PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERAS

DENGAN HPLC SECARA SERENTAK
Nur Hidayati*
ABSTRAK
PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERAS
DENGAN I1PLC SECARA SERENTAK. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan metorle
analisis tiamin, riboflavin, dan piridoksin secara serentak agar Icbih sederhana, mudah, dan cepal
dengan HPLC. Kolom yang digunakan adalah p-Bondapak CI8, detektor ultra violet pada panjang
gelombang 254 nm, dengan eluen campuran metanoi/larutan bufer asetat pad a pH 3,6 (15 + 85)
dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Kondisi HPLC yang digunakan
adalah kecepatan aliran 1,5 ml/menit, kecepatan kertas 0,5 cm/menit, dan kepekaan 0,05, dapal
memberikan hasil pemisahan puncak-puncak piridoksin, tiamin, dan riboflavin dengan baik. Analisis
secara kuantitatif dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin memerlukan waktu tidak lebih dari 20 men it.
Hasil recovery dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin masing-masing adalah 92%,82%, dan 56%.
ABSTRACT
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIAMINE, RIBOFLAVIN ANI> I)YRII>OXINE IN RICE UY
IIIGHI)ERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. This study was
done to develope a simple, easy and rapid method of analysis for simultaneous determination of
thiamine, riboflavin and pyridoxine in rice using HPLC. The column used was p-Bondapak C18 and
detection was done using a ultra violet detedor at 254 nm. The mobile phase was a mixture of
methanol-acetate buffer (15 + 85) pH 3,6 with the addition of 0,005 M I-heptane sulphonic acid
sodium salt.
The most satisfadory separation of pyridoxine, thiamine and riboflavin peaks was obtained at flow
rate
1.5 ml/min, chart speed 0.5 cm/min, and sensitivity 0,05. Quantitative analysis of the three vitamins
could be done in less than 20 minutes. Recoveries of pyridoxine, thiamine, and riboflavin were 92%,
82 %, and 56%, respectively.
PENDAHULUAN
Vitamin 8 merupakan suatu molekul organik yang tidak termasuk dalam
golongan protein, karhohidrat atau lemak. Vitamin 8 terdapat dalam jumlah yang
kedl dalam hahan makanan, namun sangat penting peranannya hagi heberapa fungsi
tertentu dalam tubuh, yaitu untuk proses metabolisme dan pertumbuhan yang normal
(I). Vitamin tersebut tidak dapat dibuat oleh tubuh dalam jumlah yang cukup. Oleh
karena itu, harus diperoleh dari bahan pang an yang dikonsumsi misalnya beras.
Kamlungan vitamin 81 atau tiamin dalam beras giling sekitar 0,12 mg/1 00 g
sam pel dan dalam beras merah sekitar 0,21 mg/ 100 g sampel (2), atau antara 100
* Pusat Aplikasi IsotoI' Jan Radiasi, ~ATAN
IIIdan 1000 JLg/IOOg sampel, riboflavin antara 10 dan 100 JLg/lOO g sampel, dan
pirido~~in untrrrrr1000dnn 10.000 ~2f100 2 ~JmD~10).
Peneliti terdahulu telah mempelajari pengawetan beras dengan iradiasi
gamma (4). Dalam rangka pengawetan beras dengan iradiasi gamma perlu diketahui
pengaruh iradiasi terhadap vitamin .Byang dikandungnya di antaranya vitamin BI
atau tiamin, vitamin B2 atau ribotlavin dan vitamin B6 atau piridoksin. Untuk
menentukan kandungan tiamin, riboflavin, dan piridoksin dalam beras perlu dikembangkan metode
yang sederhana, mudah dan cepat, serta dapat ditentukan secara
serentak.
SOEYONO (5) telah mengembangkan metode pengukuran riboflavin
dengan cara spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 440 nm dan
panjang gelombang emisi 565 nm, SOEYONO dan PAMUNTJAK (6) telah
mengembangkan pula pengukuran tiamin dengan cara spektrofluorometri pada
panjang gelombang eksitasi 365 nm dan panjang gelombang emisi 435 nm. Pengukuran secara
spektrofluorometri tidak dapat dilakukan secara serentak bila dalam
larutan terdapat campuran tiamin, riboflavin dan piridoksin. Salah satu metode yang
dapat digunakan ialah dengan cara kromatograti cair atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
AUGUSTIN (7) telah mengembangkan metode pengukuran dengan cara
HPLC untuk tiamin dan ribotlavin. Detektor yang digunakan adalah tluoresensi
dengan panjang gelombang eksitasi 360 nm dan panjang gelombang emisi 415 nm,
sedangkan WEHLING dan DAVID (8) melakukan pengukuran tiamin, riboflavin
dan piridoksin secara HPLC dengan detektor fluoresensi dengan panjang gelombang
eksitasi 288 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm.
KAMMAN dkk. (9) telah mengembangkan metode pengukuran tiamin dan
riboflavin dengan metode yang sederhana, mudah, dan cepat, yaitu dengan HPLC,
dengan detektor ultra violet yang bekerja pada panjang gelombang 254 nm. FUKLUEN LAM dkk. (10)
telah dapat menentukan asam askorbat, niasinamide, tiamin,
riboflavin, dan piridoksin dengan HPLC, dan detektor ultra violet (uv). Untuk
analisis asam askorbat ditentukan pada panjang gelombang 254 nm, sedangkan untuk
analisis vitamin yang lainnya ditentukan pada panjang gelombang 280 nm. Penentuan vitamin B6
atau piridoksin telah pula dikembangkan oleh VANDERSLICE dkk.
(II) dengan cara HPLC dengan detek-tor tluoresensi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode pengukuran tiamin,
riboflavin dan piridoksin dalam beras dengan cara HPLC dengan menggunakan
detektor uv pada panjang gelombang 254 nm dan dengan kolomn jL-Bondapak C18.
BAlIAN DAN METODE
Bahan. Vitamin yang digunakan sebagai standar adalah tiaminhidroklorida
(BDH), ribotlavin dan piridoksin (E. MERCK). Bahan kimia lain yang digunakan
112ialah trietilamin (Ajax Chemical), garam natrium I-heptan asam sulfonat (BOH),
metanol untuk HPLC, asam asetat, natrium asetat, dan asam trikloroasetat (E.
MERCK). Sampel beras yang digunakan ialah beras giling cianjur rojolele dan beras
merah .
Peralatan. Pada penelitian ini digunakan alat HPLC buatan Waters Associates model 441 Absorbance
detektor. Kolom yang digunakan adalah wBondapak
C18 (4mm x 30 em).
Eluen. Pada penelitian ini digunakan eluen dengan berbagai perbandingan
eampuran antara metanol dan larutan bufer asetat pH 3,6 yaitu 20%, 15%, dan 10%
dengan dan tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat.
Pembuatan Larutan Rufer Asetat. Ke dalam labu takar 1 titer yang telah
berisi aquabidest dimasukkan berturut-turut sebanyak 24 ml asam asetat p.a. dan 5,0
ml trietilamin, lalu ditepatkan menjadi 1 liter dengan aquabidest. Penepatan pH 3,6
diatur dengan menambahkan asam asetat atau trietilamin.
Penyiapan Standar dan Kurva Kalibrasi Vitamin. Standar tiamin, riboflavin, dan piridoksin dengan
konsentrasi yang paling tinggi masing-masing 10 ppm,
10 ppm, dan 25 ppm dan konsentrasi yang terendah ialah 1 ppm, 1 ppm dan, 2,5
ppm dilarutkan dalam HCI 0, I N. Oari data yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi
standar seperti tertera dalam Gambar 4. Sumbu X ialah konsentrasi standar vitamin
dalam ppm, dan sumbu Y ialah tinggi puneak dalam em.
Penentuan Recovery Standar Vitamin. Ke dalam larutan sampel beras
ditambahkan standar vitamin dengan konsentrasi tertentu, dan dibandingkan dengan
larutan sampel beras tanpa penambahan standar vitamin. Berdasarkan perbedaan
konsentrasi yang diperoleh dari hasil analisis HPLC standar vitamin tersebut, dapat
ditentukan harga recovery masing-masing standar vitamin.
Penyiapan Sampel. Beras giling eianjur rojolele dan beras merah masingmasing ditumbuk dengan
mortar porselen hingga halus. Kemudian ditimbang
masing-masing 10 gram, ditambah 10 ml HCI 0,1 N dan dibiarkan semalam pada
suhu 35°C. Bubur tepung beras tersebut ditambah natrium asetat 2,5 M sebanyak 5
ml, selanjutnya diinkubasi pada suhu 42°C, selama 2 jam. Kemudian ditambah 2 ml
TCA 50% dan diinkubasi pada 42°C selama 2 jam. Bubur tepung beras tersebut
disentrifus dan diambil filtratnya, lalu disaring dan diinjeksikan pada HPLC.
Analisis dengan HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah laju aliran
1,5 ml/menit, kecepatan kertas 5 cm/l0 menit dan kepekaan 0,05. Untuk analisis
secara kuantitatif dibuat kurva kalibrasi larutan standar dengan plot tinggi puncak
(em) terhadap konsentrasi (ppm).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pellgaruh Eluen TerhadapHasil Pemisahan. Pada penelitian ini digllnakan
herhagai perbandingan campllran eluen antara metanol/asetonitril dengan larlltan
113bufer asetat pH 3,6 tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat. Dari
hasil kromatogram yang diperoleh ternyata puncak-puncak tiamin, riboflavin dan
piridoksin tidak terpisah. Hal ini mungkin disebabkan ketiga vitamin tersebut
mempunyai sifat kimia seperti kestabilan, kepolaran, dan keasaman yang karakteristik. Untuk
mendapatkan pemisahan puncak tiamin, riboflavin, dan piridoksin yang
baik, perlu diperhatikan pemilihan eluen dengan pH yang sesuai. Banyak sekali
pelarut yang dapat digunakan sebagai fase mobil, dengan syarat utama yang harus
diperhatikan, yaitu komponen-komponen dalam sampel harus dapat larut dengan
baik dalam fase mobil tersebut. Pada waktu pemilihan pelarut yang akan dipakai
sebagai fase mobil perlu diperhatikan kepolarannya. Pada perbandingan eluen
eampuran metanol dan larutan bufer asetat (pH 3,6) 20% dengan penambahan 0,005
M garam natrium I-heptan asam sulfonat, terjadi pemisahan puncak-puncak tiamin,
riboflavin, dan piridoksin, namun kurang baik karena puneak-puncak ketiga vitamin
tersebut jaraknya berdekatan, atau waktu yang dilalui sejak sampel diinjeksikan
sampai tereatatnya respons maksimum (tR) ketiga vitamin tersebut berdekatan
(Gambar I). Pada perbandingan eluen 10%, terjadi pemisahan yang eukup baik,
namun tR ketiga vitamin tersebut eukup jauh, sehingga memerlukan waktu yang
lama dan kurang efisien (Gambar 2). Pada perbandingan eluen 15%, terjadi pemisahan yang cukup
baik dengan waktu retensi (tR) tiamin, riboflavin dan piridoksin
masing-masing 4,8; 9,6; dan 19,0 menit (Gambar 3).
Kurva Kalibrasi Standar Vitamin. Pada penelitian ini diperoleh persamaan
linier untuk piridoksin, tiamin, dan riboflavin berturut-turut sebagai berikut Y =
0,1294 X, Y = 0,5608 X, dan Y = 0,3700 X (Y ialah tinggi puneak standar
vitamin dalam em, dan X ialah konsentrasi standar vitamin dalam ppm). Kurva
kalibrasi piridoksin, tiamin, dan riboflavin dapat dilihat pada Gambar 4.
Kandungan Tiamin, Riboflavin, dan Piridoksin dalam Beras. Hasil kromatogram dari sampel beras
dapat dilihat pada Gambar 5 & 6. Kandungan ketiga
vitamin dalam sampel beras yang diperoleh pada pereobaan ini dapat dilihat pada
Tabel I. Nilai yang diperoleh masuk dalam kisaran nilai yang tertera dalam Handbook of Vitamins and
Hormones (3) dan hampir sama dengan hasil analisis yang
diperoleh oleh SOEYONO dkk (5,6). Hasil recovery yang diperoleh pada analisis
ini ialah tiamin dan piridoksin masuk dalam kisaran nilai 80 dan 100%, sedangkan
riboflavin hanya 56%. Kandungan riboflavin dalam sampel beras giling cianjur
rojolele tidak terdeteksi (Gambar 6). Kelebihan analisis dengan cara ini ialah ketiga
vitamin tersebut dapat diukur seeara serentak, sehingga lebih mudah dan eepat.
KESIMPULAN
Penentuan piridoksin, tiamin, dan riboflavin dalam beras dapat dilakukan
secara serentak dengan eara HPLC menggunakan kolom I1-Bondapak C18, detektor
ultra violet pada panjang gelombang 254 nm, dan eluen yang digunakan adalah
114campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) dengan menambahkan
0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Pada kondisi tersebut piridoksin,
tiamin, dan ribotlavin terpisah baik dengan waktu retensi (tR) berturut-turut 4,8
menit, 9,5 menit, dan 19,0 menit.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Ibu Surtipanti yang telah membantu penulisan ini, dan
kepada semua pihak yang telah membantu, sehingga percobaan
ini terlaksana dengan baik.
PUSTAKA
1. WINARNO, EG., Kimia Pangan dan Gizi, Gramedia, Jakarta (1984).
2. SOEDARMO, P., dan SEDlAOETOMO, A.D., Masalah Gizi dan Perbaikannya, Dian Rakyat, Jakarta
(1974).
3. ROMAN J. KUTSKY, Handbook of Vitamins and HORMONES, Van Nostrand.
Reinhold Company, New York, Cincinnati, Toronto, London, Melbourne
(1973).
4. ANONIM, "Penelitian Pengawetan Beras dengan Radiasi Sinar Gamma",
(Laporan Akhir Kerjasama BULOG-BATAN), P2PsD/39/1970.
5. SOEYONO, "Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap Riboflavin dalam
Beras", P2PsD/54/1971.
6. SOEYONO dan PAMUNTJAK, M., "Pengaruh Radiasi (Co-60) pada thiamin
Beras" P2PsD/33/1970.
7. AUGUSTIN, 1., Simultaneous determination of thiamine and ribotlavin in foods
by liquid chromatography, J. AOAC, 67 (1984) 1012.
8. WEHLING RANDY, L. and WETZEL DAVID, L., Simultaneous determination performance of
pyridoxine,riboflavin and thiamine in fortitied cereal products by high- liquid chromatography, J.
Agric. Food Chern., J1 (1984) 1326.
9. KAMMAN, J.E, LABUZA, T.P. and WARTHESEN, Thiamine and riboflavin
analysis by high performance liquid chromatography, J. Food Science, 45
(1980) 1497.
10. FUK-LUEN LAM, IRA J. HOLCOMB, and FUSARI A. SALVATORE,
Liquid chromatographic assay of ascorbic acid, niacinamide, pyridoxine,
thiamine, and ribotlavin in multivitamin-mineral preparation, J. AOAC, 67
(1984) 1007.
115II. VANDERSLICE, J.T., BROWNLEE R. STELLA, and CORTISSOZ E.
AOAC, MARIANN, 67 Liquid chromatographic determination of vitamin B6 in foods, J. (I 984) 9997.
Tabel 1. Kandungan vitamin B1, B2, dan B6 dalam sampel beras
giling cianjur rojolele dan beras merah
Kandungan vitamin, ug/100 9 sampel
Sampel
Beras giling
cianjur rojolele
Beras merah
Bl
221,83
406,65
B2
tt
164,09
B6
2284,79
7568,38
Basil rata-rata dari 3 ulangan percobaan.
tt = tidak terdeteksi.
1]6~
Uc::
=' 0.. cO
050
n 2 I'
I':1
0.0 c::
F=
Waktu retensi
Gambar 10 Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen
campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (20 + 80) dengan
penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat
(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin
117I ~
::::
/.
"
I
/:3
Ii
I
,
'I
I
I
i
,
00
..>C'"
~
=
=
c.
~
~
=
E=
,
f
: .
~4r
I
! I
i I
~ J ' _
Waktu retensi
~
--------
Gambar 2. HasH kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen
campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (10 + 90) dengan
penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat
(I) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribot1avin2
--------
A~-----------
Waktu retensi
Gambar 3. Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen
campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) dengan
penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat
(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavinN
o
7,0
,.......
u '---'E 6,0
..10::
a.
:'<:S
Uc:: :::s 4,0 5,0
.~
OJ) c:: E=, 3,0
2,0 1,0
0
5,0 10,0 15,0
Konsentrasi (ppm)
20,0 25,0
Gambar 4. Kurva kalibrasi standar tiamin, ribotlavin, piridoksin
(A) piridoksin, (D) tiamin, dan (A:) ribotlavinWaktu retensi
Gambar 5. HasH kromatogram sampel beras merah
(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin
121-- \,~'- j (J, \.'--- "------------ __0' __
Waktu retensi
122
Gamhar 6. Hasil kromatogram sampel beras giling Cianjur Rojolele
(I) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin