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Remerciements :

Nous tenons particulirement remercier Mme Murielle


BAHUT de la Plate-Forme Technologique de Biologie Molculaire
dAngers (Universit dAngers) qui, par des explications simples,
claires et prcises nous a permis de comprendre rapidement des
phnomnes et des techniques totalement inconnus. De plus, la visite
des laboratoires nous a permis de comprendre rellement le cadre du
squenage
et
notamment de dcouvrir les appareils utiliss.
Nous remercions galement l'
cole
ADN qui nous orienta directement vers les
personnes les plus appropries pour rpondre
nos besoins.

Introduction
I. Comment squence-t-on lADN ?
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Historique
Prparation de la squence cible
Mthode de Sanger
Mthode de Maxam et Gilbert
Automatisation du squenage
Pyrosquenage luminomtrique en temps rel

II. quoi sert le squenage ?

1. Test hrditaire
2. Identification judiciaire
3. Thrapie gnique

III. Quels dangers reprsente le squenage ?


1. Gnome humain
2. Carte didentit gntique
3. Et demain ?

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page 7

Conclusion
Index des mots-cls

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Introduction :
Le squenage de l'
ADN, consiste dterminer l'
ordre d'
enchanement des
nuclotides dun fragment dADN donn. Nous dvelopperons dans ce dossier les diffrentes
mthodes les plus souvent utilises, les multiples usages et les rglementations en vigueur.
Nous avons choisi ce sujet afin de comprendre les dessous d'
une technique en vogue,
souvent utilise dans les grands enqutes criminelles actuelles et tendant se gnraliser dans
certaines situations (test de paternit...). Du point de vue technique, les mthodes utilises
paraissant assez complexes, nous nous sommes tourns vers une spcialiste qui russit nous
expliquer les choses simplement, en partant des bases que nous connaissions et nous permit
finalement de comprendre les conclusions complexes des sources d'
informations plus
conventionnelles.

I. Comment squence-t-on lADN ?


1. Historique :

Les premires techniques de squenage ont t dveloppes en parallle au milieu des


annes 1970. Les mthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes
deux t rcompenses d'
un prix Nobel de chimie en 1980.
Le premier organisme a t squenc en 1977. Il s'
agissait du virus bactriophage
X174, possdant un ADN simple brin ne ncessitant donc pas l'
tape de dnaturation utilis
dans les mthodes de Sanger et Maxam et Gilbert.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Depuis une trentaine d'


anne, l'
amlioration de la technique de production des
amorces, de l'
amplification des brins et la gnralisation des traceurs fluorescents ont permis
d'
amliorer considrablement les techniques de squenage. L'
apparition des squenceurs
automatiques a notamment permis l'
automatisation de ces technologies et ont contribu la
finalisation du gnotypage humain en 2003.
2. Prparation de la squence cible :
Ces trois mthodes utilisent des bases communes : le brin dADN squencer est
extrait, amplifi, puis dnatur (on spare le double brin dADN en deux), et on utilise la
polymrase, une enzyme dont le rle est de dupliquer un lment.
L'
amplification, c'
est dire la rplication de la squence, est ralise partir d'
un
technique appele PCR ou "Polymerase chain reaction" (raction de polymrisation en
chane). Cela permet de dupliquer plusieurs millions d'
exemplaires un fragment d'
ADN
grce l'
ADN polymrase. Cette technique utilise des cycles de trois phases au cours des
quelles chaque double brin est dnatur (cf. infra) et spar de sa polymrase (qui est
maintenu par des protines). Une variation spcifique de la temprature permet aux
nombreuses amorces prsentes en suspension dans la solution de s'
hybrider aux simples brins
sans que ceux-ci ne s'
hybrident entre eux (ce qui rendrait impossible l'
accrochage de
l'
amorce). Enfin, la polymrase assimile progressivement les nuclotides noforms libres
ajouts galement dans la solution jusqu'
l'
obtention de doubles brins complets ; cest
llongation. Le cycle, d'
une dure maximum de quatre minutes, est rpt en boucles de
nombreuses fois (entre 35 et 45 par PCR) et double le nombre de brins chaque fois (suite
logique de
puissance
2).
La dnaturation (ou dshybridation), c'
est dire la sparation des deux brins
composant la molcule d'
ADN, est obtenue par lvation de temprature ce qui a pour effet de
fragiliser les liaisons hydrognes reliant les bases azotes.
3. Mthode de Sanger :
Dans quatre tubes essais distincts, on
introduit en parallle des brins dADN cibles dnaturs
en grand nombre, des amorces (sur laquelle se fixe la
polymrase), la polymrase elle-mme et des
nuclotides normaux (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
On ajoute ensuite un nuclotide modifi ou didshydro-nuclotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP)
de type diffrent dans chaque tube. Ceux-ci sont
identiques aux nuclo bases classiques la diffrence
qu'
il leur manque un groupepement-HO ncessaire
l'
assimilation du nuclotide suivant par la polymrase
(liaison phospho-diester).
La quantit de nuclotides modifis incorpors dans chaque tube est bien infrieure au
nombre de nuclotides classiques afin de ne pas stopper l'
assimilation trop tt. Il faut quil y
ait moins de ddNTP que de dNTP pour que dans le tube, on ait toutes les molcules possibles
qui soient synthtises.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Ainsi,
lors
de
l'
assimilation d'
un de ces
nuclotides par la polymrase,
la rplication du brin est
stoppe. La quantit de
nuclotides
modifis
incorpors dans chaque tube
tant infrieure au nombre de
nuclotides
classiques,
statistiquement.
Une fois les ractions
termines, on obtient dans
chacun des quatre tubes des
doubles brins dADN de tailles
variables, en fonction de leur
arrt par les nuclotides
modifis.
Les
"ractions
de
squence" (avec ddNTP) sont rapides (moins de 15 minutes). Le point long du protocole est
en fait la lecture du rsultat.
On place alors le contenu des tubes dans quatre puits distincts (correspondant aux
quatre nuclotides possibles) de gel dlectrophorse. LADN tant charge ngativement,
plus la taille de la squence est important et plus la molcule migre vers le pole positif du gel
dlectrophorse. Aprs leurs migrations, dans ce gel on peut aisment retrouver lordre des
nuclotides de la squence concerne. Une simple lecture horizontale de ce gel (une fois
rvl) permet de connatre l'
ordre des bases de la squence.
Afin de voir les fragments d'
ADN sur le gel d'
lectrophorse, on utilise la plupart du
temps des marqueurs fluorescents. On peut aussi marquer radioactivement les nuclotides
puis les exposer un film photographique: des bandes sombres apparaissent l o se trouvait
de l'
ADN sur le chromatogramme ; cest lautoradiographie.
4. Mthode de Maxam et Gilbert :
Contrairement la mthode prcdente, celle-ci n'
utilise quant elle aucune base
modifie mais une raction chimique permettant de couper le brin suite un type de base.
tant donne le nombre important de copies prsentes dans le tube, on obtient statistiquement
chaque possibilit. La mthode de l'
lectrophorse suit ensuite celle de Sanger.
Moins facile robotiser que la mthode de Sanger, cette technique est aujourd'
hui
trs peu utilise dans les milieux industriels.
5. Automatisation du squenage :
Aujourd'
hui, la plupart des squenages sont raliss par des squenceurs industriels
entirement automatiss. Ceux-ci utilisent la technique de Sanger mais avec des mthodes de
rvlation diffrentes.
Les fragments d'
ADN sont marqus par des marqueurs fluorescents; leur taille est
ensuite dtermine par chromatographie ou lectrophorse assiste par ordinateur.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Avec ces techniques, on peut squencer jusqu'


1000 bases avec les meilleurs
squenceurs contre 200 300 via une mthode manuelle comme celles exposes ci-dessus. En
effet, lors de llectrophorse manuelle, le nombre de bases est limit afin de ne pas rendre le
chromatogramme illisible par la surcharge des bandes et ainsi ne plus permettre une lecture
horizontale.
Cest notamment grce la rapidit de ces appareils que le squenage du gnome
humain fut ralis en un temps record par rapport aux prvisions effectues lors du dmarrage
du projet.
6. Pyrosquenage luminomtrique en temps rel :
Contrairement
aux
mthodes
traditionnelles,
le
pyrosquenage ne peut squencer
que des brins dune centaine de
bases azotes. Par consquent,
cette mthode nest pas trs
courante.
Elle
est
utilise
principalement pour dtecter des
mutations sur des squences
cibles par comparaisons de brins.
Encore une fois, on utilise
un brin dnatur, une amorce, les
quatre types de nuclotides
normaux. On ajoute galement
quatre enzymes : la polymrase, la
sulfurylase, la lucifrase, et
lapyrase. Les nuclotides, les
enzymes et leurs substrats sont
introduits dans une cartouche
adapte, et le brin dADN dans
une micro cuvette. Le tout est mis
dans un pyrosquenceur, appareil
entirement informatis.
Le pyrosquenceur propose alors tour tour un type de base. Si la base correspond,
elle est alors incorpore par la polymrase au brin.
Celui-ci rejette alors un phosphate inorganique (PPi) transform en ATP par la
sulfurylase puis en lumire par la lucifrase. Cette mission lumineuse est alors capte par un
dtecteur photosensible qui transmet un signal lordinateur.
Dans le cas ou deux bases identiques se suivent, celles-ci sont incorpores dans le
mme temps ; lnergie lumineuse donc une intensit double se qui se traduit
graphiquement sur lcran.
Dans le cas o la base nest pas incorpore, celle-ci est alors dgrade par lapyrase.
Un autre type de nuclotide est alors propos.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

II. quoi sert le squenage ?


1. Test hrditaire :

Lorsqu'
une simple vrification des groupes sanguins et des gnes rcessifs ne suffit
pas dterminer la parent, on utilise alors indirectement le squenage gntique.
Chez chaque individu, des squences de nuclotides non codantes (aussi appeles
ADN rptitif ou encore ADN poubelle ) se rptent un certain nombre de fois, diffrent
selon les individus. Ces squences rptes sont appeles minisatellites; leur taille, qui
correspond au nombre de rptitions varie gnralement de 5 50.
Etant donn que l'
on possde tous les chromosomes, except les sexuels, par paire, on
a deux tailles diffrentes de minisatellites, transmises par chaque parent. La comparaison de
ceux-ci avec les gniteurs potentiels conduit la dcouverte du pre biologique.
Afin d'
augmenter les probabilits du lien de parent recherch, ces mesures de
minisatellites sont tendues plusieurs chromosomes; cela permet actuellement aux
laboratoires d'
analyse d'
assurer une fiabilit suprieure 99%.
2. Identification judiciaire :
La mdecine lgale utilise les mme minisatellites afin de constituer une empreinte
gntique spcifique chaque individu Celle-ci est ensuite compar aux preuves biologiques
de l'
enqute comme par exemple du sang, du sperme, des cheveux ou de la salive.
Cette mthode permet d'
inculper ou de relaxer un suspect avec une quasi-certitude
cartant tout risque d'
erreur judiciaire (sous rserve que les lments cibles soient les bons
bien entendu).
3. Thrapie gnique :
Certaines maladies sont dues la mutation dun gne. Le squenage gntique
permet de comparer lADN de deux personnes afin de dtecter une mutation. Ainsi, on peut
savoir sur quel gne et donc quel endroit du gnome sest produite la mutation.
Les techniques de thrapies gniques, encore ltat de test, essaient de remplacer la
squence mute par une squence saine. Cependant, il savre beaucoup plus difficile
dintroduire la squence modifie au bon endroit dun gnome humain que dun gnome de
souris.
Ces nouvelles pistes de recherche, mme si elles sont encore balbutiantes, ouvrent de
nouveaux horizons et autorisent les malades esprer. En effet, il y a quelques annes encore,
des maladies telles que la mucoviscidose, l'
hmophilie, la myopathie de Duchenne et la
drpanocytose taient incurables. Aujourdhui, les chercheurs savent o chercher et les
perspectives de gurison grandissent chaque anne.
Cependant leur llaboration, les tests quils ncessitent prennent su temps et surtout
de largent ; Il est donc ncessaire que des manifestations contre le Tlthon perdurent pour
sensibiliser et informer le grand public propos de limportance de leurs dons.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

III. Quels dangers reprsente le squenage ?


Actuellement, les rglementations au sujet du squenage ne sont pas trs claires.
1. Gnome humain :
Au dbut des annes 1990, la communaut internationale a dcid dorganiser un
projet public de squenage dont le but tait dobtenir, en lan 2000, la totalit des squences
du gnome humain en caractres. En raison de lampleur de ce travail, 20 institutions ont
convenu de partager la tche. Chaque centre de squenage stait alors engag dposer les
squences dans des bases de donnes publiques ds lacquisition, pour viter un accs payant
ces informations.
Dans le mme temps, une socit prive, Celera Genomics, stait engage donner
accs ses clients plus rapidement une squence plus complte que celle du consortium.
Cependant, la socit na pas russi obtenir une bauche suffisamment complte pour
pouvoir concurrencer le consortium.
Sur ce point, le projet public de squenage a atteint son objectif dobtenir la squence
complte au dbut du troisime millnaire (2003).
La seule loi en vigueur a t nonce par lUNESCO, en 1997 : Le gnome humain
est un patrimoine de l'
humanit. Un patrimoine de l'
humanit ne peut pas tre la proprit de
quelqu'
un.
2. Carte didentit gntique :
Il est, depuis 2003, formellement interdit de dresser la carte didentit gntique dun
tre humain : cela est considr comme une forme de racisme et de discrimination.
Cependant, un Fichier Automatis des Empreintes Gntiques national de lutte contre
la criminalit se et progressivement en place dans certains pays tels que les Etats-Unis, le
Royaume Uni, l'
Autriche, l'
Allemagne et les Pays Bas. LADN rpertori correspond aux
minisatellites non codant permettant lidentification judiciaire.
En France, ce systme regroupe exclusivement les dlinquant sexuels potentiellement
rcidivistes.
3. Et demain ?
On pourrait par exemple envisager que lempreinte gntique soit implante
directement dans nos papiers didentit. Cependant le fichage systmatique des individus pose
des problmes sous-jacents invitables. Quest-ce qui empcherait un terroriste de fabriquer
des armes gntiquement cibles pour un individus ou un groupe de personnes ? De plus,
pourquoi ne pas imaginer un monde limage du film Bienvenue Gattaca dans lequel le sort
de chacun est dcid avant mme sa naissance ?
Les drives criminelles de la gntique sont aussi nombreuses et diversifies que leurs
perspectives bnfiques...La science et le savoir en eux-mmes ne sont ni bons ni mauvais ;
tout dpend de ce que lhomme en fait. Depuis la nuit des temps la recherche progresse et lon
ne peu pas la stopper, cest dans la nature humaine. Il est cependant ncessaire de lencadrer !

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Conclusion
Cette tude approfondie des techniques de gnie-gntique nous a permis de
comprendre les dessous du thme d'
actualit que reprsente le squenage gntique.
Nous avons prfr approfondir les techniques de squenage et leurs utilits aux
rglementations en vigueurs et aux consquences qu'
il en dcoule afin de ne pas trop tomber
dans une rflexion polmique pour le moment insoluble. En effet, ce dernier point nous parat
trs important du point de vu thique cependant, il nous sembl plus intressant de
comprendre le pourquoi du comment biologique.
Nous esprons vous avoir transmis, de la manire la plus simple et complte possible
lessentiel de tout ce que nous avons pu apprendre lors de la prparation de ce thme au choix.
Excusez cependant notre maladresse dans la rdaction rendant parfois nos explications moins
comprhensibles que nous laurions souhait.
Cette tude ne dtaille que succinctement de nombreux fonctionnement (notamment
ceux des enzymes utilises), ceci dans le but de ne pas surcharger le lecteur et facilit la
comprhension. Ainsi si le minimum prsent ici ne rpond pas vos attentes, nous vous
invitons consulter en profondeur les sites web utiliss dans la prparation de ce dossier.

Index des mots-cl


Amorce (ou oligonuclotide): Srie de quelques dizaines de nuclotides
complmentaires au dbut du brin squencer. Support sur lequel se fixe la polymrase.
Apyrase : enzyme utilise dans la technique de pyrosquenage. Dgrade les
nuclotides non assimile par la polymrase.
Dnaturation ou dshybridation : sparation des deux brins de la double hlice
dADN.
dNTP: nuclotide (ou nuclobase) "classique". Sigle signifiant dsoxyNuclotide
TriPhosphate. Correspondant aux quatre bases Adnine (dATP), Thymine (dTTP), Cytosine
(dCTP)
et
Guanine
(dGTP).
ddNTP: type de nuclotide modifi, ne permettant pas la poursuite de l'
assimilation
par la polymrase cause du manque d'
un groupement hydroxyde HO ncessaire aux liaisons
phosphodiesters. Utilis dans la mthode de Sanger.
Electrophorse : technique utilisant la proprit es ions se dplacer selon un champ
lectrique. Elle est utilise pour connatre et classer par longueur les squences dAdn dans
certaines techniques de squenage gntique.
Lucifrase : enzyme utilis dans la mthode de pyrosquenage. Transforme lATP
en lumire.
Minisatellites : squence de nuclotides non codantes rptes un nombre spcifique
de fois chez chaque individus et utilis pour les empreintes gntiques.
(ADN) polymrase: complexe enzymatique permettant, partir d'
une amorce,
d'
assimiler les nuclobases (noforms libres) afin de rpliquer un brin d'
ADN fils ; sorte de
"tricoteuse" ou "assembleuse de fermeture clair".
PPi : phosphate inorganique. Rejet lors de lassimilation dun nuclotide par lAdn
polymrase.
Sulfurylase : enzyme utilis dans la mthode de pyrosquenage. Transforme le PPi
dgag en en ATP.

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

Sources :
Pour prparer ce dossier, nous avons utilis
plusieurs types de documentations. Mme BAHUT de la
PFT nous a premirement fourni de nombreuses
explications ainsi que quelques documents papier. De plus,
nous avons galement bnfici de cours de luniversit
dAngers prts par notre professeur de S.V.T.
La plupart des photographies proviennent de la
visite des laboratoires de lcole ADN et de la PFT. Les
illustrations et complments dinformations sont quand
eux principalement extraits des sites web suivants :
www.wikipedia.org
www.snv.jussieu.fr
www.genoscope.cns.fr

Aurlien DUMAINE & Vincent COLIN

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