Guia de biologia molecular

Que es una mutacion?
R= es un cambio al azar o provocado por agentes mutagenos en el material genético celular (no
son dirigidas)
Tipos de mutaciones POR SU EFECTO:
R= estas se dividen en:
Nocivas: es un cambio al azar de cualquier información, y siempre lleva a un información sin
sentido o defectuosa para el individuo.
Neutras: sin efecto, son beneficiosas ya que para el indiviuo y para la especie si se transmite a su
desendencia.
Tipos de mutaciones:
Según las células afectadas
Según la extencion de material genético afectado
SEGÚN LA CELULA AFECTADAS:
Germiales: afectan a gemetos y a células madre
Somaticas: afectan células somaticas y no son heredables
SEGÚN LA EXTENCION DEL MATERIAL GENETICO AFECTADO:
Cromosómicas: afectan a disposición de genes en el cromosoma
Genicas: provocan cambios en la secuencia de nucleótidos
Genomicas: alteran el numero cromosómico
SEGÚN SU EFECTO SE DIVIDEN EN:
Perjudiciales
Neutras
Beneficiosas
SEGÚN SU ORIGEN SE DIVIDEN EN:
Al azar
Provocadas por agentes mutagenos

Ejemplo de una mutacion es: la mariposa abedul
MUTACIONES GENICAS PUNTUALES:
Afectan la secuencia de ADN de un gen y afectan solo 1 base
Se van a dividir en:
Mutuaciones por cambio de bases
Mutaciones de inserción
Mutuaciones por delecion
SUSTITUCION DE BASES: lineal
Transciciones de bases nitrogenadas: purina por purína ejemplo:
adenina por guanina o citosina por timina
TRANSVERSIONES:
Purina por pirimidina
Pirimidina por purina
Ejemplo: adenina por timina
Citosina por guanina _(CRUZADA)
CONSECUENCIAS D LAS MUTUACIONES (_GENICAS)
MUTUACION SILENCIOSA: Hay cambio en la secuencia de bases pero el aminoácido no se ve
afectad.
MUTUACION CON SENTIDO O OMISENCE:
Son cambios en las bases y cambia el aminoácido producido
MUTUACION SIN SENTIDO:
Son cambios en las bases que generan codón de paro
Se crean proteínas no funcionales y pp se interrumpen
MUTUACIONES CON DESPLAZAMIENTO CON MARCO DE LECTURA:
Estas son mutaciones que insertan o delecionan 1 o mas pares d bases y por lo tanto cambia todo
el marco de lectura a partir de la mutacion.

AFECCIONES EN REGIONES REGULADORAS:
Promotor: habrá sobreexpresión en la transcripción de proteínas o que no se exprese nada
PotenciadOr:
Silenciador
CITOGENETICA:
Estudia la estructura y función de los cromosmas
¿Cómo se obtienen los cromosmas?
Sangre + medio (RPMI-1640)+ANTIBIOTICOS: en 72 hrs y a 37ºc
EUPLOIDE: Son organismos con sets completos o normales completos
POLILOIDE: organismos que llevan sets extras de cromosomas
ANEUPLOIDIA: cambios numéricos en alguna parte del genoma _(1 cromosoma d mas o 1 de
menos

POLIPLOIDIAS SE VAN A DIVIDIR EN:
ALOPOLIPLOIDIA: son poliploidias creadas por hibridación entre especies diferentes
AUTOPOLIPLOIDIAS: Son poliploidias creadas por duplicación cromosómica dentro de una especie

CROMOSOMAS EN ANILLOS:
Se originan por la perdida de material genético de ambos extremos del cromosoma y fusión de
ambos extremos

BALANCEADOS:
No hay perdida de material genético
INVERSIONES: Son reordenamientos intracromosomicos equilibrados que provocan un genotipo
afectado ya que interrumpen genes
Se dividen en:
INVERSIONES PERICENTRICAS: el fragmento invertido incluye al centrómero

INVERSIONES PARACENTRICAS: No se incluye el centrómero
MUTACION ESPONTANEA: Cambio conformacional de la secuencia genético en sus bases.
Que son los errores de apareamiento?
Incluye cambio conformacional, desanminacion, depurinacion y tambaleo
REACCIONES OXIDATIVAS:
Son las formas reactivas del oxigeo y entre ellas radicales de superoxido, peróxido de hidrogeno y
radicales de oxigeno.

ANALOGOS DE BASES: se cambia el metil por el bromo
EJEMPLOS DE AGENTES INTERCALANTES:
Bromuro de tidio
Naranja de acridina
EJEMPLOS DE AGENTES FISICOS:
Radiación ultravioleta

AGENTES BIOLOGICOS:
Son principalmente los virus y estos son trnsmisibles que no se pueden duplicar sin la presencia d
un huésped.
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN:
DETECCION: Reconocimiento dela sección dañada del ADN
ESICION: las endonucleasas de reparación del DNA dañado cortan el esqueleto fosfodieter y se
eliminan 1 o mas nucleótidos
POLIMERIZACIÒN: la DNA polimerasa agrega nucleótidos al extremo 3’-OH.
ALGUNOS SISTEMAS DE REPARACIÒN:
Errores de apareamiento
Reparación directa
Escisión de bases

Errores de la replicaciòn
Dìmeros de pirimidina u otros tipos específicos
de alteraciones
Bases normales, bases modificadas y dìmeros

Escisión del nùcleo

Alteración del DNA que distorsiona la doble
hélice, como las bases anormarles.

REPARACIÒN DIRECTA: no reemplaza los nucleótidos alterados sino que les devuelve sus estruc.
Naturales.
REPARACIÒN POR ESCISIÒN DE BASES: primero se corta la base modificada, y luego se reemplaza
el nucleótido completo.
Esta catalizada por las enzimas DNA glucosilasas. Después llega otra enzima llamada endonucleasa
AP (apirimidinica) y corta el enlace fosfodièster. Despuès llega otra proteína, que elimina la
desoxirribosa y agrega nuevos nucleótidos. Al final llega la DNA ligasa y sella la cadena de bases.
PS3: activa la transcripción de gad d 45, y este repara el ADN.
Cual es considero el gen guardian? P53
MDM2 CONTROLA A P53
ARF REGULA A MDM2
Cuando se unen ARF y MDM 2 se activa P53.
SINDROMA DE COCKAYNE: enanismo, sensibilidad a la luz solar, envejecimiento prematuroy
retardo mental.
PCR
REACCION EN CADENA DE POLIMERASA
CUYA FINALIDAD ES:
La amplificación o reproducción in vitro de un numero de copias de una región especifica de ADN
de forma natural.
Fue desarrollada por el mèdico Kary Mullis en 1983.
SUS PRINCIPALES APLICACIONES SON: la clonación de ADN para la secuenciòn, la filogenia basada
en ADN, análisis funcional de genes, identificación de huellas genéticas, y el diagnòstico de enf.
Hereditarias.
La pcr consta de 3 ciclos.
Ciclo 1: es la desnaturalización.
Ciclo 2: alineación del cebador.
Ciclo 3: extensión del cebador.

PCR IN SITU: Se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjetos., los productos generados
pueden visualizarse en el sitio de amplificación.
Helicasa: abre la cadena
Topoisomerasa: cierra la cadena
ADN POLIMERASA:
Talq ampli talq: termus aquaticus a 85º C expresada por e colli act. Exonucleasa de 5 a 3
Vent: act. Exonucleasa 5 a 3 eliminar residuos mal apareados hasta que se forma un extremocon
bases correctamente unidas
Deep vent: degradación de cebadores
Pfu
uitma
amplitaq good:
PCR MULTIPLEX: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción.
VENTAJAS:
Rápido y de uso sencillo, permite clonar ADN en pocas horas.
DESVENTAJAS DEL PCR: necesidad de disponer de información de la secuencia de ADN.
HIBRIDACIÒN: formación de dúplex a partir de cualquier combinación de acidos nucleicos.
Que es la eletroforesis: es la sepraciòn de moléculas en un campo eléctrico.
ESTRINGENCIA: Condiciones alas cuales se desarrolla la hibridación y detección del dúplex.
COPIA ÙNICA: Secuencia de ADN que se encuentra una vez por genoma.
Que es un dúplex?? Estructura de ácidos nucleicos de doble cadena.
FACTORES QUE AFECTAN LA HIBRIDACIÒN:
Concentración de sales, bases no complementarias, longitud del fragmento, temperatura a 25
grados.
SONDA: es un fragmento de ADN o ARN formado por oligonucleótidos.
SONDAS MARCADAS: Contienen alguna marca que revela su uniòn a la secuencia, generalmente
en p32.

APLICACIONES: Caracterizar la identidad de genes específicos, identificar fragmento de ADN que
contengan un gen determina, determinar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a
enfermedades, detección de mutaciones puntuales.
HIBRIDACIÒN TIPO NORTHERN: identifica ARN, es rápida y evita contacto con las ARNasas.
HIBRIDACIÒN TIPO SOUTHERN: detectar genes específicos en el ADN.
ENZIMAS DE RESTRICCIÒN Y TÈCNICA DE RFLPs
QUE SON LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÒN? Son enzimas que cortan o restringen enlaces
fosfodiester del ADN a partir de una secuencia que reconocen. También se les llama
endonucleasas.
USO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÒN: para aislar un gen que se requiere de un cromosoma, y
para cortar el ADN en el sitio donde va a ser insertado el fragmento.
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÒN:


TIPO 1: bifuncional de 3 subunidades, R, M, y S.
TIPO 2: endonucleasa y metilasa.
TIPO 3: bifuncional con 2 subunidades MS y R.

APLICACIONES DE ESTAS ENZIMAS: hacer un mapa de restricción de un plásmido, fragmentar ADN
genómico, generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas, generación de
fragmentos para ser subclonados.
ASI ES COMO SE NOMBRAN LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÒN:

TIPOS DE CORTES DE LAS ENZ. DE REST. :

ABRUPTOS: cortan en un sòlo punto.
COHESIVOS: cortan en dos puntos diferentes.

TÈCNICA DE RFLP (TÈCNICA DE POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE
RESTRICCIÒN): identifica grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enf.
Genéticas, y muestra relación genética entre individuos.
NOTA: ESTA TÈCNICA SE REFIERE A SECUENCIAS ESPECÌFICAS DE NUCLEÒTIDOS EN EL ADN QUE
SON RECONOCIDAS Y CORTADAS POR LAS ENZ. D RESTRICCIÒN.
SECUENCIACIÒN:
SECUENCIA: composición de nucleótidos de un trozo de ADN.
¿QUE ES LA SECUENCIACIÒN? Conjunto de métodos y técnicas cuya finalidad es conocer el orden
de los nucleótidos.
A QUE SE REFIERE SECUENCIAR: es determinar la estructura de una secuencia de ADN y el orden
de los nucleótidos.
HAY 2 MÈTODOS:
QUÌMICO: rompe zonas especìficas de la cadena, altamente tòxico, mayor complejidad de la
técnica, utiliza ADN directamente.
ENZIMÀTICO: utiliza DNA polimerasa, se conserva el ADN, pràctico y fácil de utilizar.
MÈTODO DE SANGER: método enzimático utilizado principalmente los dideoxynucleotidos
Este es como cualquier ADN salvo que no tiene el grupo hidroxil 3.
Sin el grupo o-h
Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por calor y
separados por tamaño.
Llamado método clásico de cadena.
Necesita una hebra de molde de ADN de cadena sencilla y un cebador de ADN y un ADN
polimerasa con nucleótidos marcados
Se divide en 4 reacciones:
4 desoxinucleotidos estándar
Datp , Dgtp, Dctp, Dttp y una ADN polimerasa.
SECUENCIACION DE ALTO RENDIMIENTO O NEXT- GENERATION:
Son capaces de paralelizar muchas operaciones

AMPLIFICACION CLONAL IN VITRO:
Utilizan un paso de clonación in vitro para generar muchas copias de cada molecula individual.
Unos de los métodos es la PCR de emulsio
PIROSECUENCIACION:
ES un método de secuenciación de ADN basado en la monitorización a tiempo real de la síntesis de
ADN.
Se realizan in vitro.
PCR DE EMULSION:
En la que se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con
cebadores en burbujas de copias clonales para ser secuenciadores.
ILLUMINA SOLEXA:
Se utilizan polimerasa diseñadas, las hebras de ADN y os primers se pegan a un portaobjetos, se
leva a cabo na amplificación de la polimerasa. Con un reversible bases RT de forma que cuando
una de ellas se pega ala secuencia se pare la reacción.
ION TORRENT SEMICONDUCTOR:
Se basa en la detección de de iones de hidrógenos que se generan en la polimeraza del ADN.
SECUENCIACION POR LIGACION:
Emplea una ADN ligasa para identificar la secuencia.
RATONES TRANSGÈNICOS:
QUE SON LOS ORGANISMOS TRANSGÈNICOS? Organismos vivos manipulados genéticamente
mediante un gen que no formaba parte de el.
Todo empezó en 1980.
ALGUNOS MODELOS TRANSGÈNICOS: en vacas, cerdos, ovejas, cabras, conejos, changos.
QUE ES UN MODELO TRANSGÈNICO? Son aquellos que tienen un gen añadido o alterado, y se
introduce un fragmento de ADN dentro del genoma del huésped.
MICROINYECCIÒN: se inyecta virus en huevos no fertilizados con genes recombinantes y se
integran a los cromosomas del huésped.
VENTAJAS DE LOS MODÈLOS TRANSÈNICOS: permite ensayar la efectividad de diseños específicos.

Mejora la efectividad y disminuye la toxicidad respecto a otras terapias.
Se puede estudiar la expresión de genes para cambios celulares.
¿POR QUE SE USAN LOS RATONES? Porque hay control de la base genética y de las posibles
alteraciones genéticas, cuenta con muchas cepas consaguìneas diferentes, existe un número
abundante de anticuerpos y sondas de cADN,.
RATÒN KNOCK OUT: animal mutante que carece de la expresión especìfica de un gen.
¿Cómo se consiguen los ratones knock out? Insertando aleatoriamente un trozo de ADN en células
madres embrionarias.
KNOCK IN: es un método que involucra la introducción de un cADN en un locus particular del
cromosoma.
RATONES KNOCK IN: es aquel al que se le ha sustituido una secuencia génica por otra diferente.
FUNCIÒN DE ESTE PROCESO: se estudia el funcionamiento de la maquinaria regulatoria que
gobierna la expresión del gen.
NOTA: ESTE PROCESO ES TODO LO CONTRARIO AL KNOCK OUT.
IMPORTANCIA DE ESTUDIOS EN RATONES TRANSGÈNICOS: herramienta para el estudio de
enfermedades inducidas por el ambiente como el cáncer, y la posibilidad de alterar la expresión y
la regulación de genes específicos.
CLASES DE GENES QUE INFLUYEN EN LA FORMACIÒN DE UN TUMOR: serán dos:

Los supresores de tumor: actúan en forma negativa para controlar el crecimiento celular.
Los oncogenes: promueven la división celular.

TRANSGÈNESIS: tiene una baja eficiencia, los animales mueren tempranamente durante el
desarrollo embrionario.
TERAPIA GÈNICA: consiste en la inserción de uno o varios genes funcionales ausentes en el
genoma de un individuo.
APLICACIONES: tratar una enfermedad o realizar un marcaje celular.
EN QUE CONSISTE EL MARCAJE GÈNICA: tiene como objetivo hacer un seguimiento de las células y
comprobar la posición de estas células.
CLASIFICACIÒN DE LA TER. GÈNICA:
EN CÈLULAS SOMÀTICAS: Se realiza en cèl. Somàtcas, entonces las modificaciones de la terapia
solo se manifestaràn en el paciente.

SE DIVIDE EN:
IN VIVO: aquí se administra al paciente un gen a través de un vector (por un ejemplo un virus),
solo que es muy difícil conseguir un vector que solo localize a un sòlo tipo de células.
EX VIVO: esta se lleva a cabo a través de una biopsia del tejido del paciente. Se da màs en células
hematopoyéticas.
TERAPIA GÈNICA GERMINAL: se realiza sobre cèl. Germinales, por lo que los cambios generados
son hereditarios y por cuestiones èticas esta terapia no se realiza.
USOS DE LA TERAPIA GÈNICA: SE UTILIZARÀ COMO:
TERAPIA DE ENFERMEDADES MONOGÈNICAS HEREDITARIAS: se usa en enfermedades en las que
no se puede administrar la proteína deficiente y se proporciona el gen defectuoso.
TERAPIA DE ENF. ADQUIRIDAS: se insertan genes suicidas en las células tumorales o inserción de
antígenos tumorales que potencian la respuesta inmune.
ENZIMAS USADAS EN LA TERAPIA GÈNICA: las enzimas de restricción.

QUE ES UN VECTOR GÈNICO? Es el organismo transportador de la información génica.
TIPOS DE VECTORES DE LA TERAPIA GÈNICA: SON 2 GRUPOS
VIRALES: como retrovirus, adenovirus, herpes.
NO VIRALES: DNa desnudo, oligonucleótidos, liposomas.
CARACTERÌSTICAS DE UN VECTOR IDEAL: que sea reproducible, que sea estable, que posibilite la
integración del gen funcional en un sitio especìfico del genoma, que se integre una vez por célula,
que la expresión del gen pueda ser regulada, que se fácil de producir y almacenar, que sea inocuo
o que sus efectos secundarios sean mínimos.
EN QUE ENFERMEDADES PUEDE USARSE LA TERAPIA GÈNICA? Cáncer principalmente, enf.
Infecciosas, esclerosis, artritis, diabetes.

LIMITACIONES DE LA TERAPIA GÈNICA: que de material extracromosòmico, reacción inmune ante
el nuevo, corto tiempo de expresión de la nueva proteína.

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