LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI ENZIM AMILASE DARI MIKROBA Bacillus subtilis

NAMA : DWI NICHE
NIM : H311 12 264
KELOMPOK : III (TIGA)
HARI/TGL PERCOBAAN : KAMIS/1 MEI 2014
ASISTEN : SARTIKA














LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel
hidup, kira-kira lebih dari 2000 enzim telah teridentifikasi yang masing-masing
berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia dalam sistem hidup. Sintesis enzim
terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi
dan jaringan tanpa mengubah fungsinya. Salah satu faktor yang berpengaruh pada
enzim atau protein adalah keasaman atau pH dan temperatur. Enzim mempunyai
aktivitas paling besar atau hilang sama sekali. Begitu pula dengan faktor
temperatur. Enzim dapat bekerja pada temperatur optimum
(Yazid dan Nursanti, 2006).
Ezim merupakan suatu senyawa yang termasuk dalam golongan protein.
Enzim ini memiliki fungsi yang sangat penting dalam kelangsungan hidup
manusia karena sebagian besar dari proses metabolisme tubuh kita
mengikutsertakan kinerja dari enzim tersebut. Enzim amilase adala enzim yang
menghidrolisis pati menjadi dekstrin, kemudian menjadi maltosa, dan selanjutnya
menjadi glukosa. Enzim ini memecah ikatan -1,4 maupun -1,6 glikolisis.
Aktivitas katalitik suatu enzim sangat ditentukan oleh letak pusat aktif. Pada
bagian pusat aktif ini terdapat gugus-gugus yang berperan dalam proses
biokatalisis (Tim Dosen Biokimia, 2014)
Enzim yang digunakan umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari
bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi
dan meningkatkan jumlah produksi. Hal inilah yang melatarbelakangi percobaan
dilakukan.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan kali ini adalah untuk mempelajari dan mengetahui
teknik isolasi enzim amilase dari mikroba Bacillus subtilis dan mengetahui
aktivitas enzim amilase.

1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan kali ini adalah untuk mengisolasi enzim amilase
dari mikroba Bacillus subtilis dan mengetahui aktivitas enzim dari mikroba
tersebut.

1.3 Prinsip Percobaan
Prinsip dari percobaan kali ini adalah mengisolasi enzim amilase dari
mikroba Bacillus subtilis dalam suatu medium padat dengan cara menginokulasi
pada agar cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran kultur mikroba di
atas agar pada kondisi optimum yaitu suhu 50 C dan pH 7 dan melakukan
pengukuran OD dan uji aktivitas.






BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Mikrobiologi berasal dari kata mikro (kecil atau renik), bio (hidup) dan
logos (ilmu). Jadi mikrobiologi merupakan bidang ilmu yang mengkaji tentang
mikroba seperti virus, archeae, bakteri, fungi, algae, dan protozoa. Mikrobia
(mikroorganisme) digunakan untuk menyatakan suatu organisme yang
mempunyai ukuran yang sangat kecil, sehingga tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang tanpa menggunakan mikroskop (Ali, 2005).
Mikroorganisme memegang peranan yang sangat penting, bahkan
eksistensinya merupakan persyaratan mutlak bagi terbinanya semua kehidupan
yang lain. Sebelum orang mengenal pemakaian mikroskop dengan daya
pembesaran yang kuat, dan belum diketahui adanya dunia mikroorganisme, para
ahli biologi tidak mengalami kesukaran dalam mengklasifikasi bermacam-macam
bentuk hidup yang tampak oleh mata biasa, seperti dunia hewan (animalia) atau
dunia tumbuhan (plantae). Tumbuhan dianggap tidak dapat bergerak dan
sederhana susunannya, sedangkan hewan dapat bergerak dan susunannya lebih
kompleks (Irianto, 2006).
Berdasarkan ciri morfologinya, maka sejak tahun 1872 Ferdinan Cohn
telah membagi bakteri ke dalam 4 bentuk yang berbeda-beda yaitu (Ali, 2005):
1. Bentuk coccus, bakteri berbentuk bundar atau bulat.
2. Bentuk basil, bakteri berbentuk batang atau silinder.
3. Bentul spiral, bakteri berbentuk batang bengkok atau melingkar.
4. Bentuk filamen, bakteri berbentuk serabut.
Bakteri berbentuk batang dinamakan basilus (bacillus yang berarti
batang). Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas dua (Irianto, 2006):
1. Basil tunggal, yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal.
2. Diplobasil, yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan dua-dua.
3. Streptobasil, yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang
membentuk rantai.
Berdasarkan susunan kelompoknya, maka bakteri Bacillus subtilis
termasuk dalam kelompok Bacillus, streptobacillus, dan spirillum, yaitu
pembelahan melintang terhadap axis longitudinal selnya, lalu terbentuk sel anakan
seperti bakteri coccus (sendiri-sendiri)(Ali, 2005).
Sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu: 1) sterilisasi pemanasan
basah dengan menggunakan uap atau air panas; 2) sterilisasi kering dalam tanur;
dan 3) pembakaran total (incineration). Berdasarkan pada ketiga cara tersebut,
sterilisasi dapat dibagi menjadi sterilisasi kering (pemijaran, flaming, tanur uap
panas) dan sterilisasi basah (penggodokan dalam air, uap mengalir, uap dalam
tekanan)(Irianto, 2006).
Beberapa mikroba dapat tumbuh dengan baik pada keadaan yang hangat
dan lembap misalnya bakteri dapat dibedakan berdasarkan daya tahannya terhadap
panas. Bakteri termofilik adalah bakteri yang suhu pertumbuhannya antara
45-55
o
C, bakteri mesofilik yang suhu pertumbuhannya antara 20-45
o
C dan
bakteri psikrofilik adalah bakteri yang suhu pertumbuhannya dibawah 20
o
C.
spora bakteri pada umumnya pada suhu air mendidih dan pada suhu yang lebih
rendah sporanya akan bergraminasi dan berkembang biak (Patong, 2013).
Beberapa bakteri yang membutuhkan oksigen untuk tumbuh disebut
bakteri aerobik sedangkan bakteri yang lain dapat tumbuh tanpa adanya oksigen
disebut bakteri anaerobik. Faktor lingkungan hidup yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroba diantaranya air, kelembapan nisbi, suhu, pH, oksigen,
mineral dan lain-lain (Patong, 2013).
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel
hidup. Sekarang, lebih dari 2000 enzim telah terindentifikasi, yang masing-masing
berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia dalam sistem hidup. Sintesis enzim
terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi
dari jaringan tanpa merusak fungsinya (Yazid dan Nursanti, 2006).
Enzim adalah pusat untuk setiap proses biokimia yang bertindak dalam
urutan terorganisir mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang mendegradasi
nutrisi molekul, melestarikan dan mengubah energi kimia dan membuat
makromolekul biologis dari prekursor sederhana. Melalui aksi enzim peraturan,
jalur metabolisme yang sangat terkoordinasi untuk menghasilkan interaksi yang
harmonis antara banyak kegiatan yang diperlukan untuk mempertahankan hidup
(Nelson dan Cox, 2004).
Berikut ini adalah ringkasan klasifikasi enzim secara internasional
(Montgomery dkk., 1993):
1. Oksidoreduktase mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi-reduksi serta
sering mempergunakan koenzim seperti NAD
+
, FAD, atau lipoat sebagai
akseptor hidrogen. Nama umum lainnya adalah dehidrogenase, oksidase,
peroksidase, dan reduktase.
2. Transferase mengkatalisis berbagai jenis transfer kelompok dalam
metabolisme banyak langkah-langkah penting yang memerlukan transfer dari
satu molekul lain dari kelompok amino, karboksil, metil, asil, glikosil, atau
fosforil. Nama umum yang sering digunakan adalah aminotransferase
(transaminase), karnitin asil transferase, dan transkarboksilase.
3. Hidrolase mengkatalisis pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom
lainnya dengan adanya penambahan air. Nama umum yang sering dijumpai
termasuk esterase, peptidase, amilase, fosfatase, urease, pepsin, tripsin, dan
kemotripsin.
4. Liase mengkatalisis pemecahan ikatan karbon-karbon, karbon-sulfur,
karbon-nitrogen tertentu (tidak termasuk peptida). Nama umumnya adalah
dekarboksilase, aldolase, sitrat liase, dan dehidratase.
5. Isomerase mengkatalisis rasemase isomer optik dan geometrik dan reaksi
oksidasi-reduksi intramolekular tertentu. Nama umumnya antara lain
epimerase, rasemase, dan mutase.
6. Ligase mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dan oksigen, sulfur,
nitrogen, dan atom-atom lain. Energi yang diperlukan untuk pembentukan
ikatan sering didapatkan dari hidrolisis ATP. Nama umumnya antara lain
sintetase dan karboksilase.
Enzim -amilase adalah enzim ekstrasel yang mengkatalisis reaksi
pemotongan ikatan glukosidik 1,4 pada bagian dalam molekul substrat
(endoenzim). Secara komersial enzim ini dihasilkan baik oleh bakteri dari genus
Bacillus (Setiasih dkk., 2006).


BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Bahan Percobaan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah bakto agar, yeast
ekstrak, pepton, NaCl, CaCl
2
, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, amilum, BSA (Bovine
Serum Albumin), Natrium Kalium Tatrat, Nelson A, Nelson B, buffer Fosfat pH
7, akuades, tissue roll, dan kertas label.

3.2 Alat Percobaan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah tabung reaksi, rak
tabung reaksi, gelas kimia 1000 mL, gelas kimia 600 mL, pipet volume 1 mL,
statif, bulb, labu semprot, labu ukur 50 mL, kuvet, penangas listrik, gegep,
inkubator, cawan petri, erlenmeyer, pipet mikro, pipet tetes, enkas jarum ose,
spektrofotometer 20 D+, neraca analitik, autoclave, shaker, sentrifuse, dan
pembakar spritus.

3.1 Prosedur Percobaan
3.1.1 Pembuatan Medium Padat
Mula-mula ditimbang yeast ekstrak 0,2 gram, pepton 1 gram, CaCl
2

0,015 gram, K
2
HPO
4
0,01 gram, NaCl 0,01 gram, MgSO
4
7H
2
O 0,05 gram, pati
1 gram dan bakto agar 2 gram dengan neraca analitik dan dimasukkan dalam gelas
kimia. Setelah itu, campuran dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL. Diukur
pH larutan hingga mencapai pH 7. Larutan kemudian dididihkan lalu diaduk
sampai tercampur sempurna lalu dipindahkan dalam tabung erlenmeyer. Tabung
kemudian ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa, lalu ditutupi lagi dengan
aluminium foil. Tabung erlenmeyer dimasukkan dalam autoclave selama 15
menit, dan ditunggu sampai tekanannya turun selama kurang lebih 15 menit lagi.
Larutan lalu dituang ke dalam cawan petri yang sebelumnya telah disterilkan
dengan cara dicuci bersih, dibungkus kertas dan dimasukkan ke dalam oven.
Cawan petri yang telah diisi media padat kemudian dibungkus dengan plastic
wrap dan diinkubasi selama 24 jam. Dibuat 4 kuadran pada bagian bawah cawan
petri dengan spidol permanen.

3.1.2 Peremajaan Mikroba
Setelah terbentuk medium padat, bakteri Bacillus subtilis digoreskan pada
medium tersebut. Mula-mula, jarum ose dicelupkan dalam etanol lalu dibakar
pada pembakar spiritus sampai berubah warna menjadi kemerahan. Dalam
keadaan membara, jarum ose ditempelkan pada tutup bagian dalam cawan petri
kemudian diambil sampel bakteri Bacillus subtilis yang telah disediakan
sebelumnya, lalu dipindahkan dengan cara digoreskan pada medium padat.
Dilakukan berulang-ulang sampai keempat kuadran telah digores. Setelah itu,
cawan petri dibungkus kembali dengan plastic wrap dan dimasukkan ke dalam
inkubator pada suhu 50 C selama 24 jam kemudian dilanjutkan dengan uji
iodida. Stok bakteri yang telah tumbuh dalam cawan petri ditetesi dengan larutan
iodida dan dilihat zona bening yang terbentuk.



3.1.3 Pembuatan Media Inokulum
Pembuatan media inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak
0,16 gram, pepton 0,8 gram, CaCl
2
0,012 gram, K
2
HPO
4
0,008 gram, NaCl
0,04 gram, MgSO
4
7H
2
O 0,04 gram dan pati 1 gram dengan menggunakan neraca
analitik dan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dengan
akuades hingga 80 mL kemudianlarutan tersebut dihomogenisasi. Dipanaskan
sampai larut kemudian dibagi dalam 4 erlenmeyer masing-masing berisi 20 mL
dan disterilkan dalam autoclave.
Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan pada media padat diambil sebanyak
2-3 ose dan dimasukkan ke dalam inokulum yang telah dibuat. Biakan tersebut
dishaker pada suhu 50 C selama 24 jam.

3.1.4 Pembuatan Media Produksi
Pembuatan media produksi dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak
0,2 gram, pepton 1 gram, CaCl
2
0,015 gram, K
2
HPO
4
0,01 gram, NaCl
0,05 gram, MgSO
4
7H
2
O 0,05 gram, dan pati 1 gram dengan neraca analitik dan
dimasukkan dalam tabung erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dengan akuades
hingga 100 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Larutan
kemudian disterilkan di dalam autoclave.
Selanjutnya inokulum aktif dipindahkan kedalam media produksi,
kemudian dikocok pada kecepatan 180 rpm selama 48 jam pada suhu 50 C.

3.1.5 Pengukuran Optical Density (OD)
Larutan yang telah dishaker selama 2 hari diukur absorbansinya dengan
menggunakan spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 650 nm lalu
disentrifugasi 3.500 rpm pada suhu 4 C selama 30 menit. Larutan kemudian akan
terbagi menjadi dua bagian, yaitu residu (berupa padatan di dasar tabung) dan
supernatan (cairan bening kekuningan). Bagian residu dibuang, sedangkan bagian
supernatan diambil untuk pengujian uji aktivitas enzim.

3.1.6 Uji Aktivitas Enzim Amilase
Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Di tambahkan
0,5 mL amilum dan 0,5 mL buffer pH 6 ke dalam sampel. Dimasukkan ke dalam
oven pada suhu 42 C selama 1 jam. Masing-masing larutan sampel, standar, dan
blanko dipipet 0,5 mL kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 0,5 mL larutan
Nelson. Dan dipanaskan selama 15 menit. Ditambahkan 0,5 mL arsen dan
diencerkan dengan 3,5 mL aquades. Diukur absorbansi masing-masing larutan
dengan menggunakan spektronik 20 D+ pada panjang gelombang maksimum.











BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan
Pada umumnya enzim amilase berasal dari bakteri, salah satunya bakteri
termofilik yang mempunyai aktivitas tinggi dan bersifat lebih stabil seperti bakteri
Bacillus subtilis. Pada percobaan ini, dilakukan pembuatan medium padat sebagai
tempat pertumbuhan mikroba. Uji aktivitas dilakukan terhadap 3 larutan yaitu
larutan blanko, larutan standar, dan larutan sampel dan diukur dengan
menggunakan spektrofotometer dan dilakukan pengukuran OD (optical density)
atau disebut juga tingkat kekeruhan adalah untuk melihat seberapa banyak
mikroba yang ada dalam enzim yang telah dibuat. Data yang diperoleh adalah
sebagai berikut.
Tabel 1. Penentuan Panjang Gelombang () Maksimum
(nm) Absorbansi
600 0,209
650 0,274
700 0,272


Gambar 1. Grafik Penentuan Panjang Gelombang () Maksimum
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
580 600 620 640 660 680 700 720
Penentuan Maksimum
Tabel 2. Uji Aktivitas
Konsentrasi Absorban
0,002 0.214
0,004 0,274
0,006 0,334
0,008 0,580
0,010 0,572
0,012 0,774
Sampel 1,405




Gambar 2. Grafik Uji Aktivitas

4.2 Pembahasan

Pemakaian enzim meningkat pesat, salah satu enzim yang paling banyak
digunakan adalah amilase. Pada umumnya enzim amilase berasal dari bakteri,
salah satunya bakteri termofilik yang mempunyai aktivitas tinggi dan bersifat
lebih stabil seperti bakteri Bacillus subtilis.
y = 61.9x + 0.0116
R = 0.9285
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 0.005 0.01 0.015
A
b
s
o
r
b
a
n

Konsentrasi
Absorban 0.214
Linear (Absorban
0.214)

Pada percobaan isolasi ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas suatu
enzim. Alat yang digunakan telah disterilkan terlebih dahulu, karena mikroba
yang dihasilkan bersifat sensitif sehingga diperlukan situasi tertentu agar
menghasilkan mikroba dengan baik. Oven digunakan untuk mengeringkan alat
yang akandigunakan seperti cawan petri. Autoklaf digunakan untuk mensterilkan
bahan dengan cara penguapan dan tekanan yang dapat diatur, sesuai yang
diinginkan. Enkas yang berfungsi sebagai tempat peremajaan mikroba atau tempat
untuk bekerja yang dapat mengurangi kontaminasi dengan udara. Sebelum
digunakan, enkas ini harus disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70 %
kedalamnya. Sentrifuge digunakan untuk menstrifugasi bahan agar dapat terpisah
secara jelas antara filtrate dan residu.Inkubator digunakan untuk memanaskan
larutan dengan suhu yang diinginkan.

4.2.1 Pembuatan Medium Padat

Pembuatan medium padat berfungsi sebagai tempat peremajaan bakteri.
Mikroba itu akan tumbuh dalam medium padat yang komposisinya terdiri dari
bakto agar, yang berfungsi sebagai sumber energi dan sumber karbohidrat yang
mengandung karbon. Yeast ekstrak berfungsi sebagai sumber nutrisi bagi bakteri.
Serbuk (NH
4
)
2
SO
4
sebagai sumber senyawa nitrogen. Serbuk Mg
2
SO
4
sebagai
sumber unsur logam Mg dan NaK
2
HPO
4
digunakan sebagai sumber fosfat yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba.

Pada peremajaan bakteri pada media padat dilakukan penggoresan,
dimana penggoresan terdapat beberapa teknik, namun teknik yang digunakan
dalam percobaan ini adalah teknik sinambung, yakni penggoresan yang dilakukan
berbentuk zig-zag. Penggoresan dilakukan dalam medium padat yang telah dibuat.
Dimana medium yang digunakan harus betul-betul kering, agar koloni yang
dihasilkan menyebar mengikuti goresannya.

Penggoresan dilakukan dengan menggunakan ose. Sebelum digunakan
jarum tersebut dipijarkan terlebih dahulu, hal ini bertujuan agar bakteri yang
terdapat pada mata ose tersebut dapat dihilangkan dan mencegah pencemaran
penggoresan pada daerah berikutnya. Kemudian dilakukan pemanasan dengan
lampu spiritus yang bertujuan untuk menghilangkan bakteri yang terdapat
disekitar alat gelas, yang dapat mengganggu pertumbuhan mikroba. Setelah
perlakuan berdasarkan prosedur maka dihasilkan dua macam medium, yakni
medium yang berisi mikroba dan medium yang tidak mengisi mikroba. Dimana
medium yang berisi medium akan menghasilkan zona-zona bening yang sudah
dimakan oleh subtrat. Sedangkan pada medium yang tidak berisi mikroba dapat
terjadi karena telah terkontaminasi dengan udara luar pada saat penggoresan.

4.2.2 Pembuatan Medium Inokulum dan Media Produksi.
Pembuatan medium inokulum berfungsi sebagai tempat mikroba
mengadaptasi lingkungannya. Pada tahap ini, medium dishaker karena bakteri
akan tumbuh secara maksimal di daerah yang bergerak. Komposisinya sama
dengan komposisi medi padat namun tidak menggunakan bakto agar. Lalu bakteri
yang tumbuh di medium padat diinokulum pada medium inokulum yang
dilakukan dalam enkas agar tetap steril.
Setelah biakan dishaker selama 24 jam. Biakan kemudian dipindahkan ke
dalam media produksi dan dishaker selama 48 jam untuk produksi enzim amilase.

4.2.4 Penentuan OD dari Larutan Enzim dan Uji Aktivitas Enzim
Untuk mengetahui uji aktifitas enzim dilakukan pengukuran larutan
sampel, larutan standar dan larutan blanko sebagai pembanding. Larutan sampel
didapatkan dari larutan yang dishaker selama 3 hari kemudian ditambahkan
dengan buffer pH 5,0, 6,8 dan 7,4 dikarenakan enzim pada larutan tersebut
bekerja pada pH optimum. Ditambahkan pula dengan larutan amilum yang
berfungsi sebagai substratnya. Kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu
38 C karena pada suhu ini enzim bekerja. Setelah sampai pada waktu 10 menit,
ditambahkan TCA (trikloroasetat) 1,5 M. Fungsi penambahan tersebut yaitu untuk
mendenaturasi protein yang terkandung dalam larutan tersebut dan pada kondisi
ini enzim tidak bekerja lagi. Dimasukkan dalam sentrifus 3500 rpm selama
30 menit, agar dapat terpisah secara jelas antara filtrat dan residu. Hasil yang
didapatkan adalah sebagai berikut.

Gambar 3. Grafik Uji Aktivitas
y = 61,9x 0,0116
1,405 = 61,9x 0,0116
y = 61.9x + 0.0116
R = 0.9285
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 0.005 0.01 0.015
A
b
s
o
r
b
a
n

Konsentrasi
Absorban 0.214
Linear (Absorban
0.214)
x =
61,88
1,405

x = 0,0227 mM
Diketahui, t = 10 menit
V = 0,1 mL
1 unit =
t
dipipet yang volume mM

=
10
mL l 0, mM 0,0227

= 0,000227 U
= 2,27 x 10
-4
U
Total aktivitas enzim dalam percobaan adalah
2,27 x 10
-4
U/mL x 100 mL = 2,27 x 10
-2
U
Jadi, aktifitas enzim yang diperoleh dalam percobaan ini secara keseluruhan
adalah 0,0227 Unit.
Berdasarkan tabel dan grafik di atas, didapatkan nilai OD (Optical
Density) dapat diperoleh dengan pengukuran optical density dengan menggunakan
spektrofotometer 20 D
+
. Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui sejauh mana
pertumbuhan mikroba.
0,214 + 0,274 + 0,334 + 0,580 + 0,572 + 0,774 + 1,405
7
= 0,59
Nilai OD (Optical Density) yang diperoleh untuknilai OD yang diperoleh
yaitu 0,59. Semakin tinggi nilai OD (Optical Dencity) maka semakin banyak
bakteri yang dihasilkan dan begitu pula pada tingkat kekeruhan yang
memperlihatkan bahwa semakin keruh berarti semakin banyak bakteri yang
OD =
tumbuh pada medium. Semakin tinggi tingkat kekeruhan maka semakin banyak
bakteri yang dihasilkan. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa semakin banyak
bakteri yang dihasilkan dalam medium produksi maka semakin besar aktifitas
enzim yang terjadi di dalamnya.




















BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan bahwa enzim
amilase dapat diisolasi dari mikroba Bacillus subtilis yang terbentuk pada medium
ditandai dengan adanya zona-zona bening dengan aktivitas optimum enzim pada
pH 7-8 dan nilai aktivitas enzim pada larutan mikroba adalah 0,0227 Unit.

5.2 Saran
5.2.1 Laboratorium
Saran untuk laboratorium agar lebih memperhatikan kualitas
bahan-bahannya dan memperhatikan alat-alatnya agar tidak terjadi kesalahan yang
tidak terduga.

5.2.2 Praktikum
Saran untuk praktikum mungkin untuk ke depannya dilakukan isolasi
enzim lain dari mikroba seperti enzim protease yang tentunya dengan
menggunakan metode lain seperti metode Lowry.

5.2.3 Asisten
Saran untuk asisten agar dapat lebih memperhatikan praktikan dalam
pengerjaan praktikum ini sehingga dapat meminimalisir kesalahan yang mungkin
terjadi.


DAFTAR PUSTAKA
Ali, A., 2005, Mikrobiologi Dasar, Badan Penerbit UNM, Makassar.

Irianto, K., 2006, Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme, CV. Yrama
Widya, Bandung.

Montgomery, R., Dryer, R. L., Conway, T. W., dan Spector, 2001, Biochemistry:
A Case- Oriented Approach, Sixth Edition, C.V.Mosby Co., St.Louis.

Nelson, D.L., Cox, M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth
Edition, Amazone.

Patong, A.R., 2013, Analisis Kimia Pangan, Dua Satu Press, Makassar.

Setiasih, S., Wahyuntari, B., Trismilah, dan Apriliani, D., 2006, Karakterisasi
Enzim -Amilase Ekstrasel dari Isolat Bakteri Termofil SW2, Jurnal
Kimia Indonesia, 1(1):22-27.

Tim Dosen Biokimia, 2013, Penuntun Praktikum Biokimia, FMIPA Universitas
Hasanuddin, Makassar.

Yazid, E., dan Nursanti L., 2006, Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa
Analisis, Penerbit Andi, Yogyakarta.






















LEMBAR PENGESAHAN



















Makassar, 30 Mei 2014
Asisten Praktikan

SARTIKA DWI NICHE
Lampiran 1. Bagan Kerja
A. Pembuatan Medium Padat


- Ditambahkan 0,2 gram yeast ekstrak, 1 gram pepton,
0,01 gram NaCl, 0,01 gram K
2
HPO
4
, 0,05 gram MgSO
4
.7H
2
O,
0,15 gram CaCl
2
anhidrat, dan 1 gram amilum.
- Dicampur dalam gelas kimia.

- Dilarutkan dengan aquades hingga 100 mL dan diaduk hingga
semua larut.
- pH diatur hingga tercapai pH 7.
- Dipanaskan hingga mendidih selama 10 menit.
- Dituang ke dalam erlenmeyer dan ditutup dengan kapas wol serta
aluminium foil.
- Disterilkan dengan autoclave


- Larutan dituang ke dalam cawan petri.
- Cawan petri dilapisi dengan parafilm dan didiamkan dalam oven.
- Ditandai menjadi empat kuadran.
- Mikroba digoreskan pada permukaan medium
- Cawan petri dimasukkan dalam oven pada suhu 50
o
C

Medium Steril
Medium
Campuran
2 gram Bakto agar
B. Pembuatan Media Inokulum

- Ditambahkan dengan 0,8 gram pepton, 0,4 gram NaCl, 0,008 gram
K
2
HPO
4
, 0,04 gram MgSO
4
.7H
2
O, 0,012 gram CaCl
2
anhidrat dan
1 gram amilum.
- Dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250 mL dan dilarutkan dengan
80 mL aquades.
- Dishake selama 3 hari kemudian disterilkan.
- Dimasukkan isolate bakteri Bacillus subtilis yang telah ditumbuhkan
tadi ke dalam media padat dengan menggunakan jarum ose.
- Dibiakkan dan dishakepada suhu kamar selama satu malam













0,16 gram yeast ekstrak
Medium steril
C. Pembuatan Medium Produksi


- Ditambahkan 1 gram pepton, 0,05 gram NaCl, 0,01 gram
KH
2
PO
4,
0,05 gram MgSO
4
.7H
2
O, 1 gram Pati dan
0,015 g CaCl
2
anhidrat.
- Dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250 mL
- Ditambahkan akuades hingga volume mencapai 100 mL.
- Dishaker selama 3 hari.
- Disterilkan dalam autoclave.
- Dipindahkan ke dalam media produksi
- Dikocok pada kecepatan 180 rpm selama 48 jam pada suhu
50 C



D. Penentuan Optical Density



- Diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 650 nm.
- Disentrifuse 3500 rpm pada suhu 4 C selama 30 menit.



Larutan Blanko, Larutan
Standar, dan Larutan Sampel
Hasil
Hasil
0,2 gram yeast ekstrak
E. Uji Aktivitas Enzim


- Dihidrolisis sampel dengan memasukkan 1 mL enzim ke dalam
tabung reaksi.
- Ditambahkan 0,5 mL amilum dan 0,5 mL buffer pH 6 pada
sampel.
- Dimasukkan dalam oven sampel tadi pada suhu 42 C selama
1 jam.
- Masing-masing larutan sampel, standar, dan blanko dipipet
0,5 mL ke dalam tabug reaksi .
- Ditambahkan 0,5 mL Neslon A dan dipanaskan selama
- 15 menit.
- Ditambahkan 0,5 mL arsen dan diencerkan dengan 3,5 mL
aquades.
- Diukur absorbansi masing-masing larutan dengan menggunakan
spektronik 20 D+ pada panjang gelombang maksimum 650 nm.







Hasil
Larutan Blanko, Larutan
Standar, dan Larutan Sampel
Lampiran 2. Gambar Pengamatan
Larutan Deret Standar


Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan Bakteri