Standar Mikrobiologi dan Uji 

Mikrobiologi untuk Bahan 
dan Produk Farmasi
Marlia Singgih Wibowo
Bahan Farmasi
• Bahan baku
• Air murni (Purified Water)
• Produk Farmasi Steril (Sterile 
Pharmaceuticals)
• Produk Farmasi Non‐Steril (Non‐Sterile 
Pharmaceuticals)
• Produk kosmetik, alat kesehatan, PKRT, 
suplemen makanan
Mengapa diperlukan kualitas mikrobiologi dalam
produk farmasi?
• Produk harus bermanfaat dan aman
• Mikroorganisme patogen → Bagaimana
mikroorganisme patogen dapat mengkontaminasi
produk
• Bagaimana mendeteksi mikroorganisme patogen
dan bagaimana menghitung jumlahnya
• Analisis kualitatif dan kuantitatif
BAHAN BAKU FARMASI
• Bahan baku untuk produk farmasi dapat 
berupa bahan kimia atau bahan yang berasal 
dari alam
• Bahan yang berasal dari alam lebih cenderung 
terkontaminasi mikroorganisme lebih berat 
dibandingkan bahan sintetik kimia
Kategori Bahan Baku Alam (Grigo, 1976)
1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak bahan alam 
yang sudah dimurnikan (rata‐rata 10 cfu/g atau mL)
2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan alam 
(rata‐rata 10
2
cfu/g atau mL)
3. Ekstrak tanaman (rata‐rata 10
3
cfu/g atau mL)
4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit 
mengalami proses (rata‐rata 10
4
cfu/g atau mL)
5. Produk hewan atau tanaman yang tidak mengalami 
proses (rata‐rata 10
5
cfu/g atau mL)
Mikroorganisme kontaminan yang sering 
dijumpai dalam bahan baku alam
• Bacillus 
• Enterobacteriaceae
• Staphylococcus
• Aspergillus
• Penicillium 
• Mucor
• Rhizopus
E.coli
Salmonella
AIR
• Air minum (potable water) : tidak boleh ada 
Coliform bacilli per 100 ml
• Air untuk injeksi : 
– < 0,25 endotoksin unit (EU) per ml.
– Batas mikroba < 10 cfu per 100 ml
– Tidak ada Pseudomonas
• Air untuk sediaan non‐steril : 
o Kisaran dari <10 sampai < 100 cfu per 100 ml
o Tidak ada Pseudomonas
Produk Farmasi Steril
• Untuk produk parenteral, sediaan obat mata, termasuk 
larutan lensa kontak , dan produk‐produk yang diberikan 
pada luka terbuka atau untuk proses irigasi rongga tubuh.
• Uji sterilitas perlu dilakukan 
• Syarat Steril : Sterility Assurance Level dengan 
probabilitas sama atau lebih baik dari 10 
‐6
, artinya dalam 
satu juta sediaan steril hanya boleh maksimum 1 yang 
tidak steril.
• Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya 
pertumbuhan mikroba pada media Fluid Thioglycollate
(FTM) dan Soyabean Casein Digest (SCD)pada 30‐35°C 
(bakteri) dan 20‐25°C (fungi) selama 7 dan 14 hari.
Produk Farmasi Non‐Steril
• Tidak ada aturan tunggal yang mengatur, tergantung 
pada farmakope negara masing‐masing
• Tidak mengandung mikroba yang dapat 
menyebabkan infeksi akibat penggunaan obat 
tersebut (medication‐borne infection)
• TVC (Total Viable Count) dalam jumlah tertentu dan 
tidak adanya patogen enterik dalam bahan baku nya.
Persyaratan Kualitas Mikrobiologi 
Sediaan Farmasi versi FIP (1976)
Gol. J enis Sediaan Persyaratan
1a
1b
Injeksi
Obat mata, sed.utk bgn tubuh
yg bebas mikroba, sed.utk luka
bakar, tukak berat
Steril – Farmakope
Bebas mikroba yang memp.daya hidup/g atau
mL
2 Sed. topikal pada lesi kulit,
hidung, tenggorokan (resiko
tinggi)
Mikroba yg memp.daya hidup maks 10
2
/g atau
mL, dan tidak mengandung Enterobacteriaceae,
P.aeruginosa, S.aureus
3 Sediaan lain Mikroba yg memp.daya hidup maks 10
3
– 10
4
bakteri anaerob, 10
2
ragi dan kapang /g atau mL,
Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak
mengandung Salmonella, P.aeruginosa,
S.aureus,
Enterobacteriaceae lain maks. 10
2
/g atau mL
Batas kontaminan mikroba pada bahan dan sediaan 
obat asal tanaman (versi UNIDO,1990)
Bahan/
Sediaan
Bakteri Ragi dan
kapang
Baketri
coliform
Salmonella Staphylococcus
Sediaan
obat asal
tanaman
< 10
4
/g < 10
2
/g
- - -
Bahan
obat asal
tanaman
< 10
7
/g < 10
4
/g
- - -
Ket.: (-) tidak boleh ada
UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)
Uji Mikrobiologi yang Tercantum pada 
Farmakope Indonesia edisi IV
• Uji secara Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
<61> Uji Efektivitas Pengawet
<71> Uji Sterilitas
• Uji dan Penetapan secara Biologi
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara 
Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
• Dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob 
viabel di dalam semua jenia perbekalan farmasi, mulai 
dari bahan baku hinga sediaan jadi
• Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi tersebut 
bebas dari spesies mikroba tertentu
• Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik
• Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah 
menempatkan wadah di dalam ruang terkendali secara 
termostatik pada suhu antara 30 – 35°C selama 24 – 48 
jam
• Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya dan 
kemungkinan adanya perkembangan mikroba viabel
<61> Uji Efektivitas Pengawet
• Pengertian Pengawet Antimikroba : zat yang ditambahkan 
pada sediaan obat untuk melindungi sediaan terhadap 
kontaminasi mikroba.
• Pengawet terutama digunakan pada wadah dosis ganda
• Pengawet tidak boleh digunakan semata‐mata untuk 
menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai pengganti cara 
produksi yang tidak baik
• Kadar yang digunakan harus serendah mungkin
• Pengujian dalam farmakope dimaksudkan untuk menguji 
efektivitas pengawet yang ditambahkan pada sediaan dosis 
ganda yang dibuat dengan dasar atau bahan pembawa cairan
• Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada produk di 
dalam wadah asli yang belum dibuka , yang didistribusikan 
oleh produsen
<71> Uji Sterilitas
• Digunakan untuk menetapkan apakah bahan atau produk 
farmasi yang harus steril memenuhi syarat berkenaan 
dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing‐
masing monografi bahan atau produk
• Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai bagian 
dari pengawasan mutu di industri, tertera pada <1371> 
Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia
• Mengingat kemungkinan hasil positif dapat disebabkan 
oleh pengerjaan yang salah atau kontaminasi lingkungan, 
diberlakukan pengujian 2 tahap seperti yang tertera pada 
bagian : 
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas
• Prosedur alternatif dapat digunakan asal hasil yang 
diperoleh sekurang‐kurangnya setara keandalannya →
Lihat Prosedur pada Uji dan Penetapan dalam 
Ketentuan Umum
• Jika timbul perbedaan, dan adanya kontaminasi terdapat 
pada hasil dari prosedur Farmakope, maka hasil harus 
dinyatakan sebagai tidak memenuhi syarat. 
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus 
leichmanii dengan metode turbidimetri
• Pembanding larutan baku Sianokobalamin BPFI
berkisar antara 0,01 – 0,04 ng per mL. Blanko 
menggunakan air.
• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang 
530 nm.
• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus 
plantarum dengan metode turbidimetri
• Pembanding larutan baku Kalsium pantotenat BPFI
berkisar antara 0,01 – 0,04 µg per mL. Blanko 
menggunakan air.
• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang 
660 nm.
• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
• Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat ditunjukkan 
pada kondisi sesuai dengan efek daya hambatnya 
terhadap mikroba uji
• Perbedaan kadar dan potensi
• Dua metode umum : cara lempeng dan cara tabung
• Cara lempeng : menggunakan kertas cakram atau 
selinder baja, efek difusi antibiotik pada medium 
agar.
• Cara tabung : turbidimetri, efek larutan antibiotik 
terhadap turbiditas mikroba
Tahapan analisis mikrobiologi
Penyiapan metode, alat dan bahan pereaksi

Identifikasi sampel

Sampling

Analisis kualitatif

Analisis kuantitatif

Kesimpulan
Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi
pada Produk Farmasi dan Makanan
Jenis Uji Mikrobiologi
• Uji langsung
• Teknik kultur
• Metode Enumerasi
• Metode Alternatif
• Metode Cepat
Uji Langsung
• Pengamatan langsung
dengan mata
(makroskopik)
• Pengamatan di bawah
mikroskop (mikroskopik)
• Metode pewarnaan
• DEFT (Direct
Epifluorescent Filter
Technique)
• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) :
morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk
koloni
• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan
motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua
jenis mikroskop : optik dan fase kontras
• Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri
• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel
disaring dengan filter, bakteri diwarnai dengan zat warna
tertentu lalu dilihat di bawah mikroskop epifluoresens
Morfologi Aspergillus niger
di bawah mikroskop
DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
• Filter membran polikarbonat
• Zat warna senyawa fluorokromatis yang
berfluoresensi setelah berikatan
• Acridine orange :
Ikatan denan dsDNA : hijau
Ikatan dengan ssRNA : oranye
Ikatan dengan sel hidup : kuning
Ikatan dengan sel mati : hijau terang
Teknik Kultur
Walaupun berbagai metode analisis cepat
dan sensitif telah dikembangkan untuk
identifikasi dan karakterisasi mikroba
patogen, teknik pembiakan mikroba di dalam
medium mikrobiologi masih diperlukan
terutama untuk konfirmasi identitas. Media
mikrobiologi yang sering digunakan
umumnya adalah medium padat atau cair.
Medium padat umumnya mengandung agar.
Kultur pada media agar
• Tujuan Isolasi
• Tujuan Determinasi
• Tujuan Penyimpanan
• Tujuan Pertumbuhan
• Tujuan Produksi
• Tujuan Analisis
Metode Enumerasi
• Plate Count : metode perhitungan mikroba
yang ditumbuhkan di atas cawan petri
• MPN Count (Most probable Number) : metode
perhitungan relatif berdasarkan fenomena
kekeruhan
• Analisis Fisikokimia : metode perhitungan
mikroba berdasarkan komponen sel atau
metabolit yang dihasilkan
Metode Alternatif
• Uji Biokimia
• Dye-reduction Test
• Electrical Methods
• ATP Determination
Biochemical Methods: Enzymes
M. Ryan
Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase,
trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase,
glucuronidase, proteases, fucosidase.
An APIZYM strip
Biochemical Methods: Metabolites
Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites
(Example of Patulin production by Penicillium spp.)
Dye-reduction Test
• Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna (dye)
• Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem biologi
yang aktif dan akan menghasilkan perubahan warna
• Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarna dan bentuk
tereduksi tidak berwarna
• Contoh dye yang sering digunakan : metilen blue,
resazurin, trifeniltetrazolium klorida
Electrical Methods
• Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan
menyebabkan perubahan komposisi medium dan
oleh karenanya akan merubah sifat elektriknya.
• Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi,
kapasitans, dan impedansi
Penetapan ATP
• ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidup yang
melakukan metabolisme
• Diukur melalui aktivitas enzim luciferase dan
substrat luciferin menghasilkan pendaran cahaya
(chemiluminesence)
ATP assay
Luciferin + Luciferace + ATP
Luciferin-Luciferace-AMP + PP + O2
Oxyluciferin-Luciferase-AMP + H2O
Oxyluciferin + Luciferase + AMP + hµ (560 nm)
Metode cepat
• Metode Imunokimia
• Metode Biologi molekuler
Metode Imunokimia
• Prinsip analisis : berdasarkan reaksi Antigen-
Antibodi
• Komponen sel atau metabolit sel mikroba
bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan
pereaksi (suatu Ab yang spesifik) menghasilkan
kompleks Ag-Ab
• Kompleks Ag-Ab divisualisasi dengan berbagai
cara yang dapat diukur (spektrofotometri,
spektofluorometri, dll.)
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)
Antigen
Antibodi
Kompleks Ag-
Ab
Konjugat
enzim pada
Ag-Ab
Substrat
Produk
berwarna
Reaksi
enzimatik
Jenis Metode Imunokimia
• EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)
• RIA (Radio Immuno Assay)
• IFA (Immuno Fluoresence Assay)
• LIA (Luminescence Immuno Assay)
Metode Molekuler
• Cara Hibridisasi
• Cara Amplifikasi
Teknik hibridisasi
• Proses denaturasi dsDNA menjadi ssDNA
menggunakan pemanasan
• Kombinasi ssDNA tersebut dengan suatu segmen
ssDNA lain yang telah di beri probe (label)
• Hibrid DNA yang telah mengandung label dapat
dideteksi dengan berbagai
Teknik amplifikasi
• PCR (polymerase chain reaction) : reaksi polimerisasi
berantai
• DNA target didenaturasi menggunakan panas
• Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek) yang
komplemen dengan salah satu ujung ssDNA
• Sintesis DNA yang diawali dari primer
• Proses pengulangan 20 – 50 x
Proses PCR
3’ 5’
3’ 5’
Denaturasi pada 94 °C
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
Annealing primer pd 72°C
3’ 5’
3’ 5’
Polimerisasi
pada 72 °C
3’ 5’
3’ 5’ dsDNA baru
dsDNA baru
Proses berulang
Denaturasi
Annealing
Polimerisasi
Proses setelah PCR
• Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah
fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat di
deteksi
• Produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis
DNA
• Pita-pita DNA dibandingkan dengan marker DNA
Elektroforesis DNA
DNA
marker
Produk PCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate
of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of
Preservation with Mr Primer
L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in
water , 12-16 cryopreserved, 17 control
M. Ryan