E. Macromoléculas.

Rev 23/09/2003

TEMA 7. PLEGAMIENTO DE PROTEINAS

La estructura tridimensional de las proteínas está implícita en su estructura primaria (su secuencia aminoácidica). Este hecho queda demostrado por el gran número de proteínas que pueden desnaturalizarse y después renaturalizarse in vitro sin la presencia de ningún cofactor o coayudante. Los recientes descubrimientos de la existencia de numerosas proteínas que facilitan el plegamiento de las proteínas in vivo (rotamasas, disulfide-isomerases, chaperones) no cambian nada el “dogma” central del campo que es “que las proteínas contienen la información necesaria para replegarse”. Las proteínas facilitadoras del plegamiento lo que hacen es simplemente catalizar, hacer más rápido y eficiente el plegamiento, llevarlo hacia su final de manera más eficiente, al i) mejorar la cinética de la ruta productiva del plegamiento y ii) evitar la formación de estructuras no nativas (véase Science, 258, 466, 1992 y Folding and Design, 1,27, o el libro monográfico sobre el tema de Creighton (Protein Folding, Freeman NY, 1992)). El hecho de que las proteínas se pliegen solas de una manera tan fidedigna es una paradoja aún no resuelta, y formulada por primera vez por Levinthal. Esta paradoja se formula de la siguiente manera. Una cadena polipeptídica pequeña tiene 100 residuos, solo contando los ángulos φ y ψ y contando que cada 30 grados se tiene una conformación diferente tenemos para cada residuo tendremos 144 confórmeros y para la proteína en su conjunto un total de 12200 confórmeros distintos. Si suponemos (y es una suposición muy favorable) que cada 10 fs podemos cambiar de uno a otro confórmero tendremos que para explorar todo el espacio conformacional la proteína necesitaría unos 10173 millones de años para plegarse. Un tiempo infinitamente superior a la edad del universo. En realidad el tiempo de plegamiento de una proteína oscila entre el microsegundo al minuto. Como toda paradoja ésta no tiene una solución obvia, y durante muchos años ha existido un fuerte debate al respecto. A lo largo de este capítulo veremos algunas ideas de cómo pensamos hoy que que la proteína consigue resolverla.

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MECANISMO GENERAL DE PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS
FUERZAS QUE CONDICIONAN EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS El plegamiento de una proteína debe conducir a un mínimo de energía libre, es decir que la variación de energía libre a lo largo del plegamiento debe ser negativa: ∆Gfold) . Ignoramos si este mínimo es el más estable, o simplemente es uno muy estable al que se llega de manera sencilla en el proceso de plegamiento. La variación de energía libre en el proceso de plegamiento vendrá dada por el balance de dos términos: el entálpico y el entrópico. El plegamiento debe por tanto intentar optimizar al máximo la energía del sistema (i.e. debe mejorar las interacciones del sistema proteína-solvente) y por otro lado debe hacer aumentar el desorden del universo. Empezaremos describiendo las interacciones que marcan la estabilidad de las proteínas: Interacciones de enlace La forma nativa de las proteínas presenta todas las distancias y casi todos los ángulos próximos a los valores de equilibrio. La gran mayoría de las torsiones están también en sus zonas estéricamente más favorecidas (e.j. mínimos mapa de Ramachandran). Respecto a los enlaces amida en general se encuentran en la conformación trans, con la excepción de las prolinas que a veces se encuentran en la conformación cis. Es de destacar que el cambio de prolinas de conformación cis a trans es muy importante in vivo y que incluso existen enzimas dedicado a catalizar este proceso (las peptidyl-proline-isomerases o rotamases). Unos enlaces covalentes que merecen especial atención son los puentes disulfuro. Estos puentes se forman entre 2 cisteinas cuyas cadenas laterales se encuentran próximas en el espacio. Los puentes disulfuros estabilizan en general la estructura de la proteína como lo demuestra que las proteínas de vida extracelular

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 tengan una gran riqueza de los mismos. No obstante, en general los puentes disulfuro no mejoran la cinética del plegamiento, ya que a lo largo del mismo se forman (y han de romperse) puentes disulfuro no nativos y esto puede hacer muy lento el proceso de plegamiento. De hecho, proteínas que se pliegan en microsegundos pueden tardar minutos si existen posibilidades de formar puentes disulfuro no nativos en el plegamiento. La naturaleza ha diseñado las Protein Disulfide Isomerases como un mecanismo para facilitar la formación de los puentes disulfuro nativos y desestabilizar los no nativos. Interacciones no enlazantes Son el conjunto de interacciones electrostáticas y de van der Waals que modulan la interacción entre átomos no ligados por enlaces. Por tradición las interacciones no enlazantes se clasifican en este campo en tres tipos en función de su teórica intensidad en fase gas (medio anhidro). Interacciones no específicas. Son un conjunto de interacciones de van der Waals e interacciones electrostáticas débiles (en general interacciones de menos de 1 kcal/mol) que per se contribuyen poco a la estabilidad de la proteína, pero que en su conjunto son muy importantes ya que son muy abundantes. Los puentes de hidrógeno son interacciones básicamente electrostáticas de una intensidad moderada (menos de 10 kcal/mol). Son muy direccionales y su existencia es clave en todos los fenómenos de reconocimiento molecular y en los de formación de estructura secundaria. Las interacciones iónicas. También denominadas puentes salinos se forman entre cadenas laterales de residuos cargados. Son totalmente interacciones electrostáticas, tienen mucha importancia en el reconocimiento molecular a largas distancias y pueden ser extraordinariamente intensas (superiores a 10 kcal/mol en fases apolares). De estas interacciones cual es la que marca el plegamiento de la proteína?

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 Durante muchos años se pensó que como en otros sistemas químicos, los términos de enlace eran los que determinaban la estructura tridimensional de las proteínas. Esto fue refutado por Alfinsen a principios de los sesenta (PNAS, 47, 1309 (1961)) cuando realizó un experimento clave que demostró que son las interacciones no-enlazantes y no las enlazantes (puentes disulfuro) las que guían el plegamiento. Para este experimento Anfinsen cogió ribonucleasa, una proteína pequeña (14000 Daltons) y que tiene 4 puentes disulfuro. Desnaturalizó el enzima con urea y b-mercaptoetanol la solución resultante la dividió en dos alícuotas P1 y P2. A la alícuotas P1 le eliminó primero el β-mercaptoetanol, dejo reposar y le eliminó luego la urea (alícuota resultante P1bis). A la alícuotas P2 le eliminó primero la urea, y luego el β-mercaptoetanol (alícuota resultante P2b). Una vez hecho esto miro la actividad enzimática de P1bis y P2bis. Encontró que la alícuota P2b había mucha actividad enzimática, mientras que en P1b prácticamente no había nada. Esto demostraba que eran las interacciones noenlazantes y no las interacciones enlazantes las que guiaban el plegamiento de las proteínas.

−β-Mercapto -urea

-urea

β-Mercapto −β-Mercapto

-urea

Figura 1. Esquema del experimento de Anfinsen. Rojo significa alícuota no activa, azul activa

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 Así, queda demostrado que son la interacciones no enlazantes (aquellas que rompe la urea) y no las de enlace (que rompe el β-mercaptoetanol) las que guían el plegamiento de las proteínas. De las tres interacciones de no-enlace cual es la más relevante? En un principio se pensó que eran los puentes salinos dada su alta estabilidad los responsables del plegamiento. Esta hipótesis está actualmente descartada por diversos hechos: i) no todas las proteínas tienen puentes salinos, ii) el número de puentes salinos que se forma en una proteína nativa es solo una porción de los que se podrían formar, iii) los grupos cargados se encuentran mayoritariamente hacia el exterior de la proteína, no hacia el interior que es donde prediciría la hipótesis de que son claves. Además, cálculos teóricos han demostrado que la formación de puentes salinos en agua está desfavorecida por el alto coste que supone desolvatar los iones que forman el par. Recientemente, la mutagénesis dirigida ha demostrado que los puentes salinos no son vitales para la estructura, ni aún en casos en los que están en el interior de la proteína. En el experimento (Nature Structural Biology, 2, 122 (1995)) los autores cogieron una proteína represor Arc que posee un puente salino interno doble (Arg31, Glu36, Arg40) y mutaron los tres residuos por tres residuos apolares, en concreto por Met, Tyr y Leu (respectivamente). La proteína resultante que ganaba contactos hidropóbicos, pero que perdia el puente salino resultó ser mas de 4 kcal/mol más estable que la proteína nativa!. En resumen, los puentes salinos pueden ser importantes para mantener zonas concretas de proteínas, claves en el reconocimiento, y pueden ser importantes en la guía del plegamiento, pero parece que no son los determinantes del mismo. Los puentes de hidrógeno son también candidatos razonables a tener un papel clave en el plegamiento de las proteínas. Son abundantes, son claves en la estructura secundaria, son relativamente intensos y muy direccionales. No obstante, parece asumido que no son los puentes de hidrógeno los determinantes del plegamiento, a pesar de su importancia. Esto es por dos razones fundamentales: i) son interacciones demasiado direccionales y de corto alcance para organizar el plegamiento global de la proteína, ii) si se cuentan los puentes de hidrógeno totales de una proteína (proteína-

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 proteína, y proteína-agua) se ve fácilmente que el número de puentes de hidrógeno totales no varia demasiado al producirse el plegamiento de la proteína: Así pues, no existe una fuerza única responsable del plegamiento de la proteína, sino que dicho plegamiento depende de un conjunto de interacciones muchas de ellas de escasa intensidad. Más importante aún para entender el plegamiento de una proteína es pensar que la proteína es una cadena polipeptídica sumergida en agua, y que la estructura de la misma cambia drásticamente a lo largo del procesos de plegamiento.

TERMODINAMICA DEL PLEGAMIENTO El proceso de plegamiento de una proteína implica un término entálpico que se puede asociar a la variación de energía del sistema. La entalpía de plegamiento dependerá pues del balance de la energía proteína-proteína, agua-proteína y agua-agua. El término entrópico dependerá del grado de desorden que se consiga en el proceso de plegamiento en la proteína y en el agua que la rodea. Es sencillo ver que en el proceso de plegamiento se produce una mejora en las interacciones proteína-proteína (p.ej se forman muchos puentes de hidrógeno entre los residuos aminoacídicos) y que por el contrario el término entrópico es desfavorable ya que la forma desnaturalizada “random-coil” está muy desordenada y la forma plegada está muy ordenada. De hecho, las teoría más moderna para explicar el plegamiento lo simula como un “embudo” o “cono” entrópico (entropy funel). De acuerdo a esta teoría la proteína cuando se pliega se mueve como en un embudo, donde el diámetro del embudo da idea de la entropía de la cadena y la profundidad determina la energética del sistema. Así la proteína desplegada se asume que está en el borde superior del cono, con energía (interna) poco óptima pero mucha entropía (interna). En el bode del embudo la proteína puede pues moverse entre diferentes estado quasi degenerados energéticamente. Al ir cayendo por el embudo cada vez hay menos entropía (el diámetro del cono es más pequeño) y por lo tanto son accesibles menos estados, pero estos son más estables energéticamente. Al fin se llega a la forma plegada donde la energía será óptima y la entropía más pequeña.

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Un motivo de reflexión durante años ha sido cual es la entropía de la forma desplegada. Si en principio tenemos 12200 estados (confórmeros) accesibles, el costo entrópico de pasar a uno solo sería enorme (del orden de 200 kcal/mol) si todos estuvieran poblados en la forma desnaturalizada. Esto no parece razonable, pero cual es entonces el grado de desorden de la forma desplegada??. Tradicionalmente se suponía que la forma desplegada estaba muestreando una gran región del espacio configuracional accesible, pero trabajos recientes de dinámica molecular y espectroscopía de NMR demuestran que de hecho el estado desplegado es una combinación finita de un número limitado de estados. La interconversión entre ellos es lo que da una imagen de desorden absoluto. Esta nueva hipótesis sobre la entropía del estado desplegado tiene unas consecuencias claras: al ser el número de estados accedidos por la forma desplegada más pequeño de lo que se esperaba, el coste entrópico del plegamiento de la cadena es también más reducido. Cual es el papel del agua?. Ciertamente la cantidad de agua en los alrededores de la proteína es enorme, por lo que es de esperar que juegue un papel importante en el plegamiento. De hecho el agua modula el plegamiento de las proteínas tanto a nivel entálpico, como a nivel entrópico. El agua forma puentes de hidrógeno con ella misma y con todos los grupos polares de la proteína. En principio se formarán más puentes de hidrógeno proteína-agua en la forma desnaturalizada, lo que podría inducir a pensar que el agua desfavorece el plegamiento. No obstante, sabemos que el agua favorece el plegamiento y de hecho remover agua con agentes hidrofóbicos es uno de los mecanismos para desnaturalizar proteínas. Por que? Cuando una cadena polipeptídica esta desordenada en agua sus grupos polares y apolares se encuentran rodeados de moléculas de agua. El agua cuando está cercana a los grupos apolares expuestos (lo que pasa en la forma desnaturalizada) no puede interaccionar intensamente con ellas y reacciona formando estructuras poliédrica altamente ordenadas alrededor del soluto. Estas estructuras tienen por objeto maximizar la estabilidad intrínseca del agua entorno al soluto, pero tiene como inconveniente su gran orden que hace que cuando estas estructuras se forman aumente el orden del agua. Cuando 2 grupos hidrofóbicos se encuentran en solución cada uno de ellos forma uno

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 de estos poliedros de alta ordenación, con lo que la situación entrópica será peor. La respuesta del sistema es la de comprimir los 2 grupos apolares (igual que 2 gotas de aceite en agua) para que al juntarse el area accesible al solvente del conjunto se reduzca. De esta manera los poliedros de alto orden se hacen más pequeños (que la suma de los 2 poliedros que existen antes de la fusión) liberándose en el proceso moléculas de agua que aumentan el desorden del solvente. El efecto descrito se conoce como “efecto hidrofóbico” y es el que hoy se asume que guía el plegamiento de la proteína hasta un estado de colapso hidrofóbico (el molten globule), una forma compacta donde los residuos apolares ya están hacia el interior. La evolución de este estado compacto a la forma nativa es entonces mucho más sencilla, ya que implica solo movimientos locales.

CINETICA DEL PLEGAMIENTO La termodinámica del plegamiento es compleja de estudiar, pero aún lo es más la cinética del mismo. La razón es clara: la escala temporal del proceso es mucho más rápida que nuestra capacidad de medida. Así, se cree que muchas proteínas se pliegan en escalas de tiempo de micro al milisegundo, y en muchos casos las etapas más importantes pueden pasar en el lapsus del microsegundo, tiempos estos demasiado pequeños para permitir el seguimiento experimental del plegamiento. Así pues, el mecanismo cinético del plegamiento de una proteína dista de estar claro. Durante mucho tiempo se asumió como cierto que existian solo 2 estados: el nativo y el desnaturalizado. El paso de uno a otro sería vía un estado de transición y no existirían intermedios de ningún tipo. Los datos en los que este modelo se apoya son sólidos, derivados fundamentalmente de datos de calorimetría, y a la fuerte cooperatividad del plegamiento. Alternativamente se han desarrollado otros modelos que dice que el plegamiento se da por núcleos. Es decir que no es un proceso de “todo o nada” sino que el plegamiento se organizaría por una serie de puntos (centros de nucleación) que se compactarían para dar una estructura que evolucionaría hacia la terciaria. Este último modelo predice la existencia de formas intermediarias del plegamiento. Alguna de ellas parece asumida como es el “molten globule” sugerido teóricamente y encontrado experimentalmente en algunas proteínas. Este “molten

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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003 globule” vendria a ser como una estructura nativa desordenada, con los elementos fundamentales del empaquetamiento ya definidos, pero carente de la definición fina de la estructura. Realmente no se puede decir si existen o no intermediaros en el plegamiento de proteínas. No obstante parece que los datos más recientes apoyan la existencia de intermediarios en muchas proteínas, aunque sean de moderada estabilidad en frente de los 2 estados mayoritarios. Se especula que la formación del molten globule es rápida y que es la reorganización de este hasta dar la estructura terciaria lo que limita la velocidad del proceso de plegamiento.

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