FACULTATEA DE CHIMIE I INGINERIE CHIMIC

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI, CLUJ-NAPOCA

Rezumatul tezei de doctorat

SILAI (cs. KILLYNI) Catalina Anik

Electrozi modificai cu
proprieti de recunoatere
molecular
Comisie:
Preedinte:
Prof. Liana Maria MUREAN, Universitatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca

Conductor tiinific:
Prof. Ionel Ctlin POPESCU

Refereni:
Prof. Camellia BALA, Universitatea din Bucureti
Prof. Lo GORTON, Universitatea din Lund, Sweden
Conf. Graziella TURDEAN, Univeritatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca

Susinere: 26 August 2013

CUPRINS

Cuvinte cheie .................................................................................................... 2

1. ntroducere .................................................................................................. 3
2. Obiectivele principale ale tezei .................................................................. 4
3. Efectul deglicozilrii asupra activitii electrocatalitice mediat a
AmPDH conectat electric prin OS-RP......................................................... 5
3.1. Optimizarea bioelectrozilor................................................................................................. 5
3.2. Efectul deglicozilrii asupra oxidrii electrocatalitice a glucozei .................................... 7
3.3. Stabilitatea bioelectrozilor................................................................................................... 8
3.4. Selectivitatea bioelectrozilor ............................................................................................... 9
3.5. Descompunerea enzimei deglicozilate AmPDH i influena condiiilor de depozitare . 10

3.5.1. Urmrirea descompunerii enzimei deglicozilate prin SDS-PAGE .................. 10

3.5.2. Determinarea spectrofotometric a activitii enzimei .................................... 11
3.5.3. Oxidarea electrocatalitic a glucozei pe electrozi modificai cu gPDH,
dgPDH i sdgPDH ..................................................................................................... 11

4. Studiul cinetic al adsorbiei S-acetil-clix[8]arenei i reorganizrii

filmului format pe suprafa Au policristalin ............................................ 13
4.1. Msurtori de voltametrie ciclic ..................................................................................... 13
4.2. Msurtori de spectroscopie de impedan electrochimic ........................................... 14

4.2.1. Adsorbia S-Calix............................................................................................. 14

4.2.2. Procesul de reorganizare a monostratului de S-Calix ...................................... 18

5. Concluzii generale ..................................................................................... 23

6. Activitatea tiinific ................................................................................. 24
6.1. Articole ................................................................................................................................ 24
6.2. Participri la conferine ..................................................................................................... 25

7. Referine (Selective) .................................................................................. 26

Cuvinte cheie
Piranoz dehidrogenaz, polimer redox cu osmiu, transfer mediat de electroni,

deglicozilarea enzimei, S-calix[8]aren, cinetica adsorbiei, straturi auto-asamblate

2|

1. NTRODUCERE
De-a lungul secolului trecut, mai multe studii au fost publicate cu scopul de a
elabora o metod eficient i simpl pentru funcionalizarea suprafeelor metalice cu
diverse molecule. Pe de alt parte utilizarea enzimelor viznd creterea selectiviti
electrozilor modificai este bine stabilit, dar mai exist nc multe provocri i n acest
domeniu (Frew et al. 1987)
Piranoz dehidrogenaz (PDH; CE 1.1.99.29) este o oxidoreductaz care este
produs ntr-un grup restrns de ciuperci. PDH poart un centru activ (flavin-adenindinucleotid, FAD) cu legtur covalent (Sygmund et al. 2008) (Figura 1).

Figura 1. PDH izolat din Agaricus meleagris (Am), n rou centrul active al
enzimei.
n funcie de sursa de enzim i substrat, PDH poate cataliza mono- i dioxidarea
unor varieti de substraturi n poziia C-2, C-3 i C-2,3, respectiv C-3, 4
(Volc et al. 1998; Volc et al. 2002; Peterbauer et al. 2010), cu o eficien catalitic
asemntoare, ceea ce face enzima atractiv pentru aplicarea ei n chimia analitic,
producia industrial de zaharuri rare i construirea de pile galvanice enzimatice (EBFC).
Glicozilarea este una din cele mai frecvente modificri ale proteinelor. Mai mult de
50% din proteine sunt glicozilate. Eliminarea nveliului de glicani din molecula enzimei,
poate conduce la o scdere a distanei dintre centrul redox al enzimei i suprafaa
electrodului (Lindgren et al. 1999; Presnova et al. 2000; Ferapontova et al. 2001;
Prvoteau et al. 2010), i n conformitate cu ecuaia Marcus (Marcus 1964), acesta poate
facilita transferul direct de electroni.

3|

Masa molecular (MW) a enzimei PDH izolat din Agaricus meleagris (AmPDH)
exprimat n P. pastoris a fost determinat a fi ~93 kDa, coninnd ~30% glicani, n timp
ce MW a enzimei native este ~66.5 kDa nsemnnd doar 7% glicani.
Deglicozilarea unei enzime poate oferi noi posibiliti pentru creterea eficienei
biocatalitice a bioelectrodului, aa cum s-a observat anterior n transfer direct de electroni
(Lindgren et al. 1999; Presnova et al. 2000; Ferapontova et al. 2001; Ferapontova et al.
2005; Prvoteau et al. 2010; Ortiz et al. 2012), dar i transfer mediat de electroni
(Fraser et al. 1992; Courjean et al. 2010; Prvoteau et al. 2010).
Printre diferitele metode de realizare a interfeelor electrochimice modificate cu
molecule, monostraturile formate prin auto-asamblare s-au dovedit a avea o eficien
remarcabil i o mare versatilitate (Buck 2009). Prin urmare, un numr mare de studii
fundamentale i aplicative au fost publicate viznd exploatarea structurilor autoasamblate.
Calixarenele sunt compui macrociclici. Ele exist n form de cup avnd o parte
superioar, una inferioar respectiv un spaiu inelar central. Calixarenele pot fi utilizate
pentru realizarea unor senzori electrochimici, cu scopul de a detecta specii ionice i
moleculare de interes biologic sau pentru protecia mediului. Fiind cunoscut marea
afinitate dintre sulf i aur, s-a presupus faptul c prezena sulfului n compuii
calixarenici poate asigura dezvoltarea unor straturi auto-asamblate ale acestor compus pe
o suprafa de Au.
n lucrarea de fa sunt descrise dou abordri pentru modificarea electrozilor:
(i) Prima se bazeaz pe imobilizarea enzimei deglicozilate (dgPDH) cu scopul de a
mbunti proprietile biocatalitice ale bioelectrodului modificat;
(ii) A doua are la baz modificarea prin auto-asamblare, rezultat prin absorbia Scalix[8]arenei pe suprafaa electrodului de Au, n scopul de a obine o interfa
inteligent, capabil s recunoasc diverse specii chimice.
Teza este structurat n dou pri principale: o descriere bibliografic i
contribuiile originale. n partea bibliografic urmtoarele teme sunt evideniate:
biosenzori, transferul de electroni ntre centrul redox al enzimei i electrozi, generaliti
despre enzima PDH i proprietile sale moleculare, mono-straturi auto-asamblate
(SAM) pe Au i calixarene, precum i o scurt descriere a metodelor folosite pentru
investigarea experimental. Partea original este structurat pe dou capitole distincte:
prima parte cuprinde investigarea efectului deglicozilrii PDH asupra electroactivitii
acesteia, n timp ce, n a doua parte, este prezentat un studiu cinetic al adsorbiei unui
derivat S-calix[8]arenic pe Au.

2. OBIECTIVELE PRINCIPALE ALE TEZEI

Exist multe cercetri de-a lungul ultimelor trei decenii care ncearc s risipeasc
ceaa din domeniul electrozilor modificai. Lucrarea de fa are scopul de a:
(i) Caracteriza i de a dezvolta un nou bioelectrod cu proprieti biocatalitice
mbuntite, bazate pe deglicozilarea enzimei PDH;
(ii) Investiga procesul de reorganizare observat n cazul unui SAM, construit prin
adsorbia unui derivat S-Calix[8]arenic pe suprafaa Au policristalin.

4|

3. EFECTUL DEGLICOZILRII ASUPRA ACTIVITII

ELECTROCATALITICE MEDIAT A AMPDH CONECTAT
ELECTRIC PRIN OS-RP
Efectul deglicozilrii asupra activitii bioelectrocatalitice a PDH a fost investigat
prin efectuarea imobilizrii enzimelor gPDH sau dgPDH pe suprafaa electrodului de
grafit (Killyeni et al. 2012; Killyni et al. 2013). Imobilizarea enzimei a fost realizat
prin simpla adsorbie a acesteia, dizolvat ntr-un amestec care conine Os-RP i un agent
de reticulare (PEGDGE).

Figura 2. Prezentarea schematic a reaciei de reticulare a Os-RPII i enzim folosind

PEGDGE ca agent de reticulare.
Reacia de reticulare este prezentat n Figura 2. PEGDGE este solubil n ap i
poate s se lege de amine primare, secundare, i teriare, precum i de azot heterociclic.
n scopul de a efectua o comparaie fiabil, cantiti egale (n termeni de activitate) ale
gPDH i dgPDH au fost depuse pe suprafaa electrodului.
3.1. Optimizarea bioelectrozilor
Rspunsul unui bioelectrod este puternic influenat de civa parametri-cheie de
lucru, dintre care potenialul aplicat, pH, debitul electrolitului purttor i ncrcarea cu
enzim a bioelectrodului joac un rol important. Pentru a avea un sistem eficient este
necesar optimizarea acestor parametri-cheie.
i. Polimerul redox cu osmiu
Pentru conectarea electric a centrului activ al AmPDH la electrodul de grafit au
fost testai doi polimeri redox cu Os, solubili n ap (Os-RP) avnd diferite poteniale
formale redox standarde.
Rspunsul amperometric maxim nregistrat la electrodul G/gPDH-(Os-RPII) a fost
de aproximativ 3,5 ori mai mare dect cel msurat pentru electrodul G/gPDH-(Os-RPI).
Pentru a avea un transfer eficient de electroni Os-RPII, avnd E de +32 mV vs.
Ag|AgCl, 0.1M KCl, a fost ales cu scopul de a conecta electric centrul activ al enzimei
de electrod.

5|

ii. Debit
AmPDH este capabil de mono- respectiv dioxidarea D-glucozei, n primul pas la
2-dehidro-D-glucoz
sau
3-dehidro-D-glucoz
i
n
continuare
la
2,3-didehidro-D-glucoz (Peterbauer et al. 2010). Prin urmare, innd cont de acest
comportament complex al enzimei PDH, a fost interesant s se evalueze influena
debitului electrolitului purttor (domeniul studiat a fost 0.1 -1.8 ml / min) asupra
rspunsului bioelectrodului. Cum era de ateptat pentru msurtori tranzitorii, creterea
debitului conduce la o scdere semnificativ a curentului.
n continuare toate msurtorile s-au efectuat la un debit de 0.45 mL/min. Pentru
aceast valoare a debitului, ambii biosenzori au artat o scdere minor a rspunsului
(mai mic de 10%).
iii. Potenial aplicat
Pentru un potenial aplicat mai mare de +200 mV vs. Ag|AgCl, 0.1 M KCl, n cazul
bioelectrozilor investigai, rspunsul se plafoneaz ( Figura 4). Prin urmare, cu scopul de
a realiza cea mai mare sensibilitate la cea mai mic valoare a potenialului aplicat, un
potenial aplicat de +200 mV vs. Ag|AgCl, s-a ales 0.1M KCl pentru toate msurtorile
ulterioare.

Relative response gPDH (%)

100

Figura 3. Influena potenialului aplicat

gPDH
dgPDH

asupra rspunsului amperometric al

80

bioelectrozilor G/gPDH-(Os-RPII) and

60

G/dgPDH-(Os-RPII).
Condiii experimentale: ncrcare

40

enzimatic, 17,6 Ucm-2; 10mg/mL Os-RPII;

20

electrolit de fond, 50 mM PB coninnd 137

0
-200

-100

100

200

E / mV vs. Ag|AgCl, 0.1 M KCl

300

mM NaCl (pH 7.4); prob injectat, 50 L

de 5 mM glucoz debit, 0.45 mL/min.

iv. ncrcarea enzimatic

n scopul de a optimiza cantitatea de enzim imobilizat, electrozii modificai
AmPDH-(Os-RPII) au fost realizai cu diferite ncrcri ale enzimei. Pentru ambii
electrozi modificai pentru o ncrcare enzimatic de 23.6 Ucm-2 a fost nregistrat un
curent maxim. Pentru o ncrcare enzimatic mai mare, rspunsul acestora a fost aproape
la fel, n timp ce pentru ncrcri enzimatice mai mici curentul nregistrat a fost
semnificativ mai mic.
n consecin, indiferent de tipul de AmPDH imobilizat pe suprafaa electrodului
de grafit, o ncrcare enzimatic de 23.6 Ucm-2 a fost considerat ca valoare optim.
v. pH utilizat
O mic diferen a fost observat ntre valorile corespunztoare pH-ului optim
pentru gPDH (pH 9) i dgPDH (pH = 9,5). Cu toate acestea, toate experimentele

6|

ulterioare au fost efectuate

fiziologice (pH = 7.4).

la

valoare

pH

corespunztoare

condiiilor

3.2. Efectul deglicozilrii asupra oxidrii electrocatalitice a glucozei

n scopul de a evalua parametrii cinetice ale electrozilor modificai cu AmPDH att
electrozi modificai cu gPDH, ct i dgPDH au fost investigai ntr-un sistem sistem FI,
iar curbele de calibrare obinute pentru glucoz sunt prezentate n Figura 4 A. Parametrii
cinetici corespunztori bioelectrozilor investigai au fost estimai prin fitarea curbelor de
calibrare pentru glucoz cu ecuaia Michaelis-Menten (Tabel 1).
Tabel 1. Compararea parametrilor cinetici ai electrozilor modificai cu gPDH i dgPDH
utiliznd glucoz ca i substrat. (condiii experimentale Figura 4; 10 mg/mL Os-RPII)
Bioelectrod

jmax
(Acm-2)

KMapp
(mM)

DL*
(mM)

Domeniul
linear
(mM)

Electrozi
testai

G/gPDH-(Os-RPII)

80.9 1.9

7.5 0.3

0.01

0.1-1

G/dgPDH-(Os-RPII)

146.6 2.6

2.4 0.1

0.003

0.1-1

estimat pentru un raport ntre semnal/zgomot de 3.

Bioelectrodul bazat pe dgPDH a artat o densitate de curent catalitic semnificativ

mai mare dect cea observat pentru gPDH. Aceasta constatare dovedete activitatea
bioelectrocatalitic mai mare a enzimei deglicozilate.
gPDH
dgPDH

50

-2

75

(Acm )

100

J /

-2

J / (Acm )

45

gPDH
dgPDH

125

30

15

25
A

0
0

10

15

20

0
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

[glucose] / mM

[glucose] / mM

Figura 4 (A) curbele de calibrare i (B) domeniul linear corespunztoare electrozilor

modificai G/gPDH-(Os-RPII) i G/gPDH-(Os-RPII) utiliznd glucoz ca substrat.
Condiii experimentale: potenial aplicat, +200 mV vs. Ag|AgCl, 0.1M KCl; ncrcare
enzimatic, 17.6 Ucm-2; 10 mg/mL Os-RPII; electrolit de fond, 50 mM PB coninnd 137
mM NaCl (pH 7.4); debit, 0.45 mL/min.

7|

n acelai timp, n cazul bioelectrodului modificat cu dgPDH constanta aparent

Michaelis are o valoare mai mic comparativ cu cea estimat pentru bioelectrodul
modificat cu enzima glicozilat. Acest comportament sugereaz fie:
(i) o mai mare afinitate ntre enzim-substrat pentru dgPDH,
(ii) o mai mare permeabilitate pentru glucoz prin matricea enzimei deglicozilat
asociat cu o accesibilitate mai mare a Os-RP pentru enzima deglicozilat.
Pentru ambii bioelectrozi modificai domeniului linear a fost practic aceeai, de la
0.1 pn la 1 mM glucoz (Figura 3 B), n timp ce limitele de detecie au fost
semnificativ diferite: 0.01 i 0.003 mM pentru AmPDH glicozilat respectiv
deglicozilat.
Panta
domeniului
linear
pentru
bioelectrodul
G/dgPDH-(Os-RPII)
2
[(43.6 1.1) A/(mM/cm )] a fost aproximativ de 4.5 ori mai mare dect cea pentru
bioelectrodul G/gPDH-(Os-RPII) [(9.74 0.16) A/(mM/cm2)].
Pentru aceeai ncrcare enzimatic (exprimat n Ucm-2), bioelectrodul
G/dgPDH-(Os-RPII) prezint un rspuns amperometric mai mare comparativ cu
bioelectrodul G/gPDH-(Os-RPII), probabil datorit:
(i) unui transfer mai rapid de electroni ntre Os-RP i cofactorul enzimei dgPDH;
(ii) creterii accesibilitii substratului la centrul activ al enzimei dgPDH, indus de
permeabilitatea mai mare a reelei Os-RP dgPDH (Prvoteau et al. 2010).
3.3. Stabilitatea bioelectrozilor
Stabilitatea operaional a unui bioelectrod este unul dintre parametrii-cheie pentru
eventuala utilizare a acestuia, din acest motiv, n continuare aceasta a fost evaluat prin
efectuarea unui test de stabilitate pe termen de 80 h sub un flux constant de
5 mM glucoz (Figura 5).
100

It/Io / %

80
60
40
20
0

gPDH
dgPDH

20

40

Time / h

60

80

Figura 5. Stabilitatea
bioelectrozilor G/gPDH(Os-RPII) i G/dgPDH-(OsRPII) sub un flux constant
de 5 mM glucoz.
Condiii experimentale:
potenial aplicat, +200 mV
vs. Ag|AgCl, 0.1M KCl;
ncrcarea enzimatic, 23.6
Ucm-2; 5 mg/mL Os-RPII;
electrolit de fond, 50 mM
PB (pH 7.4); debit, 0.45
mL/min.

Liniile continue reprezint fitarea datelor experimentale cu ecuaia care descrie

descreterea exponenial a rspunsului bioelectrozilor.
Pentru ambii electrozi modificai, a fost observat o scdere accentuat a
rspunsului n primele 20 de ore. Astfel, pentru G/dgPDH-(Os-RPII), scderea a

8|

fost de ~26%, n timp ce pentru G/gPDH-(Os-RPII) scderea rspunsului a fost mai

accentuat (~38%).
3.4. Selectivitatea bioelectrozilor
AmPDH arat o activitate bioelectrocatalitic semnificativ pentru diverse
substraturi, cum ar fi: 2-deoxi-D-galactoz, celobioz, fucoz, zaharoz, trehaloz,
galactoz, xiloz (Tasca et al. 2007). n scopul de a se stabili dac deglicozilarea enzimei
induce schimbri n ordinea selectiviti acestuia, parametrii cinetici corespunztori
bioelectrozilor G/gPDH-(Os-RPII) i G/dgPDH-(Os-RPII) au fost estimai prin fitarea cu
ecuaia Michaelis-Menten a curbelor de calibrare nregistrate pentru urmtoarele
substraturi: glucoz, galactoz, lactoz, maltoz, manoz, celobioz, 2-deoxi-D-glucoz,
fucoz, zaharoz i xiloz. Sensibilitatea bioelectrozilor G/gPDH-(Os-RPII) i
G/dgPDH-(Os-RPII) pentru toate substraturile investigate a fost estimat ca raportul
dintre Imax / KMapp (Figura 6).
gPDH

-3
Sensitivity / (10 A/M)

dgPDH
4
2
0.6

0.3

0.0
Glu

Gal Lac Mal Man Cell 2-Glu Fuc Suc Xyl

Substrate

Figura 6. Sensibilitatea bioelectrozilor G/gPDH-(Os-RPII) i G/dgPDH-(Os-RPII) pentru

diferite substraturi: Glu, glucoz; Gal, galactoz; Lac, lactoz; Mal, maltoz; Man,
manoz; Cell, celobioz; 2-Glu, 2-deoxi-D-glucoz; Fuc, fucoz; Suc, zaharoz; Xyl,
xiloz.
Condiii experimentale: potenial aplicat, +200 mV vs. Ag|AgCl, 0.1M KCl; ncrcare
enzimatic, 23.6 Ucm-2; 5 mg/ml Os-RPII; electrolit de fond, 50 mM PB coninnd 137
mM NaCl (pH 7.4); debit, 0.45 mL/min
Dup cum se poate observa din Figura 6 deglicozilarea enzimei AmPDH induce
schimbri semnificative n ordinea de selectiviti a acesteia:
gPDH: Glucoz > Fucoz > Galactoz > Celobioz > Xiloz > Zaharoz >
Maltoz > Lactoz > 2-Deoxi-D-glucoz > Manoz
dgPDH: Fucoz > Glucoz > Xiloz > Zaharoz > Galactoz > Celobioz >
Maltoz > 2-Deoxi-D-glucoz > Lactoz > Manoz

9|

3.5. Descompunerea enzimei deglicozilate AmPDH i influena condiiilor de

depozitare
S-a observat c atunci cnd dgPDH este stocat n anumite condiii, enzima pierde
aproximativ 20 kDa din MW total (Yakovleva et al. 2013). Pierderea unui fragment de
peptid a dgPDH din partea C-terminal a rezultat n formarea unei enzime deglicosilate
stabile (sdgPDH).
Pentru a urmri procesul de descompunere, o cantitate de enzim PDH proaspt
purificat i deglicozilat a fost stocat la o temperatura de 4 C n loc
de -30 C (temperatura la care enzima a artat a fi stabil (Sygmund et al. 2012)).
Procesul de fragmentare a fost urmrit prin electroforez n gel (SDS-PAGE)
respectiv msurtorile de activitate a enzimei prin utilizarea Fc+ ion ca acceptor de
electroni. Toate cele trei forme ale enzimei AmPDH (gPDH, dgPDH i sdgPDH) au fost
electric conectate cu Os-RPII pe suprafaa electrozilor de grafit. Curentul generat de
oxidarea biocatalitic a glucozei la bioelectrozi modificai cu gPDH, dgPDH sau
sdgPDH au fost comparat utiliznd voltametrie ciclic, respectiv amperometrie n
sistem FI.
3.5.1. Urmrirea descompunerii enzimei deglicozilate prin SDS-PAGE
Toate cele trei forme ale enzimei AmPDH (gPDH, dgPDH i sdgPDH) au fost
investigate prin utilizarea SDS-PAGE, gelurile fiind colorate cu azotat de argint pentru
vizualizarea proteinelor (Bartsch et al. 2012). Greutatea molecular a gPDH exprimat n
P. pastoris a fost determinat a fi de aproximativ ~95 kDa (Figura 7 A, B) valoare
similar cu cea raportat precedent (Sygmund et al. 2012). PDH apare ntr-o band larg
datorit posibilelor variaii structurale datorit coninutului mare de glicani
(Mechref et al. 2002). Band major la ~65 kDa poate fi atribuit enzimei deglicozilate
(dgPDH), diferena de ~30-35 kDa fiind atribuit glicanilor nlturai de pe lanul
peptidei. Band minor la ~46 kDa este asociat cu enzima deglicozilat fragmentat
(sdgPDH), fragmentarea fiind un proces care are loc atunci cnd dgPDH a fost
stocat la + 4 C (Figura 7). PDH deglicozilat stabilizat (sdgPDH) apare ca urmare a
pierderii unui fragment de ~20 kDa din partea C-terminal a proteinei, chiar i n absena
unei activiti proteolitice.

Figura 7. Caracterizarea descompunerii enzimei n timp utiliznd 10% acrilamid SDSPAGE; pentru vizualizarea peptidei s-a folosit azotat de argint: (A) coloana 1 marker
A
de greutate molecular; coloana 2,3 dgPDH; coloana 4,5 sdgPDH; coloana 6,7
gPDH; (B) coloana 1 marker de greutate molecular; coloana 2,3 gPDH; coloana 4,5
sdgPDH ( dup 2 sptmni); coloana 6,7 sdgPDH (dup 3 luni).
Enzima a fost pstrat la 4 0C.

10 |

3.5.2. Determinarea spectrofotometric a activitii enzimei

Activitatea volumetric a dgPDH (sdgPDH) respectiv gPDH a fost msurat n
termen de trei luni utiliznd Fc+ ca electron acceptor i glucoz ca substrat.

Activity / UmL

-1

2500

gPDH
dgPDH

Figura 8. Schimbarea n
timp a activitii
enzimatice a enzimelor
gPDH i dgPDH.
Activitatea volumetric a
fost msurat cu ajutorul
glucozei utilizat ca
substrat i Fc+ ca electron
acceptor

2000

1500

1000

500

0
0

20

40

Time

60

80

100

/ day

Din Figura 8 se poate observa c activitatea enzimei dgPDH crete progresiv

atingndu-se un platou dup aproximativ dou luni, n timp ce pentru gPDH nu s-au
observat modificri de activitate.
3.5.3. Oxidarea electrocatalitic a glucozei pe electrozi modificai cu gPDH, dgPDH
i sdgPDH
Enzima sdgPDH a pierdut o parte din lanul peptidic, fapt ce ar putea micora
distana dintre centrul activ al enzimei i mediator sau electrod, facilitnd astfel transferul
de electroni. Pentru a investiga acest aspect, comportamentul electrochimic al enzimei
sdgPDH a fost comparat cu cel al enzimelor gPDH i dgPDH. Toate cele trei forme ale
enzimei AmPDH (sdgPDH, dgPDH i gPDH) au fost co-imobilizate consecutiv cu OsRPII n prezena PEGDGE pe suprafaa unui electrod de grafit, n acelai mod precum
cel descris n (Yakovleva et al. 2012) i au fost investigate utilizndu-se voltametria
ciclic (rezultate doar in tez) i amperometria n sistem FI.
Curbele de calibrare corespunztoare oxidrii electrocatalitice a glucozei pe
bioelectrozii modificai cu gPDH, dgPDH, respectiv sdgPDH sunt prezentate n Figura 9.
Parametrii cinetici pentru bioelectrozii investigai au fost estimai prin fitarea rezultatelor
experimentale cu ecuaia Michaelis-Menten.

11 |

20
100

gPDH
dgPDH
sdgPDH

50

10

-2

150

/ (Acm ) (sdgPDH)

30

-2

J / (Acm ) ( gPDH, dgPDH)

200

0
0

10

[glucose]

15

20

mM

Figura 9. Curbe de calibrare ai biolectrozilor G/gPDH-(Os-RPII), G/dgPDH-(Os-RPII)

i G/sdgPDH-(Os-RPII) utiliznd glucoz ca substrat.
Condiii experimentale: potenial aplicat +200 mV vs. Ag|AgCl, 0.1M KCl; electrolit de
fond, 50 mM PB coninnd 137 mM NaCl (pH 7.4); debit, 0.45 mL/min.
cretere semnificativ a densitii de curent catalitic maxim
[jmax = (230.8 4.9) Acm-2] poate fi observat n cazul bioelectrodului
G/sdgPDH-(Os-RPII) comparativ cu cea nregistrat pentru bioelectrodul
G/gPDH-(Os-RPII) [jmax = (16.3 0.7) Acm-2] sau pentru bioelectrodul
G/dgPDH-(Os-RPII) [jmax = (33.9 0.4) Acm-2]. Constanta aparent Michaelis pentru
ambii, dgPDH [KMapp = (1.8 0.1) mM] i sdgPDH [KMapp = (3.0 0.2) mM] este mai
mare comparativ cu cea pentru gPDH [KMapp = (5.5 0.5) mM] fapt care indic:
O

o mai mare afinitate ntre enzim i substrat, n cazul bioelectrozilor modificai cu

sdgPDH i dgPDH;
o permeabilitate mai mare a matricelor enzimatice, n cazul sdgPDH i dgPDH
pentru glucoz, ceea ce nseamn c difuzia substratului spre centrul activ al
acestor enzime este mai uoar

Att creterea remarcabil a curentului catalitic de oxidare pentru sdgPDH, ct i

scderea KMapp susin ideea c pierderea spontan a fragmentului peptidic din partea
terminal a proteinei joac un rol important n performana catalitic a enzimei
descompuse care i pstreaz centrul activ.

12 |

4. STUDIUL CINETIC AL ADSORBIEI S-ACETILCLIX[8]ARENEI I REORGANIZRII FILMULUI FORMAT PE

SUPRAFA AU POLICRISTALIN
Studiul de fa (Killyeni et al. 2013) a fost realizat cu scopul de a obine un
electrod modificat cu un derivat calixarenic (S-Calix). Datorit binecunoscutelor
proprieti de recunoatere ale calixarenei, s-a presupus c electrodul modificat cu SCalix va avea capacitatea de a recunoate anumite specii chimice.
n acest scop, utiliznd interaciunea puternic dintre atomii de S i Au s-a format
un strat de S-Calix, prin simpla adsorbie a acesteia pe suprafaa unui electrod de Au
policristalin. Cu ajutorul msurtorilor de spectroscopie de impedan a fost posibil
urmrirea cineticii adsorbiei S-Calix pe Au i n continuare s-a putut studia cinetica
procesului de reorganizare a mono-stratului auto-asamblat (SAM) forat pe electrodul de
Au policristalin.
Electrozii modificai Au/S-Calix au fost preparai prin simpla imersie a unor fire de
Au ntr-o soluie adecvat de S-Calix.
4.1. Msurtori de voltametrie ciclic
Voltamogramele ciclice pentru cuplul HCF(III/II) nregistrate pentru un electrod de
Au, un electrod modificat Au/S-calix i un electrod modificat Au/S-Calix,MUA sunt
prezentate n
Figura 10.
In cazul electrodului de Au nemodificat se observ o pereche de picuri
voltametrice bine definite, specifice unui cuplu redox dizolvat, cu transfer de sarcin
cuasi-reversibil. Valoarea estimat a potenialului standard formal, obinut prin
medierea potenialelor de pic, este de 0.26 V vs. Ag/AgCl, 3 M NaCl, fiind o valoare
apropiat de cea caracteristic cuplului HCF(III/II).
Dup modificarea electrodului cu S-Calix, perechea de picuri voltametrice se
modific prin scderea curenilor de pic i prin creterea separrii potenialelor de pic.
Scderea intensitii curentului de pic a fost atribuit unor modificri de la interfaa
electrodic n sensul micorrii suprafeei accesibile cuplului redox ca urmare a
adsorbiei calixarenei. Scderea important a curentului sugereaz c o fraciune mare a
interfeei este blocat cu S-Calix i astfel accesul cuplului redox utilizat ca sond
electrochimic la interfa devine restricionat. Totodat, trebuie s menionm c n
intervalul de potenial studiat nu au fost prezente alte picuri adiionale datorate prezenei
calixarenei.

13 |

90
60

Au
Au/S-Calix
Au/S-Calix,MUA

I / A

30
0
-30
-60
-90
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Figura 10. Rspunsul

voltammetric al 5 mM
HCF(II)/(III) nregistrat la
electrodul de Au, respectiv
electrozii modificai Au/S-Calix i
Au/S-Calix,MUA.
Condiii experimentale: vitez de
baleiaj, 50 mV/s; potenial de
start, 0.3 V vs. Ag|AgCl,3M
NaCl; electrolit de fond, 1 M KCl.

E / V vs. Ag/AgCl, 3M NaCl

Alura voltamogramei nregistrate la electrodul modificat Au/S-Calix arat c

suprafaa electrodului nu este complet blocat. Pentru a se verifica aceast presupunere
au fost trasate voltamograme ciclice pentru cuplu redox HCF(III/II) la electrozii
modificai Au/S-Calix,MUA, deoarece moleculele de MUA au o mare abilitate de a
forma un mono-strat compact pe suprafaa electrodului de Au in comparaie cu S-Calix.
Scderea curentului de pic observat n cazul electrodului modificat cu Au/SCalix,MUA indic faptul c toat suprafaa electrodic este blocat cu molecule de SCalix i MUA, ambii compui fiind electrochimic inactivi n domeniul de potenial
investigat.
4.2. Msurtori de spectroscopie de impedan electrochimic
4.2.1. Adsorbia S-Calix
Cinetica adsorbiei S-Calix pe Au a fost monitorizat prin msurtori de
impedan electrochimic, efectuate succesiv la intervale de 87 secunde, n timpul
procesului de adsorbie (4 ore). Spectrele de impedan obinute au acoperit intervalul de
frecven cuprins ntre 100 Hz i 23 kHz, interval n care s-au alese 23 de frecvene.
Pentru fiecare spectru de impedan, amplitudinea semnalului alternativ a fost de 10 mV,
iar valoarea componentei continue a corespuns valorii potenialului de circuit deschis
(OPC).
Spectrele de impedan obinute au fost interpretate folosindu-se circuitul electric
echivalent prezentat n Figura 11.

14 |

Figura 11. Circuitul electric echivalent utilizat pentru modelarea spectrelor de impedan
nregistrate n timpul adsorbiei S-Calix pe electrod de Au. Elementele circuitului electric
echivalent sunt: Rs rezistena soluiei, Rct rezistena de transfer de sarcin; CPE element de
faz constant.
Spectrele de impedan nregistrate au fost fitate pe circuitul electric echivalent
menionat anterior, iar o selecie reprezentativ a valorilor parametrilor modelului, pentru
cteva valori de timp, este prezentat n Tabel 2. Toate valorile parametrilor sunt nsoite
de semilimea intervalelor de ncredere (calculate pentru un interval de ncredere de
95%) i de criteriul de calitate al corelaiilor (Chi2).
Pentru identificarea etapei determinante de vitez a procesului de adsorbie, s-au
utilizat dou modele cinetice, care coreleaz fracia de acoperire cu timpul (Subramanian
et al. 2000):
i.
Modelul pur difuziv, model descris de ecuaia:
(t) = kdCt1/2
(1)
unde: (t) este fracia acoperit, C este concentraia S-Calix, t este timpul, kd este
constanta de vitez al difuziei
n prima parte a procesului (t < 20 min) se constat o bun liniarizare a dependenei
fraciei de acoperire de t1/2, fapt care susine valabilitatea modelului pur difuziv
(Figura 12 A).
ii. Modelul Langmuir, model descris de ecuaia:
(t) = 1 exp(kmt)
(2)
Unde: (t) este fracia de acoperire; t este timpul; km este constanta de vitez a
procesului de adsorbie.
n a doua parte a procesului de adsorbie se observ o liniarizare mai bun n
coordonate ln(1-) vs. t, ceea ce indic faptul c procesul de adsorbie este bine descris n
aceast etap de un modelul Langmuir (Figura 12 A).

15 |

1.0

0.5

0.0
0

20

40
1/2

60

80

1/2

/ s

Ln (1 - )

-1

-2

-3
0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

t / h
Figura 12. (A) Variaia fraciei acoperite cu t1/2 (liniarizare corespunztoare modelului
pur difuziv); (B) variaia of ln(1 ) cu t (liniarizarea modelului Langmuir cu control
difuziv).
Condiii experimentale: potenial aplicat (OCP), 0.33 V vs. Ag|AgCl, 3 M NaCl;interval
de frecven,100 Hz la 23 kHz (23 valori); amplitudine, 10 mV;
soluie de lucru, 1.16 mg/L S-Calix n CHCl3/C2H5OH 1:1 (v/v) coninnd 0.05 M LiClO4
ca electrolit de fond.

16 |

Tabel 2. Evoluia n timp a parametrilor Rs, Rct, Q i (circuit electric echivalent din Figura 11) n timpul adsorbiei S-Calix pe
electrodul de Au

17 |

Timp
(s)

Rs
( cm2)

Rct
(k cm2)

Q
-1
(M cm-2s)

Chi2 / N
(2 cm4)

75.30 0.33

0.97 0.16

6.127 0.075

0.669 0.034

0.81 / 23

304

75.21 0.35

0.98 0.14

5.551 0.067

0.644 0.034

0.89 / 23

652

74.82 0.41

1.13 0.19

5.344 0.081

0.598 0.042

1.19 / 23

1000

75.14 0.38

1.09 0.16

5.143 0.064

0.635 0.036

1.06 / 23

2044

75.32 0.41

1.23 0.19

4.828 0.062

0.616 0.037

1.18 / 23

3001

75.25 0.42

1.30 0.20

4.649 0.060

0.607 0.038

1.27 / 23

5002

74.48 0.44

1.32 0.19

4.406 0.055

0.604 0.038

1.35 / 23

8047

73.20 0.48

1.44 0.19

4.099 0.053

0.585 0.041

1.58 / 23

14050

73.56 0.47

1.46 0.21

4.062 0.069

0.590 0.039

1.63 / 23

4.2.2. Procesul de reorganizare a monostratului de S-Calix

Msurtorile voltametrice au evideniat faptul c stratul de S-Calix, auto-asamblat
pe suprafaa Au, trece printr-o evoluie lent n timp, probabil datorit reorganizrii sale
ceea ce determin o cretere a fraciei acoperite a electrodului modificat Au/S-Calix.
Acest proces de reorganizare a fost explorat tot prin utilizarea spectroscopiei de
impedan pentru electrozi modificai Au/S-Calix. Spectrele Nyquist obinute, coninnd
57 de valori ale frecvenei
(de la 0,01 Hz pn la 100 kHz), prezint caracteristicile
tipice ale unui proces controlat de activare i difuzie.
Dup cum se poate observa din Figura 1112, indiferent de timpul de nregistrare
toate spectrele sunt alctuite: (i) dintr-un semicerc (datorat procesului de transfer de
sarcin i situat n domeniul de frecvene nalte) (ii) cuplat cu o linie de transport
Warburg (corespunznd difuziei cuplul redox i situat n domeniul de frecvene joase).
Acest comportament este similar cu cel observat n cazul electrodului de Au (
Figura 13), cu excepia faptului c procesul transfer de sarcin aste mult mai rapid
n cazul electrodului nemodificat.
n timp, rezistena transferul de sarcin, arat o cretere monoton, sugernd o
cretere a suprafeei blocate a electrodului, care ngreuneaz procesul de transfer de
sarcin. Acest comportament este foarte probabil o consecin a creterii acoperirii
electrodului, indus de o rearanjare a statului auto-asamblat de S-Calix.
Chiar i dup un interval mare de timp (t> 20 h), n spectrele de impedan
nregistrate se poate observa semicercul reprezentnd transferul de sarcin. Acest lucru
indic faptul c stratul S-Calix, format i reorganizat pe suprafaa electrodului nu
blocheaz complet procesul de transfer de electroni al suprafeei de Au.
Aceast ipotez a fost confirmat, prin scderea semnificativ a diametrului
semicercului observat n spectrele de impedan nregistrate la electrodul modificat
Au/S-Calix,MUA, care coroboreaz i cu rspunsul voltametric nregistrat la acelai
electrod.
8
250

Z /

200

150

im

100

0h
3h
6h
9h
12 h
15 h
18 h
21 h
24 h

-Zim/k

50

50

100

150

200

250

Z re /

0
0

Figura 13. Spectre de impedan

nregistrate la electrozi modificai
Au/S-Calix. nserat: spectrul de
impedan nregistrat la electro de Au
la pH 7.
Condiii experimentale: Potenial
aplicat, +0.24 V vs. Ag|AgCl, 3M
NaCl; domeniu de frecven, de la
10 mHz la 100 kHz (57 valori); ac
amplitudinea, 10 mV; electrolit de
fond, 1 M KCl

Zre/k

.
Pentru modelarea spectrele de impedan nregistrate n etapa de reorganizare a
stratului S-Calix format pe suprafaa Au, s-a utilizat circuitul electric echivalent prezentat
n Figura 14. Acest circuit echivalent pornete de la modelul propus de Finklea
18 |

(Finklea et al. 1993; Rueda et al. 2011) pentru pori activi nconjurai de zone inactive.
Aceast idee este rezonabil lund n considerare conformaia aparte a moleculei S-Calix,
care formeaz un strat auto-asamblat mai puin compact dect tioalkeneii.

Figura 14. Circuitul electric echivalent utilizat pentru modelarea spectrelor de

impedan nregistrate n timpul reorganizrii stratului de S-Calix pe suprafaa
electrodului modificat Au/S-Calix. Elementele circuitului electric echivalent sunt: Rs
rezistena soluiei, Rct rezistena de transfer de sarcin; Cd capacitatea stratului dublu
electric, Zw este impedana Warburg.

Figura 15. Circuitul electric echivalent utilizat pentru modelarea spectrelor de

impedan nregistrate pentru (A) electrodul de Au i (B) electrodul modificat Au/SCalix,MUA. Elementele circuitului electric echivalent sunt: Rs rezistena soluiei, Rct
rezistena de transfer de sarcin; Cd capacitatea stratului dublu electric, CPE element de
faz constant, Zw este impedana Warburg.
Datele suplimentare, necesare pentru a modela circuitul echivalent, au fost obinute
prin modelarea spectrelor de impedan nregistrate la electrozi de Au folosind circuitul
echivalent din Figura 14 (A) i electrozi modificai cu Au/S-Calix,MUA din
Figura 14 (B).
Cu ajutorul datelor estimate prin fitarea spectrelor de impedan nregistrate la
electrozi de Au i electrozii modificai Au/S-Calix,MUA prezentate n tabel 3 i valorile
estimate prin fitarea spectrelor corespunztore electrodului modificat Au/S-Calix tabel 4
s-a putut calcula fracia de acoperire a electrozilor modificai cu S-Calix la diferite
intervale de timp.

19 |

Tabel 3. Valorile parametrilor utilizai pentru modelarea spectrelor de impedan corespunzatoare electrodului de Au, respectiv
electrodului modificat Au/S-Calix,MUA (Circuit electric echivalent din Figura 14)

Electrod

Chi2 / N

( s-1/2 cm2)

(2 cm4)

0.55 0.10

22.8 0.2

0.00001 / 57

161 44

0.75 0.03

28.2 0.6

0.00006 / 57

655.7 1.2

6.12 0.07

0.940 0.002

30.6 0.4

2.66 / 57

2440.9 3.8

6.61 0.05

0.943 0.002

28.7 1.2

33.32 / 57

Rs

Rct

( cm2)

( cm2)

(M-1 cm-2 s)

0.93 0.74

5.23 1.29

615 124

0.45 0.38

10.29 0.80

0.87 1.11

1.37 1.58

pH

Au

Au/S-Calix,MUA

20 |

Tabel 4. Evoluia n timp a parametrilor circuitului electric echivalent prezentat in Figura 14 pentru monitorizarea reorganizrii
stratului de S-Calix format prin auto-asamblare pe electrozii de Au
Electrode

pH

Timp

Rs

Cd

1-

Chi2 / N

(h)

( cm2)

(F cm-2)

(%)

(s-1)

(2 cm4)

0.86 1.53

2.82 0.62

3.96 0.19

245 55

61.3 / 57

0.50 2.67

2.89 0.26

1.42 0.03

236 34

110.5 / 57

12

1.06 3.80

2.76 0.27

0.95 0.03

222 33

161.4 / 57

18

0.89 7.02

2.67 0.47

0.77 0.04

189 28

249.7 / 57

3.17 0.76

5.39 0.03

4.59 0.02

334 13

0.9 / 57

4.07 1.39

4.92 0.03

1.53 0.01

221 12

7.2 / 57

12

4.22 2.56

4.64 0.05

1.09 0.01

171 13

29.3 / 57

18

4.12 3.63

4.46 0.06

0.90 0.01

149 14

62.1 / 57

Au/S-Calix

21 |

Datele prezentate n tabelul 4 indic n mod clar faptul c stratul S-Calix trece printr-un
proces de reorganizare lent, implicnd moleculele deja imobilizate de S-Calix. Reorganizarea
induce o scdere semnificativ a suprafeei libere a electrodului (Figura 6). Este demn de
menionat c scderea total a suprafeei libere este n concordan cu scderea observat pe
voltamogramele nregistrate la electrodul modificat Au/S-Calix (vezi Figura 10).
0.05

pH5
pH7

0.04

Figura 16. Evoluia n

timp a suprafeei libere (1 )
pentru electrodul modificat
Au/S-Calix la pH 5 i pH 7.

1-

0.03

0.02

0.01

0.00
0

10

Time / h

15

20

n esen, procesul de reorganizare const n creterea numrului de legturi S-Au pentru

moleculele de S-Calix deja imobilizate prin conversiea conformaional adecvat a moleculelor
S-Calix. Acest proces este datorat afinitii remarcabile dintre atomi de S i Au, care favorizeaz
legarea tuturor atomilor de S din molecula S-Calix. Pe de alt parte, procesul de reorganizare
este facilitat de flexibilitatea binecunoscut a scheletului moleculei calix[8]arenei, care permite
o multitudine de conformaii, consolidat de prezena substituenilor de mici dimensiuni, cum ar
fi -S-CO-CH3 (pe partea superioar) i -O-CH3 (pe partea inferioar) (Neri et al. 2002).

22 |

5. CONCLUZII GENERALE
I. Efectul deglicozilrii enzimei AmPDH exprimat n P. pastoris a fost studiat prin
realizarea de electrozi modificai cu AmPDH. Stabilitatea enzimei dgPDH n soluie a fost
urmrit prin msurtori SDS-PAGE i UV/Vis. Activitatea biocatalitic a electrozilor
modificai cu enzima PDH a fost evaluat cu ajutorul voltametriei ciclice i msurtorilor
amperometrice n sistem FI.
Din msurtorile de electroforez n gel (SDS-PAGE) s-a observat c, datorit
expresiei n organism-gazd P. pastoris, gPDH este n mai mare msur glicozilat. Prin
diminuarea parial a coninutului de glicani, masa enzimei scade de la 95-100 kDa la ~ 65
kDa ( diferena fiind glicanii eliminai din lanul peptidic)
Pentru aceeai ncrcare enzimatic (exprimat n Ucm-2), bioelectrodul G/dgPDH(Os-RPII) prezint un rspuns amperometric mai mare comparativ cu bioelectrodul
G/gPDH-(OS-RPII). n acelai timp, deglicozilarea enzimei AmPDH a dus la scderea
valorii constantei Michaelis, comparativ cu cea estimat pentru enzima iniial.
Deglicozilarea enzimei AmPDH induce modificri semnificative n ordinea
selectiviti acesteia:
gPDH: Glucoz > Fucoz > Galactoz > Celobioz > Xiloz > Zaharoz >
Maltoz > Lactoz > 2-Deoxi-D-glucoz > Manoz
dgPDH: Fucoz > Glucoz > Xiloz > Zaharoz > Galactoz > Cellobioz >
Maltoz > 2-Deoxi-D-glucoz > Lactoz > Manoz
Bioelectrodul bazat pe enzima PDH deglicozilat arat o stabilitate n timp mai bun
dect bioelectrodul bazat pe enzima PDH glicozilat.
S-a constatat c dup dou luni de stocare la 4 C, enzima dgPDH sufer o
fragmentare spontan. Enzima stabil rezultat (sdgPDH) are MW de ~46 kDa i dispune
de o activitate enzimatic mai ridicat comparativ cu cea a enzimelor glicozilate i
deglicozilate.
II. A doua parte a lucrrii de fa a fost consacrat investigrii: absorbiei moleculei S-Calix
i procesului de reorganizare a SAM format pe suprafa de Au policristalin, folosind
voltametrie ciclic, spectroscopie Raman, microbalan de cuar i msurtori de spectroscopie
de impedan electrochimic.
Msurtorile de voltametrie ciclic efectuate n prezena cuplului redox HCF (III/II),
evideniaz o evoluie n timp a permeabilitii stratului format prin simpla adsorbie a
moleculei S-Calix pe suprafaa de Au. Rspunsul voltametric observat la electrodul
modificat Au/S-Calix sugereaz un proces de reorganizare care apare n stratul autoasamblat de S-Calix, avnd ca rezultat creterea suprafeei blocate de electrodul modificat
Au/S-Calix.
Msurtorile de spectroscopie de impedan au fost utilizate pentru a descrie procesul
de adsorbie a moleculei S-Calix. Astfel, nceputul procesului de adsorbie prezint
caracteristicile unui proces controlat de difuzie pur, dar n a doua parte se supune
modelului Langmuir.
23 |

 La sfritul procesului de adsorbie ( > 0,9), un proces lent de reorganizare are loc,
care const n creterea numrului de legturi S-Au pentru moleculele de S-Calix deja
adsorbite. Acest proces de reorganizare este determinat de mare afinitatea existent ntre
atomi de S i Au. Pe de alt parte, acest proces este facilitat de flexibilitatea remarcabil a
scheletului moleculei de calix[8]aren. La starea de echilibru, moleculele S-Calix sunt
organizate ntr-un monostrat pe suprafaa Au policristalin, fiecare molecul fiind ataat
prin 3-4 atomii de S.
Se poate afirma c monostratul de S-Calix format prin auto-asamblare pe Au ofer un
mod simplu, rapid i eficient pentru un design versatil de materiale inteligente, care
prezint proprieti interesante pentru recunoaterea ionic sau molecular

6. ACTIVITATEA TIINIFIC
6.1. Articole
I.

II.

III.

IV.

V.

Maria E. Yakovleva, Aniko Killyeni, Roberto Ortiz, Christopher Schulz, Domhnall

MacAodha, Peter . Conghaile, Dnal Leech, Ionel Catalin Popescu, Christoph
Gonaus, Clemens K. Peterbauer, Lo Gorton, (2012) Recombinant pyranose
dehydrogenase A versatile enzyme possessing both mediated and direct electron
transfer. Electrochemistry Communications 24, 120122
Aniko Killyeni, Maria E. Yakovleva, Clemens K. Peterbauer, Dnal Leech, Lo Gorton,
Ionel Catalin Popescu, (2012) Effect of enzyme deglycosylation on the amperometric
detection of glucose at PDH-modified electrode, Studia Universitatis Babes-Bolyai,
Seria Chemia 4, 87-99
Aniko Killyeni, Adrian Nicoara, Vali Canpean, Attila Kun, Simion Astilean, Ionel
Catalin Popescu, (2013) S-acetyl-calix[8]arene adsorption on polycrystalline Au
surface: A kinetic study, Electrochimica Acta 102, 225232
Anik Killyni, Maria E. Yakovleva, Domhnall MacAodha, Peter Conghaile,
Christoph Gonaus, Dnal Leech, Ionel Catalin Popescu, Clemens K. Peterbauer, Lo
Gorton, (2013) Effect of deglycosylation on the mediated electrocatalytic activity of
recombinantly expressed Agaricus meleagris pyranose dehydrogenase wired by
ososmium- redox polymer, Electrochimica Acta (trims spre publicare)
Maria Yakovleva, Anik Killyni, Oliver Seubert, Peter Conghaile, Domhnall
MacAodha, Dnal Leech, Christoph Gonaus, Ionel Catalin Popescu, Clemens K.
Peterbauer, Sven Kjellstrm, Lo Gorton, (2013) Further insights into the catalytical
properties of deglycosylated pyranose dehydrogenase from Agaricus meleagris
recombinantly expressed in Pichia pastoris, Electrochimica Acta (trimis spre
publicare)

24 |

6.2. Participri la conferine

I.

II.

III.

IV.

V.

VI.

VII.

Anik Killyni, Adrian Nicoara, Graziella Liana Turdean, Ionel Catalin Popescu, (2011)
Electrochemical investigation of self-assembled calixarenes on gold. 17th Conferin
internaional chimie, Cluj-Napoca, Romania, 4-6 Noiembrie (poster)
Aniko Killyeni, Vali Canpean, Adrian Nicoara, Graziella Liana Turdean, Ionel Catalin
Popescu, Simion Astilean, (2011) Electrochemical investigation of self-assembled Sacetyl-calix[8]arene on gold for molecular recognition. Advance Spectroscopies on
Biomedical Nanostructured Systems (BioNanoSpec), 7 Septembrie (comunicare
oral)
Aniko Killyeni, Maria E. Yakovleva, Lo Gorton, Ionel Catalin Popescu, (2012) Effect of
PDH deglycosylation on the glucose amperometric detection. 18th Conferin
internaional chimie, Bile Felix, Romania, 23-25 Noiembrie (comunicare oral)
Anik Killyni, Maria Yakovleva, Lo Gorton, Ionel Catalin Popescu, (2013) Effect of
Deglycosylation on the Selectivity of Agaricus meleagris Pyranose Dehydrogenase
Modified Electrodes. 12th Topical Meeting of the International Society of
Electrochemistry/XXII International Symposium on Bioelectrochemistry and
Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, 17-21 Martie (poster)
Maria Yakovleva, Anik Killyni, Clemens K. Peterbauer, Ionel Catalin Popescu, Lo
Gorton, (2013) Further insights into catalytical properties of deglycosylated
pyranose dehydrogenase from Agaricus meleagris recombinantly expressed in
Pichia pastoris. 12th Topical Meeting of the International Society of
Electrochemistry/XXII International Symposium on Bioelectrochemistry and
Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, 17-21 March (comunicare oral)
Anik Killyni, Maria Yakovleva, Lo Gorton, Ionel Catalin Popescu, (2013) Improved
biosensors by deglycosylation of pyranose dehydrogenase isolated from Agaricus
meleagris. 4th Regional Symposium on Electrochemistry South East Europe, 26 - 30
Mai (poster)
Adrian Nicoara, Anik Killyni, Ionel Catalin Popescu (2013) Formation and
reorganization kinetics of self-assembled calixarene on gold 4th Regional
Symposium on Electrochemistry South East Europe, 26 - 30 Mai (poster)

25 |

7. REFERINE (SELECTIVE)
Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M., 2012. Silver staining
techniques of polyacrylamide gels. . In: Kurien, B.T., Scofield, R.H. (Eds.), Protein
Electrophoresis, pp. 481-486. Humana Press.
Buck, M., 2009. Structure, Electrochemistry and Applications of Self-Assembled
Monolayers of Thiols. Chemically Modified Electrodes, pp. 197-255. Wiley-VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA.
Courjean, O., Flexer, V., Prvoteau, A., Suraniti, E., Mano, N., (2010); Effect of Degree
of Glycosylation on Charge of Glucose Oxidase and Redox Hydrogel Catalytic Efficiency,
ChemPhysChem 11(13), 2795-2797.
Ferapontova, E.E., Grigorenko, V.G., Egorov, A.M., Borchers, T., Ruzgas, T., Gorton, L.,
(2001); Direct electron transfer in the system gold electrode-recombinant horseradish
peroxidases, Journal of Electroanalytical Chemistry 509(1), 19-26.
Ferapontova, E.E., Shleev, S., Ruzgas, T., Stoica, L., Christenson, A., Tkac, J.,
Yaropolov, A.I., Gorton, L., 2005. Direct Electrochemistry of Proteins and Enzymes. In: Emil
Paleek, F.S., Wang, J. (Eds.), Perspectives in Bioanalysis, pp. 517-598. Elsevier.
Fraser, D.M., Zakeeruddin, S.M., Grtzel, M., (1992); Mediation of glycoslated and
partially-deglycosylated glucose oxidase of Aspergillus niger by a ferrocene-derivatised
detergent, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1099(1), 91-101.
Frew, J.E., Hill, H.A.O., Thomas, J.D.R., (1987); Electron-Transfer Biosensors [and
Discussion], Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 316, 95-106.
Killyeni, A., Nicoara, A., Canpean, V., Kun, A., Astilean, S., Popescu, I.C., (2013); Sacetyl-calix[8]arene adsorption on polycrystalline Au surface: A kinetic study, Electrochim.
Acta 102(0), 225-232.
Killyni, A., Yakovleva, M.E., MacAodha, D., Conghaile, P.., Gonaus, C., Leech, D.,
Popescu, I.C., Peterbauer, C.K., Gorton, L., (2013); Effect of deglycosylation on the mediated
electrocatalytic activity of recombinantly expressed Agaricus meleagris pyranose
dehydrogenase wired by ososmium- redox polymer, Electrochim. Acta subbmited.
Killyeni, A., Yakovleva, M.E., Peterbauer, C.K., Leech, D., Gorton, L., Popescu, I.C.,
(2012); Effect of enzyme deglycosylation on the amperometric detection of glucose at PDHmodified electrode, Studia Universitatis Babes-Bolyai, Seria Chemia 4.
Lindgren, A., Tanaka, M., Ruzgas, T., Gorton, L., Gazaryan, I., Ishimori, K., Morishima,
I., (1999); Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase:
insight into the mechanism, Electrochemistry Communications 1(5), 171-175.
Marcus, R.A., (1964); Chemical and Electrochemical Electron-Transfer Theory, Annual
Review of Physical Chemistry 15, 155-196.
Mechref, Y., Novotny, M.V., (2002); Structural Investigations of Glycoconjugates at
High Sensitivity, Chemical Reviews 102(2), 321-370.
26 |

Ortiz, R., Matsumura, H., Tasca, F., Zahma, K., Samejima, M., Igarashi, K., Ludwig, R.,
Gorton, L., (2012); Effect of Deglycosylation of Cellobiose Dehydrogenases on the
Enhancement of Direct Electron Transfer with Electrodes, Analytical Chemistry 84(23), 1031510323.
Peterbauer, C.K., Volc, J., (2010); Pyranose dehydrogenases: biochemical features and
perspectives of technological applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(4), 837-848.
Presnova, G., Grigorenko, V., Egorov, A., Ruzgas, T., Lindgren, A., Gorton, L., Borchers,
T., (2000); Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidases on
gold, Faraday Discussions 116, 281-289.
Prvoteau, A., Courjean, O., Mano, N., (2010); Deglycosylation of glucose oxidase to
improve biosensors and biofuel cells, Electrochemistry Communications 12(2), 213-215.
Subramanian, R., Lakshminarayanan, V., (2000); A study of kinetics of adsorption of
alkanethiols on gold using electrochemical impedance spectroscopy, Electrochim. Acta 45(27),
4501-4509.
Sygmund, C., Gutmann, A., Krondorfer, I., Kujawa, M., Glieder, A., Pscheidt, B.,
Haltrich, D., Peterbauer, C., Kittl, R., (2012); Simple and efficient expression of Agaricus
meleagris pyranose dehydrogenase in Pichia pastoris, Appl. Microbiol. Biotechnol. 94(3), 695704.
Sygmund, C., Kittl, R., Volc, J., Halada, P., Kubatova, E., Haltrich, D., Peterbauer, C.K.,
(2008); Characterization of pyranose dehydrogenase from Agaricus meleagris and its
application in the C-2 specific conversion of d-galactose, J. Biotechnol. 133(3), 334-342.
Tasca, F., Timur, S., Ludwig, R., Haltrich, D., Volc, J., Antiochia, R., Gorton, L., (2007);
Amperometric Biosensors for Detection of Sugars Based on the Electrical Wiring of Different
Pyranose Oxidases and Pyranose Dehydrogenases with Osmium Redox Polymer on Graphite
Electrodes, Electroanalysis 19(2-3), 294-302.
Volc, J., Sedmera, P., Halada, P., Daniel, G., Prikrylova, V., Haltrich, D., (2002); C-3
oxidation of non-reducing sugars by a fungal pyranose dehydrogenase: spectral
characterization, J. Mol. Catal. B-Enzym. 17(2), 91-100.
Volc, J., Sedmera, P., Halada, P., Prikrylova, V., Daniel, G., (1998); C-2 and C-3
oxidation of d-Glc, and C-2 oxidation of d-Gal by pyranose dehydrogenase from Agaricus
bisporus, Carbohydr. Res. 310(1), 151-156.
Yakovleva, M., Killyn, A., Seubert, O., Conghaile, P., , MacAodha, D., Leech, D.,
Gonaus, C., Popescu, I.C., Peterbauer, C.K., Kjellstrm, S., Gorton, L., (2013); Further insights
into the catalytical properties of deglycosylated pyranose dehydrogenase from Agaricus
meleagris recombinantly expressed in Pichia pastoris, manuscript.
Yakovleva, M.E., Killyni, A., Ortiz, R., Schulz, C., MacAodha, D., Conghaile, P..,
Leech, D., Popescu, I.C., Gonaus, C., Peterbauer, C.K., Gorton, L., (2012); Recombinant
pyranose dehydrogenaseA versatile enzyme possessing both mediated and direct electron
transfer, Electrochemistry Communications 24, 120-122.

27 |