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INTRODUCCIÓN

El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente


movilizable. Es un polímero muy grande y ramificado de residuos de
glucosa, unidos en su mayoría por enlaces glucosídicos α -1,4. Las
ramificaciones se forman por enlaces α -1,6, los cuales se presentan con
frecuencia aproximada de uno por cada diez residuos.

La presencia de glucógeno incrementa fuertemente la cantidad de glucosa


disponible inmediatamente entre las comidas y durante la actividad
muscular. Los lugares principales de almacenamiento del glucógeno son el
hígado y el músculo esquelético, siendo en el hígado mayor la
concentración (10% de la masa hepática y en los músculos 1% de la masa
muscular). Además, pueden encontrarse pequeñas cantidades de
glucógeno en ciertas células gliales del cerebro.
El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos con un
diámetro variable de entre 10 y 40 nm; estos gránulos contienen proteínas
reguladoras y también las enzimas que catalizan la síntesis y degradación
del glucógeno a glucosa, la cual es liberada al torrente sanguíneo
rápidamente, en caso de necesidad; como en los casos de tensión o alerta,
el glucógeno se degrada nuevamente a glucosa, que queda disponible para
el metabolismo energético.
Gracias a la capacidad de almacenamiento de glucógeno, se reducen al
máximo los cambios de presión osmótica que la glucosa libre podría
ocasionar tanto en el interior de la célula como en el medio extracelular.
En el hígado la conversión de glucosa almacenada en forma de glucógeno a
glucosa libre en sangre, está regulada por la hormona glucagón y
adrenalina.
El glucógeno se almacena dentro de vacuolas en el citoplasma de las
células que lo utilizan para la glucólisis. Estas vacuolas contienen las
enzimas necesarias para la hidrólisis de glucógeno a glucosa.
La regulación del metabolismo del glucógeno se ejecuta a través de las dos
enzimas; la glucógeno sintetasa que participa en su síntesis, y la glucógeno
fosforilasa en la degradación. Tanto la glucógeno sintetasa como la
glucógeno fosforilasa se regulan por un mecanismo de modificación
covalente.
Las hormonas adrenalina y glucagón activan las proteínas quinasas que
fosforilan ambas enzimas, provocando activación de la glucógeno
fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno; mientras que la
glucógeno sintetasa disminuye su actividad, lo que inhibe la síntesis de
glucógeno.
La hormona insulina provoca la desfosforilación de las enzimas, en
consecuencia la glucógeno fosforilasa se hace menos activa, y la glucógeno
sintetasa se activa, lo que favorece la síntesis de glucógeno.
Es decir, que hormonas como la adrenalina y el glucagón favorecen la
degradación del glucógeno, mientras que la insulina estimula su síntesis.

OBJETIVOS
• Determinar la variación de la concentración, en el tiempo, de glucógeno y
glucosa en cortes de hígado de rata en solución de Krebs, para confirmar
así el rol de éste en la regulación de la glicemia sanguínea, a través de
procesos como la glucogenolisis.
• Perfeccionar la realización de la técnica de GOD-PAP para la determinación
de glucosa.
• Aprehender a determinar cuantitativamente la concentración de glucógeno
hepático.

MATERIALES Y MÉTODOS
Material
es
Tubos de ensayo Reactivos
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 5 mL
Propipeta verde Solución de Krebs (isotónica con
Propipeta azul el plasma)
Micropipeta 200 – 1000µ L Ácido Tricloroacético 5%
Puntas para micropipeta Reactivo de Lugol
Recipiente para puntas usadas Kit para determinación
Papel filtro enzimática de glucosa (GOD-
Marcador PAP) (tampón fosfato, pH 7.3,
Vórtex 100mmol; fenol 16mmol/L; 4-
Baño termorregulado para la Incubación aminoantipirina 0.25mmol/L;
Tubos Khan
glucosa oxidasa ≥ 20000U/L;
Espectrofotómetro
Cubetas para espectrofotómetro peroxidasa ≥ 1000U/L).
Gradillas para Cubetas Solución estándar de glucógeno
Mortero 0.05 g%
Embudo Solución estándar 20 mg%
Balanza
Cronómetro

• PREPARACIÓN DE CORTES DE HÍGADO: Un momento antes del práctico algunos


compañeros se ofrecieron, de forma voluntaria, a sacrificar las ratas1.
Utilizando guantes de procedimiento, tijeras y pinzas, se extrajo el hígado y
a continuación se puso en un vaso precipitado con suero fisiológico. Se
hacen cortes delgados que se dejan sobre una placa petri sobre hielo. Se
pesaron en la balanza2 tres porciones de cortes de aprox. 150 mg cada
uno, los trozos no deben diferir entre sí en más de 10 mg. Se colocan las
porciones en 3 tubos rotulados como: 0’, 10’ y 30’.

• INCUBACIÓN: A cada tubo se le agregó 2 mL de solución de Krebs para su


posterior incubación en el baño termorregulado a 37°C cronometrando
diferentes tiempos: 0’, 10’ y 30’. Terminado dicho tiempo, se vacía el

1
Por lo demás, bien alimentadas y en situación de stress controlado, para que no secreten
adrenalina y no liberen el glucógeno de su hígado.
2
Tarada previamente con el respectivo tubo de ensayo para cada muestra del tejido
sobrenadante líquido en otra serie de tubos, con el cual se determinará la
glucosa liberada, utilizando el método enzimático GOD-PAP.

• Los trozos de tejidos que quedaron en los tubos incubados servirán para
determinar el glucógeno.

Tubos 0’ 10’ 30’


Cortes de Hígado (mg) 150 150 150
Solución de Krebs (mL) 2.0 2.0 2.0
Tiempo de incubación 37°C 0 10 30
(minutos)

• DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCÓGENO HEPÁTICO


El tubo que corresponde al tiempo cero (F1) de nuestro experimento,
contiene sólo el trozo de hígado. En él, rápidamente agregamos 5mL de
TCA 5%, llevamos a vórtex, para luego vaciar el contenido3 a un mortero y
triturar por aproximadamente 5 minutos, hasta homogeneizar
completamente. Una vez filtrado4, se determina el contenido de glucógeno,
tomando 0.5 mL del filtrado, agregándole 1.5 mL de TCA 5% y 0.25mL de
Reactivo de Lugol, lo que se lleva a Vórtex para mezclar por agitación. Este
procedimiento se repitió de forma exacta en los otros tiempos de
incubación: 10’ y 30’, en los tubos F2 y F3, respectivamente.
Para cuantificar el glucógeno, se prepararon dos estándar (Std) y un
tubo Blanco (Bco). Se vació el contenido de los tubos en las cubetas para
espectrofotómetro, previamente escogidas por los docentes a cargo, para
leer a 540nm.

Tubos 0’ 10’ 30’ Estándar Blanco


Filtrado (ml) 0.5 0.5 0.5 - -
TCA 5% (ml) 1.5 1.5 1.5 1.0 2.0
Glucógeno
- - - 1.0 -
0.05% (ml)
Reactivo yodo
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
(ml)

• DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCOSA (GOD-PAP)


La glucosa liberada desde el hígado al líquido de incubación (al detectar
una falsa hipoglicemia, condicionada por la solución de Krebs) es
determinada cuantitativamente a través del método enzimático GOD-PAP.
Para llevar a cabo el procedimiento, colocamos 100µ L del sobrenadante a
3 tubos rotulados (S1, S2 y S3), posteriormente se agrega 1.5mL de Reactivo
enzimático, se mezcla por agitación en Vórtex e incubamos 10 minutos a
37°C en el baño termorregulado.
Finalmente, para leer a espectrofotómetro se preparan dos tubos Estándar
y un Blanco, se vacía el contenido en cubetas para espectrofotómetro y se
lee a 500nm.

3
Cuidadosamente, no bruscamente como dice la guía, pues sino, salta fuera del mortero.
4
Aunque no lo hicimos en el práctico, antes del filtrado se puede centrifugar (para mejores
resultados)
Estándar
0’ (S1) 10’ (S2) 30’ (S3) Blanco
(x2)
Sobrenadante 100 100 100 - -
Estándar 20mg%
- - - 100 -
(µ L)
Reactivo
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Enzimático (µ L)

RESULTADOS
Realizamos una regla de 3 simple pues tenemos la concentración y
absorbancia del estándar de glucosa y glucógeno, lo cual nos permite
calcular la concentración de las otras muestras.
Para glucógeno:
0.25 mg/ml --------> 0.316 X = 0.69 mg/ml
X mg/ml --------> 0.869

GLUCOGENO (longitud de [mg/ml]


onda: 540nm) glucógeno
std1 0.321 0.25
std2 0.310 0.25
0’ 0.869 0.69
15’ 0.631 0.50
30’ 0.458 0.36
De acuerdo a los
resultados, la concentración de glucógeno va disminuyendo a medida que
aumentan los minutos, debido a que el hígado gasta sus reservas con el fin
de aumentar la concentración de glucosa en la solución.

Para glucosa:
0.2 mg/ml --------> 0.387 X = 0.18 mg/ml
X mg/ml --------> 0.340

GLUCOSA (longitud de [mg/ml]


onda: 500nm) glucosa
std1 0.388 0.20
std2 0.385 0.20
0’ 0.340 0.18
15’ 0.502 0.26
30’ 0.605 0.31
Según los resultados
anteriores, la concentración de glucosa aumenta a medida que transcurre
el tiempo, pues el hígado regula la glicemia transformando el glucógeno en
glucosa por el proceso de glucogenolisis.

* Para el cálculo de las concentraciones se utilizó el promedio de los estándares para glucosa y
glucógeno.

En el grafico se observa que la concentración de glucógeno disminuye a


mayor tiempo, en cambio la de glucosa aumenta. Esto se debe a que el
hígado, órgano que se encarga de regular la glicemia sanguínea entre sus
funciones, trata de aumentar la concentración de glucosa en la solución de
Krebs a partir del glucógeno disponible (glucogenolisis), razón por la cual la
concentración de éste último disminuye.

* Para determinar las variaciones de ambas concentraciones en el tiempo, se utilizaron cortes


de hígado de rata.

CONCLUSIÓN
Desarrollado ya el práctico, por los resultados obtenidos, hemos podido
cumplir el objetivo del estudio de glucógeno en tejido hepático junto con
observar la relación entre la cantidad de glucógeno presente y la cantidad
de glucosa que se obtenía de la misma muestra al pasar el tiempo. La
relación que se obtuvo era la esperada en donde la cantidad de glucógeno
disminuía conforme pasaba el tiempo debido al proceso de glucogenolisis el
cual aumentaba la cantidad de glucosa en la muestra. Sucede con el corte
de tejido hepático al ser sometido a un medio similar al plasma sanguíneo
carente de glucosa. Tal como indica la teoría, se ve favorecida la
glucogenólisis para liberar glucosa a la sangre, o, si fuera el caso de un
paciente humano, para contrarrestar la hipoglicemia.
Para la cuantificación de glucógeno y glucosa se detuvieron las reacciones
con la aplicación de ATC al 5% el cual mantuvo constantes las cantidades
de glucógeno mientras se procedía con la muestra de tejido hepático.
Para esto se tomó el sobrenadante una vez incubada la muestra de tejido
hepático a 37°C por distintos valores de tiempo, el que se procedió a
estudiar por el método GOD-PAP para determinar la concentración de
glucosa, el cual, como se trató en el práctico anterior, se fundamenta en la
generación de un compuesto coloreado que es proporcional a la cantidad
de glucosa en la muestra y que es sometido a estudio espectrofotométrico.
Los resultados como ya hemos mencionado fueron los esperados ya que
conforme las muestras tenían un mayor tiempo de incubación se observaba
un aumento en la cantidad de glucosa, esto debido a que el medio era el
apropiado y, al no contener sustratos, predominaba el proceso de
formación de glucosa.
Para la cuantificación de glucógeno también se procedió con técnicas
espectrofotométricas debido a la propiedad de este de dar coloración caoba
con el yodo. Una vez detenida la reacción se procedió a sacar el glucógeno
de las células con métodos mecánicos triturando el trozo de hígado. Luego
se tomo un poco de la solución resultante y se le aplicó reactivo de lugol
para dejar reposar por 5 minutos y llevar a espectrofotómetro. La tendencia
de los resultados fue la esperable, donde la cantidad de glucógeno había
disminuido mientras más tiempo de incubación había tenido la muestra,
pues éste se había degradado a glucosa por el proceso de glucogenolisis.
Situación que se observa en las personas cuando es necesario aumentar el
nivel de glucosa en la sangre debido a un ayuno o ejercicio intenso, el
hígado recurre a sus reservas de glucógeno el cual es degradado a glucosa
y liberada a la sangre, para así mantener una glicemia constante, ya que el
hígado cumple un importante rol en la regulación de ésta.
Podemos concluir además, que la degradación de glucógeno es un proceso
relativamente rápido; en un intervalo de aproximadamente 30 minutos la
concentración de las reservas de glucógeno en el hígado ya había
disminuido considerablemente, según los datos obtenidos mediante
espectrofotometría, y, por el contrario, la concentración de glucosa liberada
había aumentado

DISCUSIÓN
Una vez mas fue utilizado el método GOD-PAP del cual se conoce su
aplicación en la determinación de presencia de glucosa en la orina, tema
tratado en el práctico anterior. Al igual que con la glucosa, una vez más
debimos recurrir a técnicas espectrofotométricas para el estudio de
glucógeno, de las cuales ya se conocen las ventajas y dificultades que
presenta en su procedimiento, asociadas principalmente a la correcta
preparación de la muestra a estudiar. Durante el práctico, no presentamos
dificultad alguna en el procedimiento pues se tuvo cuidado en las etapas
mas sensibles y también se estuvo muy atento al tiempo entre cada
muestra para que los resultados obtenidos fueran lo mas certeros posibles.
Es importante destacar que el aumento de glucosa en la solución, y la
disminución de ésta en los hepatocitos no es exactamente proporcional, ya
que durante el procedimiento puede ocurrir pérdida de ésta, como
consecuencia del manejo de los instrumentos.

BIBLIOGRAFÍA
• Dr. Reginald Del Pozo; Mg. Mirna Muñoz. “Guía de Trabajos Prácticos
Bioquímica”; U.C.S.C., Fac. Medicina, 2003.
• Lehninger, Albert; Nelson, David; Cox, Michael. “Principios de
Bioquímica”; Editorial Omega, segunda edición, 1995.
• Stryer, Lubert. “Bioquímica” Vol. 2; Editorial Reverté, S.A.; cuarta
edición, 1995.
• http://www.scielo.cl/pdf/rcp/v56n6/art01.pdf
• http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/miranda_s/sources/miranda_s.
pdf
• http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1994.pdf