You are on page 1of 35

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL


LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC

FACULTAD DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL














GUA DE PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA













Ing. Anderson Nez Fernndez

Apurmac Abancay Per
2013
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez



INTRODUCCIN

La Biotecnologa es una palabra compuesta. Sin embargo, si se analiza por partes es ms
fcil entender qu significa Bio quiere decir vida, y biologa es el estudio de los seres vivos.
El trmino Tecnologa se refiere a las herramientas o tcnicas que se usan para fabricar o
producir algo. Entonces, si se junta todo se podra definir la biotecnologa como las
herramientas o tcnicas que emplean a los seres vivos para obtener algn producto. Los
seres vivos que participan en estas tcnicas son microorganismos (bacterias,
hongos, levaduras), plantas y animales. Y lo que se obtiene son alimentos, medicamentos y
otros productos tiles para las personas y para el ambiente en general. En realidad, el
hombre practica la biotecnologa desde hace miles de aos, pero en ese entonces lo haca
de forma ms simple que en la actualidad. Por ejemplo, usaba bacterias y levaduras para
fabricar yogur, queso, pan, vino, sidra, etc. Estas tcnicas an siguen en prctica, pero hoy
en da la biotecnologa usa herramientas ms modernas para obtener nuevos productos

Hace miles de aos cuando el hombre descubri que al fermentar las uvas se obtena un
producto como el vino. Tambin es biotecnologa la fabricacin de cerveza a partir de la
fermentacin de cereales que el hombre empez a elaborar hace 4.000 aos, y la
fermentacin de jugo de manzanas para la fabricacin de sidra. En estos procesos
intervienen microorganismos que transforman componentes del jugo de frutas o de
cereales en alcohol. Tambin es biotecnologa la fabricacin de pan mediante el uso de
levaduras, la elaboracin de quesos mediante el agregado de bacterias, y tambin de
salames. El yogur tambin es un producto que se obtiene mediante procesos
biotecnolgicos desde la antigedad. Aunque en ese entonces los hombres no entendan
cmo ocurran estos procesos, ni conocan la existencia de microorganismos, podan
utilizarlos para su beneficio. Estas aplicaciones constituyen lo que se conoce como
biotecnologa tradicional y se basa en
la obtencin y utilizacin de los productos del metabolismo de ciertos microorganismos. Se
puede definir la biotecnologa tradicional como la utilizacin de organismos vivos para la
obtencin de un bien o servicio til para el hombre

Actualmente, los cientficos comprenden mucho mejor cmo ocurren los procesos
biolgicos que permiten la fabricacin de productos biotecnolgicos. Esto les ha permitido
desarrollar nuevas tcnicas a fin de modificar o imitar algunos de esos procesos y lograr
una variedad mucho ms amplia de productos. Los cientficos hoy saben, adems, que los
microorganismos sintetizan compuestos qumicos y enzimas que pueden emplearse
eficientemente en procesos industriales. Estos conocimientos dieron lugar al desarrollo de
la biotecnologa moderna.

Por qu el agroindustrial debe conocer de la Biotecnologa y tener los procedimientos
bsicos y tcnicas comunes en un laboratorio de Biotecnologa. Porque la biotecnologa
trata sobre la utilizacin y produccin de microorganismos y del estudio de los cambios
bioqumicos que ocurren en el proceso de obtencin de diferentes productos antes
mencionados.



UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez



PRESENTACIN


Los experimentos formulados en el presente manual de prcticas de Biotecnologa son
formulados con el objetivo de guiar al estudiante en los procesos ms importantes de
fermentaciones Agroindustriales de los cursos de especialidad de la Escuela Acadmico
Profesional de Ingeniera Agroindustrial. En la preparacin de una clase de laboratorio, el
estudiante va a encontrar dos puntos de importancia para entender los experimentos a
realizar:

1. Cul es el propsito del experimento y
2. Cules son los principios cuantitativos involucrados o como los clculos deben ser
realizados.

Con estas dos herramientas el estudiante debe ser capaz de entender y discutir los
resultados de una prctica determinada. Para poder realizar estos dos puntos
durante el semestre, el estudiante requiere conocer el laboratorio, las normas de
seguridad en este, como tomar notas sobre las prcticas a realizar y los resultados de estos
experimentos y como elaborar un reporte de los resultados obtenidos, lo que se expresa en
los siguientes objetivos:

1. Aprender los pasos bsicos para la elaboracin del reporte de prctica.
2. Conocer las normas de seguridad necesarias para el trabajo en el laboratorio de
qumica.
3. Aprender las normas bsicas en el manejo de equipos, insumos, reactivos y
materiales en el laboratorio.
4. La realizacin de las prcticas que permitan comprender el proceso principal de la
fermentacin industrial y principios de la bioqumica, aplicados y orientados a la
transformacin de la parte alimentaria.
5. Del mismo modo el presente manual promueve la investigacin al estudiante que
hace entender como un conjunto sistematizado de conocimientos, sobre la realidad
observada, que se obtienen aplicando un sinfn de mtodos. El fin esencial de la
Universidad y de los universitarios es la investigacin y por ello exhorto al estudiante
a plantear alternativas de solucin a los problemas que aqueja a nuestra regin y el
Pas.








Ing. Anderson Nez Fernndez


UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez


PAUTAS Y SUGERENCIAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME

El informe de laboratorio es una acabada prueba de que hicimos un experimento, lo
analizamos y comprendimos. Cuando redactamos el informe es cuando terminamos de
ordenar nuestros datos, grficos, anotaciones y sobre todo nuestras ideas. Debe ofrecer a
los lectores un recuento claro y completo de las actividades experimentales realizadas,
nuestras conclusiones y reflexiones de lo que hicimos. El informe debe ser, ante todo, claro,
y, en lo posible, breve. Debemos redactarlo en lenguaje preciso y ameno, tratando de
atraer y retener la atencin de los lectores. Hagamos el siguiente ejercicio: Son las doce de
la noche y el lector de nuestro informe tiene tambin como opciones hojear el diario o ver
televisin.
Nuestro trabajo entrar en competencia con estas alternativas solo si est cuidadosamente
redactado y si en l expresamos nuestras ideas con claridad y concisin. Esto podemos
lograrlo usando construcciones cortas y cuidando que las descripciones no den lugar a
interpretaciones ambiguas, de manera que el lector no se vea obligado a tener que volver
sobre lo ledo. Recordemos que no estaremos al lado de nuestro lector para hacerle
aclaraciones a sus dudas y decirle que donde escribimos una cosa, en realidad, quisimos
decir otra.

El informe no debe ser considerado como un documento que se presenta con el solo fin
para que el profesor juzgue el trabajo realizado, sino que debe ser pensado como un texto
que sea capaz de mostrar que hemos ganado la habilidad de comunicar por escrito
nuestras ideas y resultados. Con esto en mente, los informes que se realizan en los cursos
bsicos de laboratorio son un muy buen entrenamiento para mejorar nuestra redaccin y
con ella nuestra capacidad de comunicar temas cientficos y tcnicos.

ORGANIZACIN DEL INFORME
El informe debe contar con secciones bien diferenciadas, que garanticen orden y cohesin.
Se sugiere el siguiente esquema para el texto del informe, que es usualmente empleado en
publicaciones cientficas y tcnicas.

El informe de laboratorio debe cubrir los siguientes apartados:

I. GENERALIDADES

1. PORTADA
1.1. Nombre de la universidad (en letras grandes en la parte superior central)
1.2. Nombre de la facultad o carrera profesional (en letras ms pequeas debajo del
nombre de la universidad)
1.3. Puede ir el logotipo de la universidad debajo del nombre de la carrera profesional
no pudiendo exceder de 5cm x 5cm.
1.4. Numero de prctica y ttulo del experimento (corto e ilustrativo).
1.5. Nombre de la asignatura.
1.6. Nombre(s) del (de los) participante(s).
1.7. Identificacin de (de los) participante(s) (por ejemplo grupo de trabajo, semestre).
1.8. Nombre del profesor.
1.9. Fecha en que se realiz el experimento.
1.10. Fecha de entrega del informe.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

II. ENCABEZAMIENTO DEL INFORME

2.1. TTULO: El ttulo del trabajo debe ser especfico e informativo, y en lo posible
agudo y provocador. Con l debemos dar una idea clara del tema estudiado.

2.2. RESUMEN: El resumen del informe debe dar un adelanto de lo que se leer en el
cuerpo del mismo, en lo posible en no ms de 150 palabras. Aqu debemos indicar
con concisin el tema del trabajo, referirnos sucintamente a la metodologa
seguida y destacar los resultados ms importantes obtenidos.

2.3. OBJETIVOS (que se busca con el experimento)
El o los objetivos deben especificar de manera clara lo que se pretende estudiar y
los conocimientos que se pretenden adquirir. No deben confundirse con una lista
de las actividades realizadas.

III. CUERPO DEL INFORME

INTRODUCCIN: En esta seccin debemos orientar al lector hacia el tema de
estudio y la motivacin por hacerlo elegido. Para esto es aconsejable que
incluyamos un marco tericoexperimental del tema que estudiamos, con
referencias adecuadas (ver Referencias) que lleven rpidamente a los antecedentes
del problema y que destaquen la conexin de esas ideas con el trabajo realizado.
Estas referencias deben orientar al lector hacia el estado del arte del tema.
Asimismo debemos enunciar claramente el propsito u objetivo del experimento.

IV. REVISIN BIBLIOGRFICA
Se hace referencia a los principios fsicos relacionados directamente con el
experimento y que dan soporte al trabajo realizado. Se describen las frmulas
empleadas, definiendo la simbologa utilizada. Debe hacerse con apoyo de material
bibliogrfico, pero no debe ser una copia textual de ste ni una secuencia de prrafos
copiados y sin relacin entre ellos, el redactor debe extraer las partes que se
relacionan de manera directa con la prctica desarrollada debiendo citar en cada una la
fuente bibliogrfica.
V. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Materiales: Se presenta una descripcin de materiales y/o equipo con el cual se
trabaj y de los instrumentos utilizados. Se deben incluir esquemas y se debe
describir la funcin de cada instrumento. En lo posible, debe indicarse la
precisin del equipo. No debe limitarse a una simple lista de instrumentos.
5.2. Mtodos o Procedimiento del experimento: En la seccin describimos los
procedimientos seguidos y el instrumental usado. Es til incluir un esquema del
diseo experimental elegido. Para esto puede recurrirse a diagramas
esquemticos que muestren las caractersticas ms importantes del arreglo
experimental y la disposicin relativa de los instrumentos. Es una buena prctica
indicar tambin cules variables se miden directamente, cules se obtienen
indirectamente y a cules tomamos como datos de otras fuentes (parmetros
fsicos, constantes, etc.). Tambin es aconsejable describir las virtudes y
limitaciones del diseo experimental, analizar las fuentes de errores e
individualizar las que aparezcan como las ms crticas.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

VI. RESULTADOS: Los resultados deben presentarse preferiblemente en forma de
grficos. En lo posible evitemos la inclusin de tablas de datos, a menos que sean
sustanciales. Los datos del experimento deben estar diferenciados de otros datos que
puedan incluirse para comparacin y tomados de otras fuentes (se sugiere ver la
Unidad 4 donde se dan pautas para hacer grficos). Como prctica invariante,
debemos expresar resultados con sus incertidumbres, en lo posible especificando
cmo las calculamos.

VII. DISCUSINES: En esta parte debemos explicitar el anlisis de los datos obtenidos.
Aqu se analizan, por ejemplo, las dependencias observadas entre las variables, la
comparacin de los datos con un modelo propuesto, o las similitudes y discrepancias
observadas con otros resultados. Si el trabajo adems propone un modelo que trate de
dar cuenta de los datos obtenidos, es decir, si el modelo es original del trabajo, su
descripcin debe quedar lo ms clara posible; o bien, si se us un modelo tomado de
otros trabajos, debe citarse la fuente consultada. Si fuera necesaria una comparacin
de nuestros resultados con otros resultados previos, resaltemos similitudes y
diferencias de los materiales, mtodos y procedimientos empleados, para as poner en
mejor contexto tal comparacin.

VIII. CONCLUSIONES. En esta seccin tenemos que comentar objetivamente qu hemos
aprendido del experimento realizado, y sintetizar las consecuencias e implicancias que
encontramos asociadas a nuestros resultados. Podemos decir que un buen informe es
aquel que demuestra el mayor nmero de conclusiones (correctas) alcanzadas a partir
de los datos obtenidos.

IX. CUESTIONARIOS. Desarrollar los cuestionarios encargados por el docente que
regenta el curso.

X. REFERENCIAS: Las referencias bibliogrficas se ordenan al final del informe.
Deben contener el nombre de los autores de las publicaciones (artculos en revistas o
libros) citados en el texto, el ttulo de los trabajos; el nombre de la revista o editorial que
los public; adems se debe incluir los datos que ayuden a la identificacin de los
mismos: volumen donde estn incluidos, captulo, pgina, fecha de publicacin, etc.

XI. APNDICES: Algunas veces son necesarios para la mejor comprensin de alguna
parte del informe. Por lo general no es conveniente distraer al lector con muchos
clculos, despejes de trminos y propagaciones de errores en la mitad del texto, as
que este lugar puede ser propicio para estas consideraciones. En el texto principal
deberemos orientar al lector para que consulte estos apndices.

XII. COMENTARIOS FINALES
Nuestra experiencia nos ensea que no es fcil congeniar de primera con la literatura
cientfica, ms aun si actuamos como escritores. Es cuestin de prctica lograr que
nuestra narrativa descriptiva sea desenvuelta y precisa.
No se debe de confundir el informe con la bitcora de laboratorio. Esta ltima es
donde se registraron todos los datos y detalles de experimento. La bitcora es
principalmente un cuaderno de uso personal donde en lo posible estn documentados
todos los detalles del experimento. El informe es una versin final depurada y tiene
como destinatario un lector que no necesariamente realiz el experimento.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

PRCTICA N 01 y 02: Normas de seguridad en el laboratorio de
Biotecnologa Agroindustrial y reconocimiento de materiales, equipos e
insumos.


I. OBJETIVOS

El alumno conocer el reglamento de Laboratorio de Biotecnologa
Agroindustrial y comprender la importancia de respetarlo para optimizar el
trabajo experimental as como minimizar las posibilidades de sufrir u ocasionar
accidentes.
El alumno revisar las medidas de seguridad ms importantes que se utilizan
en un laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial para minimizar la posibilidad
de accidentes.
Identificar los materiales y equipos ms usados en el laboratorio y sus
funciones
Manipular materiales y equipos de uso y cuidados especficos.
El alumno realizar algunos clculos bsicos de los ms utilizados en el
laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial, para aislar, identificar y preparar
soluciones.

II. INTRODUCCIN

Prcticamente todos los laboratorios de Biotecnologa Agroindustrial, donde el
trabajo de laboratorio es frecuente han sido escenarios de accidentes, la mayora
de poca importancia, pero algunos de graves consecuencias. Estos, as llamados
accidentes no suceden, sino que son causados por descuidos o faltas de
atencin en el trabajo. Una observancia rigurosa de las precauciones que se
indican a continuacin prevendr directamente la mayora de dichos accidentes y
ayudar indirectamente a los alumnos a adquirir aquellos hbitos de seguridad
que les sern de inestimable valor no slo en el laboratorio, sino en cualquier sitio
donde se desarrolle como profesional en la vida cotidiana.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. Reglamento del laboratorio.
Usar siempre bata de algodn, manga larga, abotonada, de preferencia
blanca.
Usar siempre dentro del laboratorio lentes de seguridad.
Usar guantes de ltex cuando se usen reactivos txicos, corrosivos y
cuando se lave el material.
No fumar, no consumir alimentos ni bebidas en el laboratorio.
No jugar, ni correr en el laboratorio.
No utilizar equipos de sonido ni celulares.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

La salida del laboratorio debe ser autorizada por el profesor.
No se admitirn visitas durante la sesin de laboratorio.
Nunca pipetear con la boca ningn lquido (sin exceptuar el agua), usar
propipeta.
Realizar exclusivamente los experimentos que indique el profesor.
Cuando se trabaje con lquidos inflamables evitar tener mecheros
encendidos cerca.
No verter a la tarja residuos slidos o reactivos corrosivos.
Identifique recipientes de desechos cidos, bsicos, orgnicos o
inorgnicos.
Al final de la prctica dejar limpio el material y la mesa de trabajo.

3.2. Medidas de seguridad.
Manipular las sustancias voltiles, inflamables y explosivas en la campana
de extraccin o en su defecto en un lugar ventilado.
Evitar encender mecheros o generar calor cerca de lugares donde se
manipulen disolventes orgnicos.
Etiquetar los recipientes de reactivos y disolventes que se tengan en uso;
aquellos que se encuentran sin identificacin y se ignore el contenido,
desecharlo en un lugar adecuado.
Rotular siempre el material con el que se est trabajando.
Investigar la peligrosidad de cada uno de los reactivos a utilizar en cada
prctica para minimizar los riesgos.
En caso de tener algn accidente en el laboratorio avisar rpidamente a su
profesor.
Si trabaja con dispositivos de reflujo o destilacin verifique que las piezas
estn correctamente colocadas, pinzas perfectamente cerradas, para as
evitar perdida de material por ruptura.
Cuando est trabajando con la parrilla de calentamiento nunca trabaje con
temperaturas muy altas.
En caso de romper algn material no recoger los restos con las manos.

3.3. Los materiales de laboratorio se pueden clasificar en:

1. Material de vidrio: vasos precipitados, placas de petri, tubos de ensayo,
probetas, pipetas aforadas, pipetas volumtricas, buretas, matraces de
Erlen Meyer y matraces aforados.
2. material de calor y fro y sus accesorios: refrigerantes, mecheros (de
Bunsen), baos termorregulados, baos de arena, calefactores elctricos,
congeladores, autoclaves, estufas, etc.
3. Material de porcelana, acero, caucho.
4. Materiales de medicin de temperatura, tiempo y masa: termmetros,
balanzas y cronmetros.
5. otros: equipos en general
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez


IV. SECCIN EXPERIMENTAL.

4.1 Por equipos analizar y discutir, El reglamento de laboratorio y las medidas
de seguridad.
Criticarlas y considerar su pertinencia e importancia.
4.2 Despus de un tiempo razonable determinado de comn acuerdo entre
profesores y alumnos, discutir en forma grupal el reglamento y las medidas
de seguridad.
4.3 En seguida se realizar un recordatorio de los materiales, equipos y
reactivos con sus determinados usos y precauciones.
4.3 Realizar los clculos bsicos por equipo, y despus el profesor
seleccionarn a diferentes equipos para que pasen al pizarrn a resolver los
ejercicios y a explicarlos.


V. RESULTADOS.
Indicar los resultados de la identificacin de materiales, equipos adems las
funciones.
Redactar los resultados de las normas de seguridad, las prevenciones y las
medidas que debe tener antes, durante y despus de ingresar al
laboratorio.

VI. DISCUSIONES
6.1 Discutir e indicar la importancia de respetar el Reglamento de
Laboratorio.
6.2 Discutir e indicar la importancia de conocer los diferentes materiales,
equipos e insumos que existen en el laboratorio.
6.3. Las discusiones se realizan en relacin a los resultados obtenidos
adems considerando la revisin de la literatura para el proceso de
aseveracin o contradiccin.


VII. CONCLUSIONES
7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de
conocer y respetar el reglamento de laboratorio, as como tambin tener
conocimiento de las medidas de seguridad ms importantes que se tienen
que observar en un laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial.







UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez


VIII. CUESTIONARIO.

1. Mencione cinco importancias que se debe considerar para la
implementacin del laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial.
2. Dibuje, describa y mencione sus funciones de los materiales, reactivos y
equipos del laboratorio que no observaste en la prctica y que es necesario
que debe incluirse en el laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial.
3. Dibuje y explique los smbolos de seguridad que existe en el laboratorio y
que smbolos ms considerara Ud. Que debe ir en el laboratorio como
sealizacin. Por qu.
4. Mencione cmo se debe realizar la limpieza y desinfeccin de un
laboratorio.
5. De qu manera se debe realizar el almacenamiento de muestras
biolgicas.
6. Cmo actuara Ud. En caso de quemaduras con algn cido?




























UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez


PRACTICA N 03: ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS:
SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos

Determinar la curva de crecimiento en microorganismos como levaduras cultivados en
aerobiosis utilizando diferentes fuentes de carbono.
Determinar la velocidad de fermentacin utilizando un medio definido con diferentes
fuentes de carbono.
Comparar las tasas de crecimiento especfico durante la fermentacin de
Saccharomyces cerevisiae con diferentes fuentes de carbono.
Controlar la fermentacin por produccin de CO2 y decrecimiento en peso del medio
de cultivo.


II. Marco terico


2.1. Metabolismo de azcares por levaduras

Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaerbicas, la fosforilacin a nivel del
substrato en la gluclisis es la nica fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y
posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molcula de glucosa convertida en dos
molculas de piruvato. La disimilacin de glucosa a piruvato va la gluclisis est unida a
la reduccin de NAD+ en la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato-
deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilacin es logrado por
descarboxilacin de piruvato a acetaldehdo, el cul (NAD+) subsecuentemente acta
como un aceptor de electrones para la reoxidacin de NADH2.1
El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metablica de
Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vas asimilatorias. La
gluclisis juega un rol esencial en la disimilacin de azcar, pero tambin genera bloques
constituyentes para la biosntesis. Adems, aunque muchas reacciones biosintticas usan
NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH ocurren en la conversin
de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monmeros celulares, por
ejemplo en la biosntesis de aminocidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae sobre azcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la
reduccin de acetaldehdo a etanol y la reduccin del pool de quinona de la cadena
respiratoria) es muy fuerte.

En Saccharomyces cerevisiae, el mantenimiento de las condiciones de cultivo aerbico no
es suficiente para lograr metabolismo respiratorio de azcar. Incluso cultivos totalmente
aerbicos exhiben un metabolismo mixto respiro-fermentativo, a menos que ellos sean
desarrollados con un suplemento limitado de azcar a tasas bajas de crecimiento
especfico.2, 3 Este fenmeno de fermentacin aerbica (frecuentemente referido como
efecto de la glucosa o Crabtree) es parcialmente debido a la represin de la sntesis de
enzimas respiratorias por exceso de glucosa.4, 5
Durante el crecimiento respiratorio sobre azcares, la reoxidacin del NADH2 formado en
la gluclisis puede ocurrir va respiracin mitocondrial, de esta manera rinde ATP
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

adicional va fosforilacin oxidativa. Adems por otra parte, la reoxidacin respiratoria de
NADH2 glucoltico implica que el piruvato no tiene que ser convertido en acetaldehdo
(aceptor de electrones), pero puede ser posteriormente oxidado. La oxidacin de piruvato
a acetil coenzima-A, ocurre predominantemente va el complejo mitocondrial piruvato-
deshidrogenasa, y subsecuentemente el acetil-CoA es oxidado a CO2 y H2O por las
enzimas del ciclo del cido tricarboxlico (TCA).6 Los anlisis cuantitativos de culturas
respiratorias, han concluido que la eficiencia in vivo de este proceso en Saccharomyces
cerevisiae es menor que en muchos otros microorganismos, esta baja estequiometra de
fosforilacin oxidativa est relacionado con la ausencia de un protn de translocacin
NADH deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae, la disimilacin respiratoria
completa de glucosa rinde aproximadamente 16 ATP por molcula de glucosa (cuatro
ATP desde la fosforilacin a nivel del substrato y cerca de 12 a partir de la fosforilacin
oxidativa).

Gay-Lussac fu el primero en mostrar que la fermentacin de la glucosa rinde
aproximadamente pesos iguales de etanol y CO2 (45 partes de glucosa rinden 23 partes
de alcohol y 22 partes de CO2). Pasteur encontr que 100 partes de sucrosa rinden 105.4
partes de azcar invertida, el cual fu fermentada a 51.1 partes de etanol, 49.4 partes de
CO2, 3.2 partes de glicerol y 1.7 partes de cido succnico.
El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor terico, el cual
debe ser 51.1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la
formacin de sub-productos durante la fermentacin alcohlica y a la asimilacin de
azcar por la levadura, adems de esto el rendimiento es afectado por diversas variables
incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inculo y presencia ausencia de O2, en la
prctica 47.0 47.5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100 gramos de
azcar fermentado.


III. Culturas, reactivos y materiales

Levadura Saccharomyces
cerevisiae
10 g Bagetas 02
Glucosa, sucrosa 20g c/u Pinzas 01
Extracto de levadura 5.0 g/L Chapitas 30
KH2PO4 4 g/L Espectrofotmetro 01
MgSO4.7H2O 2 g/L Balanza analtica 01
(NH4)2SO4 5 g/L Potencimetro 01
Agua destilada 5 L Algodn 01 rollo
HCl al 10% 50ml Cinta mazkin 01
Matraces Erlenmeyer de 1L 02 Rotulador 01
Matraces Erlenmeyer de 250ml 06 Papel aluminio 01 rollo
Pipetas de 10 ml 02 Tijera 01
Vasos de precipitacin de 200ml 04 Pabilo 01 rollo
Esptulas 02
Pizeta 01
Pipetas 5ml, 10ml 02 c/u

IV. Metodologa
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez



Preparacin de inculo: Preparar 100 ml de una solucin que contenga: Glucosa
sacarosa 2 g, extracto de levadura 0.1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.04 g, ajustar el
pH a 3.8. Luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, inocular
aspticamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae usando una asa de siembra y
cultivar por 24 horas en agitacin a 28C.

Medio de fermentacin: Preparar 250 ml de una solucin que contenga: Glucosa
sacarosa 5 g, extracto de levadura 0.25 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KH2PO4 1.0 g,
MgSO4.7H2O 0.1 g.


V. Procedimiento

En cada uno de 3 matraces Erlenmeyer de 400 ml se adicionan 250 ml de medio de
fermentacin de composicin citada anteriormente, el pH se ajusta a 3.8 con HCl al 10%.
Luego se esteriliza a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja
enfriar hasta alcanzar los 28 C (temperatura de cultivo con Saccharomyces cerevisiae).
Luego aspticamente se inocula con el 5% del inculo cultivado anteriormente. El inculo
a utilizar debe centrifugarse previamente a 3 000 rpm x 10min., y enjuagado con agua
destilada antes de inocular al medio de fermentacin.



























Tratamiento del inculo:
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez
























VI. Mediciones:


Para determinar la curva de crecimiento en el cultivo aerobio se realizar por dos mtodos
indirectos:

1. Determinacin del crecimiento por gravimetra: Con una pipeta se extrae
aspticamente 2 3 ml de medio cada 4 horas, se centrifuga y las clulas se vierten en
una placa metlica previamente tarada. Seguidamente la biomasa centrifugada se coloca
en la estufa para secarlo durante 1hora a 100 C. Con los datos obtenidos: peso seco de
Agitacin
150rpm, 24h, 28C
24 horas
Pipetear 5% del volumen de
fermentacin
Centri-
fugacin

Enjuagar con H2Od
Centri-
fugacin


3000 rpm x 10min
3000 rpm x 10min
3000 rpm x 10min Inoculo
enjuagado y
centrifugado
100 ml de medio estril
glucosa sacarosa
Inocular con levadura
Proceso de cultivo: 250 ml de medio de cultivo estril glucosa sucrosa
Inculo tratado
Inculo tratado
Inculo tratado
DO
Tiempo (h)
Tiempo (h)
mg biomasa seca/ml
Espectrofotometra
Agitacin 150 rpm
Agitacin 150 rpm
Anaerobiosis
28C, tiempo: a criterio
28C, tiempo: a criterio
Medicin: Biomasa total (biomasa seca/L)
Etanol: picnometra
Medicin: Biomasa total (biomasa seca/L)
Etanol: picnometra
Control de la fermentacin: Pesado
glucosa sacarosa
glucosa sacarosa
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

las clulas y el intervalo de tiempo en el que se tomo la muestra se construye una grfica
tiempo peso seco de biomasa (mg de biomasa seca/ml). Luego se determinar la tasa
de crecimiento especfico al inicio de la fase logartmica con la siguiente formula:

Ln X1 Ln Xo
= ----------------------
t1 to

2. Determinacin del crecimiento por densidad ptica: Se tomar muestras del medio de
fermentacin (2ml aprox.) cada 4 horas para medir la densidad ptica del medio a 620nm.
Con estos datos se construye una curva de crecimiento de la levadura ploteando
densidad ptica y tiempo de toma de muestras.


Para controlar el tiempo de fermentacin (en anaerobiosis), se toma el peso inicial del
medio de cultivo correspondiente a 250ml (no olvidar descontar el peso del matraz y el
tapn) y cada 4 horas se vuelve a pesar el matraz para determinar la velocidad de
fermentacin, se anota el intervalo en que se toma cada medida y el peso neto del medio
de cultivo en ese instante, y se construye una grafica tiempo peso.

Se determinar el etanol producido al final de la fermentacin por picnometra, con los
datos obtenidos se calcular la eficiencia de cada fermentacin


VII. Cuestionario

Cul es la importancia de controlar el desprendimiento de CO2 en una fermentacin?
Cmo esta caracterizada la fase exponencial de crecimiento microbiano?
Qu es la fase lag y que factores influye en su duracin?
Qu rendimientos en etanol ha encontrado utilizando diferentes azcares?
Realice una discusin respecto a los valores encontrados de produccin de etanol y
biomasa bajo condiciones aerobias y anaerobias


VIII. Referencia bibliogrfica


Bisson, L. F. Metabolismo de azcares por levaduras, en la microbiologa y
biotecnologa del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers, 1993, p.
55-75.
De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras., 1966.
Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156.
Estela, W. D. Evaluacin del comportamiento fisiolgico de levaduras
Saccharomyces y no-Saccharomyces bajo diferentes condiciones de crecimiento.
Reporte anual, VSCHT, Praga Repblica Checa, 2001.




UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

PRCTICA N 03: LEVADURAS COMO AGENTE LEUDANTE DE LA MASA PANARIA

I. OBJETIVOS
Evaluar la actividad de las levaduras como agente leudante a travs del
esponjamiento de la masa.
Determinar la eficiencia de la levadura en presencia de azucares fermentables
(sacarosa) en la produccin de CO
2


II. INTRODUCCIN

Casi todos los tipos de pan que se hacen hoy en da incorporan algn agente leudante, lo
que significa que una sustancia es aadida a la masa para iniciar su fermentacin y
hacerla subir.
Sin la levadura u otro agente leudante, la mezcla de harina y agua, una vez cocida, sera
una simple torta plana y poco apetitosa.
En un momento determinado de la historia, nuestros antepasados descubrieron que
dejando fermentar la masa en un lugar clido obtenan un pan ms ligero y esponjoso.
La transformacin de la masa en pan es por la levadura u otro agente leudante mediante
la produccin de dixido de carbono que se expande, la masa se estira y unas diminutas
bolsas de aire se introducen en la masa.
Cuando sta se cuece, el proceso se estabiliza y el aire queda atrapado dentro.

III. MARCO TERICO

3.1. Agentes leudantes. Denominados tambin agentes gasificantes, son aquellas
substancias capaces de producir, o incorporar gases, en productos que van a
ser horneados con el objeto de aumentar su volumen y producir cierta forma y textura en
su masa final. En la industria alimenticia estos agentes leudantes se emplean en las
masas elaboradas tanto en panadera como en repostera. En el caso concreto de
la panadera las levaduras, mediante la fermentacin, son empleadas como agentes
leudante naturales con el objeto de que hinchen las masas de pan con dixido de
carbono (CO
2
) y den como resultado una miga de textura. En muchas ocasiones, dentro
de las masas de repostera se emplean levaduras qumicas (como el bicarbonato de
sodio) que liberan dixido de carbono igualmente, hinchando su volumen. Durante el
horneado estas masas se estabilizan, se rigidizan y liberan el gas quedando esponjosas.

3.2. Caractersticas
Para que un agente leudante sea capaz de aumentar el volumen de la masa debe existir
una substancia capaz de "retener" el gas liberado en su interior. Este papel lo realizan en
los procesos culinarios, por regla general, las protenas existentes en los alimentos. En el
caso de la harina de trigo empleada en la panificacin, es el gluten.2Sin gluten no se
producira el aumento de masa, a pesar de incluir agentes leudantes. Esta es la razn por
la que aquellos cereales con un menor contenido de gluten poseen menor capacidad de
leudar. Las protenas durante el amasado forman una red en el interior capaz de favorecer
la retencin de los gases que liberan los agentes leudantes.




UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

3.3. El mtodo del esponjado
Algunas levaduras para pan se preparan con el mtodo del bizcocho, que consiste en
disolver la levadura en agua ms caliente de lo normal, y luego mezclndola con parte de
la harina para hacer una especie de pasta.
Esto puede hacerse en un bol o haciendo un volcn en la harina e incorporando sta a la
levadura disuelta slo parcialmente al principio, como en la receta del pan partido.
La pasta se deja en reposo por lo menos unos 20 minutos -normalmente durante mucho
ms- hasta que se forman burbujas en su superficie, proceso que se conoce como
esponjado.
A continuacin se mezcla con el resto de la harina y se aaden otros posibles
ingredientes.
Este mtodo permite a la levadura empezar a actuar sin verse inhibida por la presencia de
ingredientes como huevos, manteca o azcar que reducen su eficacia.

3.4. Insumos utilizados en el proceso fermentativo de la masa panaria
3.4.1. Azcares.
Presentes en la harina, suelen estar en forma de sacarosa y maltosa. Estos disacridos
no son fermentables directamente, sino que es preciso transformarlos enzimticamente,
en azcares simples, monosacridos, que s lo son. Estas transformaciones se realizan
por medio de las enzimas invertasa y maltasa, presentes en la harina, dando lugar al
llamado azcar invertido, constituido por una mezcla de glucosa y fructosa.

3.4.2. El agua.
El agua es un cuerpo formado por la combinacin de un volumen de oxgeno y dos de
hidrgeno, cuya frmula qumica es H
2
O. Es lquida, inodora, inspida e incolora, disuelve
muchas substancias. Habitualmente la encontramos en estado lquido, aunque,
dependiendo de las condiciones de presin y temperatura, es usual hallarla en estado
slido o gaseoso.
El agua que empleemos debe ser potable, por lo que debe reunir las propiedades
anteriores y tener un buen estado sanitario. El agua constituye una tercera parte de la
cantidad de harina que se vaya a emplear, aunque esto es un clculo estimado la
cantidad final que se aadir depender de una serie de circunstancias, como el tipo de
consistencia que queramos conseguir. As, si aadimos poca agua, la masa se desarrolla
mal en el horno, mientras que un exceso hace que la masa resulte pegajosa y se afloje el
pan quedando aplanado.

3.4.3. Levadura.
Antes de nada debemos distinguir entre levadura biolgica y gasificantes, las primeras
realizan la fermentacin biolgica del producto, transforma los azcares en CO
2
, alcohol
etlico y energa, adems de descomponer los azcares complejos fermentables en otros
ms simples por mediacin de la enzima Zymasa. Los gasificante son productos
empleados para provocar la hinchazn o elevacin de la masa sin llegar a transformar
ningn componente de la harina, en el modo que ocurre en la biolgica. Son compuestos
alcalinos como el bicarbonato amnico, sdico, etc. La levadura biolgica es un hongo
perteneciente al gnero de los hemiascomicetos y ms especialmente a los miembros del
gnero Saccharoromyces. No todas las levaduras son aptas para la panificacin, la ms
utilizada por los panaderos es la Saccharomyces Cerevisiae.


UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

IV. MATERIALES
Pipetas
Gradilla
Erlenmeyer
Balanza
Probeta
Baguetas
Esptula
Bao mara

V. PARTE PROCEDIMENTAL (EXPERIMENTAL). Prepare los siguientes
tratamientos:
Componentes
Tratamientos
1 2 3
Harina 10g 10g 10g
Sacarosa 1g 1g 1g
Agua 15ml 15ml 15ml
Levadura 0.3g 0.5g 0.7g
Bicarbonato 0.3g 0.5g 0.7g

Mezclar y homogenizar la masa en cada beaker con ayuda de una bagueta
Trasladar el homogenizado a las probetas rotulada y homogenizadas
Incubar a 37C
Leer y anotar el volumen inicial de la masa, en los diferentes intervalos de tiempo
segn lo establecido.
Leer y anotar el peso inicial de la masa, en los diferentes intervalos de tiempo
segn lo establecido.

VI. RESULTADOS. Analice, describa los atributos de cada tratamiento, segn
corresponda.
Tabla 01: Descripcin de los atributos ms importantes de los tratamientos
Atributo
Tratamientos
1 2 3
Color
Olor
Sabor
Flavor
Textura
Volumen
Contenido de humedad
Elasticidad
Peso

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

Tabla 02: Descripcin del volumen y peso de los diferentes tratamientos
Tiempo
Tratamientos (Volumen) Tratamiento (Peso)
1 2 3 1 2 3
0 minutos
5 minutos
10 minutos
15 minutos
20 minutos
30 minutos
40 minutos
50 minutos
60 minutos

VII. DISCUSIONES

6.1 Discutir e indicar la importancia de los agentes leudantes de la masa
panaria.
6.2 Discutir e indicar la importancia de conocer los diferentes agentes
leudantes de la masa panaria.
6.3. Realice el proceso de discusin en base a sus resultados obtenidos y la
contrastacin del fundamente terico.

VIII. CONCLUSIONES
7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de
conocer los agentes leudantes, del mismo modo deber tener relacin con
los objetivos del informe de prctica de laboratorio.

IX. CUESTIONARIO
1) Mencione cules son los factores que interviene en el proceso de hinchamiento
de la masa panaria? Por qu?
2) Grafique la frecuencia de variacin del volumen y del peso de os diferentes
tratamientos e interprtelos correctamente.
3) Mencione en que tiempo es necesario parar el proceso de fermentacin? y por
qu?
4) Desarrolle las condiciones de Saccharomyces Cerevisiae.

X. BIBLIOGRAFA
Matz, S (1972). "Bakery Technology and Engineering", AVI Publishing Co.
Francisco Javier Alonso de la Paz, El libro del pan y de la leche; Madrid 1999,
Editorial gata. ISBN 84-8238-328-0.
Simmons, Amelia. "American Cookery". Oxford University Press, 1958
Graciela Martnez de Flores Escobar,Marcela Gonzlez-Garza , (2005),Iniciacin
a Las Tcnicas Culinarias, Madrid, pg 212


UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

PRCTICA 05: AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS

Adiestrar al estudiante en las tcnicas de aislamiento y seleccin de
microorganismos.
Diferenciar morfolgicamente los tipos de levaduras que habitan en nichos
naturales.
Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de
aislamiento en placa de Petri.
Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos.

II. INTRODUCCIN

En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados,
sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y
trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.

Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo un tipo de
microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de
sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el
nombre de colonia.
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta,
se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas
durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio
lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de
microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch
introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la
superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo.

El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. Generalidades del proceso de aislamiento
El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo
(clula) inmovilizada sobre la superficie de un medio slido y separada del resto
de individuos presentes en el cultivo mixto. Esta clula, en las condiciones de
crecimiento adecuadas dar lugar a una descendencia (clon) que resultar
macroscpicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene millones
o miles de millones de clulas idnticas y con el mismo origen y propiedades. Se
puede demostrar que prcticamente cada colonia procede de una sola clula o de
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

un grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello
lo ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos
al origen de una colonia. El cultivo descendiente de una misma colonia es un
cultivo puro.

En los primeros tiempos de la Microbiologa se utilizaban como sustratos slidos
para inmovilizar los microorganismos patatas o pan, con el inconveniente de la
opacidad de estos sustratos. En el laboratorio de Robert Koch se desarrollaron
tcnicas para solidificar un medio lquido con composicin conocida aadiendo
una sustancia sin opacidad y con la posibilidad de modificar la composicin del
medio lquido segn los requerimientos nutricionales del microorganismo a aislar.
La gelatina fue el primer agente solidificante utilizado por Koch, sin embargo,
presentaba el inconveniente de que algunos microorganismos son capaces de
utilizarla para su crecimiento.
Entonces la gelatina fue sustituida por el agar; introducida por Fanny Eilshemius
(1881). El agar es un polisacrido que se obtiene de algunas algas rojas y para
pasar de slido a lquido se debe calentar por encima de los 100C y una vez
fundido es mantiene lquido hasta enfriarse a 44C.

3.2. Nociones sobre el proceso de inculo y siembra

Inculo es la masa microbiana que se utiliza para sembrar el medio de cultivo.
Para evitar contaminaciones a la hora de inocular el medio de cultivo,
habitualmente se trabaja al lado de la llama del mechero Bunsen. Para la toma del
inculo a partir de una muestra a examinar a partir de un medio slido o de un
tubo con lquido, se recomiendan las maniobras siguientes:

1. Colocar frente al mechero la muestra a analizar y el resto del material
necesario (tubos, placas...) de manera que sea fcilmente accesible.
2. Tomar el asa de siembra o la pipeta. La pipeta debe estar previamente
esterilizada. Se debe flamear el asa de siembra hasta que el filamento alcance
un rojo incandescente y despus enfriar en la proximidad de la llama (unos 10
segundos).
3. Tomar con la otra mano el recipiente (tubo, placa...) que contiene la muestra a
analizar:

a) Si la muestra est en un tubo, quitar el tapn y flamear la boca del tubo.
b) Si la muestra est en una placa de Petri, colocar la placa invertida sobre la
mesa y levantar la parte de la placa que contiene el crecimiento bacteriano.
Situar en la proximidad de la llama del mechero.

4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tomar la alcuota o
inculo:
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

a. Si el medio es lquido agitar ligeramente el tubo e introducir la pipeta o el
asa de siembra en la cual quedar adherida una gota por tensin
superficial.
b. Si el medio es slido, rozar con el asa de siembra una pequea porcin de
colonia.
c. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hundir el filamento
dentro del medio hasta tomar una pequea porcin.

5. Transferir el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando la boca del tubo, trabajando en la
proximidad de la llama...).

a. Si la transferencia va a ser a un caldo lquido, descargar el inculo
mediante agitacin del asa de siembra en aqul o la expulsin del volumen
pipeteado.
b. Si la transferencia se va a realizar a un tubo de agar inclinado, introducir el
asa con el inculo y sembrar en zig-zag sobre la superficie del agar o bien
sembrar en picadura en la profundidad del medio.

c. Si la transferencia se va a hacer sobre un medio slido en placa de Petri,
existen diferentes tipos de siembra: extensin de una gota con asa de
vidrio, siembra en masa y por agotamiento en placa.

6. Una vez realizada la transferencia:
a. En el caso de los tubos, flamear la boca antes de colocar el tapn.
Identificar los tubos e incubar a temperatura adecuada durante el tiempo
necesario para que crezcan los microorganismos.
b. En el caso de la placa de Petri, tapar la placa. Identificar las placas
marcndolas en la base e incubar en posicin invertida para evitar que
el agua de condensacin

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
4.1. Materiales
Asa de siembra
Pipeta graduada
Placas de Petri
Micro pipetas
Cultivo de microorganismos (Poblacin de microorganismos)
4.2. Equipos
Incubadora
Microscopio
Autoclave
Potencimetro
Mechero bunsen

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

4.3. Reactivos
Peptona
NaCl
Na
2
HPO
4

KH
2
PO
4

Agua destilada

V. PARTE EXPERIMENTAL:
Lavar las frutas con 100ml de agua estril, utilice una vajilla estril y guantes. La
solucin de lavado se considera como la muestra. De la misma forma realice los
siguientes pasos:

A. Eliminacin de la poblacin bacteriana
Transfiera de 2ml a 5ml de muestra a un tubo el cual contiene 10ml de solucin
Raulin e incubar durante 24 horas a 22C 25C. Con esta metodologa
garantizamos la eliminacin de bacterias presentes en la muestra.

A.1. Preparacin de la solucin Raulin
Peptona 5.0g
NaCl 8.5g
Na
2
HPO
4
.12H
2
O 9.0g
KH
2
PO
4
1.5g
Agua destilada 1000ml
pH 7.2


B. Aislamiento de levaduras
B.1. Si la muestra contiene solo levaduras, obviamos la parte A y realizamos el
siguiente procedimiento:
Realizar tres diluciones de la muestra en tres tubos de ensayo
conteniendo 9 ml de agua peptonada previamente esterilizada.
De cada dilucin tomar una alcuota de 1ml con una pipeta estril y
verterla a una placa petri, enseguida adicionar el agar saboraud
fundido, tibio y mezclar suavemente.
Finalmente dejar que solidifique y llevar a incubar de 24 a 48 h a
una T de 22 a 25C
Verificar macroscpicamente (con una lupa) la presencia de los tipos
de colonia. Escoja minuciosamente una colonia bien aislada y
definida, y evalela microscpicamente, si cada colonia que usted
evala contiene clulas de un solo tipo, tome el restante de la colonia
y transfirala a un tubo con agar sabouraud inclinado e incubar a T
de 22 25C, en caso de que encuentre clulas diferentes (en
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

tamao, morfologa, tipo de gemacin), realice la prueba con otras
colonias, si no encuentra ninguna colonia pura o limpia, realice el
aislamiento de nuevo
Despus de 24 48h de incubar la colonia en agar Sabouraud
inclinado controle microscpicamente la pureza de la cultura que
usted obtuvo.

V. RESULTADOS.
Indicar los resultados de los anlisis y discusiones de las Reglas de
laboratorio y de Las medidas de seguridad.
Indicar los materiales, equipos y sus funciones respectivas.

VI. DISCUSIONES
6.1 Discutir e indicar la importancia de realizar las destilaciones.

VII. CONCLUSIONES
7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de
conocer y realizar las destilaciones por diferentes mtodos.

VIII. CUESTIONARIO.

1. Menciona la importancia de la filtracin?
2. Un lquido orgnico comienza a descomponerse a 80C. Su tensin
de vapor a esa temperatura es de 36 mm de Hg. Cmo podra
destilarse?
3. Ctense dos razones que justifiquen que el agua fra circule en un
refrigerante en sentido ascendente.
4. Se podra separar por destilacin sencilla una mezcla de dos
lquidos de puntos de ebullicin 77 C y 111 C? Y por destilacin
fraccionada? Qu lquido se recogera en primer lugar?














UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

PRCTICA 06: TOLERANCIA DE LEVADURAS AL ETANOL Y CIDO ACTICO A
CONDICIONES ANAERBICAS

I. OBJETIVOS

Evaluar y determinar la tolerancia exgena del etanol sobre Saccharomyces
cerevisiae y levaduras aisladas (Saccharomyces Sp)
Evaluar la tolerancia del cido actico exgeno sobre Saccharomyces cerevisiae y
levaduras aisladas (Saccharomyces Sp)
Determinar los procesos de fermentacin con fines tecnolgicos.


II. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA

Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el
transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las
levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son
los siguientes:

2.1.1. TEMPERATURA. A mayor temperatura la fermentacin transcurre ms
rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y ms
cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima
de desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes
de 45C.

2.1.2. OXIGENO. Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras
mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxgeno disuelto en el mosto.

2.1.3. NUTRIENTES. Los azcares son fuente de energa para las levaduras.

2.2. INFLUENCIA DE ETANOL SOBRE EL METABOLISMO DE LEVADURAS

El etanol inhibe la viabilidad de las levaduras, la tasa especfica de crecimiento y la tasa
especfica de fermentacin; adems de esto, la composicin del medio, concentracin de
azcar, pH y la temperatura afectan esta inhibicin.
1
Hay algunas teoras acerca de la
inhibicin del crecimiento y fermentacin relacionadas a la produccin de etanol, se
produce un decrecimiento del contenido de esteroles en la membrana celular y esto
puede afectar el transporte de azcares, las enzimas del metabolismo de azcares son
inhibidas por los productos que se sintetizan durante la fermentacin, el etanol parece
tener un efecto inhibitorio sobre la actividad de la hexoquinasa y consecuentemente sobre
el funcionamiento de la gluclisis.

Hoy en da es asumido que la tolerancia al etanol depende de la habilidad de las clulas
de levadura para exportar etanol al medio externo, un proceso que depende grandemente
de la composicin de la membrana celular y de la fluidez.
5
Adems, la permeabilidad del
etanol desde afuera hacia adentro de la clula es muy baja, lo cual explica el hecho de
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

que el etanol adherido al medio es menos inhibitorio que el etanol producido por las
clulas.

Los lpidos y esteroles de la membrana celular de levaduras son importantes porque ellos
afectan el transporte de soluto y la tolerancia al etanol. Al preparar un inculo bajo
condiciones aerbicas, incrementa el contenido de esteroles en la membrana celular y
ayuda durante la fermentacin anaerbica reteniendo la vitalidad celular, por esta razn
ellos son conocidos como factores de sobrevivencia.

Muchos experimentos mostraron que la incorporacin de cido linoleco, ergosterol u otro
cido graso insaturado y esterol en la membrana celular de la levadura, incrementa su
permeabilidad al etanol, y permite una alta tasa de transporte de etanol hacia fuera de la
clula. Cuando no se suplementa con cidos grasos o esteroles al medio de cultivo, la
clula podra sintetizarlos cuando hay disponible oxgeno en el medio, pero no en la total
ausencia de l. Esta es la razn del mejoramiento a la tolerancia bajo condiciones micro-
aerbicas.

Bajo condiciones anaerbicas el contenido de esterol cae rpidamente y la actividad
fermentativa se retrasa, por esta razn, en la elaboracin de vinos es necesario una
aereacin intermitente de por lo menos de cinco minutos para inducir la sntesis de
esteroles.
Ocasionalmente, durante la elaboracin de vinos, y otras bebidas fermentadas se puede
tambin necesitar una aereacin intermitente para animar el crecimiento de la levadura y
as conducir sin duda a la formacin de ergosterol.


El crecimiento en la presencia de etanol conlleva a la adaptacin de la clula al etanol y a
una elevada tolerancia al etanol, durante este proceso toma lugar cambios en la
composicin de cidos grasos, fosfolpidos y esteroles de la membrana citoplasmtica.

El etanol y el cido actico son bien conocidos como inhibidores del crecimiento y son
usados como agentes antimicrobianos. Por otro lado, estos compuestos son sub-
productos o substratos de fermentacin, as el cido actico es un sub-producto de la
produccin de etanol e inhibe la fermentacin a altas concentraciones, el mecanismo de
su toxicidad envuelve la acidificacin del citoplasma y modificacin de ciertas enzimas de
la gluclisis.
10


III. MATERIALES Y REACTIVOS
a. MATERIALES

Levadura Saccharomyces
cerevisiae
10 g Pipetas de 0.1 ml, 1ml,
10ml
01c/u
Glucosa 100g Vasos de precipitacin de
250ml
04
(NH
4
)
2
SO
4


5.0g Tubos de ensayo 20
Extracto de levadura 5.0g Tubos Durham 20
KH
2
PO
4
4.0 g Bagetas 02
Glicerol 20ml Esptulas 02
Agua destilada --- Pizetas 01
HCl al 5% --- Algodn Rollo
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

Balanza analtica de 3
decimales
01 Rotulador 01
pH metro 01
Matraces Erlenmeyer de 1L 01 Espectrofotmetro ---
Matraces Erlenmeyer de
250ml
04
IV. PARTE EXPERIMENTAL
Preparacin de inculo

Preparar 100 ml de una solucin que contenga: 0.5 % de extracto de levadura, 0.4% de
KH
2
PO
4
, luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg
2
, agregar
aspticamente 5.0 g de levadura Saccharomyces cerevisiae y agitarlo.


A.- Medio de fermentacin para ensayos de tolerancia a etanol y cido actico

Colocar en tubos de ensayo (20 tubos), 10 ml de medio de fermentacin con la siguiente
composicin: Glucosa 20 g/L, KH
2
PO
4
5.0 g/L, (NH
4
)
2
SO
4
2.0 g/L, extracto de levadura
1.0 g/L. El medio de fermentacin se ajusta a pH 4.0 con HCl al 5% y se esteriliza a 121
C por 20 minutos a 15 libras/pulg
2
,

antes de adicionar los volmenes correspondientes
de etanol y cido actico.


PROCEDIMIENTO

Tolerancia al etanol por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaerbicas

Se colocan 10 ml de medio de fermentacin A en cada tubo de ensayo, seguidamente se
colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 C por 20 minutos a
15 libras/pulg
2
.Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la produccin de
CO
2
bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces cerevisiae se
ensaya a 28
o
C, durante 72 horas. La cantidad de etanol a adicionar al medio esterilizado
en los tubos de ensayo es la siguiente: 4.0 % v/v, 6.0 % v/v, 8.0 % v/v, 10.0 % v/v y 12.0
% v/v.

Tolerancia al cido actico por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaerbicas


Se colocan 10 ml de medio de fermentacin A en cada tubo de ensayo, seguidamente se
colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 C por 20 minutos a
15 libras/pulg
2
.Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la produccin de
CO
2
bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces cerevisiae se
ensaya a 28
o
C, durante 72 horas. La cantidad de cido actico a adicionar al medio
esterilizado en los tubos de ensayo es la siguiente: 0.1 % v/v, 0.2 % v/v, 0.5 % v/v, 1.0 %
v/v y 2.0 % v/v.




UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

Mediciones:

1. Observacin de la produccin de CO
2
a las 72 h en los tubos de ensayo por
Saccharomyces cerevisiae en los ensayos de tolerancia a etanol y cido actico.
Tomar como referencia lo siguientes parmetros:

Donde:

- = Nulo + = Dbil ++ = Moderado +++ = Intenso


V. RESULTADOS. Tabla 01: Evaluacin de la tolerancia al etanol exgeno por
Saccharomyces cerevisiae

Reacciones durante
la fermentacin
% ETANOL
Tiempo
4% 6% 8% 10% 12 %
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia
Tabla 02: Efecto del cido actico exgeno en la fermentacin de Saccharomyces
cerevisiae
Reacciones durante
la fermentacin
Concentracin de cido actico
Tiempo
0.1%v/v 0.2%v/v 0.5%v/v 1%v/v 2%v/v
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

VI. Tabla 03: Evaluacin de la Tolerancia al etanol exgeno por levaduras aisladas

Reacciones durante
la fermentacin
% ETANOL
Tiempo
4% 6% 8% 10% 12 %
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia
Tabla 04: Efecto del cido actico exgeno en la fermentacin de levaduras aisladas
Reacciones durante
la fermentacin
Concentracin de cido actico
Tiempo
0.1%v/v 0.2%v/v 0.5%v/v 1%v/v 2%v/v
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia
VII. DISCUSIONES

VIII. CONCLUSIONES

IX. CUESTIONARIO.

Explique el fenmeno de tolerancia e inhibicin de la fermentacin por etanol y
cido actico. Qu levaduras son altas productoras de cido actico?
Qu implicancia tiene el sulfito en la produccin de etanol y glicerol en
Saccharomyces cerevisiae?
Qu soluciones planteara Usted si un proceso de fermentacin se detendra y no
se llegara a la conversin total del azcar en etanol?



UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

X. BIBLIOGRAFA
1. Sa-Correia, I., y Van Uden, N. Perfiles de temperaturas en la tolerancia al etanol:
Efectos del etanol sobre la temperatura mxima y mnima de crecimiento en
Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces fragilis., 1983. Revista: Biotech.
Bioeng. Vol. 25, p. 1665-1667.
2. La Rue, F., Lafon-Lafourcade, S. y Ribereau-Gayon P., 1980. Revista: Appl. Env.
Microbiol. Vol. 39, p. 808-811.
3. Nagodawithana, T. W., Whitt, J. T. y Cutaia, A. J. Estudio del efecto de
retroalimentacin de etanol sobre enzimas seleccionadas de la va gluclica.,
1977. Revista Americana: Soc. Brew. Chem. Vol. 35, p. 179-193.
4. Navarro, J. M. y Finck, J. O., 1982. Revista: Cell. Molec. Biol. Vol. 28, p. 85-89.
5. Nagodawithana, T. W., y K. Steinkraus. Influencia de la tasa de produccin y
acumulacin de etanol sobre la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae en
fermentacin rpida., 1976. Revista: Appl. Environ. Microbiol. Vol. 31, p. 158-162.
6. Novak, M., P. Strehaiano, M. Morena, y G. Goma. Fermentacin alcohlica: Sobre
el efecto inhibitorio del etanol., 1981. Revista: Biotech. Bioeng. Vol. 23, p. 201-211.
7. Prasad, R., y H. Rose. Relacin de los lpidos en el transporte de solutos., 1986.
Revista: Levaduras. Vol 2, p. 205-220.
8. Navarro, J. M. y Durand, G., 1978. Revista: Ann. Microbiol. (Instituto Pasteur,
1926), p. 215-224.
9. Beech, W. F. Levaduras en la elaboracin de sidra. En: La levadura, 2da. ed. Vol.
V. Rose, A.H. y Harrison, J.S. Londres: Ed. Academic Press, 1987.
10. Pampulha, M. E. y Loureiro-Dias, M. C., 1990. Revista: Appl. Microbiol. Biotechnol.
Vol. 34, p. 375-380.
11. Beech, F. W. Reporte anual de la estacin de investigacin Long Ashton para
1952: 125. Londres, 1953.
12. Beech, F. W., 1972b. Revista del instituto de cervecera. Vol. 78, p. 477.
13. Beech, F.W., Burroughs, L.F., Timberlake, C.F. y Whiting, G.C. Progresos
actuales en los aspectos qumicos y efectos antimicrobiales de dixido de azufre
(SO
2
). Boletn de la O.I.V., 1979. Vol. 52, p. 1001-1022.
14. Reed, G. y Peppler, H. J. Tecnologa de levaduras; AVI Publishing Co.: Westport,
Connecticut, 1973, p. 366.
15. Hammond, S. M.y Carr, J. G. Actividad antimicrobial de SO
2
con referencia
particular a jugos de fruta fermentados y no fermentados. En: Inhibicin e
inactivacin de microbios vegetativos, (editado por F. A. Skinner y W. B. Hugo).
Londres: Ed. Academic Press, 1976, p. 89-110.













UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

PRCTICA 10: FERMENTABILIDAD DE DISTINTAS FUENTES DE
CARBONO POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y
SACCHAROMYCES SP

I. OBJETIVOS

Evaluar la capacidad de las levaduras para fermentar anaerbicamente distintas
fuentes de carbono
Determinar la velocidad de fermentacin utilizando un medio definido con
diferentes fuentes de carbono
Identificar que fuentes de carbono son fermentables por las levaduras
Saccharomyces cerevisiae
Controlar la fermentacin por produccin de CO
2
y decrecimiento en peso del
medio de cultivo

II. INTRODUCCIN

La fermentaciones un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso
de oxidacin incompleta, tpico de los organismos anaerbicos. Se realiza, pues, sin la
intervencin del oxgeno.
El proceso de fermentacin no slo incluye la desasimilacin anaerbica como la
formacin de alcohol, butanol-acetona, cido lctico, etc. sino tambin la produccin
industrial de vinagre, cido ctrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son el
resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentacin.

Durante la fermentacin, la energa obtenida procede, igual que en la respiracin aerobia,
de las reacciones de xido-reduccin habidas durante el catabolismo de la glucosa
(gluclisis), pero en la fermentacin las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a
una cadena cuyo aceptor final es el oxgeno, sino que los ceden directamente a un
compuesto orgnico que se reduce y es el producto caracterstico de cada fermentacin.

Inculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las bebidas
alcohlicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autctonas, las cuales estn
adaptadas a los medios de fermentacin de cada rea. Aunque se han encontrado
muchos gneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisiae
es la principal responsable de la fermentacin alcohlica, as como de la produccin de la
mayora de los compuestos aromticos. Algunos de los criterios de seleccin de las cepas
se basan en su capacidad fermentativa, medida como produccin de etanol, acidez y
consumo de azcares.


III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. Fermentacin
Son cambios qumicos en las sustancias orgnicas producidos por la accin de las
enzimas. Esta definicin general incluye prcticamente todas las reacciones qumicas de
importancia fisiolgica. Actualmente, los cientficos suelen reservar dicha denominacin
para la accin de ciertas enzimas especficas, llamadas fermentos, producidas por
organismos diminutos tales como el moho, las bacterias y la levadura. Por ejemplo, la
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

lactasa, un fermento producido por una bacteria que se encuentra generalmente en la
leche, hace que sta se agrie, transformando la lactosa (azcar de la leche) en cido
lctico. El tipo de fermentacin ms importante es la fermentacin alcohlica, en donde la
accin de la cimasa segregada por la levadura convierte los azcares simples, como la
glucosa y la fructosa, en alcohol etlico y dixido de carbono. Hay otros muchos tipos de
fermentacin que se producen de forma natural, como la formacin de cido butanoico
cuando la mantequilla se vuelve rancia, y de cido etanoico (actico) cuando el vino se
convierte en vinagre.
La fermentacin es un proceso que realizan muchos microorganismos, efectuando
reacciones sobre algunos compuestos orgnicos y liberando energa. Hay muchos tipos
diferentes de fermentacin, pero en condiciones fermentativas solamente se efecta una
oxidacin parcial de los tomos de carbono del compuesto orgnico y, por consiguiente,
slo una pequea cantidad de la energa potencial disponible se libera.

3.2. Metabolismo de azcares por levaduras
Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaerbicas, la fosforilacin a nivel del
substrato en la gluclisis es la nica fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y
posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molcula de glucosa convertida en dos
molculas de piruvato. La disimilacin de glucosa a piruvato va la gluclisis est unida a
la reduccin de NAD
+
en la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato-
deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilacin es logrado por
descarboxilacin de piruvato a acetaldehdo, el cul (NAD
+
) subsecuentemente acta
como un aceptor de electrones para la reoxidacin de NADH
2
.
1

El NADH
2
y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metablica de
Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vas asimilatorias. La
gluclisis juega un rol esencial en la disimilacin de azcar, pero tambin genera bloques
constituyentes para la biosntesis. Adems, aunque muchas reacciones biosintticas usan
NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH ocurren en la conversin
de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monmeros celulares, por
ejemplo en la biosntesis de aminocidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae sobre azcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la
reduccin de acetaldehdo a etanol y la reduccin del pool de quinona de la cadena
respiratoria) es muy fuerte. En contraste a varias otras levaduras, Saccharomyces
cerevisiae no puede directamente conectar la oxidacin de NADPH a la cadena
respiratoria.
1
El metabolismo redox no puede ser visto como un proceso aislado, su
regulacin est cercanamente conectada con reacciones centrales y perifricas en el
metabolismo de carbono y nitrgeno. Ello implica que el NADH
2
generado en estas
reacciones es reoxidado y la ocurrencia de NADH
2
/NAD
+
redox mitocondrial y citoslico
no es solamente relevante durante el crecimiento en respiracin aerbica, sino tambin
durante el crecimiento anaerbico en fermentacin
8
.

El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor terico, el cual
debe ser 51,1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la
formacin de sub-productos durante la fermentacin alcohlica y a la asimilacin de
azcar por la levadura, adems de esto el rendimiento es afectado por diversas variables
incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inculo y presencia ausencia de O
2
, en la
prctica 47,0 47,5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100 gramos de
azcar fermentado.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

IV. Culturas, materiales y reactivos.

Levadura Saccharomyces
cerevisiae
10 g Vasos de precipitacin de
200ml
04
Glucosa, maltosa, sucrosa 100g c/u Balanza analtica 01
Fructosa, lactosa, almidn 100g c/u Tubos de ensayo 30
Extracto de levadura 5.0 g/L Algodn Rollo
KH
2
PO
4
4 g/L Bagetas 05
HCl al 5% -- Esptulas 02
NaOH al 5% --- Pizetas 01
Agua destilada 12 L Lapicero rotulador 01
Matraces Erlenmeyer de 0,5L 10 Cinta mazkin 01
Matraces Erlenmeyer de 1ml 02 Mechero Bunsen 02
Pipetas de 10 ml 03 Gradillas 02
Pipeta de 20ml 04
Fuente: elaboracin propia

V. PARTE EXPERIMENTAL

Preparacin de inculo: Preparar 200 ml de una solucin que contenga: 0,5% de
extracto de levadura, 0,4% de KH
2
PO
4
, luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15
libras/pulg
2
, agregar aspticamente 10 g de levadura de panadera Saccharomyces
cerevisiae y agitarlo

Medio de fermentacin: La referencia es; 1L de una solucin debe contener: Fuente de
carbono 20 g; extracto de levadura 0,5%; KH
2
PO
4
0,4%; (NH
4
)
2
SO
4
1,2 g.

Se trabajar en 2 grupos

Para la determinacin de la velocidad de fermentacin

Cada grupo elegir 2 3 azcares para la prctica. En 2 3 Erlenmeyer de 0,5 L se
prepara el medio de fermentacin (0,3 L) de composicin citada anteriormente; el pH se
ajusta a 3,8 con HCl al 5% NaOH al 5%, se tapa con algodn y luego se esteriliza a 121
C por 20 minutos a 15 libras/pulg
2
, seguidamente se deja enfriar hasta alcanzar los 27 C
(temperatura ptima para el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae). Luego
aspticamente con una pipeta estril cada Erlenmeyer se inocula con la solucin de
levadura (4% del volumen total de medio de fermentacin) y se incuba a 27C durante
todo el proceso.

Para ensayos de fermentabilidad de fuentes de carbono

Cada grupo determinar la fermentabilidad de fuentes de carbono como: sucrosa,
maltosa, fructosa, almidn, almidn y lactosa, los ensayos se harn por triplicado por cada
fuente de carbono. Colocar en cada tubo de ensayo de 8 10 ml de medio de
fermentacin, ajustar el pH a 3,8 con HCl al 5% NaOH al 5%, taparlos con algodn y
cubrirlos con papel aluminio, no olvide rotular en cada tubo de ensayo que tipo de fuente
carbonada est contenido. Una vez preparado los tubos de ensayo conteniendo los
medios de fermentacin se esterilizan a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg
2
,
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

seguidamente se deja enfriar para luego inocular aspticamente con un asa de siembra
utilizando la solucin de levaduras preparada al inicialmente. Una vez inoculado los tubos
de ensayo se colocan en una gradilla y se llevan a incubacin por 48 horas.

Mediciones:

1. Para los ensayos de velocidad de fermentacin, se toma el peso inicial del medio
de cultivo correspondiente a 300ml y cada hora se vuelve a pesar el Erlenmeyer,
se anota el intervalo en el que se toma cada medicin y el peso neto del medio de
cultivo en ese instante (no olvide al inicio pesar el Erlenmeyer ms el tapn), y se
construye una grfica tiempo peso.

2. Observacin de la produccin de CO
2
por Saccharomyces cerevisiae en los tubos
de ensayo a las 48 horas. Tomar como referencia las siguientes consideraciones:

Produccin de CO
2
: Intensa: +++, moderada: ++, dbil: +
Formacin de pelcula sobre la superficie del medio lquido: Intenso: ***,
moderado: **, dbil: *

VI. RESULTADOS

Tabla 01: Evaluacin de la fermentacin por Saccharomyces cerevisiae

Reacciones durante
la fermentacin
Carbohidratos
Tiempo
Almidn Sacarosa Maltosa Fructuosa lactosa
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia
VII. Tabla 02: Evaluacin de la fermentacin por por levaduras aisladas

Reacciones durante
la fermentacin
Carbohidratos
Tiempo
Almidn Sacarosa maltosa fructuosa Lactosa
Formacin de CO
2


2
4

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez

espuma
Formacin de CO
2


4
8

h
o
r
a
s

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de
espuma

Fuente: elaboracin propia
VIII. DISCUSIONES
IX. CONCLUSIONES
X. CUESTIONARIO.

1. Cul es la importancia de controlar el desprendimiento de CO
2
en una
fermentacin?
2. Qu comentarios puede hacer acerca de la fermentabilidad de las diferentes
fuentes de carbono por Saccharomyces cerevisiae?
3. Qu es la fase lag y que factores influye en su duracin?
4. Qu puede comentar acerca de la velocidad de fermentacin con diferentes
fuentes carbonadas?

XI. BIBLIOGRAFA
1. Kappeli, O. Regulacin del metabolismo de carbono en Saccharomyces
cerevisiae y levaduras relacionadas., 1986. Revista: Adv. Microbiol. Physiol. Vol.
28, p. 181-209.
2. Van Urk, H., Bruinenberg, P. M., Veenhuis, M., Scheffers, W. A. y Van Dijken, J.
P. Capacidad respiratoria mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae CBS 8066
y Candida utilis CBS 621 crecidos bajo limitacin de glucosa., 1989. Revista:
Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 56, p. 211-220.
3. Petrik, M., Kappeli, O. y Fiechter, A. Un concepto amplio sobre el efecto de
glucosa en levaduras Saccharomyces uvarum, relacin de un trmino amplio y
simple de regulacin., 1983. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 129, p. 42-49.
4. De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras., 1966.
Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156.
5. Van Dijken, J. P. y Scheffers, W. A. Balance redox en el metabolismo de
azcares por levaduras., 1986. Revista: FEMS Microbiol. Rev. Vol. 32, p. 199-
224.
6. Pronk, J. T., Wenzel, T. J., Luttik, M. A., Klaassen, C. M., Scheffers, W. A.,
Steensma, H. Y. y Van Dijken, J. P. Aspectos energticos del metabolismo de
glucosa en un mutante piruvato-dehidrogenasa negativo de Saccharomyces
cerevisiae., 1994. Revista: Microbiology Vol. 140, p. 601-610.
7. Verduyn, C. Fisiologa de levaduras en relacin al rendimiento del crecimiento.,
1991. Revista: Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 60, p. 325-353.
8. Bisson, L. F. Metabolismo de azcares por levaduras, en la microbiologa y
biotecnologa del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers, 1993, p.
55-75.