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Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina


Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica /

LABORATORIO Nº 10

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)


Cromatografía en capa fina de lípidos

Medicina Sección I

Integrantes:
 Franca González Beltrán
 Juan González Oyarzún
 Loreto Hernández
 Max Hetz Navarrete

Fecha del Laboratorio:


 23/09/2009
 30/09/2009
Fecha de Entrega:
 14/10/2009

Docentes:
 Dr. Reginald del Pozo Ph.D
 BQ. Mirna Muñoz M.Sc
INTRODUCCIÓN

La cromatografía es un método usado principalmente para la separación de los componentes


de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria (soporte sólido), mientras que la otra es móvil (sustancia que fluye por la fase
estacionaria). La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un
gel (matriz).esta fase puede también ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, o
también distribuida como una película y por tanto, se basa en el principio de la retención selectiva,
en la que los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van
separando. Uno de los diversos tipos de cromatografías que existen (cromatografía en columna, en
papel, en fase gaseosa, etc) es la Cromatografía de Capa Fina (TLC) mediante la cual hemos
realizado el trabajo en laboratorio separando los componentes existentes de una muestra de lípidos.

Este tipo de cromatografía se basa principalmente en la preparación de una capa, uniforme,


de un adsorbente sobre una placa de vidrio u otro soporte. El componente estacionario puede ser
un componente polar y el eluyente será por general menos polar que la fase estacionaria, así se
permitirá más fácilmente el desplazamiento de los componentes menos polares.

El absorbente que usaremos en este práctico es el gel de sílice que es débilmente ácido
(pH=4-5 aprox.), el tamaño del poro suele ser de 20 a 150 A. Por lo general lleva un agente
aglomerante que le proporciona firmeza al absorbente. Este absorbente es de características
polares, el cual puede ser tratado por hidrocarburos para neutralizar los –OH, de este modo queda
apto para la separación de componentes lipídicos, con los cuales trabajamos.

En esta técnica debemos sembrar nuestras muestras y una muestra estándar (con sus
componentes previamente conocidos), y luego iniciar la corrida cromatográfica de las muestras por
la fase estacionaria, las cuales posteriormente deben ser reveladas. Para el proceso de revelado
existen métodos físicos y químicos. En este caso se hará reaccionar la sustancia reveladora con los
componentes separados, ocuparemos como agente revelador al Yodo, el cual genera productos
coloreados. Otro agente revelador usado también es el ácido sulfúrico.

En el presente laboratorio realizamos la medición de estándares: fosfolípidos


(fosfatidilcolina), colesterol, triacilgliceroles (trioleina), ácidos grasos (ác. Oleico), ésteres de
colesterol (colesterol miristato) y la detección de diferentes componentes lipídicos de una muestra
alimentaria tal como la margarina. Una vez empleada la técnica cromatográfica podemos comparar
estándar y la “muestra problema” (margarina), identificando de este modo los tipos de lípidos
continentes en nuestra muestra.
La cromatografía en capa fina ofrece importantes ventajas, tales como el requerir poco
tiempo para su separación (20min-2h), tener una alta sensibilidad en la separación de manchas,
debido a su baja difusión. Además permite el uso de reactivos agresivos como elementos de
detección, es sencillo de realizar y requiere de poco instrumental lo que disminuye su costo. Por
tanto es una técnica factible y eficaz de realizar, adecuado para objetivos que implican de análisis y
detección bioquímica.
OBJETIVOS

• Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina, sus características y los


factores que en ella intervienen.
• Identificar los principales componentes lipídicos de la muestra, conforme a los
valores de Rf de los estándares, y determinar así los Rf de las muestras.
• Deducir a través de Rf la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que
se analizan y la de los eluyentes utilizados
• Aprehensión de conceptos cromatográficos: polaridad, fase móvil, fase estacionaria,
factor de retención
• Determinación de los componentes orgánicos presentes en una muestra usando
sustancias patrón.

MATERIALES
- Cubetas o Cubetas de vidrio con tapa.
- Cromatofolios de sílica gel 60 F254, 20 x 20 cm(MERK)
- Jeringas Hamilton.
- Regla.
- Lápiz grafito.
- Clip.
- Toalla Nova.
- Pipeta Pasteur.
- Tubos eppendorf.
- Cámara cromatográfica.
- Tubos de ensayos.
- Centrífuga.
- Vórtex.
- Guantes.
- Vasos PP.
- Micropipetas.
Reactivos

- Solución Cloroformo: Etanol 2:1; v/v.


- Solución Estándar Colesterol Ester.
- Solución Estándar Colesterol Libre.
- Solución Estándar Ac. Graso.
- Solución Estándar Fosfolípido.
- Solución Estándar TAG
- Yodo Sólido.
- Muestra de suero.
- Solución Fase Móvil Bencina de petróleo: Dietiléter: Ác. acético 90:10:1; v/v/v.
- Muestra de Margarina
- FLUJOGRAMA

a) Extracción de los lípidos de la muestra biológica:

b) Sembrado de muestras juntamente con estándares:

2
c) Corrida de TLC:

Datos anexos
(Indicados con cuadrados y dentro los números)

1. En este caso la fase lipídica debe sacarse sin pasar a llevar la fase proteica con la pipeta
Pasteur para no proveer de malos resultados ni contaminación.
2. Cada línea debe marcarse con regla, previamente traída por cada grupo. Cabe señalar que
la línea de siembra de cada muestra debe marcarse con lápiz mina, de esta manera no se
quedarán atrapados en la brecha cada estándar que desee correrse.

RESULTADOS
Imagen 1.- corresponde al
cromatofolio, donde se realizó por
técnica de TLC, la corrida de
muestras lipídicas señaladas en la
tabla 1.

Carril Muestra
1 Estándar Colesterol Ester
2 Estándar TAG
3 Estándar Ácidos Grasos
4 Estándar Colesterol
5 Estándar Fosfatidilcolina
6 Mezcla
7 Suero
8 Muestra Margarina
Tabla 1.- corresponde a las muestras
analizadas por cada carril del
cromatofolio.

Banda\Carril 1 2 3 4 5 6 7 8
A (cm) 10.2 5 3.7 1.8 0 0 0 0
B (cm) 1.8 0.7 0.2
C (cm) 3.5 4.7 1.6
D (cm) 5 8.9 2.9
E (cm) 12.3 12.3 6.2
Tabla 2.- corresponde a la movilidad en centímetros de cada banda,
donde cada banda es tabulada con letras en orden alfabético, conforme
aumenta la movilidad de la banda.
Banda\Carri 1 2 3 4 5 6 7 8
l
A (cm) 0.708 0.347 0.257 0.125 0.000 0.000 0.000 0.000
B (cm) 0.125 0.049 0.014
C (cm) 0.243 0.326 0.111
D (cm) 0.347 0.618 0.201
E (cm) 0.854 0.854 0.431
Tabla 3.- corresponde a la movilidad relativa (Rf) de cada banda correspondiente a
cada carril, donde cada banda es tabulada con letras en orden alfabético, conforme
aumenta la movilidad de la banda.

Cálculo Movilidad Relativa

La movilidad relativa, es una relación matemática entre la movilidad individual de la


banda, desde el punto donde fue sembrada en el cromatofolio, hasta donde se detuvo; versus
la distancia total capaz de correr una muestra en el cromatofolio.
Por ejemplo: En el carril 1, la movilidad individual de la banda presente fue de 10.2
cm.; y el espacio en el cromatofolio para correr es de 14.4 cm. Por ende:

Mi 10.2
Rf = ! = 0.708 " Rf = 0.708
Mc 14.4
Sea,
Rf = Movilidad Relativa
Mi = Movilidad individual de la banda (cm)
Mc = Movilidad posible en el cromatofolio (cm)

Interpretación TLC >> Análisis por carril

Rf Muestra Carril
0 Fosfatidilcolina 5
0,125 Colesterol 4
0,257 Ácidos Grasos 3
0,347 TAG 2
0,708 Colesterol Ester 1
Tabla 3.- corresponde a la organización de los
.
estándares conforme a sus Rf, para analizar más
organizadamente las muestras de los demás
carriles.
CARRIL 1

Banda\Carril 1 La banda única presente en el carril 1, corresponde a un


A (cm) 0.708 colesterol éster. Es sabido que todas las células del cuerpo
pueden sintetizar colesterol, pero el hígado es el mayor
productor. Parte del colesterol sintetizado es para las membranas celulares, pero otra gran
parte se exporte como colesterol biliar, ácidos biliares, o bien, ésteres de

colesterol. Para su transporte o almacenamiento, el colesterol debe ser esterificado por


ACAT, produciendo un colesterol con una forma mas hidrofóbica, movilidad que se
evidencia en esta banda (0,708); y corresponde al Colesterol Miristato.

CARRIL 2

Banda\Carril 2 La banda unida presente en el carril 2, corresponde al estándar de


A (cm) 0.347 TAG trioleína, triglicérido formado por un glicerol y tres ácidos
grasos, en este caso, ácido oleico. La presencia del grupo éster,
por esterificación de ácidos grasos, hace que el glicerol pierda su característica polar y se
torne en una molécula hidrofóbica; además, más lo grupos carboxilos de los ácidos oleicos, se
le confiere mayor polaridad que los ésteres de colesterol y menor que los ácidos grasos. Lo
anteriormente señalado se evidencia en que esta banda se encuentra sobre el estándar de
acido graso y por debajo de la banda de estándar de colesterol éster.

CARRIL 3

Banda\Carril 3 La banda única presente en este carril, corresponde al estándar


A (cm) 0.257 del ácido graso, el ácido oleico, el cual es un ácido graso
monoinsaturado. Al poseer grupos carboxilos en sus extremos le
confiere propiedades ácidas y escasa solubilidad, haciendo que posea un Rf mayor que el
colesterol libre (mayor solubilidad) y menor que los TAG.

CARRIL 4

Banda\Carril 4 La banda única visualizada en el carril 4, hace alusión al


A (cm) 0.125 colesterol libre, que es un tipo de esterol y es el componente
principal en los tejidos animales. El colesterol es anfipático, por
ende por su cuerpo hidrocarbonato, es hidrofobito, y debido a la cabeza polar se le otorga
una pequeña solubilidad; y es debido a lo anteriormente señalado que presenta una Rf baja.

CARRIL 5

Banda\Carril 5 La fosfatidilcolina (lecitina), es un lípido de membrana del tipo


A (cm) 0.000 glicerofosfolípido, y está formado por un ácido graso insaturado
y otro saturado, donde se une alcohol apolar al C3 del glicerol
mediante enlace fosfodéester, cuyo grupo cabeza es la colina. Tanto la colina como el grupo
fosfato confieren alta polaridad, lo que significa una alta solubilidad de agua, pero no en
solventes orgánicos, lo cual refleja la Rf = 0 visualizada en la corrida y así se queda en el
lugar de sembrado.

CARRIL 6

Corresponde a un sembrado que contiene mezcla de todos los estándares presentados en le


Tabla 3.
Banda\Carril 6 Realizando una comparación de Rf con la tabla 3, podemos
A (cm) 0.000 visualizar que:
B (cm) 0.125 Banda A: corresponde a fosfatidilcolina.
C (cm) 0.243 Banda B: corresponde a Colesterol
D (cm) 0.347 Banda C: corresponde a Ácidos Grasos.
E (cm) 0.854 Banda D: corresponde a TAG
Banda E: corresponde a Colesterol Ester, aunque se presenta
una leve diferencia, pero se asume una mal corrida por parte de la muestra en el carril 1, pero
no hay duda del tipo de muestra lipídica al cual pertenece.

CARRIL 7

Corresponde a un sembrado que contiene suero.


Banda\Carril 7 Realizando una comparación de Rf con la tabla 3, podemos
A (cm) 0.000 visualizar que:
B (cm) 0.049 Banda A: corresponde a fosfatidilcolina.
C (cm) 0.326 Banda B: corresponde a colesterol.
D (cm) 0.618 Banda C: corresponde a TAG.
E (cm) 0.854 Banda D: no conocido.
Banda E: corresponde a Colesterol éster.
En la sangre encontramos gran cantidad de lípidos plasmáticos transportados libremente o
unidos a proteínas o mediante complejos mayores. Podemos encontrar fosfolípidos,
colesterol, ésteres de colesterol, TAG y ácidos grasos, aunque en este caso no se ha
detectado ácidos grasos, y la banda D que posee un Rf de 0,618 puede ser una mala corrida
de parte del colesterol éster o algún componente que no se representa con los estándares. Se
debe señalar que lo más probable el colesterol haya corrido de forma irregular y por eso
posea un Rf mas bajo de lo normal.

CARRIL 8

Corresponde a un sembrado de una muestra proporcionada por el grupo de trabajo, que en


esta ocasión corresponde a Margarina (Banda Azul®).
Banda\Carril 8 Realizando una comparación de Rf con la tabla 3, podemos
A (cm) 0.000 visualizar que:
B (cm) 0.014 Banda A: corresponde a fosfatidilcolina.
C (cm) 0.111 Banda B: posible contaminación.
D (cm) 0.201 Banda C: corresponde a colesterol.
E (cm) 0.431 Banda D: corresponde a Ácidos Grasos.
Banda E: corresponde a TAG.
En este carril se pueden observar bandas cuya Rf es similar a la de los estándares utilizados,
con excepción de la banda B. Se sospecha que la banda B es posible contaminación, por su
cercanía a la banda A, correspondiente a la fosfatidilcolina, también puede tratarse de un mal
sembrado. Por lo tanto, los componentes de nuestra muestra serían fosfatidilcolina,
colesterol, ácidos grasos y TAG, unos en mayor cantidad que otros, por ejemplo, la banda E
(correspondiente a TAG) es más ancha que las demases.
Debe hacerse el siguiente alcance: dentro de la información nutricional de la Margarina
ocupada, se subraya que ésta no contiene colesterol, pero se observa una cantidad de
colesterol en la corrida, representada por la banda C.

DISCUSIÓN

Durante el práctico se realizó a separación de lípidos de distintas muestras: suero


sanguíneo y margarina Banda Azul®.
Dentro de los componentes plasmáticos que pueden ser medidos a partir del suero
sanguíneo, que corresponde al plasma sanguíneo sin sus factores de coagulación, se
encuentran los lípidos plasmáticos. Los lípidos plasmáticos viajan asociados a lipoproteínas
y a la albúmina, por lo que para ser separados por TLC deben concentrarse. Mediante la
extracción por cloroformo y metanol estos lípidos son separados de otros componentes
plasmáticos, como las proteínas, que pueden interferir en la corrida del TLC. Este paso debe
realizarse cuidadosamente para obtener una buena corrida.
En la muestra de suero analizada, se encontraron los siguientes lípidos:
fosfatidilcolina, colesterol, TAG y colesterol éster. Se sabe que estos lípidos se encuentran
normalmente en la sangre, pero al ser el TLC un análisis cualitativo, no se puede saber en
qué cantidad se encuentran en el suero. No se observa presencia de ácidos grasos, de lo que
se puede inferir que el paciente no se encontraba en estado de ayuno y también puede
descartarse una hipergliceridemia (patológica). En el carril correspondiente al suero (carril 7)
se observa una banda cuya composición es desconocida (banda D). Si se observa la
fotografía de la corrida, puede verse que parte del contenido del carril 8 pasó al carril 7, por
lo que la banda D podría ser producto de la contaminación proveniente del carril 8.
En la muestra de margarina analizada, se encontraron fosfatidilcolina, colesterol,
ácidos grasos y TAG. Si se compara la composición del producto (Tabla 4) existen datos
que concuerdan, como la presencia de ácidos grasos; por otra parte, la información
nutricional del producto indica que no debería haber presencia de colesterol, pero éste fue
encontrado en la corrida.

Composición 100 g
Proteínas (g) 0
Grasa total (g) 50
Ácidos grasos saturados (g) 22
Ácidos grasos monoinsaturados (g) 8
Ácidos grasos poliinsaturados (g) 20
Ácidos grasos trans (g) 0.9
Colesterol (mg) 0
Hidratos de carbono (g) 0
Tabla 4.- Información nutricional de la margarina Banda Azul ®.
A pesar de ser un análisis cualitativo, puede hacerse una estimación de la cantidad de
lípido dependiendo del tamaño de la banda, se puede decir que en la margarina se encuentra
mayor cantidad de TAG que de otro lípido.
Cabe destacar que seguir la metodología del proceso es fundamental, ya que cualquier
descuido puede interferir en la corrida. Por ejemplo, se observa contaminación del carril 8 en
el carril 7, esto pudo ocurrir por sembrar más cantidad de muestra que la indicada. Otro
ejemplo es la aparición de una segunda banda justo por sobre la banda correspondiente a los
fosfolípidos del carril 8, esto pudo ocurrir por un mal sembrado (fuera de la línea de
siembra) o por sembrar un exceso de muestra, la que puede difundir si no es secada a
tiempo. También, en el mismo carril 8, se observa que las bandas corrieron de forma
desequilibrada, avanzando más del lado derecho que del izquierdo, esto también pudo ser
causado por un error de sembrado, esto puede significar que se sembró más muestra del lado
izquierdo que del derecho. Otro aspecto importante del trabajo, era tomar cuidadosamente la
placa de sílice, evitando tocarla directamente con los dedos descubiertos, ya que esto puede
contaminar la placa con lípidos de la piel y afectar en la visibilidad de las muestras.

CONCLUSIÓN

La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica que permite separar una mezcla
de dos o más compuestos en base a su solubilidad en la fase móvil. En este caso se
separaron mezclas de lípidos, que tienen carácter apolar, por lo que se usó como fase móvil
un solvente orgánico; por consiguiente, el compuesto más apolar tendrá una Rf mayor por
ser más soluble en la fase móvil que otro polar o menos apolar.
El compuesto que presentó mayor Rf fue el colesterol éster (Rf = 10.2), lo que
demuestra su gran apolaridad (es el más hidrofóbico). Por el contrario, los fosfolípidos no
migraron (Rf = 0), ya que son antipáticos, poseen un carácter polar. Por lo tanto, según el
Rf se puede determinar la polaridad del lípidos analizados (a mayor Rf, mayor apolaridad y
viceversa), obteniéndose, de más apolar a menor apolar: colesterol éster, triglicéridos, ácidos
grasos, colesterol libre y fosfolípidos.
La TLC permite hacer un análisis cualitativo de los componentes lipídicos se
distintas muestras, es decir, qué lípidos componen dicha muestra. Se puede realizar una
estimación a simple vista de la cantidad de lípido que posee cada banda, ya que una banda de
mayor tamaño supone mayor cantidad de lípido.
Para separar lípidos de distintas muestras, primero deben extraerse. Por ejemplo, en
el caso de los lípidos plasmáticos, estos deben ser extraídos del suero sanguíneo para evitar
que los componentes proteicos interfieran con la corrida.
La técnica utilizada para el revelado de las bandas fue la exposición de la placa a
vapores de yodo. El yodo se une a los dobles enlaces de las moléculas, dando a las bandas
un color amarillo. Se trata de una técnica rápida y sencilla, sólo debe tenerse la consideración
de actuar con rapidez para delinear las bandas, ya que el yodo es muy volátil.
Por último, es importante seguir al pie de la letra la metodología del trabajo y así
evitar cualquier error en la corrida.

BIBLIOGRAFÍA

• Del Pozo R., Muñoz Mirna, Grandón Javier; "Guía de trabajos prácticos
bioquímica"(2009), Universidad Católica de la Santísima Concepción.
• “Lehninger, Principios de Bioquímica”; David Nelson; Michael Cox, Editorial
Omega, Tercera edición, 2001.
• http://depa.pquim.unam.mx/~fercor/dqo/manuales/1311/p7.pdf