luarea unor msuri de precauie mpotriva nnecrii. Rezultate bune s-au obinut i cu
extractorul Graesser n separarea -lactalbuminei din zer cu SAB PEG sare [158].
Acest extractor, format dintr-un rotor orizontal prevzut cu cupe (de unde i denumirea
de contactor n ploaie cu glei
1
) care se rotete lent n interiorul unui tambur

1
Raining bucket contactor denumirea alternativ n limba englez a extractorului Graesser
(F) alimentare;
(S) solvent;
(E) extract;
(R) rafinat.

103
alimentat pe la extremiti cu fazele supuse extraciei (fig. 4.30). Este singurul extractor
care disperseaz att faza uoar n faza grea, ct i faza grea n faza uoar [86, 87].
Pentru prevenirea nnecrii s-a redus viteza de rotaie de la 20 rot/min la 2 5 rot/min i
s-a inversat sensul de rotaie al rotorului cu cupe, reducndu-se astfel i intensitatea
amestecrii [159].

a b

Figura 4.30. Extractor Graesser (actualmente RTL SA Londra) [160]
a seciune transversal; b vedere interioar.
sensul normal de rotaie; sensul de rotaie la extracia n SAB.

4.2.6. Recuperarea chimicalelor i reducerea costurilor

Pentru a reduce costurile ridicate cu reactivii i cu depozitarea deeurilor se
recomand reciclarea sau recircularea materialelor auxiliare. Recuperarea polimerilor
dup extracia biomoleculelor este o etap important att la scar de laborator, ct i n
instalaia industrial. Posibilitatea de a recupera i recircula uor polimerii utilizai ar
face mult mai atractiv extracia cu SAB n instalaii de mare capacitate [161].
n literatur sunt menionate cateva modaliti de recuperare a polimerilor i
srurilor utilizate n extracia cu SAB. Astfel, din fluxurile lipsite de faz solid fosfatul
poate fi recuperat prin cristalizare la 6 C [134]. Pentru recircularea PEG s-a propus
extracia lui cu cloroform [161], dar mult mai viabil s-a dovedit ns reextracia salin
a proteinelor din faza bogat n PEG (fig. 4.28), cu formarea astfel a unei soluii
reciclabile de PEG liber de protein [134, 162]. Tot pentru separarea PEG de enzimele
extrase se propun ultrafiltrarea, dializa, sau reinerea enzimei pe un adsorbant adecvat
[163]. A fost demonstrat posibilitatea recirculrii detergenilor [164] prin extracie cu
alcooli alifatici inferiori (fig. 4.31), precum i posibilitatea recuperrii srurilor [165]
prin exploatarea lacunelor de miscibilitate n sistemele ternare ap sare alcooli
alifatici inferiori (fig. 4.32). n acest din urm caz, amestecul de alcool (etanol) i faz
bogat n sare este trimis ntr-un evaporator unde este concentrat n vederea ndeprtrii
i reciclrii etanolului. Soluia de sare este concentrat, la nevoie, ntr-un al doilea
evaporator, de unde este apoi recirculat n procesul de extracie a proteinelor.
Majoritatea apei evaporate poate fi de asemenea reciclat [166]. Mai recent s-a
demonstrat formarea SAB n condiii normale (25 C i presiune atmosferic) ntre PEG
2000, respectiv PEG 4000 i carbamatul de amoniu. Carbamatul fiind volatil, poate fi
recuperat din sistemul de extracie i recirculat sub form de amoniac i dioxid de
carbon [167].

104
n principiu, chimicalele auxiliare (PEG, sruri, detergeni etc.) introduse n
procesul de extracie cu SAB pot fi recuperate i recirculate n proporie de peste 90%,
conducnd la un proces cu costuri rezonabile i acceptabil din punct de vedere al
problemelor de mediu.

Solubilizare
Lichid de
fermentaie
Extracia
proteinelor
Faza de coacervat
Extracie cu
2-metil-1-propanol
Cromatografie de
schimb anionic
Purificare 160 x
Randament total 80 %
Puritate analitic
Faza apoas
de la extracia
secundar
Extracia primar
Extracia secundar
Omogenizat
de celule PEG sare
sare
Faza inf. bogat n sare:
resturi celulare, proteine,
acizi nucleici
Faza sup. bogat
n PEG: produs
Faza inf. bogat
n sare: produs
Faza sup.
bogat n PEG
Ultrafiltrare
Soluie de sare Concentrat:
produs
R
e
c
i
r
c
u
l
a
r
e

s
a
r
e
R
e
c
i
r
c
u
l
a
r
e

s
a
r
e
R
e
c
i
r
c
u
l
a
r
e

P
E
G
R
e
c
i
r
c
u
l
a
r
e

d
e
t
e
r
g
e
n
i

Figura 4.31. Schema de flux a extraciei
colesteroloxidazei utiliznd SAB bazate
pe detergeni [164]
Figura 4.32. Schema de flux a extraciei
cu SABPEG sare, cu recircularea
extractanilor [165]

4.2.7. Transpunerea la scar a extraciei n sisteme apoase bifazice

Unul dintre avantajele exctraciei n SAB l reprezint uurina transpunerii la
scar a procesului, prin simpla cretere proporional a cantitii ingredientelor utilizate
[144, 145, 168]. Echipamentele industriale de separare centrifugal existente pe pia
pot fi selecionate utiliznd conceptul (vezi subcap. 2.4.1). Numai n perioada 1982
1995 au fost transpuse la scar industrial 27 de procese, marea majoritate utiliznd
sisteme PEG sare, pentru separarea i purificarea enzimelor, antigenului hepatitei B,
interferonului, lactalbuminelor, lactoglobulinelor, hemoglobinei, precum i a altor
proteine terapeutic active [129]. Scara de operare a acestor procese variaz de la 24 kg
celule prelucrate / arj pn la 50 m
3
material celular prelucrat / arj [169]. Exist
instalaii cu capaciti de 500 kg drojdii / 24 h n care procesul de extracie a enzimelor
este asistat de calculator [170], procesul putnd fi realizat n arje sau continuu, prin
extracie n contracurent [171]. n fig. 4.33 sunt prezentate rezultatele obinute n
transpunerea la scar a separrii i purificrii formiatdehidrogenazei obinute din
Candida boidinii n SAB PEG K
3
PO
4
. Transpunerea la scar la un factor de aproape
4.10
4
a patru etape diferite de separare nu a influenat semnificativ gradul de separare
realizat [144].

105
Factor de transpunere la scar
G
r
a
d

d
e

s
e
p
a
r
a
r
e

[
%
]
Scara de 10 cm
3
[%] Scara industrial [%]
Materia
prima, 35.5
Materiale
auxiliare, 14
Forta de
munca, 13.3
Utilitati, 0.4
Aparatura de
control, 33.9
Alte cheltuieli,
2.9
Fermentare,
40.1
Dezagregare
, 17.2
Extractie 1,
21.5
Extractie 2,
6.6
Ultrafiltrare,
9.8
Ape
reziduale, 4.8
Figura 4.33. Transpunerea la scar a diferitelor
etape de izolare i purificare a
formiatdehidrogenazei din Candida boidinii [144]
Figura 4.34. Structura
costurilor de fabricaie a
fumarazei din Brevibacterium
ammoniagenes [172]

4.2.8. Aspecte economice ale extraciei n sisteme apoase bifazice

Costurile recuperrii i concentrrii biomoleculelor prin extracie n SAB depind
n mod hotrtor de sistemul utilizat, de scara de operare, dar i de ali factori.
La separarea i purificarea fumarazei obinute din Brevibacterium ammoniagenes
printr-un proces discontinuu n arje a 100 kg, gradul global de extracie utiliznd SAB
PEG K
3
PO
4
n dou trepte a fost de 70% [172]. Structura costurilor este redat n fig.
4.34. Calculul costurilor a fost efectuat pe baza relaiei:
Y
C C C C
C
I E L M
T
13 , 0 13 , 1 6 , 2 13 , 1 + + +
= (4.14)
n care C
T
sunt costurile totale, C
M
costurile cu materialele, C
L
costurile cu fora de
munc, C
E
costurile energetice, C
I
costurile de investiii, Y gradul de extracie.
Separarea i purificarea fumarazei obinute din Saccharomyces cerevisiae a fost
de asemenea analizat din punct de vedere al costurilor, comparndu-se extracia
discontinu cu extracia continu n curent ncruciat, cu i fr reciclarea chimicalelor
[148]. Datele obinute sunt redate n tab. 4.11. Estimarea costurilor s-a fcut cu relaia:
I U L M T
C C C C C 6 , 1 13 , 1 6 , 2 13 , 1 + + + = (4.15)
n care C
T
sunt costurile totale, C
M
costurile cu materialele, C
L
costurile cu fora de
munc, C
U
costurile cu utilitile, C
I
costurile de investiii.
Se poate constata o important reducere a costurilor cu materialele: 24% n
procesul continuu i 43% n procesul discontinuu. Reducerile totale ale costurilor sunt

106
ns mai modeste (14% n procesul continuu i 5% n cel discontinuu) datorit ponderii
mari a costurilor cu fora de munc.

Tabelul 4.11. Evaluarea costurilor n producia fumarazei din S. cerevisiae [148]
Fr recirculare Cu recirculare Modificare
2
[%]
Costuri
1
Disc. Cont. Disc. Cont. Disc. Cont.
Cu materiale 2,48
3
2,48 1,41 1,89 -43 -24
Cu fora de munc 1,34 1,00 1,66 0,91 24 -8
Cu investiiile 0,14 0,18 0,14 0,23 0 28
Cu utilitile 0,015 0,018 0,016 0,02 8 19
Costuri totale 6,5 5,69 6,19 4,88 -5 -14
1
Valori preluate din [162]
2
Valori exprimate n % de modificare comparnd procesul discontinuu (Disc.) respectiv continuu
(Cont.) n variantele cu i fr recuperarea i recircularea chimicalelor
3
Valori relative, bazate pe ec. (4.15). Concentraia biomasei n procesul discontinuu a fost de 25% v/v,
iar n procesul continuu de 20% v/v.

Extracia n SAB este o tehnic cu consumuri energetice sczute, i investiii
minime, necesitnd ns cheltuieli mari cu fora de munc i cu materialele. Costurile
materialelor pot fi reduse semnificativ printr-o alegere corespunztoare a rapoartelor
volumice ale fazelor, prin introducerea de noi SAB i n special prin perfecionarea
proceselor de recuperare recirculare [166]. Durata procesului poate fi sensibil redus
prin utilizarea separrii centrifugale; aceasta nu numai c duce la obinerea unor
randamente superioare, ci i la obinerea unor produse calitativ superioare, datorit
absenei unei degradri proteolitice semnificative [173, 174].
Aspectele economice ale extraciei n SAB folosind liganzi de afinitate au fost de
asemenea analizate, constatndu-se puternica dependen a costurilor totale ale
extraciei de costul iniial i reciclabilitatea liganzilor de afinitate utilizai [175, 176].
Pentru o evaluare economic corect, este important de tiut c extracia n SAB
este o tehnologie integrativ, permind ndeprtarea solidelor i creterea activitii
specifice a produselor ntr-o singur etap. n plus, produsul poate fi separat de acizii
nucleici cu mas molecular mic i poate fi concentrat, mbuntindu-se astfel
performana urmtoarelor etape de separare. Pentru exemplificare, n fig. 4.35 este
redat schema de principiu a obinerii -amilazei din Bacillus sp. prin tehnologia
convenional i prin extracia n SAB. Extracia n SAB s-a realizat la scar mare
(capacitate de 50 m
3
). Fa de procesul convenional, procesul utiliznd extracia n
SAB necesit mai puine etape, randamentul global fiind de 80% la extracia ntr-o
singur treapt i de 95% la extracia n dou trepte, fa de numai 70% prin procedeul
convenional. Costurile se reduc cu 35% la extracia ntr-o singur treapt i cu 50% la
extracia n dou trepte [169].
Dei nou i relativ puin utilizat n practica industrial, extracia n SAB este o
tehnic important pentru izolarea i separarea moleculelor proteice. Numrul mare de
cercetri n domeniu (mii de articole publicate), numrul crescut de aplicaii brevetate i
implementate la nivel pilot i industrial, corelate cu creterea mrimii produciei de
proteine terapeutice vor face din aceast tehnic o alternativ atractiv n
biotehnologiile industriale, mai ales dac se rezolv tehnico-economic problema
recuperrii i recirculrii eficiente a chimicalelor de proces.


107

Fermentaie Fermentaie
Condiionare
lichid de
fermentaie
Filtrare /
centrifugare
Concentrare
Precipitare
Recuperare
precipitat
Solubilizare
enzim
Filtrare
Decolorare
Finisare
Formularizare
Biomas
Biomas
Filtrat
Filtrat
Propilenglicol
Propilenglicol
Material
insolubil
Material
insolubil
Condiionare
lichid de
fermentaie
Centrifugare
Decolorare
Finisare
Formularizare
Ap
Sare
Biomas
Ap
Sare
Biomas
a b

Figura 4.35. Obinerea -amilazei din Bacillus sp.:
a procedeul convenional; b - procedeul prin extracie n SAB [169]

4.3. EXTRACIA CU MICELE INVERSE

Dac extracia clasic L L realizeaz distribuia biomoleculelor ntre o faz
apoas i o faz organic distinct, iar extracia n sisteme apoase bifazice realizeaz
distribuia biomoleculelor ntre dou faze apoase distincte, extracia cu micele inverse
implic trecerea biomoleculelor din faza apoas iniial ntr-o faz organic distinct
prin intermediul unei microemulsii de tip ap-n-ulei (A/U). Aceast microemulsie este
format din aa-numitele micele inverse: asociaii sferice de molecule de compui
tensioactivi (surfactani) care ncorporeaz un mediu apos i care se gsesc dispersate
ntr-un solvent nepolar. Utilizarea sistemelor micelare inverse este relativ recent,
primele studii sistematice asupra acestor sisteme fiind efectuate la sfritul anilor 1980
[177 - 182].

4.3.1. Formarea i proprietile micelelor inverse

Surfactanii sunt molecule constituite dintr-un cap polar hidrofil (atras de ap) i
o coad hidrofob o caten hidrocarbonat (atras de ulei) fig. 4.36. Adugarea n

108
ap a unui astfel de surfactant foreaz lanurile hidrocarbonate hidrofobe s se asocieze
astfel nct s minimizeze contactul cu moleculele de ap. Asocierea moleculelor de
surfactant conduce la formarea unor agregate de diverse forme (fig. 4.37) [183]. Forma
surfactantului joac un rol important n formarea agregatelor. Dac apa solubilizeaz n
mod egal att captul polar ct i catena hidrocarbonat, agregatele nu se mai formeaz.

capt polar (hidrofil)
catene hidrocarbonate (hidrofobe)
a b

Figura 4.36. Reprezentarea schematic a unui surfactant:
a cu o singur caten hidrofob; b cu dou catene hidrofobe.

Dac molecula de surfactant are un capt polar voluminos i o caten hidrofob
redus, de form conic (fig. 4.37 a), moleculele tind s se asocieze ntr-un agregat
sferic, cu catenele formnd un miez interior, nconjurat de o suprafa exterioar
alctuit din capetele polare. O astfel de asociaie este o micel normal (fig. 4.37 b). La
concentraii reduse de surfactant micela normal este sferic, cu un diametru dictat de
lungimea catenei hidrocarbonate i de mrimea captului polar. Sistemul este dinamic,
n sensul c moleculele implicate n formarea micelelor prsesc agregatul, fiind
nlocuite de altele care se mic liber n volumul fazei apoase. n cteva microsecunde
nlocuirea tuturor moleculelor de surfactant dintr-o micel este complet, iar forma
sferic amicelei normale se pstreaz ntotdeauna. Dac molecula de surfactant are un
capt polar mic i o caten hidrocarbonat voluminoas, ramificat (semnnd cu un
dop de ampanie fig. 4.37 c), moleculele se asociaz ntr-un agregat sferic n care
miezul este format din capetele polare i suprafaa extern din catenele hidrofobe,
agregat numit micel invers (fig. 4.37 d) [181] sau microemulsie de tip A/U. Spre
deosebire de micelele normale, mrimea micelelor inverse crete liniar cu cantitatea de
ap adugat n sistem [178]. n sistemele care conin cantiti mari att de ulei ct i
de ap, forma i dimensiunile agregatelor se modific, cu formarea de canale
cilindrice interconectate, coninnd faza apoas n interior (fig. 4.37 e). n aceste
sisteme, spaiul este divizat n dou volume distince de ap i ulei, separate de stratul de
surfactant care formeaz o suprafa continu n form de ea. Structura devine astfel
dublu-continu (bicontinu) att n ap ct i n ulei. La adugare de ap, moleculele de
surfactant se reorganizeaz sub forma unui film plan sau lamelar (fig. 4.37 f), sistemul
devenind opalescent i birefringent. Recent s-a demonstrat c se poate forma o emulsie
stabil i din supra-agregate n sisteme coninnd doi surfactani funcionalizai,
capabili s formeze legturi puternice ntre ei [184]. Surfactanii se organizeaz ntr-o
faz de form lamelar care nu mai este plan ci spaial, de forma unei cepe (fig. 4.37
g), form numit i sferulit.
Formarea tuturor acestor structuri este explicat prin factorii geometrici specifici
moleculelor de surfactant [183, 185], fiind valabil doar pentru soluii diluate. La
creterea concentraiei de surfactant structurile se modific i se complic [186].

109
Ap

Figura 4.37. Forme de agregate rezultate prin organizarea moleculelor de surfactant
n soluiile coloidale: a surfactant de form conic; b micel normal;
c surfactant de form dop de ampanie; d micel invers cu coninut variabil
de ap; e cilindri interconectai; f faz lamelar plan; g faz lamelar spaial
(sferulit sau ceap) [186]

Surfactanii se clasific de regul n funcie de sarcina captului hidrofil existent
dup disocierea n ap. n acest sens exist surfactani neionici i surfactani ionici, care
la rndul lor pot fi anionici, cationici, sau amfiionici. Cei mai importani surfactani
utilizai n extracia cu micele inverse sunt prezentai n tab. 4.12. De menionat c
aceti compui trebuie s fie compatibili cu sistemele biochimice n care acioneaz.
Sunt cunoscui numeroi surfactani care formeaz micele inverse n medii
nepolare, cei mai muli dintre ei necesitnd ns i prezena unui co-surfactant. Unul
dintre puinii surfactani care poate forma micele inverse fr co-surfactant este bis(2-
etilhexil) sulfosuccinatul de sodiu, cunoscut mai mult sub denumirea de AOT [177].
Surfactantul amfiionic 1,2-dioctanoic-sn-glicero-3-fosfocholin formeaz micele
inverse doar n prezena alcoolilor alifatici drept co-surfactani [187].


110
Tabelul 4.12. Surfactani frecvent utilizai n extracia cu micele inverse
Tip Denumire
Denumire
comercial
Formul chimic
anionic
dodecilsulfat
de sodiu
SDS

anionic
bis(2-etil-
hexil)
sulfosuccinat
de sodiu
AOT

anionic
acid cholic
sare de sodiu

anionic
acid
deoxicholic
sare de sodiu

anionic
N-lauril
sarcosin sare
de sodiu


111
cationic
bromur de
cetiltrimetil-
amoniu
CTAB

cationic
clorur de
trioctilmetil-
amoniu
TOMAC

amfiionic
1,2-
dioctanoic-
sn-glicero-3-
fosfocholin

neionic
monooleat
de sorbitan
Span 80

neionic
oleil poli(10)
oxietilen eter
Brij 96

neionic
monooleat
de poli(20)
oxietilen
sorbitan

neionic
Triton
X 100

neionic
laurildimetil-
aminooxid

Interaciunea dintre micelele inverse i ap prezint o importan deosebit.
Datorit miezului polar ele pot ngloba apa, dizolvnd-o n solvenii organici nepolari.
Raportul molar ap surfactant (w
0
) influeneaz puternic proprietile micelelor
inverse. Apa din interiorul micelei inverse este parial legat de capetele hidrofile ale
surfactantului; numai peste anumite valori w
0
aceasta se comport ca i apa liber (fig.
4.38). De exemplu, n micelele inverse formate de AOT, pn la w
0
= 6 8 apa este
legat de capetele hidrofile ale surfactantului; de abia la valori w
0
> 6 8 apa se
comport ca i apa liber [177, 180].

112
periferia micelar
centrul
micelar
w
0
= [H
2
O] / [surfactant]
proprietile apei libere
p
r
o
p
r
i
e
t
i
l
e

f
i
z
i
c
e

a
l
e

a
p
e
i

m
i
c
e
l
a
r
e
a b
molecule de
surfactant
Figura 4.38. Proprietile apei nglobate n micele inverse:
a schema unei micele inverse de AOT [189]; b variaia proprietilor fizice ale
apei n micele inverse [190]

Micelele inverse au, de regul, diametrul ntre 2 i 20 nm [188]. Dimensiunile
micelelor inverse formate de AOT depind de temperatur i de coninutul de ap
nglobat, respectiv de raportul molar ap surfactant [177]. Ele variaz, la temperatura
camerei, ntre 2 nm (w
0
= 0) i 15 nm (w
0
= 60).
Micelele inverse de AOT i mresc diametrul la creterea concentraiei de ap,
dac concentraia AOT rmne constant. La coninut de ap constant, creterea
concentraiei de AOT conduce la micorarea diametrului micelelor inverse. Dac att
concentraia apei, ct i concentraia AOT cresc n acelai raport, mrimea micelelor
rmne aproximativ constant, mrindu-se doar numrul acestora (fig. 4.39).
Concentraia apei
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a

A
O
T

Figura 4.39. Efectul coninutului de ap i al concentraiei surfactantului asupra
micelelor inverse de AOT: A crete concentraia AOT; B crete concentraia apei
i concentraia AOT n acelai raport; C crete concentraia apei [177]

Micelele inverse sunt dispersate uniform n solvenii organici nepolari, formnd
sisteme omogene, stabile termodinamic. Practic apa este dizolvat sub form de
micropicturi, stabilizate interfacial de surfactant, n mediul organic nepolar [191].
Aceste sisteme sunt foarte dinamice: amestecnd o soluie de micele inverse de
diametru mare cu o soluie de micele inverse de diametru mic, n cteva secunde se
obine o soluie coninnd micele inverse avnd un diametru intermediar [192].

113
n fig. 4.40 este redat diagrama de echilibru a unui sistem ternar ap AOT
izooctan la temperatura de 15 C. Se pot remarca pe diagram: domeniul emulsiilor
U/A, domeniul cristalelor lichide, domeniul emulsiilor A/U.A, precum i domeniul
microemulsiilor A/U.
Cristale lichide
AP AOT
IZOOCTAN
U/A A/U A
A/U
T = 288 K
U/A ulei n ap
A/U ap n ulei

Figura 4.40. Diagrama sistemului ternar ap AOT izooctan la 15 C

Datorit polaritii mediului lichid din interiorul micelei inverse, aici se pot solubiliza
compui polari ca aminoacizi, enzime, proteine, compui care sunt insolubili sau
instabili n solveni organici obinuii [193]. Este interesant de notat c dimensiunile
micelelor inverse pot depinde de natura compusului dizovat n faza apoas intern.
Astfel, micelele inverse de AOT n hexan (w
0
= 6) care conin ADN au un diametru de
100 150 nm, n timp ce aceleai micele, dar fr ADN ncorporat, au doar 10 nm n
diametru [194].

4.3.2. Mecanismul extraciei n micele inverse

Micelele inverse au capacitatea de a extrage biomoleculele n apa din faza intern
dispersat ntr-un solvent organic (hexan, izooctan etc.). Capacitatea de extracie
depinde de punctul izoelectric (pI) al proteinelor, respectiv de pH-ul i tria ionic a
soluiei din care se realizeaz extracia. Principiul procesului de extracie este redat n
fig. 4.41. Solventul organic permite organizarea micelelor inverse i separarea apei din
faza intern de volumul de ap din faz din care se extrag componenii dorii.
Electroliii i proteinele solubilizate n faza apoas intern pot fi schimbate ntre
micelele inverse, pentru acest tip de transfer fiind propuse trei mecanisme posibile [180,
192, 195]. Un prim mecanism implic fuziunea tranzitorie a dou micele inverse ntr-o
pictur dimer cu via foarte scurt. n timpul existenei picturii dimere, are loc
redistribuia solutului prin difuzie, dup care pictura dimer se desparte formnd dou

114
micele inverse (fig. 4.42 a). Al doilea mecanism implic difuziunea mleculelor solutului
prin stratul dublu de surfactant format la punctul de contact dintre dou micele inverse
care nu fuzioneaz (fig. 4.42 b), n timp ce al treilea mecanism implic migrarea
solutului prin faza organic dintre dou micele inverse (fig. 4.42 c).
Surfactant Protein
Substan
nedorit
Micel invers
incluznd proteina
Faza organic
Faza apoas

Faza organic
+ +
+ +
+ +
Micele
inverse
Protein
a
c
b

Figura 4.41. Schema de principiu a
extraciei n micele inverse [129]
Figura 4.42. Mecanisme posibile de transfer
a solutului ntre micelele inverse [196]

Procesul global de transfer de mas interfazic prin care solutul trece din faza
apoas n faza de micel invers este rezultatul a trei procese elementare, fiecare dintre
ele putnd fi determinant de vitez: (i) difuzia solutului (proteinei) din faza apoas ctre
interfaa dintre faza apoas i faza organic, respectiv difuzia micelei inverse din faza
organic ctre interfa; (ii) includerea solutului n micela invers la interfa; (iii)
difuzia micelelor inverse n volumul fazei organice (fig. 4.43).
FAZA APOASA
FAZA ORGANICA
PROTEINA
micela
inversa
(i)
(iii)
(ii)
(i)

Figura 4.43. Mecanismul transferului interfazic al proteinelor din faza apoas n
faza organic prin intermediul micelelor inverse [136]

115
4.3.3. Factorii care influeneaz transferul biomoleculelor n micelele
inverse

Principalii factori care influeneaz repartiia biomoleculelor ntre faza apoas
extern i faza apoas intern din micelele inverse sunt pH-ul, tria ionic, tipul
electrolitului din faza apoas, tipul i natura surfactantului, tipul solventului organic.
Repartiia proteinelor i aminoacizilor n micelele inverse este controlat de
interaciunile electrostatice dintre moleculele ncrcate electric i prile hidrofile ale
surfactanilor, dar i de unele fenomene de respingere n funcie de mrime, care depind
de dimensiunile relative ale micelelor inverse ca molecule gazd (host) i de
dimensiunile biomoleculelor, ca molecule oaspete (guest) [89].
Valoarea pH-ului determin sarcina net a proteinelor, aceasta trebuind s
confere proteinei o sarcin net de semn opus sarcinii captului polar al surfactantului,
astfel nct s apar o atracie electrostatic ntre suprafaa proteinei i captul polar
hidrofil de la suprafaa intern a micelelor inverse. Fora motoare a procesului de
transfer a proteinelor este diferena de potenial. Experimental s-a constatat c diferena
dintre pH-ul mediului i pI-ul proteinei trebuie s fie cuprins ntre 1 i 2 pentru ca
eficiena extraciei s fie ridicat, iar denaturarea s fie minim [193, 197-199]. n cazul
utilizrii surfactanilor anionici, pH-ul trebuie s fie mai mic dect pI-ul, iar n cazul
surfactanilor cationici, pH-ul trebuie s fie mai mare dect pI-ul [200, 201].
Tria ionic joac un rol important n procesele de solibilizare. Concentraii mari
de sruri n faza apoas extern ecraneaz interaciunile electrostatice ntre proteine i
captul polar al surfactantului, reducnd fora motoare disponibil pentru solubilizarea
proteinelor. Creterea triei ionice face ca interaciunile repulsive dintre capetele polare
ncrcate electric ale surfactanilor s se micoreze, micorndu-se astfel raza micelei
inverse. Dac raza micelei inverse devine mai mic dect raza agregatului proteic
extracia nu mai poate avea loc. Studii efectuate cu diverse sruri (NaCl, NaSCN,
Na
2
CO
3
, KCl, CsCl, BaCl
2
) indic o puternic reducere a cantitii de ap nglobate n
micela invers; la o cretere a concentraiei de NaCl de 0,6 M, de ex., raportul molar w
0

scade de la 50 la 15 [191, 198]. Un alt efect al creterii triei ionice este acela de a
determina ionii s migreze nspre microfaza apoas din interiorul micelei inverse,
oblignd astfel proteinele s migreze din aceast zon.
Prin modificarea controlat a pH-ului i a triei ionice se poate realiza separarea
unor proteine n funcie de mrimea acestora [193, 202, 203]. Efectul pH-ului i al triei
ionice a soluiei asupra gradului de solubilizare al unor molecule n micele inverse este
ilustrat n fig. 4.44.
Efectul de ecranare a interaciunilor electrostatice protein surfactant este
influenat i de mrimea ionilor din sistem [199, 204, 205]. Ionii K
+
, mai voluminoi
dect ionii Na
+
, ecraneaza mai puternic, reducnd solubilizarea ribonucleazei A i a
taumatinului n micelele inverse [191]. Cantitatea de ap nglobat n micelele inverse
nu este influenat de anionul srii, dar depinde puternic de cationul acesteia. Cationii
din faza apoas sunt interschimbabili cu contraionii surfactantului, fapt care duce la
modificarea dramatic a coninutului de ap din microfaza apoas intern [191].


116
Figura 4.44. Efectul pH-ului i al triei ionice a soluiei asupra solubilizrii unor
biomolecule: () citocrom C; () lizozima; () ribonucleaza A; a sistem
AOT izooctan cu 0,1 M KCl; b sistem AOT izooctan fr control de pH [203]

Concentraia surfactantului afecteaz att transferul proteinei n faza de micele
inverse, ct i reextracia acesteia. O concentraie ridicat de surfactant poate ntrzia
procesul de reextracie. Proteinele cu mas molecular mic pot fi extrase mai uor
dect cele voluminoase, utiliznd concentraii reduse de surfactant [206].
Co-surfactanii sunt substane care favorizeaz dizolvarea surfactantului n faza
organic i stabilizeaz micelele inverse formate [198], dar mecanismul aciunii
acestora nu este nc pe deplin elucidat [207]. Deoarece surfactanii cationici formeaz
micele inverse foarte mici (w
0
< 3), prezena co-surfactanilor este imperios necesar
[193]. Surfactanii anionici formeaz micele inverse mari (w
0
= 20 115), astfel nct
adugarea de co-surfactani nu este obligatorie [208, 209]. Co-surfactanii uzuali sunt
alcoolii alifatici cu caten liniar C
4
C
10
i alcoolul benzilic [180, 197, 206, 210, 211].
Cu ct raportul volumic dintre faza apoas (V
aq
) i faza organic (V
org
) este mai
redus, cu att procesul devine mai economic, iar bioprodusul este obinut ntr-o form
mai concentrat. Creterea raportului volumic conduce la scderea gradului de extracie.
O cretere a raportului fazic de la 1 la 5 duce la o scdere de numai 5% a gradului de
extracie pentru peroxidaz [212], n timp ce creterea raportului fazic de la 1 la 4 duce
la scderea gradului de extracie de la 87% la 63% n cazul inulinazei [193].
Natura i tipul solventului pot influena transferul biomoleculelor din faza
apoas n faza organic. Solvenii utilizai nu trebuie s fie miscibili cu apa. Solvenii
uzuali utilizai n extracia cu micele inverse sunt hidrocarburi alifatice (n-octan, i-octan,
heptan, ciclohexan) sau aromatice (benzen), amestecuri de hidrocarburi (kerosen),
cloroform [180, 213]. ntr-un studiu referitor la extracia tripsinei s-a constatat c gradul
de extracie este ridicat (circa 70%) n cazul utilizrii kerosenului drept solvent, dar
scade la jumtate (circa 35%) cnd se utilizeaz ca solvent ciclohexanul [213]. Unii
autori [209] explic acest lucru prin aceea c solventul este capabil de a denatura forma
i structura micelelor inverse.
Caracterul hidrofob sau hidrofil al biomoleculelor extrase influeneaz, de
asemenea, procesul. De exemplu, aminoacizii cu structur hidrofil sunt ncorporai n
interiorul micelelor inverse, pe cnd cei hidrofobi la interfaa acestora [4].
Temperatura, care influeneaz proprietile fizico-chimice ale micelelor inverse,
are un rol important n special n procesele de reextracie a biomoleculelor.

117
4.3.4. Reextracia din micele inverse

Reextracia sau extracia invers este operaia prin care biomoleculele nglobate n
microfaza apoas intern din micelele inverse sunt trecute din nou n volumul unei faze
apoase. Procesul de reextracie este lent i dificil de realizat fr pierderea semnificativ
a activitii bioprodusului separat, fiind unul dintre principalele impedimente care nu au
permis deocamdat implementarea extraciei cu micele inverse la nivel industrial.
Pentru reextracia proteinelor din faza de micel invers au fost studiate i propuse
mai multe procedee, printre care se numr modificarea pH-ului [136, 214], a
temperaturii [193, 204, 215 - 217], utilizarea unor particule adsorbante de silice care
rein proteinele, apa i compuii tensioactivi din faza micelelor inverse [218], utilizarea
zeoliilor pentru deshidratarea fazei de micele inverse [4], distrugerea fazei de micele
inverse i eliberarea proteinelor prin adugarea unor cantiti ridicate de solvent organic
(acetat de etil) [219, 220], adugarea unor soluii care conin ioni de Ca
2+
(CaCl
2
) sau
K
+
(KCl), care nlocuiesc ionii Na
+
din structura surfactantului i formeaz un complex
hidrofob cu acesta [136, 221].
Reextracia proteinelor este afectat de valoarea pH-ului i de concentraia
srurilor n soluia de alimentare i n soluia utilizat pentru reextracie [214]. Este de
dorit ca tria ionic a soluiei n care se face reextracia s fie ct mai mare, iar pH-ul s
fie similar cu valoarea pI a proteinei care trebuie purificat [197]. Sarcina proteinei
trebuie s fie aceeai cu cea a captului polar al surfactantului pentru a se permite
eliberarea proteinei din micela invers. De ex., pentru reextracia -amilazei dintr-o faz
cu micele inverse de AOT n i-octan s-a folosit o soluie apoas coninnd 0,5 M NaCl
i soluie tampon acid acetic acetat de sodiu. Separarea fazelor dup reextracie s-a
realizat prin centrifugare [222]. Dei modificarea pH-ului este foarte eficient pentru
reextracie, aceasta poate cauza i degradarea moleculelor proteice, respectiv pierderea
activitii enzimelor extrase.
Temperatura are o influen puternic asupra proprietilor micelelor inverse.
Eficiena reextraciei poate fi mbuntit prin creterea temperaturii. Creteri
importante ale gradului de recuperare al enzimelor cu creterea temperaturii de
reextracie au fost observate n cazul -amilazei [215], -chimotripsinei [204],
glucoamilazei [217], inulinazei [193] etc. Majoritatea studiilor efectuate arat c
mrirea temperaturii duce la creterea raportului w
0
, n final ajungndu-se la distrugerea
micelelor inverse, cu formarea unei faze apoase distincte n care sunt concentrate
majoritatea biomoleculelor extrase. Aceast faz este separat apoi prin centrifugare [4].
Deoarece la creterea temperaturii se produce inactivarea termic a enzimelor,
temperatura la care se realizeaz procesul de reextracie reprezint un compromis ntre
cantitatea de protein recuperat i activitatea sa enzimatic. Pentru majoritatea
enzimelor, domeniul optim al temperaturilor de reextracie este cuprins ntre 30 38 C
(tab. 4.13), la peste 40 C observndu-se o scdere accentuat a activitii enzimatice.

Tabelul 4.13. Temperaturi de reextracie optime pentru pstrarea activitii enzimatice
Enzima -amilaz glucoamilaz inulinaz -chimotripsin
Temperatura de reextracie corespunz-
toare activitii enzimatice maxime [ C]
32 35 37 38
Referina bibliografic [216] [217] [193] [204]

118
Comparativ cu celelalte metode, reextracia prin modificarea temperaturii este
deocamdat cea mai eficient modalitate de recuperare a biomoleculelor, aa cum reiese
i din datele prezentate n tab. 4.14.

Tabelul 4.14. Comparaie ntre dou procedee de reextracie a -amilazei [4]
Reextracie
Caracteristicile procesului
fr creterea temperaturii cu creterea temperaturii
Activitate iniial [%] 100 100
Pierderi la extracie [%] 3 12
Eficien total [%] 30 50 73
Factor de concentrare al soluiei finale 10 2000

Cercetri mai recente iau n calcul facilitarea procesului de reextracie prin
utilizarea la formarea micelelor inverse a co-surfactanilor, n vederea unui control mai
bun al proprietilor i structurii acestora [223 - 226]. Alcoolii avnd proprieti
amfifile
1
ar putea fi buni ageni de modificare ai micelelor inverse. Un studiu efectuat
pentru reextracia albuminei din ser bovin (BSA) i a citocromului c din micele inverse
de AOT/i-octan a pus n eviden faptul c prezena unor cantiti mici de alcooli
alifatici drept co-surfactani poate accelera procesul de reextracie, existnd o
dependen clar ntre viteza de reextracie i lungimea catenei alifatice a alcoolului
[227]. La concentraii egale de co-surfactant, efectul accelerator scade n ordinea (fig.
4.45):
octanol (octOH) > hexanol (HexOH) > AOT fr co-surfactant > propanol (PrOH)

G
r
a
d

d
e

r
e
e
x
t
r
a
c
i
e
c
i
t
o
c
r
o
m
c

[
%
]
G
r
a
d

d
e

r
e
e
x
t
r
a
c
i
e
B
S
A

[
%
]
Timp [ore]
Timp [ore]
Figura 4.45. Efectul adaosului de co-surfactant n micelele inverse de AOT/i-octan
asupra gradului de reextracie al BSA (a) i citocromului c (b) [227]

Mai multe studii cinetice [228 - 231] arat c etapa determinant de vitez a
procesului de reextracie este procesul de desolubilizarea a proteinei la interfa, proces
descris de ecuaia [227]:

1
Amfifil - att caracter hidrofil datorit gruprii OH, ct i caracter hidrofob datorit catenei alifatice

119

( )
+

+
=
0
1
1 ln
1
1
org
aq N
N
R
C
C K
K
K (4.16)
n care: K
R
constanta de vitez a procesului de reextracie, K
N
= (C
*
aq
)/(C
*
org
)
constanta de distribuie la echilibru, durata procesului, C
o
org
concentraia iniial a
proteinei n faza organic, C
aq
concentraia actual a proteinei n faza apoas.

4.3.5. Procesul tehnologic de extracie cu micele inverse

Etapele principale ale procesului tehnologic de extracie cu micele inverse sunt
extracia propriu-zis (extracia direct) procesul prin care biomoleculele sunt
transferate din faza apoas iniial n microfaza apoas din interiorul micelelor inverse,
i reextracia (extracia invers) procesul prin care biomoleculele sunt stripate din
interiorul micelelor inverse ntr-o nou faz apoas. Pe lng aceste procese principale,
n tehnologia extraciei cu micele inverse mai intervin i alte etape, aa cum reiese din
schema de flux redat n fig. 4.46.

1
5
3
2
6
4
ap
solvent
organic surfactant soluie protein brut soluie salin
soluie protein purificat
faz apoas
faz apoas + impuriti
solvent
organic
recuperat
amestecare separare
Figura 4.46. Schema de principiu a procesului tehnologic de extracie cu micele
inverse: 1 prepararea microemulsiei; 2 separarea microemulsiei; 3 extracia
direct; 4 separarea fazelor; 5 reextracia (striparea biomoleculelor); 6
separarea fazelor i recuperarea solventului

ntr-o prim etap are loc formarea microemulsiei de micele inverse dispersate n
solvent organic. n acest sens se prepar un amestec de solvent organic, surfactant i
ap, ntr-o proporie care s asigure valoarea concentraiei micelare critice (CMC),
respectiv a concentraiei minime de surfactant la care se formeaz micelele inverse.
Microemulsia este separat de faza apoas n exces i trecut n procesul de extracie.
Extracia se poate realiza principial n dou moduri: (i) prin amestecarea fazei organice
care conine micelele inverse cu faza apoas care conine proteina i impuritile
hidrosolubile rezultate n urma dezagregrii masei celulare (glucide, lipide, acizi
nucleici etc.); (ii) prin suspendarea pulberii de protein brut n microemulsia de micele

120
inverse n solvent organic [136]. Transferul proteinei n faza micelar invers este
facilitat printr-o agitare blnd, avnd n vedere tensiunea interfacial foarte mic din
sistem: 1 2 mN/m fa de 8 50 mN/m n sistemele clasice de extracie cu solveni
organici [232]. Avantajul tensiunii interfaciale mici este timpul de contact redus necesar
realizrii transferului proteinei n interiorul micelelor inverse. Dup extracie se
realizeaz separarea fazelor prin decantare gravitaional sau prin centrifugare la vitez
mic. Faza organic, coninnd proteina ncapsulat n micelele inverse este trimis la
reextracie, care se poate realiza prin una din metodele prezentate n paragraful 4.3.4. n
urma reextraciei micelele inverse sunt distruse, formndu-se o faz apoas care conine
proteina purificat. Acast faz apoas este separat de faza organic pe baza diferenei
de densitate, prin decantare gravitaional sau centrifugal. Faza organic este
recirculat n etapa de preparare a microemulsiei, iar faza apoas este prelucrat n
vederea recuperrii proteinei. Una din problemele ntmpinate o reprezint pierderile de
surfactant n faza apoas rezultat la prepararea microemulsiei i n faza apoas n care
este reextras proteina [222]. Datorit acestui fapt este necesar utilizarea de surfactant
proaspt, fapt care duce la creterea costului separrii.
Procesul poate fi realizat n regim discontinuu sau continuu. Pentru extracia
discontinu a -amilazei s-au folosit flacoane de 50 mL nchise etan, agitate timp de 2
min la 250 rot/min pentru realizarea extraciei i centrifugate timp de 5 min la 3500
rot/min pentru separarea fazelor [211]. De asemenea, au mai fost utilizate celule cu
agitare [228, 233] i celule rotative de difuzie [234].
Soluie apoas iniial Soluie de stripare
Soluie apoas epuizat Soluie protein purificat
Faza micelar invers 1
Faza micelar invers 2
EXTRACIE REEXTRACIE
Faza apoas
continu
Faza
dispers
cu micele
inverse
Probe
faz
dispers
25 mm
6
0
m
m
6
0

m
m
3
0
0

m
m
6
5

m
m
Figura 4.47. Instalaie de extracie continu cu dou
uniti agitator/decantor [222]
Figura 4.48. Coloan cu
pulverizare [232]

Cu toate c extracia continu este un proces eficient i cu un numr redus de
etape de purificare a biomoleculelor, datele din literatur asupra acestui subiect sunt
relativ srace. Este relatat utilizarea a dou uniti de extracie agitator/decantor pentru
separarea -amilazei din soluii apoase cu micele inverse de TOMAC (fig. 4.47) [222],
utilizarea unui contactor cu discuri rotative perforate pentru separarea cutinazei pure
recombinate cu micele inverse de AOT [235], a unei coloane cu pulverizare pentru
recuperarea proteinelor intracelulare din Candida utilis [236], a extractorului Graesser

121
pentru separarea lizozimei din albuul de ou cu micele inverse AOT n i-octan i
AOT/TOMAC/i-octan [237]. O coloan cu pulverizare operat n regim semicontinuu
(faza continu stagnant, faza dispers alimentat continuu) cu micele inverse de AOT
n i-octan este redat n fig. 4.48 [232]. Comparativ cu alte echipamente, aceste coloane
sunt caracterizate prin simplitate constructiv, costuri mici de operare i flexibilitate n
exploatare [238].
Procesul de extracie cu micele inverse este eficient i selectiv, posibil de realizat
n sistem continuu, cu consumuri reduse de energie, uor de transpus la scar. La
transpunerea la scar a procesului de extracie cu micele inverse de BDBAC
1
a
-amilazei din lichid de fermentaie filtrat, de la 10 mL la 2 L, n vase prevzute cu
icane i cu agitatoare cu brae, se observ o scdere cu 15 20 % a activitii
enzimatice [198]. Rezultate similare s-au obinut i la transpunerea la scar a extraciei
inulinazei de la 10 mL la 5 L, constatndu-se o scdere a activitii enzimatice de la 90
la 77 % [197]. Denaturarea enzimelor este explicat fie prin timpul mai lung necesar
separrii la scar mare, fie prin micorarea vitezei de transfer datorit complexrii
enzimei cu surfactantul existent n faza apoas [198].

4.3.6. Aplicaii ale extraciei cu micele inverse

Din studiile efectuate pn n prezent s-a demonstrat posibilitatea utilizrii
procesului de extracie cu micele inverse pentru recuperarea unor produse de biosintez
intra- i extracelulare: proteine, peptide, acizi nucleici, acizi organici, antibiotice,
steroizi. Cu toate c procesul de extracie cu micele inverse a fost intens cercetat,
aplicarea sa la scar industrial se las nc ateptat [239, 240], principalele motive ale
neimplementrii fiind pe de o parte dificultatea reextraciei proteinelor n faza apoas i
pe de alt parte imposibilitatea reutilizrii micelelor inverse datorit pierderilor
importante de surfactant n faza apoas.
O alt problem, care conduce la reducerea randamentului global al procesului de
extracie, este prezena n soluiile apoase reale rezultate la dezagregarea masei celulare
a unor compui impurificatori (acizi nucleici, zaharuri, peptide etc.) a cror comportare
este puin cunoscut; au fost raportate ns fenomene de denaturare i precipitare la
interfa n cazul extraciei cu micele inverse din soluii obinute n urma dezagregrii
masei celulare de Saccharomyces cerevisiae [241].

4.3.6.1. Extracia cu micele inverse n prezena masei celulare

Studii efectuate pentru separarea -amilazei din lichide de fermentaie filtrate,
respectiv cu un coninut de cca. 1% biomas umed au condus la rezultate identice,
prezena masei celulare neinfluennd n mod semnificativ procesul de extracie [198].
Concluzii similare au fost trase i n cazul separrii inulinazei din Kluyveromyces
marxianus [197]. n ambele situaii, dup separarea prin centrfugare a fazelor, celulele
s-au gsit n faza organic, sub forma unui strat ntre faza organic i cea apoas. Acest
strat, care ar putea ngreuna procesul de extracie la scar industrial, rezult probabil
datorit adsorbiei moleculelor de surfactant pe suprafaa celulelor ncrcat cu sarcini

1
BDBAC abreviere pentru clorura de (n-benzil-n-dodecil-n-bis(2-hidroxietil)amoniu

122
electrice contrare, prin interaciuni electrostatice sau prin formarea unor perechi de ioni
[198]. n exemplele menionate, nu a fost raportat liza celulelor, dei alte studii indic
liza celulelor n prezena surfactanilor. Astfel, este menionat liza celulelor de
Acetobacter vinelandii ntr-un mediu de micele inverse coninnd drept surfactant
CTAB [242]. Din celulele de Candida utilis s-au extras direct proteinele intracelulare
folosindu-se ca surfactani SDS, CTAB sau Triton X-100 cuplat cu un agent reductor
[243]. Cu sau fr liza celulelor, cu sau fr partiia masei celulare ntre faze, este
posibil extracia micelar invers direct din lichidul de fermentaie, fr o separare
prealabil a masei celulare. Eliminarea etapei de separare a masei celulare n procesul
de prelucrare n aval de bioreactor este un alt argument pentru utilizarea extraciei cu
micele inverse la scar industrial.

4.3.6.2. Izolarea i renaturarea proteinelor

n cazul proteinelor intracelulare coninute n corpii de incluziune, micelele
inverse pot fi folosite cu succes n izolarea i rempachetarea corect (renaturarea)
proteinelor denaturate, principiul procesului fiind redat n fig. 4.49.
proteina
renaturat
micela invers
corp de incluziune
protein solubilizat
SPLARE

Figura 4.49. Schema de principiu a renaturrii proteinelor n micele inverse [136]

Dac gradul de renaturare n cazul ribonucleazei A, de natur hidrofil, a fost de
100%, metoda s-a dovedit a fi necorespunztoare pentru renaturarea interferonului , a
crui natur hidrofob conduce la conglomerarea sa n timpul procesului de extracie
[244, 245].

4.3.6.3. Sinteza proteinelor n micele inverse

Sinteza proteinelor in vitro, n absena celulelor (cell free protein synthesis) se
poate realiza fie pe cale chimic, fie pe cale enzimatic, fiecare metod avnd avantaje

123
i dezavantaje [246]. ntruct micelele inverse, prin nsi natura lor, prezint o
compartimentare obligatorie, ele ar putea reprezenta un mediu potrivit pentru sinteza in
vitro a proteinelor. Este semnalat sinteza in vitro a interleucinei umane 2, o protein
scurt, format dintr-o secven de 156 aminoacizi, n micele inverse de Brij 96 n
ciclohexan [247], precum i sinteza in vivo a -galactozidazei n plasmid recoltat din
E. coli i micele inverse de Tween 85 n palmitat de i-propil [248].
n cazul sintezei unor proteine mai voluminoase, cum ar fi, de exemplu proteina
albastr fluorescent (BFP
1
) sau proteina mbuntit verde fluorescent (EGFP
2
),
prezena micelelor inverse are un efect advers asupra randamentului n protein fig.
4.50, 4.51. Una dintre explicaii este secvena mai mare de aminoacizi (238) necesar
sintezei EGFP [196].

Timp [minute] Timp [minute]
I
n
t
e
n
s
i
t
a
t
e
a

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
e
i

[
u
n
i
t

.
a
b
s
.
]
I
n
t
e
n
s
i
t
a
t
e
a

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
e
i

[
u
n
i
t

.
a
b
s
.
]
Figura 4.50. Sinteza cell free a EGFP
la 23 C [196]
A n micele inverse cu 140 mM Brij 96 /
ciclohexan i 1,8 % vol soluie apoas; B n ap;
C EGFP format n ap n 3,5 h a fost adugat la
micele inverse cu 140 mM Brij 96 / ciclohexan i
1,8 % vol soluie apoas
Figura 4.51. Sinteza cell free a EGFP
la 37 C n prezena:[196]
A 29 mM Brij 96; B 29 mM AOT; C n
absena surfactanilor

Pentru sinteza EGFP se recomand utilizarea unor compartimente mai mari, cum
sunt, de ex., emulsiile A/U. O astfel de emulsie, format din 4,5% vol. Span 80, 0,5%
vol. Tween 80, 5% soluie apoas n ulei mineral, a fost utilizat pentru prima dat n
sinteza cell-free a proteinelor [249, 250]. n fig. 4.52 este redat schema de principiu a
procesului de sintez a proteinelor n emulsii A/U. n cazul proteinelor fluorescente,
micrografiile pun n eviden cantitatea de protein format prin intensitatea
fluorescenei probei (fig. 4.53, 4.54).

1
BFP Blue Fluorescent Protein;
2
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein;

124
Plasmid
Premix Extract S30 20 aminoacizi
Combinarea
fazelor lichide
apoase la 4
o
C
Amestec apos de Plasmid,
Premix, extract S30 i 20
Aminoacizi amestec de
sintez cell-free
Emulsificare la 4
o
C
Amestec de sintez
cel-free n picturi
de emulsie A/U

Figura 4.52. Schema de principiu a procesului de sintez cel-free a proteinelor n
emulsii de tip A/U [196]

Figura 4.53. Sinteza cell-free a EGCP
n emulsie A/U cu 0,45% vol Span 80;
0,05% vol Tween 80; preparare la 4 C,
incubare la 37 C [196]
a 0 min; b 11 min; c 23 min; d 32 min; e
44 min; f 57 min; g 21 h; Control negativ: h
0 min; i 21 h. Bara reprezint 50 m
Figura 4.54. Sinteza cell-free a BFP
n emulsie A/U cu 0,45% vol Span 80;
0,05% vol Tween 80; preparare la 4 C,
incubare la 37 C [196]
a 15 min; b 1,25 h; c 3,25 h; d 5 h; e 23
h; Control negativ: f 30 min; g 1,5 h; h 5,25
h. Bara reprezint 50 m


125
4.4. EXTRACIA CU AFRONI

Afronii sunt uniti distincte de fluid, ncapsulate prin intermediul unui film
subire de surfactant (balona de spun), ntr-un alt fluid [251]. Reprezentarea
schematic a unui afron este redat n fig. 4.55.
Strat dublu
electric
Suprafaa interioar
a filmului de surfactant
Suprafaa exterioar
Film
Miez gazos
Volumul fazei lichide a
a Afron coloidal gazos (CGA)
Strat dublu
electric
Suprafaa interioar
Suprafaa exterioar
Film
Miez lichid
Volumul fazei lichide b
b Afron coloidal lichid (CLA)
Figura 4.55. Reprezentarea schematic a afronilor coloidali

Diametrul mediu al afronilor coloidali gazoi (CGA) este de 25 150 m, n timp
ce diametrul mediu al afronilor coloidali lichizi (CLA) este de 0,1 50 m (Fig. 4.56).
Att CGA ct i CLA prezint o serie de proprieti deosebite, dintre care se remarc
stabilitatea extraordinar i proprietile coloidale. CGA nu prezint coalescen i pot fi
pompai la fel ca apa. CLA preparai n mod corespunztor pot fi depozitai timp de
civa ani n recipiente bine nchise, fr o deteriorare vizibil. De asemenea, CLA pot
forma dispersii stabile n ap [252].

a b

Figura 4.56. Microfotografii ale unor afroni [253]
a CGA din soluie de HTAB (bromur de hexadeciltrimetilamoniu C
19
H
42
NBr);
b CLA din kerosen


126
Afronii coloidali gazoi (CGA) se pot obine prin agitarea energic la temperatura
camerei a unei soluii de surfactant. Procesul decurge ntr-un recipient prevzut cu 2 4
icane amplasate simetric i avnd nlimea mult mai mare dect nivelul soluiei din
recipient, agitarea soluiei realizndu-se cu ajutorul unui disc rotitor antrenat de un
motor electric avnd turaia de 5000 10000 rpm (fig. 4.57). Dup cteva minute de
agitare se obin CGA care se separ ridicndu-se la suprafaa soluiei. Aceti CGA pot
avea o porozitate (fracie de goluri) de pn la 70%, uzual de peste 50%. Bulele de gaz
ncapsulate sunt stabile i prezint un spectru ngust i reproductibil al diametrelor.
Stabilitatea afronilor este condiionat de concentraia surfactantului, care trebuie s fie
mai mare dect concentraia micelar critic. n cazul utilizrii surfactanilor ionici, tria
ionic a soluiei este hotrtoare pentru stabilitatea afronilor. Stabilitatea maxim se
obine n soluii de NaCl 0,002 0,05 mM [254].
Majoritatea aplicaiilor CGA se bazeaz pe o serie de proprieti ale acestora, cum
ar fi: (i) suprafaa interfacial mare; (ii) posibilitatea de a adsorbi particule la interfaa
microbulelor; (iii) stabilitatea [255]. Dintre aplicaiile posibile ale CGA se pot enumera:
procesele de separare, recuperarea ieiului, stingerea incendiilor, sinteza materialelor,
fermentarea i bioreactoarele. O serie de utilizri ale CGA sunt sintetizate n tab. 4.15.

icane
disc rotitor
motor electric
> 6000 rpm
lichid spumant
CGA

Figura 4.57. Dispozitiv pentru
obinerea CGA
Tabelul 4.15. Aplicaii ale CGA
Aplicaia Ref.
Remedierea solurilor contaminate cu
hidrocarburi
[256 258]
Epurarea apelor contaminate cu metale [259 261]
Epurarea apelor contaminate cu colorani [253, 262, 263]
Extragerea minereurilor prin flotaie [264]
ndeprtarea algelor din apele poluate [252]
Curirea nisipului mbibat cu iei [257]
Flotaia celulelor de drojdii [265, 266]
Separarea proteinelor [267 271]

Separarea proteinelor se poate realiza prin utilizarea unor CGA preparai din
diveri surfactani. Astfel, CGA provenii din AOT se pot utiliza la separarea lizozimei,
ribonucleazei, proteinelor din zer, iar CGA din Triton X114 pentru separarea enzimelor
recombinante din bulionul de cultur. Pentru separarea proteinelor din zer se pot utiliza
i CGA din CTAB sau Tween [272]. Folosind CGA preparai dintr-o soluie de AOT,
s-a separat din zer -lactoglobulina, gradul maxim de separare (86%) obinndu-se la
pH = 8 [273].
La scar de laborator, procesul de separare a proteinelor cu ajutorul CGA implic
urmtoarele etape (fig. 4.58): prepararea CGA utiliznd un dispozitiv similar celui din
fig. 4.57, amestecarea CGA cu soluia care conine proteina, transferul proteinei n faza
de afron, separarea fazei de afron i recuperarea proteinei din aceasta. La contactul
proteinelor cu afronii, acestea se adsorb pe surfactant prin fore electrostatice i/sau
hidrofobe. Este posibil formarea unui complex ntre surfactant i protein prin
neutralizarea sarcinilor electrice, fapt care conduce la precipitarea proteinei. Faza de

127
afron se separ uor de faza lichid, datorit faptului c avnd un volum liber mare
(~50%), are densitate mic i se ridic la suprafaa fazei lichide.

CGA
agitator
magnetic
soluie
protein
amestec
CGA - protein
FAZA AFRON
FAZA LICHID

Figura 4.58. Separarea proteinelor cu ajutorul CGA [274]
a prepararea CGA; b adugarea CGA la soluia de protein;
c amestecarea fazelor; d separarea fazelor

Deocamdat nu exist aplicaii la scar industrial ale separrii cu afroni, mai
fiind nc de elucidat anumite aspecte ale mecanismului i selectivitii separrii. De
asemenea, nu au fost nc studiate aspectele referitoare la transpunerea la scar a
procesului. Exist i cercetri referitoare la comportarea reologic i la transferul termic
al afronilor coloidali gazoi [275]. Utilizarea la scar industrial a separrii cu afroni
este atractiv, deoarece scade numrul etapelor necesare separrii unui anumit
bioprodus. Astfel, prin extracia cu afroni s-ar putea nlocui secvena de operaii:
centrifugare filtrare extracie cromatografie.

4.5. EXTRACIA REACTIV

Dup cum indic i denumirea procedeului, extracia reactiv implic existena
unei reacii chimice ntre solutul care trebuie extras i solvent sau unul dintre
componenii acestuia. Dac n extracia fizic L L este necesar utilizarea unor
solveni a cror solubilitate reciproc cu solventul iniial s fie ct mai mic i care s
prezinte selectivitate ridicat i inerie chimic fa de solut (pentru diminuarea
pierderilor la recuperare), n extracia reactiv este necesar adugarea n solvent a unui
agent de extracie (extractant) capabil s reacioneze reversibil cu solutul, formnd un
compus miscibil cu solventul (fig. 4.59). n acest mod se poate mri fie capacitatea de
reinere a solventului, fie selectivitatea separrii.
Conform reprezentrii din fig. 4.59, procesul de extracie reactiv comport mai
multe etape. ntr-o prim etap, la soluia de solut iniial (B) n solventul iniial (A) se
adaug solvent (S) mpreun cu agent de extracie (X). Agentul de extracie X
reacioneaz reversibil cu B, formnd un compus BX solubil n S:
BX X B + (4.17)

128
Dup separarea fazelor, n rafinat mai rmn urme de B dizolvat n solventul iniial A.
Extractul obinut, care conine compusul rezultat n urma reaciei dintre solutul B i
extractantul X, este trecut la etapa de reextracie (stripare), n vederea eliberrii solutului
B i regenerrii extractantului X. n prezena agentului de stripare M are loc reacia de
descompunere a lui BX:
X B BX + (4.18)
Solutul B este ulterior recuperat din faza de rafinat de la reextracie. Extractul, format
din solventul S i extractantul regenerat X este recirculat la etapa de extracie reactiv.

SOLVENT INITIAL
+ SOLUT
(A + B)
SOLVENT
(S)
BX + S
A + B
Extracie
reactiv
Separare
faze
EXTRACTANT
(X)
Reextracie
(stripare)
BX + S
A + B
AGENT DE
STRIPARE
(M)
S + X
B + M
Separare
faze
B + M
S + X
Recirculare solvent i extractant
B + X BX
BX B + X

Figura 4.59. Schema de principiu a procesului de extracie reactiv

Iniial, extracia reactiv a fost utilizat pentru separarea unor compui anorganici,
aplicarea la scar industrial fiind impulsionate de cercetrile referitoare la extracia din
minereuri a uraniului folosit n energetica nuclear. Ulterior, au fost puse la punct
procedee de recuperare i a altor metale: beriliu, wolfram, vanadiu, zirconiu, hafniu,
lantanoide, metale platinice etc. [276]. Dup 1960, studiile asupra extraciei reactive
s-au orientat ntr-o msur din ce n ce mai mare, spre stabilirea condiiilor de separare a
compuilor de biosintez: acizi organici, aminoacizi, antibiotice [4].

4.5.1. Mecanismul extraciei reactive

n ipoteza n care solubilitatea reciproc a solvenilor A i S este nul, procesul de
extracie reactiv const n urmtoarele etape (fig. 4.60.a):
- difuzia extractantului X din volumul fazei organice ctre interfa;
- difuzia solutului B din volumul fazei apoase ctre interfa;
- reacia (4.17) ntre solut i extractant la interfa;
- difuzia produsului reaciei (4.17) de la interfa ctre volumul fazei organice.
n mod similar, reextracia (striparea) va implica urmtoarele etape (fig. 4.60.b):
- difuzia compusului solut extractant (BX) din volumul fazei organice ctre
interfa;

129
- descompunerea compusului BX la interfa conform reaciei (4.18);
- difuzia solutului B de la interfa ctre volumul fazei apoase;
- difuzia extractantului X de la interfa ctre volumul fazei organice.

b Reextracie (stripare)
Faza
apoas
Faza
organic
i
n
t
e
r
f
a
a
X
B
BX
B
X
B
X
+
a Extracie
Faza
apoas
Faza
organic
i
n
t
e
r
f
a
a
X
B
BX
B
X
B
X
+

Figura 4.60. Mecanismul extraciei reactive (a) i al reextraciei (b)

n anumite cazuri, n funcie de solubilitatea componenilor sistemului de extracie
n cealalt faz, locul de desfurare al reaciei (4.17) dintre solutul B i extractantul X
poate fi situat fie la interfa, fie n faza apoas, fie n faza organic. Viteza procesului
global de extracie reactiv este dictat de viteza celui mai lent proces elementar: difuzia
solutului B ctre interfa, difuzia extractantului X ctre interfa sau reacia chimic
(4.17). Dac unul din procesele de difuziune are viteza mult mai mic dect viteza
reaciei chimice, acela va fi procesul limitativ (determinant de vitez), iar procesul este
controlat difuzional. Dac dimpotriv, reacia chimic este lent, viteza reaciei fiind
mult mai mic dect viteza proceselor
elementare de difuziune, determinant
de vitez va fi reacia (4.17), procesul
global fiind controlat cinetic. Cnd
vitezele proceselor elementare sunt
comparabile ca ordin de mrime,
procesul global decurge dup un model
cinetic combinat transfer de mas
reacie chimic. Procesul elementar
limitativ depinde de condiiile de
operare: dac procesul este controlat
difuzional, prin intensificarea agitrii
masei de reacie se poate mri viteza
difuziunii, astfel nct procesul s
devin controlat cinetic (fig. 4.61).
Pentru descrierea matematic a procesului de extracie reactiv exist numeroase
modele. Unul dintre acestea este modelul Wang Langemann (1994) [277], cunoscut i
drept modelul nestaionar al celor dou filme [89]. Dei nu este un model nou, el
G
r
a
d
u
l
d
e

e
x
t
r
a
c
i
e
Intensitatea amestecrii
control
difuzional
control
mixt
control
cinetic

Figura 4.61. Modificarea procesului
determinant de vitez n extracia reactiv

130
combin ntr-un mod original o serie de ipoteze specifice modelelor clasice de transfer:
modelul celor dou filme al lui Whitman (1923), modelul Lewis Whitman (1924),
modelul rennoirii suprafeei al lui Higbie (1935), modelul rennoirii ntmpltoare a
suprafeei al lui Danckwerts (1951) [90]. Modelul a fost folosit pentru a descrie un
proces de transfer de mas nestaionar n dou straturi limit, de o parte i de alta a
interfeei, n prezena unei reacii ireversibile de ordin I. Ipotezele modelului sunt
urmtoarele:
- ntre cele dou faze lichide exist o interfa a crei arie medie poate fi
cunoscut sau estimat, chiar i experimental;
- exist dou straturi limit, laminare de ambele pri ale interfeei, avnd
grosimile
1
i
2
n cele dou faze;
- n straturile limit difuziunea are loc prin mecanism molecular;
- n a doua faz are loc o reacie ireversibil de ordin I;
- concentraiile din volumul celor dou faze lichide nu variaz n timp; la interfa
se consider ntotdeauna echilibrul descris de legea lui Henry.
Pe baza acestor ipoteze, ecuaiile modelului de transfer de mas sunt:
0 pentru
1
2
1
2
1
1
< <
x
x
C
D
t
C
(4.19)
2 2
2
2
2
2
2
0 pentru < <
x C k
x
C
D
t
C
R
(4.20)
cu urmtoarele condiii la limit i condiii iniiale:
0 pentru
0 pentru
0 , pentru
0 , 0 pentru
0 , 0 pentru
0 , pentru
, 2 2
, 1 1
2 , 2 2
2
2
1
1
2 1
1 , 1 1
= =
= =
> = =
> =
> = =
> = =
t C C
t C C
t x C C
t x
x
C
D
x
C
D
t x C K C
t x C C
V
V
V
N
V
(4.21)
n care:
C concentraia componentului transferat [kmol.m
-3
];
D difuzivitatea [m
2
.s
-1
];
k
R
constanta vitezei de reacie [s
-1
];
K
N
coeficientul de distribuie al speciei transferate ntre cele dou faze;
t timpul [s];
x coordonata n direcia transferului de mas;
grosimea stratului limit [m].
Indici: 1 faza 1; 2 faza 2; V volumul fazei lichide.
Rezolvnd ecuaiile (4.19 4.20) cu condiiile la limit (4.21) se obine profilul de
concentraie n fiecare strat limit. Din profilurile de concentraie obinute se poate
calcula fluxul instantaneu de transfer de mas:

131
0
1
1
) (
=
=
x
x
C
D t N (4.22)
n ipoteza c interfaa se rupe parial i aleatoriu, refcndu-se n acelai timp, iar
durata medie de via a turbioanelor la interfa este dat de legea de distribuie a lui
Danckwerts:

st
e s t

= ) ( (4.23)
se poate calcula fluxul mediu de component transferat:

=
0
) ( dt e t N s N
st
(4.24)
Rezolvarea integralei (4.24) conduce la o expresie a debitului mediu de component
transferat n funcie de un timp adimensional caracteristic, :

s
D
1
1
1
= (4.25)
n ecuaiile (4.23 4.25), s reprezint viteza de rennoire a suprafeei [s
-1
].
n cazul general (regim nestaionar i reacie chimic), expresia fluxului mediu de
component transferat are doi termeni, primul reprezentnd debitul transferat n condiii
staionare, iar al doilea reprezentnd contribuia transferului nestaionar datorat
turbulenei la interfa. Dac termenul nestaionar dispare i relaia de calcul a
debitului mediu de component transferat devine:

( )
2
2
2 1 2
, 2 2 , 1 1 2
sinh cosh
cosh

+

=
r N
V N V
D K
C K C D
N (4.26)
n care:
2
2 2
D
k
R
= (4.27) i
2
1
D
D
D
r
= (4.28)
Un alt caz particular este cel n care nu are loc reacia chimic (k
R
= 0), caz n care
N se reduce la expresia:
2
2
1
1
, 2 , 1
D
K
D
C K C
N
N
V N V

+

= (4.29)
expresie identic cu cea obinut de Lewis i Whitman [278] prin aplicarea teoriei celor
dou filme n cazul transferului de mas interfazic.
Modelul Wang Langemann arat c profilurile concentraiilor n cele dou faze
precum i fluxul mediu de component transferat depind de trei parametri: grosimea
straturilor limit (
1
,
2
), viteza de rennoire a suprafeei (s). Aceti parametri depind n
general de hidrodinamica sistemului, n unele cazuri putnd fi determinai pe cale
experimental. ntruct sunt puine reacii chimice n sisteme L L care decurg dup o
cinetic de ordin I (n majoritatea cazurilor de extracie reactiv ntlnindu-se reacii de
ordin fracionar), modelul descris anterior, precum i altele similare, prezint mai mult
importana teoretic, ele neputnd fi aplicate n proiectare.

132
4.5.2. Ageni de extracie

Alegerea agentului potrivit pentru extracia reactiv este hotrtoare pentru
realizarea cu succes a separrii. Pentru combinaia solvent-extractant exist dou
categorii de criterii de selectare. n prima categorie intr criteriile care sunt eseniale
pentru separare, cum ar fi selectivitatea, recuperabilitatea, diferena de densitate fa de
rafinat. Criteriile din cea de-a doua categorie nu sunt hotrtoare, dar pot mbunti
separarea i/sau o pot face mai eficient din punct de vedere economic. Unele
proprieti ale solventului (extractantului) pot fi contradictorii, caz n care trebuie aleas
o soluie de compromis [279].
Selectivitatea. Un factor de separare ridicat permite realizarea extraciei ntr-un
numr mai redus de trepte. Puritatea extractului sau a rafinatului pot fi mbuntite prin
creterea cantitii de solvent utilizate. Dac alimentarea este un amestec complex din
care trebuie separai mai muli componeni, selectivitatea de grup devine o caracteristic
important.
Capacitatea de extracie. O valoare ridicat a coeficientului de distribuie ntre
faze indic o capacitate ridicat a solventului pentru solut i permite utilizarea unor
rapoarte mai reduse solvent/alimentare. ntruct acest parametru este funcie de
temperatur, un gradient termic aplicat procesului de extracie poate conduce la
creterea capacitii de extracie. Creterea temperaturii poate conduce ns la scderea
selectivitii. Adugarea unor componeni cum ar fi antisolvenii, poate modifica
valoarea coeficientului de distribuie. De cele mai multe ori este necesar realizarea
unui compromis ntre selectivitate i capacitatea de extracie. Utilizarea refluxului de
rafinat sau de extract poate mbunti puritatea, fie a rafinatului, fie a extractului. Un
factor sensibil l reprezint valoarea pH-ului la care se realizeaz extracia, respectiv
striparea. n cazul unor separri dificile, se utilizeaz un gradient de pH n zona de
concentrare, pentru optimizarea refluxului [280].
Recuperabilitatea solventului. Solventul trebuie s poat fi recuperat ct mai
uor. Dac n extracia fizic L L recuperarea se realizeaz prin distilare sau distilare
urmat de stripare, n extracia reactiv recuperarea se realizeaz fie prin modificarea
pH-ului, fie prin modificarea triei ionice, ambele ducnd la descompunerea compusului
format ntre solut i extractant. Cu alte cuvinte, se aleg acele condiii de pH i trie
ionic, care favorizeaz deplasarea echilibrului reaciei (4.18) spre dreapta.
Densitatea. Diferena de densitate dintre extract i rafinat trebuie s fie suficient
de mare (minimum 150 kg.m
-3
) pentru a uura separarea fazelor prin decantare. O
diferen de densitate mai mare permite creterea capacitii utilajelor. La diferene de
densitate mici ntre faze sunt necesare extractoare centrifugale costisitoare.
Viscozitatea i punctul de topire. O viscozitate prea ridicat reduce eficiena
transferului de mas i provoac dificulti la vehiculare i dispersie. O viscozitate
sczut permite o sedimentare rapid i o capacitate mai mare (uzual faza mai viscoas
este faza dispers). Temperatura de realizare a procesului este de regul determinat de
viscozitate. Este de preferat ca punctul de topire al solventului s fie mai sczut dect
temperatura mediului nconjurtor, pentru a uura manipularea sa.
Solubilitatea. Solubilitatea reciproc a solventului de extracie cu solventul iniial
din care se realizeaz extracia reactiv trebuie s fie ct mai sczut. n caz contrar,

133
este necesar o etap suplimentar de separare pentru recuperarea solventului din
rafinat.
Tensiunea interfacial. O tensiune interfacial ridicat permite o sedimentare
rapid datorit coalescenei facile a picturilor de faz dispers, permind astfel
creterea capacitii instalaiei de extracie. O tensiune interfacial sczut faciliteaz
dispersia fazelor, cu obinerea unei arii mari a interfeei, fapt care conduce la creterea
eficienei separrii. n acest caz ns va fi necesar un volum mai mare de utilaj pentru
separarea fazelor. O tensiune interfacial mult prea sczut accentueaz tendina de
formare a emulsiilor.
Faza dispers. Amenajrile interne ale coloanelor de extracie nu trebuie s fie
udate de ctre faza dispers, fapt care ar conduce la scderea capacitii coloanei.
Adeseori transferul de mas de la faza continu ctre faza dispers mbuntete
coalescena picturilor; n picturi mari, eficiena transferului de mas este mai redus.
Toxicitatea i inflamabilitatea. Pentru procesarea produselor alimentare sunt
acceptai doar solvenii netoxici. n general, orice pericol asociat cu solventul va
necesita msuri de siguran suplimentare. n consecin, solvenii organici alifatici sunt
preferabili celor aromatici.
Corozivitatea. Utilizarea unor solveni corozivi conduce la creterea costului
echipamentelor, care vor trebui confecionate din materiale anticorozive. De asemenea,
astfel de solveni pot necesita prelucrri costisitoare nainte sau dup utilizare.
Stabilitatea termic i chimic. Este important avnd n vedere necesitatea
reciclrii solventului. n special acesta trebuie s fie rezistent la descompunere n timpul
recuperrii, n coloanele de stripare, de ex. Uneori sunt necesare msuri suplimentare
pentru a preveni degradarea solvenilor. De exemplu, n cazul furfuralului, este necesar
limitarea temperaturii, operarea ntr-o atmosfer protectoare de azot i deaerarea
alimentrii.
Disponibilitate i cost. Solventul trebuie s fie uor disponibil. Nu conteaz att
preul solventului, ct costurile anuale datorate pierderilor inevitabile de solvent n
timpul operrii.
Impactul asupra mediului ambiant. Solventul nu trebuie doar s fie compatibil
cu procesele de prelucrare din amonte i din aval de extracie, ci i cu mediul ambiant
(pierderi minime prin evaporare, solubilizare i antrenare).
n general, cerinele impuse extraciei reactive sunt similare cu cele impuse
extraciei fizice L L. Viscozitatea fazei organice trebuie s fie sub 2 mPa.s
-1
, punctul
de fierbere ntre 150 250 C, iar densitatea ntre 750 900 kg.m
-3
. Punctul de
aprindere trebuie s fie cu cel puin 25 K mai ridicat dect temperatura de operare, fiind
recomandat o valoare de peste 55 C. La aceeai mas molecular, solvenii aromatici
sunt mai polari, deci mai solubili n ap, dect cei alifatici. Preul mai ridicat i
toxicitatea mai mare a solvenilor aromatici, face ca n practica industrial s fie
preferai solvenii alifatici. Degradarea solventului este de regul neglijabil n
comparaie cu degradarea extractantului. Extractantul se poate degrada chimic, termic
sau prin radiaii. De asemenea el poate fi otrvit prin complexare ireversibil cu solutul
extras. De exemplu, n hidrometalurgie, la interfaa dintre stratul apos i cel organic
apare i se concentreaz o faz cu coninut de substane de natur mineral sau
biologic, faz care reduce transferul de mas i scade eficiena extraciei. Aceast faz

134
apare datorit precipitrii substanelor dizolvate i coloidale (n special silice) la tensiuni
de forfecare mari. Fenomenul este favorizat de prezena acizilor humici [281].
Principalele clase de ageni de extracie care se utilizeaz pentru separarea
produselor de biosintez sunt derivaii organofosforici, aminele cu mas molecular
ridicat i compuii macrociclici de tip eteri-coroan sau derivai ai calixarenelor.

4.5.2.1. Derivai organofosforici

Derivaii organofosforici sunt cunoscui pentru capacitatea lor de a realiza
extractia cu viteze i randamente ridicate. Acetia sunt folosii fie individual, fie n
amestec cu ali extractani (extracie reactiv sinergetic) pentru separarea metalelor, a
compuilor anorganici, a compuilor organici.
n funcie de structura chimic, derivaii organofosforici pot fi: acizi
organofosforici, esteri neutri ai acidului fosforic, acizi fosfonici, acizi fosfinici,
fosfinoxizi. Toi aceti extractani au la baz acidul ortofosforic, gruprile OH ale
acestuia fiind substituite parial sau total cu radicali organici (fig. 4.62). O prezentare a
agenilor de extracie organofosforici comerciali este redat n tab. 4.16.
P
O
R
3
P
O
OH
OH
HO
R
2
R
1
Acid ortofosforic Derivat organofosforic

Figura 4.62. Structura general a extractanilor organofosforici

Structura chimic a agenilor de extracie determin mecanismul reaciilor
implicate n extracia reactiv. Astfel, extracia cu acizi organofosforici decurge prin
intermediul schimbului ionic, n timp ce extracia cu esteri neutri sau fosfinoxizi
decurge prin formarea unor specii solvatate [4].
Schimbul ionic implic existen solutului din faza apoas sub form cationic, la
interfa stabilindu-se echilibrul:
( ) ( ) ( ) [ ]
+ + +
+ + H X NH COOH CH R HX NH COOH CH R
org org aq ] [ 3 ] [ ] [ 3
) ( ) ( (4.30)
indicii [aq] i [org] referindu-se respectiv la faza apoas i la cea organic. n cazul
formrii speciilor solvatate, la interfa se stabilete echilibrul:
( ) ( ) ( ) ( ) [ ]
] [ ] [ ] [

org org aq
TOPO m COOH R TOPO m COOH R + (4.31)


135
Tabelul 4.16. Ageni de extracie organofosforici comerciali[4, 276, 282]
Denumire
Clasa Structur
tiinific comercial
R
1
= R
2
= OH
R
3
= C
4
H
9
CH(C
2
H
5
)CH
2
O
acid mono-(2-
etilhexil) fosforic
MEHPA
R
1
= OH
R
2
= R
3
= C
4
H
9
CH(C
2
H
5
)CH
2
O
acid di-(2-etilhexil)
fosforic
DEHPA
Acizi
organofosforici
R
1
= OH
R
2
= R
3
= p-CH
3
(CH
2
)
6
C
6
H
5
O
acid di-p-octilfenil
fosforic
OPPA
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
3
O tri-n-butilfosfat TBP
Esteri neutri ai
acidului fosforic
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
7
O tri-n-octilfosfat TOP
Acizi
organofosfonici
R
1
= OH
R
2
= C
4
H
9
CH(C
2
H
5
)CH
2

R
3
= C
4
H
9
CH(C
2
H
5
)CH
2
O
ester mono-(2-
etilhexil) al acidului
mono-(2-etilhexil)
fosforic
PC88A
(P-507)
R
1
= OH
R
2
= R
3
= C
4
H
9
CH(C
2
H
5
)CH
2

acid di-(2-etilhexil)
fosfinic
P-229
Acizi
organofosfinici
R
1
= OH
R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
3
CH
2
CH(CH
3
)CH
2

acid di(2,4,4
trimetilpentil)
fosfinic
CYANEX
272
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
7
tri-n-octilfosfinoxid
TOPO
(CYANEX
921)
Fosfinoxizi
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
5
tri-n-hexilfosfinoxid THPO

4.5.2.2. Amine cu mas molecular ridicat

Aminele alifatice cu caten lung i srurile acestora sunt utilizate pe scar larg
ca extractani pentru metale, acizi minerali, acizi carboxilici, aminoacizi, antibiotice etc.
din urmtoarele motive:
- performane superioare comparativ cu ali extractani;
- posibilitatea separrii unei game largi de compui chimici;
- similaritatea dintre mecanismul reaciilor implicate cu cel al reaciilor care au
loc la separarea pe schimbtori de ioni; datorit acestui fapt se poate prevedea
comportarea sistemului de extracie.
Din punct de vedere al structurii chimice, extractanii de tip aminic se clasific
dup numrul atomilor de hidrogen substituii cu radicali organici n: amine primare,
amine secundare, amine teriare, sruri cuaternare de amoniu. Dup natura radicalului
hidrocarbonat, aminele pot fi alifatice (cu caten normal sau ramificat) sau aromatice.
O clasificare a agenilor de extracie comerciali pe baz de amine este redat n tab.
4.17.
Pentru ca o amin s poat fi utilizat n extracia reactiv, ea trebuie s
ndeplineasc cumulativ urmtoarele condiii [4, 283]: (i) s aib o capacitate ridicat de
extracie; (ii) s aib o hidrofobicitate ridicat; (iii) s fie uor solubil n solveni
organici; (iv) s formeze cu solutul compui puternic hidrofobi; (v) s permit o
separare rapid a fazelor, respectiv s aib o tendin de emulsionare ct mai redus;
(vi) s fie stabile din punct de vedere chimic, n special la radiaii i ageni oxidani,
pentru a putea fi regenerate i reutilizate n ct mai multe cicluri de extracie.

136
Tabelul 4.17. Ageni de extracie comerciali de tip aminic [4, 276, 282]
Denumire
Clasa Structur
tiinific comercial
R = CH
3
(CH
2
)
6
CH
2
n-octilamin
R = CH
3
(CH
2
)
8
CH
2
n-decilamin
R = CH
3
(CH
2
)
10
CH
2
n-dodecilamin
Amine primare
RNH
2
R = (CH
3
)
3
C(CH
2
C(CH
3
)
2
)
4
trialchil-metilamin Primene JMT
R
1
= R
2
= CH
3
(CH
2
)
6
CH
2
di-n-octilamin
R
1
= C
9
H
19
CH=CHCH
2

R
2
= CH
3
C(CH
3
)
2
(CH
2
C(CH
3
)
2
)
2

n-lauril-trialchil-
metilamin
Amberlite LA-1
R
1
= CH
3
(CH
2
)
11

R
2
= CH
3
C(CH
3
)
2
(CH
2
C(CH
3
)
2
)
2

n-dodecenil-trialchil-
metilamin
Amberlite LA-2
R
1
= R
2
= CH
3
(CH
2
)
12
di-n-tridecilamin Adogen 283
R
1
= R
2
= (CH
3
)
2
CH(CH
2
)
7
di-2-metil-nonilamin HOE F2562
R
1
= R
2
= CH
3
(CH
2
)
9
di-n-decilamin

DDA
Amine secundare
R
1
R
2
NH
R
1
= CH
3
(CH
2
)
7

R
2
= C
5
H
4
N
n-octil-aminopiridin
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
5
tri-n-hexilamin THA
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
7
tri-n-octilamin
TOA
Alamine 300
R
1
= R
2
= R
3
= (CH
3
)
2
CH(CH
2
)
5
tri-i-octilamin
Adogen 381
Alamine 308
Hostarex A 324
R
1
, R
2
, R
3
= amestec n C
8
C
10

Alamine 336
Adogen 364
Hostarex A 327
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
9
tri-n-decilamin
R
1
= R
2
= R
3
= (CH
3
)
2
CH(CH
2
)
7
tri-i-decilamin Alamine 310
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
11
tri-n-dodecilamin
Adogen 363
Alamine 304
R
1
= R
2
= R
3
= CH
3
(CH
2
)
12
tri-n-tridecilamin Adogen 383
R
1
= R
2
= CH
3

R
3
= CH
3
(CH
2
)
7

dimetil-n-octil-amin
R
1
= R
2
= R
3
= C
28
H
57
Amberlite XE 204
Amine teriare
R
1
R
2
R
3
N
R
1
= CH
3
(CH
2
)
7

R
2
= CH
3
(CH
2
)
9

R
3
= CH
3
(CH
2
)
11

n-octil-n-decil-n-
dodecil-amin
Adogen 368
R
1
= CH
3

R
2
= R
3
= R
4
= CH
3
(CH
2
)
7

X
-
= Cl
-
clorur de metil-tri-n-
octilamoniu
TOMAC
Adogen 464
Sruri cuaternare
de amoniu
R
1
R
2
R
3
R
4
N
+
X
-
R
1
= CH
3

R
2
= R
3
= R
4
= amestec n C
8
C
10

X
-
= Cl
-
clorur de metil-tri-n-
(C
8
C
10
) amoniu
Aliquat 336
Adogen 464
HOE S 2706

Datorit caracterului puternic bazic, conferit de gruparea aminic, aceti
extractani fac parte din categoria anioniilor lichizi. Extracia cu amine decurge fie prin
procese de schimb anionic, fie prin asociere n faza organic, fie prin formare de perechi
de ioni [284].

137
Capacitatea de extracie a aminelor i derivailor acestora crete odat cu
creterea masei moleculare. Ea depinde, de asemenea, i de configuraia moleculei:
compuii simetrici au o capacitate de extracie mai bun dect cei asimetrici, la aceeai
mas molecular. De asemenea, capacitatea de extracie se mrete prin substituirea
unei catene alifatice cu o grupare aromatic [4].
Hidrofobicitatea aminelor este mai ridicat dect cea a srurilor corespunztoare,
aminele fiind preferate srurilor lor n procesele de extracie.
Solubilitatea n solveni nepolari a aminelor primare crete cu creterea lungimiii
catenei hidrocarbonate. Prezena unei a doua catene hidrocarbonate (n cazul aminelor
secundare) duce la creterea solubilitii n solveni nepolari i la scderea solubilitii n
solveni polari. Aminele teriare cu catene hidrocarbonate lungi sunt practic insolubile n
ap, dar sunt complet miscibile cu solvenii nepolari [283]. Solubilitatea srurilor
aminelor primare n solveni organici scade cu reducerea polaritii solventului, astfel
nct n hidrocarburi alifatice aceti derivai sunt foarte puin solubili. Solubilitatea
poate fi mrit prin adugarea n solvent a unui alcool. Srurile aminelor secundare i
teriare sunt mai solubile n solveni organici dect srurile aminelor primare, n special
dac solventul este perfect anhidru [4].
Bazicitatea maxim o prezint aminele secundare, acestea fiind adecvate separrii
compuilor acizi [4]. Dac n cazul aminelor primare i secundare bazicitatea variaz
puin cu lungimea catenei hidrocarbonate, bazicitatea aminelor teriare crete cu
creterea numrului de atomi de carbon din molecul. Ordinea bazicitii aminelor n
solveni organici polari este aceeai ca n soluie apoas, putnd fi atribuit unui efect de
solvatare [283].
Tendina de emulsionare, cu formarea unor emulsii mai mult sau mai puin
stabile, reprezint principalul dezavantaj al utilizrii aminelor i srurilor acestora n
extracia reactiv. ntruct aminele cu caten lung sunt ageni tensioactivi,
emulsionarea poate fi evitat prin alegerea corespunztoare a solventului, a
concentraiei extractantului, precum i prin modificarea parametrilor fazei apoase (pH,
concentraia unor electrolii etc.) [4].

4.5.2.3. Compui macrociclici

Compuii macrociclici utilizai ca extractani fac parte din categoria eterilor-
coroan (fig. 4.63) i a calixarenelor (fig. 4.64). Structurile macrociclice ale acestor
compui delimiteaz caviti intramoleculare de forme i dimensiuni diverse. Astfel,
diametrul cavitilor formate variaz ntre 0,12 0,15 nm pentru eterii 14-coroan-4 i
0,34 0,43 nm pentru eterii-21-coroan-7 [285]. n aceste caviti pot fi reinute chimic
specii ionice sau moleculare, formndu-se compleci cu stabilitate ridicat, stabilitate
care este determinat de raportul dintre mrimea ciclului i cea a speciei chimice extrase
(fig. 4.65). Pentru accentuarea caracterului hidrofob sau pentru creterea gradului de
extracie, acestor extractani le pot fi ataai diveri substitueni aromatici, carboxilici
sau alchilici. Cel mai cunoscut extractant din aceast categorie este eterul dibenzo-18-
coroan-6 (fig. 4.63.d), cunoscut sub denumirea comercial DBC 18 [276].


138
a b c d
e f
g h

Figura 4.63. Eteri-coroan: a 12-coroan-4; b 15-coroan-5; c 18-coroan-6;
d dibenzo-18-coroan-6; e benzo-15-coroan-5; f diciclohexil-18-coroan-6;
g dibenzo-21-coroan-7; h diciclohexil-24-coroan-8 (neplanar)[285]

a b c
d e f

Figura 4.64. Calixarene: a structur general; b calix[4]arene: reprezentare
plan; c calix[4]arene: reprezentare pseudo-tridimensional; d para-ter-
butilcalix[4]aren; e - para-ter-butilcalix[6]aren; f - para-ter-butilcalix[8]aren
[286]

139
a b c

Figura 4.65. Compleci ai compuilor macrociclici:
a ion K
+
coordinat de eter-18-coroan-6 [287]; b vas antic grecesc (calix), a
crui form a inspirat denumirea calixarenelor [286]; c molecul de derivat
benzenic coordinat de para-ter-butilcalix[5]aren

Extractanii cu structur macrociclic sunt utilizai la transportul printr-o
membran lichid organic a diferitelor specii chimice ntre dou faze apoase cu valori
diferite ale pH-ului, proces care a avut ca model sistemele biologice. Astfel, unii
ionofori naturali din categoria antibioticelor (monesina, lascalocidul, valinomicina,
nigericina fig. 4.66) au capacitatea de a transporta diveri cationi i anioni prin
membranele celulare, n sensul sau mpotriva gradientului de concentraie al speciilor
ionice respective [4].

a
b
c

Figura 4.66. Ionofori naturali:
a monesina [4]; b lascalocidul [4]; c valinomicina [288]

Dac la extracia i transportul prin membrane lichide este meninut diferena de
pH dintre soluiile apoase, solutul poate fi transportat chiar mpotriva gradientului s u
de concentraie.
Extractanii macrociclici sunt utilizai, de regul, pentru separarea metalelor i
aminoacizilor.


140
4.5.2.4. Sinergismul agenilor de extracie

n anumite situaii, capacitatea de extracie a unui amestec de extractani este mai
mare dect suma capacitilor de extracie ale fiecrui extractant considerat separat
[276]. Fenomenul, observat i studiat la nceputul anilor 1960, poart denumirea de
sinergism i exprim faptul, aparent paradoxal, c ntregul este mai mare dect suma
tuturor prilor componente.
Extractanii care genereaz acest efect nu reacioneaz ntre ei, dar pot extrage
separat solutul, sau pot forma cu acesta o combinaie puternic hidrofob.
Extracia reactiv sinergic poate fi estimat cantitativ prin intermediul
coeficientului sinergic (sau sinergetic), C
S
:

B A
AB
S
E E
E
C
+
= lg
(4.32)
n care E
A
i E
B
reprezint coeficienii individuali de extracie ai solutului cu extractanii
A i B, E
AB
reprezint coeficientul de extracie al solutului cu amestecul extractanilor A
i B:
AB B A AB
E E E E + + =
(4.33)
iar E
AB
reprezint un coeficient de amplificare. n funcie de valoarea acestui
coeficient, extracia reactiv sinergic poate fi pozitiv (E
AB
> 0) sau negativ (E
AB
<
0).
Pentru extracia reactiv sinergic se folosesc, principial, patru tipuri de
combinaii ntre extractani: (i) agent de chelatizare + ligand neutru; (ii) acid
organofosforic + ligand neutru; (iii) doi extractani neutri; (iv) doi extractani cu
caracter acid. Extractanii neutrii utilizai recent sunt derivaii compuilor de tip eter-
coroan. Prima i ultima categorie de combinaii sunt specifice extraciei reactive a
metalelor. Celelalte combinaii pot fi aplicate att la extracia metalelor, ct i pentru
extracia acizilor minerali sau a compuilor organici [4].
Dei nc nu este pe deplin lmurit, mecanismul extraciei sinergice implic
formarea unui complex mixt care conine solutul i cei doi extractani. Dei tipul
reaciilor care intervin n proces difer de la un sistem de extracie la altul, efectul
sinergic apare ca rezultat a dou fenomene simultane: (i) modificarea capacitii de
extracie individual a extractanilor; (ii) modificarea structurii speciei moleculare
extrase. Astfel, unul dintre extractani complexeaz solutul, iar cellat mrete
hidrofobicitatea complexului format, n condiiile n care configuraia structural a
extractanilor nu genereaz mpiedicri sterice.
Cu ct diferena de polaritate dintre extractani este mai mare, cu att efectul
sinergic va fi mai puternic. Mrirea eficienei extraciei prin folosirea a doi extractani
neutri cu valori foarte diferite ale constantei dielectrice s-ar putea explica prin aceea c
derivatul cu polaritate mai redus va solvata solutul, solubilizarea complexului format
fiind favorizat de mrirea constantei dielectrice a solventului organic prin adugarea
solventului cu polaritate mai ridicat [4].


141
4.5.3. Echipamente pentru extracia reactiv

4.5.3.1. Instalaii cu uniti distincte amestector decantor

De regul, procesele de extracie reactiv decurg n echipamente similare celor
proiectate pentru extracia fizic L L. Majoritatea instalaiilor folosesc uniti
individuale amestector decantor amplasate n cascad (fig. 4.67), care permit reglarea
individual a pH-ului, stabilirea fazei disperse i a timpului de staionare, n funcie de
cinetica transferului de mas i de hidrodinamica sistemului. Dezavantajul acestor
instalaii l reprezint forfecarea neuniform n unitile de amestecare, fapt care
conduce la o distribuie larg a diametrului picturilor fazei disperse. Datorit acestei
neuniformiti n dimensiunea picturilor apar pierderi de solvent prin antrenare n
rafinat, pierderi evideniate prin scderea eficienei de extracie. Un alt dezavantaj este
zestrea mare de solvent comparativ cu alte extractoare [279, 289, 290]. Unitile
individuale amestector decantor sunt preferate atunci cnd numrul treptelor de
extracie este redus (1 2 trepte) i cnd debitele prelucrate sunt mari [279].
AMESTECTOR DECANTOR
faza
uoar
faza
uoar
faza
grea
faza
grea
plac perforat
interfa
nmol
a

faza
uoar
faza
grea
faza
grea
faza
grea
faza
grea
faza
uoar
faza
uoar
faza
uoar
interfa
zon de sedimentare
zon de amestecare
b

faza
uoar
faza
uoar
faza
grea
faza
grea
interfa
A
M
E
S
T
E
C
T
O
A
R
E
D
E
C
A
N
T
O
A
R
E
clapete de reglare
c

Figura 4.67. Instalaie de extracie reactiv cu uniti distincte amestector
decantor (A D): a unitate cu o singur treapt A D [289]; b cascad
orizontal de uniti A D [289]; c cascad vertical de uniti A D [290]

142
4.5.3.2. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic

Cnd numrul treptelor de extracie este mai mare sunt preferate extractoarele de
tip coloan. Acestea au avantajul unui necesar mai redus de solvent, pierderile de
solvent sunt mai mici, iar spaiul necesar amplasrii este de asemenea mai redus [279,
289]. Datorit timpului de staionare limitat, coloanele de extracie sunt utilizabile doar
pentru procesele cu cinetic rapid, cnd echilibrul se atinge n mai puin de 1 minut
[279].
Coloanele fr agitare (fig. 4.68) sunt simple; ele pot fi fr amenajri interioare
(coloane cu pulverizare fig. 4.68 a), cu umplutur (fig. 4.68 b) sau cu talere (fig. 4.68
c, d).
a b c d
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FU
FU
FU
FU
FU
FU
FU
FU
Figura 4.68. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic: a coloan cu
pulverizare; b coloan cu umplutur; c coloan cu talere pentru dispersarea fazei
uoare; d coloan cu talere pentru dispersarea fazei grele [279]
FG faza grea; FU faza uoar

Coloana cu pulverizare, dei simpl i ieftin, are eficiena sczut din cauza
amestecrii axiale puternice care apare n faza continu datorit ascensiunii picturilor
prin aceasta. Pentru a contracara amestecarea axial, coloanele sunt prevzute cu
amenajri interioare, care au i rolul de a favoriza ruperea i coalescena picturilor,
mbuntindu-se astfel transferul de mas. De regul se folosesc aceleai tipuri de
umpluturi ca i n cazul distilrii, cu toate c parametrii hidrodinamici sunt alii n cazul
extraciei. Performanele extractorului cresc semnificativ cnd acesta este echipat cu
corpuri de umplere cu suprafa specific mare i fracie de goluri mic, sau cu
umpluturi structurate [279].

4.5.3.3. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic

n coloanele de extracie fr agitare, hidrodinamica dispersiei este controlat de
ctre proprietile fizice i de ctre debitele vehiculate prin coloan. Pentru o mai bun

143
flexibilitate n operare, este necesar decuplarea hidrodinamicii de debitul vehiculat.
Acest lucru se realizeaz prin folosirea unor dispozitive de agitare mecanic (fig. 4.69).
a b c d e
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FG
FU
FU
FU
FU
FU
FU FU
FU
FU
FG
FG
FU
Figura 4.69. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic [279]:
a coloan cu discuri rotative; b coloan Karr; c coloan Oldshue-Rushton;
d coloan Khni; e coloan Scheibel.

Agitarea mrete aria interfacial i viteza de rupere i coalescen a picturilor,
mrind eficiena transferului de mas n coloan. Preul pltit este de regul o uoar
scdere a capacittii de producie i o proiectare, respectiv transpunere la scar, mai
sofisticate. Majoritatea instalaiilor noi de extracie reactiv folosesc coloane cu agitare
datorit flexibilitii ridicate n operare: mrimea picturilor se poate regla independent
de debitele de alimentare, ceea ce duce la minimizarea pierderilor de solvent n
condiiile meninerii eficienei.

4.5.3.4. Alte tipuri de extractoare

Extractoarele centrifugale se preteaz la prelucrarea lichidelor cu particule solide
de dimensiuni mici (lichide de fermentaie, de ex.), cu capacitate de spumare ridicat i
care necesit timpi de contact scuri. Pentru extracia reactiv a produselor de biosintez
se folosesc aceleai tipuri de extractoare centrifugale care au fost descrise n
subcapitolul consacrat extraciei fizice L L (p. 78 83).
Extractoarele centrifugale prezint avantajul unei bune separri a fazelor chiar n
condiiile unei diferene mici de densitate i la valori reduse ale tensiunii interfaciale. n
centrifugele moderne n contracurent se pot atinge cteva trepte de echilibru ntr-un
singur utilaj, ca rezultat al construciei interne a acestuia [291].

4.5.4. Extracia reactiv a produilor de biosintez

Pn n prezent sunt cunoscute i aplicate cel puin la nivel de laborator i pilot
procedee de extracie reactiv din medii apoase a acizilor organici, aminoacizilor,

144
antibioticelor. Exist cercetri intense pentru lrgirea domeniului de aplicabilitate al
extraciei reactive i la alte clase de compui de biosintez.

4.5.4.1. Extracia acizilor carboxilici

Acizii carboxilici sunt produse utilizate pe scar larg n industria chimic,
farmaceutic i alimentar. Cu toate c obinerea lor pe cale fermentativ din resurse
regenerabile este cunoscut de mai bine de un secol, marea majoritate a produciei
actuale de acizi carboxilici este bazat pe materii prime petroliere. Tehnologiile
fermentative nu s-au impus nc datorit dificultii recuperrii produselor finite.
ntruct acizii carboxilici au valori extrem de reduse ale coeficienilor de
distribuie n solveni organici (vezi tab. 4.1), nu este posibil separarea lor prin
extracie fizic L L, ci numai prin extracie reactiv. Ca ageni de extracie se pot
utiliza derivaii organofosforici sau aminele cu mas molecular mare [113].

4.5.4.1.1. Extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici

La extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici (esteri neutri sau
fosfinoxizi) are loc solvatarea solutului din faza apoas, respectiv stabilirea unor
legturi coordinative sau dipol-dipol ntre solut i extractant. La modul general,
solvatarea poate fi descris de o ecuaie de forma:

] [ 3 2 1 ] [ 3 2 1 ] [

org org aq
PO R R mR COOH R PO R R mR COOH R + (4.34)
n care m reprezint numrul de solvatare al acidului carboxilic. Constanta de echilibru
(constanta de extracie) este dat de expresia:
[ ]
[ ] [ ]
m
org aq
org
ex
PO R R R COOH R
PO R R mR COOH R
K
] [ 3 2 1 ] [
] [ 3 2 1

= (4.35)
ea depinznd puternic de hidrofobicitatea acidului extras (tab. 4.18), dar i de
bazicitatea extractantului. La extracia acizilor carboxilici din soluii apoase 0,1 M cu
TBP nediluat la 25 C, coeficienii de distribuie cresc n ordinea: acid tartric (0,6), acid
malic (1,3), acid lactic (1,4), acid citric (2,0), acid maleic (3,6), acid succinic (5,7), acid
propionic (8,4) [293, 294].

Tabelul 4.18. Constantele de echilibru la extracia unor acizi carboxilici cu TOPO
dizolvat n hexan [295]
Acid carboxilic K
ex
Acid carboxilic K
ex
Acizi monocarboxilici Acizi dicarboxilici
Acid acetic 5,32 Acid succinic 21,2
Acid glicolic 0,67 Acid fumaric 174,5
Acid propionic 37,9 Acid malic 33,5
Acid lactic 1,19 Acil L-maleic 3,52
Acid piruvic 1,67 Acid itaconic 80,8
Acid butiric 51,9 Acid tartric 2,19
Acizi tricarboxilici
Acid citric 19,61 Acid izocitric 32,7

145
Se poate concluziona c acizii monocarboxilici sunt mai uor de extras dect cei
dicarboxilici, iar prezena gruprilor OH n structura acidului micoreaz puternic
extractabilitatea acestuia [113].
n cazul derivailor organofosforici neutri, bazicitatea, respectiv eficiena
extraciei, cresc n ordinea [4]: tributilfosfat < dibutilfosfat < tributilfosfinoxid,
respectiv cu creterea numrului de legturi directe C P (tab. 4.19) [113].

Tabelul 4.19. Constantele de echilibru la extracia unor acizi carboxilici cu extractani
organofosforici [113]
Parametrii din ecuaia (4.35)
Acid Extractant Solvent T [C]
K
ex
m
Propionic TOPO n-hexan 25 59,0 1
Succinic TOPO n-hexan 25 152,0 2
Malic TBP n-dodecan 20 0,11 2
Tartric TBP n-dodecan 20 0,04 2
Lactic TBP n-dodecan 20 0,26 -
Lactic DEHPA dietilbenzen - 38,0 1
Citric TBP CCl
4
25 0,04 3

Extracia reactiv a acizilor
mono- i dicarboxilici cu TBP decurge
cu randamente superioare extraciei
acizilor minerali, n condiii
experimentale identice [295]. La
extracia acizilor carboxilici cu TBP
coeficientul de distribuie scade, iniial
rapid, cu creterea concentraiei
acidului n faza apoas iniial (fig.
4.70). Efectul este mai pregnant la
extracia cu soluii concentrate de TBP.
Utilizarea TBP prezint i o serie
de dezavantaje, cum ar fi viscozitatea
ridicat i tendina de hidroliz n
mediu acid la dibutilfosfat care este un
puternic agent complexant [4].

4.5.4.1.2. Extracia acizilor carboxilici cu amine

n cazul extraciei cu amine, mecanismul extraciei depinde, printre altele, i de
numrul gruprilor carboxilice din molecula acidului.
La extracia acizilor monocarboxilici cu un extractant aminic Q, n sistem se
stabilesc urmtoarele echilibre succesive [296]:
- disocierea acidului carboxilic n faza apoas:
+
+
] [ ] [ ] [

aq aq aq
H COO R COOH R (4.36)
- extracia fizic a acidului carboxilic nedisociat:
Concentraia iniial a acidului carboxilic n faza apoas [mol/L]
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l
d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

[
H
A
]
o
r
g
/
[
H
A
]
a
q
1 acid lactic
2 acid malic
3 acid citric
4 acid tartric
Figura 4.70. Distribuia acizilor carboxilici
ntre ap i TBP nediluat n funcie de
concentraia iniial a acidului n faza apoas
la echilibru la 20 C [113]

146

] [ ] [

org aq
COOH R COOH R (4.37)
- extracia reactiv a acidului carboxilic prin formarea unui complex (o sare) cu
amina la interfa:

] [ ] [ ] [ ] [

org org aq aq
Q COOH R Q H COO R + +
+
(4.38)
- extracia reactiv cu formarea unor aduci aminici la interfa:

] [ ] [ ] [ ] [

org org aq aq
nQ COOH R nQ H COO R + +
+
(4.39)
- extracia reactiv cu formarea unor aduci acizi la interfa:

] [ ] [ ] [ ] [ ] [

org org org aq aq
COOH mR COOH R Q mR-COOH Q H COO R + + +
+
(4.40)
- dimerizarea srii n faza organic:
( )
] [ 2 2 ] [
2
org org
Q COOH R Q COOH R (4.41)
La extracia acizilor dicarboxilici au loc reacii similare, expresia general a
echilibrului la interfa putndu-se scrie sub forma:
( ) ( ) [ ]
] [ 2 ] [ ] [ 2

org p m org aq
Q COOH R pQ COOH mR + (4.42)
n funcie de raportul molar solut extractant se disting trei tipuri de reacii
interfaciale prin care decurge extracia reactiv:
- la valori m << p are loc formarea de sruri n faza organic:
( ) ( )
] [ 2 2 ] [ ] [ 2
2
org org aq
Q COOH R Q COOH R + (4.43)
- la valori m ~ p la formarea complexului hidrofob solutul i extractantul vor
participa n proporie echimolecular:
( ) ( )
] [ 2 ] [ ] [ 2

org org aq
Q COOH R Q COOH R + (4.44)
- la valori m >> p, exist posibilitatea apariiei celei de-a treia faze, o emulsie
stabil, cu un coninut ridicat de compleci acizi, insolubili att n faza apoas,
ct i n faza organic:
( ) ( ) [ ]
] [ 2 ] [ ] [ 2

org m org aq
Q COOH R Q COOH mR + (4.45)
n scopul separrii rapide a emulsiei create de apariia celei de a treia faze, n
solventul organic se adaug un modificator de faz (alcool alifatic cu caten lung,
uzual n sau i-decanol), component care mrete solubilitatea complexului n faza de
extract. Dac solventul este nepolar, poate aciona el nsui ca modificator de faz [4].
n cazul acizilor policarboxilici sunt posibile aceleai reacii interfaciale ca i n
cazul acizilor dicarboxilici. Dac structura acizilor este voluminoas, n faza organic se
vor forma n special sruri de amoniu, prin legarea parial sau total a gruprilor
carboxil de ctre extractani [4].
Regenerarea extractantului i eliberarea solutului se realizeaz prin tratarea fazei
organice cu o soluie apoas bazic: NaOH, KOH, Na
2
CO
3
, K
2
CO
3
etc.
Utilizarea unor sruri cuaternare de amoniu poate conduce la modificarea
mecanismului reaciei interfaciale, procesul decurgnd prin schimb ionic:

+ +
+ +
] [ ] [ ] [ ] [

aq org org aq
Cl Q COO R Cl Q COO R (4.46)

147
Procesul de extracie reactiv a acizilor carboxilici cu amine, respectiv gradul de
extracie, este influenat de numeroi factori, cei mai importani fiind natura i
concentraia extractantului, tipul diluantului, natura i concentraia iniial a acidului,
temperatur, pH, precum i o serie de condiii de operare, cum ar fi durata i viteza
agitrii, durata separrii fazelor, raportul fazic apos : organic etc. n cazul extraciei cu
sruri cuaternare de amoniu gradul de extracie depinde i de dimensiunea anionului
organic, care controleaz hidrofobicitatea complexului interfacial format.
Coeficienii de distribuie ai acizilor carboxilici ntre faza apoas i faza organic
cu coninut de amin depind de hidrofobicitatea acidului carboxilic, bazicitatea aminei,
polaritatea solventului i concentraiei iniiale a acidului n faza apoas (tab. 4.20).

Tabelul 4.20. Coeficieni de distribuie (K
N
) ai unor acizi carboxilici la extracia cu
amine n diferii solveni organici [4]
Acid acetic Acid citric
Extractant Solvent K
N
*
Extractant Solvent K
N
*
Chevron 25 1,27 2,26 n-hexan 0,2 2,9 Amberlite
LA-1 cloroform 4,48 parafine + MIBC 0,63 9,6
Chevron 25 3,82 4,48 toluen 1,4 10,8 Amberlite
LA-2 cloroform 9,86 acetat de etil 2,5 23,0
2-heptanon 3,46 9,65 MIBC 3,1 27,5 Adogen
283-D cloroform 32,11 2-etilhexanol 2,1 70,0
2-heptanon 1,72 alcool i-amilic 2,7 87,8 Adogen
381 cloroform 7,79
Alamine 336
n-butanol 3,1 168,3
2-heptanon 1,98 toluen 0,55 6,0 Adogen
364 cloroform 9,69 MIBC 4,8 34,0
2-heptanon 1,83 cloroform 17,7 136 Adogen
368 cloroform 8,23
Tri-dodecilamin
2-etilhexanol 31,7 177,0
2-heptanon 1,58 Adogen
363 cloroform 7,82
2-heptanon 2,24 Alamine
366 cloroform 9,68
Metil-di-
tridecil
amina
metil-i-amil
ceton
3,54

* - intervalul de valori corespunde reducerii
concentraiei iniiale a acidului n faza apoas

Modificarea valorilor coeficienilor de distribuie ai unor acizi carboxilici la
extracia cu sruri cuaternare de amoniu este redat n fig. 4.71 i 4.72. Se poate
constata c valoarea K
N
, deci i eficiena extraciei crete cu creterea numrului de
atomi de carbon din molecula acidului, deci cu creterea hidrofobicitii acestuia, dar n
mod paradoxal scade cu creterea pH-ului soluiei apoase. Acest lucru este pus pe seama
modificrii mecanismului de extracie n prezena srii cuaternare de amoniu [297].
Exist numeroase cercetri care ncearc s elucideze multiplele aspecte ale
extraciei reactive a acizilor carboxilici cu amine cu mas molecular mare. Majoritatea
acestora sunt efectuate cu soluii sintetice de acizi carboxilici, avnd drept scop
studierea fie a echilibrului n diverse sisteme, fie a cineticii extraciei reactive. Alte
studii se ocup cu modelarea matematic a procesului, n vederea stabilirii unor modele
utilizabile pentru optimizarea procesului sau pentru proiectarea echipamentelor de
extracie.


148
Concentraia iniial a acidului propionic n faza apoas [mol.L
-1
]
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l
d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

K
N
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t

d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
t
i
e
Acid acetic
Acid propionic
Acid butiric
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l
d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

K
N

Figura 4.71. Variaia coeficientului de
distribuie al acidului propionic cu
concentraia sa iniial n faza apoas
[298]
Figura 4.72. Variaia coeficienilor de
distribuie ai unor acizi carboxilici cu
pH-ul fazei apoase la extracia cu
TOMAC [299]

Punerea n practic la nivel industrial a proceselor de extracie reactiv se lovete
de dou dificulti majore: (i) procesele de fermentare conduc la obinerea unui amestec
de acizi carboxilici care trebuie separai; (ii) n lichidul de fermentaie, pe lng acizii
carboxilici se gsesc i alte produse secundare, nutrieni neconsumai, care ngreuneaz
procesul de extracie.
n tab. 4.21 sunt prezentate comparativ rezultatele obinute la extracia reactiv a
acidului lactic cu TOA n i-decanol din soluii sintetice, respectiv din lichid de
fermentaie [300]. Se poate constata c n cazul lichidului de fermentaie, gradul de
extracie a acidului lactic a fost de trei ori mai redus dect n cazul extraciei din soluii
sintetice.

Tabelul 4.21. Rezultate ale extraciei acidului lactic cu TOA n i-decanol la 5 C [300]
Extracie din:
Parametrul
soluii model lichid de fermentaie
pH iniial 2,50 2,50
pH la echilibru 3,83 5,27
% Acid lactic n faza apoas iniial 2,45 2,27
% Acid lactic n faza apoas la echilibru 0,24 1,61
% Acid lactic n faza organic la echilibru 4,92 1,54
Coeficient de distribuie, K
N
20,27 0,96
Randament de extracie, % 90,32 29,49

ntruct structura compuilor formai ntre acizii carboxilici i aminele utilizate ca
extractani depinde att de numrul gruprilor carboxilice din molecula acidului, ct i
de raportul molar acid/amin utilizat la extracie exist posibilitatea separrii selective a
acizilor carboxilici prin extracie reactiv. Dac extracia decurge prin mecanismul
formrii perechilor ionice, separarea acizilor carboxilici este posibil dac valorile
constantelor de aciditate ale acesora difer cu cel puin un ordin de mrime (respectiv
valoarea pK
a
difer cu cel puin o unitate) [301]. Valorile pK
a
pentru acizii carboxilici
ntlnii n procesele fermentative sunt redate n tab. 4.22.

149
Tabelul 4.22. Valorile constantelor de disociere, pK
a
, ale unor acizi carboxilici
la 25 C [113]
Acidul Structur pK
a

Propionic (propanoic) CH
3
-CH
2
-COOH 4,85
Lactic (2-hidroxipropanoic) CH
3
-CH(OH)-COOH 3,86
Piruvic (2-oxopropanoic) CH
3
-CO-COOH 2,49
Succinic (butandioic) HOOC-CH
2
-CH
2
-COOH 4,20 ; 5,64
Fumaric (trans-butendioic) HOOC-CH=CH-COOH 3,02 ; 4,38
Maleic (cis-butendioic) HOOC-CH=CH-COOH 1,93 ; 6,14
Malic (hidroxi-butandioic) HOOC-CH
2
-CH(OH)-COOH 3,22 ; 4,70
Itaconic (2-metilen-butandioic) HOOC-CH
2
-(C=CH
2
)-COOH 3,65 ; 5,13
Tartric (2,3-dihidroxi-butandioic) HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH 3,01 ; 4,38
Citric (2-hidroxipropan-1:2:3-
tricarboxilic)
HOOC-CH
2
-(C(OH)-COOH)-CH
2
-COOH 3,13 ; 4,76 ; 6,40
Izocitric (1-hidroxipropan-1:2:3-
tricarboxilic)
HOOC-CH
2
-(CH-COOH)-CH(OH)-COOH 3,29 ; 4,71 ; 6,40

La fermentaia citric, pe lng acidul citric aflat n concentraie de aproximativ
50 g/L, n lichidul de fermentaie mai exist i acizii dicarboxilici malic i succinic
(circa 4 g/L). La extracia cu Amberlite LA-2 n acetat de butil, reacia (4.39) duce la
formarea unor aduci de tip R(COOH)
2
.
Q
2
n cazul acizilor succinic i malic, respectiv
R(COOH)
3
.
Q n cazul acidului citric. Dac extractantul este deficitar stoichiometric faa
de coninutul total de acizi din lichidul de fermentaie (raport molar acizi dicarboxilici :
extractant = 1), gradul de extracie al acizilor malic i succinic este de 95%, n timp ce
gradul de extracie al acidului citric este de numai 4%. Adugarea 2-octanolului ca
modificator de faz mrete i mai mult diferena dintre gradele de extracie ale celor
dou grupe de acizi [4].
ncercri similare, pe soluii sintetice de acid tartric (5 g/L), malic (2g/L) i citric
(0,25 g/L), tot cu Amberlite LA-2 ca extractant i acetat de butil ca solvent, s-a reuit
separare selectiv a acidului tartric de ceilali acizi carboxilici (fig. 4.73). Metoda poate
fi aplicat pentru recuperarea acidului tartric din produsele secundare rezultate n
procesul de vinificaie [302].
0 5 10 30 50
Concentraie extractant [g/L]
E
f
i
c
i
e
n
a

e
x
t
r
a
c
i
e
i
[
%
]
Acid tartric
Acid malic i citric
Concentraie extractant [g/L]
Selectivitate
a b

Figura 4.73. Variaia gradului de extracie (a) i a selectivitii (b) la extracia
acizilor carboxilici cu Amberlite LA-2 n acetat de butil [303]

150
La obinerea acidului lactic prin fermentare, n mediul de cultur se pot aduga o
serie de acizi organici, cu scopul creterii productivitii tulpinii. Aceti acizi (citric,
acetic) trebuie separai de acidul lactic din lichidul final de fermentaie. A fost studiat
extracia reactiv selectiv a acizilor acetic i lactic cu un extractani fosfinoxidici i
aminici comerciali (Cyanex 923, respectiv Hostarex A 327) n acetat de butil i kerosen.
Acidul citric a fost extras doar ntr-o proporie redus (55% cu Cyanex 923, 75% cu
Hostarex A 327). Reextracia s-a realizat cu HCl, procesul fiind selectiv pentru acidul
lactic. Randamentul global de separare al acidului lactic a fost modest: 22% cu Cyanex
923, respectiv 37% cu Hostarex A 327 [304].
Extracia selectiv a acidului
succinic din lichidul de fermentaie care
conine i ali acizi carboxilici se poate
realiza cu eficien i selectivitate ridicat
folosind ca extractant TOA. Aceasta
extrage cu precdere acizii acetic, piruvic
i srurile acesora [305, 306]. Recent a
fost pus la punct un procedeu de
recuperare a acidului succinic produs de
un microorganism recombinant,
Mannheimia succiniciproducens, prin
extracie reactiv, distilare la vid i
cristalizare. Procedeul permite obinerea
de acid succinic 99,76% puritate cu un
randament global de 73,09% [307].
Separarea impurificatorilor (acid acetic,
acid piruvic) se realizeaz prin extracie
n mai multe etape cu TOA (0,25 mol/kg)
n 1-octanol la pH = 5, cnd coeficientul
de distribuie al acidului succinic este sub 0,1 (fig. 4.74). n tab. 4.23 este prezentat
compoziia fazei lichide n diverse etape ale procesului de extracie.

Tabelul 4.23. Evoluia compoziiei fazei lichide n procesul de extracie [308]
Dup etapa de extracie
Component
Lichidul de
fermentaie 1 2 3
Acid succinic 32,2 34,8 35,2 35,6
Acid maleic 2,3 0,3 0,3 0,3
Acid acetic 2,6 1,6 1,4 1,1
Acid piruvic 10,1 8,0 7,1 6,6
Acid fumaric 1,2 0,1 0,1 0,1
Glucoz 49,4 53,6 54,3 54,9
Alte componente 2,2 1,7 1,6 1,4
Total SU 100,00 100,00 100,00 100,00
Not: Compoziia exte exprimat n procente masice de component raportat la total substan uscat (SU)

Dei exist numeroase eforturi pentru dezvoltarea tehnologiilor de extracie
reactiv a acizilor carboxilici, fiind patentate zeci de variante, la scar industrial este
cert aplicarea unui singur procedeu, extracia acidului citric cu o amin teriar, urmat
de reextracie cu ap la temperatur ridicat [309].
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t

d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

K
N
pH
Acid succinic
Acid piruvic
Acid acetic

Figura 4.74. Efectul pH-ului asupra
coeficientului de distribuie al acizilor
carboxilici [308]
(extractant: 0,25 mol/kg TOA n 1-octanol la 25 C;
concentraia iniial a acizilor n lichidul de
fermentaie: acid succinic 22,3 g/L; acid piruvic
7,0 g/L, acid acetic 1,8 g/L)

151
4.5.4.2. Extracia aminoacizilor

Aminoacizii, care sunt componenii structurali de baz ai proteinelor i enzimelor,
se pot obine prin biosintez sau prin hidroliza proteinelor. Ca i n cazul altor produse
de biosintez, problema dificil o reprezint separarea aminoacizilor din lichidul de
fermentaie sau din hidrolizatul proteic.
Cei 20 de aminoacizi eseniali, care se gsesc n proteinele naturale, pot fi
clasificai n funcie de polaritatea radicalului R pe care sunt grefate gruprile amino i
carboxil n aminoacizi: (i) cu radical R alifatic nepolar; (ii) cu radical R aromatic; (iii)
cu radical R polar, neutru electric; (iv) cu radical R polar, ncrcat pozitiv; (v) cu radical
R polar, ncrcat negativ. n tab. 4.24 sunt prezentate cteva dintre proprietile
aminoacizilor eseniali [310].

Tabelul 4.24. Clasificarea i unele proprieti ale aminoacizilor eseniali [310]
Valori pK
a

Aminoacid Abreviere Simbol
pK
1

(COOH)
pK
2

(NH
3
+
)
pK
R
(R)

pI
Indice
hidro-
patic
*

(i) Cu radical R alifatic nepolar
Glicin Gly G 2,34 9,0 5,97 -0,4
Alanin Ala A 2,34 9,69 6,01 1,8
Prolin Pro P 1,99 10,96 6,48 1,6
Valin Val V 2,32 9,62 5,97 4,2
Leucin Leu L 2,36 9,60 5,98 3,8
Izoleucin Ile I 2,36 9,68 6,02 4,5
Metionin Met M 2,28 9,21 5,74 1,9
(ii) Cu radical R aromatic
Fenilalanin Phe F 1,83 9,13 5,48 2,8
Tirozin Tyr Y 2,20 9,11 10,07 5,66 -1,3
Triptofan Trp W 2,38 9,39 5,89 -0,9
(iii) Cu radical R polar, neutru electric
Serin Ser S 2,21 9,15 5,68 -0,8
Treonin Thr T 2,11 9,62 5,87 -0,7
Cistein Cys C 1,96 10,28 8,18 5,07 2,5
Asparagin Asn N 2,02 8,80 5,41 -3,5
Glutamin Gln Q 2,17 9,13 5,65 -3,5
(iv) Cu radical R polar, ncrcat pozitiv
Lizin Lys K 2,18 8,95 10,53 9,74 -3,9
Histidin His H 1,82 9,17 6,00 7,59 -3,2
Arginin Arg R 2,17 9,04 12,48 10,76 -4,5
(v) Cu radical R polar, ncrcat negativ
Aspartat Asp D 1,88 9,60 3,65 2,77 -3,5
Glutamat Glu E 2,19 9,67 4,25 3,22 -3,5
* - pe o scal care combin hidrofobicitatea i hidrofilicitatea gruprilor R; poate fi utilizat pentru
msurarea tendinei unui aminoacid de a trece ntr-un mediu apos (valori negative) sau unul hidrofob
(valori pozitive)

Datorit structurii lor amfionice, aminoacizii se gsesc n soluie apoas sub
diferite forme ionice (cation, amfion, anion), n funcie de valoarea pH-ului (fig. 4.75).
Extracia acestor compui nu poate fi realizat dect prin utilizarea unor extractani, cei

152
mai utilizai fiind derivaii acizilor organofosforici [311], aminele cu mas molecular
mare [92, 301], eterii-coroan [312 - 314].
R CH COOH R CH COO
-
R CH COO
-
NH
3
+
NH
3
+
NH
2
cation amfion anion
pH

Figura 4.75. Structuri ionice ale aminoacizilor n funcie de pH-ul soluiei apoase

4.5.4.2.1. Extracia aminoacizilor cu derivai organofosforici

La extracia aminoacizilor cu D2EHPA, n sistem se stabilete urmtorul echilibru
interfacial, extracia decurgnd prin schimb ionic [311]:
] [ ] [
3 ] [ ] [ 3
) ( ) ( aq org
org aq
H X NH COOH CH R HX NH COOH CH R
+ + +
+ + (4.47)
Dac aminoacidul este bazic, la valori pH sczute el exist ca dianion, astfel nct
echilibrul de extracie se poate scrie:

] [
] [ 2 3
] [ ] [ 3
2 ] [ ] ) ( [
2 ) (
aq
org
org aq
H X NH COOH CH R
HX NH COOH CH R
+ + +
+ +
+
+
(4.48)
Separarea aminoacizilor cu D2EHPA este posibil doar dac acetia se gsesc n
faza apoas n form cationic. Acest lucru este posibil doar la valori pH mai mici dect
valoarea pH-ului izoelectric. O valoare prea mic a pH-ului conduce ns la protonarea
extractantului, acesta nemaiputnd lega cationul aminoacidului. Ca urmare, va exista un
domeniu optim de pH pentru extracia aminoacizilor. Acest domeniu, n care gradul de
extracie este maxim, este redat, pentru civa aminoacizi, n diagramele din fig. 4.76.
n afar de valoarea pH-ului, extracia aminoacizilor este influenat i de
concentraia extractantului, a substanelor tensioactive existente n sistem, de
intensitatea amestecrii etc.
Att n cazul biosintezei, ct i n cazul hidrolizei proteinelor, se obin amestecuri
de aminoacizi, a cror separare este mai dificil. La biosinteza fenilalaninei se formeaz
i triptofan, a crui comportare este similar cu cea a fenilalaninei. Prezena
triptofanului n masa de reacie determin reducerea coeficientului de distribuie al
fenilalaninei, comparativ cu extracia din sisteme pure [4]. Cercetri experimentale au
artat c separarea selectiv a aminoacizilor din amestecuri, este posibil doar pentru
grupe de aminoacizi. Se pot separa aminoacizii n funcie de aciditatea acestora, prin
extracie cu D2EHPA, la diverse valori ale pH-ului fazei apoase (fig.4.77). ntruct
gradul de extracie ntr-o singur treapt este redus, este necesar utilizarea mai multor
trepte de extracie (tab. 4.25).
n procesele de fabricare industrial a aminoacizilor, extracia reactiv nu s-a
impus deocamdat. Sunt folosite cu precdere procesele de separare bazate pe schimb
ionic (cromatografie de schimb ionic, cromatografie de excluziune) urmate de
cristalizare [315].

153
pH faz apoas
G
r
a
d

d
e
e
x
t
r
a
c
i
e
[
%

m
a
s
i
c
e
]
Glicin
Alanin
Triptofan
Histidin
Lizin
Arginin
Cistein Acid aspartic
Acid glutamic

Figura 4.76. Efectul valorii pH-ului soluiei apoase asupra gradului de extracie al
aminoacizilor cu D2EHPA n acetat de butil [316]

Tabelul 4.25. Condiii de separare selectiv a unor grupe de aminoacizi din amestec
prin extracie reactiv cu D2EHPA n acetat de butil [316]
Grupa de aminoacizi extrai Interval de pH
Grad de extracie ntr-o
treapt [% masice]
Numr de
trepte necesar
Aminoacizi neutri* 5,0 5,5 20 25 9
Aminoacizi bazici** 4,0 4,5 18 25 10
Histidin 3,0 3,5 40 5
Aminoacizi acizi 2,0 2,5 60 63 3
* - fr cistein; ** - cu cistein, fr histidin

154
SOLUIE DE AMINOACIZI
Extracie reactiv
pH = 5,0 5,5
Extracie reactiv
pH = 4,0 4,5
Extracie reactiv
pH = 3,0 3,5
Extracie reactiv
pH = 2,0 2,5
Acetat de butil
+ D2EHPA
Aminoacizi neutri:
Gly, Ala, Trp
Acetat de butil
+ D2EHPA
Aminoacizi bazici:
Arg, Lys
+ Cys
Acetat de butil
+ D2EHPA
Acetat de butil
+ D2EHPA
Histidin
Aminoacizi acizi:
Asp, Glu

Figura 4.77. Schem de principiu pentru extracia selectiv a aminoacizilor dintr-un
amestec cu D2EHPA n acetat de butil [316]

Pentru o serie de extractani acizi dizolvai n toluen, capacitatea de extracie
scade n ordinea:
arginin > fenilalanin > alanin > glicin > acid aspartic
cu observaia c la valori pH sczute, la extracia cu D2EHPA i D2EHPA(S) se
inverseaz ordinea nre arginin i fenilalanin. Capacitatea de extracie a extractanilor
scade n ordinea:
DNNSA
1
> D2EHPA(S) > D2EHPA > Versatic 10
adic n ordinea invers a valorilor constantelor lor de disociere, pK
a
[317].

4.5.4.2.2. Extracia aminoacizilor cu amine

n cazul extraciei cu amine, la interfa se formeaz perechi ionice hidrofobe,
ntre aminoacidul protonat, un anion din faza apoas i extractantul din faza organic:
] [ 3 ] [
] [
] [ 3
) ( ) (
org org
aq
aq
Q COOH A NH CH R Q A COOH NH CH R + +
+ +
(4.49)
Pentru ca aminoacidul s fie protonat, trebuie ca pH-ul fazei apoase s fie mai mic dect
pH-ul punctului izoelectric (pI) al aminoacidului respectiv.
Reextracia aminoacidului i regenerarea aminei se realizeaz prin tratarea fazei
organice cu o soluie de carbonat de sodiu.

1
DNNSA acid dinonilnaftalensulfonic; D2EHPA(S) acid di(2-etilhexil)monotiofosforic; D2EHPA
acid di(2-etilhexil)fosforic; Versatic 10 acid neodecanoic, R
1
R
2
CH
3
COOH

155
Cnd extracia are loc cu sruri de amoniu, aminoacidul trebuie s se gseasc sub
form anionic. Acest lucru se ntmpl atunci cnd pH-ul fazei apoase este mai mare
dect pH-ul punctului izoelectric (pI) al aminoacidului respectiv. n aceste condiii, n
sistem se stabilesc urmtoarele echilibre:
- disocierea aminoacidului n faza apoas:
] [
2 2
] [
] [ 2
) ( ) ( aq aq
aq
COO NH CH R O H HO COOH NH CH R

+ + (4.50)
- extracia reactiv a anionului aminoacidului printr-o reacie de schimb ionic la
interfa:
] [ ] [
2 ] [
] [
2
) ( ) ( aq org
org
aq X Q COO NH CH R QX COO NH CH R
+
+ + (4.51)
- coextracia anionului OH
-
sau a altui anion mineral (clorur, sulfat, fosfat etc.)
prezent n soluia apoas:
] [ ] [
] [
] [ aq org
org
aq X HO Q QX HO
+
+ + (4.52)
] [ ] [
] [
] [ aq org
n
n org
aq
n
X M Q nQX M
+
+ + (4.53)
Reextracia aminoacidului se realizeaz prin tratarea fazei organice cu o soluie
apoas de acid clorhidric.
Concentraia ionilor de hidrogen din faza apoas este hotrtoare pentru eficiena
extraciei, aceasta determinnd forma ionic a aminoacidului. Astfel, acidul glutamic (pI
= 3,22) poate fi extras cu amina secundar Amberlite LA-2 doar la pH < 3,22, n timp
ce acidul aspartic (pI = 2,77) poate fi extras cu o sare cuaternar de amoniu doar la pH >
2,77. Se poate constata faptul c la pH = pI extracia aminoacizilor cu amine sau sruri
cuaternare de amoniu nu este posibil (fig. 4.78).
La extracia aminoacizilor cu sruri
cuaternare de amoniu, la valori ridicate ale
pH-ului fazei apoase, este posibil extracia n
paralel a anionilor existeni n lichidul de
fermentaie (sulfat, fosfat, carbonat), lucru
care poate duce la reducerea eficienei
extraciei. Chiar dac aceti anioni sunt
ndeprtai din lichidul de fermentaie anterior
extraciei, coextracia ionului OH
-
nu poate fi
evitat.
Pentru separarea aminoacizilor sau a
srurilor acestora din lichidul de fermentaie
se pot utiliza extractani acido-bazici cuplai,
aa-numiii extractani ABC, alctuii dintr-un
schimbtor de cationi lichid (uzual un derivat
organic al acidului fosforic) i un schimbtor
de anioni lichid (o amin cu mas molecular
mare), care acioneaz simultan. Aceti ageni
de extracie, utilizai iniial pentru recuperarea unor sruri minerale (MgCl
2
, ZnSO
4
,
LiCl etc.) din soluii apoase [318, 319], au fost propui ulterior i pentru recuperarea
acizilor minerali tari [320] i a acizilor carboxilici [321].
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14
pH
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]
pI = 6
amina
sare cuaternara de amoniu

Figura 4.78. Influena pH-ului fazei
apoase asupra gradului de extracie
al aminoacizilor

156
De exemplu, valina se poate extrage dintr-o soluie apoas avnd iniial 70 g/L
aminoacid folosind ca extractant ABC un amestec coninnd 0,5 mol/L Alamin 336,
0,5 mol/L D2EHPA i 30% octanol ntr-un solvent organic. Extracia se realizeaz la
temperatura ambiant, cu un raport [aq] : [org] = 5 : 1. Dup 7 trepte de extracie, gradul
de recuperare al valinei este de peste 90%, obinndu-se un extract organic cu 13,1 g/L
valin. De aici aminoacidul se reextrage cu ap, la temperatur ambiant, folosind un
raport [aq] : [org] = 1 : 2,3. Dup 5 trepte de extracie, aminoacidul se extrage practic
cantitativ, rezultnd o soluie apoas cu 30 g/L valin. n mod similar se pot extrage i
ali aminoacizi, dar i sruri ale acestora, cum ar fi clorhidratul de lizin sau
monoglutamatul de sodiu [322].

4.5.4.2.3. Extracia aminoacizilor cu eteri-coroan i calixarene

Eterii-coroan pot extrage aminoacizii din soluii apoase acide (pH < pI), n care
acetia se gsesc sub form cationic. Procesul de extracie are loc prin mecanismul
perechilor ionice [cationul aminoacidului se cupleaz cu un contraion (A
-
)] n
conformitate cu urmtorul mecanism [4]:
- transferul extractantului (eterul-coroan CR) n faza apoas:
] [ ] [

aq org
CR CR (4.54)
- reacia extractantului cu cationul aminoacidului, n faza apoas:

] [ 3 ] [ ] [ 3
) ( ) (
aq aq aq
CR NH COOH CH R CR NH COOH CH R +
+ +
(4.55)
- reacia complexului cationic cu contraionul, n faza apoas:

] [ 3
] [
] [ 3
) ( ) (
aq
aq
aq
CR A NH COOH CH R A CR NH COOH CH R +
+ +
(4.56)
- transferul perechii ionice complex cationic contraion n faza organic:

] [ 3 ] [ 3
) ( ) (
org aq
CR A NH COOH CH R CR A NH COOH CH R
+ +
(4.57)
Acidul HA care trebuie s furnizeze contraionul A
-
este ales astfel nct valoarea
pK
a
s fie apropiat de cea a aminoacidului. Procesul global de extracie poate fi descris
de ecuaia:
] [ 3
] [
] [ ] [ 3
) (
) (
org
aq
org aq
CR A NH COOH CH R
A CR NH COOH CH R

+ +
+
+
(4.58)
constanta de extracie fiind dat de expresia:

[ ]
[ ] [ ] [ ]
] [
] [
] [ 3
] [ 3
) (
) (
org
aq
aq
org
ex
CR A NH COOH CH R
CR A NH COOH CH R
K

=
+
+
(4.59)
Pentru extracia unor aminoacizi cu eter 18-coroan-6 n 1,2-dicloretan, valorile
K
ex
sunt redate n tab. 4.26. Compoziia molar a complexului extras este de 1 : 1 : 1
(cation : extractant : anion). Constanta de extracie depinde de masa molecular a
aminoacidului (cu ct acesta este mai hidrofob, cu att K
ex
este mai mare); dependena
nu este suficient de puternic pentru a realiza separarea selectiv a aminoacizilor. O
separare selectiv se poate realiza prin modificarea pH-ului fazei apoase.

157
Tabelul 4.26. Constantele de extracie ale unor aminoacizi cu eter 18-coroan-6 n
1,2-dicloretan [4]
Aminoacid lg K
ex
Aminoacid lg K
ex

D,L triptofan 5,01 L-izoleucin 4,90
L leucin 5,78 L valin 4,34
L fenilalanin 5,12 L -alanin 4,34
L metionin 4,62 L cistein 3,24

Tot din soluii apoase acide se pot extrage la temperatura camerei la pH = 1,5
4,0 triptofanul, glicina, alanina, leucina, iar la pH = 1,5 5,5 lizina i arginina, folosind
ca extractant eterul diciclohexil-18-coroan-6 dizolvat ntr-un lichid ionic, BmimPF
6

(hexafluorofosfat de 1-butil-3-metilimidazoliu). Eficiena extraciei este de 92 96%,
att pentru aminoacizii hidrofili, ct i pentru cei mai puini hidrofili. Raportul molar
ntre aminoacid i eterul-coroan n complexul format este de 1:1 n cazul aminoacizilor
monocarboxilici i de 1:2 n cazul aminoacizilor dicarboxilici. Procesul este influenat
de Ph, concentraia aminoacizilor, concentraia eterului-coroan, precum i de raportul
fazic [aq]:[org]. Sistemul de extracie a fost testat cu succes i pentru recuperarea
aminoacizilor din lichidul de fermentaie [323].
Pentru separarea unor produse de biosintez au fost sintetizai extractani din clasa
polisiloxanilor pe care au fost grefai eteri-coroan. Aceti derivai au fost utilizai
pentru extracia selectiv a compuilor care conin grupri aminice protonate, din
amestecuri de amine secundare i teriare (separarea norcodeinei) [4].
Derivaii guanidinici biciclici cu grupare puternic hidrofob silil-eter, pe care se
grefeaz eteri-triaza-coroan, dizolvai n diclor metan prezint o capacitate sporit de
complexare i extracie pentru fenilalanin, triptofan, leucin i glicin, permind
separarea acestora de serin, lizin i acid glutamic (fig. 4.79) [324].
18.6
9.8
2.6
0.25 0.1 0.1 0.1
64.4
41.6
44.6
22.5
0.9
0.2 0.1
0
20
40
60
80
100
Phe Trp Leu Gly Ser Lys Glu
Aminoacizi
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]
1 2

Figura 4.79. Extracia aminoacizilor cu derivai guanidinici [324]

158
Tot pentru extracia aminoacizilor nepolari au fost sintetizai extractani alctuii
din dou subuniti: una pe baz de eter-coroan pentru legarea ionului amoniu, alta pe
baz de derivat de uree, pentru legarea gruprii carboxil (fig. 4.80 a). Un astfel de
extractant dizolvat n cloroform extrage aminoacizii nepolari n ordinea:
Phe > Ile > Leu > Val > Ala
extracia aminoacizilor polari (Ser, Asp, His, Tyr) fiind practic neglijabil n acest
sistem [325].
N
+
N
H
O
N
H
PF
6
a b
Figura 4.80. Extractani sinergetici pentru aminoacizi nepolari:
a pe baz de eter-coroan i derivat de uree [325]; b pe baz de eter-coroan i
porfirinai de lantanide [326]

Extractani similari (fig. 4.80 b 1,2,3) au fost obinui i din porfirinai ai
lantanidelor (fig. 4.80 b 4,5,6) grefai pe derivai de eteri benzo-18-coroan-6 (fig. 4.80
b 7). Acetia dizolvai n diclormetan pot extrage aminoacizii din soluii apoase neutre
cu o eficien dubl fa de derivatul porfirinic simplu sau fa de amestecul fizic derivat
porfirinic eter-coroan (fig. 4.81).
Studii recente au artat c derivaii calixarenelor sunt extractani selectivi pentru
aminoacizi i derivaii acestora. ntre cationul amoniu al aminoacidului i atomii de
oxigen ai moleculei gazd se realizeaz un complex 1:1 care trece apoi uor n faza
organic. Includerea moleculei oaspete de aminoacid n cavitatea calixarenei provoac
asimetrizarea moleculei gazd. Pentru extracia unui ester al triptofanului s-a utilizat
un derivat carboxilic al unei calix[6]arene, reextracia realizndu-se ntr-o soluie apoas
acid [327]. Calix[6]arenele au o capacitate de extracie superioar derivailor

159
organofosforici, cum ar fi D2EHPA, aceasta depinznd de structura calixarenei i de
diametrul cavitii acesteia, de numrul gruprilor carboxilice i de natura radicalului
alchilic. Proprietile moleculei oaspete, hidrofobicitatea n mod special, influeneaz
de asemenea procesul de extracie [328]. Calix[4]arenele i p-ter-butil-calix[4]arenele
substituite cu fenil-etil-amin au proprieti extractante pentru esterii metilici ai unor
-aminoacizi, ct i pentru unele -amine chirale [329].

G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]

Figura 4.81. Extracia aminoacizilor cu extractani sinergetici eter-coroan
porfirinat de lantanide [326]
Condiii de lucru: faza apoas = 125 nmol aminoacid n 2,5 mL ap (pH = 5,9 6,2); faza organic =
125 nmol extractant n 10 mL CH
2
Cl
2

4.5.4.3. Extracia antibioticelor

Aa cum s-a precizat n paragraful
4.1.3.1., separarea penicilinelor de
biosintez din lichidul de fermentaie se
realizeaz prin extracie fizic cu acetat
de butil. Datorit polaritii reduse a
solventului, penicilina trebuie s se
gseasc n stare nedisociat, pentru ca
gradul de extracie s fie maxim. Acest
lucru se ntmpl la pH < 2, valoare la
care viteza de inactivare a penicilinelor
este foarte ridicat. n aceste condiii,
extracia reactiv apare ca o soluie fiabil
de separare a penicilinelor i a
antibioticelor -lactamice n general. La
extracia cu Amberlite LA-2, gradul de
extracie al penicilinelor G i V este de 97
0
20
40
60
80
100
2 3 4 5 6 7 8
pH
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]
Extractie fizica
peniciline G si V
Extractie reactiva
penicilina G
Extractie reactiva
penicilina V

Figura 4.82. Influena valorii pH-ului fazei
apoase asupra gradului de extracie al
penicilinelor [4]

160
98% chiar i la valori pH = 5 n faza apoas (fig. 4.82). La acest pH, timpul de
semiinactivare a penicilinei G este de 92 ore, pericolul degradrii chimice fiind practic
ndeprtat [4].
La extracia reactiv, la interfa, se stabilete urmtorul echilibru ntre penicilina
din faza apoas i amina din faza organic:

] [ ] [
] [ ] [
org org
aq aq A COOH P A H COO P + +
+
(4.60)
Din cauza structurii voluminoase pe care o au att penicilinele, ct i extractantul,
n complexul rezultat n urma reaciei (4.60) ele se vor gsi n raport molar de 1:1 [4].
Extracia reactiv a penicilinelor cu amine este influenat de valoarea pH-ului
fazei apoase iniiale, concentraia iniial a extractantului, concentraia iniial a
antibioticului, timpul de contact, raportul volumic [aq]:[org]. Gradul de extracie
depinde puternic de structura antibioticului extras, n special datorit solubilitii
acestuia, aa cum reiese din tab. 4.27.

Tabelul 4.27. Gradul de extracie al unor antibiotice -lactamice la extracia reactiv
cu TOA n cloroform [33]
Gradul de extracie [%]
Antibiotic
0,01 mol/L TOA 0,1 mol/L TOA
Benzilpenicilina 92,0 92,1
Cloxacilina 96,8 96,2
Dicloxacilina 98,9 99,1
Ampicilina 23,1 71,3
Meticilina 94,6 98,5
Carbenicilina 84,4 66,8
Amoxicilina 0,5 1,4
Epicilina 22,4 66,8
Bayercilina 98,3 97,6
Fenoximetilpenicilina 98,4 98,3
Clometacilina 97,8 98,8
Oxacilina 99,0 100

Reextracia se realizeaz n soluii apoase de carbonat sau fosfat de sodiu sau
potasiu. La reextracia cu carbonat de sodiu, de ex., are loc urmtorul proces:
O H CO A Na COO P CO Na A COOH P
org
aq
aq org 2 2 ] [
] [
] [ 3 2 ] [
2 2 + + + +
+
(4.61)
n general, reextracia decurge cu randamente mari i fr degradare antibioticelor
la pH neutru. La reextracia penicilinei G, la valori pH = 7,2 7,5, pierderile totale de
antibiotic, att n etapa de extracie reactiv cu Amberlite LA-2, ct i n etapa de
reextracie, nu au depit 0,3% [331, 332]. Un agent de extracie mai performant s-a
dovedit a fi DITDA (di-izo-tridecilamina) n butanol; gradul de extracie al penicilinei G
este de 95% (la pH = 5), iar gradul de reextracie (la pH = 8,5) este aproape 100%. n
plus, DITDA este de 20 de ori mai ieftin dect Amberlite LA-2 [301]. ntruct aceti
extractani aminici sunt toxici pentru celule, ei nu pot fi utilizai pentru extracia in situ.
La extracia reactiv a antibioticelor cu sruri cuaternare de amoniu, are loc la
interfa o reacie de schimb ionic:
] [
] [ 4
] [ ] [
4
aq
org
aq org Cl NR COO P COO P Cl NR
+ +
+ + (4.62)

161
Reextracia se poate realiza cu o soluie apoas de acid clorhidric:

+ + +
+ + +
] [ 4 ] [
] [
] [ ] [ 4

org aq
aq
aq org
Cl NR H COO P HCl NR COO P (4.63)
n medii neutre, echilibrul reaciei (4.62) este independent de pH. Aceast
independen de pH are i o serie de inconveniente; dac valoarea constantei de
echilibru este mare, reextracia decurge dificil, ea neputnd fi mbuntit prin
modificarea pH-ului, ci numai printr-o reacie care s ndeprteze ionul P-COO
-
din
sistem [301].
La extracia cu TOMAC n kerosen a mai multor antibiotice (teicoplanin,
rifampicin, chitasamicin, penicilin G) s-a constatat c gradul de extracie crete cu
creterea pH-ului (la pH > pK) i c viteza extraciei este cu circa dou ordine de
mrime mai mare dect viteza procesului de reextracie, n ambele cazuri determinant
de vitez fiind difuziunea prin faza organic. La concentraii mari de antibiotic sau de
extractant, determinant de vitez devine reacia care decurge la interfa [333].
La extracia antibioticelor din clasa cefalosporinelor cu Aliquat 336 n diveri
solveni s-a constatat c valorile constantei de echilibru ale reaciei (4.62) se coreleaz
bine cu hidrofobicitatea antibioticelor i cu dipol-momentul solvenilor. Constanta de
echilibru a reaciei de reextracie a cefalosporinelor (4.63) este mai mare dect valorile
aceleiai constante pentru co-extracia ionilor tampon, existnd astfel posibilitatea
separrii selective a antibioticelor [334]. Cefalosporina C poate fi extras cu clorur de
tri-n-octilamoniu n acetat de butil. Pentru a evita descompunerea antibioticului,
reextracia se realizeaz cu o soluie tampon de carbonat [335].
Srurile cuaternare de amoniu sunt extractani mai eficieni pentru antibiotice
dect aminele secundare sau teriare. La extracia unor compui cu structur tiazolidin-
-lactamic (acid olivanic, acid clavulanic, penicilin V, amoxicilin, acid fenoxiacetic),
eficiena extraciei crete n ordinea extractanilor:
Amberlite LA-2 clorhidrat < Alamine 336 clorhidrat << Aliquat 336
i n ordinea solvenilor:
1-butanol < tributilfosfat < hexan < dietileter < diclormetan < acetat de butil
Cel mai eficient sistem de extracie este format din Aliquat 336 n acetat de butil,
gradul de extracie realizat fiind de peste 98,6 % [336]. Acest sistem de extracie s-a
dovedit a fi foarte performant i pentru extracia acidului 6-aminopenicilanic, compus
care reprezint nucleul activ al tuturor penicilinelor substituite [337, 338].
O sare cuaternar de amoniu cu comportare aparte este sulfatul acid de
tetrabutilamoniu (TBAHSO
4
). Acest extractant este solubil n faza apoas, echilibrul
extraciei reactive stabilindu-se n aceast faz:
] [ ] [ ] [ org aq aq TBA COO P COO P TBA
+ +
+ (4.64)
Utiliznd TBAHSO
4
exist posibilitatea separrii penicilinei V de acidul
fenoxiacetic, un precursor al biosintezei acesteia (fig. 4.83), sau a altor antibiotice
dintr-un amestec. Gradul de extracie al penicilinei V cu TBAHSO
4
variaz foarte mult
cu natura solventului (fig. 4.84).


162
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]
cu extractant
fara extractant

33
76.7
77.7
81.6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hexan Acetat de
amil
1-octanol Diclormetan
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
t
i
e

[
%
]
apoase asupra gradului de extracie a
acidului fenoxiacetic cu TBAHSO
4
n
diclormetan [336]
Figura 4.84. Influena solventului asupra
gradului de extraie a penicilinei V cu
TBAHSO
4
[336]

4.5.4.4. Alte aplicaii ale extraciei reactive

Dei deocamdat fr aplicaii la nivel industrial, n literatura de specialitate sunt
semnalate i alte aplicaii ale extraciei reactive pentru separarea unor compui naturali
sau obinui prin biosintez. De asemenea, extracia reactiv poate fi utilizat pentru
ndeprtarea din ap a unor poluani, cum ar fi, de exemplu, fenolii.

4.5.4.4.1. Extracia acizilor organici din produse naturale

Acidul gluconic se gsete n fructe, miere i vin, fiind utilizat ca aditiv alimentar
i regulator de aciditate. n soluie apoas se afl n echilibru cu un ester ciclic,
D-glucono--lactona (fig. 4.85).
acid gluconic
D-glucono--lactona

Figura 4.85. Echilibrul acid gluconic glucono -lactona n faz apoas [339]

163
Este un agent chelatizant puternic n mediu alcalin, n special pentru Ca
2+
, Fe
3+
,
Al
3+
, Cu
2+
; pe baza acestei proprieti este utilizat ca ingredient n produsele de curire,
pentru ndeprtarea depunerilor anorganice [339].
La extracia acidului gluconic din soluii apoase cu Alamine 336 n diferii
solveni, s-a constatat c gradul de extracie crete cu creterea concentraiei iniiale a
aminei n faza organic, iar eficiena solvenilor crete n ordinea:
ciclohexan < hexan < toluen < propanol < metil-izobutil-ceton
Extracia are loc prin mecanismul formrii perechilor de ioni, polaritatea
solventului favoriznd solvatarea complexului n faza organic [340].
Acidul cinamic este un compus natural derivat din fenilalanin, care se gsete n
scorioar, rina arborelui Liquidambar, balsamul de Peru, storax, untul de shea
(Vittelaria paradoxa) etc. [341]. Poate fi obinut prin extracie din produse vegetale,
prin sintez chimic sau prin biosintez [342, 343]. Este utilizat n obinerea
aromatizanilor, a indigoului sintetic i a anumitor produse farmaceutice. Principala sa
utilizare este ns n parfumerie, unde este folosit sub form de esteri (metilic, etilic,
benzilic) [343]. Dintre izomeri, izomerul trans (fig. 4.86) este cel care se ntlnete
frecvent i care are cea mai ridicat activitate biologic.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
E
x
t
r
a
c
t
i
o
n

d
e
g
r
e
e
,

%
Concentration of Amberlite LA-2, g l
-1
Concentraia extractantului Amberlite LA-2 [g/L]
G
r
a
d
u
l

d
e

e
x
t
r
a
c
i
e

[
%
]
durata extraciei = 60 secunde
Figura 4.86. Structura acidului
trans-cinamic
Figura 4.87. Influena concentraiei
extractantului asupra gradului de
extracie a acidului cinamic [342]

Din soluii apoase, acidul cinamic poate fi extras cu Amberlite LA-2 n n-heptan,
un solvent care nu este toxic pentru microorganismele implicate n biosintez, existnd
astfel posibilitatea realizrii extraciei reactive in situ. Cercetrile efectuate [342] au
artat c gradul de extracie crete cu creterea concentraiei iniiale a extractantului de
la 0 la 25 g/L. La concentraii de extractant ntre 25 60 g/L, gradul de extracie rmne
constant (80%), pentru o concentraie iniial a acidului cinamic n faza apoas de 0,2
g/L (fig. 4.87). ntre amin i acid se formeaz un complex stoichiometric 1:1, reacia
fiind foarte rapid, determinante de vitez fiind procesele difuzionale.


164
4.5.4.4.2. Extracia vitaminelor

Vitaminele sunt compui organici eseniali care fie nu sunt sintetizai de ctre
organismul uman sau animal, fie sunt produi doar n cantiti insuficiente [344], avnd
un rol vital n reglarea proceselor metabolice i a activitii celulare. La separarea prin
extracie reactiv se preteaz vitaminele hidrosolubile, cu caracter acid. Acestea se
comport la extracie similar cu acizii carboxilici.
Vitamina B
3
, cunoscut i ca vitamina PP, niacin, niacinamid, hexaniacinat,
corespunde compuilor nicotinamid i acid nicotinic (fig. 4.88). Se gsete n diverse
produse de origine vegetal i animal, cantiti mari aflndu-se n alunele de pmnt
prjite (22,10 mg/100 g), orz (5,4 g/100 g), nap alb (5,40 g/100 g), seminele de floarea-
soarelui (4,50 g/100 g), migdale (4,40 g/100 g), fin de gru (4,3 g/100 g), orez (4,10
g/100 g) [345].

acid nicotinic nicotinamid
Figura 4.88. Componenii vitaminei B
3

Se poate obine prin oxidarea enzimatic a 5-etil-2-metilpiridinei sau prin
hidroliza total a 3-cianopiridinei, ambele procese decurgnd sub aciunea nitrilazei
bacteriene. Peste 60% din producia mondial este destinat mbuntirii hranei
psrilor, porcinelor, rumegtoarelor, petilor i animalelor de companie, restul
utilizndu-se n preparate multivitaminice, cereale pentru micul dejun, buturi
rcoritoare [346].

Concentraia iniial a acidului nicotinic [kmol/m
3
]
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l

d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

K
D
=

C
[
o
r
g
]
/
C
[
a
q
]

Concentraia iniial a TBP [% v/v]
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l

d
e

d
i
s
t
r
i
b
u
i
e
,

K
D
=

C
[
o
r
g
]
/
C
[
a
q
]
Concentraia iniial a
acidului nicotinic = 0,105 kmol/m
3

Figura 4.89. Distribuia acidului
nicotinic ntre ap i diferii solveni
organici [347]
Figura 4.90. Influena concentraiei
iniiale a extractantului i a solventului
asupra extraciei acidului nicotinic [347]

165
Acidul nicotinic poate fi recuperat din faza apoas fie prin extracie fizic, fie prin
extracie reactiv. Extracia fizic decurge cu rezultate modeste, cei mai buni solveni
dovedindu-se 1-octanolul i metil-izobutil-cetona (fig. 4.89). Ca agent de extracie
reactiv se poate utiliza TBP ca atare sau dizolvat n diferii solveni organici. Gradul
maxim de extracie se obine cu TBP pur; cel mai indicat solvent pentru TBP este metil-
izobutil-cetona (fig. 4.90). Solventul se regenereaz prin stripare cu un volum redus de
soluie alcalin [347].
Vitamina B
9
sau acidul folic a fost descoperit n anii 1930, fiind izolat din
frunzele de spanac n 1941 i ulterior sintetizat n 1946 [345, 348, 349]. n structura
acesteia i a celorlali acizi folici exist un rest pteridinic i un rest de acid glutamic
grefate pe acidul p-aminobenzoic (fig. 4.91).
Pteridin
Acid glutamic
Acid p-aminobenzoic

Figura 4.91. Structura acidului folic

Acidul folic este puin solubil n ap (8,5 g/100 mL la 20 C), stabil n mediu acid.
Se distruge rapid n soluii neutre sau alcaline, n prezena cldurii, luminii i a
compuilor cu sulf. Dei se poate obine prin extracie din produse vegetale (frunze de
spanac, cereale, lmi etc.), animale (ficat), sau prin biosintez cu ajutorul unor
microorganisme modificate genetic, singura metod economic de producie la scar
industrial o reprezint deocamdat sinteza chimic [350], cu toate c randamentul total
nu depete 40 50%, iar puritatea produsului este de 80% [345].
Separarea i purificarea acidului folic din lichidele de fermentaie implic filtrarea
biomasei i sorbia acidului pe anionii, dup o purificare prealabil a filtratului prin
tratamente termice i chimice. Eluia de pe schimbtorii de ioni se realizeaz cu soluii
de NaOH n condiii blnde, stabilitatea produsului fiind maxim n intervalul de pH = 4
12 [345]. La separarea prin extracie reactiv, utilizarea aminei secundare Amberlite
LA-2 permite obinerea unor valori ridicate ale gradului de extracie [351].
Vitamina C sau acidul ascorbic este una dintre cele mai cunoscute i mai studiate
vitamine. Acidul ascorbic are doi enantiomeri, activitate biologic avnd doar izomerul
levogir. Fiind un reductor puternic, se oxideaz foarte rapid transformndu-se n acid
dehidroascorbic (fig. 4.92).
Dei microorganismele, plantele i majoritatea animalelor au capacitatea de a
sintetiza vitamina C, primatele (inclusiv omul) i-au pierdut aceast abilitate [353].
Vitamina C, pe lng rolul su important pe care l are n nutriie, are i alte utilizri.
Din totalul de peste 80.000 tone produse anual, circa o treime se utilizeaz n industria

166
farmceutic (multivitamine, tablete, siropuri, comprimate efervescente etc.), restul
utilizndu-se n special n calitate de conservant n industria alimentar [354] sau n
industria cosmetic [345].
[O]
[H]

Figura 4.92. Forma redus (stnga) i oxidat (dreapta) a acidului ascorbic [352]

Vitamina C se obine prin extracie din diferite materii prime vegetale, prin sintez
chimic, prin biosintez sau prin procedee combinate de sintez chimic i biosintez
[354]. Indiferent de metoda de obinere, separarea i purificarea necesit numeroase
etape, care implic consumuri ridicate de materiale i energie. Soluia final din care
trebuie extras acidul ascorbic conine numeroase produse secundare, cel mai important
dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. n ciuda faptului c fiecare etap a procesului
decurge cu randamente de 90%, conversia global a glucozei n acid ascorbic nu
depete 60% [354, 355].
Studiile efectuate arat c la extracia acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 n
acetat de butil separarea decurge prin intermediul unei reacii interfaciale de ordinul I
ntre acid i extractant:
CO
C HO
C
C
C
HO
HO
CH
2
OH
H
H
O

+
HNR
1
R
2
(aq) (o)
(o)
CO
C HO
C
C
C
-
O
HO
CH
2
OH
H
H
O
R
2
R
1
H
2
N
+
[aq] [org] [org]

(4.65)
Procesul este controlat de concentraia extractantului n faza organic i de
valoarea pH-ului fazei apoase. Un grad de extracie de 90% se obine la o concentraie
iniial a extractantului de 160 g/L i un pH = 1 n faza apoas iniial [356]. Gradul de
extracie poate fi mbuntit cu 6 23% prin adugarea unui modificator de faz (2-
octanol), care mrete polaritatea solventului [357].
Modelarea matematic a procesului de extracie arat c eficiena extraciei este
influenat n proporie de 91,1% de ctre concentraia iniial a extractantului n faza
organic i de ctre pH-ul fazei apoase, ceilali factori (intensitatea amestecrii,
temperatura, raportul volumic al fazelor etc.) influennd procesul ntr-o mai mic
msur [358].

167
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
i
e

[
%
]
p
H C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
e

e
x
t
r
a
c
t
a
n
t

[
g
/
L
]

0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
E
x
t
r
a
c
t
i
o
n

d
e
g
r
e
e
,

%
pH
with 2-octanol
without 2-octanol
G
r
a
d

d
e

e
x
t
r
a
c
i
e

[
%
]
pH
cu 2-octanol
fr 2-octanol
C
LA-2
= 160 g/L

apoase i a concentraiei extractantului la
extracia reactiv a acidului ascorbic cu
Amberlite LA-2 n acetat de butil [358]
Figura 4.94. Influena adaosului de
modificator de faz asupra gradului
de extracie a acidului ascorbic cu
Amberlite LA-2 n acetat de butil [356]

4.5.4.4.3. Extracia selectiv a enantiomerilor

Foarte muli compui organici cu activitate biologic posed atomi de carbon
asimetrici i implicit izomerie optic sau chiralitate. n marea majoritate a cazurilor,
compuii extrai din surse naturale au aceeai chiralitate: majoritatea aminoacizilor
eseniali sunt (L)-aminoacizi, majoritatea zaharurilor sunt (D)-glucide. La sinteza
chimic a acestor compui se obin amestecuri racemice, amestecuri formate n proprii
egale din cei doi enantiomeri.
Dei proprietile fizice ale enantiomerilor sunt identice, exceptnd direcia de
rotaie a planului luminii polarizate, activitatea lor biologic poate fi mult diferit. De
exemplu, n cazul betablocantelor (propranolol, atenolol, metoprolol etc.) doar izomerul
(S) este activ, avnd aceeai structur cu noradrenalina (fig. 4.95). Izomerul (R) este
inactiv. Neproducnd efecte secundare, acesta este doar un balast izomeric [359].

(S)-propranolol noradrenalin
Figura 4.95. Structuri similare pentru betablocant i hormonul adrenergic

n alte cazuri, cei doi enantiomeri au reacii fiziologice diferite: unul dintre
enantiomerii naproxenului este util n calmarea durerilor artritice, cellalt provoac
otrvirea ficatului fr a avea un efect analgezic; (S)-limonenul are arom de lmie, n
timp ce (R)-limonenul are arom de portocal. Alte exemple sunt redate n fig. 4.96
[360, 361]. Datorit acestui comportament, separarea enantiomerilor reprezint o
necesitate, n special n aplicaiile farmaceutice, cosmetice, alimentare etc.

168
(S)-asparagina (R)-asparagina (S)-carvona (R)-carvona
gust amar gust dulce aroma de chimen aroma de menta
(R, R)-cloramfenicol (S, S)-cloramfenicol (S, S)-ethambutol (R, R)-ethambutol
antibacterial inactiv tuberculostatic provoaca orbire

Figura 4.96. Reacii fiziologice diferite ale enantiomerilor

Separarea izomerilor optici dintr-un amestec racemic este dificil, dat fiind faptul
c proprietile fizice ale enantiomerilor sunt identice. Cu excepia separrii prin
cristalizare, toate metodele de separare necesit prezena unui agent de separare chiral.
O alt posibilitate o reprezint separarea diastereoizomerilor: enantiomerii reacioneaz
n prealabil cu un compus optic pur, rezultnd diastereoizomeri. Acetia, avnd
proprieti fizice diferite, pot fi separai prin diverse procedee (fig. 4.97).

Separri
chirale
Separarea
diastereoizomerilor
i a altor derivai
Separarea
direct a
enantiomerilor
Separarea
diastereoizomerilor prin
distilare, extracie,
Cristalizare
Cromatografie
Tehnici de membran
Extracie reactiv
analiz industrial
preparativ
de laborator

Figura 4.97. Principalele metode de separare a compuilor chirali i scara la care se
aplic n prezent [359]

Extracia reactiv, ca metod de separare a enantiomerilor, implic utilizarea a doi
solveni, un solvent de extracie i un solvent de splare (fig. 4.98). Acest procedeu este
cunoscut sub denumirea de extracie fracionat. Cei doi solveni trebuie s fie
nemiscibili, sau cu miscibilitate foarte redus. Ei trebuie s aib polaritate i densitate
ct mai diferite, circulnd prin extractor n contracurent, fiecare dintre ei extrgnd
selectiv cte unul din componenii amestecului de separat. Dac extractorul este un
aparat tip coloan, cei doi solveni se alimenteaz pe la capetele acestuia, iar amestecul
de separat printr-un punct intermediar, care mparte coloana n dou zone: o zon situat
deasupra punctului de alimentare, denumit zon de extracie i o zon situat
dedesubtul alimentrii, denumit zon de splare (fig. 4.99).

169
ALIMENTARE (F)
[A + B]
Solvent de extracie
(S)
Solvent de splare
(W)
Rafinat (W + B)
Extract (S + A)

ALIMENTARE (F)
[A + B]
Solvent de extracie
(S)
Solvent de splare
(W)
Rafinat (W + B)
Extract (S + A)
Zon de
extracie
Zon de
splare

Figura 4.98. Schema de principiu a
extraciei fracionate
Figura 4.99. Coloan de extracie
fracionat

La nivel de laborator se utilizeaz diverse echipamente, constnd, de regul din
dou uniti independente, echivalente zonelor de extracie, respectiv de splare.
Frecvent utilizat este extractorul fracional Takeuchi, compus din dou coloane rotative
din sticl, nclinate (fig. 4.100). Echipamentele de laborator sunt caracterizate de
dimensiunea redus a acestora, numrul mare de trepte teoretice de extracie, timpul
mare de staionare n aparat (2 24 h); toate acestea conduc la obinerea unor produse
de puritate avansat, dar cu o productivitate foarte redus (1 10 mg/h).

Alimentare
Solvent uor (de extracie)
Solvent greu
(de splare)
EXTRACT
RAFINAT
P pompe

Figura 4.100. Extractor fracional Takeuchi [362]

170
Pentru a se putea realiza separarea enantiomerilor prin extracie fracionat
reactiv (FREX), unul dintre solveni va trebui s conin agentul de extracie
enantioselectiv. ntruct recunoaterea moleculelor chirale este mai selectiv ntr-un
mediu hidrofob, solventul organic S este, de regul, purttorul extractantului [363].
Un sistem de extracie versatil, foarte studiat, este acela bazat pe alchil derivai de
(L)-prolin sau (L)-hidroxiprolin. Aceti compui solubilizai n butanol, sunt capabili
s extrag ionii de Cu(II) din faza apoas, formnd cu acetia un complex chiral, avnd
un raport Cu : Ligand = 1 : 2 (fig. 4.101) [364]. Reacia care are loc se poate scrie:
] [
] [ 2 ] [
] [
2
2 2 aq
org org
aq H CuLig HLig Cu
+ +
+ + (4.66)
Complexul astfel format, CuLig
2
, are posibilitatea de a schimba unul din liganzii
chirali cu un enantiomer al unui aminoacid existent n faza apoas. Se formeaz astfel
un complex mixt, ligandul chiral pus n libertate rmnnd n faza organic, nefiind
solubil n ap. Aminoacidul existent n faza apoas, nedisociat, poate trece n faza
organic, unde poate avea loc capturarea sa de ctre complexul cupric al (L)-(hidroxi)
prolinei (fig. 4.102):

] [ ] [

org aq
HD HD (4.67)

] [ ] [

org aq
HL HL (4.68)

] [ ] [
K
] [ 2 ] [

D
org org org org
HLig DCuLig CuLig HD + + (4.69)

] [ ] [
K
] [ 2 ] [

L
org org org org
HLig LCuLig CuLig HL + + (4.70)
unde HD, HL reprezint respectiv (D)-aminoacidul i (L)-aminoacidul, iar K
D
i K
L
reprezint respectiv constantele de echilibru ale reaciilor (4.69) i (4.70). Dac K
D
K
L
,
reacia de schimb de liganzi este enantioselectiv. Unul dintre enantiomeri va fi extras
n faza organic n cantitate mai mare, cellalt concentrndu-se n faza apoas.
Repetndu-se procedura, n final, dup n trepte de extracie, faza organic, respectiv cea
apoas, vor conine cte un singur enantiomer, realizndu-se astfel separarea.

Faza apoas
Faza organic
Figura 4.101. Structura chimic
a complexului Cu(II) cu
N-dodecil-(L)-hidroxiprolina
Figura 4.102. Extracia n faza organic
a fenilalaninei de ctre
Cu(II)- N-decil-(L)-hidroxiprolin [365]


171
Sistemul bazat pe compleci de Cu(II) N-alchil-(L)-(hidroxi)prolin n diveri
alcooli (n-butanol, n-amilalcool, n-octilalcool) a fost utilizat pentru separarea selectiv a
enantiomerilor unor aminoacizi (leucina, izoleucina, norleucina, valina, norvalina,
fenilalanina) [364, 365], acizi carboxilici (acid mandelic [366], acid -ciclohexil-
mandelic [367]), aminoalcooli (fenilglicinol, 2-amino-1-feniletanol, 2-aminobutanol,
efedrin, norefedrin) [359, 368, 369], amine (feniletilamin, 2-aminopentan) [359, 368,
369] i chiar antibiotice [370]. Aceste sisteme au dezavantajul existenei n sistem a
ionului amoniu (pentru reglarea pH-ului) i a ionilor de cupru, ioni care trebuie ulterior
separai din faza apoas n care se concentreaz unul dintre enantiomeri [368].
Pentru separarea unor beta-blocante s-au utilizat sisteme bazate pe didodecil-(L)-
tartrat i acid boric n sistemul cloroform ap [371, 372], iar pentru aminoalcooli i
amine s-au utilizat diferii dialchiltartrai i tartrai alturi de hexafluorofosfai in
cloroform [373 375]. Dei versatilitatea sistemelor este bun, selectivitatea de numai
1,2 1,6 este prea redus pentru aplicarea la scar industrial; n plus apare
dezavantajul coextraciei unui contra-ion puternic lipofil, [PF
6
]
-
.
Un alt sistem de extracie selectiv a enantiomerilor este cel bazat pe derivai de
eteri-coroan. Sistemul a fost conceput iniial pentru separarea aminelor chirale prin
HPLC/CSP
1
[376, 377]. Aceti derivai de eteri-coroan conin un rest fenolic a crui
grupare OH se afl n interiorul coroanei, servind ca grupare de legtur pentru gruparea
aminic. n poziia para se gsete o grupare 2,4-dinitrofenilazo, care pe lng faptul c
este o grupare cromofor, conduce la creterea capacitii de legare a aminelor neutre i
a aminoalcoolilor [378]. Selectivitatea acestor derivai este influenat de aranjamentul
substituenilor pe inelul eterului-coroan: compuii avnd gruprile C
6
H
5
localizate
lng puntea de dietilenglicol (1 i 2 din fig. 4.103) sunt mai selectivi dect cei care au
gruprile C
6
H
5
amplasate lng gruparea fenolic (3 i 4 din fig. 4.103).

Figura 4.103. Derivai de eteri-coroan cu selectivitate chiral pentru amine i
aminoalcooli [376]

n timp ce eterii coroan n conformaie (S,S,S,S) s-au dovedit a fi selectivi pentru
izomerii R ai compuilor: 2-aminopropan-1-ol, 2-amino-3-metilbutan-1-ol i 2-amino-2-
feniletan-1-ol, eterii n conformaie (R,S,S,R) s-au dovedit a fi selectivi pentru izomerii
S ai acelorai aminoalcooli. Aceast selectivitate poate fi explicat prin factorii sterici
care pot sau nu favoriza includerea aminei n cavitatea eterului-coroan [376].

1
HPLC/CSP cromatografie de nalt performan pe faz chiral staionar

172
Un derivat piridinic de eter-coroan (fig. 4.104) a fost sintetizat i i-a fost testat
selectivitatea pentru diferite amine i aminoalcooli chirali (fig. 4.105). Macrociclul
chiral a prezentat o bun selectivitate pentru sec-butilamina (2), pentru compuii (3)
(5) a prezentat o selectivitate redus, iar pentru (1) i (6) nu a fost enantioselectiv [379].

(S,S)

1 2 3
4 5 6

Figura 4.104. Eter azofenolic
piridino-18-coroan-6
Figura 4.105. Compui model pentru testarea
enantioselectivitii eterului azofenolic piridino-18-
coroan-6 asupra aminelor primare chirale

Studii mai ample au fost efectuate cu eterul-coroan azofenolic prezentat n fig.
4.106 [359]. Acesta a fost testat ca extractant n diferii solveni, cei mai eficieni
dovedindu-se diclormetanul i, ntr-o mai mic msur, toluenul. Cu toate acestea,
pentru aplicaiile la scar mai mare se recomand utilizarea toluenului ca solvent, acesta
fiind mai puin duntor mediului nconjurtor dect diclormetanul. Drept compui
model de extras s-au folosite aminele i aminoalcoolii avnd o structur asemntoare
efedrinei (fig. 4.107).

(1) fenilglicinol (2) 2-amino-1-feniletanol (3) 2-aminobutanol (4) norefedrina
(5) efedrina (6) feniletilamina (7) 2-aminopentan
Figura 4.106. Eter
azofenolic 18-coroan-6
[359]
Figura 4.107. Compui model pentru testarea
enantioselectivitii eterului azofenolic 18-coroan-6
asupra unor amine chirale de tip efedrinic [359]

S-a constatat c acest eter-coroan are o selectivitate bun (peste 1,7) pentru
majoritatea compuilor testai (tab. 4.28), iar faptul c valorile coeficienilor de
distribuie sunt mari la concentraii relativ sczute de extractant, permite utilizarea
acestui compus n instalaii de capacitate ridicat [368]. Faptul ca 2-aminopentanul nu a
putut fi separat poate conduce la concluzia c pentru recunoaterea chiral este necesar
prezena unei a doua grupri funcionale (fenil sau hidroxil) n molecula-int. De

173
asemenea, selectorul (eterul-coroan) ar putea fi enantioselectiv i pentru alte amine
primare chirale, cu cel puin nc o grupare funcional n molecula lor: aminoacizi,
aminalcooli, amine aromatice [359, 368].

Tabelul 4.28. Separarea chiral a unor aminoalcooli i amine prin extracie reactiv cu
eter-coroan azofenolic (2 mMol/L) n diclor metan [368]
Enantiomer T [C] pH D
1
D
2
Selectivitate
Enantiomerul
preferat
Fenilglicinol 25 9,0 4,0 0,8 5,0 R
2-Amino-1-feniletanol 5 10,0 5,6 4,2 1,3 R
Norefedrin 5 8,7 4,5 2,6 1,7 (+)
2-Aminobutanol 5 9,9 1,9 0,6 3,2 R
Feniletilamin 5 9,2 20,4 9,9 2,1 S
2-Aminopentan 5 9,9 6,2 6,0 1,0
D
1
coeficientul de distribuie al enantiomerului cel mai puternic extras
D
2
coeficientul de distribuie al enantiomerului cel mai slab extras

Studiile cinetice indica faptul c extracia aminoalcoolilor cu eteri-coroan
azofenolici decurge n domeniul difuzional, reacia chimic nefiind etapa determinant
de vitez [369]. La extracia ntr-o singur treapt, selectivitatea operaional este
influenat n special de valoarea constantei de complexare dintre eterul-coroan i
enantiomeri (care depinde de tipul solventului i de temperatur), precum i de
concentraia extractantului. Raportul de distribuie al enantiomerilor ntre faza apoas i
cea organic este puternic influenat de pH [380].
Reextracia aminoalcoolilor din faza organic se poate realiza fie prin modificarea
pH-ului (n cazul feniletilaminei), fie prin modificarea temperaturii (n cazul
fenilglicinolului). Pentru modificarea pH-ului nu se recomand utilizarea acizilor
minerali, ci a dioxidului de carbon. O presiune parial de circa 0,02 MPa a CO
2
este
suficient pentru reducerea pH-ului unei soluii cu 2 mMol/L feniletilamin pn la
valoarea 6. n aceste condiii are loc decomplexarea de eterul-coroan i trecerea aminei
n faza apoas, fenomen
vizbil prin modificarea
clar i rapid a culorii
fazei organice de la
purpuriu nchis la porto-
caliu [359, 380].
Flexibilitatea extrac-
iei reactive fracionate cu
derivai axzofenolici ai
eterilor coroan a fost
demonstrat la scar redus
ntr-un contactor cu mem-
bran avnd circa dou
trepte teoretice de extracie
att n zona de extracie,
ct i n zona de splare
(fig. 4.108).

Figura 4.108. Instalaie de extracie reactiv fracionat
(FREX) de tip contactor cu membran [381]


1

Bibliografie

1. U.S. Congress, Office of Technology Assessment: Biotechnology in a Global Economy, OTA-BA-494,
Washington, DC, U.S. Government Printing Office, October 1991
2. Jurcoane, ., Ssrman, E., Lupescu, I., Rou, A., Berehoiu Tamba, R., Banu, A., Rdoi, F.: Tratat de
biotehnologie, 1, Ed. Tehnic, Bucureti, 2004
3. Doran, P.M.: Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, London, 1995
4. Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction, A.-I.: Inginerie biochimic i biotehnologie, 3 Procese de separare, Ed.
Performantica, Iai, 2004
5. Shuler, M.L.: Bioprocess engineering in: Encyclopedia of Physical Science and Technology, 2 (Meyers, R.A.
ed.), Academic Press, Orlando, 1987
6. Berruex, L.G., Freitag, R.: Separation and Purification of Biochemicals in: Encyclopedia of Physical Science
and Technology, 3
rd
ed. (Meyers, R.A. ed.), Academic Press, Orlando, 2001
7. Harrison, R.G., Todd, P., Rudge, S.R., Petrides, D.P.: Bioseparations Science and Engineering, Oxford
University Press, New York, 2003
8. Petrides, D.P.: Bioprocess Design, http://www.intelligen.com, 2000
9. Petrides, D.P., Cooney, C.L., Evans, L.B.: An Introduction to Biochemical Process Design, in: Chemical
Engineering Problems in Biotechnology (Shuler, M.L. ed.), 1, American Institute of Chemical Engineers,
1989, 351 372
10. www.lsbu.ac.uk/water/kosmos.html
11. http://ron.proz.com/kudoz/1229225#2932486
12. Hunter, R.J.: Foundations of Colloid Science, 1, Clarendon Press, Oxford, 1987
13. Calleja, G.B.: Microbial Aggregation, CRC Press, Boca Raton, 1984
14. Bilanovic, D., Shelef, G., Sukenik, A.: Biomass, 1988, 17, 65 76
15. Boonaert, C.J.-P., Dupont-Gillain, C.C., Dengis, P.B., Dufrne, Y.F., Rouxhet, P.G.: Cell Separation,
Flocculation, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley
Interscience, New York, 1999
16. * * * Degrmont Water Treatment Handbook, 6
th
ed., 1, Lavoisier Publishing, Paris, 1991
17. Nakamura, J., Miyashiro, S., Hirose, Y.: Agric. Biol. Chem., 1976, 40, 377 383
18. Kurane, R., Takeda, K., Suzuki, T.: Agric. Biol. Chem., 1986, 50, 2301 2307
19. Takagi, H., Kadowaki, K.: Agric. Biol. Chem., 1985, 49, 3151 3157
20. Agerkvist, I., Eriksson, L., Enfors, S.-O.: Selective flocculation with chitosan in Escherichia coli
disintegrates: Effects of pH and nuclease treatment, Enzyme Microb. Technol., 1990, 12(8), 584590
21. Ferenci, T., Lee, K.-S.: Recovery of bacteria from growth media by starch-dependent floc formation,
Biotechnol. Bioeng., 1991, 38(3), 314 318
22. Sharma, B.P.: Cell Separation, Sedimentation in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C.,
Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999
23. Li, D.-H., Ganczarczyk, J.J.: Water Res., 1987, 21, 257 262
24. Maia, A.B.R.A., Nelson, D.L.: Application of gravitational sedimentation to efficient cellular recycling in
continuous alcoholic fermentation, Biotechnol. Bioeng., 1993, 41(3), 361 369
25. Bratu, E.A.: Operaii unitare n ingineria chimic, 2, Ed. Tehnic, Bucureti, 1984
26. Kalyanpur, M.: Membrane Separations, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew,
S.W. eds.), 3, Wiley Interscience, New York, 1999
Bibliografie

2
27. Levy, R.V., Jornitz, M.W.: Types of Filtration in: Sterile Filtration (Jornitz, M.W. ed.), Advances in
Biochemical Engineering / Biotechnology, 2006, 98, 1 26
28. Oniscu, C., Tehnologia produselor de biosintez, Ed. Tehnic, Bucureti, 1978
29. * * * Advanced Filtration Technology, Larox OY Company Brochure, Lappeenranta, 1993
30. Hsu, H.-W.: Separations by Centrifugal Phenomena, John Wiley, New York, 1981
31. Ambler, C.M.: The evaluation of centrifuge performance, Chemical Engineering Progress, 1952, 48, 150
158
32. Ambler, C.M.: Centrifugation in: Handbook of Separation Techniques for Chemical Engineers (Schweitzer,
P.A. ed.), 2
nd
ed., McGraw-Hill, New York, 1988
33. Dahlstrom, D.A., et al: Liquid-Solid Operations and Equipment in: Perrys Chemical Engineers Handbook
(Perry, R.H., Green, D.W. ed.): 7
th
ed., McGraw-Hill, New York, 1997
34. Ambler, C.M.: J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng., 1959, 1, 185 205
35. Svarovsky, L: Separation by centrifugal sedimentation in: Solid Liquid Separation (Svarovsky, L. ed.), 4
th

ed., Butterworth-Heinemann, Oxford, 2000
36. Axelsson, H. in: Comprehensive Biotechnology, 2: The Principles of Biotechnology: Engineering
Considerations (Clooney, C.L., Humphrey, A.E. ed.), Pergamon Press, Oxford, 1985, 325 346
37. Axelsson, H.: Cell Separation, Centrifugation, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C.,
38. Apelman, S., Bjrling, T.: Biotech. For. Eur., 1991, 8, 356 358
39. Mayer, M., Woernle, R.: Chem.-Ing.-Tech., 1985, 57, 152 153
40. Hanle, D.D.: Centrifuges, Animal Cells in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew,
S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999
41. Middelberg, P.J., ONeill, B.K., Bogle, I.D.L.: Trans. Inst. Chem. Eng., 1992, 70, 8 12
42. Westfalia Separator Industry: Pharmaceutical Biotechnology. Components, Systems, Installations, Brochure
9997-8203-010/0503 EN, disponibil la: http://www.westfalia-separator.com/pdfs/9997-8203-010.pdf
43. Baker, R.W.: Membrane Separation in: Encyclopedia of Separation Science (Wilson, I.D. ed.), 1, Academic
Press, London, 2000
44. http://www.ncnr.nist.gov/programs/reflect/rp/biology/cell_membrane.html
45. http://microscopy.fsu.edu/cells/plants/cellwall.html
46. http://www.doctorfungus.org/thedrugs/antif_pharm.htm
47. http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Biochemicals/Enzyme_Explorer/Key_Resources/Lysing_Enz
ymes.html
48. http://www.leica-microsystems.com/WebSite/ImageGallery.nsf/
49. http://www.microbiologytext.com/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=60
50. Doulah, M.S.: Biotechnol. Bioeng., 1977, 19, 649 660
51. Kuboi, R., Umakoshi, H., Takagi, N., Komasawa, I.: Optimal disruption methods for the selective recovery of
-galactosidase from Escherichia coli, J. Ferment. Bioeng., 1995, 79(4), 335 341
52. Hetherington, P.J., Follows, M., Dunnill, P., Lilly, M.D.: Trans. Inst. Chem. Eng., 1971, 49, 142 148
53. Garcia, F.A.P.: Cell Disruption and Lysis in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C.,
54. Engler, C.R., Robinson, C.W.: Effects of organism type and growth conditions on cell disruption by
impingement, Biotechnol. Lett., 1981, 3, 83 88
55. Hetherington, P.J., Follows, M., Dunnill, P., Lilly, M.D.: Release of protein from bakers yeast
(Saccharomyces cerevisiae) by disruption in an industrial homegeniser, Trans. Inst. Chem. Eng., 1971, 49,
142 148
56. Doulah, M.S., Hammond, T., Brookman, J.S.G.: Biotechnol. Bioeng., 1975, 17, 845 858
57. Sauer, T., Robinson, O.W., Glick, B.R.: Biotechnol. Bioeng., 1989, 33, 1330 1342
58. http://www.microfluidicscorp.com/pdf/tb_hc.pdf
59. Siddiqi, S.F., Bulmer, M., Shamlou, P.A., Titchener-Hooker, N.J.: The effects of fermentation conditions on
yeast cell debris particle size distribution during high pressure homogenization, Bioprocess Eng., 1995, 14(1),
1 8
61. http://www.btc-bti.com/applications/yeasthomogenization.htm
62. Limon-Lason, J., Hoare, M., Orsborn, C.B., Doyle, D.J., Dunnill, P.: Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 745
774
63. http://www.btc-bti.com/product_literature/grindingmedia.htm
64. Chaplin, M., Bucke, C.: Enzyme Technology, Cambridge University Press, 1990 (text abreviat, disponibil
online la: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html , postat 20.12.2004)
65. Baldwin, C.V., Robinson, C.W.: Enhanced disruption of Candida utilis using enzymatic pretreatment and
high-pressure homogenization Biotechnol. Bioeng., 1994, 43(1), 46 56
66. Bunge, F., Pietzsch, M., Mller, R., Syldatk, C.: Mechanical disruption of Arthrobacter sp. DSM 3747 in
stirred ball mills for the release of hydantoin-cleaving enzymes, Chem. Eng. Sci., 1992, 47(1), 225 232

3
67. Majors, R.E.: Sample Preparation for Large-Scale Protein Purification, LCGC North America, August 1,
2005, disponibil la:
http://neuro_healthcentersonline.mediwire.com/main/Default.aspx?P=Content&ArticleID=172950
68. http://www.microfluidicscorp.com/cell_disruption/cell_disruption.html
69. Lee, C.H., Tsang, S.K., Urakabe, R., Rha, R.A.: Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 1 17
70. Ropars, M., Marchal, R., Pourquie, J., Vandercasteele, J.P.: Large scale enzymatic hydrolysis of agricultural
lignocellulosic biomass, Bioresource. Technol., 1992, 42(2), 197 203
71. Petre, M., Zarnea, G,, Adrian, P., Gheorghiu, E.: Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using
bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydrogels, Resource, Conversion and Recycling,
1999, 27(2), 309 332
72. Vogels, G., Kula, M.-R.: Combination of enzymatic and/or thermal pretreatment with mechanical cell
disintegration, Chem. Eng. Sci., 1992, 47(1), 123 131
73. Dabora, R.L., Cooney, C.L.: Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 1990, 43, 11 30
74. Clarkson, A.I., Lefevre, P., Titchener-Hooker, N.J.: A study of process interactions between cell disruption
and debris clarification stages in the recovery of yeast intracellular products, Biotechnol. Prog., 1993, 9(5),
462 467
75. Keshavarz, E., Bonnerjea, J., Hoare, M., Dunnill, P.: Disruption of a fungal organism, Rhizopus nigricans, in
a high-pressure homogenizer, Enzyme Microb. Technol., 1990, 12(7), 494 498
76. Carlson, A., Signs, M., Liermann, L., Boor, R., Jem, K.J.: Biotechnol. Bioeng., 1995, 48, 303 315
77. Agerkvist, I., Enfors, S.-O.: Characterization of E. coli cell disintegrates from a bead mill and high pressure
homogenizers, Biotechnol. Bioeng., 1990, 36(11), 1083 1089
78. Siddiqi, S.F., Titchener-Hooker, N.J., Shamlou, P.A.: Simulation of particle size distribution changes
occurring during high-pressure disruption of bakers' yeast, Biotechnol. Bioeng., 1996, 50(2), 145 150
79. Mukhopadhyay, A.: Biotreatment, downstream processing and modeling, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.,
1997, 56, 61 109
80. Wong, H.H., ONeill, B.K., Middelberg, A.P.J.: A mathematical model for Escherichia coli debris size
reduction during high pressure homogenisation based on grinding theory, Chemical Engineering Science,
1997, 52(17), 2883 2890
81. Bailey S.M., Mragher, M.M.: Biotechnol. Bioeng., 1997, 56, 304 310
82. Kasatkin, A.G.: Procese i aparate principale n tehnologia chimic, ed a 2-a, Ed. Tehnic, Bucureti, 1963
84. Dobre, T., Floarea, O.: Separarea compuilor chimici din produse naturale, Ed. Matrix Rom, Bucureti, 1997
85. Stoica Guzun, A., Stroescu, M., Dobre, T., Floarea, O.: Operaii de transfer interfazic, Ed. Matrix Rom,
Bucureti, 2001
86. Perry, R.H., Green, D.W. (ed.): Perrys Chemical Engineers Handbook, 7
th
ed., McGraw-Hill, New York,
1997
87. Richardson, J.F., Harker, J.H.: Coulson and Richardsons Chemical Engineering, 2, 5
th
ed., Particle
Technology and Separation Processes, Butterworth-Heinemann, Oxford, 2002
88. Rydberg, J.: Introduction to solvent extraction, in Principles and Practices of Solvent Extraction (Rydberg,
U., Musikas, C., Choppin, G.R. eds.), Marcel Dekker, New York. 1992
89. Stoica Guzun, A., Floarea, O., Dobre, T.: Transfer de mas i reacie chimic la interfaa lichid lichid, Ed.
Matrix Rom, Bucureti, 2000
90. Gavril, L.: Fenomene de transfer, 2, Transfer de cldur i de mas, Ed. Alma Mater, Bacu, 2000
91. Gu, T.: Liquid liquid partitioning methods for bioseparations, in: Handbook of Bioseparations (Ahuja, A.
ed.), 2, Academic Press, New York, 2000
92. Schgerl, K.: Solvent Extraction in Biotechnology: Recovery of Primary and Secondary Metabolites,
Springer-Verlag, Berlin, 1994
93. Thornton, J.D.: Science and Practice of Liquid Liquid Extraction, 2, Oxford University Press, New York,
1992
94. Lo, T.C., Baird, M.H.I.: Solvent Extraction, in: Encyclopedia of Physical Science and Technology, Chemical
Engineering, (Meyers, R.A. ed.), 3
rd
ed., Academic Press, Orlando, 1987
95. Horvath, A.L.: Molecular Design, Elsevier, Amsterdam, 1992
96. Seader, J.D., Henley, E.: Separation Process Principles, John Wiley, New York, 1998
97. Mavriounioutis, M. (ed.): Special issue on design of chemical compounds, Computers and Chemical
Engineering Journal, 1998, 22, 713
98. Harper, P., Gani, R., Kolar, P., Ishikawa, T.: Computer aided molecular design with combined molecular
modeling and group contribution, Fluid Phase Equilibria, 1999, 337, 158 160
99. Harper, R.G.P.M., Hostrup, M.: Solvent Based Separation in: : Encyclopedia of Separation Science (Wilson,
I.D. ed.), Academic Press, London, 2000
100. Lo, T.C., Baird, M.H.I.: Liquid Liquid Extraction in: Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical technology,
4
th
ed., 10, Wiley Interscience, New York, 1994
101. Barson, N., Beyer, G.H.: Chem. Eng. Progr., 1953, 49, 243
Bibliografie

4
102. Tudose, R.Z., Ibnescu, I., Vasiliu, M., Stancu, A., Cristian, G., Lungu, M.: Procese, operaii, utilaje n
industria chimic, Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1977
103. Brunner, K.H.: Separatoren und Dekanter fr die kontinuierliche Extraktion, 3
rd
ed., Westfalia Separator AG,
Oelde, 1991
104. Westfalia AG: Extraction, disponibil la: http://www.westfalia-separator.com/pdfs/9997-7651-010.pdf
105. Meikrantz, D.H., Meikrantz, S.B., St. George, M.: Continuous Liquid Liquid Extraction via an Improved
Centrifugal Contactor, Symposium on Extraction Practice, AIChE Spring National Meeting, March 8 12,
1998
106. Trandafir, I.: Studii n extracia lichid lichid, Tez de doctorat, Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai,
2003
107. Baier, G.: Liquid Liquid Extraction Based on a New Flow Pattern: Two Fluid Taylor Couette Flow,
Ph.D. Dissertation, University of Wisconsin Madison, May 1999
108. Meikrantz, D.H., Macaluso, L.L., Flim, W.D., Heald, C.J., Mendoza, G., Meikrantz, S.B.: A New Annular
Centrifugal Contactor for Pharmaceutical Processes, Chemical Engineering Communications, 2002, 189(12),
1629 1639
109. Chisti, Y.: Strategies in Downstream Processing, in: Bioseparation and Bioprocessing: A Handbook, 2
(Subramanian, G. ed.), Wiley-VCH, New York, 1998
110. Reissinger, K.-H., Schrter, J.: Selection Criteria for Liquid-Liquid Extractors, Chem. Eng., November 1978,
109 118
111. Baird, M.H.I., Rao, N.V.R., Prochazka, J., Sovova, H.: Reciprocating-plate columns, in: Liquid Liquid
Extraction Equipment (Godfrey, J.C., Slater, M.J. eds.), Wiley Interscience, New York, 1994
112. Belter, P.A., Cussler, E.L., Hu, W.-S.: Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, Wiley,
New York, 1988
113. Kertes, A.S., King, C.J.: Extraction chemistry of fermentation product carboxylic acids, Biotechnology and
Bioengineering, 1986, 28, 269 282
114. Reuben, B.G., Sjoberg, K.: Chemtechnol., 1981, 11, 315
115. Wennersten, R.: Extraction of Organic Compounds in: Solvent Extraction Principles and Practice (Rydberg,
J., Cox, M., Musicas, C., Choppin, G.R. eds.), 2
nd
ed., Marcel Dekker, New York, 2004
116. Essien, D.E., Pyle, D.L.: Fermentation ethanol recovery by solvent extraction in: Separations for
Biotechnology (Verrrall, M.S., Hudson, M.J. eds.), Ellis Horwood, Chichester,1987
117. Roffler, S.R., Blanch, H.W., Wilke, C.R.: In-situ extractive fermentation of acetone and butanol,
Biotechnology and Bioengineering, 1988, 31, 135-143
118. Weatherley, L.R.: Some current developments and extraction techniques in: Science and Practice of Liquid-
Liquid Extraction (Thornton, J.D. ed.), 2, Oxford University Press, New York, 1992
119. Mattiasson, B., Suominen, M., Andersson, E., Haggstrom, L., Albertsson, P.-., Hahn-Hgerdahl, B.: Solvent
production by Clostridium acetohutylicum in aqueous two phase systems, Enzyme Engineering, 1982, 6, 153
155
120. Wang, H.Y., Robinson, E.M., Lee, S.S.: Biotechnol. Bioeng. Symp., 1981, 11, 555 565
121. Lloyd-Jones, E.: Chem Ind., 1967, 1590
122. Lurgi Life Science Technologies GmbH: Citric Acid by a Gypsum-free Process, Technical Brochure
260e/5.00/10
123. Wennersten, R.J.: Chem. Tech. Biotechnol., 1983, 33, 85
124. Zigov, J., turdik, E.: Advances in Biotechnological Production of Butyric Acid, J. Ind. Microbio. &
Biotech., 2000, 24, 153
125. Pouillart, P.R.: Role of butyric acid and its derivatives in the treatment of colorectal cancer and
haemoglobinopathies, Life Sciences, 1998, 63(20), 1739 1760
126. Kirbalar, .I.: Liquid-Liquid Equilibria of the Water + Butyric Acid + Decanol Ternary System, Brazilian
Journal of Chemical Engineering, 2006, 23(3), 365 374
127. Beijerinck, M.W.: ber eine Besonderheit der lslichen Strke, Zentralbl. Bakteriol., 1896, 2, 697 699
128. Albertsson, P.A.: Partition of Cell Particles and Macromolecules, John Wiley & Sons, New York, 1986
129. Kula, M.-R., Selber, K.: Protein Purification, Aqueous Liquid Extraction in: Encyclopedia of Bioprocess
Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), John
Wiley Interscience, New York, 1999
130. Terstappen, G.C., Ramelmeier, R.A., Kula, M.-R.: Protein partitioning in detergent-based aqueous two-phase
systems, J. Biotechnol., 1993, 28(2-3), 263 275
131. Alred, P.A., Kozlowski, A., Harris, J.M., Tjerneld, F.: Application of temperature-induced phase partitioning
at ambient temperature for enzyme purification, J. Chromatogr. A, 1994, 659(2), 289 298
132. Johansson, H.-O. Karlsstrm, G., Mattiasson, B., Tjerneld, F.: Bioseparation, 1995, 5, 269 279
133. Persson, J., Nystrm, L., Ageland, H., Tjerneld, F.: Purification of recombinant apolipoprotein A-1
Milano

expressed in Escherichia coli using aqueous two-phase extraction followed by temperature-induced phase
separation, J. Chromatogr. B, 1998, 711(1-2), 97 109
134. Hustedt, H., Kroner, K.H., Kula, M.-R. in: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems (Walter, H., Brooks,
D.E., Fisher, D. eds.), Academic Press, Orlando, 1985, 529 587

5
135. Kubek, D.J. in: Protein Purification Process Engineering, (Harrison, R.G. ed.), Marcel Dekker, New York,
1994, 87 114
136. Asenjo, J.A., Chaudhuri, J.B.: Innovative separation methods in bioprocessing in: Separation Processes in
the Food and Biotechnology Industries Principles and Applications (Grandison, A.S., Lewis, M.G. eds.),
Woodhead Publishing, Cambridge, 1996
137. Schtte, H., Hummel, W., Kula, M.-R.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, 19, 167 176
138. Diamond, A.D., Hsu, J.T.: Aqueous two-phase systems for biomolecule separation, Adv. Biochem.
Eng./Biotechnol., 1992, 47, 89 135
139. Wnschell, G.E., Naranjo, E., Arnold, F.: Aqueous two-phase metal affinity extraction of heme proteins,
Bioproc. Eng., 1990, 5(5), 199 202
140. Chung, B.H., Bailey, D., Arnold, F.H.: Metal Affinity Partitioning in: Methods in Enzymology, 228 (Walter,
H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 167 179
141. Lee, C.K., Sandler, S.I.: Vancomycin partitioning in aqueous two-phase systems: effects of pH, salts, and an
affinity ligand, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(4), 408
142. Kula, M.-R.: Extraction and purification of enzymes using aqueous two-phase systems, Appl. Biochem.
Bioeng., 1979, 2, 71 95
143. Zaslavsky, B.Y.: Aqueous Two-Phase Partitioning: Physical Chemistry and Bioanalytical Applications,
Marcel Dekker, New York, 1995
144. Kroner, K.H., Schtte, H., Stach, W., Kula, M.-R.: J. Chem. Technol. Biotechnol., 1982, 32, 130 137
145. Schtte, H., Kroner, K.H., Hummel, W., Kula, M.-R.: Ann. N.Y. Acad. Sci., 1983, 413, 270 282
146. Hart, R.A., Ogez, J.R., Builder, S.E.: Bioseparation, 1995, 5, 113 121
147. Kelley, B.D., Wang, D.I.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. I: Principles
and protein-ligand systems, Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1199 1208
148. Papamichael, N., Hustedt, H.: Enzyme Recovery by Continuous Crosscurrent Extraction in: Methods in
Enzymology, 228 (Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 573 584
149. Fauqueux, P.-F., Hustedt, H., Kula, M.-R.: J. Chem. Technol. Biotechnol., 1985, 35B, 51 59
150. Johansson, G.: Recovery of Proteins and Phase-Forming Chemicals in: Methods in Enzymology, 228 (Walter,
H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 569 573
151. Minuth, T., Thmmes, J., Kula, M.-R.: Extraction of cholesterol oxidase from Nocardia rhodochrous using a
nonionic surfactant-based aqueous two-phase system, J. Biotechnol., 1995, 38(2), 151 164
152. Hustedt, H., Kroner, K.-H., Menge, U., Kula, M.-R.: Enzyme Eng., 1988, 5, 45 47
153. Kula, M.-R., Kroner, K.H., Hustedt, H.: Adv. Biochem. Eng., 1982, 24, 73 118
154. Jafarabad, K.R., Sawant, S.B., Joshi, J.B., Sikdar, S.K.: Enzyme and protein mass transfer coefficient in
aqueous two-phase systems. I: spray extraction columns, II: York-Scheibel extraction columns, Chem. Eng.
Science, 1992, 47(1), 57 68, 69 73
155. Sawant, S.B., Joshi, J.B., Sikdar, S.K.: Hydrodynamics and mass transfer characteristics of spray column for
two phase aqueous extraction, Biotechnology and Bioengineering, 1990, 36, 109
156. Bhawsar, P.C.M., Pandit, A.B., Sawant, S.B., Joshi, J.B.: Enzyme mass transfer coefficient in a sieve plate
extraction column, The Chemical Engineering Journal, 1994, 55, B1 B17
157. Patil, T.A., Jafarabad, K.R., Sawant, S.B., Joshi, J.B.: Enzyme mass transfer coefficient in aqueous two phase
system using a packed extraction column, The Canadian Journal of Chemical Engineering, 1991, 69, 548
556
158. Dos Reis Coimbra, J., Thmmes, J., Meirelles, A., Kula, M.-R.: Bioseparation, 1995, 5, 259 268
159. Dos Reis Coimbra, J., Thmmes, J., Kula, M.-R.: Continuous separation of whey proteins with aqueous two-
phase systems in a Graesser contactor, J. Chromatogr. A, 1994, 668(1), 85 94
160. Couper, J.R., Penney, W.R., Fair, J.R., Walas, S.M.: Chemical Process Equipment: Selection and Design, 2
nd

ed., Gulf Professional Publishing, Burlington, 2005
161. Carlsson, A.: Factors influencing the use of aqueous two-phase for protein purification, Separation Science
and Technology, 1988, 23(8-9), 765
162. Papamichael, N., Brner, B., Hustedt, H.: Continuous aqueous phase extraction of proteins: automated
processing and recycling of process chemicals, J. Chem. Technol. Biotechnol., 1992, 54(1), 47 55
163. Kula, M.-R., Kroner, K.L., Hustedt, H.: Purification of enzymes by liquid-liquid extraction, Advances in
Biochemical Engineering, 1982, 24, 73 118
164. Minuth, T., Thmmes, J., Kula, M.-R.: A closed concept for purification of the membrane-bound cholesterol
oxidase from Nocardia rhodochrous by surfactant-based cloud-point extraction, organic-solvent extraction
and anion-exchange chromatography, Biotechnol. Appl. Biochem., 1996, 23(2), 107 116
165. Greve, A., Kula, M.-R.: Cost structure and estimation for the recycling of salt in a protein extraction process,
Bioprocess Eng., 1991, 6(4), 173 177
166. Greve, A., Kula, M.-R.: Recycling of salt from the primary bottom phase of a protein extraction process, J.
Chem. Technol. Biotechnol., 1991, 50(1), 27 42
167. van Berlo, M., Luyben, K.C.A.M., van der Wielen, L.A.M.: Polyethylene glycol-salt aqueous two-phase
systems with easily recyclable volatile salts, Journal of Chromatography B, 1998, 711(1-2), 61 68
Bibliografie

6
168. Hart, R.A., Lester, P.M., Riefsnyder, H., Ogez, J.R., Builder, S.E.: Large scale, in situ isolation of periplasmic
IGF- from E. coli, Bio/Technology, 1994, 12(11), 1113 1117
169. Kim, C.Y., Brewer, J.W., Brothers, C.E., Farver, T.F., Lee, E.K.: 3
rd
Chemical Cong. of North America,
Toronto, Canada, June 5 10, 1988
170. Hustedt, H., Brner, B., Kroner, K.H., Papamichael, N.: Biotechnol. Tech., 1987, 1, 49 54
171. Hustedt H., Papamichael, N.: Enzyme Eng., 1988, 9, 135 139
172. Kroner, K.H., Hustedt, H., Kula, M.-R.: Process Biochem., 1984, 19, 170 179
173. Hellebust, H., Veide, A., Enfors, S.: J. Biotechnol., 1988, 7, 185 198
174. Pulliam, T.R., Winston, S., Bentley, W.E.: Tryptophan regulated expression and aqueous two-phase
separation of recombinant HIV-fusion peptides, Enzyme and Microbial Technology, 1997, 20(1), 46 51
175. Johansson, G., Andersson, M.: J. Chromatogr., 1984, 303, 39
176. Cordes, A., Kula, M.-R.: Large-Scale Purification of Formate Dehidrogenase in: Methods in Enzymology, 228
(Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 600 617
177. Zulauf, M., Eicke, H.F.: Inverted Micelles and Microemulsions in the Ternary-System H
2
O-Aerosol-OT-
Isooctane as Studied by Photon Correlation Spectroscopy, Journal of Physical Chemistry, 1979, 4, 480 486
178. Pileni, M.P., Zemb, T., Petit, C.: Solubilization by reverse micelles: Solute localization and structure
perturbation, Chem. Phys. Lett., 1985, 118, 414 420
179. Luisi, P.L.: Enzymes Hosted in Reverse Micelles in Hydrocarbon Solution, Angewandte Chemie
International Edition in English, 1985, 6, 439 450
180. Luisi, P.L., Giomini, M., Pileni, M.P., Robinson, B.H.: Reverse Micelles as Hosts for Proteins and Small
Molecules, Biochimica et Biophysica Acta, 1988, 1, 209 246
181. Pileni, M.P. (ed.): Reverse micelles, Elsevier, Amsterdam, 1989
182. Peng, Q., Luisi, P.L.: The Behavior of Proteases in Lecithin Reverse Micelles, European Journal of
Biochemistry, 1990, 188(2), 471 480
183. Evans, D.F., Mitchell, D.J., Ninham, B.W.: Oil, water and surfactant: properties and conjectured structure of
simple microemulsions, J. Phys. Chem.,1986, 90, 2817 2825
184. Andr, P., Filankembo, A., Lisiecki, I., Petit, C., Gulik-Krzywicky, T., Ninham, B.W., Pileni, M.P.: Supra-
aggregation: Microphase formation in complex fluids, Adv. Mater., 2000, 12(2), 119 123
185. Hyde, S. et al. eds.: The Language of Shape: The Role of Curvature in Condensed Matter: Physics,
Chemistry and Biology, Elsevier, Oxford, 1997
186. Pileni, M.P.: The role of soft colloidal templates in controlling the size and shape of inorganic nanocrystals,
Nature Materials, 2003, 2, 145 150
187. Peng, Q.: Biological Function and Conformation of Proteases in Reverse Micelles, ETH Diss No. 9114,
Eidgenssische Technische Hochschule Zrich, 1990
188. Walde, P., Giuliani, A.M., Boicelli, C.A., Luisi, P.L.: Phospholipid-Based Reverse Micelles, Chemistry and
Physics of Lipids, 1990, 53, 265 288
189. El Seoud, O.A.: Acidities and Basicities in Reversed Micellar Systems in: Reverse Micelles: Biological and
Technological Relevance of Amphiphilic Structures in Apolar Media (Luisi, P.L., Straub, B.E. eds.),
Plenum Press, New York, 1984, 81 93
190. Higuchi, W.I., Misra, J.: Solubilization in Nonpolar Solvents - Influence of Chain Length of Solvent on
Solubilization of Water by Diocryl Sodium Sulfosuccinate, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1962, 51(5),
455 458
191. Rabie, H.R., Vera, J.H.: Generalized Water Uptake Modelling of Water-in-Oil Microemulsions. New
experimental results for Aerosol-ot-Isooctane-water-salts systems, Fluid Phase Equilibria, 1996, 122, 169
186
192. Fletcher, P.D.I., Howe, A.M., Robinson, B.H.: The Kinetics of Solubilisate Exchange between Water
Droplets of a Water-in-Oil Microemulsion, Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions I, 1987,
83, 985 1006
193. Pessoa Jr, A., Vitolo, M.: Recovery of Inulinase Using BDBAC Reversed Micelles, Proc. Biochem., 1998,
33(3), 291 297
194. Hanley, A.B., Grinfeld, E., Baxter, R.L.: The Cleavage of Nucleic Acids in Reversed Micelles Using Site
Specific Endonucleases, Biocatalysis, 1990, 3, 253 258
195. Eicke, H.F., Shepherd, J.C.W., Steinemann, A.: Exchange of Solubilized Water and Aqueous-Electrolyte
Solutions between Micelles in Apolar Media, Journal of Colloid and Interface Science, 1976, 56(1), 168
176
196. Pietrini, A.V.: Biochemical Reactions in Micro- and Nanocompartments, ETH Diss No. 15216,
Eidgenssische Technische Hochschule Zrich, 2003
197. Pessoa Jr, A., Vitolo, M.: Separation of Inulinase from Kluyveromyces marxianus using Reversed Micellar
Extraction, Biotechnol. Techn., 1997, 11(6), 421 422
198. Krei, G., Meyer, U., Brner, B., Hustedt, H.: Extraction of -Amylase Using BDBAC-Reversed Micelles,
Bioseparation, 1995, 5, 175 183
199. Andrews, B.A., Pyle, D.L., Asenjo, J.A.: Effect of pH and Ionic Strength on the Partitioning of Four Proteins
in Reversed Micelle Systems, Biotechnol. Bioeng., 1993, 43(11),1052 1058

7
200. Fletcher, P.D.I., Parrot, D.: The partitioning of proteins between water-in-oil microemulsions and conjugate
aqueous phases, Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions I, 1988, 84(4), 1131 1144
201. Krei, G.A., Hustedt, H.: Extraktion von Enzymen Mittels Reverser Mizelle, Bio Engineering, 1992, 47(1), 99
111
202. Regalado, C., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Studies on the Purification of Peroxidase from Horseradish Roots
Using Reversed Micelles, Enz. Microb. Technol., 1996, 18(5), 332 339
203. Gklen, K.E., Hatton, T.A.: Liquid-liquid extraction of low-molecular weight proteins by selective
solubilisation in reversed micelles, Sep. Sci. Technol., 1987, 22, 831 841
204. Marcozzi, G., Correa, N., Luisi, P.L., Caselli, M.: Protein Extraction by Reversed Micelles: a Study of the
Factors Affecting the Forward and Backward Transfer of -Chymotrypsin and its Activity, Biotechnol.
Bioeng., 1991, 38(10), 1239 1246
205. Andrews, B.A., Haywood, K.: Effect of pH, Ion Type and Ionic Strength on Partitioning of Proteins in
Reversed Micelle Systems, J. Chromat. A, 1994, 668(1), 55 60
206. Pires, M.J., Aires-Barros, M.R., Cabral, J.M.S.: Liquid-Liquid Extraction of Proteins with Reversed Micelles,
Biotechnol. Prog., 1996, 12(3), 290 301
207. Kilikian, B.V., Bastazin, M.R., Minami, N.M., Gonalves, E.M.R., Pessoa Jr., A.: Liquid-liquid extraction by
reversed micelles in biotechnological processes, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2000, 17(1), 29
38
208. Castro, M.J.M., Cabral, J.M.S.: Reversed Micelles in Biotechnological Processes, Biotech. Adv., 1988, 6, 151
167
209. Kadam, K.I.: Reversed Micelles as a Bioseparation Tool, Enzyme Microb. Technol., 1986, 8, 266 273
210. Chang, Q.L., Chen, J.Y.: Purification of Industrial -amylase by Reversed Micellar Extraction, Biotechnol.
Bioeng., 1995, 48, 745 748
211. Chang, Q.L., Chen, J.Y., Zhang, X.F., Zhao, N.M.: Effect of the Cosolvent Type on the Extraction of -
Amylase with Reversed Micelles: Circular Dichroism Study, Enz. Microb. Technol., 1997, 20, 87 92
212. Regalado, C., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Protein Extraction by Reversed Micelles: Studies on the Recovery of
Horseradish Peroxidase, Biotechnol. Bioeng., 1994, 44, 674 681
213. Chang, Q.L. and Chen, J.Y.: Reversed Micellar Extraction of Trypsin: Effect of Solvent on the Protein
Transfer and Activity Recovery, Biotechnol. Bioeng., 1995, 46, 172 174
214. Shiomori, K., Kawano, Y., Kuboi, R., Komasawa, I.: Effective Purification Method of Large Molecular
Weight Proteins Using Conventional AOT Reversed Micelles, J. Chem. Eng., 1995
215. Dekker, M.: Enzyme recovery using reversed micelles, Ph.D. diss., Agricultural University of Wageningen,
Department of Food Engineering, Wageningen, Netherlands, 1990
216. Dekker, M., Koenen, P.H.M., vant Riet, K.: Trans. I. Chem. Eng., 1991, 69(C), 54
217. Forney, C.E., Glatz, C.E.: Extraction of Charged Fusion Proteins in Reversed Micelles: Comparison between
Different Surfactant Systems, Biotechnol. Prog., 1995, 11, 260 264
218. Leser, M.E., Wei, G., Luisi, P.L., Maestro, M.: Application of reverse micelles for the extraction of proteins,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 135, 629 635
219. Wolbert, R.B.G., Hilhorst, R., Voskuilen, G., Nachtegaal, H., Dekker, M., vant Riet K., Bijsterbosch, B.H.:
Protein transfer from an aqueous phase into reversed micelles: the effect of protein size and charge
distribution, Eur. J. Biochem., 1989, 184, 627 633
220. Carlson, A., Nagarajan, R.: Biotechnol. Prog., 1992, 8, 85
221. Hu, Z., Gulari, E.: Protein extraction using the sodium bis(2-ethylhexyl) phosphate (NaDEHP) reverse
micellar system, Biotechnol. Bioeng., 1996, 50(2), 203 206
222. Dekker, M., vantt Riet, K., Bijsterbosch, B.H., Fijneman, P., Hilhorst, R.: Mass transfer rate of protein
extraction with reversed micelles, Chem. Eng. J., 1986, 33, B27 B33
223. Kelley, B., Wang, D.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. II: Effect of
cosurfactant tail length, Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1209 1217
224. Sun, Y., Ichikawa, S., Sugiura, S., Furusaki, S.: Affinity extraction of proteins with a reversed micellar
system composed of Cibacron Blue-modified lecithin, Biotechnology and Bioengineering, 1998, 58(1), 58
64
225. Zhang, T., Lit, H., Chen, J.: Biochem. Eng. J., 1999, 4, 17 21
226. Hong, D.P., Lee, S.S., Kuboi, R.: Conformational transition and mass transfer in extraction of proteins by
AOT-alcohol-isooctane reverse micellar systems, J. Chromatography B, 2000, 743(1-2), 203 312
227. Lee, S.-S., Lee, B.-K., Choi, J.-S., Lee, J.-P.: Effect of Alcohol Addition on Back-Extraction of BSA and
Cytochrome c Using AOT Reverse Micellar System, Bull. Korean Chem. Soc. 2001, 22(8), 897 902
228. Dekker, M., vant Riet, K., Bijsterbosch, B.H., Wolbert, R.B.G., Hilhorst, R.: Mass transfer rate of protein
extraction with reversed micelles, Chem. Eng. Sci., 1990, 45(9), 2949 2957
229. Nishiki, T., Sato, A., Kataoka, T.: Solv. Ext. in the Process Industries, 1993, 2, 840
230. Yamada, Y., Kuboi, R., Komasawa, I.: Extraction of enzymes and their activities in AOT reverse micellar
systems modified with nonionic surfactants, J. Chem. Eng. Japan, 1994, 27(3), 404 409
Bibliografie

8
231. Nishiki, T., Muto, A., Kataoka, T., Kato, D.: Back extraction of proteins from reversed micellar to aqueous
phase : Partitioning behaviour and enrichment, Chemical Engineering Journal and The Biochemical
Engineering Journal, 1995, 59(3), 297 301
232. Lye, G.J., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Reverse micellar mass-transfer processes spray column extraction of
lysozime, AIChE J., 1996, 42(3), 713 726
233. Lye, G.J., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Protein extraction using reverse micelles: Kinetics of protein partitioning,
Chem. Eng. Sci., 1994, 49(19), 3195 3204
234. Albery, W.J., Choudhery, R.A., Atay, N.Z., Robinson, B.H.: Rotating diffusion cell studies of
microemulsions kinetics, J. Chem. Soc. Faraday Trans. I, 1987, 83(8), 2407 2419
235. Carneiro-da-Cunha, M.G., Aires-Barros, M.R., Tambourgi, E.B., Cabral, J.M.S.: Recovery of a Recombinant
Cutinase with Reversed Micelles in a Continuous Perforated Rotating Disc Contactor, Biotechnol. Techn.,
1994, 8, 413 418
236. Han, D.H., Lee, S.J., Hong, W.H.: Separation of Intracellular Proteins from Candida utilis Using Reversed
Micelles in a Spray Column, Biotechnol. Techn., 1994, 8, 105 110
237. Jarudilokkul, S., Stuckey, D.C.: Continuous forward and back extraction of lysozyme from egg white using
reverse micelles, Separation Science and Technology, 2001, 36(4), 657 669
238. Lo, T.C.: Commercial liquid-liquid extraction equipment in: Handbook of Separation Techniques for
Chemical Engineers (Schweitzer, P.A. ed.), McGraw-Hill, New York, 1988
239. Kelley, B.D., Wang, D.I.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. I: Principles
and protein-ligand systems Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1199 1208
240. Pires, M.J., Cabral, J.M.S.: Liquid-liquid extraction of a recombinant protein with reverse micelles, J. Chem.
Technol. Biotechnol., 1994, 61(3), 219 224
241. Chaudhuri, J.B.: 2
nd
Interlaken Conference on Advances in Purification of Recombinant Proteins, Interlaken,
Switzerland, March, 1991
242. Giovenco, S., Verheggen, F., Laane, C.: Purification of intracellular enzymes from whole bacterial cells using
reversed micelles, Enz. Microb. Technol., 1987, 9, 470 473
243. Han, D.H., Lee, Y.S., Hong, W.H., Direct Recovery of Intracellular Proteins from Candida utilis Using
Reversed Micelles in Combination with a Reducing Agent, Biotechnol. Techn., 1993, 8, 545 550
244. Hagen, A.J., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: Protein refolding in reversed micelles, Biotechnol. Bioeng., 1990,
35(10), 955 965
245. Hagen, A.J., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: Protein refolding in reversed micelles: interactions of the protein
with micelle components, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(10), 966 975
246. Guzmn, F., Barberis, S., Illanes, A.: Peptide synthesis: chemical or enzymatic, Electronic Journal of
Biotechnology, 2007, 10(2), 279 314, disponibil la:
http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue2/full/13/
247. Nametkin, S.N., Kolosov, M.I., Ovodov, S.Y., Alexandrov, A.N., Levashov, A.V., Alakhov, V.Y., Kabanov,
A.V.: Cell-Free Translation in Reversed Micelles, FEBS Letters, 1992, 309(3), 330 332
248. Haering, G., Pessina, A., Meussdoerffer, F., Hochkoeppler, S., Luisi, P.L.: Solubilization of Bacterial-Cells in
Organic-Solvents via Reverse Micelles and Microemulsions, Annals of the New York Academy of Sciences,
1987, 506, 337 344
249. Tawfik, D.S., Griffiths, A.D.: Man-Made Cell-Like Compartments for Molecular Evolution, Nature
Biotechnology, 1998, 16(7), 652 656
250. Griffiths, A.D., Tawfik, D.S.: Miniaturising the laboratory in emulsion droplets, Trends in Biotechnology,
2006, 24(9), 395 402
251. Sebba, F.: Sep. Sci. Techol., 1985, 20, 331
252. Sebba, F.: Foams and Biliquid Foams: Aphrons, Wiley, New York, 1987
253. Lee, D.W., Hong, W.H., Hwang, K.Y.: Removal of an Organic Dye from Water Using a Predispersed Solvent
Extraction, Separation Science and Technology, 2000, 35(12), 1951 1962
254. Kommalapati, R.R., Roy, D., Valsaraj, K.T., Constant, W.D.: Characterization of colloidal gas aphron
suspensions generated from plant-based natural surfactant solutions, Separation Science and Technology,
1996, 31, 2317 2333
255. Bredwell, M.D., Worden, R.M.: Mass transfer properties of microbubbles: 1. Experimental studies,
Biotechnology Progress, 1998, 14, 31 38
256. Kommalapati, R.R., Valsaraj, K.T., Constant, W.D., Roy, D.: Soil flushing using colloidal gas aphron
suspensions generated from a plant-based surfactant, Journal of Hazardous Materials, 1998, 60, 73 78
257. Roy, D., Valsaraj, K.T., Constant, W.D., Darji, M.: Removal of hazardous oily waste from a soil matrix using
surfactants and colloidal gas aphron suspensions under different flow conditions, Journal of Hazardous
Materials, 1994, 38, 127 144
258. Jutaporn, P.,

Jarudilokkul, S., Vitaya, V.B: Removal of Pyrene in Pumice by Biodegradable Surfactant in the
Forms of Colloidal Gas Aphron and Aqueous Solution, Paper 9-016 (P), Proceedings of the 2
nd
Regional
Conference on Energy Technology Towards a Clean Environment, 12-14 February 2003, Phuket, Thailand

9
259. Roy, D., Kommalapati, R.R., Valsaraj, K.T., Constant, W.D.: Soil flushing of residual transmission fluid:
application of colloidal gas aphron suspensions and conventional surfactant solutions, Water Research, 1995,
29, 589 595
260. Ciriello, S., Barnett, S.M., Deluise, F.J.: Removal of heavy-metals from aqueous-solutions using microgas
dispersions, Separation Science and Technology, 1982, 4, 521 534
261. Cabezon, L.M., Caballero, M., Diaz, J.M., Perezbustamante, J.A.: Multi-elemental separation and
determination of some heavy-metals (Cu, Co, Cd, and Ni) in tap water and high salinity media by CGA
(Colloidal Gas Aphron) coflotation, Analysis, 1991, 4, 123 127
262. Roy, D., Valsaraj, K.T., Kottaisa, S.A.: Separation of organic-dyes from waste-water by using colloidal gas
aphrons, Separation Science and Technology, 1992, 27, 573 588
263. Basu, S., Malpani, P.R.: Removal of methyl orange and methylene blue dye from water using colloidal gas
aphron effect of processes parameters, Separation Science and Technology, 2001, 36(13), 2997 3013
264. Cilliers, J.J., Bradshaw, D.J.: The flotation of fine pyrite using colloidal gas aphrons, Minerals Engineering,
1996, 9, 235 241
265. Subramaniam, M.B., Blakebrough, N., Hashim, M.A.: Clarification of suspensions by colloidal gas aphrons,
Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1990, 48, 41 60
266. Hashim, M.A., Sengupta, B., Subramaniam, M.B.: Investigations of the flotation of yeast-cells by colloidal
gas aphrons (CGA) dispersions, Bioseparation, 1995, 5, 167 173
267. Jauregi, P., Varley, J., Gilmour, S.: Characterization of gas aphrons for subsequent use for protein recovery,
Chemical Engineering Journal, 1997, 65, 1 11
268. Jauregi, P., Varley, J.: Colloidal gas aphrons: A novel approach to protein recovery, Biotechnology and
Bioengineering, 1998, 59, 471 481
269. Noble,M., Brown, A., Jauregi, P., Kaul, A., Varley, J.: Protein recovery using gasliquid dispersions, Journal
of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1998, 711(1-2), 31 43
270. Amiri, M.C., Valsaraj, K.T.: Effect of gas transfer on separation of whey protein with aphron flotation,
Separation and Purification Technology, 2004, 35, 161 167
271. Jarudilokkul, S., Rungphetcharat, K., Boonamnuayvitaya, V.: Protein separation by colloidal gas aphrons
using nonionic surfactant, Separation and Purification Technology, 2004, 35, 23 29
272. Jauregi, P.: Recovery of value added food products using colloidal gas aphrons, SCI London, 30
th
March,
2006
273. Fuda, E., Bhatia, D., Jauregi, P.: Selective separation of -lactoglobulin from sweet whey using CGAs
generated from the cationic surfactant CTAB, Biotechnology and Bioengineering, 2005, 90(5), 532 542
274. Jauregi, P., Varley, J.: Colloidal gas aphrons: potential applications in biotechnology, Trends in
Biotechnology, 1999, 17, 389 395
275. Tseng, H., Pilon, L., Warrier, G.R.: Rheology and convective heat transfer of colloidal gas aphrons in
horizontal mini-channels, International Journal of Heat and Fluid Flow, 2006, 27, 298 310
276. Perescu, N.: Chimia extraciei cu solveni i aplicaii, Ed. Academiei, Bucureti, 1985
277. Wang, J., Langemann, H.: Unsteady two-film model for mass transfer accompanied by chemical reaction,
Chemical Engineering Science, 1994, 49(20), 3457 3463
278. Lewis, W.K., Whitman, W.G.: Principles of gas absorption, Industrial Engineering Chemistry, 1924, 16,
1215
279. Bart, H.-J., Stevens, G.W.: Reactive Solvent Extraction in: Ion Exchange and Solvent Extraction (Marcus, Y.,
SenGupta, A.K., Marinski, J.A. eds.), 17, Marcel Dekker, New York, 2004
280. Schfer, J.P., Sluyts, D.: VDI-Jahrbuch; VDI/GVC, VDI-Verlag, Dsseldorf, 1996, 285 295
281. Ritcey, G.M.: in Value Adding Through Solvent Extraction (Shallcross, D.C., Paimin, R., Prvcic, L.M.
eds.), The University of Melbourne, Melbourne, 1996, 17 24
282. Cox, M.: Solvent Extraction in Hydrometallurgy in: Solvent Extraction Principles and Practice (Rydberg, J.,
Cox, M., Musicas, C., Choppin, G.R. eds.), 2
nd
ed., Marcel Dekker, New York, 2004
283. Jercan, E.: Metode de separare n chimia analitic, Ed. Tehnic, Bucureti, 1983
284. Gavril, L.: Elaborarea unor tehnologii de recuperare a nichelului sub form de sulfat de nichel, clorur de
nichel sau nichel metalic, din soluiile provenite de la dezagregarea catalizatorilor uzai referat n cadrul
tezei de doctorat, Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai, 1994
285. Pedersen, C.J.: The Discovery of Crown Ethers, Nobel lecture, December 8, 1987, disponibil la:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1987/pedersen-lecture.pdf
286. Gutsche, D.: Calixarenes: a personal history, in: Calixarenes in the nanoworld (Vicens, J., Harrowfield, J.,
Baklouti, L. eds.), Springer, Doordrecht, 2007, 1 20
287. * * * Crown ether, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Crown_ethers
288. * * * Valinomycin, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Valinomycin
289. Gamse, T.: Liquid Liquid Extraction and Solid Liquid Extraction, Graz University of Technology, 2002,
disponibil la: www.iq.uva.es/separacion/archivos/SkriptumExtraction.pdf
290. Halwachs, W.: Reaktivextraktion, Habilitationsschrift, Universitt Hannover, 1981, disponibil la:
www.halwachs.de/solvent-extraction.htm
291. Sattler, K., Feindt, H.J.: Thermal Separation Processes: Principles and Design, VCH, Weinheim, 1995
Bibliografie

10
292. Hano, T., Matsumoto, M., Ohtake, T., Sasaki, K., Hare, F., Kawano, Y.: Extraction equilibria of organic acids
with tri-n-octylphosphineoxide, J. Chem. Eng. Jpn., 1990, 23(6), 734 738
293. Pagel, H.A., McLafferty, F.W.: Anal. Chem., 1948, 20, 272
294. Pagel, H.A., Schwab, K.D.: Anal. Chem., 1950, 22, 1207
295. Marcus, Y., Kertes, A.S.: Ion Exchange and Solvent Extraction of Metal Complexes, Wiley-Interscience,
London, 1969
296. Putemans, M., Dryon, L., Massart, D.C.: Analytica Chimica Acta, 1984, 161, 221
297. Lukhezo, M., Dunne, L.J., Reuben, B.G., Verrall, M.S.: Statistical mechanical treatment of reactive solvent
extraction, Chemical Physics, 1997, 220, 53 61
298. Kumar, S., Babu, B.V., Wasewar, K.L.: Recovery of Propionic Acid using Reactive Extraction, Indian
Chemical Engineering Congress, CHEMCON 2006, 27 30 dec. 2006, Ankleshwar, India, disponibil la:
http://discovery.bits-pilani.ac.in/discipline/chemical/BVb/ RE_SK_BVB_KLW_ Chemcon-
2006_FullPaper.pdf
299. Yang, S.-T., White, S.A., Hsu, S.-T.: Extraction of carboxylic acids with tertiary and quaternary amines:
effect of pH, Ind. Eng. Chem. Res., 1991, 30(6), 1331 1335
300. Castiblanco, D.A., Martnez, M., Serrato, J.C., Bejarano, P.J.: Estudio de la extraccin reactiva de cido
lctico con el sistema trioctilamina-isodecanol, XXII Interamerican Congress of Chemical Engineering, 1 4
oct. 2006, Buenos Aires, Argentina, disponibil la:
http://dpi.eq.ufrj.br/ciaiq_22/CD/formCrCongreso/papers/13a/13a_383.pdf
301. Schgerl, K.: Extraction of Primary and Secondary Metabolites, Advanced in Biochemical Engineering/
Biotechnology, 2005, 92, 1 48
302. Oniscu, C., Mereu, A., Cacaval, D., Duca, G.: Selective Separation of Organic Oxyacids from Aqueous
Phase by Reactive Extraction, Romanian Biotechnological Letters, 2002, 7(5), ediie electronic, disponibil
la: http://www.unibuc.ro/eBooks/biologie/RBL/Archive/2002/nr5/art8.htm
303. Mereu, A.: Optimizarea tehnologiei de obinere a unor oxiacizi din deeurile oenologice, Tez de doctorat,
Universitatea de Stat din Moldova, Chiinu, 2004
304. von Frieling, P., Schgerl, K.: Recovery of lactic acid from aqueous model solutions and fermentation broths,
Process Biochemistry, 1999, 34(6-7), 685 696
305. Hong, Y.K., Hong, W.H., Chang, H.N.: Selective extraction of succinic acid from binary mixture of succinic
acid and acetic acid, Biotechnological Leters, 2000, 22, 871 874
306. Hong, Y.K., Hong, W.H.: Removal of acetic acid from aqueous solutions containing succinic acid and acetic
acid by tri-n-octylamine, Separation and Purification Technology, 2005, 42, 151 157
307. Song, H., Lee, S.Y.: Production of succinic acid by bacterial fermentation, Enzyme and Microbial
Technology, 2006, 39, 352 361
308. Huh, Y.S., Jun, Y.-S., Hong, Y.K., Song, H., Lee, S.Y., Hong, W.H.: Effective purification of succinic acid
from fermentation broth produced by Mannheimia succiniciproducens, Process Biochemistry, 2006, 41, 1461
1465
309. Baniel, A.M., European Patent, no. EP 49429, 1982; Chem. Abs., 97, 109557, 1982
310. Nelson, D.L., Cox, M.M.: Lehninger Principles of Biochemistry, 4
th
ed., W.H. Freeman, 2004
311. Itoh, M., Thien, M.P., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: A liquid emulsion membrane process for the separation of
amino acids, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(9), 853 - 860
312. Shinkai, S., Inuzuka, K., Hara, K., Stone, T., Manabe, O.: Bull. Chem. Soc. Jpn., 1984, 57, 2150
313. Shinkai, S., Minami, T., Araragi, Y., Manabe, O.: J. Chem. Perkin Trans. II, 1985, 503
314. Mutihac, L., Mutihac, R., Constantinescu, T., Luca, C.: The transport of amino acids by 18-crown-6 through
liquid membranes, Journal of inclusion phenomena and molecular recognition in chemistry, 1994, 17(1), 45
51
315. Hermann, T.: Industrial production of amino acids by coryneform bacteria, Journal of Biotechnology, 2003,
104, 155 172
316. Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction, A.-I.: Selective separation of amino acids by reactive extraction,
Biochemical Engineering Journal, 2001, 7(3), 171 176
317. Kelly, N.A., Lukhezo, M., Reuben, B.G., Dunne, L.J., Verrall, M.S.: Reactive solvent extraction of amino
acids with cationic extractants, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1998, 72(4), 347 355
318. Eyal, A.M., Kogan, L., Bressler, E.: Extraction of metal salts by mixtures of water-immiscible amines and
organic acids (acid-base couple extractants). I: A review of distribution and spectroscopic data and of
proposed extraction mechanisms, Industrial & Engineering Chemistry Research, 1994, 33(5), 1067 1075
319. Eyal, A.M., Kogan, L., Bressler, E.: Extraction of metal salts by mixtures of water-immiscible amines and
organic acids (acid-base couple extractants). II: Theoretical treatment and analysis, Industrial & Engineering
Chemistry Research, 1994, 33(5), 1076 1085
320. Eyal, A.M.: Acid extraction by acid-base coupled extractants, Solvent Extraction and Ion Exchange,1995, 13,
31 93
321. Syzova, N., Eyal, A.M., Vitner, A., Hazan, B.: Extraction of dicarboxylic acids by ABC extractants, Solvent
Extraction and Ion Exchange, 2004, 22(1), 51 67

11
322. Eyal, A.M., Cohen-Sydov, N.: Process for the separation of amino acids and their salts from an aqueous
solution, US Patent 6171501, 2001
323. Smirnova, S., Torocheshnikova, I., Formanovsky, A., Pletnev, I.: Solvent extraction of amino acids into a
room temperature ionic liquid with dicyclohexano-18-crown-6, Analytical and Bioanalytical Chemistry,
2004, 378(5), 1369 1375
324. Metzger, A., Gloe, K., Stephan, H., Schmidtchen, F.P.: Molecular recognition and phase transfer of
underivatized amino acids by a foldable artificial host, J. Org. Chem., 1996, 61(6), 2051 2055
325. Jeong, K.-S., Park, T.-Y.: Complexation and transport of zwitterionic amino acids by an artificial receptor,
Bull. Korean Chem. Soc., 1999, 20(2), 129 131
326. Tsukube, H., Wada, M., Shinoda, S., Tamiaki, H.: Porphyrinatoerbiumcrown ether conjugate for synergistic
binding and chirality sensing of zwitterionic amino acids, Chem. Commun., 1999, 1007 1008
327. Oshima, T., Goto, M., Furusaki, S.: Extraction behavior of amino acids by calix[6]arene carboxylic acid
derivatives, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002, 43(1-2), 77 86
328. Oshima, T., Inoue, K., Uezu, K., Goto, M.: Dominant factors affecting extraction behavior of amino
compounds by a calix[6]arene carboxylic acid derivative, Analytica Chimica Acta, 2004, 509(2), 137 144
329. Tabakci, M., Tabakci, B., Yilmaz, M.: Design and synthesis of new chiral calix[4]arenes as liquid phase
extraction agents for -amino acid methylesters and chiral -amines, Journal of Inclusion Phenomena and
Macrocyclic Chemistry, 2005, 53(1-2), 51 56
330. Puttemans, M., Dryon, L., Massart, D.C.: Anal. Chim. Acta, 1984, 161, 221
331. Likidis, Z., Schgerl, K.: Bioprocess Engineering, 1988, 3(2), 79
332. Likidis, Z., Schgerl, K.: Chemical Engineering Science, 1988, 43(1), 27
333. Wei, L.S.: Reactive extraction of antibiotics: equilibrium and kinetic study, Thesis, Faculty of Chemical and
Natural Resource Engineering, University of Technology, Malaysia, 2005
334. Bora, M.M., Dutta, N.N., Bhattacharya, K.G.: Extraction equilibria of Cephalosporin antibiotics with Aliquat
336, Journal of Chemical and Engineering Data, 2000, 45(2), 399 403
335. Hano, T., Matsumoto, M., Ohtake, T., Hori, F.: Reactive extraction of Cephalosporin C, Journal of Chemical
Engineering of Japan, 1992, 25(3), 293 297
336. Harris, T.A.J., Khan, S., Reuben, B.G., Shokaya, T.: Sep. Biotechnol., 2, Elsevier, London, 1990, 172
337. Bora, M.M., Ghosh, A.C., Dutta, N.N., Mathur, R.K.M.: Reactive extraction of 6-aminopenicillanic acid with
Aliquat-366: Equilibrium and kinetics, Canadian Journal of Chemical Engineering, 1997, 75(3), 520 526
338. Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction A.-I.: Separation of 6-Aminopenicillanic Acid by Reactive Extraction,
Romanian Biotechnological Letters, 2002, 7(5), 917 924
339. * * * Gluconic acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Gluconic_acid
340. Inci, I.: Extraction of gluconic acid with organic solutions of Alamine 336, Chem. Biochem. Eng. Q., 2002,
16(4), 185 189
341. * * * Cinnamic acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Cinnamic_acid
342. Cmru, M., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Separation of trans-cinnamic acid by reactive extraction with
Amberlite LA-2 in low-polar solvent. 1. Mechanism of separation process, Romanian Biotechnological
Letters, 2006, 11(5), 2897 2903
343. Garbe, D.: Cinnamic Acid in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6
th
ed., electronic release,
Wiley Interscience, New York, 2002
344. Folkers, K.: Int. J. Vitam. Nutr. Res., 1969, 39, 334
345. Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Metabolii secundari cu aplicaii farmaceutice, cosmetice i alimentare, Casa
de Editur Venus, Iai, 2006
346. Blum, R.: Niacin (Nicotinic Acid, Nicotinamide) in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6
th
ed.,
electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002
347. Kumar, S., Wasewar, K.L.: Intensification of recovery of nicotinic acid using reactive extraction: Equilibrium
study, 59
th
Indian Chemical Engineering Congress, Chemcon 2006, 27 30 Dec. 2006, Bharuch-
Ankhleshwar, Gujarat, India
348. *** Folic Acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Folic_acid
349. Brody, T., Shane, B.: Folic Acid in: Handbook of Vitamins, 3
rd
ed. (Rucker, R.B., Suttie, J.W., McCormick,
D.B., Machlin, L.G. eds.), Marcel Dekker, New York, 2001
350. Weimann, B.J., Hengartner, U., de Saizieu, A., Wehrli, C.: Folic Acid in: Ullmanns Encyclopedia of
Industrial Chemistry, 6
th
ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002
351. Galaction, A.-I., Blaga, A.-C., Cacaval, D.: Kinetic study of folic acid reactive extraction, Romanian
Biotechnological Letters, 2005, 10(4), 2283 2290
352. * * * Vitamin C, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C
353. Harris, R.J.: Ascorbic Acid: Subcellular Biochemistry, Springer, Berlin, 1996
354. Oster, B., Fechtel, U.: Vitamin C (L- Ascorbic Acid) in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6
th

ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002
355. * * * BASF, Annual Report, 2003, Appendix 4.2, 5.1.
356. Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Folescu, E., Cacaval, D.: Separation of vitamin C by reactive extraction
1. Mechanism and influencing factors, Romanian Biotechnological Letters, 2004, 9(6), 1917 1924
Bibliografie

12
357. Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Kinetic study of vitamin C reactive extraction with Amberlite
LA-2, Bull. Inst. Pol. Iai, 2005, 50(3-4),
358. Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Separation of vitamin C by reactive extraction 2. Mathematical
modeling of extraction process, Romanian Biotechnological Letters, 2004, 9(6), 1939 1946
359. Steensma, M.: Chiral separation of amino-alcohols and amines by fractional reactive extraction, PhD Thesis,
University of Twente, 2005
360. Schmidt, K.F.: Mirror-image molecules: new techniques promise more potent drugs and pesticides -
controlling the "handedness" of enantiomers, Science News, 29 Mai, 1993
361. Guiu Rozas, E.: Tunable chiral ligands for Ir and Rh hydrogenation processes. Synthesis of
enantioamerically enriched amines, PhD Thesis, Universitat Rovira i Virgili, 2003
362. Takeuchi, T., Horikawa, R., Tanimura, T., Kabasawa, Y.: Resolution of DL-valine by countercurrent solvent
extraction with continuous sample feeding, Separation Science and Technology, 1990, 25(7-8), 941 951
363. Sheldon, R.A.: Chirotechnology, Industrial synthesis of optically active compounds, Marcel Dekker Inc.,
New York, 1993
364. Takeuchi, T., Horikawa, R., Tanimura, T.: Enantioselective solvent extraction of neutral DL-amino acids in
two-phase systems containing N-n-alkyl-L-proline derivatives and copper(II) ion, Analytical Chemistry,
1984, 56, 1152 1155
365. Pickering, P.J., Chaudhuri, J.B.: Equilibrium and kinetic studies of the enantioselective complexation of
(D/L)-phenylalanine with copper (II) N-decyl-(L)-hydroxiproline, Chemical Engineering Science, 1997,
52(3), 377 386
366. Nishizawa, H., Tahara, K., Hayashida, A., Abe, Y.: Continuous separation method with liquid particle
extractor: enantioseparation of ()-mandelic acid, Anal. Sci., 1993, 9(5), 611 615
367. Jiao, F., Huang, K., Yuan, X., Zhao, X., Yu, J.: Extraction and separation of racemic -cyclohexyl-mandelic
acid using chiral ligand as selector, Pakistan Journal of Biological Sciences, 2006, 9(6), 1149 1153
368. Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Identification of enantioselective extractants for
chiral separation of amines and aminoalcohols, Chirality, 2006, 18(5), 314 328
369. Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Modelling and experimental evaluation of reaction
kinetics in reactive extraction for chiral separation of amines, amino acids and amino-alcohols, Chemical
Engineering Science, 2007, 62(5), 1395 1407
370. Tang, K.-W., Chen, G.-B., Yi, J.-M., Zhang W.-Z.: Enantioselective separation of ofloxacin enantiomers by
chiral ligand exchange, Huaxue xuebao, 2004, 62(17), 1621 1625
371. Abe, Y., Shoji, T., Kobayashi, M., Qing, W., Asai, N., Nishizawa, H.: Enantioselective distribution of amino-
alcohols in a liquid-liquid two-phase system containing dialkyl L-tartrate and boric acid, Chem. Pharm. Bull.,
1995, 43(2), 262 265
372. Abe, Y., Shoji, T., Fukui, S., Sasamoto, M., Nishizawa, H.: Enantioseparation by dual-flow countercurrent
extraction: its application to the enantioseparation of (6)propanolol, Chem. Pharm. Bull., 1996, 44(8), 1521
1524
373. Prelog, V., Stojanac, Z., Kovacevic, K.: ber die Enantiomerentrennung durch Verteilung zwischen flssigen
Phasen, Helv. Chim. Acta., 1982, 65(1), 377 384
374. Prelog, V., Mutak, S., Kovacevic, K.: ber die Enantiomerentrennung durch Verteilung zwischen flssigen
Phasen, 3. Mitteilung, Selektivitt der lipophilen Weinsareester fr chirale Ammonium-Salze verschiedener
Konstitution und Konfiguration, Helv. Chim. Acta., 1983, 66(7), 2279 2284
375. Prelog, V., Kovacevic, M., Egli, M.: Lipophilic tartaric acid esters as enantioselective ionophores, Angew.
Chem. Int. Ed., 1989, 28, 1147 1152
376. Ogasahara, K., Hirose, K., Tobe, Y., Naemura, K.: Preparation of optically active azophenolic crown ethers
containing 1-phenylethane-1,2-diol and 2,4-dimethyl-3-oxapentane-1,5-diol as a chiral subunit: temperature-
dependent enantiomer selectivity in the complexation with chiral amines, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,
1997, 3227 3236
377. Hirose, K., Nakamura, T., Nishioka, R., Ueshige, T., Tobe, Y.: Preparation and evaluation of novel chiral
stationary phases covalently bound with chiral pseudo-18-crown-6 ethers, Tetrahedron Letters, 2003, 44,
1549 1551
378. Naemura, K., Nishikawa, Y., Fuji, J., Hirose, K., Tobe, Y.: Tetrahedron: Asymmetry, 1997, 8, 873
379. Kim, J., Song, S., Kim, J., Kim, T.H., Kim, H., Suh, H.: Synthesis of chiral azophenolic pyridino-18-crown-6
ether and its enantiomeric recognition toward chiral primary amines, Bull. Korean Chem. Soc., 2006, 27(10),
1577 1580
380. Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Influence of process parameters on extraction
equilibria for the chiral separation of amines and amino-alcohols with a chiral crown ether, Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, 2006, 81(4), 588 597
381. Kuipers, N.J.M., Steensma, M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Chiral separation of amines and aminoalcohols by
fractional reactive extraction, Chemie Ingenieur Technik, 2006, 78(9), 1378
382.

Curs TSCB 2007 2008

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Curs TSCB 2007 2008

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Soluii apoase bifazice

You might also like