You are on page 1of 44

Naujausių mokslinių pasiekimų ir naujausių mokslinių tyrimo metodų augalų

genetikos ir biotechnologijos srityje mokslinė studija










Augalų genomika ir biotechnologija












Rengė : doc. dr. S. Kuusienė
















KAUNAS, 2007

1. Turinys
1. Turinys ...................................................................................................................1
2. Įvadas .....................................................................................................................3
3. Augalinės ląstelės struktūra ir ląstelės ciklas.........................................................4
4. Augalo ląstelės totipotentiškumas..........................................................................9
5. Veiksniai, reguliuojantys augalų somatinę embriogenezę ir organogenezę ........11
6. Haploidų gavimo metodai ir jų panaudojimas selekcijoje...................................13
7. Pagrindiniai transgeninių augalų kūrimo metodai ...............................................19
8. Genetiškai modifikuotų augalų biocheminis ir citogenetinis įvertinimas............29
9. Molekuliniai žymenys medžių genetinės įvairovės ir tapatumo įvertinimui .......34
10. Praktiniai darbai ...............................................................................................38

2

2. Įvadas

Gyvojoje gamtoje visas gyvybės formas ( prokariotines ir eukariotines) vienija jų
struktūrininis vienetas - ląstelė. Mokslas, visapusiškai nagrinėjantis ląstelės veiklą ,
vadinamas ląstelės biologija, kurios pradžia laikoma 1665 metai, kai R. Hukas,
sukonstravęs šviesinį mikroskopą kamštyje įžiūrėjo mažas ertmes. Tas ertmes
pavadino cellulae. Iš šio termino kilo šiuolaikinis angliškas ląstelės pavadinimas (
angl.k. – cell). Vėliau R. Hukas stebėjo ir gyvų augalų audinių pjūvius ir pamatė, kad
jos pripildytos „ sulčių“. Po dviejų šimtmečių mikslininkai M.J. Šleidanas ir Švanas
suformulavo organizmų struktūros ląstelinę teoriją, kuri pagrindė ,kad gyvieji
organizmai sudaryti iš ląstelių ir jų gyvybinės veiklos produktų.
Skiriamos dviejų tipų ląstelės - prokariotinės ir eukariotinės.Pagrindinis jų
skiriamasis bruožas susijęs su branduoliu. Eukariotinių organizmų ląstelės sandara
yra sudėtingesnė, nes turi tipišką branduolį, su membraniniu apvalkalėliu ir yra
ląstelės procesų programos ir valdymo centras. Prokariotinių ląstelių branduolys
neturi apvalkalėlio. Todėl laikoma , kad prokariotinės ląstelės neturi tipiško
branduolio, otik jo ekvivalentą, kuris vadinamas nukleoidu.
Augalinės ląstelės struktūra susijusi su augalinio organizmogyvenimo ir mitybos
būdu. Per evoliuciją susiformavo kai kurie specifiniai augalinių ląstelių strukrūros
ypatumai: tvirta polisacharidinė sienelė; plastidinė sistema; stambi centrinė vakuolė .
Augalai yra didelis ekonominis sektorius, veikiantis daugelį kitų sektorių: maisto,
tekstilės, chemijos, energijos, sveikatos, medicinos ir kt. Todėl augalų savybių
gerinimas yra svarbus ir aktualus. Prieš 30 metų mokslininkai išmoko karpyti ir
perkelti DNR segmentus, klonuoti izoliuotus genus. Manipuliacijos su DNR leido
sparčiai vystyti naujus metodus ir augalų tyrimuose.

Šio modulio tikslas - suteikti magistrantams integruotas teorines žinias apie eukariotinių ir
prokariotinių organizmų genomus, geno klonavimo ir rekombinantinės DNR kūrimo
pagrindus, augalų DNR ir RNR tyrimo metodus, modelinių augalų in vitro kultūras, augalų
biotechnologijos metodus, bei išlavinti gebėjimą atlikti augalų transformaciją, identifikavimą
integruoto geno ir įvertinti transgeninių augalų panaudojimo perspektyvas.

3

3. Augalinės ląstelės struktūra ir ląstelės ciklas
Augalo ląstelės savo struktūra iš esmės yra panašios į kitas eukariotines, t.y. turinčias
branduolį, ląsteles. Be branduolio, visoms eukariotinėms ląstelėms būdinga plazminė
membrana bei įvairių eukariotinių organizmų ląstelėse analogiškas funkcijas
atliekančios organelės: endoplazminis tinklas, Goldžio kompleksas, mitochondrijos,
mikrovamzdeliai, peroksisomos. Tačiau augalinių ląstelių struktūra turi ir nemažai
savitų bruožų, kuriais skiriasi nuo kitų eukariotinių ląstelių struktūros. Tik augalų
ląstelėms yra būdinga tvirta celiuliozinė sienelė, kuri ne tik suteikia ląstelėms tvirtumą
bei formą, tačiau taip pat apsaugo nuo ligas sukeliančių mikroorganizmų. Celiuliozės
gijos augalinės ląstelės sienelėje išsidėsto tam tikrame užpilde, kurį sudaro kiti
polisacharidai: hemiceliuliozė ir pektinai. Hemiceliulioze vadinami šakotos struktūros
polisacharidai, kurie jungia ir sutvirtina vienas su kitomis celiuliozės gijas. Celiuliozė
sutinkama visose augalų ląstelėse, tuo tarpu medienoje, be celiuliozės, yra daug kito
polimero – lignino, taip pat čia kaupiasi netirpūs mineralinių medžiagų kristalai.
Augalų ląstelių sienelėje yra angelių, pro kurias praeina savitos augalo ląstelių
jungtys, vadinamos plazmodezmomis. Jų vietose dviejų ląstelių plazminės
membranos jungiasi, o per plazmodezmą į kitą ląstelę prasikiša endoplazminio tinklo
išaugos – desmovamzdeliai. Pro juos iš vienos ląstelės į kitą gali patekti netirpios
medžiagos, tuo tarpu tirpios difunduoja pro plazmodezmos tarpą. Dažniausiai augalų
ląstelės turi apie 1000 tokių tiesioginio sąlyčio su kitomis ląstelėmis vietų.
Augalo augimui svarbus ląstelių sienelės tamprumas. Ypač dideliu tamprumu sienelė
pasižymi intensyviai augančiose augalo dalyse, šaknų ir ūglių meristemoje, kadangi
pirminė augančios ląstelės sienelė yra plona ir gali lengvai temptis. Ji susidaro tarp
dviejų dukterinių ląstelių dalijantis motininei ląstelei. Ląstelei nustojus augti, jos
pirminės sienelės išorė ima trauktis pirmuoju antrinės sienelės sluoksniu. Ląstelei
visai nustojus augti, šis sluoksnis iš vidaus pildomas kitu, kitaip orientuotų celiuliozės
skaidulų sluoksniu, o vėliau – dar kitaip išsidėsčiusiomis skaidulomis (kiekvieno
sluoksnio celiuliozės skaidulos lygiagrečios). Be to, pamažu antrinė sienelė
mineralizuojasi dėl susikaupusių kalio druskų ir visai sukietėja.
Daugeliui augalų ląstelių būdinga stambi centrinė vakuolė, kuri užima didžiąją dalį
subrendusios ląstelės tūrio. Čia saugomos maisto medžiagos, kaupiami medžiagų
apykaitos produktai, vyksta medžiagų hidrolizė (pastarąją funkciją gyvūnų ląstelėse
atlieka lizosomos, tuo tarpu augalinėms ląstelėms šios organelės nebūdingos).
4
Vakuolės palaiko augalų ląstelių stangrumą bei yra svarbios jų augimui. Augalų
ląstelės gali pasižymėti labai greitu tįstamuoju augimu, kurį lemia ląstelės sienelės
tempimas dėl vakuolę patenkančio vandens spaudimo.
Savitos augalinių ląstelių organelės yra plastidės. Tai dviejų membranų apvalkalą
turinčios organelės, išsidėstę citoplazmoje. Funkciniu požiūriu svarbiausios plastidės
yra chloroplastai, kurie lapų ląstelėse išsidėsto aplink centrinę vakuolę.
Chloroplastuose vyksta fotosintezė, taigi šios organelės suteikia augalams gebėjimą
Saulės energiją paversti chemine energija, kuri fotosintezės tamsos reakcijų metu
naudojama sacharidų sintezei.










1 pav. Tipiška augalo ląstelė. Iš: V. Mildažienė ir kt. Ląstelės biologija.

Augalų, kaip ir kitų eukariotų, ląstelės cikle skiriami du pagrindiniai etapai – interfazė
ir M fazė. Interfazė skirstoma į tris fazes: G
1
, S ir G
2
. G
1
fazėje ląstelė auga, vyksta
medžiagų apykaita, dvigubėja organelės. S fazėje vyksta DNR replikacija, dvigubėja
genetinė medžiaga. G
2
fazėje ląstelė auga ir ruošiasi mitozei. M fazėje ląstelėje vyksta
esminiai įvykiai: kinta chromatino tankis, persitvarko ląstelės griaučiai, chromosomes
juda vidurio plokštumos link, o vėliau link ląstelės polių, dalijasi branduolys bei visa
ląstelė. Šie procesai užtikrina tikslų genetinės medžiagos, kurios kiekis padvigubėjo S
fazės metu, padalijimą į dvi lygias dalis, atitenkančias dukterinėms ląstelėms. M fazę
sudaro du nuoseklūs procesai: mitozė ir citokinezė. Mitozės metu pasidalija
branduolys ir jame esanti DNR. Citokinezė yra ląstelės pasidalijimas į dvi dalis,
užbaigiantis genetinės medžiagos paskirstymą tarp dviejų naujų ląstelių. Ląstelės
ciklo vyksmas augaluose šiek tiek skiriasi nuo kitų eukariotų, pvz. mielių ir žinduolių
(2 pav.). Pastarosiose ląstelėse yra tarsi tam tikras atskaitos taškas G
1
fazėje, nuo kurio
5
prasideda ląstelės ciklas ir tęsiasi per mitozę vėl iki G
1
fazės. Nesidalijančios mielių ar
žinduolių ląstelės pasilieka G
1
fazėje (tokia ląstelių būsena dar vadinama G
0
faze).
Tuo tarpu augalų ląstelės gali pasilikti tiek G
1
, tiek G
2
fazėse. Netgi pilnai
diferencijavusios ląstelės gali būti G
2
fazėje. Augalinės ląstelės geba vykdyti
diferenciacijos ar dediferenciacijos procesus būdamos tiek G
1
, tiek G
2
fazėse. Taigi,
augalinė ląstelė, perėjusi per S fazę (su padvigubėjusiu DNR kiekiu) nebūtinai pereina
į M fazę.

2 pav. Ląstelės ciklas mielėse ir pas žinduolius (A) bei augaluose (B). Mielių ir
žinduolių ląstelėse G1/S perėjimas yra reguliuojamas kontrolės punktu, vadinamu
pradžios ar pabaigos tašku. Augaluose toks taškas dar neatrastas. Praeidamos pro
pradžios/pabaigos tašką, mileių ar žinduolių ląstelės paprastai pereina visą ląstelės
ciklą. Priešingai, augalų ląstelės gali būti sulaikomos G1 ar G2 fazėje. Be to, jos gali
diferencijuoti ar dediferencijuoti arba iš G1 arba iš G2 (pagal Ferreir et al., 1994) Iš:
L.M. Srivastava. Plant growth and development: hormones and enviroment.

Augalinių ląstelių bioreguliacija
Augalinių ląstelių veiklos reguliavime labai svarbų vaidmenį atlieka fitohormonai.
Fitohormonai, arba augalų augimo reguliatoriai, yra nedideliais kiekiais augaluose
aptinkamos cheminės medžiagos, kontroliuojančios augalo augimą ir vystymąsi.
Augimo reguliatoriai akivaizdžiai dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų. Jie veikia
augalo vystymąsi kontroliuodami specifines biochemines reakcijas. Fitohormonų
koncentracijos augaluose paprastai esti labai mažos. Kitaip nei gyvūnų hormonų,
augalų hormonų sintezė dažnai nėra lokalizuota viename specifiniame audinyje, bet
gali vykti įvairiuose audiniuose. Be to, augalų augimo reguliatorius gamina ne tik
patys augalai, bet ir kai kurios bakterijų bei grybų rūšys. Dažnai ryšiai tarp augalų ir
6
mikroorganizmų esti tokie glaudūs, jog pastarųjų išskiriami augimo reguliatoriai turi
didelę svarbą ne tik augalams, bet per augalo metabolinius procesus ir patiems
mikroorganizmams. Nors augalų hormonai gali būti pernešami ir veikti nuo išskyrimo
vietos nutolusius audinius, bet dažnai jų veikimas pasireiškia ir ten, kur jie
sintetinami. Taip pat augalų hormonai nėra tokie specifiški kaip gyvūnų hormonai.
Vienas ir tas pats fitohormonas gali veikti įvairius fiziologinius procesus. Nors dažnai
įvairių fitohormonų rūšių (citokininų, auksinų, giberelinų bei kitų) poveikis gali būti
labai panašus, tačiau kiekvienas hormonas turi tik jam būdingas savybes, išreikštas
tam tikrų biocheminių reakcijų valdomų ląstelės virsmų kontrole. Panašaus ar
pastebimai priešingo įvairių klasių fitohormonų poveikio priežastis yra ta, jog vieni
fitohormonai gali veikti kitų augimo reguliatorių (priklausančių tai pačiai ar
skirtingoms fitohormonų klasėms) sintezę ar skaidymą, taip pat gali įvairiai persipinti
skirtingų fitohormonų kontroliuojami biomolekulių metabolizmo ar tam tikrų procesų
reguliavimo keliai augalo ląstelėje. Fitohormonų poveikis taip pat stipriai priklauso
nuo audinio – taikinio jautrumo. Tam tikrame audinyje ląstelės gali neatpažinti
hormoninio signalo arba nepajėgti duoti pageidaujamo atsako.
Fitohormonų poveikis dažniausiai susijęs su tam tikros signalų kaskados aktyvavimu.
Hormonas jungiasi su receptoriumi, tai pakeičia (susilpnina ar sustiprina) receptoriaus
sąveiką su kitomis molekulėmis, atitinkamai kinta šių molekulių geba sudaryti kitas
sąveikas, moduliuoti dar kitų molekulių veiklą ir taip toliau. Paprastai tokia signalų
kaskada būna nukreipta į atitinkamą reguliacinį baltymą, taigi dėl hormonų poveikio
reguliacinio baltymo veikla gali būti skatinama arba slopinama. Savo ruožtu toks
baltymas gali dalyvauti genų veiklos reguliavime ir atitinkamai skatinti ar slopinti kitų
baltymų sintezę (pavyzdžiui, per transkripcijos kontrolę). Pavyzdžiui, fitohormonas
giberelinas, kuris, kaip žinoma, skatina krakmolą skaidančio fermento α-amilazės
sintezę dygstančiose sėklose, jungiasi su plazminėje membranoje esančiais
receptoriais. Šie receptoriai susiję su G-baltymais, per kuriuos nuosekliai aktyvuojami
kiti procesai: didėja viduląstelinio Ca
2+
koncentracija, mažėja viduląstelinis pH,
didėja kalmodulino bei ciklinio GMP koncentracijos. Šie pokyčiai skatina baltymą
GAMYB koduojančio geno ekspresiją. Savo ruožtu šis baltymas valdo α-amilazės
geno transkripciją. Panašiu būdu fitohormonai geba reguliuoti daugelį svarbių procesų
augalinėje ląstelėje, įskaitant fotosintezę (citokininai skatina kai kurių fotosintezės
reakcijas katalizuojančių fermentų sintezę), ląstelių dalijimąsi bei augimą. Nustatyta,
kad citokininai bei auksinai atlieka svarbų vaidmenį augalinės ląstelės ciklo valdyme.
7
Šie fitohormonai ląstelės ciklo valdyme dalyvauja keisdami reguliacinių baltymų
kiekį. Svarbiausi visų eukariotinių ląstelių ciklą kontroliuojantys baltymai – tai
ciklinai ir nuo ciklinų priklausomos kinazės arba Cdk (angl. cyclin-dependent kinase).
Cdk yra kitus baltymus fosforilinantys fermentai, tačiau jie pasižymi fermentiniu
aktyvumu tik tada, kai sudaro kompleksą su atitinkamu ciklinu. Cdk kiekis ląstelėje
yra maždaug pastovus, tuo tarpu įvairių ciklinų kiekiai labai svyruoja skirtingose
ląstelės ciklo fazėse (ląstelės ciklo valdymo schema pavaizduota 3 pav.). Per
pastaruosius baltymus citokininai dalyvauja augalo ląstelės perėjimo į S ir M fazes
reguliavime. Perėjimui iš G
1
į S fazę citokininai reikšmingi tuo, jog padidina ciklino
D3 kiekį. Naudojant citokininų biosintezės inhibitorių lovastatiną įrodyta, jog
citokininai būtini augalo ląstelės perėjimui į M fazę. Lovastatinas sustabdo mitozę,
bet pridėtas zeatinas atstato normalų ląstelių dalijimąsi. Toks perėjimo iš G
2
į M fazę
reguliavimas greičiausiai susijęs su nuo ciklino priklausančios kinazės aktyvacija. Į
tabako audinių kultūrą pridėtas auksinas padidina nuo ciklino priklausančios kinazės
kiekį, o pridėtas citokininas lemia šio fermento aktyvumą, kadangi pastarasis
hormonas reguliuoja ląstelės ciklą valdančio baltyminio komplekso (Cdk-ciklinas)
reguliacinių subvienetų, t.y. ciklinų, kiekį.















3 pav. Ląstelės ciklo valdymas. MPF – ląstelės dalijimąsi skatinantis veiksnys (angl.
mitosis-promoting factor), t.y. Cdk-ciklino kompleksas. Iš: V. Mildažienė ir kt.
Ląstelės biologija.

8
Savitais mechanizmais augalų augimą reguliuoja auksinas ir giberelinas. Auksinas
jungiasi su receptoriais ir aktyvuoja nuo ATP priklausomą protonų siurblį. Kai
vandenilio jonai išsiurbiami iš ląstelės, jos sienelė rūgštėja ir nutrūksta vandeniliniai
ryšiai tarp celiuliozės gijų. Aktyvuoti fermentai toliau ardo ląstelės sienelę.
Elektrocheminis gradientas, kurį sukūrė protonų siurblys, verčia tirpias medžiagas
skverbtis į ląstelės vidų, o paskui jas veikiamas osmoso skverbiasi ir vanduo. Slėgiui
veikiant sieneles, jos išsiplečia ir ląstelės pailgėja. Toks auksino valdomas ilgėjimas
būdingas jaunesnėms ląstelėms. Giberelino skatinamas augalo stiebo ilgėjimas
paaiškinamas tuo, jog giberelino indukuotoje signalinių molekulių kaskadoje yra
molekulių, kurios jungiasi su reguliaciniais baltymais GAI/RGA. Šie baltymai
augalinės ląstelės branduolyje rišasi su DNR ir stabdo už augalo tįstamąjį augimą
atsakingų genų transkripciją. Kai toks baltymas susijungia su giberelino indukuota
molekule, jis praranda gebėjimą rištis su DNR ir nebegali slopinti augalo augimo.

4. Augalo ląstelės totipotentiškumas
Suvokimą apie tokius procesus, kaip ląstelių diferenciacija, organogenezė ir somatinė
embriogenezė, labai išplėtė audinių kultūrų naudojimas tyrimuose. Augalų gebą
regeneruoti in vitro lemia somatinių augalų ląstelių totipotentiškumas.
Totipotentiškumas – tai somatinių augalų ląstelių savybė, atspindinti jų sugebėjimą
elgtis kaip zigotai ar meristemos pirminėms ląstelėms, reguliuojant ir išreiškiant
genetinę bei epigenetinę informaciją, kuri reikalinga atskirų augalo organų ar viso
organizmo vystymuisi. Tačiau ne kiekviena eksplanto ar kaliaus audinio ląstelė geba
duoti pradžią naujam organui ar organizmui. Tik dalis ląstelių yra potencialiai
pajėgios pereiti naują morfogenetinio vystymosi kelią. Tam jos turi būti aktyvuojamos
kompleksiniais signalais.
Ypač akivaizdžiai augalo ląstelės totipotentiškumą atskleidžia sėkmingi augalų
regeneracijos iš kaliaus bandymai. Gamtoje kalius sutinkamas kaip augalų žaizdas
padengiantis parenchiminis audinys. In vitro kultūroje susidaręs kalius yra vertinga
medžiaga tiriant organizmo vystymąsi. Kaliaus indukcijai audinių kultūroje paprastai
imamas kelių milimetrų dydžio augančio stiebo ar gemalo gabalėlis ir sodinamas
steriliomis sąlygomis ant maitinamosios terpės, turinčios reikiamų makro ir
mikroelementų, fitohormonų, vitaminų bei angliavandenių. Iš tokio audinio pradeda
formuotis nediferencijuotų ląstelių grupė – kalius. Išauga ląstelių masė, panaši į
9
bakterijų koloniją. Kalius gali ilgai augti ir daugintis ant maitinamosios terpės, jei ji
kas keletą savaičių keičiama nauja. Kalių, kaip purią ląstelių masę, galima skaidyti ir
išskirstyti į daugelį dalių. Dažniausiai kaliaus ląstelės išlaiko tos rūšies augalui
būdingus požymius bei savybes. Tačiau tai priklauso nuo kaliaus amžiaus, terpės
sudėties ir kitų veiksnių.
Augalų audinių kultūrose pastebimas žymus polimorfizmas tarp kaliaus ląstelių.
Skiriamos meristeminės, parenchiminės, vakuolizuotos kaliaus ląstelės, taip pat kai
kurios kitos specializuotų ląstelių rūšys, pavyzdžiui, protrachėjiniai elementai.
Meristeminis aktyvumas paprastai koncentruojasi dviejuose kaliaus kultūros
regionuose. Pirmoji meristeminė sritis aptinkama kaliaus pakraštyje. Čia ląstelės gali
formuoti ūglio užuomazgą arba somatinį gemalą. Antrojoje vidinėje kaliaus srityje
formuojami žiedo pavidalo meristeminiai centrai., kurie paprastai išsivysto į šaknį
arba formuoja trachėjinius elementus. Norint atgaminti augalus iš kaliaus ląstelių, jos
persodinamos į kitokios sudėties maitinamąsias terpes, kurios sužadina jų
diferenciaciją ir organų susidarymą. Šie procesai labai priklauso nuo fitohormonų
balanso terpėje. Kai terpėje daugiau auksinų, formuojasi šaknelės, o esant daugiau
citokininų – viršūnių stiebeliai. Būtent šios dvi fitohormonų klasės (auksinai ir
citokininai) laikomos svarbiausiomis augalų regeneracijos tyrimams audinių
kultūroje. Kiti fitohormonai (giberelinai, etilenas, abscisinė rūgštis, poliaminai,
jazmonatai) naudojami rečiau.

4 pav. Maumedžio kalius su regeneruojančiu ūgliu

10
5. Veiksniai, reguliuojantys medžių somatinę
embriogenezę ir organogenezę
Medžio augimas – tai negrįžtamas tūrio ir masės didėjimas, susijęs su naujų
struktūrinių vienetų susidarymu. Daugialąsčio organizmo augimo procesai susideda iš
ląstelių, audinių ir atskirų organų augimo procesų. Taigi augimas yra integralinis
daugiaetapis procesas, kurio metu vyksta ne tik tūrio ir masės pokyčiai, bet ir ląstelių
bei audinių diferenciacija, besitęsianti per visą medžio gyvenimą ir lemianti jo
produktyvumą. Pirminiai augalo augimo metu yra endogeniniai augimo procesai –
naujų struktūrų atsiradimo, tarpusavio sąveikos ir išsidiferencijavimo mechanizmai.
Svarbus ir kitas etapas – ląstelių masės susigrupavimas į audinius, audinių tarpusavio
sąveika ir integracija į augalo organų sistemą, sudarančią augantį augalo organizmą.
Tai vadinama augalo morfogeneze. Morfogenezei būdingi augimo koordinacijos ir
poliarizacijos virsmai, už kurių pobūdį ir kinetiką yra atsakingos augimo reguliavimo
sistemos.
Morfogenezės pradžia yra aktyvus lokalizuotas ląstelių dalijimasis, susidarant arba
meristemoidui, arba embriogeninei ląstelių grupei (somatiniam pirminiam gemalui).
Yra keletas svarbiausių faktorių, atliekančių lemiamą vaidmenį kontroliuojant ląstelės
vystymosi procesus. Tai ląstelės tinkamumas, ląstelės pozicija audinyje, ląstelės
dalijimasis ir poliariškumo išlaikymas, išoriniai bei vidiniai stimulai. Ląstelės
tinkamumas vystymuisi reiškia ląstelės gebą atpažinti hormoninius ar kitus signalus,
paleidžiančius tam tikrą vystymosi metabolinį kelią. Tai viena iš pačių svarbiausių
morfogenezės sąlygų. Indukcija yra procesas, kurio metu vystymosi signalai veikia
tinkamas ląsteles, kad būtų pakeista jų būsena. Indukcijos rezultatas yra
determinuotos ląstelių populiacijos susidarymas, priklausomas nuo atitinkamos
vystymosi programos, kurią lemia savita genų raiška.
Daugialąsčio augalo besidalijančios, tįstančios ir užbaigusios vidinės diferenciacijos
procesus ląstelės yra sugrupuotos į atskiras augimo zonas: meristeminę, tįsimo ir
diferencijuotų ląstelių. Atskirų augimo fazių ląstelės turi morfologinių, anatominių ir
metabolinių skirtumų. Nors nėra visiškai išaiškinta, kokie reguliaciniai procesai yra
atsakingi už ląstelių perėjimą iš vienos augimo fazės į kitą, tačiau manoma, kad
lemiamą vaidmenį čia turėtų vaidinti hormoninė augimo reguliavimo sistema.
Skiriami du pagrindiniai morfogenezės keliai: organogenezė ir somatinė
embriogenezė. Organogenezė ir somatinė embriogenezė turi bendrų bruožų
11
fiziologiniame, biocheminiame bei struktūriniame lygmenyse. Abu šie keliai yra
organizmo vystymosi de novo procesai, vedantys į augalo regeneraciją.
Organogenezė – tai procesas, kurio metu ląstelės ir audiniai kinta, kaip galutinį
rezultatą formuodami unipoliarinę struktūrą, būtent, ūglio, šaknies ar žiedo
užuomazgą, kurios indų sistema dažniausiai susijusi su motininiais audiniais. Tipišku
atveju, organogenezė prasideda mažų pirminių ląstelių grupių, vadinamų
meristemoidais, susidarymu. Organogenetinį vystymąsi pajėgios pradėti pradinio
eksplanto ląstelės į meristemoidą gali virsti daugiau ar mažiau tiesiogiai arba
netiesiogiai, kai tarpinis etapas yra kaliaus susidarymas. Toliau meristemoidai vystosi
į ūglio, šaknies ar žiedo viršūnines meristemas. Dažniausiai miško medžių rūšių
regeneracija audinių kultūrose vyksta organogenezės keliu. Organogenezės kontrolei
labai svarbūs yra fitohormonai. Susidariusių meristemoidų tolesnį vystymąsi viena ar
kita kryptimi gali nukreipti išorinis aprūpinimas fitohormonais arba T-DNR genų
įterpimas, kurie koduotų auksinų arba citokininų sintezėje dalyvaujančius fermentus.
Savo ruožtu citokininai ir auksinai veikia kitų genų raišką.
Somatinė embriogenezė yra kompleksinis procesas, kurio metu atitinkamos
diploidinės ląstelės išreiškia savo totipotentiškumą, duodamos pradžią somatiniam
embrionui. Didesnę galimybę pradėti somatinę embriogenezę turi jaunesnės, mažiau
diferencijuotos ląstelės. Ypač dažnai somatinės embriogenezės indukcijai naudojamas
embriogeninis kalius, t.y. kalius, susidaręs ant zigotinių embrionų (tokio kaliaus
išauginimui audinių kultūroje paprastai naudojamas sintetinis auksinas 2,4-
dichlorfenoksiacto rūgštis bei citokininas benzilaminopurinas). Nustatyta keletas
auksino indukuojamų genų, kurie svarbūs ląstelėms pereinant į embriogeninį
vystymąsi (pvz. skatina ląstelių dalijimąsi). Spygliuočių medžių embriogeninio
kaliaus subrandinimui beveik visada naudojama abscisinė rūgštis. Somatinis
embrionas – tai organizuota bipoliarinė struktūra, turinti ūglio – šaknies ašį bei uždarą
nepriklausomą indų sistemą, jungiančią ūglio ir šaknies meristemas. Somatinis
embrionas nuosekliai vystosi į augalą, pereidamas embrioniniam vystymuisi būdingas
stadijas nuo globulės iki skilčialapio. Svarbiausi embriogenezės vyksmai yra
poliariškumo išlaikymas, kontroliuojamas ląstelės dalijimasis, ląstelės augimo
kontrolė, meristemos formavimasis ir audinių diferenciacija, šakojimasis. Šie procesai
būdingi tiek gemalo, tiek ir suaugusio augalo vystymuisi.

12
6. Haploidų gavimo metodai ir jų panaudojimas
selekcijoje
Haploidas (gr. haploos - paprastas, eidos - pavidalas) - organizmas (šiuo atveju,
augalas), turintis haploidinį (gametinį) chromosomų skaičių somatinėse ląstelėse.
Pastaruoju metu haploidiniai augalai vis plačiau naudojami praktinėse augalų
selekcijos programose bei fundamentaliuosiuose mokslo tyrimuose dvigubų haploidų
linijoms gauti. Dvigubu haploidu vadinamas organizmas, kuris gaunamas iš haploido,
poliploidizacijos metodais pervedant jį į diploidinį lygį. Reikia pažymėti, kad
terminas ,dihaploidas' naudojamas kiek kitokiu aspektu nei terminas ,dvigubas
haploidas'. ,Dihaploidu' vadinamas diploidas gautas iš autotetraploido haploidijos
būdu ir nėra tas pats kas ,dvigubas haploidas' gautas iš diploido. Patogiausia pradine
medžiaga haploidiniams organizmams gauti laikomos gametos. Būtent todėl ir
išskiriami du pagrindiniai augalų haploidizacijos būdai: iš vyriško ir iš moteriško
gametofito. Pirmu atveju, vyksta androgenezė (gr. andros - vyras, genesis - gimimas,
kilmė) -mikrosporų regeneracija į haploidinį sporofitą, tuo tarpu antru - partenogenezė
(gr. parthenos -nekalta mergina, genesis - gimimas, kilmė) - haploidų vystymasis iš
neapvaisintų gemalinio maišelio ląstelių, dažniausiai, kiaušialąstės.
Abu procesai aptinkami ir gamtoje, tačiau paprastai haploidiniai augalai nesusilaukia
palikuonių, kadangi nesuformuoja sėklų arba jos būna sterilios. Partenogeniniai
haploidai gamtoje sutinkami dažniau nei androgeniniai. Pirmuosius spontaninius
haploidus, kurie buvo partenogeniniai, 1922 m. aptiko ir aprašė A.F. Blakeslee.
Paprastai jie išsivysto iš vienos iš sinergidžią kartu su normaliu gemalu. Susidaro
'dvyniai', kurių vienas - diploidas, o kitas -haploidas. Androgenezė taip pat gali vykti
natūraliai, kada mikrospora ar dulkiadaigio branduolys be apvaisinimo vystosi
gemaliniame maišelyje ar net šalia jo. Androgeninius haploidus 1941 m. pirmasis
aptiko bulgarų genetikas D. Kostoff. Blakeslee ir Kostoff įrodė, kad tiek
partenogeniniai, tiek androgeniniai haploidai gali atsirasti spontaniškai, tačiau labai
retai (10~6-10"3). Praktiniams selekcijos tikslams šis haploidizacijos dažnis yra per
mažas.
1966 m. S.Guha ir S.C.Maheshvvari pavyko gauti pirmuosius indukuotus haploidus.
Jie paskelbė apie haploidinių durnaropių in vitro regeneraciją iš jaunų dulkinių. Nuo to
laiko haploidiniai augalai gauti daugiau nei 90 rūšių, priklausančių 35 gentims.
13
Šiuo metu žinomi įvairūs haploidizacijos būdai (5 pav.), tačiau visi jie gali būti
suskirstyti į dvi grupes: in vitro partenogenezė bei in vitro androgenezė.














5 pav. Augalų haploidų gavimo būdų schema

In vitro partenogenezė
Sporofitinis megagametofitas diferencijuojąs! į gemalinį maišelį, kurio viduje yra
kiaušialąstė, sinergidės ir antipodės. Šios haploidinės ląstelės gali sudaryti gemalą ar
kalių in vitro. Nors ir atlikti bandymai su daugeliu augalų rūšių, siekiant indukuoti
kiaušialąstės augimą mitybinėje terpėje, daugumoje atvejų vystymasis sustodavo
kaliaus stadijoje. Vis tik metodas yra labai svarbus tiems augalams, kuriems dulkinių
kultūra nebuvo sėkminga.
Pseudogamija (gr. pseudo - netikras, gamos - vedybos) - gemalo susiformavimas be
vyriškosios ir moteriškosios gametos susiliejimo, stimuliuojančiai veikiant
dulkiadaigio turiniui, gali būti panaudojama haploidinių augalų indukcijai.
Pseudogamijai sukelti naudojamos chemiškai paveiktos (toluidino mėliu) ar
apšvitintos (100 krad) žiedadulkės. Apdulkinus augalą tokiomis žiedadulkėmis,
pavyko iššaukti neapvaisintos kiaušialąstės vystymąsį. Tačiau dėl mažo efektyvumo,
šis metodas nesulaukė platesnio pripažinimo.
14
In vitro androgenezė
Augalo gyvenimo cikle diploidai, sporas auginanti generacija (sporofitas), keičiasi su
haploidais, gametas auginančia generacija (gametofitas). Augalo žieduose yra
vyriškos ir moteriškos struktūros, tokios kaip dulkinės ir piestelės, kuriuose
atitinkamai susidaro vyriškas ar moteriškas gametofitas. Gametofitų funkcija yra
sudaryti vyriškas ar moteriškas gametų ląsteles, kurios dalyvauja apsivaisinime.
Vyriškas žydinčių augalų gametofitas yra žiedadulkė. Mikrosporogenezė prasideda
mejoze ir baigiasi formuojantis haploidinėms mikrosporoms. Mikrogametogenezės
metu vienląstelinė mikrospora dalijasi nesimetriškai, ko rezultate gaunamos jaunos
žiedadulkės su vegetatyvinėmis bei generatyvinėmis ląstelėmis, kurios
diferencijuojasi į subrendusias, bi- ar triląstelines žiedadulkes (6 pav.).


6 pav. Mikrosporos vystymasis ( pagal Батыгина Т.Б. и др., 1994)

Nors galutinis mikrosporos vystymosi tikslas yra diferencijuotis į subrendusią
žiedadulkę ir apvaisinti, bet mikrosporos ar jaunos žiedadulkės gali diferencijuotis į
subrendusią žiedadulkę (vyriškas gametofitas) ar streso poveikyje pakartotinai dalintis
ir sudaryti embrioidą (sporofitą) . Guha ir Maheshwari (1964) tyrė Datura innoxia
vyriško gametofito vystymąsi dulkinių kultūroje ir pastebėjo kad vietoje to, kad
sudarytų žiedadulkes, sudarė embrionus. Tai buvo pirmasis įtarimas, kad embrionai
gali vystytis iš nesubrendusių žiedadulkių - mikrosporų. Pradedant šiuo atradimu
15
atsirado didelis susidomėjimas dulkinių kultūra, kurioje regeneruoja haploidiniai ar
spontaniniai dihaploidiniai augalai.


Subrendusi
žiedadulkė
Biląstelinė
žiedadulkė
Vienląstelinė
mikrospora
brendimas
brendimas
Būsena A
Būsena C2 Būsena C1
Turtinga terpė
Temperatūrinis
šokas, badavimas
Embrioidas
Būsena D
Totipotentinė
(embriogeninė)
mikrospora
Būsena B
GAMETOFITINIS KELIAS
SPOROFITINIS KELIAS





7 pav. Stresas - mikrosporų
embriogenezės priežastis


Pirmą kartą vyriškos generatyvinės ląstelės totipotentiškumą pademonstravo Guha ir
Maheshwari (1964) su Datura innoxia. Mikrosporų, esančių dulkinėse ar izoliuotų
mikrosporų embriogenezę indukuoja skirtingi stresai, kurie verčia vyriškąją
gametofitinę ląstelę (nesubrendusią žiedadulkę) vystytis į sporofitą (embrioidą).
Izoliuotos mikrosporos yra nepriklausomos nuo dulkinės sienelės audinių, tai leidžia
tirti skirtingų veiksnių poveikį tiesiogiai generatyvinei ląstelei (7 pav.).. Mikrosporas
galima izoliuoti dideliais kiekiais ir regeneruoti haploidinius augalus. Sėkmingiausi
rezultatai gauti su kultūriniais augalais, bet pavieniai darbai paskelbti iš sumedėjusių
augalų atliktų tyrimų.

Tolimieji kryžminimai ir chromosomų eliminacija
Tarprūšinė hibridizacija (tolimieji kryžminimai) gali būti sėkmingai panaudota tiek
fundamentaliuosiuose augalų genetikos tyrimuose, tiek praktinės augalų selekcijos
programose. Šis metodas ypatingai sėkmingas javams, kur gali būti išnaudotas dviem
būdais. Visų pirma, kariotipiškai stabilūs kryžminimai, kurių pasėkoje gaunami
hibridiniai augalai. Jie gali būti panaudoti javų genų rinkino praturtinimui iš
giminingų laukinių ar kultūrinių rūšių. Taip pat pradinės medžiagos genetiniams
tyrimams sukūrimui. Antru atveju, kariotipiškai nestabilūs hibridai, kuriuose vienas iš
tėvinių genomų prarandamas besivystant, gali būti panaudojami haploidų gavimui.
Vieni geriausių tokio chromosomų eliminavimo pavyzdžių yra miežių (Hordeum
16
vulgare L.) ir kviečių (Triticum aestivum L.) haploidų gavimas kryžminant su Hordeum
bulbosum L..
Iš pradžių manyta, kad efektyvūs tik tokie tolimieji kryžminimai, kurių tėvinės formos
yra gana giminingos. Vėlesni tyrimai parodė, kad net tokios tolimos rūšys kaip
kviečiai ir kukurūzai gali būti sėkmingai naudojamos kviečių haploidams gauti. 1984
m. Zenktler ir Nitsche buvo pirmieji, kurie pastebėjo gemalų užuomazgas kviečių
kukurūzų kryžminimuose. Šis pasiekimas sukėlė mokslo visuomenės susidomėjimą,
tačiau rezultatai buvo įvertinti skeptiškai, nes jiems pagrįsti buvo naudojami gana
stori (apie 10 um) pjūviai šviesos mikroskopijai. Vis tik neilgai trukus buvo gauti
tikslesni įrodymai. 1986 m. Laurie ir Bennett kviečių veislę ,Chinese Spring'
apdulkino kukurūzų veislės ,Seneca 60' žiedadulkėmis. Dvi-tris dienas prieš žydėjimą
iš kviečių žiedų pincetu buvo pašalintos dulkinės, kad išvengti savidulkos. Mezginės
buvo fiksuojamos 1-6 dienas po apdulkinimo ir vėliau analizuojamos šviesiniu
mikroskopu. Gauti rezultatai pirmą kartą parodė, kad kviečių x kukurūzų
kryžminimuose gaunama hibridinė zigota su pilnais abiejų tėvų chromosomų
haploidiniais rinkiniais, t.y. hibridinė zigota turėjo 21 kviečių ir 10 kukurūzų
chromosomų. Dar daugiau, šie tyrimai taip pat parodė, kad kukurūzų chromosomos
yra greitai eliminuojamos iš hibridinės zigotos. Paprastai eliminacija įvyksta per tris
pirmuosius zigotos dalinimusis. Vėliau paaiškėjo, kad kukurūzų chromosomos yra
eliminuojamos dėl jų nesugebėjimo prisijungti prie dalinimosi verpstės mikrosiūlų ir
tokiu būdu nėra transportuojamos į ląstelės dalinimosi polius.

Haploidų reikšmė augalų selekcijoje
Haploidiniai augalai yra labai vertinga genetinė medžiaga, praktiškai panaudojama
selekcijoje. Haploidų panaudojimas leidžia tirti perskilimą gametos lygyje ir tuo pat
metu pasiekti homozigotinę būseną jau F1 generacijoje. Recesyvinių mutacijų
pasireiškimas galimas haploidinėje fazėje, tiesiog gametofito lygyje arba
haploidiniuose sporofituose, gautuose iš paveiktų mutagenais mikrosporų. Ryšium su
tuo, kad haploiduose nėra gametų atrankos, turinčių šį mutantinį alelį, mutacijos tipą
galima nustatyti pagal segregacijos dažnumą haplofazėje.
Čeizas įvedė sąvoką “analitinė selekcija” poliploidų selekcijos metodui, kuris
pagrįstas galimybe paversti juos dihaploidais. Tam tikrame ploidiškumo lygyje
vykdomas kryžminimas ir atranka, po to iš geriausių rekombinantinių genotipų vėl
17
sintezuojama pradinė poliploidinė būsena. Taikant žiedadulkių kultūrą “analitinė
selekcija” perkeliama į monoploidų lygį, o tai leidžia gauti pilnas homozigotas.
Gavimas haploidinių augalų, kurie turi tik po vieną iš kiekvienos poros homologinių
chromosomų, leidžia atrasti vertingų rekombinantų ir mutantų jau pirmoje
generacijoje. Tokių augalų genotipas atsispindi ir fenotipe. Haploiduose pasireiškia
visi recesyvinai genai, kas leidžia pagreitinti selekcinį procesą. Efektyvumas
selekcijos haploidų palyginus su diploidais padidėja 2 kartus, kur n – poros
nepriklausomų rekombinacinių alelių tėvinių augalų. Kryžminant diploidinius
organizmus, kurie skiriasi 2 genų poromis, homozigota F1 kartoje gali pasireikšti tik
iš 1/16 heterozigotų, o pas diploidizuotus monoploidus ji bus pas ketvirtį individų .
Pastaruoju metu yra sukurta daugiau kaip 200 veislių įvairių rūšių augalų haploidų
pagrindu (1 lentelė).

1 lentelė. Įvairių augalų veislės, sukurtos, naudojant haploidijos technologijas (1990 –
2004). (Paimta iš: http://www.scri.sari.ac.uk/assoc/COST851/Default.htm).

Augalas Šalis Veislių
skaičius,
vnt.
Procentais
nuo bendro
skaičiaus
Šparagas Italija, Kanada, Prancūzija 7 2,5
Miežiai
(vasariniai)
Australija, Kanada, Čekija, Vokietija,
Danija, Prancūzija, Lenkija, Vengrija,
Švedija, Rusija, Austrija, Olandija,
Anglija, Ispanija, Belgija, Japonija,
Naujoji Zelandija, Šveicarija,
Norvegija, Ukraina
141 49,8
Miežiai
(žieminiai)
Suomija, Anglija, Prancūzija 9 3,2
Baklažanas Ispanija 5 1,8
Melionas Ispanija 9 3,2
Paprika Ispanija 7 2,5
Rapsai Kanada, Danija, Prancūzija, Vokietija,
Švedija, Anglija, Australija
52 18,3
Ryžiai Kinija, Vengrija 10 3,5
Pašarinė ropė Norvegija 1 0,3
18
Augalas Šalis Veislių
skaičius,
vnt.
Procentais
nuo bendro
skaičiaus
Kviečiai Brazilija, Kanada, Kinija, Prancūzija,
Vokietija, Vengrija, Švedija, Anglija
30 10,6
Kvietrugiai Australija, Prancūzija 3 1,1
Bendras veislių skaičius 283

7. Pagrindiniai transgeninių medžių kūrimo metodai

Medžių genetinės transformacijos tikslai
Augalų genetinė inžinerija pastebimai vystėsi nuo pat pirmųjų transformuotų augalų
sukūrimo praėjusio amžiaus 9-ojo dešimtmečio pradžioje. Molekulinės technologijos
buvo pritaikytos daugeliui rūšių, gauta didelė išaugintų transgeninių augalų, taip pat ir
sumedėjusių rūšių, įvairovė. Genetinės transformacijos esmė yra naujų genų įvedimas
į ląstelę-taikinį, tokiu būdu genetinė miško medžių transformacija suteikia galimybę
sukurti medžius, pasižyminčius naujomis, tai rūšiai įprastai nebūdingomis savybėmis.
Vykdant miško medžių genetinę transformaciją siekiama padidinti jų augimo greitį,
ūkiškai naudinga linkme keisti kamieno pavidalą, pagal atitinkamus poreikius
modifikuoti ligniną, padidinti atsparumą herbicidams, ligoms, kenkėjams (pirmiausia
vabzdžiams), sutrumpinti medžio brandos laikotarpį (pagreitinti žydėjimą). Taip pat
medžių transformacija atitinkamai sukonstruotais genais leidžia nustatyti tiriamų
medžių genų transkripcijos ypatumus.Genų įvedimui į augalinę ląstelę gali būti
naudojami įvairūs metodai, kuriuos toliau ir aptarsime.

Genetinė transformacija Agrobacterium pagalba
Dažniausiai augalų genetinė transformacija vykdoma bakterijos Agrobacterium
pagalba. Agrobacterium tumefaciens turi taip vadinamą Ti plazmidę, kurios sudėtyje
yra T-DNR sritis. Šioje srityje yra genai, atsakingi už fitohormonų auksino bei
citokinino sintezę, taip pat genai, kurie lemia augalui neįprastų aminorūgščių opinų
bei fosforilintų cukraus darinių agrocinopinų sintezę, kuriuos bakterija gali naudoti
kaip energijos šaltinį. T-DNR yra perkeliama į augalo genomą, Minėtus
fitohormonus bei metabolitus tada sintetina užkrėstos augalo ląstelės. Infekcijos
vietoje susidaro gumbeliai (dėl fitohormonų poveikio), bakterijoms maisto medžiagas
19
teikia augalas-šeimininkas, dargi tokiu pavidalu, kad jų negali panaudoti kitų rūšių
bakterijos. Agrobacterium savybė integruoti tam tikrą savo DNR dalį į augalo ląstelės
genomą buvo panaudota augalų genų inžinerijoje. Tam reikalingi genai yra Ti
plazmidėje. Dalis Ti plazmidėje esančių genų koduoja receptorius, kurie padeda
bakterijai nustatyti pažeistą vietą augalo audinyje. Pavyzdžiui, pažeistas augalo
audinys išskiria fenolinius junginius, tokius kaip acetosyringonas, kurio netgi labai
nedideles koncentracijas geba užfiksuoti Agrobacterium cheminiai receptoriai. Pro
pažeidimo vietą bakterijos lengvai įsiskverbia į augalo audinį. Minėtas fenolinis
junginys acetosyringonas toliau atlieka svarbų vaidmenį infekcijos eigoje. Kai šio
junginio koncentracija tampa didesnė nei reikalinga Agrobacterium chemotaksiui
sukelti, yra aktyvuojami šios bakterijos virulentiškumo (vir) genai, kurie toliau
koordinuoja infekcijos procesą. Sintetinami atitinkami fermentai, pvz. permeazės,
kurios įterpiamos į bakterijos membraną, kad vėliau tarnautų infekuoto augalo
gaminamų junginių (opinų) įsisavinimui. vir genai yra atsakingi taip pat už
restrikcijos fermento endonukleazės sintezę. Būtent šis fermentas iškerpa tam tikrą Ti
plazminės dalį, vadinamą T-DNR. Bakterija išskiria iškirptąją T-DNR, ši genetinė
medžiaga pereina į augalo ląstelę ir integruojasi į augalinės ląstelės chromosomą (tuo
tarpu likusi Ti plazmidės dalis lieka bakterijos ląstelėje). Natūraliai dėl T-DNR
integracijos augalo ląstelės pradeda gausiai sintetinti fitohormonus (citokininą bei
auksiną), dėl to infekuotosios ląstelės sparčiai dalijasi, sutrinka įprastinis augalinio
audinio vystymasis, susidaro gumbai. Tokios ląstelės gamina bei išskiria metabolitus,
kuriuos Agrobacterium panaudoja kaip maisto šaltinį. Tačiau genų inžinerijos
metodais galima pašalinti tą T-DNR dalį, kurioje yra genai, atsakingi už fitohormonų
bei Agrobacterium mitybai reikalingų metabolitų produkciją, ir jos vietoje įterpti
norimą geną. Svarbu palikti tik nedidelę T-DNR dalį, būtent jos kraštinius 25 bazių
fragmentus iš abiejų pusių, kurie būtini augalinės ląstelės transformacijai. Taip pat
naujai sukonstruota T-DNR privalo turėti restrikcijos saitą – specifinę nukleotidų
seką, kurią galėtų atpažinti restrikcijos fermentas DNR iškirpimui iš Ti plazmidės.
Ruošiantis perkelti genetinę medžiagą į augalo ląstelę Agrobacterium pagalba,
galimos kelios strategijos. Viena iš galimybių yra in vitro manipuliuoti su plazmide,
turinčia nedidelį segmentą iš T-DNR (kad būtų atitinkamas homologijos regionas tarp
šios plazmidės ir Ti plazmidės). Konstruojant tokią plazmidę į ją įterpiamas genas,
kurį norima perkelti į augalo ląstelę. Plazmidė sukonstruojama E. coli bakterijoje,
kadangi su šia bakterija žymiai paprasčiau atlikti įvairias manipuliacijas in vitro.
20
Sukonstruota plazmidė perkeliama iš E. coli į Agrobacterium tumefaciens su Ti
plazmide, iš kurios pašalinti už fitohormonų sintezę atsakingi genai. Sukonstruotoji
plazmidė homologinės rekombinacijos būdu įsiterpia į Agrobacterium T-DNR. Kai
pastaroji bakterija infekuoja augalą, T-DNR su intarpu yra perkeliama į chromosomą
augalo ląstelės branduolyje. Kitas būdas vadinamas dvigubo vektoriaus strategija.
Šiuo atveju sukonstruojama plazmidė, turinti kairįjį ir dešinįjį T-DNR kraštus. Tarp jų
įterpiamas genas, kurį norima perkelti į augalo ląstelę. Tokia plazmidė
transformuojama į E. coli. Tada transformuotos E.coli kultūra sumaišoma su A.
tumefaciens linija, turinčia plazmidę su vir genais. Vykstant konjugacijai tarp dviejų
skirtingų rūšių bakterijų sukonstruotoji plazmidė perkeliama į Agrobacterium. Šios
bakterijos plazmidėje buvę vir genai lemia tai, kad augalo audinys yra infekuojamas ir
tai, kad tarp dešiniojo ir kairiojo T-DNR pakraščių buvęs DNR fragmentas iš
sukonstruotosios plazmidės (atpažįstama kairiojo T-DNR pakraščio seka) įterpiamas į
augalinės ląstelės chromosomą. Atitinkamai augalų transformacijoje gali būti
panaudota ir kita Agrobacterium rūšis – Agrobacterium rhizogenes. Aprašytoji lemia
gumbelių susidarymą ant įvairių augalo dalių, tuo tarpu A. rhizogenes taikinys yra
pažeistos augalų šaknys ir ši bakterija savo ruožtu skatina šakniaplaukių susidarymą.
Infekcijos mechanizmas analogiškas A. tumefaciens infekcijai. A. rhizogenes turi Ri
plazmidę, kurios funkcija atitinka Ti plazmidės funkciją, taigi į augalo ląstelės
chromosomą gali būti integruota A. rhizogenes T-DNR. Ši Agrobacterium rūšis
augalų genetinėje transformacijoje naudojama rečiau, tačiau kartais augalų audinių
kultūroje naudojama kitam tikslui – paskatinti pridėtinių šaknų formavimąsi. Tiek A.
tumefaciens, tiek A. rhizogenes atveju bakterijų geba infekuoti augalo ląsteles gali
smarkiai skirtis tarp įvairių tos pačios rūšies bakterijų linijų.
Nors šiaip transformacija naudojant Agrobacterium sistemą pasižymi palyginus
aukštu efektyvumu, esama ir tam tikrų sunkumų, kurie riboja tokios sistemos taikymą
miško medžių genetinei transformacijai. Augalų transformacija Agrobacterium
pagalba reikalauja efektyvios tos augalų rūšies dauginimo in vitro sąlygomis sistemos.
Kai pažeistas augalo audinys yra transformuojamas Agrobacterium, reikia, jog iš šio
audinio, būtent iš transformuotų ląstelių, išsivystytų nauji augalai. Šito tikėtis leidžia
aukščiau minėta svarbi augalinių ląstelių savybė – totipotentiškumas, t.y. somatinių
ląstelių geba išauginti naują organizmą. Somatinės embriogenezės ar organogenezės
keliu iš transformuotos ląstelės išsivystęs augalas tada turėtų perkeltojo geno
lemiamas savybes bei galėtų perduoti jas palikuonims. Tačiau miško medžių atveju
21
tik nedaugeliui rūšių yra sukurta tokia efektyvi mikrovegetatyvinio dauginimo
sistema. Svarbiausia miško kultūra, tinkančia genetinei transformacijai, išlieka
drebulė, taip pat ir kai kurios kitos tuopų (Populus) rūšys. Tačiau kai kurie bandymai,
atlikti su įvairiomis spygliuočių medžių rūšimis, patvirtino ir sunkiau regeneruojančių
audinių kultūroje rūšių transformacijos galimybę. Geri rezultatai gauti
transformuojant Agrobacterium tumefaciens pagalba hibridinį maumedį. Kaip
augalinė medžiaga čia buvo naudota maumedžio embrioninė masė (ant zigotinių
embrionų susidaręs embriogeninis kalius). Atlikus transformavimo procedūrą pavyko
gauti somatinius embrionus, kurie vėliau išsivystė į augaliukus, ir kurių molekulinis
tyrimas patvirtino transformacijos sėkmę. Taigi maumedžiai buvo pirmieji
spygliuočiai, kuriems atlikta sėkminga transformacijos procedūra. Bandant įvairius
transformacijos būdus, pati efektyviausia pasirodė transformacijos Agrobacterium
tumefaciens pagalba sistema. Tačiau daugeliui miško medžių rūšių šią sistemą sunku
pritaikyti dėl jų menkos regeneracijos audinių kultūroje. Tai įgalina ieškoti genetinės
transformacijos galimybių apeinant audinių kultūros stadiją. Vienas iš galimų būdų
yra transformacija in planta, išbandyta su žoliniais augalais (vaireniu). Šiuo atveju
Agrobacterium, nešančia atitinkamą geną-žymenį, buvo užkrėstos dygstančios sėklos
ir transformacijos lygis patikrintas tarp išsivysčiusių augalų, taip pat tarp jų
palikuonių. Panaši metodika galėtų būti pritaikyta toms medžių rūšims, kurias sunku
dauginti audinių kultūroje. Atitinkamai būtų galima mėginti
užkrėsti ir transformuoti in planta žydinčius medžių ūglius,
o transformacijos lygį patikrinti tarp gautų palikuonių.


8 pav. Transformacijos Agrobacterium tumefaciens pagalba
pavyzdys: į augalą įvedamas atsparumą vabzdžiams
lemiantis genas. Iš: National 4-H Council. Fields of genes:
making sense of biotechnology in agriculture.

Tam tikrų privalumų turi sumedėjusių rūšių transformacija
Agrobacterium rhizogenes, lyginant su A. tumefaciens.
Medžių transformacijos efektyvumą A. tumefaciens riboja
tai, kad dauguma sumedėjusių augalų rūšių pasižymi
nedideliu imlumu pastarosios bakterijų rūšies sukeliamai infekcijai, nedideliu
transgeninių ląstelių regeneracijos potencialu bei pernelyg dideliu jautrumu
cheminėms medžiagoms, naudojamoms transformuotų ląstelių selekcijai. Tuo tarpu
22
didelė dviskilčių augalų, o taip pat ir plikasėklių, įvairovė pasižymi imlumu A.
rhizogenes sukeliamai infekcijai. A. rhizogenes plačiai naudojama įvairių vaismedžių
bei miško medžių šaknijimosi pagerinimui. Šiuo atžvilgiu pastaroji Agrobacterium
rūšis pasirodė efektyvi dirbant su kriaušėmis, obelimis, vyšniomis, alyvmedžiais,
lazdynais, migdolais, kaštainiais, pušimis, maumedžiais, eukaliptais. Regeneravusius
transgeninius medžius pavyko gauti iš netikrosios akacijos, europinio maumedžio,
obelies, hibridinės tuopos, vynuogės šakniaplaukių. Ypač greita transformacija gauta
dirbant su netikrąja akacija: šakniaplaukiai susidarė per savaitę po infekcijos, o per
keturias savaites iš jų regeneravo ūgliai. Susidarę šakniaplaukiai gali greitai augti, ilgą
laiką būti kultivuojami bei spontaniškai regeneruoti ūglius. Taigi Agrobacterium
rhizogenes tarpininkaujama transformacija turi keletą privalumų: galima tiesioginė
(vizuali) šakniaplaukių atranka, nenaudojant ūglių regeneraciją inhibuojančių
chemikalų, taip pat galima išlaikyti stabilią šakniaplaukių kultūrą bei gauti
spontanišką ūglių regeneraciją. Siekiant gauti vienodo genotipo transformuotus
augalus tai yra patikimiau nei augalų regeneracija iš kaliaus, kadangi ilgai auginant
kaliaus kultūrą galimos ląstelių mutacijos, dėl ko toje pačioje kaliaus kultūroje
susiklosto tam tikra genetinė įvairovė. Tačiau A. rhizogenes panaudojimo galimybę
miško medžių transformacijoje riboja tai, kad šios bakterijos T-DNR sudėtyje yra rol
genai, kurie, infekcijos metu perkelti drauge su pageidaujamu genu, lemia išsigimusį
medžio fenotipą. Šiaip rol genai iš A. rhizogenes dažnai naudojami transformacijos
bandymuose, kadangi ženkliai pakitęs besivystančio augalo fenotipas yra geras
sėkmingos transformacijos indikatorius. Pavyzdžiui, rolC genas pakeičia
transformuotų drebulių augimą, lapų spalvą bei dydį.
Atliekant medžių transformaciją Agrobacterium pagalba, reikia turėti omenyje, kad
perkelta T-DNR gali integruotis į bet kurią chromosomą augalo genome. Tai gali būti
vienetinė insercija vienoje chromosomoje, keletas perneštos į augalinę ląstelę DNR
vienetinių insercijų skirtingose chromosomose ar keletas perkelto geno kopijų toje
pačioje chromosomoje. Taigi sunku iš anksto nuspėti, kiek rekombinantinio geno
kopijų po genetinės transformacijos bus integruota pirminių transformantų genome.
Kopijų skaičius gali būti skirtingas skirtinguose transformantuose. Taip pat negalima
iš anksto numatyti, kuriame chromosomos regione (heterochromatine ar
euchromatine) integruosis perkeliamas genas, tuo tarpu nuo integracijos vietos stipriai
priklauso perkelto geno ekspresija. Jei T-DNR į augalo ląstelės chromosomą įsiterpia
šalia kartotinių sekų arba heterochromatino (paprastai tai būna metilintos sekos), tai
23
perkeltas genas greičiausiai bus inaktyvuotas, jo ekspresija nevyks. Iš kitos pusės, kai
perkeliamas genas įsiterpia į intensyviai transkribuojamą euchromatino regioną, tai
tada jo ekspresiją veikia reguliacinės ląstelės-šeimininkės genų sekos. Taigi T-DNR
integracijos vieta bei tokių T-DNR intarpų skaičius neišvengiamai veikia šios DNR
sudėtyje perkelto geno ekspresiją. Vis dėlto transformacija Agrobacterium pagalba
sukuria mažesnę įvairovę pernešamos DNR įsiterpimo į augalinės ląstelės genomą
atžvilgiu nei kai kurie kiti metodai. Pavyzdžiui, apšaudymo dalelėmis atveju (šis
metodas aprašytas žemiau) regeneravusių transformuotų somatinių embrionų (įvairių
spygliuočių medžių rūšių) genome gali būti aptinkama nuo vienos iki daugiau kaip
šimto to paties integruoto geno kopijų, tuo tarpu Agrobacterium pagalba
transformuotos drebulės regenerantuose perkelto geno kopijų skaičius svyruoja nuo
vienos iki keleto. Geriausias variantas yra tuo atveju, kai į augalo ląstelės genomą
įsiterpia viena T-DNR kopija tokioje chromosomos vietoje, kur gali vykti normali
integruoto geno ekspresija. Perkelto geno ekspresijos reguliavimas savo ruožtu
priklauso ne vien nuo ląstelės-šeimininkės reguliacinių sekų, kurios gali veikti jo
raišką (tai vadinama trans reguliavimu), bet ir nuo atitinkamų sekų, esančių to paties
geno konstrukcijoje (cis reguliavimas). Konstruojant geną, kurį norima perkelti į
augalo ląstelę, parenkamas atitinkamas promotorius to geno transkripcijos valdymui.
Miško medžių genetinės transformacijos atveju čia reikia išspręsti specifines
problemas. Medžiai gyvena daugelį metų, tad ir promotorius perkeliamam genui turi
būti parinktas toks, kad galėtų užtikrinti stabilią ilgalaikę integruoto geno ekspresiją.

Kiti metodai, taikomi augalų genetinėje transformacijoje
Kiti pagrindiniai augalų genetinės transformacijos būdai yra susiję su tiesioginiu
svetimos genetinės medžiagos įvedimu į augalo ląstelę. Vienas iš tokių būdų yra
vadinamas balistiniu metodu arba dalelių bombardavimu. Tai gana įprastas metodas
augalų transformacijoje, ypač toms jų rūšims, kurios yra atsparios Agrobacterium
infekcijai. Šio metodo principas (6 pav.) paprastas: perkeliama DNR (paprastai
plazmidė) prilipdoma prie mikroskopinių metalo (aukso arba volframo) dalelių,
vadinamų mikrodalelėmis. Tada tokios mikrodalelės, padengtos DNR, yra iššaunamos
į augalo audinį, kurį norima transformuoti. Dalelių svoris, dydis ir greitis parenkamas
kaip tik toks, kad jos prasiskverbtų pro augalo ląstelės sienelę ir įstrigtų ląstelėje, jos
neužmušdamos. Dalis į ląstelę patekusios plazmidinės DNR atsiskiria nuo
mikrodalelių ir gali judėti į branduolį bei ten integruotis į augalinės ląstelės genomą.
24
Tokiu atveju perneštieji genai bus ekspresuojami. Tokios transformacijos sėkmė
dažniausiai patikrinama sekant geno-žymens ekspresiją. Paprasčiausia čia naudoti β-
gliukuronidazės (GUS) geną su stipriu, nespecifiniu promotoriumi. Po tam tikro laiko,
per kurį jau gali pasireikšti geno ekspresija, GUS aktyvumas gali būti lengvai
nustatytas inkubuojant audinį su GUS substratu X-Gluc (5-bromo-4 chloro-3-indolil-
β-D-gliukuronidas); reakcijos produktas pasižymi charakteringa mėlyna spalva. Tada
transformacijos efektyvumas nustatomas tiesiog suskaičiuojant mėlynas dėmes ant
mikrodalelėmis apšaudyto audinio. Paprastai šis efektyvumas nėra didelis, kadangi
svetima DNR dažniausiai nesiintegruoja į augalinės ląstelės genomą (vieną iš
chromosomų) ir nesireplikuoja. Daug tyrimų atliekama norint padidinti šio genetinės
transformacijos metodo efektyvumą. Ieškoma optimalaus dalelių dydžio bei greičio,
DNR ir aukso arba volframo koncentracijų, buferio, kuriame DNR rištųsi su
mikrodalelėmis, DNR formos (linijinė ar žiedinė) ir kitų parametrų. Be to, svarbu ne
tik tai, kad perkeliama DNR integruotųsi į ląstelės genomą, tačiau taip pat reikia, kad
pati augalo ląstelė būtų pajėgi duoti pradžią naujam augalui, t.y. regeneruoti.
Nustatyta, jog sumedėjusiuose augaluose tokiai transformacijai yra tinkamiausi šie
audiniai: embriogeninis kalius, nesubrendę zigotiniai bei somatiniai gemalai,
embrioninės meristemos. Minėti audiniai transformacijai tinkamiausi būtent dėl
aukšto regeneracijos potencialo.







9 pav. Augalo transformacija dalelių
bombardavimo metodu.


Elektroporacija yra ląstelių veikimas aukštos įtampos elektros lauku. Padidinamas
membranų pralaidumas ir tokiu būdu į ląstelę gali patekti į terpę pridėtos medžiagos,
taip pat ir DNR. Kaip ir dalelių bombardavimo atveju, nėra aišku, ar į ląstelę patekusi
DNR judės į branduolį, integruosis į ląstelės genomą ir bus ekspresuojama. Iš pradžių
25
manyta, jog elektroporacijos metodas dėl augalų ląstelės sienelės nepralaidumo bus
tinkamas tik protoplastams (augalinėms ląstelėms, kurių sienelė pašalinta mechaniškai
arba fermentų pagalba). Tačiau kai kurių augalų rūšių embrioninės bei kaliaus ląstelės
buvo sėkmingai transformuotos elektroporacijos metodu. Transformacijos
elektroporacijos metodu efektyvumas padidėja, kai dirbama su tokiomis augalų
ląstelėmis, kurių sienelė yra dalinai ištirpinta arba mechaniškai pažeista. Vis dėlto pati
transformacija šiuo metodu efektyviausa, kai dirbama su protoplastais. Tačiau
protoplastai pernelyg jautrūs aplinkai, didelė jų dalis žūva, be to, iš jų ypač sunku
regeneruoti naujus augalus. Taigi elektroporacija kol kas nėra itin efektyvus metodas
siekiant transformuoti augalines ląsteles.
Mikroinjekcijų metodu ląstelės transformuojamos įvedant į jas ypač plonus švirkštus
ir suleidžiant svetimą genetinę medžiagą. Šis metodas gali būti ypatingai efektyvus,
kai DNR įterpiama tiesiai į ląstelės branduolį. Iš pradžių šis metodas taikytas gyvūnų
ląstelėms, pavyzdžiui, atliekant DNR injekcijas į žinduolių zigotas galima sukurti
transgeninius gyvūnus. Augaluose sėkmingas mikroinjekcijų panaudojimas
dažniausiai apsiriboja protoplastų transformacija, nors kai kuriais atvejais įmanoma
atlikti tokias DNR injekcijas netgi į ūglio meristemos ląsteles. Yra aprašytas aukštu
efektyvumu pasižymintis DNR įleidimo į augalinės ląstelės branduolį ar chloroplastus
būdas naudojant vadinamąjį galinstano išsiplėtimo švirkštą: labai mažo diametro
stiklinis kapiliaras yra užpildomas DNR bei skystų metalų lydiniu galinstanu, į kurio
sudėtį įeina galis, indis ir alavas. Kapiliaro galiukas įterpiamas į ląstelę ir stiklinis
vamzdelis kaitinamas karštu oru. Kaitinamas metalų lydinys išsiplečia, taip
išstumdamas DNR į ląstelę. Tokia metodika gali būti sėkmingai pritaikoma lengvai iš
protoplastų regeneruojantiems žoliniams augalams, taip pat – laisvai gyvenančių
žemesniųjų augalų zigotų transformacijai. Tačiau, kaip ir elektroporacijos atveju,
sunki sumedėjusių augalų regeneracija iš protoplastų neleidžia plačiau taikyti
mikroinjekcijų metodo miško medžių genetinėje transformacijoje.
Tiesioginio genetinės medžiagos pasisavinimo metodai susiję su pastebėjimu, kad
visos gyvos ląstelės geba “susirinkti” DNR molekules iš jas supančios aplinkos. Tokiu
būdu į ląstelę patekusi DNR gali būti įterpta į branduolio genomą ir ekspresuojama.
Šis procesas yra analogiškas bakterijų transfekcijai, lyginant su pastarosiomis,
eukariotinėse ląstelėse jis sutinkamas rečiau, tačiau vis dėlto jo dažnis nėra mažas.
Pirmieji tiesioginio DNR įsisavinimo bandymai augalų tarpe buvo atlikti su įvairių
augalų sėklomis bei daigais. Kai kuriais atvejais taip pat naudotos žiedadulkės bei
26
kultūroje užaugintos ląstelės. DNR pasisavinimas bei integracija buvo sekama
naudojant autoradiografiją arba centrifugavimą cezio chlorido gradiente, vėliau
sukurti patikimesni metodai specifinių genų buvimui bei ekspresijai nustatyti.
Didesnio tiesioginio DNR pasisavinimo efektyvumo galima siekti įvairiais būdais.
DNR sąveika su ląstelės membrana tirpale gali būti sustiprinta naudojant polietileno
glikolį. Galima nusodinti DNR ant ląstelės paviršiaus kalcio fosfatu arba stroncio
fosfatu, formuoti DNR kompleksus su dekstranu arba katijonais, paveikti ląstelę
osmotiniu šoku arba dimetilsulfoksidu. Taip pat išorinė DNR gali būti patalpinta į
dirbtines fosfolipidų pūsleles, vadinamas liposomomis, kurios suliejamos su ląstelės
plazmine membrana. Liposomų naudojimo privalumai yra šie: genetinė medžiaga
apsaugoma nuo degradacijos nukleazėmis, DNR lengviau patenka į ląstelę, taip pat
liposomose į ląstelę gali patekti didelės plazmidės, dideli DNR kiekiai ir daugybiniai
genai (daugiau kaip 10000 plazmidžių vienai ląstelei), be to, liposomos nepasižymi
toksiniu poveikiu. Tačiau visa ši su tiesioginio DNR pasisavinimo pagerinimu susijusi
metodika daug dažniau naudojama transformuojant žinduolių ląsteles, tuo tarpu
augalų genetinėje transformacijoje tai atliekama palyginti retai. Problema išlieka ta
pati: tvirta augalinės ląstelės sienelė trukdo efektyviam genetinės medžiagos
pasisavinimui iš aplinkos, o regeneracijos iš protoplastų galimybės ribotos. Iš dalies
šią problemą gali padėti išspręsti paprasta, bet efektyvi tiesioginio DNR pasisavinimo
technologijos modifikacija: augalinių ląstelių maišymas drauge su silikono karbido
skaidulomis. Silikono karbidas yra ypač kieta medžiaga, kuri gali būti apdorota taip,
kad suformuotų ilgus spyglio pavidalo kristalus. Kai augalinės ląstelės sūkuriniu
judėjimu sumaišomos drauge su tokiais kristalais, silikono karbido skaidulos perveria
ląsteles, tuo būdu atverdamos mažas poras ląstelės sienelėje bei membranoje, pro
kurias į ląstelę gali nesunkiai patekti DNR. Tada transformuotos ląstelės toliau gali
būti kultivuojamos ant atrankinės terpės. Ši metodika sėkmingai naudojama
transformuojant įvairias augalų rūšis, taip pat ir medžius, pavyzdžiui, silikono karbido
skaidulų panaudojimas padidino amerikinio kaštainio transformacijos Agrobacterium
tumefaciens pagalba efektyvumą.
Svetimos DNR patekimas į branduolį nėra vienintelis augalinių ląstelių genetinės
transformacijos kelias. Savitą genomą turi ir augalų ląstelių plastidės, ir šių ląstelių
genetinės transformacijos eigoje galimas tikslingas svetimos genetinės medžiagos
nukreipimas į chloroplastus. Chloroplastai turi savo žiedinę DNR, kuri koduoja dalį
šiose plastidėse sutinkamų baltymų (kai kurie jų ypač svarbūs fotosintezei) bei jų
27
sintezei reikalingas RNR. Chloroplastų genetinė transformacija gali padėti išvengti
kai kurių su branduolio genomo transformacija susijusių problemų. Transformavus
branduolio genomą, perkelto geno ekspresija dažniausiai vyksta sąlyginai žemu lygiu,
be to, gali vykti nepageidautinas šio geno plitimas tarp laukinio tipo augalų drauge su
transformuoto augalo sėklomis, o ypač – su jo žiedadulkėmis. Tuo tarpu chloroplastai
pasižymi geba sukaupti labai dideles atskirų baltymų koncentracijas. Į chloroplastų
genomą integruotas svetimas tai augalų rūšiai genas neturi tiek daug galimybių plisti
aplinkoje, kadangi daugumos augalų rūšių žiedadulkės neturi plastidžių. Du
dažniausiai naudojami būdai chloroplastų transformacijai yra dalelių bombardavimas
ir polietileno glikoliu sustiprintas DNR pasisavinimas. Chloroplastų transformacijos
galimybę turėtų žymiai padidinti mikroinjekcijų technologijos vystymas, kai svetima
DNR į ląstelę perkeliama naudojant galinstano išsiplėtimo švirkštą. Perkeltų genų
raiška chloroplastuose gali būti reguliuojama plastidėms specifiniais promotoriais.
DNR į branduolį ar kitas ląstelės organeles gali būti nukreipiama suliejant ją su
atitinkamomis peptidinėmis sekomis, kurios tarnauja kaip viduląstelinio transporto
signalai, arba tiesiogiai įliejama į paskirties vietą mikroinjekcijos metu.
Kita problema yra ta, kad pernešta DNR į ląstelės-šeimininkės genomą integruojasi
nespecifiškai. Kaip minėta, geno įsiterpimas į netranskribuojamą chromosomos vietą
praktiškai reiškia nesėkmingą tos ląstelės transformaciją. Apskritai, yra du būdai, kaip
perkeliamas genas gali integruotis į ląstelės-šeimininkės genomą. Tai homologinė
rekombinacija ir nehomologinė rekombinacija. Homologinė rekombinacija vyksta
tarp panašių sekų ląstelės genome ir perkeliamoje genetinėje medžiagoje. Šiuo atveju
ląstelės-šeimininkės genai pakeičiami tais, kurie pernešami su svetima DNR. Tuo
tarpu nehomologinės rekombinacijos atveju pernešama DNR tiesiog atsitiktinai
įsiterpia bet kurioje ląstelės genomo vietoje, nepriklausomai nuo panašumo į ląstelės-
šeimininkės DNR sekas. Nehomologinės rekombinacijos metu ląstelė savo genų
dažniausiai nepraranda. Homologinė rekombinacija yra dažnai pasitaikantis ir netgi
vyraujantis rekombinacijos kelias bakterijų ir žemesniųjų eukariotų tarpe. Šis
reiškinys siūlo įvairialypes galimybes genų inžinerijai: perkeltų genų ekspresija gali
būti reguliuojama vietiniais ląstelės promotoriais, defektyvūs genai pakeisti
veikliomis sekomis arba, atvirkščiai, veiklūs genai išmušti pakeičiant juos
mutavusiomis neveikliomis sekomis, gali būti sustiprinta svetimų genų raiška,
sumažintas ko-supresijos dažnis, kai įvedamos daugybinės homologinių genų sekos.
Taip pat homologinė rekombinacija labai pasitarnauja funkcinėje genomikoje, t.y.
28
tiriant atskirų genų funkcijas. Tačiau aukštesniuosiuose eukariotuose homologinė
rekombinacija yra labai retas įvykis. Dirbant su aukštesniaisiais augalais dar nedaug
yra sukaupta eksperimentinės patirties tikslingam genų įterpimui į atitinkamas vietas
augalų chromosomose. Bandant tikslingai įterpti homologinius genus į modelinio
augalo vairenio genomą nustatyta, kad homologinė rekombinacija tarp perkeliamos
DNR ir ląstelės šeimininkės genomo vyko tik 1/2500 dažniu iš visų transformacijos
atvejų. Tuo tarpu tiriant kitų augalų rūšių transformacijos ypatumus homologinės
rekombinacijos atvejų apskritai nenustatyta. Tačiau pora žemesniųjų augalų rūšių iš
žaliųjų dumblių bei samanų buvo sėkmingai transformuotos homologinės
rekombinacijos būdu, t.y. perkeliama genetinė medžiaga įsiterpė būtent į atitinkamą
chromosomos vietą, pakeisdama homologinę ląstelės-šeimininkės DNR. Kadangi
minėtų augalų genomas haploidinis, galima spėti, jog haploidinėje būsenoje augalų
genomas yra labiau linkęs į homologinę rekombinaciją nei diploidinėje. Tačiau šį
spėjimą sunku patikrinti, nes apskritai trūksta pranešimų apie sėkmingą aukštesniųjų
augalų haploidinių audinių transformaciją. Tad kol kas metodikos tikslingam genų
įterpimui į atitinkamas vietas augalų chromosomose sukūrimas lieka vienu iš
svarbiausių augalų biotechnologijos uždavinių.

8. Genetiškai modifikuotų medžių biocheminis ir
citogenetinis įvertinimas
Pirmieji augalų transformacijos bandymai buvo atliekami su genais-žymenimis, o
toliau genetinės augalų modifikacijos pradėtos sieti su ūkiniu požiūriu svarbiais
genais. Tačiau ir vykdant augalų transformaciją su komerciškai naudingais genais
svarbiu etapu išlieka transformacijos sėkmės įvertinimas. Dirbant su miško medžiais
ypač svarbu atitinkamų žymenų pagalba įvertinti, ar transformacija buvo sėkminga, ar
ne, kadangi medžiai bręsta ne vienerius metus ir įvestojo geno pasireiškimas fenotipe
kartais gali būti pastebėtas tik po labai ilgo laiko. Tuo tarpu genetinių žymenų
panaudojimas leidžia netrukus po transformacijos nustatyti būtent iš transformuotų
ląstelių regeneravusius augalus. Augalų ląstelėms tirti naudojami tiek bakterinės, tiek
augalinės kilmės genetiniai žymenys, kurie gali būti suskirstyti į dvi grupes. Tai
atrankos žymenys bei patikros žymenys. Atrankos žymenimis vadinami tokie
žymenys, kurie leidžia atrinkti transformuotas ląsteles ar audinių eksplantus pagal jų
sugebėjimą augti ant terpės su antibiotiku ar herbicidu. Dažniausiai naudojami
29
atrankos žymenys yra kanamicinas ir higromicinas. Be to, kad padeda atrinkti
augalus-transformantus, tokie žymenys leidžia sekti svetimos kilmės geno
paveldėjimą atskiroje augalų populiacijoje.
Patikros žymenys yra genai, koduojantys produktus, kurių fermentinis aktyvumas gali
būti lengvai įvertintas. Tai leidžia ne tik nustatyti augalus-transformantus, bet taip pat
ir įvertinti svetimo geno ekspresijos lygį transgeniniame audinyje. Tokie žymenys
kaip β-gliukuronidazė (GUS), liuciferazė ar β-galaktozidazė leidžia histocheminių
dažų ar fluorimetrinio tyrimo pagalba patikrinti fermento aktyvumą individualiose
ląstelėse ir gali būti naudojami tirti audiniui ar ląstelei specifinę, o taip pat vystymosi
eigoje reguliuojamą perkeltojo geno raišką. Genai-žymenys turi būti surišti su
promotoriais, gautais iš augalų patogenų, pavyzdžiui, Agrobacterium T-DNR ar
augalų virusų. Tada galima tikėtis, jog tokie promotoriai gerai funkcionuos visose
augalo ląstelėse, nors vis labiau aiškėja, kad tokių promotorių valdoma ekspresija gali
būti tam tikru moduliuojama pagal augale veikiančius vystymosi veiksnius.
Parenkant atrankos geną-žymenį svarbu atsižvelgti į du dalykus. Tai, pirmiausia, geno
struktūra (nukleorūgščių seka), kuri apsprendžia trnskripcijos reguliavimo pobūdį
(gali būti pastovi, priklausoma nuo aplinkos arba kintanti vystyosi eigoje geno raiška),
transkripcijos lygį, transkripto stabilumą bei transliacijos efektyvumą. Antras dalykas
– pats geno produktas, kuris turi būti atsakingas už dominuojantį tinkamo atrankinio
fenotipo pasireiškimą. Daugumos įprastų transformacijos vektorių atrankinės
funkcijos pasireiškia tuo, jog jie koduoja atsparumą antibiotikams lemiančius
fermentus. Taip pat naudojami genai-žymenys, kurie koduoja fermentus,
apsaugančius augalo ląstelę nuo specifinių herbicidų. Ruošiant geną-žymenį, fermentą
koduojanti geno dalis viename sekos gale suliejama su promotoriumi, išskirtu iš
Agrobacterium T-DNR arba augalų viruso CaMV genomo, tuo tarpu kitame gale
prijungiamas poliadenilinimo signalas, kuris taip pat dažniausiai būna išskirtas iš
vieno T-DNR genų. Taigi, kaip atrankos žymenys gali tarnauti genai, suteikiantys
atsparumą antibiotikams arba herbicidams. Ypač efektyvi transformantų atranka
vyksta naudojant geną, kuris lemia augalinių ląstelių atsparumą herbicidui
kanamicinui. Šis atrankos būdas dažnai taikomas atliekant augalų transformaciją
Agrobacterium pagalba. Atsparumą kanamicinui suteikiantis genas įeina į T-DNR
sudėtį drauge su tiksliniu genu ir po to, kai T-DNR iš Agrobacterium pernešama į
augalo ląstelę, čia vykstanti atsparumo geno ekspresija parodo, jog augalinė ląstelė
30
sėkmingai transformavosi, t.y. T-DNR įsiterpė į augalo genomą transkribuojamoje
chromosomos dalyje. Tuo būdu augalo audiniai po transformacijos procedūros yra
kultivuojami ant atrankinės terpės, į kurios sudėtį įeina kanamicinas. Toliau vystytis ir
regeneruoti naujus augalus geba tik transformuotos ląstelės, kadangi kitos ląstelės dėl
herbicido poveikio lieka negyvybingos. Taigi, yra didelė tikimybė, jog visi ant tokios
atrankinės terpės regeneravę augalai bus genetiškai modifikuoti.
Patikros genai-žymenys suteikia galimybę patikrinti audinių transformaciją
nepriklausomai nuo atrankinėje terpėje esančių antibiotikų ar herbicidų. Dažniausiai
naudojami patikros žymenys yra chloramfenikolio acetil transferazė, β-gliukuronidazė
(GUS), β-galaktozidazė ir liuciferazė. Tai yra bakterijų fermentai, augaluose
aptinkami tik tada, jei augalas transformuojamas šiuos fermentus koduojančiais
genais. Ypač dažnai naudojamas patikros žymuo yra β-gliukuronidazę koduojantis
genas iš bakterijos E. coli. β-gliukuronidazė (GUS) yra fermentas hidrolazė,
katalizuojantis β-gliukuronidų skilimą. Dauguma β-gliukuronidų yra naudojami kaip
substratai spektrofotometrinėje, fluorometrinėje ir histocheminėje analizėje. GUS yra
ypač parankus augalų transformacijos tyrimuose, kadangi augaluose šio fermento
natūraliai neaptinkama. Tai reiškia, jog histocheminės analizės metu išryškėja būtent
specialiai tyrimui į augalą įvesto GUS geno produkto veiklos aktyvumas. Fermentas
atsparus fiksacijai, jo aktyvumas nustatomas lengvai, jautriai ir pigiai, histochemiškai
jį galima lokalizuoti labai tiksliai. Kaip GUS substratas histocheminėje analizėje
dažniausiai naudojamas 5-bromo-4 chloro-3-indolil- β-D-gliukuronidas (X-gluc).
Fermentinės reakcijos, kurią katalizuoja GUS, metu nuo X-gluc atskyla indoksilo
grupė, kuri dimerizuojasi į vandeninėje aplinkoje netirpų indigą (mėlyna spalva).
Taigi histocheminės GUS analizės metu tiriamasis augalo audinys mirkomas substrato
tirpale ir stebimas mėlynos spalvos pasirodymas. Tiksli GUS aktyvumo audinyje
lokalizacija atliekama stereomikroskopo pagalba.
GUS analizė plačiai pritaikoma augalų genų raiškos tyrimuose. Ši analizė naudojama
ne vien tada, kai transformuojant augalą stengiamasi įvesti kokį nors tikslinį, t.y.
augalo savybes pagerinantį geną, o GUS genas reikalingas tiesiog patikrinti, kiek
sėkminga buvo transformacija, bet taip pat ir kitokio pobūdžio tyrimuose. Naudojant
GUS geną gali būti tiriami kitų genų raiškos ypatumai augalo audiniuose. Tokiu
atveju paprastai konstruojamas genas, sudarytas iš tiriamojo geno promotoriaus ir
fermentą gliukuronidazę koduojančios sekos. Tada augalas transformuojamas šiuo
31
dirbtiniu genu. Histocheminė analizė leidžia sekti po transformacijos regeneravusių
augalų audiniuose GUS geno aktyvumą, kuris yra priklausomas nuo kito (tiriamojo)
geno promotoriaus, dirbtinai prijungto prie gliukuronidazę koduojančios sekos. Tokiu
būdu gali būti nustatomi tiriamojo geno ekspresijos ypatumai įvairiuose audiniuose,
taip pat įvairiomis augalo vystymosi stadijomis, kadangi taikant tokį analizės metodą,
galima stebėti, kaip GUS genas yra transkribuojamas nuo tiriamojo geno
promotoriaus, taigi tiriama šio promotoriaus veikla ir tuo pačiu gaunami duomenys
apie tiriamojo geno transkripciją. Analogiška metodika gali būti taikoma ir siekiant
atrasti promotorius ar kitas reguliuojančias sekas, kurios būtų naudojamos
konstruojant vektorių tiksliniam genui įvesti. GUS geno panaudojimas suliejant šio
geno koduojančią seką su tiriamais promotoriais leidžia ištirti transkripcijos nuo šių
promotorių ypatumus. Tokių tyrimų eigoje sukaupti duomenys leidžia atitinkamai
parinkti promotorius įvedamiems tiksliniams genams atsižvelgiant į tai, kokių geno
raiškos ypatumų augale pageidaujama, pavyzdžiui, aktyvios transkripcijos, ilgalaikės
transkripcijos, transkripcijos tam tikrame audinyje arba nuo tam tikrų aplinkos
veiksnių priklausomos transkripcijos.
Augalų transformacijoje taikomi molekuliniai tyrimo metodai skirti tiesioginei
transformuotų audinių genetinės medžiagos analizei. Transgeninių augalų analizei
taikomuose molekulinių tyrimų metoduose dažnai naudojama polimerazės grandininė
reakcija. Paprasčiausiu atveju, kai siekiama tiesiog nustatyti svetimos DNR buvimą
augalinėse ląstelėse, atliekama iš transformuoto audinio regeneravusių augalų DNR
analizė. Iš regeneravusio augalo audinių išskiriama DNR, kuri bus naudojama
polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR). Šios reakcijos tikslas yra tam tikro DNR
fragmento amplifikacija. Tipiška PGR susideda iš 3 temperatūra kontroliuojamų
pakopų, kurios kartojamos 30 – 40 kartų. Reakcijos mišinys susideda iš buferio,
temperatūrai atsparios DNR polimerazės, keturių rūšių deoksinukleotidtrifosfatų,
dviejų oligonukleotidinių pradmenų, šabloninės (tiriamosios) DNR. Reakcijos
selektyvumą lemia pradmenų pasirinkimas. Pradmenys – tai vienagrandės DNR
gabaliukai (oligonukleotidai), turintys seką, komplementarią šabloninės DNR sekoms.
Pirmoje pakopoje denatūruojama dvigrandė šabloninė DNR keliant temperatūrą iki 94
0
C. Antroje pakopoje žeminant temperatūrą prisijungia pradmenys prie šabloninės
DNR. Pradmenys prisijungia tose vietose, kuriose šabloninė DNR yra jiems visiškai
ar beveik visiškai komplementari. Trečiojoje pakopoje pasirenkama temperatūra,
optimali termostabiliai DNR polimerazei (dažniausiai 72
0
C). Tai – elongacijos
32
pakopa. Jos metu fermentas dėka savo 5’→3’ polimerazinio aktyvumo nuo pradmens
3’ galo susintetina ant šabloninės DNR antrą grandinę. Kai tai nutinka abiejose
pradmenų prisijungimo vietose ant abiejų DNR grandinių, taikinio fragmentas yra
pilnai replikuotas. Sekančiame cikle visos susintetintos dvigrandės DNR, tiek
pirminės, tiek naujai susintetintos, vėl denatūruojamos. Pakartojus šį tripakopį ciklą
30 – 40 kartų, pagausinamas DNR fragmentas, apribotas pradmenimis. Ilgesni
produktai taip pat gaminami, bet jų kiekiai galutiniame produkte yra nereikšmingi.
Taigi, turi būti pasirinkti atitinkami oligonukleotidiniai pradmenys, apribojantys geno,
kuriuo buvo siekiama transformuoti augalą, DNR seką. Po PGR reakcijos atliekama
jos produktų analizė. Ši analizė pagrįsta DNR fragmentų išfrakcionavimu pagal dydį
agarozės arba poliakrilamidiniame gelyje elektroforezės eigoje. Jei po elektroforezės
padarytoje gelio nuotraukoje matome, jog PGR reakcijos metu buvo amplifikuotas
DNR fragmentas, dydžiu atitinkantis ieškomą geną, tai reiškia, jog transformacija
buvo sėkminga bent tuo atžvilgiu, jog svetimas genas integravosi į augalo ląstelės
genomą. Tačiau tai galima pasakyti tik tuomet, kai tiriama jau iš transformuoto
audinio regeneravusio augalo DNR. Tuo tarpu jei PGR reakcijos pagalba norima
ištirti augalo audinį iškart po transformacijos, tai tada ši reakcija gali patvirtinti tik
svetimos DNR buvimą augalo ląstelėse, bet ne jos integraciją į augalo genomą,
kadangi dar nežinoma, ar perkeltas genas bus stabiliai replikuojamas. Iš kitos pusės,
netgi stabili svetimo
geno replikacija kartu
su ląstelės genomu dar
nerodo, jog
transformacija tikrai
pavyko, kadangi
pernešamas genas turi
ne tik integruotis į
ląstelės genomą, bet ir
būti ekspresuojamas.


10 pav. Polimerazės
grandininė reakcija.
33
Tad transformacijos sėkmę labiau gali patvirtinti svetimo geno transkriptų, t.y.
informacinės RNR (iRNR), nustatymas transformuoto augalo audiniuose. Ieškant
perkelto geno transkriptų galima ištirti jo ekspresiją skirtinguose augalo audiniuose
arba tiesiog pasirinkti tyrimui tą audinį, kuriame tikimasi intensyviausios šio geno
raiškos. Taigi iš pasirinktojo audinio pirmiausia išskiriama visų rūšių RNR, o paskui,
naudojant politimino daleles, galima išgaudyti būtent informacinę RNR, kadangi ši
turi poliadenino uodegėles (iRNR atskyrimas pagrįstas adenino-timino sąveika). Tada
fermento atvirkštinės transkriptazės pagalba pagal iRNR matricas sintetinamos
dvigubos grandinės kopijinės DNR (cDNR). Šių cDNR rinkinys ir tarnauja kaip
šabloninė DNR PGR reakcijoje. Tokiu būdu, naudojant atitinkamus pradmenis,
galima iš kitų cDNR išskirti (amplifikuoti) tą, kuri atitinka į augalą perkeltą svetimą
geną, šitaip įsitikinant, jog šio geno raiška vyksta transformuotame augale.
Molekuliniam transformuotų augalų tyrimui taip pat dažnai pritaikomas vadinamasis
Southern analizės metodas. Jis gali patvirtinti stabilią svetimos DNR integraciją į
augalo genomą, be to, parodyti kiek yra genome įsiterpusių svetimos DNR kopijų,
kaip tos kopijos išsidėstę genome, taip pat galima nustatyti perkeltosios DNR
stabilumą pirmos kartos palikuonyse. Atliekant Southern analizę augalo DNR
restrikcijos fermentais yra sukarpoma į atskirus fragmentus. Šie fragmentai
elektroforezės eigoje išskirstomi agarozės gelyje (gelyje DNR taip pat denatūruojama
ir neutralizuojama). Tada frakcionuota DNR perkeliama ant tam tikros membranos.
Perkėlimas atliekamas kapiliarų pagalba taip, kad santykinės DNR fragmentų
pozicijos išliktų nepakitę. Membrana su imobilizuota DNR inkubuojama su
vienagrande radioaktyviai žymėta DNR, kuri pagal savo seką turi hibridizuotis su į
augalą transformacijos metu perkeltos DNR seka. Tada membrana nuplaunama ir
hibridizavęsi homologinės DNR fragmentai nustatomi naudojant autoradiografiją.

9. Molekuliniai žymenys medžių genetinės įvairovės ir
tapatumo įvertinimui
Miško medžių genetikai dažnai susiduria su praktiškais klausimais apie medžių,
miško želdinių ar miško reprodukcinės medžiagos kilmę, genetinį kintamumą ar
prisitaikymą. Šie klausimai gali iškilti biologams, ekologams, miškų savininkams,
miškininkams, aplinkos apsaugos organizacijoms, o taip pat ir patiems miško medžių
genetikams pasirenkant tyrimus. Daugumą šių klausimų galima išspręsti molekulinių
34
žymenų pagalba, kurie gali būti pritaikyti įvairių organizmų genetiniam apibūdinimui.
Naudojant molekulinius žymenis labai ženkliai išaugo galimybės įvertinti biologinę
įvairovę, atkurti tikslų filogenetinį giminingumą ir suprasti miško medžių struktūrą,
evoliuciją ir sąveiką.
Genetinė įvairovė yra vienas iš svarbiausių miškų stabilumą laiduojančių veiksnių,
ypač pastaruoju metu pastebimų ryškių klimato ir aplinkos pokyčių sąlygomis.
Paskutiniais metais Europoje ypač išsiplėtė lapuočių medžių rūšių genetiniai tyrimai,
naudojant tiek įprastus metodus, paremtus kilmių, populiacijų palikuonių, šeimų ir
klonų testavimu atskiruose eksperimentiniuose želdiniuose ar želdinių tinkluose, tiek
ir naujus molekulinių žymenų metodus. Genetiniai žymenys gali būti skirstomi į tris
pagrindines klases: morfologiniai, biocheminiai ir DNR. Pagrindiniai tipai
molekulinių žymenų, naudojamų augalų genetikoje ir selekcijoje, yra tokie:
atsitiktinai pagausintos DNR polimorfizmas (angl. random amplified polymorphic
DNA, RAPD), pagausintų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. amplified fragment
length polymorphism, AFLP), mikrosatelitai (angl. simple sequence repeats, SSR),
tarpmikrosatelitinių sekų polimorfizmas (angl. inter-simple sequence repeats, ISSR),
restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. restriction fragment length
polymorphism, RFLP) (2 lentelė).
2 lentelė. Dažniausiai naudojamų molekulinių žymenų tipai
Žymens tipas Paremti
PGR
Polimorfizmo lygis Vyravimas
RFLP Ne Vidutiniškai žemas Kodominavimas
RAPD Taip Vidutiniškai aukštas Dominavimas
SSR Taip Aukštas Kodominavimas
ISSR Taip Aukštas Dominavimas
AFLP taip Aukštas Dominavimas

Pirmieji molekuliniai žymenys, RFLP, buvo paremti DNR-DNR hibridizacija. RFLP
apibūdinama kaip įvairaus ilgio DNR fragmentai gauti naudojant specifinę restrikcijos
endonukleazę dviem ar daugiau individų genominės DNR. Galima gauti didelį skaičių
įvairaus ilgio RFLP fragmentų sukarpius DNR su specifiniais restrikcijos fermentais.
Gautų fragmentų analizavimas yra ilgas ir brangus procesas. Hibridizacijos rezultatai
35
gali būti vizualizuojami autoradiografiškai (jeigu pradmenys su radioaktyvia žyme)
arba chemiliuminescencija.
Polimerazinės grandininės reakcijos (PGR), kurios pagalba pagausinami trumpi DNR
segmentai, pritaikymas genetiniuose tyrimuose suteikė galimybę atsirasti naujiems
molekuliniams žymenims, paremtiems PGR (3 lentelė).
3 lentelė. Pagrindinės būtinos sąlygos molekuliniams žymenims
Molekulinis
žymuo
Reikalingas
DNR
kiekis
DNR sekos
reikalingumas
Radioaktyvinė
detekcija
Reikalingas gelis
RFLP Didelis Ne Taip/Ne Agarozės
RAPD Mažas Ne Ne Agarozės
SSR Vidutiniškai
mažas
Taip Ne Akrilamidinis
ISSR Vidutiniškai
mažas
Taip/Ne Ne Akrilamidinis/Agarozės
AFLP Vidutiniškai
didelis
Ne Taip/Ne Akrilamidinis

RAPD - tai techniškai pats paprasčiausias metodas iš visų PGR su atsitiktiniais
pradmenimis. Reakcijos selektyvumą lemia pradmenų pasirinkimas. Pradmenys – tai
vienagrandės DNR gabaliukai (oligonukleotidai), turintys seką, komplementarią
šabloninės DNR sekoms. Specifiškiausia amplifikacija vyksta tuomet, kai tarp
pradmenų prisijungimo vietų yra ne didesnis atstumas kaip 4 kb. Nors produktų
galima tikėtis iki 10 kb, esant optimalioms reakcijos sąlygoms. Naudojant šį metodą
galima nustatyti genetinę įvairovę ar įvertinti giminingumą, net neturint jokios
informacijos apie tiriamų objektų genominės DNR nukleotidų sekas. Tiriamų individų
genetinis panašumas nustatomas vertinant jų genominės DNR pagausinimo spektrus.
Mikrosatelitai priklauso kartotinių DNR sekų grupei. Šie mikrosatelitiniai motyvai
augaluose aptinkami dažnai, maždaug kas 6-7 kb. Šis metodas taip pat pagrįstas
polimerazės grandininė reakcija. Kiekvieno lokuso tyrimui reikalingi du specifiniai
pradmenys: tiesioginis (forward) ir atvirkštinis (reverse). PGR pradmenys yra
sukuriami pagal konservatyvias DNR sekas, supančias mikrosatelitinį lokusą.
Polimorfizmą lemia kartotinio motyvo kopijų skaičiaus kitimai dėl mutacijų. Kai kada
36
įvyksta mutacija pradmenų prisijungimo vietoje. Tada DNR pagausinimas nevyksta ir
gautas alelis vadinamas nuliniu. PGR produktų frakcionavimui naudojamas
poliakrilamidinis gelis. Pavyzdžiams išryškinti naudojamas sidabro arba Sybr-Gold
tirpalai. Mikrosatelitai yra labai informatyvūs dėl aukšto jų polimorfizmo ir
kodominavimo.
ISSR metodas taip pat paremtas PGR, naudojami paprastų pasikartojančių sekų
pradmenys (pvz. (AC)
n
) , kurie pagausina regionus, atsidūrusius tarp ISSR pradmenų.
Ši technika išnaudoja gausius ir atsitiktinius SSR motyvus, esančius miško medžių
genomuose ir pagausina DNR sekas, atsidūrusias tarp glaudžiai susijusius SSR
motyvus.
AFLP metodas panašus į RFLP metodą, tik jis paremtas PGR technologija. Visa
genominė DNR sukarpoma su restrikcijos fermentų pora. Žinomos sekos adapteriai
priklijuojami prie DNR fragmentų. Pradmenys komplementarūs adapteriams
naudojami pagausinti restrikcijos fragmentus. PGR reakcijos pagausinti fragmentai
frakcionuojami agarozės gelyje ir išryškinamos susirišimo juostelės.
37
10. Praktiniai darbai
Įžanga
Augalų transformacija yra procesas kurio metu DNR įvedama į augalo ląsteles ar
audinius. DNR iš esmės gali būti iš įvairių šaltinių tiek prokariotinių organizmų tiek
eukariotinių organizmų. Genų perkėlimo metodologija tapo svarbia dalimi
technologijų, naudojamų įvairioms manipuliacijoms atlikti su augalais tiek
moksliniais tiek komerciniais tikslais. Agrobacterium tumfaciens panaudojimas genų
perkėlimui į augalus yra vienas efektyviausių metodų. Visumoje transgeninių augalų
kūrimas susideda iš dviejų skirtingų technologijų, būtent naujos genetinės medžiagos
įvedimo į augalo ląsteles ( transformacijos) ir audinių kultūrų metodų , taikomų
augalų regeneracijai iš ląstelių ar audinių.
Užsiėmimų tikslas – magistrantams suteikti žinias ir suformuoti pirminius įgūdžius,
atliekant manipuliacijas steriliomis sąlygomis su sumedėjusių augalų audinių
kultūromis prieš transformaciją ir po transformacijos Agrobacterium tumefaciens
metodu.

Hibridinės drebulės transformacijos Agrobacterium tumefaciens metodu eigos
aprašymas

Reikalingos medžiagos ir priemonės
Plastikiniai autoklavuojami konteineriai 200 ml augalų audinių kultūrai;
Laminaras;
Įvairaus dydžio pincetai;
Sterilios veinkartinės Petri lėkštelės;
Sterilus filtrinis popierius;
Spiritinė lemputė arba dujinis degiklis;
Mikrobiologinė kilpelė;
Kratytuvas - termostatas;
Audinių ir augalų auginimo kameros;
Mikropipetės ir antgaliai: P20, P200, P1000, ir P5000;
1.5 – ml centrifūgavimui megintuvėliai;
15 – 50 mL užsukami cetrifūgavimo mėgintuvėliai;
15 proc. „ACE“ ar „Belyzna“;
70 proc. etanolis;
Parafilmas;
38
Vandens vonelė +55C arbaUltragarsinė vonelė;
10 ml sterilūs švirkštai;
Filtrai sterilinimui tirpalų;
Autoklavas;
Spektofotometras;
Buteliai: 2 po 0,5L; 2 po 100ml;
Kolbutės 4 po 150-250ml ;
Mėgintuvėliai 50ml;
Stereoskopinis mikroskopas.
Reagentai, tirpalai, terpės

1/2X MSO, pH 5.8: Murashige and Skoog ( MS) terpė agarizuota 0.8 proc.
fitoagaru.
Agrobacterium linijos: kuri nors viena iš keleto ( neformuojančių auglių)
laboratorinių linijų ( EHA 101, 105, C58, LBA4404), talpinančią binarinį
vektorių su tiksliniu genu.
YEP terpė, pH 7.2: 5.0 g/L Bacto-yest ekstraktas, 10.0 g/L Bacto – peptonas,
10.0 g/L NaCl, 15.0 g/L Bacto – agaras.
Sterilinta filtruojant MS20IM Agrobacterium indukcijos terpė, pH 5.25: MS
druskos ir vitaminai papildyti 2 proc. cukraus, 100 mikroM acetosyringono, 1
mikroM betaino fosfato, ar prolino ir 2.5 mikroM 2-( 4 – morfolino)
etanesulfoninės rūgšties ( MES).
Kokultivacijos terpė, pH 5.8: MS terpė papildyta 4.5 mikroM
benzylaminopurinu ( BA), 0.5 mikroM naftaleno rūgštimi ( NAR) ir
agarizuota fitoagaru 8.0 g/L.
MSBN 1.1 ūglių regeneracijos terpė, pH 5.8: identiška sudėtimi kokultivacijos
terpei tik įdedama selektyvinių faktorių, reikalingų atrankai transformuotos
medžiagos; antibiotikų (Rifampicinas, Spectinomicinas, Kanamicinas,
Tikarcilinas, PPT)
Augalinė medžiaga

Medžiaga medžių transformacijos technologinės eigos pademonstravimui bus paimta
iš LMI molekulinės genetikos biotechnologijos laboratorijos.
39
Hibridinės drebulės sterilūs augalai in vitro - klonai , išauginti audinių kultūroje
tiesioginės regeneracijos būdu eksplantais naudojant mikroūglių stiebo atkarpas (1,5
cm) su pažastinių pumpurų meristema.
Medžiagos transformacijai paruošimas: a) imami lapai, vidutinio didumo iš vidurinės
augalo dalies. Lapai turi būti žali, sveiki, nepaveikti nekrozės; b) imami stiebai,
supjaustomi 1,5 cm atkarpas. Eksplantai iš karto nardinami į paruoštą trasformacijai
mikroorganizmų( Agrobacterium) suspensiją.
Visos procedūros atliekamos steriliomis sąlygomis laminare.

Agrobacterium išauginimas ir paruošimas užkrėtimui
Agrobacterium su tiksliniu genu gauta iš LSDI pagal programą ABIOTECHA tyrimų
vyldymui.
Bakterijos auginamos ant kietos LB mitybinės terpės su selektyviniais antibiotikais
28
o
C

temperatūroje. Paruošiama agarizuota LB mitybinė terpė: sudedamos terpės
sudedamosios dalys ir nustatomas pH, jis turi būti 7,0±0,2. Terpės pH matuojamas
pH-juostelėmis, reguliuojama 0,1N NaOH ar 0,1N HCl tirpalais. Kietos terpės
paruošimui dedamas mikrobiologinis agaras. Paruošta terpė išpilstoma į litrinius
butelius ir sterilinama autoklave 30 minučių 115º C temperatūroje, 1 atmosferos
slėgyje.
Sterili terpė atvėsinama iki kambario temperatūros. Steriliomis sąlygomis
pridedami reikalingi antibiotikai ir išpilstoma į Petri lėkšteles.
Užsėjama bakterijų kultūra ir 2 - 3 dienas auginama termostate prie 28
o
C

temperatūros. Užaugus kolonijoms Petri lėkštelės su bakterijomis patalpinamos prie
4
o
C temperatūros ir laikomos 3-4 savaites( 11 pav.).


11 pav. A.tumefaciens kultivavimas ant agarizuotos terpės.
40

Agrobacterium paruošimas eksplantų užkrėtimui : paruošiama skysta LB mitybinė
terpė su atitinkamais selektyviniais antibiotikais. Išpilstoma į 10ml tūrio
mėgintuvėlius. Nuo kietos bakterijų terpės pernešiamos 3 kolonijos agrobakterijų ir
kelias dienas laikoma prie prie 28
o
C

temperatūros, 160aps/s kratytuve. Patikrinamas
bakterijų kultūros gyvumas .

Bakterijų kultūrų optimalaus tankio (angl. optimal density (OD)) nustatymas:
Paruošiamos trys kiuvetės: kontrolė (neagarizuota LB mitybinė terpė su
selektyviniais antibiotikais), naktinė kultūra, praskiesta 1:10.
Atliekamas skiedimas: pirmiausia į kiuvetę pilama 900 µl neagarizuota LB
mitybinė terpė su selektyviniais antibiotikais(kontrolė) ir 100 µl naktinės
bakterijos suspencijos. Atsargiai sumaišoma.
Matavimai atliekami spektrofotometru, prie 660 nm bangos ilgio. 1 OD=9·10
9

bakterijų. Transformacijai atlikti naudojama suspensija 2·10
8
bakterijų/1ml
terpės.

Praktinių užsiėmimų paskutinę dieną magistrantai įvertins tik pirminius
transformacijos rezultatus : bakterijos ir eksplantų sąveikos pradžią stebint
stereoskopiniu mikroskopu. Taip pat bus supažindinti su įranga, naudojama
molekuliniam įvertinimui augalų, regeneravusių audinių kultūroje po transformacijos
ant selektyvinės terpės.






41
Literatūra
1. Auckland L., Bui T., Zhou Y., Shepherd M., Wiliams C. 2002. Conifer
Microsatellite handbook.
2. Choi J.H., Sung Z.R. 1989. Induction, commitment, and progression of plant
embryogenesis. In: Plant Biotechnology. Butterworths, Boston-London-
Singapore-Sydney-Toronto-Wellington. 141 – 159.
3. Christianson M.L., Warnick D.A. 1988. Organogenesis in vitro as a
developmental process. Horticultural Science. 23: 515 – 519.
4. Darginavičienė J. 1981. Augalų hormonai. Mokslas ir gyvenimas. 7 (286):
30 – 31.
5. Darginavičienė J., Novickienė L. 2002. Augimo problemos šiuolaikinėje
augalų fiziologijoje. Lietuvos mokslų akademijos leidykla, Vilnius.
6. Gallois A., Audran J. C., Burrus M. 1998. Assessment of genetic
relationships and population discrimination among Fagus sylvatica L. by
RAPD. Theor. Appl. Genet., 97: 211 – 219.
7. Guivarcih A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan T., Chriqui D., Tepfer M.
1996. in situ detection of expression of the gus reporter gene in transgenic
plants: ten years for blue genes. Trans. Res. 5: 281 – 288.
8. Halperin W. 1986. Attainment and retention of morphogenic capacity in
vitro. In: Plant regeneration and genetic variability. Academic Press, New
York. 3 – 47.
9. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. 1993. New
Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Tans. Res. 2: 208 –
218.
10. Heuertz M., Hausman J.F., Hardy O.J., Vendramin G.G., Lacoste N.F.,
Vekeman X. 2004. Nuclear microsatellites reveal contrasting patterns of
genetics structure between western and southern European populations of the
common ash (Fraxinus excelsior L.). Evolution, 58 (5): 976 – 988.
11. Jain S.M., Minocha S.C. 2000. Molecular biology of woody plants. Kluwer
Academic Publishers, Dordrecht.
12. Jouanin L., Brasilerio A.C.M., Leple J.C., Pilate G., Cornu D. 1993.
Genetic transformation: a short review of methods and their applications,
results and perspectives for forest trees. Ann.Sci.For. 50: 325 – 336.
42
13. Kakimoto T. 2003. Perception and signal transduction of cytokinins. Annual
Revue of Plant Biology. 54: 605 – 627.
14. King Robert C., Stansfield William D. 1990. A dictionary of genetics.
Fourth editon. Oxford University Press, New York/Oxford.
15. Kleinschmit J., Svolba J., Enescu V., Franke A. 1996. First results of
provenance trials of Fraxinus excelsior established in 1982. Forstarchiv, 67:
114 – 122.
16. Klopfenstein Ned B., Young WooChan, Mee-Sook Kim and M. Raj Ahuja
1997. Micropropagation, Genetic Engineering, and Molecular Biology of
Populus. Rocky Mountain Forest and Range Experiment Station, Fort Colins,
Colorado.
17. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. 2003. Doubled
haploid production in crop plants. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht/Boston/London.
18. Mildažienė V., Jarmalaitė S., Daugelavičius R. 2004. Ląstelės biologija.
Vytauto Didžiojo universiteto leidykla, Kaunas.
19. McBride K.E., Summerfelt K.R. 1990. Improved binary vectors for
Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant. Mol. Biol. 14: 269 –
276.
20. Palme K., Hesse T., Moore I. 1991. Hormonal modulation of plant growth:
the role of auxin perception. Mechanical Development. 33: 97 – 106.
21. Raikhel N.V., Clarke A.E. 1998. Plant cell biology: all an inclusive field.
Current Opinion in Plant Biology. 1: 455 – 457.
22. Rohde A., Prinsen E., De Rycke R., Engler G., Van Montagu M., Boerjan
W. 2002. PtABI3 impinges on the growth and differentiation of embryonic
leaves during bud set in poplar. The Plant Cell. 14: 1885 – 1901.
23. Sánchez N., Manzanera J.A., Bueno M.A. 2004. Agrobacterium-mediated
transformation of white poplar (Populus alba L.).
24. Sankara Rao K., Rohini V.K. 2005. Plant transformation and genetic
markers. Foundation for Biotechnology Awareness and Education.
25. Sliesaravičius A., Stanys V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija.
Enciklopedija, Vilnius.
26. Schmulling T., Schell J., Spena A. 1988. Single genes from Agrobacterium
rhizogenes influence plant development. EMBO J. 7: 2621 – 2629.
43
27. Smintina I. 1993. Provenance trials of Fraxinus excelsior. Results 10 years
after planting. Revista Padurilor, 108 (1): 10 – 17.
28. Srivastava L.M. 2002. Plant growth and development: hormones and
enviroment. Academic Press, London.
29. Staub J.E., Serquen F.C. 1996. Genetic markers, map conctruction and their
application in plant breeding. Hort Science, 31 (5): 729-740.
30. Šamaj J., Bobak M., Ovečka M., Blehova A., Pret’ova A. 1997. Structural
features of plant morphogenesis in vitro. Publishing House of the Slovak
Academy of Sciences, Bratislava.
31. Tautz D., Rentz M. 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive
components of eucariotic genomes. Nature. 322: 652-656.
32. Thorpe T.A. 1993. In vitro organogenesis and somatic embryogenesis:
physiological and biochemical aspects. In: Morphogenesis in Plants.
Molecular Approaches. Plenum Press, New York-London. 19 – 38.
33. Tzfira T., Jensen C.S., Wang W., Zuker A., Vinocur B., Altman A.,
Vainstein A. 1997. Transgenic Populus tremula: a step-by-step protocol for
its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology
Reporter. 15: 219 – 235.
34. Weiser F. 1995. Studies into the existence of ecotypes of ash (Fraxinus
excelsior L.). Forstarchiv, 66(6): 251 – 257.
35. Williams E.G., Maheswaran G. 1986. Somatic embryogenesis. Factors
influencing coordinate behaviour of cells as an embryogenic group. Annual
Botany. 57. 443 – 462.
36. Williams G.K., Kubelik A.R., Livak J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990.
DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, 18: 6531 – 6535.




44