MICROBIOLOGIA I

DIAGNOSTICUL DE
LABORATOR AL INFECIILOR
AEROGENE
MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE
LABORATOR AL DIFTERIEI
DIFTERIA toxiinfecie acut, caracterizat
printr-o angin pseudo-membranoas cu efecte
toxice la distan (miocardul, SNC i rinichii).
Este provocat de mi/o din genul
Corynebacterium.
Genul Corynebacterium se caracterizeaz prin
prezena in componena peretelui celular:
- Acidului mezo-diaminopimelic
- Acizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi
de C)
- Coninutul GC ntre 46-74 %.
Prezint asemnri cu mi/o din genurile
Mycobacterium i Nocardia
Clasificarea genului Corynebacterium
I. Corinebacterii fitopatogene
II. Corinebacterii patogene pentru
animale, care afecteaz accidental
omul: C.pseudotuberculosis,
C.ulcerans
III. Corinebacterii cu tropism uman:
- Specie patogen: C.diphtheriae
(biovaruri gravis, mitis, intermedius)
- Specii comensale (specii
pseudodifterice, difteroizi):
C.xerosis, C.pseudodiphthericum,
C.jeikeium, etc
Caractere morfotinctoriale ale C.diphtheriae
Bacterii (bastonae) drepte sau puin
ncurbate, cu extremitile rotunjite sau
ngroate (aspect de halter sau de
mciuc). n frotiuri se aranjeaz ungiular, n
palisade sau sub forma caracterelor
chinezeti, cifre romane sau litere
majuscule: Y, M, N, V... Imobile,
asporogene, necapsulate.
Se coloreaz G+, pentru evidenierea
granulaiilor de volutin - Loeffler, Neisser
Caractere de cultur i biochimice
C.diphtheriae este o specie facultativ
anaerob, posed catalaz, citocromi a,b,c,
oxidazo-.
Temperatura optim de cultivare 37C, pH 7,4.

Medii de cultur elective:
- Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S,
mici, netede, opace, albe-cenuii, apar peste
16-24 ore de cultivare
- Geloz-snge
Medii de cultur selective difereniale
- Mediul Clauberg (geloz-snge cu telurit de
potasiu). C.diphtheriae gravis: colonii R, mari,
negre, crenelate, aspect de floare de
margaret, nehemolitice; mitis: colonii S,
mijlocii, negre, bombate, cu zon de hemoliz
- Mediul Tinsdale (geloz-ser-cistin-telurit de
potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun
- Mediul Bucin (geloz-snge cu hinozol) colonii
albastre
Medii de transport
- geloz-ser semilichid cu telurit de K
- Mediul OCST (ou-cistin-ser-telurit)
Activitatea biochimic a C.diphtheriae:
Proteolitic:
Ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul
Pizu), indol-.
Zaharolitic:
Gravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-
Mitis: glucoza+, amidon-, zaharoza-

Se disting 22 lizotipuri de C.diphtheriae i
multiple serogrupuri (antigen O
polizaharidic) i serovaruri (antigen K
proteic)

Factori de patogenitate
Toxina difteric- origine proteic, secretat
de tulpinile lizogene (profagi Tox+), n
prezena unor cantiti reduse de Fe.
Exotoxin tipic (fragmente polipeptidice A
i B). Mecanismul de aciune - stoparea
sintezei proteice prin inactivarea factorului
de elongare EF-2 (activitate de ADP-
riboziltransferaz). Conduce la moartea
celulei afectate.
Toxina difuzeaz n organism perturbnd
funcionarea diferitor organe (SNC, cord,
rinichi)
Poate fi transformat n anatoxin, utilizat
n vaccinare
Enzime de patogenitate: hialuronidaza,
neuraminidaza
Patogeneza i formele clinice de difterie
Sursa de infecie: bolnavul cu difterie i
purttorii sntoi de germeni
(colonizeaz rinofaringele, rareori
tegumentul sau conjunctiva).
Mecanismele i cile de transmitere:
- Direct pe cale aerogen (picturi) sau
contact cu plgi contaminate
- Indirect prin obiecte (jucrii, cri), praf
sau alimente contaminate (lactate)
La poarta de intrare bacteriile se
multiplic i provoac un focar
inflamator local, determinat de
aciunea toxinei, care fiind ulterior
difuzat pe cale limfo- i
hematogen provoac starea de
intoxicaie general.
Focarul inflamator se localizeaz n
faringe (angina difteric), mai rar n
laringe (crupul difteric), nas, urechi,
conjunctiv, mucoasa organelor
genitale, plgi cutanate.
Leziunile locale se caracterizeaz prin
inflamaie fibrinoas. Exotoxina
cauzeaz necroz, dilatarea vaselor i
creterea permeabilitii, eliminarea
fibrinogenului, care coaguleaz cu
formarea unei pseudomembrane
fibrinoase. Ea conine bacterii, hematii,
PMN i celule necrozate. Se detaeaz
dificil, nu se dizolv n ap, este
reproductibil in situ n cteva ore.
Membrana are tendin s se extind.
n forma malign difteria este nsoit
de edem al gtului, semne toxice i
paralizia vlului palatin.
Intoxicaia general afecteaz SN
(disfagie, paralizii), sistemul cardio-
vascular (miocardite), suprarenalele
(insuficien a suprarenalelor), rinichii
(nefroz)
Tulpini de C.ulcerans pot produce
toxin identic cu cea difteric
Diagnosticul de laborator al
difteriei
Este URGENT!!!
Prelevate n funcie de forma clinic,
respectnd strict regulile de prelevare
i transport.
Metode de diagnostic
Examenul microscopic (Gram, Loeffler,
Neisser), microscopia imunofluorescent
Examenul bacteriologic (izolarea,
identificarea culturii pure). Studierea
toxigenezei obligator. Se efectueaz
prin RN cu ser antitoxic in vivo (cobai),
in vitro (RP Elek), sau depistarea genei
Tox n prelevat sau n cultura pur prin
PCR.
Examenul serologic retrospectiv,
- RA cu seruri perechi (I sptmn i a III) i
cultur de C.diphtheriae. Titru semnificativ
1:100 sau creterea titrului de Ac.
- Evaluarea titrului de antitoxine n serul
bolnavului. La debutul bolii el este absent
sau nu depete 0,5 UI/ml
Receptivitatea la difterie poate fi determinat
prin:
- Testul Schick (in vivo)
- RN in vitro
- RHAI
- ELISA
Titru antitoxinelor > 0,1 UI/ml protector
Titru inferior 0,01 UI/ml lipsa proteciei
Tratamentul difteriei
1. Seroterapie precoce (ser antitoxic
antidifteric, Ig). Neutralizeaz
activitatea toxinei, blocnd fixarea
ei pe receptorii celulari.
2. Antibioticoterapie (macrolide,
tetracicline, cloramfenicol,
aminozide, beta-lactamine). Asigur
eradicarea germenilor.
3. Tratament simptomatic
Profilaxia specific a difteriei
Vaccinarea obligatorie a copiilor conform
calendarului de vaccinri cu anatoxin
difteric. Exist vaccinuri asociate:
ADT, ADTP. Vaccinarea primara cu
ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-
24 luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15
ani cu ADT.
Recent a fost obinut un vaccin sintetic
antidifteric. Reprezint un polipeptid
situat la jonciunea fragmentelor A i B
a toxinei difterice, o molecul peptidic
purttoare i un adjuvant sintetic.
MICOBACTERIILE. MICROBIOLOGIA I
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
TUBERCULOZEI
Familia Mycobacteriaceae
Genul Mycobacterium
Specii:
I. Responsabile de tuberculoza uman:
M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum
(complex tuberculosis)
II. Agentul leprei: M.leprae (strict uman)
III. Micobacterii atipice, condiionat
patogene: M.avium, M.ulcerans,
M.fortuitum, M.kansasii, M.marinum, etc.
Cauzeaz micobacterioze la persoane
imunocompromise
IV. Micobacterii nepatogene: M.smegmatis,
M.gastri, M.phley

Caracteristica general a micobacteriilor:
bastonae G+ drepte sau uor ncurbate,
necapsulate, asporogene, imobile, acido-
alcoolorezistente prin tehnica de colorare
Ziehl-Neelsen.
M.tuberculosis este o bacterie patogen
strict uman, responsabil de tuberculoz.
Este sensibil la cldur, lumin solar
direct, raze UV sau X. Rezistent la frig sau
desicare. Este puin sensibil la acizi, baze
(se utilizeaz n decontaminarea
prelevatelor) sau detergeni i foarte
sensibil la soluia de alcool de 70.
Caractere morfotinctoriale
M.tbc este un bastona fin sau uor
ncurbat, n frotiu se observ izolat, n
grmezi sau corzi. Se coloreaz in rou
prin tehnica Ziehl-Neelsen
Caractere de cultur
M.tbc este o bacterie strict aerob, foarte
exigent la cultivare. Toate mediile de
izolare au la baz ou coagulat. Mediul de
referin Lowenstein-Jensen (ou,
glicerin, asparagin). Alte medii solide
Popescu (acid glutamic in locul
asparaginei), Finn (glutamat de Na).
Mediul lichid Sauton. Contine saruri
minerale, asparagina, glicerina. M.tbc
creste in 8-10 zile sub forma de voal.
Micobacteriile patogene cresc lent
(perioada de generaie 20 ore), la 37C,
pH 6,8-7,0.
Coloniile de M.tbc apar peste 2-4 sptmni,
sunt colonii R, rugoase, friabile,
conopidiforme, opace, de culoare crem-
bej.
M.bovis i M.africanum formeaz colonii S,
mici, netede, nepigmentate, vizibile peste
4-8 sptmni.

Activitatea biochimic a
micobacteriilor patogene
- Toate micobacteriile patogene produc
o catalaz termolabil, distrus la
68C timp de 20 min. Celelalte
micobacterii posed catalaz
termostabil.
- M.tbs i M.bovis hidrolizeaz ureea
- M.tbc produce acid nicotinic (niacin),
reduce nitraii n nitrii. M.bovis nu
manifest astfel de activitate.
Compoziia chimic i
factorii de patogenitate ai micobacteriilor
Lipidele constituie 20-45% din masa celulei.
Sunt reprezentate de acizi micolici i ceruri
(condiioneaz transformarea macrofagelor n
celule epitelioide i celule gigante Langhans).
Cord-factorul (sulfo-lipid) perturba respiraia
n mitocondrii, induce cultivarea n corzi
(cosie) a M.tbc. Polizaharidele joac un rol
important n formarea Ac serici, conferind
specificitatea imunologic. Proteinele
reprezint suportul imunitii celulare i a
hipersensibilitii tardive.
Patogeneza i formele clinice
de tuberculoz
Sursa de infecie omul bolnav cu TBC cu
leziuni pulmonare cavitare deschise n
bronsii (M.tbc, M.africanum) sau bovinele
bolnave (M.bovis).
Transmiterea se efectueaz pe cale aerian
(picturi, praf). Rareori este posibil
contaminarea prin obiecte, alimente (lapte
nepasteurizat) sau mini contaminate.
Receptivitatea este influenat de vrst i
factorii de mediu: carene nutritive,
alcoolism, tratament imunosupresiv, etc
Primoinfecia tuberculoas.
Reprezinta un ansamblu de manifestari clinice,
umorale si anatomice care se desfasoara in
organism in urma primului contact cu agentul TBC.
Dup contaminare (mai frecvent in copilarie), la poarta
de intrare (90% - tractul respirator), bacteriile sunt
captate de macrofage n care se multiplic (bacterii
facultativ intracelulare, mpiedic formarea
fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare
nespecific. Peste cteva sptmni (4-12) se
dezvolt o imunitate celular i leziunea exsudativ
evolueaz n leziune granulomatoas. Sub aciunea
unor citokine macrofagii activai se difereniaz n
celule epitelioide i celule multinucleate gigante. Ele
sunt nconjurate de limfocite i fibroblaste. Acesta
este granulomul tuberculos, semn caracteristic
primo-infeciei. Infecia se extinde pe cale limfatic,
cu afectarea ganglionilor regionali.

- Primoinfecia inaparent. La cca 85%
leziunile se vindec i se pot autosteriliza.
Nici o expresie clinic sau radiologic.
- Tuberculoza primar subclinic. Dac
multiplicarea bacteriilor este masiv, n
leziunile tuberculoase se realizeaz o
necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent
are loc calcifierea tuberculomului (leziunea
este vizibil radiologic), cu autosterilizarea
spontan sau cu persistena unor bacterii
n leziune.
Consecinele primoinfeciei inaparente
sau subclinice: dezvoltarea imunitii
antituberculoase i a sensibilizrii
tuberculinice.
- Tuberculoza primar manifest necomplicat.
Pacienii au febr, astenie, pierdere n
greutate, etc. Etapa ganglionar poate fi
depit cu diseminri hematogene i
afectarea pleurei, meningelui, mduvei
osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot
evolua fie spre agravare, fie spre cicatrizare.
- Primoinfecia cu complicaii. Rareori (10%
cazuri), evoluia este defavorabil: masele
necrotice sunt evacuate n bronii, vase
sanguine, pleur sau pericard cu formarea
unei caverne, unde bacteriile se multiplic
intens. Fistulizarea ntr-un vas sangvin
disemineaz infecia sistemic (tuberculoza
miliar). Starea general este alterat, apare
febr, tuse, uneori hemoptizie. Bolnavul este
contagios, eliminnd bacterii cu sputa.
Tuberculoza secundar. Se manifest n
condiii de scdere a reactivitii imune,
reinfecii masive sau reactivarea unor focare
latente. Focarele noi apar n ritm lent i
evolueaz cronic fr tendin de vindecare
spontan.
Alte forme clinice de tuberculoz:
ganglionar, meningean, osteo-articular,
uro-genital.
Imunitatea antituberculoas este celular,
nesteril. Hipersensibilitatea tardiv
nsoete imunitatea celular. Ac circulani
nu au rol protector.
Diagnosticul de laborator al
tuberculozei
Prelevate: n funcie de forma clinic
n caz de necesitate se efectueaz
omogenizarea (decontaminarea) i
concentrarea prelevatelor.
Metode de diagnostic
1. Examenul microscopic frotiuri
colorate Ziehl-Neelsen (bastonae
purpurii izolate) sau cu auramin
(bastonase galbene pe fondul
negru).
2. Examenul bacteriologic izolarea culturii
pure pe mediile speciale, identificarea ei,
testarea sensibilitii la chimioterapice
(prin metoda diluiilor n mediu solid)
3. PCR pentru detectarea rapid a
micobacteriilor direct n prelevate
4. Intradermoreacia la tuberculin (reacia
Mantoux). Se cerceteaz starea de
hipersensibilitate cutanat la tuberculin.
Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o
cultur bulionic autoclavat de
M.tuberculosis.
Pe faa anterioar a antebraului se injecteaz
i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin n
volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore.
Reacia pozitiv se manifest printr-o
induraie i congestie cu diametrul superior
sau egal cu 5 mm. Interpretarea se
efectueaz n funcie de contextul clinic
Reacia + indic c subiectul a fost infectat
cu micobacterii (primoinfecie), a fost
vaccinat cu BCG sau este bolnav de
tuberculoz (n acest caz diametrul
depete 10 mm).
Reacia negativ exclude diagnosticul de
tuberculoz
Tratamentul tuberculozei
1. Antibiotice cu spectru larg: rifampicin,
streptomicin, kanamicin
2. Fluorochinolone
3. Chimioterapice care inhib sinteza acizilor
micolici (Izoniazida, Pirazinamida,
Etambutolul, Etionamida)
Exigenele terapiei antituberculoase: a
mpiedica selecia mutanilor rezisteni i a
steriliza definitiv focarul.
n acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4
droguri pe o perioad de 6-12 luni.
Profilaxia specific
Vaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El
reprezint o tulpin vie avirulent de
M.bovis. A fost obinut de Calmette i
Guerin n 1921 dup multiple repicri (230
pasaje) pe mediu cu cartof, bil i
glicerin.
Vaccinul se administreaz i/dermic la vrsta
de 4-5 zile de la natere. Revaccinarea
la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani
(persoanele cu reactia Mantoux negativa).
Revaccinarea se efectueaz la 7 ani
persoanelor cu proba Mantoux negativ.
MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE
LABORATOR AL TUSEI CONVULSIVE

Familia Halobacteriaceae
Genul Bordetella
Specii:
1. Bordetella pertussis (agentul tusei convulsive)
2. Bordetella parapertussis (agentul parapertusei)
3. Bordetella bronhiseptica (pneumonii,
bacteriemii)
4. Bordetella avium
5. Bordetella holmensii (izolat din hemoculturi)
6. Bordetella hinzii (izolat din prelevate
respiratorii)
7. Bordetella trematum (infecii cutanate i
auriculare)

B.pertussis agentul cauzal al tusei convulsive
Caractere morfobiologice
Cocobacterii G-, asporogene, imobile,
formeaz microcapsul, n frotiu se dispun
separat, n perechi sau lanuri scurte.
Reprezint mi/o strict aerobe, foarte
pretenioase la cultivare.
Medii speciale de izolare:
- mediul Bordet-Gengou (geloz-snge cu
amidon i glicerin)
- geloz-cazein-snge-crbune activat
Mediul de transport Kuzneov (soluie
tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2%
crbune activat)
Peste 3-5 zile de incubare n
atmosfer umed la 37 C apar
colonii S mici, bombate, lucioase, cu
aspect de picturi de mercur,
hemolitice (corespund bacteriilor
virulente faza I), forme R
avirulente, faza IV.
Coloniile de B.parapertussis apar n
48 ore, B.bronchiseptica n 24 ore
B.pertussis manifest activitate
biochimic redus: oxidaza+, nu
fermenteaz glucidele, ureaza-,
nitrat-reductaza- .
Structura antigenic a B.pertussis
este complex: exist Ag capsulare
polizaharidice, Ag proteice, Ag
fimbrial (hemaglutinina), Ag
lipopolizaharidic.
Factorii de patogenitate
1. Adezine:
- Hemaglutinina filamentoas
(purtat de pili). Permite ataarea
bacteriei la mucoasa tractului
respirator, de asemenea se fixeaz pe
macrofagi i limfocite.
- Aglutinogene. Proteine de
suprafa situate pe fimbrii. Particip
la ataarea B.pertussis la celulele
epiteliale.
- Pertactina. Protein a membranei
externe, permite fixarea pe
membrana celulelor eucariote
- Subunitatea B a toxinei
pertusice. Se fixeaz pe leucocite i
mpiedic migrarea lor spre focarul
inflamator.

2. Toxine
- Toxina pertussis (citotoxin de tip A-B).
Acioneaz asupra diferitor celule eucariote,
mrind concentraia intracelular de AMP
ciclic (n special n celulele epiteliale ale
TR). Provoac hiperlimfocitoz, sensibilizare
la histamin, hipersecreie de insulin.
- Adenilat-ciclaza-hemolizin. Hemolizina
provoac moartea macrofagelor i
monocitelor, adenilat-ciclaza perturb
activitatea bactericid a PMN, monocitelor
i macrofagelor i stimuleaz secreia sero-
mucoas a cilor respiratorii.
- Toxina dermonecrotic. Se elibereaz n
urma lizei bacteriene.
- Toxina citotraheal. Glicopeptid care
inhib sinteza ADN, provocnd distrugerea
celulelor ciliate
- Endotoxina

Patogeneza tusei convulsive
Sursa de infecie omul bolnav, n special n
perioada de debut al bolii.
Mecanismul de transmitere aerogen, prin
picturi
B.pertussis manifest tropism pentru mucoasa
cilor respiratorii: faringe, trahee, bronii,
bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului
ciliat mpiedic eliminarea mucusului, el fiind
eliminat doar prin tuse. Tusea survine din
cauza iritaiei mucoasei de ctre endotoxina
bacterian. Excitaia de lung durat a
receptorilor terminali ai nervului
pneumogastric determin un flux continuu
de impulsuri n bulbul rahidian, ce duce la
formarea unui focat de excitaie dominant. El
atrage excitaii nespecifice de la ali
receptori, fapt ce determin accesele de
tuse, care devin tot mai grave i mai
frecvente.
Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu
atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil,
persist i dup dispariia bacteriei din
organism.
n evoluia tusei convulsive se disting 4
stadii (perioade):
I. Perioada de incubaie (3-15 zile)
II. Perioada cataral, foarte contagioas.
Caracterizat prin tuse seac, rinoree (3-
14 zile)
III. Perioada convulsiv (paroxistic). Accese
de tuse spasmodic, epuizant, asociat
cu cianoz, vom, convulsii. (2-4
sptmni)
IV. Perioada de convalescen (2-4
sptmni)
Complicaii grave sunt posibile la copiii
sugari: bronho-pneumonii,
encefalite.

Imunitatea este durabil, umoral. Rol
protector au Ac anti-toxin pertussis
i anti-hemaglutinin filamentoas.
Diagnosticul de laborator
al tusei convulsive
Prelevate: mucoziti nasofaringiene sau
bronice, recoltate ct mai precoce.
Metode de diagnostic
1. RIF
2. Examenul bacteriologic (nsmnare cu
tamponul sau prin tehnic plcilor tuite)
3. Tehnnici de biologie molecular (PCR)
4. Examenul serologic (RA, RFC, ELISA).
Reaciile se pozitiveaz din sptmna a II
a perioadei convulsive. Se examineaz
seruri perechi prelevate la interval de 14-
21 zile. Semnificativ este o cretere de cel
puin 4 ori a titrului Ac.

Tratamentul tusei convulsive
Eritromicin sau cloramfenicol cel puin 10
zile (pn la apariia Ac)
Imunoglobulin uman antipertussis

Profilaxia specific
- Imunizarea artificial obligatorie cu vaccin
ADTP. Componentul antipertusic este
reprezentat de o suspensie de bordetele de
faza I, adsorbite pe adjuvant.
Vaccinul acelular conine unele componente
bacteriene (anatoxina pertussis,
hemaglutinina filamentoas). Este mai bine
tolerat, dar mai puin eficace.
- Imunoglobulin uman antipertussis