You are on page 1of 30

Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot

1. Pendahuluan
Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk
memproduksi protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot
yang dikloning. Akan tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang
disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya
aktiftas biologi. Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur
pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa yang bersiat
toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan
temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat
mengkontaminasi produk.
!ntuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah
mengembangkan sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi,
serangga atau sel mamalia untuk memproduksi protein-protein
terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga dapat digunakan
oleh manusia atau binatang dengan "umlah yang banyak dan
stabil# akti secara biologi untuk studi biokimia, biofsik, dan
struktur# dan protein yang digunakan untuk proses industri.
Selan"utnya, protein manusia yang ditu"ukan untuk penggunaan
medis harus identik siatnya dengan protein nati.
$etidakmampuan prokariot untuk memproduksi %ersi autentik
dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan
protein yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifkasi
pasca translasi. &ada eukariot terdapat en'im &rotein Disulfda
(somerase (&D() yang mengkatalisis pembentukan ikatan disulfda
pada protein. &embentukan ikatan disulfda yang menyimpang
akan merubah konfgurasi protein, sehingga menyebabkan protein
tidak stabil dan kehilangan aktiftas.
)erdapat beberapa tipe modifkasi pasca translasi. *eberapa
urutan asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui
pemotongan proteolisis protein precursor untuk menghasilkan
1
protein ungsional. &enambahan gula spesifk (glikosilasi) terhadap
asam amino tertentu merupakan modifkasi utama yang
memberikan stabilitas dan siat pengikatan yang khusus terhadap
protein. +likosilasi yang umum ter"adi adalah pengikatan gula
spesifk ke gugus hidroksil dari asam amino serin atau asparagin
(O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (N-linked
glycosylation) (gambar ,). Sekitar -./ protein mamalia mengalami
glikosilasi.
Gambar 1. *eberapa contoh 0-link dan N-link oligosakarida pada
ragi (A), serangga (*) dan mamalia (1). ) adalah threonin, S adalah
serin, N adalah asparagin dan 2 asam sembarang asam amino.
3onosakarida4oligosakarida yang berbeda.dilambangkan oleh
bentuk yang berbeda.
$enyataanya tidak ada sel inang eukariot yang eekti secara
uni%ersal, dimana proses modifkasi ter"adi dengan benar untuk
setiap protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin
menambahkan gula yang tidak la'im ke asam amino yang tidak
tepat sehingga menghasilkan protein antigen atau mungkin protein
yang mempunyai ungsi yang tidak tepat. 5alaupun beberapa
2
protein rekombinan, mungkin memiliki siat-siat yang tidak cocok
untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanaatkan untuk
penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang
berbeda harus dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat
mensintesis protein rekombinan yang ungsional dan dalam "umlah
besar. &emilihan %ektor ekspresi tergantung pada kualitas protein
rekombinan yang akan diproduksi, penggunaannya, dan biaya
produksi dan purifkasi "uga penting untuk dipertimbangkan.
&ada prinsipnya %ektor ekspresi eukariot tidak berbeda
dengan %ektor ekspresi prokariot. 6ektor ekspresi eukariot memiliki
promotor eukariot yang men"alankan transkripsi gen yang
dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang
dapat menyebabkan m7NA mengalami poliadenilasi, dan gen
penanda untuk menyeleksi klon yang positi. $arena prosedur DNA
rekombinan secara teknik sulit untuk dilakukan menggunakan sel
eukariot, kebanyakan %ektor eukariot merupakan suttle vector
dengan dua origin of replication (07() dan gen penanda seleksi.
Salah satunya berungsi di E. Coli dan yang lain berungsi di sel
inang eukariot. 8ika %ektor ekspresi eukariot akan digunakan
sebagai plasmid, maka %ektor itu harus mempunyai 07( eukariot.
Alternati lain, "ika %ektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom,
maka harus mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan
pada inang untuk memalisitasi insersi ke kromosom.
2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae.
Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk
ekspresi gen eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut9
,. *er-sel tunggal dan sudah dipela"ari secara genetik maupun
fsiologi.
:. *eberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini
dan dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung
3
plasmid yang disebut plasmid :;m dan dapat digunakan
sebagai %ektor ekspresi.
-. S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifkasi pasca
translasi.
<. 7agi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. 8adi
apabila protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan
secara ekstraselular, maka produk dapat segera di purifkasi.
=. $arena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri
makanan, S. cerevisiae sudah didatarkan oleh !.S >ood and
Drug Administration sebagai organisme ?generally recognize
as safe@ (+7AS).
0leh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi
agen terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak
membutuhkan penelitian secara ekstensi seperti yang diwa"ibkan
untuk inang yang belum ter"amin keamanannya. Dewasa ini
terdapat se"umlah protein yang telah diproduksi di S. cerevisiae,
dan digunakan secara komersial sebagai %aksin, agen terapeutik,
dan untuk diagnosa (table ,). Sebagai contoh lebih dari =./ suplai
insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.
Tabel 1
&rotein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S.
cerevisiae.
Protein rekombinan Kegunaan
Antigen permukaan %irus hepatitis *
&rotein circumsporo'oide malaria
An%elope protein B(6-,
6aksin
&rotein %irus hepatitis 1
Antigen B(6-, diagnostik
>aktor pertumbuhan epidermal
(nsulin
insulin-like growth actor
&latelet-deri%ed growth actor
Agen terapetik
untuk manusia
4
&roinsulin
>ibroblast growt actor
+ranulocyte-macrophage colony-stimulating
actor
C, antitripsin
aktor koagulasi darah 2(((a
hirudin
human growth actor
human serum albumin
2.1. Vektor untuk S. cerevisiae
)erdapat tiga kelas utama %ektor ekspresi untuk S. cerevisiae9
episom atau plasmid, yaitu %ektor Deast Apisomal plasmid EDApsF,
%ektor integrasi (Deast (ntegrating plasmid EDipsF dan Deast Artifcial
kromosom EDA1sF. 6ektor-%ektor ini telah digunakan secara
ekstensi untuk memproduksi protein heterolog intra atau
ekstraselular.
6ektor DAp direkayasa dari plasmid :;m dengan "umlah copy tinggi.
Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan
asam amino tertentu (histidin, triptoan atau leusin) atau
nukleotida urasil untuk pertumbuhan. Strain ini disebut bersiat
auGotro karena medium pertumbuhan harus diberi suplemen
dengan nutrient spesifk. Dalam prakteknya %ektor ini dilengkapi
dengan %ersi gen wild type yang men"adi komplemen dari gen yang
dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila plasmid DAp dengan gen
E!" wild type, ditransormasi ke sel inang mutan leu" dan
kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan
leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh.
Se"umlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil
untuk efsiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam %ektor
ragi. &ada umumnya %ektor-%ektor ini dapat diregulasi dengan
ketat. &romotor yang dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi
se"umlah besar protein rekombinan selama pertumbuhan skala
besar. Dalam kasus ini promotor yang diregulasi oleh galaktosa,
merespon sangat cepat penambahan galaktosa, yang menaikkan
efsiensi transkripsi sampai ,...G. &romotor yang dapat direpresi,
5
konstituti dan promotor hibrida yang menggabungkan siat
promotor yang berbeda "uga tersedia. )ingkat ekspresi maksimal
tergantung pada efsiensi terminasi transkripsi. &ada umumnya
untuk %ektor DAp urutan terminator dan promotor diambil dari gen
yang sama.
!rutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi
segmen asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan
urutan pemula) yang memasilitasi per"alanan protein rekombinan
melewati membran sel dan pelepasan protein ke luar sel. Alasan
utama modifkasi ini adalah lebih mudahnya memurnikan protein
yang disekresikan dibandingkan protein yang terdapat dalam lisat
sel. !rutan pengenal yang umum untuk S. cerevisiae diambil dari
gen α mating factor. !rutan pengenal sintetik "uga sudah dirancang
untuk menaikkan "umlah sekresi protein. !rutan lain yang
menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis,
dan menyediakan urutan asam amino spesifk (a#nity tag) yang
digunakan untuk purifkasi secara selekti, dapat digabungkan ke
urutan pengode gen heterolog. Asam amino tambahan ini
dilengkapi oleh sisi pemotongan protease sehingga bisa dipotong
dari protein rekombinan setelah dimurnikan.
Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-
kadang tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar (H ,. I)
walaupun diberi tekanan. !ntuk mengatasi masalah ini, peneliti
telah mengu"i apakah integrasi gen heterolog dapat menyediakan
sistem produksi yang dapat diandalkan. &endekatan yang berbeda
telah dilakukan untuk ko-integrasi klon dan gen penanda seleksi ke
kromosom S. cerevisiae . Iebih "elasnya gen penanda seleksi
ungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan
pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifk untuk ragi, di
insersikan antara dua segmen DNA yang berasal dari u"ung gen
non esensial pada ragi. &ada contoh ini, plasmid tidak selalu
membawa 07( yang berungsi pada sel ragi. &lasmid dipotong pada
6
u"ung dari dua segmen ragi. Setelah transormasi, melalui peristiwa
rekombinasi ganda ter"adi insersi DNA dengan dua gen ke sisi
kromosom spesifk (gambar :). DNA plasmid dilinearisasi karena
DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA sirkular untuk
berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak terintegrasi
hilang selama pembelahan sel. $ekurangan utama strategi ini
adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.
Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan
%ektor D(p. +en marker seleksi (IA!:) dan gen yang diinsersi (+0()
diinsersikan ke %ektor diantara dua segmen yang merupakan u"ung
gen nonesensial ragi (A, dan A:). !rutan ini mengalami
rekombinasi dengan kromosom sehingga +0( dan IA!: terintegrasi
ke kromosom.
*eberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan
"umlah gen heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan
DNA yang berulang. $ira-kira terdapat :.. copy urutan DNA untuk
7NA ribosom (r7NA) dan sekitar <.. copy urutan J pada genom S.
cerevisiae. !rutan J merupakan bagian dari DNA yang non
7
esensial, yang diambil dari retrotransposon. 7etrotransposon
merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi. 3olekul 7NA
ini berperan sebagai templat untuk re%erse transcriptase, dan
urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom
pada sisi yang berbeda. &ada studi awal, ,. copy gen yang
diinsersikan ke urutan J memproduksi se"umlah rekombinan
protein.
6ektor DA1 dirancang untuk mengkloning segmen DNA
dengan ukuran besar (,.. kb), yang kemudian dipertahankan
sebagai bagian dari kromosom dalam sel inang. Sistem DA1 sangat
stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fsik genom manusia,
analisis unit transkripsi yang besar dan pembentukan perpustakaan
genom yang mengandung DNA dari kromosom manusia. 6ektor DA1
menyerupai kromosom karena mempunyai urutan yang berperan
sebagai 07( (autonomous replicating se$uence), urutan centromer
ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi setelah linearisasi DNA
yang berungsi sebagai telomer kromosom untuk mempertahankan
kestabilan kromosom. (gambar :). Dalam beberapa kasus, input
DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. )anpa adanya
produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima
ditumbuhkan pada medium khusus. *eberapa %ector DA1
mengandung gen marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi
cloning. DA1 tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk
produksi protein heterolog komersial walaupun punya potensi untuk
produksi se"umlah besar protein tunggal dari gen yang punya
"umlah copy banyak atau protein heterolog dengan subunit
berbeda.
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S.
cerevisiae
$ebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae
mempunyai dasar yang sama. &roduksi en'im manusia superoksida
8
dismutase akan digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida
merupakan produk samping dari penyediaan oksigen pada
organisme aerob. &ada manusia anion ini membantu merangsang
respon inKamasi dari agosit dan untuk mengarahkan lekosit ke sisi
ineksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu banyak, turunannya
dapat menyebabkan kerusakan sel. !ntuk meminimalkan eek
cytoto%ic, en'im 1u4Ln superoksida dismutase (1u4Ln-S0D)
mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion
hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian
didegradasi men"adi air dan oksigen oleh katalase atau
peroksidase. Anion superoksida "uga dihasilkan bila darah masuk
kembali ke organ-organ (reperusion) setelah kehilangan darah
selama proses operasi. !ntuk mencegah hal ini, dokter
berspekulasi bahwa 1u4Ln-S0D dapat dimasukkan ke organ yang
sedang mengalami reperusi. 1u4Ln-S0D mungkin bisa bertindak
sebagai agen terapi terhadap penyakit-penyakit inKamasi seperti
osteoarthritis, rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing
spondylitis. !ntuk penggunaan ini bentuk nati dari 1u4Ln-S0D
lebih disukai untuk mencegah respon immunologi yang merugikan
yang mungkin dihasilkan dari penggunaan en'im dari spesies lain.
&ada awalnya, cDNA untuk 1u4Ln-S0D manusia di kloning di
sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli
membuang N terminal metionin dari protein 1u4Ln-S0D, dan asam
amino selan"utnya (alanin) tidak di asetilasi, seperti yang terdapat
pada sel manusia. Sehingga kemudian, cDNA 1u4Ln-S0D manusia
dikloning ke %ektor DAp (gambar -). 6ektor DAp mengandung9 (,)
gen untuk biosintesis leusin (E!")# (:) 07( plasmid : ;m# (-) gen
resistan ampisilin (Amp
r
)# (<) 07( dari E. Coli# dan (=) cDNA 1u4Ln-
S0D manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor gen
gliseraldehid osat dehidrogenase (+A&Dp) dan urutan yang
mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi m7NA
dari gen yang sama (+A&Dp). Strain ragi dengan leusin deekti
9
(leu:) ditransormasi dengan %ektor ini, dan sel di tumbuhkan pada
medium tanpa leusin. Banya sel dengan gen E!" ungsional (yang
terdapat pada %ektor) yang akan tumbuh. &romotor +A&D di
transkripsi secara konstituti selama pertumbuhan sel. &ada
percobaan ini sel ragi memproduksi 1u4Ln-S0D intraselular dengan
le%el tinggi, dan residu alanin pada N terminal di asetilasi seperti
protein yang sama pada manusia (+ambar -).
Gambar 3. 6ektor ekspresi S. cere%isiae. cDNA untuk gen 1u4Ln-
S0D manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen
gliseraldehid osat dehidrogenase (+A&Dp) ragi.
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae
Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae,
disekresikan ke luar sel. &rotein ini harus mempunyai urutan
pemula supaya bisa melewati sistem sekresi. $onsekuensinya
urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula
0-linked atau N-linked untuk aktiftas biologi harus dilengkapi
dengan urutan pemula. *iasanya urutan pemula dari gen yeast
mating factor type & (prepro-&-factor) diinsersikan pada bagian
10
depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini,
pembentukan ikatan disulfda yang tepat, pemotongan proteolitik
dari urutan pemula, dan modifkasi pascatranslasi yang tepat
sering ter"adi, dan protein rekombinan yang akti akan
disekresikan. Selama proses ini peptida pemula dibuang oleh
endopeptidase yang mengenali dipeptida Iys-Arg. $odon Iys-Arg
harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA, sehingga
setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan
memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal.
Strategi tambahan "uga sudah ditemukan untuk
meningkatkan sekresi protein rekombinan oleh S. cerevisiae.
Sebagai contoh, o%erproduksi &D( ('rotein (isul)de *somerase)
yang secara natural terdapat pada sistem en'im sekresi. &D(
menyebabkan ter"adinya pelipatan protein (folding) yang tepat
selama proses sekresi, sehingga &D( mungkin meningkatkan
pelepasan protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan
disulfda. !ntuk memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan
terminator transkripsi gliseraldehid osat dehidrogenase yang
konstituti ditempatkan pada u"ung gen &D( ragi yang dikloning
dalam %ektor D(p, dan diintegrasikan ke kromosom. Strain
transorman menun"ukkan peningkatan produksi &D( ,MG
dibandingkan dengan strain wild type. *ila sel yang meng-
o%erproduksi &D( ini ditransormasi dengan %ektor DAp yang
membawa gen platelet-growth factor + manusia, terdapat
peningkatan sekresi proten rekombinan ,.G lebih tinggi
dibandingkan dengan sel yang mempunyai le%el &D( normal.
Sehingga o%erproduksi &D( secara spesifk meningkatkan sekresi
protein dengan pembentukan ikatan disulfda.
3. Sistem ekspresi Pichia pastoris.
Akspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae telah
berhasil digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber
11
yang berbeda. Namun dalam beberapa kasus le%el ekspresinya
rendah. &ada contoh lain protein rekombinan mengalami
hiperglikosilasi dengan lebih dari ,.. residu manosa pada rantai
samping N-linked oligosakarida. $elebihan manosa ini sering
merubah ungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang
bersiat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi
pada S. cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma,
sehingga menambah biaya dan waktu untuk pemurnian.
Selan"utnya, bila densitas sel tinggi maka S. cerevisiae akan
memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel. Sebagai
konsekuensinya menurunkan "umlah protein yang disekresikan.
!ntuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain
dan sel eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang
eekti untuk produksi protein rekombinan.
Sebagai eukariot, &. pastoris memiliki berbagai manaat
seperti sistem ekspresi eukariot lain, seperti pemrosesan protein,
pelipatan protein, dan modifkasi pascatranslasi, serta mudah
dimanipulasi seperti E. coli dan S. cerevisieae. &enggunaannya "uga
mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan protein dengan le%el
tinggi.
'. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki
beberapa keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu9
,. '. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat,
yaitu promotor gen ,O-. yang mengkode en'im alkohol
oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada
metanol, -./ dari protein selular adalah alkohol oksidase.
Sedangkan bila tidak ada metanol, gen ,O-. tidak beker"a.
Selan"utnya promotor gen ,O-. dengan cepat merespons
penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain,
promotor ,O-. merupakan kandidat yang baik untuk
men"alankan transkripsi gen yang dikloning dan
memproduksi protein rekombinan dalam "umlah besar#
12
:. )ingkat sekresi protein rekombinan pada '. pastoris tinggi,
hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak
dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel# dan
-. '. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya
sendiri, sehingga memudahkan pemurnian protein
rekombinan yang disekresikan.
6ektor ekspresi '. pastoris pada umumnya memiliki ormat
yang sama. +en yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor
dan urutan terminator transkripsi dari gen ,O-. '. pastoris , 07(
dan gen marker seleksi dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi
(gambar <). Selain itu "uga terdapat penambahan urutan signal dari
gen osatase &B0, '. pastoris atau gen dari ragi lain yang
memasilitasi sekresi protein rekombinan. 6ektor '. pastoris pada
umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah
masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan "angka
pan"ang. +en asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke
kromosom spesifk melalui proses rekombinasi homolog antara DNA
pada %ektor dengan daerah yang homolog pada genom '. pastoris.
Gambar . 6ektor integrasi untuk &. pastoris. +en yang dikloning
(+0() diinsersikan diantara promotor dan terminator gen alkohol
oksidase (A02,).
$emampuan '. pastoris mensekresikan protein tertentu
dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi
13
tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol. 3etabolisme
yang dimaksud adalah oksidasi metanol men"adi ormaldehid
dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah
satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen
peroksida (B
:
0
:
). !ntuk mencegah siat racun dari B
:
0
:
, maka
metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus
yang disebut dengan peroksisom. $arena alkohol oksidase memiliki
afnitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi '.
pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan "umlah
sangat banyak ((n%itrogen, :..<).
Sistem ekpresi '. pastoris telah digunakan untuk
memproduksi lebih dari ,.. protein akti dari bakteri, "amur,
in%ertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia, termasuk manusia
()abel :). &rotein-protein rekombinan ini, seperti antigen
permukaan hepatitis *, serum albumin manusia, dan /ovine
lysozyme, memiliki siat identik dengan protein natinya.
3enurut Shi-Bwei et al. (:..=), beberapa masalah yang
sangat potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam '. pastoris
adalah9 (,) "enis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan,
(:) "umlah gen yang digunakan, (-) efsiensi dan kekuatan
promoter, (<) efsiensi sinyal translasi, (=) "enis peptida sinyal, (M)
proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan
+olgi, (N) aktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (O)
hidrolisis protein oleh protease. *erdasarkan pertimbangan di atas,
peptida sinyal dan proses pelipatan protein men"adi perhatian
utama dalam peningkatan sekresi protein. !ntuk menyelesaikan
permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan
teknik manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat
sekresi dari protein dalam '. pastoris.
3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris.
14
6ektor p&(1L dan p&(1Lα merupakan %ektor dengan tingkat
ekspresi tinggi. $eduanya membawa marker Leosin, sehingga
seleksi dapat dilakukan secara langsung dan multi-copy integran
dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium.
Leosin "uga dapat digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi
penggunaan antibiotik lain dan mengurangi ukuran %ektor (+ambar
=).
Gambar !. &eta %ektor p&(1L4p&(1Lα
$edua %ektor ini memiliki9 (,) promotor A02,, untuk
mengekspresikan protein dengan le%el tinggi yang diinduksi oleh
metanol. (:) 1-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin
(MGBis) untuk memudahkan deteksi dan purifkasi protein. (-) gen
=P A02, yang berungsi untuk menargetkan integrasi ke genom '.
pastoris. p&(1Lα "uga mengandung signal sekresi a-aktor, yang
berungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium.
6ektor p+A&L dan p+A&Lα dapat mengekspresikan protein
tanpa menggunakan metanol. 6ektor ini lebih disukai untuk
ekspresi skala besar. 6ektor ini memiliki promotor +A& untuk
mengekspresikan protein dengan le%el tinggi, gen resistan Leosin
untuk seleksi langsung, dan 1-terminal c-myc epitope dan urutan
15
polihistidin (MGBis) untuk memudahkan deteksi dan purifkasi
protein. p+A&α "uga mengandung signal sekresi a-aktor, yang
berungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium
(+ambar M).
Gambar ". &eta %ektor p+A&L4p+A&Lα
3.2. #ntegrasi multi$op%.
*eberapa %ektor ekspresi untuk &ichia yang tersedia dapat
meningkatkan "umlah copy gen dalam &. &astoris. Sehingga protein
akan diekspresikan lebih tinggi. 6ektor p&(1-.=$ dan p(1Q$
membawa gen resistan kanamycin, sehingga seleksi transorman
yang membawa multi copy %ektor terintegrasi dapat dilakukan.
3ulti insersi dapat diidentifkasi melalui peningkatan resistensi
terhadap +eneticin.
Tabel 2
&rotein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi '. pastoris
Protein rekombinan Tingkat ekspresi
16
&mg'()
&rotein bakteri9
)oksin tetanus ragmen 1
a-amilase
):A peroksidase
>ragmen neurotoGin C.
/otulinum
,:...
:=..
:<N.
NO
&rotein 7agi9
1atalase I
+lukoamilase
Iipase
:-..
<..
M.
&rotein tumbuhan9
Bidroksinitril liase
Aeroallergen
5heat lipid transer protein
::...
N:.
M.
&rotein mamalia9
3ouse gelatin
Buman tumor necrosis actor
Buman (+>-,
Buman 1D--O
,<...
,....
M..
<==
<. Sistem ekspresi ragi %ang lain
&rotein heterolog untuk kepentingan industri dan pengobatan
"uga telah diekspresikan di yeast lain. 1ontohnya cDNA untuk rantai
C dan R globin dari hemoglobin A manusia, masing-masingnya
diklon diantara promotor metanol oksidase (302p) dan urutan
terminator transkripsi (302t) dari ragi metilotropik 0ansenula
polymorpha, dan ditempatkan secara berurutan pada %ektor
ekspresi. Secara kebetulan ter"adi integrasi dan setelah <. generasi
dihasilkan hemoglobin A ungsional yang memiliki tetramer yang
tepat yaitu dua rantai globin C dan dua rantai globin R.
Se"umlah spesies "amur ,spergillus "uga telah digunakan
secara ekstensi untuk produksi en'im komersial, seperti C-amilase,
lipase, amyloglukosidase, katalase, dan selulase untuk industri
makanan dan kertas. 8amur ini mensekresikan se"umlah besar nati
protein, tumbuh dengan cepat pada medium yang tidak mahal,
memproses m7NA eukariot dan melakukan modifksi pasca
translasi. *eberapa %ektor telah dicocokkan dengan elemen
17
pengontrol trankripsi dan translasi "amur, untuk ekspresi protein
rekombinan. 1hymosin manusia, laktoerin tikus, interleukin-M
manusia, Gantin oksidase Drosophilla dan protein lain telah
berhasil diproduksi pada sel inang "amur.
Sebagai kesimpulan sistem ekspresi ragi telah memberikan
peranan yang penting dalam memproduksi protein rekombinan
untuk kepentingan penelitian, industri, dan aplikasi medik.
*agaimanapun, pengalaman telah menun"ukkan bahwa tidak ada
satu sistempun yang dapat memproduksi %ersi autentik dari protein
heterolog, sehingga sistem ekspresi yang menggunakan insek atau
sel mamalia "uga dikembangkan.
!. Sistem ekspresi *a$ulo+irus untuk sel serangga
*aculo%irus mengin%eksi in%ertebrata, termasuk beberapa
spesies serangga. Selama siklus ineksi dihasilkan dua bentuk
*aculo%irus. &ertama single nucleocapsid (partikel %irus)
dikeluarkan dari sel yang terineksi, dan dapat mengineksi sel lain.
$edua, kluster dari nucleocapsid (%irion) yang terperangkap dalam
matriks protein. &rotein matriks ini disebut polyhedrin dan
keseluruhannya disebut polyhedron (+ambar N). Sekumpulan
polyhedron (polyhedra) dibebaskan ke lingkungan setelah sel lisis
dan mati. &olyhedron memproteksi %irion dari inaktiasi oleh agen-
agen asing. Selama siklus akhir ineksi *aculo%irus, protein
polyhedrin diproduksi dalam "umlah
besar. Sintesis polyhedrin dimulai
sekitar -M-<O "am setelah ineksi dan
berlan"ut selama <-= hari, sampai
ineksi selesai dan sel inang mati.
Gambar ,. Autographa caliornica
multiple nuclear polyhidrosis %irus. (A)
single nucleocapsid (partikel %irus)
dikeluarkan dari sel yang terineksi.
18
(*) kluster dari nucleocapsid (%irion) yang terperangkap dalam
matriks protein.
&romotor untuk gen polyhedrin (polyh) sangat kuat, dan tidak
dibutuhkan untuk produksi %irus. Sehingga penggantian daerah
pengkode polyhedrin dengan protein heterolog dan diikuti dengan
ineksi sel serangga, akan menghasilkan produksi se"umlah besar
protein heterolog. Selan"utnya, karena kesamaan sistem modifkasi
pascatranslasi antara serangga dan mamalia, maka protein
rekombinan yang dihasilkan akan sangat mirip dengan bentuk
aslinya.
*aculo%irus yang telah digunakan secara ekstensi sebagai
%ektor ekspresi adalah ,utographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (Ac3N&6). Sel yang umum digunakan adalah
Spadoptera frugiperda. Dalam sel ini promotor polyhedrin akti, dan
selama ineksi dengan *aculo%irus wild type, polyhedrin dengan
le%el tinggi di sintesis.
!.1. Vektor sistem ekspresi *a$ulo+irus
Iangkah pertama dalam produksi rekombinan Ac3N&6 adalah
merancang %ektor transer. )ranser %ektor merupakan plasmid E.
coli-based yang membawa segmen DNA dari Ac3N&6 yang
mengandung promotor polyhedrin dan sebagian segmen upstream
19
DNA Ac3N&6, multiple cloning site, terminator polihedrin dan
daerah signal poliadenilasi, serta sebagian segmen downstream
DNA Ac3N&6. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin telah di
delesi. Segmen upstream dan downstream Ac3N&6 menyediakan
daerah untuk rekombinasi homolog dengan Ac3N&6. +en yang
diinginkan di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan
kemudian dipropagasi ke E. coli (+ambar O).
$emudian sel serangga dalam kultur di ko-transeksi dengan
DNA Ac3N&6 dan %ektor transer yang membawa gen yang diklon.
Selama proses transeksi, ter"adi peristiwa dou/le crossover dan
gen yang diklon dengan promotor dan terminator polyhedrin
terintegrasi ke DNA Ac3N&6. 6irion yang tidak memiliki gen
polyhedrin menghasilkan 'ona yang berbeda pada lisis sel (plak
negati) yang merupakan rekombinan *aculo%irus.
Gambar -. 0rganisasi %ektor transer *aculo%irus (Ac36&6). +en
asing diinsersikan ke multiple cloning site (31S) yang berada
diantara promotor gen polyhedrin (&p) dan urutan terminasi
transkripsi polyhedrin (&t). !rutan =P Ac3N&6 DNA dan -PAc3N&6
DNA menyediakan urutan untuk integrasi unit ekspresi melalui
rekombinasi homolog ke genom Ac3N&6.
8ika gen lac1 E. coli yang mengkode β-galaktosidase
diinsersikan pada promotor baculo%irus yang di-on kan selama asa
awal sampai akhir siklus litik, dan men"adi bagian dari DNA yang
diinkorporasikan ke genom baculo%irus, maka plak rekombinan
akan men"adi biru, bila ke dalam medium ditambahkan substrat
untuk β-galaktosidase. &enambahan siklus ineksi terhadap plak
negati akan meningkatkan konsentrasi %irus rekombinan. &rotein
heterolog dipanen < sampai = hari setelah sel serangga terineksi.
20
Sistem ekspresi baculo%irus ini telah digunakan untuk memproduksi
lebih dari =.. protein heterolog.
!.2. Peningkatan hasil rekombinan ba$ulo+irus.
Iinearisasi dari genom Ac3N&6 sebelum transeksi ke sel
serangga, meningkatkan rekuensi plak rekombinan. &rosedur
sederhana ini menurunkan "umlah plak non-rekombinan, karena
linearisasi genom baculo%irus mengurangi ketidak eektian dan
dou/le crossover antara DNA Ac3N&6 linear dengan %ektor transer
sirkular. !ntuk men"amin proses linearisasi ter"adi secara konsisten,
sisi restriksi +su-, telah diinsersikan kedalam gen polyhedrin dari
genom Ac3N&6 wild type. &ada kondisi ini sekitar -./ plak
mengandung baculo%irus rekombinan.
!.3. Konstruksi suttle +ektor *a$ulo+irus E.$oli.sel
serangga.
Sistem yang memungkinkan untuk melakukan semua
manipulasi genetik untuk menghasilkan %ektor ekspresi baculo%irus
dalam E. coli "uga telah dikembangkan. Dalam kasus ini transeksi
sel serangga hanya dibutuhkan untuk produksi protein heterolog.
&lasmid E. coli dikonstruksi dimana suatu segmen DNA diapit oleh
urutan DNA yang berada diluar u"ung =P dan -P gen polyhedrin.
!rutan DNA pada segmen ini mengandung gen resistensi
kanamycin, sisi integrasi (sisi pengikatan) yang diinsersikan ke gen
ac1 tanpa merusak ungsinya dan 07( E. coli. &lasmid dan DNA
Ac3N&6 dimasukkan ke E. coli, setelah ter"adi peristiwa
rekombinasi, DNA antara segmen Ac3N&6 terintegrasi ke genom
Ac3N&6 tanpa kehilangan gen polyhedrin. (ou/le crossover antara
plasmid E. coli dan genom Ac3N&6 membentuk DNA single sirkular
yang dapat dipertahankan di E. coli sebagai plasmid, setelah
transeksi ke sel inang serangga, akan langsung memproduksi
21
baculo%irus. Shuttle %ektor baculo%irus E. coli-sel serangga ini
disebut bacmid.
Gambar /. $onstruksi bacmid rekombinan. &lasmid A. 1oli
digabungkan ke genom Ac3N&6 dengan cara double crosso%er
antara segmen DNA (=P dan -P) yang mengapit gen polyhedrin
untuk membentuk suttle %ektor yang dapat bereplikasi di A. 1oli
dan di sel serangga.
Dalam prakteknya hampir semua sistem ekspresi prokariot
dan eukariot membawa satu kopi gen yang diklon. Akspresi
simultan dari dua atau lebih gen yang diklon akan membentuk
protein multimer yang ungsional. &ada suatu studi se"umlah gen
dari %irus bluetongue (*)6) sukses diinsersikan ke %ektor
baculo%irus, sehingga terbentuk %ektor dengan tu"uh gen insersi.
Sistem ini ditest dengan %ektor yang membawa empat protein *)6.
Akspresi dari gen ini menghasilkan partikel yang secara struktur
mirip dengan %irus pada siklus perakitan. 6irus-like partikel ini
diin"eksikan ke domba dan menghasilkan antibodi terhadap protein
*)6 yang bertahan untuk waktu lama. Dalam studi yang lain,
antibodi manusia dan elemen antibodi di produksi dari %ektor dua
gen dengan urutan pengkode kombinasi %ariasi rantai
immunoglobulin ringan dan berat.
!.. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel
serangga.
22
Sel serangga tidak rutin menambahkan galaktosa atau
terminal asam sialat ke N-link glikoprotein. $onsekuensinya sistem
baculo%irus tidak dapat digunakan untuk memproduksi se"umlah
gliprotein mamalia. !ntuk mengatasi kekurangan ini, sel serangga
yang stabil diintegrasi dengan gen α-:,M-sialiltranserase dan
%ektor kloning baculo%irus diintegrasi dengan gen β-,,<
glaktotranserase mamalia, dibawah kontrol promotor early-stage.
&ada kondisi u"i, sistem ini mensintesis N-link glikan dengan
galaktosa dan asam sialat.
Dalam beberapa kasus, protein heterolog "uga tidak diproses
dengan tepat dari prekursor inakti yang besar men"adi bentuk akti
dalam sel serangga. Sel mamalia mengandung se"umlah en'im
pemroses protein (proprotein kon%ertase). cDNA untuk salah satu
en'im ini, yaitu urin, telah diklon kedalam %ektor ekspresi
baculo%irus dibawah kontrol promotor polyhedrin dan dikotranseksi
ke sel serangga dengan %ektor ekspresi baculo%irus lain dengan
urutan untuk preproprotein yang normalnya tidak diproses oleh sel
serangga. &ada kondisi ini ter"adi kon%ersi penuh men"adi protein
akti.
". Sistem ekspresi untuk sel mamalia.
Sistem ekspresi sel mamalia penting untuk produksi protein
heterolog dengan modifkasi pascatranslasi yang lengkap. Se"umlah
sel telah dikembangkan untuk tu"uan ini. 1ontohnya sel yang
diambil dari gin"al monyet hi"au dari Arika (10S), sel gin"al bayi
hamster (*B$), dan sel gin"al embrio manusia (BA$-:-Q), digunakan
untuk mempercepat ekspresi gen dan mempercepat produksi
se"umlah kecil protein heterolog, atau untuk mengetahui integritas
dari konstruksi selama pengembangan %ektor. Sel Chinnese
hamster ovary (1B0) telah umum digunakan untuk ekspresi gen
"angka pan"ang dan untuk produksi protein "umlah banyak. Se"auh
23
ini telah ratusan %ektor ekspresi mamalia yang dikembangkan, dan
semuanya tidak berbeda dalam disainnya.
6ektor ekspresi mamalia mengandung origin of replication
eukariot, biasanya dari %irus binatang, seperti simian %irus <.
(S6<.). !rutan promotor yang men"alankan gen yang diklon dan
gen marker seleksi, dan urutan terminasi transkripsi (signal
poliadenilasi) harus dari eukariot dan secara teratur diambil dari
%irus lain (cytomegalo%irus, S6<., %irus herpes simpleks) atau gen
mamalia (β-actin, metallothionein, thymin kinase, /ovine growth
hormone). &romotor konstituti yang kuat dan signal poliadenilasi
"uga dibutuhkan.
Gambar 10. &eta %ektor ekspresi untuk sel mamalia. 3ultiple
cloning site (31S) dan selectable marker gene (S3+) berada
dibawah kontrol promotor (p), poliadenilasi (pa), dan terminasi
transkripsi ())) untuk eukariot. (ntron (() mempercepat produksi
protein heterolog.
&romotor yang dapat diinduksi sering digunakan bila sintesis
secara kontinu dari protein heterolog bersiat toksid terhadap sel
inang. Akspresi dari gen yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan
menempatkan urutan intron antara promotor dan sisi kloning dari
konstruksi transkripsi (cassette). (ntron hibrida yang terdiri dari
bagian donor dan sisi akseptor dari dua gen yang berbeda cukup
eekti untuk berbagai sel. !rutan yang dibutuhkan untuk seleksi
dan propagasi dari %ektor ekspresi mamalia dalam E. coli diambil
dari %ektor kloning E. coli seperti p*7-::.
!ntuk mendapatkan hasil yang baik, maka gen yang akan
diklon ditambah dengan urutan kontrol translasi. (nisiasi translasi
24
pada eukariot tingkat tinggi tergantung pada urutan spesifk
nukleotida disekitar kodon start (A!+) yang disebut dengan urutan
$o'ak, yaitu9 11(Aatau+)11A!++. !rutan $o'ak biasanya diikuti
oleh urutan signal yang memasilitasi sekresi, urutan protein (tag)
untuk memudahkan purifkasi protein heterolog, dan urutan
pemotongan proteolitik sehingga tag dapat dibuang dari protein
heterolog. $odon stop ditambahkan untuk meyakinkan bahwa
translasi ter"adi pada lokasi yang tepat. Sedangkan urutan yang
mengandung =P dan -P untranslated region (!)7) penting untuk
efsiensi translasi dan kestabilan m7NA. Sintetik =P dan -P !)7 atau
dari gen β-globin manusia digunakan pada %ektor ekspresi
mamalia.
6ektor ekspresi sel mamalia pada umumnya membawa satu
gen yang mengkode polipeptida ungsional. *entuk akti dari
beberapa protein komersial mengandung dua rantai protein yang
berbeda. 1ontohnya, hormon tyhroid manusia merupakan dua
rantai polipeptida (heterodimer), hemoglobin, dan antibodi
merupakan tetramer dengan dua copy masing-masing subunit
(yaitu α:β: dan B:I:). +en atau cDNA dari masing-masing subunit
dapat diklon, disintesis dan masing-masing subunit dipurifkasi
secara terpisah, dan kemudian semua rantai polipeptida digabung
dalam tabung reaksi. Namun, hanya sedikit protein multi-rantai
yang dapat dirakit in %itro. Sebaliknya perakitan in %i%o dari protein
dimer atau tetramer cukup efsien. Sehingga se"umlah strategi
telah dikembangkan untuk produksi dua rekombinan protein dalam
sel yang sama.
Dua %ektor ekspresi mamalia, masing-masing dengan gen
atau cDNA untuk satu subunit dan gen penyeleksi yang berbeda,
dapat dikotranseksi ke sel inang. Sel yang ditranseksi
diperlakukan dengan kedua agen penyeleksi, dan sel yang
bertahan hidup membawa kedua %ektor. Dua "enis sistem %ektor
telah sukses digunakan untuk memproduksi protein rekombinan
25
dimer dan tetramer. Namun sering ditemui salah satu %ektor bisa
hilang, dan dua %ektor "arang dipertahankan dengan "umlah copy
yang sama, sehingga kedua subunit protein diproduksi dengan
"umlah yang berbeda, dan mengurangi "umlah produk akhir. !ntuk
mengatasi masalah ini, %ektor tunggal yang membawa dua gen
yang diklon telah dikembangkan. $edua gen ditempatkan dibawah
kontrol promotor dan signal poliadenilasi yang indipenden (dou/le
cassette vector). Alternati lain, untuk meyakinkan bahwa se"umlah
protein rekombinan yang sama disintesis, %ektor (%ektor bicistronik)
dikonstruksi dengan dua gen yang diklon terpisah satu dengan
yang lain oleh urutan DNA yang mengandung sisi pemasukan
internal ribosom ((7ASS internal ri/osomal entry site). (7AS
ditemukan pada genom %irus mamalia, dan menyebabkan
ter"adinya translasi simultan dari protein yang berbeda pada
mulekul m7NA policistronik. )ranskripsi dari konstruksi @gen a-(7AS-
gen b@ dikontrol oleh satu promotor dan signal poliadenilasi. &ada
kondisi ini @dua gen@ tunggal (bicistronik) ditranskripsi dan
translasi berlangsung dari u"ung =P m7NA untuk memproduksi
rantai pertama (rantai a) dan didalam elemen (7AS memproduksi
rantai kedua (rantai b). *iasanya, konstruksi %ektor ekspresi
mamalia memakan waktu lama dan membutuhkan usaha yang
gigih untuk mendapatkan produksi protein yang optimum.
26
Gambar 11. 6ektor ekspresi bicistronik. +en yang diklon (gen a
dan gen b) mengkode subunit protein dimer (ab). 3asing-masing
gen diinsersikan ke %ektor pada dua sisi urutan (7AS. $edua gen
tersebut dan (7AS ditranskripsi di bawah kontrol satu promotor,
urutan poliadenilasi dan terminasi transkripsi eukariot.
".1. Sistem marker pen%eleksi untuk +ektor ekspresi
mamalia.
*eberapa skema seleksi telah di disain yang ungsinya tidak
hanya untuk identifkasi sel yang mengalami transeksi, "uga untuk
meningkatkan produksi protein heterolog melalui amplifkasi "umlah
copy %ektor ekspresi. Sistem dihidroolat reduktase methotreGate
(DB>7-3)2) termasuk ke dalam kategori ini. DB>7 mengkatalisis
reduksi dihidroolat men"adi tetrahidroolat, yang dibutuhkan untuk
produksi purin. 3)2 merupakan inhibitor kompetiti dari DB>7.
Sensitiftas 3)2 dapat diatasi "ika sel memproduksi DB>7 berlebih.
*ila konsentrasi 3)2 meningkat dalam "angka waktu tertentu, gen
DB>7 dalam kultur sel akan diperbanyak. &ada protokol standar
DB>7-3)2, sel defsien DB>7 ditranseksi dengan %ektor ekspresi
yang membawa gen DB>7 sebagai marker seleksi dan kemudian
sel diperlakukan dengan 3)2. Setelah seleksi awal terhadap sel
yang mengalami transeksi, konsentrasi 3)2 ditingkatkan,
sehingga sel dengan "umlah copy tinggi %ektor dapat diseleksi.
1ara seleksi yang lain adalah menggunakan sistem glutamin
sintetase-metionin suloGimin (+S-3S2). +S terlibat dalam sintesis
glutamin, yang digunakan pada sintesis protein, produksi purin dan
pyrimidin, dan proses penting lain. 3S2 secara irre%ersibel
menghambat +S. Sel yang ditranseksi dengan %ektor yang
27
membawa gen +S, reristan terhadap eek toksik dari 3S2 dan
memiliki suplai akti +S yang cukup untuk prolierasi sel. Setelah
seleksi dengan 3S2, sel yang memproduksi protein heterolog
dengan le%el tinggi biasanya memiliki %ektor ekspresi tidak lebih
dari ,. copy. Se"umlah protein untuk penelitian dan terapi telah
diproduksi dengan sistem ini, termasuk dua antibodi yang telah
digunakan untuk terapi manusia. +en pengkode rantai berat dan
ringan dari monoklonal antibodi diklon menggunakan dua promotor
yang kuat dan gen +S di"alankan oleh promotor-medium pada
%ektor ekspresi. 3onoklonal antibodi ini telah digunakan untuk
terapi manusia dan tidak terdapat re"eksi organ.
Sebagai kesimpulan %ektor ekspresi mamalia eekti dan
serbaguna sebagai %ektor untuk ekspresi protein eukariot lain.
Namun produksi skala industri protein rekombinan oleh sel mamalia
yang direkayasa men"adi cukup mahal. Sebagai konsekuensinya
sistem ekspresi yang tidak terlalu mahal lebih disukai walaupun
protein rekombinan penting yang autentik hanya dapat diperoleh
dari sel mamalia.
28
D12T13 P4ST1K1
Ansari, A., 6. 1. Amery. ,QQO. *aculo%iruses, :,Q-:--. (alam 7.
7abley and 8. 3. 5alker (ed.) 2olecular +iomethods 0and/ook.
Bumana &ress (nc., )otowa, N.8.
*arnes, I. 3., 1. 3. *entley, and A. 8. Dickson. :.... Ad%ances in
animal cell recombinant protein production9 +S-NS0
eGpression system. Cytotechnology -:9 ,.Q-,:-.
1regg, 8. 3. ,QQQ. AGpression in the methylotropic yeast &ichia
pastoris, ,=N-,Q,. (alam 8. >ernande' and 8. &. BoeTer (ed.)
3ene E%pression Systems4 !sing nature for the ,rt of
E%pression. Academic &ress, (nc., San Diego, 1ali.
+lick, *.7., &asternak, 8.8. :..-. 3olecular biotechnology, principles
and applications o recombinant DNA. ,S2 'ress (5ashington
D1). ,M--,N-.
+eisse, S., and B. &. $ocher. ,QQQ. &rotein eGpression in mamalian
and insect cells, 3ethods An'ymol. -.M9,Q-<:.
(n%itrogen, A manual o methods or eGpresion o recombinant
proteins in 'ichia 'astoris, :..<. 1aliornia. N-,..
7obinson, A. S., Bines, 6., 5ittrup, $. D. ,QQ<. &rotein disulphide
isomerase o%ereGpression increases secretion o oreign
proteins in Saccharomyces cerevisiae. +io56echnology. ,:,
-O,--O<
Schult', I. D., 3arkus, B. L., Bomann, $. 8., 3ontgomery, D. I.,
Dunwiddier, 1. )., $niskern, &. 8., >reedman, 7. *., Allis, 7. 5.,
)uite, 3. >. ,QQ<. !sing molecular genetic to impro%e the
production o recombinant proteins by the yeast
Saccharomyces cerevisiae. ,nn. N. 7. ,cad. Sci. N:,, ,<O-,=N
Shi-Bwei, I., 5ei-(, 1., 1hia-1hin, S., 3argaret Dah-)syr, 1. :..=.
(mpro%ed secretory production o glucoamylase in 'ichia
29
pastoris by combination o genetic manipulation. +iochem.
+iophys. 8es. Comm. -:M, O,N-O:<
)uite, 3.>. and >reedman, 7.*. ,QQ<, (mpro%ing secretion o
recombinant proteins rom yeast and mammalian cells#
rational o empirical designU )rends in *iotechnology.
30