You are on page 1of 11

TRANSPORTE DE GLUCOSA EN LEVADURA.

Hiptesis:
Si el consumo de Glucosa disminuye al agregar alguna sustancia desacoplante,
entonces el mecanismo de transporte que utiliza la levadura Saccharomyces
cerevisiae es mediado.

Diseo experimental
Para este experimento utilizamos el mtodo del DNS para calcular la cantidad de
glucosa residual, es decir la que la levadura Saccharomyces cerevisiae no
consumi, que se tena en los tubos despus de que se llev a cabo cada
experimento en diferentes condiciones.
Los azcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo
hemiacetal que le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros
compuestos. La determinacin de estos azcares se realiz con el objetivo de
obtener la curva de calibracin aplicando la tcnica de Miller o DNS (3,5-
dinitrosaliclico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azcares
reductores dando resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud
de onda de 540 nm.

Objetivos:
Elaborar una curva de tipo de Glucosa utilizando el mtodo del DNS.
Identificar la temperatura adecuada a la cual se tendr el transporte de
glucosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Conocer qu funcin cumple el DNS al ser adicionado a la mezcla de
suspensin celular y glucosa.
Determinar qu mecanismo de transporte utiliza la levadura Saccharomyces
cerevisiae, de acuerdo a la cantidad de glucosa consumida al adicionar
NEM.
Para cuantificar la cantidad de Glucosa residual durante la experiencia fue
necesario realizar una Curva tipo de sta, la cual se realiz por el mtodo del
Registro de datos
Registro de datos
Para cuantificar la cantidad de Glucosa residual durante la experiencia fue
necesario realizar una Curva tipo de sta, la cual se realiz por el mtodo del DNS
a diferentes cantidades de Glucosa y leyendo absorbancia de cada una
obteniendo as los siguientes datos:

Tabla 1. Absorbancias a 540 nm a diferentes concentraciones de Glucosa
g de Glucosa A (540 nm)
0 0
100 0.166
200 0.405
300 0.636
400 0.891
500 1.125

y = 0.0023x - 0.0365
R = 0.9969
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 100 200 300 400 500 600
A

(
5
4
0

n
m
)

g de Glucosa
Figura 1. Curva tipo de Glucosa de 0-500 g por el mtodo del DNS
Para obtener los g de Glucosa obtenidos utilizamos la ecuacin de la curva tipo,
despejamos y tenemos lo siguiente:

y = 0.0023x - 0.0365
A = 0.0023[g Glucosa] - 0.0365
(1)
La cantidad de alcuota que debemos tomar para realizar el mtodo del DNS es
importante ya que es necesario que nuestras lecturas de absorbancia caigan
dentro de nuestro rango de lectura en nuestra curva tipo para poder cuantificar la
Glucosa residual, para ello tomamos en cuenta la concentracin de glucosa inicial
as como las diluciones que se fueron realizando en cada paso de la experiencia:



Concentracin de Glucosa inicial: 4 mg/ml
Volumen de Glucosa adicionado: 10 ml
Volumen total: 20 ml



Concentracin de la solucin: 2 mg/ml
Vol. Alcuota tomado: 2 ml
Vol. Total: 3 ml




Considerando que tomamos una alcuota de 0.2 ml nuestra cantidad de glucosa
en g sera de:

Es por ello que tomamos los 0.2 ml de alcuota ya que los 266.66 g de Glucosa
entran en el rango til de nuestra curva tipo.
Posteriormente se realizaron 5 tubos con suspensin celular y glucosa sometidos
a distintas condiciones de tiempo y temperatura y/o con algn inhibidor, para saber
qu tipo de transporte efecta el m.o., determinando la cantidad de glucosa
residual por el mtodo del DNS teniendo los siguientes datos de absorbancia:

Tabla 2. Absorbancias a 540 nm de los matraces 1-5, a diferentes tiempos.
A (540 nm)
No. De Matraz
Tiempo (min)
0 10 20 30
1 0.803 0.770 0.691 0.777
2 0.725 0.303 0.063 0.000
3 0.743 0.795 0.398 0.312
4 0.774 0.862 0.783 0.741
5 0.003 0.005 0.006 0.014


Utilizando la ecuacin 1 as como las absorbancias de la anterior tabla 2
determinamos la cantidad de Glucosa residual para cada uno de los matraces a
los tiempos correspondientes:


Debido a que la las clulas de nuestra levadura pueden tener Glucosa que
alterara nuestras lecturas, elaboramos una muestra (Matraz 5) que contenida
nicamente la suspensin celular, sin glucosa sometida a todo el mismo proceso
que los dems con el fin de ajustar los valores obtenidos en los dems matraces
teniendo as:











Para saber la concentracin residual de Glucosa en mg/ml tomamos en cuenta la
alcuota que tomamos y realizamos la conversin de g a mg:







Tomando en cuenta que a los 0 minutos en cada uno de los matraces la
concentracin de Glucosa es la Glucosa inicial, restando esta para cada matraz a
los 4 tiempos correspondientes (Glucosa residual) para conocer la concentracin
de Glucosa consumida





Tabla 3. Concentracin de Glucosa residual y consumida a diferentes
tiempos.
mg de Glucosa/ml
No. De Matraz Residual Consumida
Tiempo (min) 0 10 20 30 0 10 20 30
1 1.75 1.67 1.50 1.67 0.00 0.08 0.25 0.08
2 1.58 0.69 0.07 0.00 0.00 0.89 1.51 1.58
3 1.62 1.72 0.86 0.65 0.00 0.00 0.76 0.97
4 1.68 1.48 1.70 1.59 0.00 0.20 0.00 0.09

Para determinar el tipo de transporte que efecta la levadura Saccharomyces
cerevisiae es necesario construir una grfica para observar el comportamiento de
cada uno de los matraces as como el efecto que ejercen las condiciones a las que
se sometieron cada uno de ellos e inhibidores que se les adicion si fue el caso, lo
podemos lograr relacionando la concentracin de Glucosa consumida en funcin
del tiempo teniendo as la siguiente grfica:

Figura 2. Transporte de Glucosa por Saccharomyces cerevisiae en diferentes
condiciones y en presencia de inhibidor.






-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 5 10 15 20 25 30
[
G
l
u

c
o
n
s
u
m
i
d
a
]

(
m
g
/
m
l
)

t (min)
Matraz 1 Matraz 2 Matraz 3 Matraz 4

Discusin:
Discusin
En condiciones enolgicas (produccin de vino), los azcares fermentables por la
levaduras son la glucosa y la fructuosa que estn presentes en fuerte
concentraciones. La Saccharomyces cerevisiae posee un sistema multitnico de
transporte de glucosa como lo observado en las clulas superiores (mamferos)
[1].
La determinacin del azcar residual por la levadura se hizo mediante el mtodo
del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), el cual se basa en la reduccin del DNS (de
color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-
nitrosaliclico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura
de la absorbancia en la zona de 540-570 nm, por lo cual se obtuvo una curva tipo
(Grfica 1) con el fin de calcular la concentracin de glucosa residual en mg/mL.
Segn la ley de Lambert y Beer, la absorbencia es directamente proporcional a la
concentracin del material que absorbe la luz, es decir, a mayor cantidad de
azcar reductor mayor ser la coloracin, y es esta la que se detecta y cuantifica
por el espectrofotmetro para determinar la cantidad de glucosa, obtenindose un
coeficiente de correlacin (r) de0.9984 cumpliendo con la Ley de Lambert y Beer.
Con base a la grfica 2 se observa que el matraz (2) que estuvo a temperatura
ambiente, se tom como testigo positivo ya que tiene las condiciones ideales para
el transporte de glucosa se lleve sin ninguna interferencia. Lo que corresponde a
la cantidad de glucosa inicial que fue transportada completamente al interior del
microorganismo. Observndose una conducta lineal al principio y despus un poco
curva esto puede ser por una mala medicin en las alcuotas tomadas a los
diferentes tiempos del experimento.
El matraz (1) que se mantuvo a 4C, se le colocaron las sustancias necesarias
para que se llevara a cabo el transporte de glucosa, sin embargo, lo que varo fue
la temperatura a la que se mantuvo. Como se observa en la grfica 2 el consumo
de glucosa por la levadura fue mnimo en comparacin con el matraz que se
mantuvo a temperatura ambiente. Esto debido a que la de Saccharomyces
cerevisiae es un microorganismo mesflo, es decir, que su temperatura ptima de
crecimiento son temperaturas moderadas [2]. Su temperatura ptima de
crecimiento vara entre los 22 y 29 C [3]. Por lo tanto al estar en condiciones
anormales, las estructuras de los fosfolpidos y protenas acarreadoras de la
membrana de Saccharomyces cerevisiae se ven afectados. Al estar en bajas
temperatura estas tienden a contraerse y desfavorecer el transporte de glucosa,
afectada la membrana citoplasmtica produciendo que su fluidez y permeabilidad
tambin disminuyeran por lo que la levadura disminuye su capacidad de tomar
glucosa del medio. As en estas condiciones se ve afectado la difusin simple de
la glucosa.
El matraz (3) con 2,4 dinitrofenol (DNF) el cual es un desacoplante que tiene la
capacidad de que al estar protonado puede atravesar a la membrana lipdica ya
que adquiere una naturaleza liposoluble, como consecuencia se ver afectado el
transporte de H+ lo cual afecto la produccin de ATP y por consecuencia
interviniendo en la cadena respiratoria y fosforilacin oxidativa, es decir afectara a
los procesos de transporte que requieran energa mediada por ATP [4]. En la
grfica 2 se observa que su comportamiento es parecido al matraz testigo, pero su
consumo de glucosa es menor, sin embargo este agente no influye en el tipo de
transporte que realiza la levadura. El DNF al inhibir la produccin de ATP se
esperaba que si el transporte que llevaba a cabo Saccharomyces cerevisiae es
activo se viera afectado en presencia de DNF, y si fuera pasivo que no se viera
afectado. [5] Por lo tanto el tipo de transporte que realiza Saccharomyces
cerevisiae es pasivo.
En el matraz (4) se agreg el agente N- etilmaleimida (NEM) que nos ayudara a
diferenciar si nuestro transporte es mediado o no, ya que acta sobre las protenas
afectando el transporte mediado por protenas acarreadoras, unindose al grupo
sulfhidrilo de estas y evitando que cambien su conformacin para introducir el
sustrato, con esto se modifica la configuracin de dichas protenas y se ve
afectado el transporte de glucosa. Idealmente se esperaba una curva de consumo
de glucosa mnimo, sin embargo, en la grfica 2 se observa que al tiempo de 20
min hay un registro de consumo de glucosa cero, esto pudo deberse a que la
alcuota que se tom a ese tiempo no fue la adecuada.
El matraz 5 fue un control negativo, las lecturas de glucosa consumida
corresponden a cero, puesto que no se agreg glucosa al medio. Las lecturas
registradas por el espectrofotmetro se le resto a los dems matraces a su
correspondiente tiempo., esto con la finalidad de eliminar el margen de error
producido por los reactivos y tener lecturas ms certeras de la glucosa
transportada.





Conclusin:
La levadura Saccharomyces cerevisiae presenta transporte mediado pasivo.
El mtodo de DNS ayuda a calcular la glucosa residual.
El NEM inactiva a las protenas acarreadoras y transporte mediado activo o
pasivo.
El DNF inactiva el transporte activo primario y secundario.
La temperatura afecta las protenas acarreadoras de la membrana.

Bibliografa
[1] Flanzy, Claude. Enologa. 2013. Fundamentos cientficos y tecnolgicos. 2
a

edicin. Editorial Mundi-Prensa. Pg. 275
[2] Madigan T., Michael. Martinko M., John. Parker, Jack. Brock. Biologa de los
microorganismos. 10
a
edicin. Editorial Pearson. Pg. 152
[3] Hernndez, Alicia. Microbiologa industrial. Pg. 178
[6] Toxicologa fundamental Manual Repetto Ediciones Daz de Santos. Madrid
Espaa. Pag 285.
[5] Rawn, J.D 1989. Bioqumica 1 Ed. Interamericana. Mc Graw Hill. Madrid. Pag
1023-1248.