You are on page 1of 27

ILEANA STOICA

TATIANA VASSU

ELENA SĂSĂRMAN

BIOLOGIA ŞI TAXONOMIA MOLECULARĂ
A MICROORGANISMELOR
COLECŢIA DE CULTURI MICROBIENE

Ilustraţie: Oana Iftime

Ileana Stoica
Coperta: Oana Iftime
Redactor: Oana Iftime
Ileana Stoica

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României
STOICA, ILEANA
Biologia şi taxonomia moleculară a microorganismelor:
Colecţia de culturi microbiene / Ileana Stoica, Tatiana Vassu-Dimov,
Elena Săsărman – Bucureşti: Arvin Press, 2002
p. ; cm.
ISBN 973-96090-3-8
I. Vassu-Dimov, Tatiana
II. Săsărman, Elena
579.8

2

P A RT E A A T R E I A . B I O LO G I A Ş I TA XO N O M I A
D R O J D I I LO R

CAPITOLUL X

BIOLOGIA ŞI TAXONOMIA DROJDIILOR
Drojdiile sunt un grup de fungi cu o diversitate filogenetică deosebită, ale căror forme
teleomorfe sau stări sexuate sunt prezente la nivelul a două clase taxonomice majore,
Ascomycotina şi Basidiomycotina.
Speciile anamorfe, care prezintă numai înmulţire asexuată, au fost iniţial grupate în
fungii imperfecţi.
De asemenea, termenul de drojdie este considerat, în prezent, unul de convenienţă,
aceste organisme, a căror diviziune mitotică (pe cale vegetativă) se realizează prin înmugurire
sau prin fisiune binară, fiind formele unicelulare ale fungilor filamentoşi.
Taxonomia sau sistematica unui organism cuprinde trei părţi importante şi anume:
 clasificarea – aranjarea organismelor în grupe taxonomice pe bază de similaritate;
 identificarea – compararea caracterelor organismelor neidentificate cu indivizi deja
caracterizaţi şi clasificaţi şi
 nomenclatura – atribuirea unor nume taxonilor identificaţi, parametrii valabili şi în
cazul drojdiilor în definirea unui taxon.
Microbiologii au studiat taxonomia drojdiilor de mai bine de un secol, dar încă mai
sunt destule de realizat pentru a stabili un sistem de clasificare complet.
O identificare corectă este absolut necesară pentru tratamentul eficient al infecţiilor,
pentru înţelegerea interacţiunii dintre specii în natură şi pentru selectarea celor mai potrivite
tulpini pentru industria fermentativă şi alimentară.
Un sistem de clasificare acurat presupune stabilirea interrelaţiilor filogenetice, ce se
bazează pe similarităţi biochimice şi genetice, incluzând diferite căi metabolice şi
mecanismele de control ale acestor căi.
Un astfel de sistem filogenetic de clasificare prezintă un interes particular pentru
biotehnologi, care trebuie să combine diferite proprietăţi metabolice şi, dacă aceste proprietăţi
aparţin unor specii strâns înrudite, şansa de a se exprima într-un singur organism este mai
mare.
De exemplu, în cazul fuziunii de protoplaşti, produşii de fuziune au o mai mare
stabilitate dacă parentalii aparţin unor specii strâns înrudite. În cazul aplicării tehnologiei
ADN recombinant pentru introducerea anumitor caracteristici metabolice, ADN-ul heterolog
inserat se exprimă mult mai bine într-o gazdă strâns înrudită cu specia donor.
Scopul acestui capitol este de a prezenta principalele metode de clasificare,
identificare şi nomenclatură a drojdiilor, inclusiv a tehnicilor de taxonomie moleculară, care
permit o încadrare taxonomică mai corectă a diferitelor genuri şi specii.
Tabelele 10.1, 10.2 şi 10.3 prezintă caracteristicile claselor în care se încadrează
drojdiile.

3

Tabelul 10.1. Genurile clasei Ascomycotina şi caracteristicile lor

Aspectul

Alte trăsături

Genul

ască

ascospori

celule

Ambrosiozyma

Sferică sau ovală

1-4/ască cu formă de pălărie

Arthroascus

Provine din celule
hifale dilatate

Sferici sau aproape
sferici ; 1-4/ască

Înmugurire multiplă, pseudohife,
hife adevărate cu septe adevărate
Înmugurire multipolară, pseudohife; hife adevărate cu septe,
având un singur micropor

Fermentează slab zaharurile;
izolate de pe insecte
Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol; materiale vegetale

Arxiozymma

Sferici sau ovali; 1-2/ască

Înmugurire multipolară; pseudohife; nu formează hife
adevărate
Înmugurie multipolară; nu
formează hife sau pseudohife

Fermentează zaharurile; izolate
iniţial de la păsări de curte

Citeromyces

Sferică sau ovală;
provine din celule
vegetative
Sferică

Clavispora

Sferică sau alungită Clavaţi; 1-2/ască

Înmugurire multipolară;
pseudohife; nu au hife adevărate

Coccidiascus

Alungită cu formă
de banană

Au formă de fus; peste 8 per ască

Înmugurire multipolară; nu
formează hife sau pseudohife

Cyniclomyces

Alungită

Alungiţi, 1-4/ască

Debaryomyces
Dekkera

Sferici; 1-2/ască

vegetative

Înmugurire multipolară;
pseudohife, dar nu hife
adevărate
Sferică sau
În general sferică cu suprafaţa
Înmugurire multipolară,
elipsoida
ondulată, 1-4/ască
ocazional pseudohife, fără hife
adevărate
Sferică sau alungită Cu formă de pălărie sau sferică, 1- Înmugurire multipolară,
4/ ască
pseudohife, fără hife adevărate

4

Fermentează intens unele
zaharuri; izolate din concentrate
de fructe
Fermentează zaharurile; izolată
iniţial din surse umane şi animale
Izolate de la Drosophila
Fermentaţia slabă a zaharurilor;
izolate din stomacul şi fecalele de
iepure

Fermentează zaharurile, proces
care este stimulat de oxigenare;
izolate din bere şi vin ca specii

contaminante.
Guilliermondella

Alungită

Sferici, ovali sau reniformi 1-4/
ască

Înmugurire predominant lângă
polii celulei; formează
pseudohife şi hife adevărate

Fermentează glucoza; izolate din
reziduri taninice.

Hanseniaspora

Ovală sau alungită

Cu formă de pălărie, 1-4 per ască

Issatcheria

Ovală sau alungită

Sferici şi uşor ondulaţi pe
margine, 1-4 per ască

Celule înmgurite au formă de
lămâie; formează pseudohife dar
nu hife adevărate
Înmugurire multipolară,
pseudohife, fără hife adevărate

Kluyveromyces

Sferică sau alungită Sferici sau reniformi, 1-c.1oo/ască Înmugurire multipolară, pot
forma pseudohife, dar nu şi hife
adevărate

Lipomyces

Elipsoidală sau
alungită

Fermentează zaharurile; izolate
din sol, fructe şi alte materiale
vegetale şi din surse clinice
Fermentează zaharurile; izolate
din sol, fructe, vin, Drosophila,
apă marină şi surse clinice
Fermentează zaharurile; izolate
din sol, apă, fructe şi alte
materiale vegetale, Drosophila,
surse clinice
Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol, formează colonii mucoide

Lodderomyces

Sferică sau alungită Oblongi cu capete netede, 1-2per
ască

Metschnicowia

Sferică sau
elipsoidală

Alungiţi, 1-2 per ască

Nadsonia

Alungită

Sferici; 1-2 per ască

Înmugurire bipolară; nu
formează nici pseudohife nici
hife adevărate

Nematospora

Alungită

Alungiţi cu formă de fus, cu un
apendice terminal asemănător
unui bici

Inmugurire multipolară;
fsormează pseudohife şi hife
adevărate

Sferici sau alungiţi, de culoare
brună, 1-c.3o/ască

5

Înmugurire multipolară, pot
forma pseudohife, dar nu şi hife
adevărate
Înmugurire multipolară,
formează pseudohife dar nu şi
hife adevărate
Înmugurire multipolară;
pseudohife; nu formează hife

Fermentează zaharurile; izolate
din sol şi suc de portocale; utililizează n-alkani
Fermentează zaharurile; izolate
din apă marină, ape curgătoare, de
pe flori, nevertrebate şi
Drosophila
Fermentează zaharurile; izolate
din sol şi materiale vegetale
Fermentează zaharurile;
determină boli la alunele de
pământ, capsulele de bumbac,

fasole
Pachysolen

Hemisfercă

Hemisferici; 1-4 per ască

Înmugurire multipolară; pseudohife; nu formează hife adevărate

Pachytichospoa

Elipsoidală

Sferici sau elipsoidali

Pichia

Sferică sau
elipsoidală

Sferici sau cu formă de pălărie, 14 per ască

Saccharomyces

Sferică sau
elipsoidală

Sferici sau elipsoidali, 1-4 per
ască

Înmugurire multipolară; pseudohife rudimentare; nu formează
hife
Înmugurire multipolară; unele
specii formează pseudohife sau
hife adevărate, cu un singur
micropor septal
Înmugurire multipo-lară,
pseudohife, nu formează hife
adevărate

Saccharomycodes

Elipsoidală sau
alungită

Sferici, 1-4 per ască

Saccharomycopsis

Schizosaccharomyces
Schwanniomyces
Sporopachydermia

Înmugurire bipolară, formează
pseudohife, dar nu hife
adevărate
Sferică sau
Sferici, elipsoidali sau în formă de Înmugurire multipolară,
elipsoidală
pălărie, 1-4 /ască
formează pseudohife şi hife
adevărate cu septe având
plasmodese
Alungită
Sferici sau elipsoidali; 4-8 per
Diviziune celulară prin fisiune
ască
binară; se pot forma hife
adevărate
Sferică sau
Sferici cu un inel ecuatorial
Înmugurire multipolară ;
elipsoidală
distinct; 1-2/ască
formează ocazinal pseudohife,
nu hife adevărate
Sferică sau alungită Sferici sau elipsoidali, 1-4/ască
Înmugurire multipolară,
formează ocazional pseudohife
dar nu hife adevărate

6

Fermentează zaharurile, inclusiv
xiloza; izolate din reziduri
taninice
Fermentează zaharurile; izolate
din sol şi din cecumul animal
Unele specii fermentează
zaharurile; izolate din sol, fructe,
alte materiale vegetale insecte,
surse clinice
Fermentează viguros zaharurile;
izolate din sol, fructe, alimente,
bere, vin foarte rar din surse
clinice
Fermentează zaharurile; izolate
din produse vegetale
Fermentează slab zaharurile;
izolate de pe fructe, polen,
material lemnos, insecte, alimente
bogate în amidon
Fermentează viguros glucidele
izolate din sucuri, fructe, vin,
substraturi bogate în zaharuri
Fermentează zaharurile; izolate
din sol
Nu fermentează zaharurile,
produc mirosuri puternice; izolate
din ape marine, curgătoare,

reziduale, surse clinice
Stephanoascus

Sferică

Iniţial cu formă de pălărie,iar la
maturitate devin hemisferici,
1-4/ască
Sferici, 1-4/ască

Înmugurire multipolară,
formează pseudohife şi hife
adevărate
Înmugurire multipolară;
pseudohife, nu formează hife
adevărate

Torulaspora

Sferică sau
elipsoidală

Waltomyces

Elipsoidală sau
alungită

Sferici sau alungiţi; pigmentaţi în
brun;1-20/ască

Înmugurire multipolară; nu
formează pseudohife sau hife
adevărate

Wickerhamiella

Sferică

Oblongi, în general 1/ască

Nu fermentează zaharurile; izolată
din vin şi melasă

Williopsis

Sferică sau
elipsoidală

Sferici sau elipsoidali, cu un inel
ecuatorial; 1-4/ască

Wingea

Sferică

Au formă lenticulară; de culoare
brun deschis, 1-4/ască

Înmugurire multipolară, nu
formează pseudohife şi hife
adevărate
Înmugurire multipolară,
pseudohife, nu formează hife
adevărate
Înmugurire multipolară; nu
formează hife şi pseudohife

Yarrowia

Sferică sau
elipsoidală

Sferici sau în formă de pălărie;
1-4/ască

Zygoascus

Sferică sau
elipsoidală

Hemisferici sau cu formă de
pălărie; 1-4/ască

Înmugurire multipolară;
formează pseudohife şi hife
adevărate cu un singur por
central
Înmugurire multipolară;
formează pseudohife sau hife
adevărate, cu un singur micropor
septal

Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol, ape reziduale, materiale
bogate în lipide şi proteine, surse
clinice şi animale
Fermentează zaharurile; izolate
din must, reziduri industriale
organice

7

Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol, surse animale şi umane
Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol, fructe, sucuri de fructe,
băuturi alcoolice, alimente bogate
în zaharuri sau sare, surse clinice
sau animale
Nu fermentează zaharurile;
formează colonii mucoide; izolate
din sol

Fermentează zaharurile; izolate
din sol, ape, material vegetal
Nu fermentează zaharurile; izolate
din sol şi materiale vegetale

Zygosaccharomices

Formată prin
conjugarea a două
celule, fiecare
cuprinzând 1 sau
mai mulţi
ascospori

Sferici sau elipsoidali, 1-4/ască

Înmugurire multipolară,
pseudohife, nu formează hife
adevărate

Fermentează zaharurile; izolate
din vin, alimente, fructe, material
vegetal, Drosophila

Tabelul 10.2. Genurile clasei Basidiomycotina şi caracteristicile lor

Genul
Chionosphaera

Filobasidiella

Aspectul
starea sexuală
celulele vegetative
Conjugarea celulelor înmugurite de Celule înmugurite şi ocazional
tip opus de împerechere uninucleate pseudohife; hife adevărate se formează
determină formarea unor hife
numai ca parte a ciclului sexuat
dicariotice care formează un mic
corp de fructificaţie; basidia de pe
corpul de fructificaţie poartă
basidiospori care se reproduc prin
înmugurire
Celulele înmugurite de tip opus de
Celule înmugurite; nu se formează
împerechere se unesc pentru a
pseudohife
forma hife dicariotice; din hife se
formează basidii neseptate, care
produc basidiospori aranjaţi în
lanţuri de câte patru; au fost
identificate şi tulpini homotalice cu
autofertilizare

8

Alte trăsături
Cu excepţia prezenţei corpului de fructificaţie
acest gen pare să aibă un ciclu de viaţă similar
cu Filobasidiella; nu formează teleospori şi
pigmenţi; izolate de pe suprafaţa frunzelor
moarte

Starea teleomorfă a lui Cryptococcus
neoformans; nu formează teleospori şi
pigmenţi; izolate din sol şi excremente de
porumbel

Filobasidium

Celulele înmugurite de tip opus de
împerechere fuzionează pentru a
forma hife dicariotice din care se
formează basidii cu basidiospori
terminali; sunt prezente şi tulpini
homotalice
Celulele înmugurite de tip opus de
împerechere conjugă pentru a
forma hife dicariotice care dau
naştere la teleospori; teleosporii
germinează pentru a forma basdii
septate şi neseptate care formează
basidiospori; prezintă şi tulpini
homotalice
Similar cu Leucosporidium

Celule înmugurite, pseudohife şi hife
adevărate

Sporidiobolus

Ciclul de sexuat este în mare
măsură similar cu cel de la
Leucosporidium

Sterigmatosporidium

Se formează hife dicariotice care
poartă teleospori,care germinează
pentru a forma basidii neseptate, ce
dau naştere la basidiospori; prezintă
şi tulpini homotalice

Celule înmugurite, pseudohife şi hife
adevărate formate de unele specii înainte
de conjugare; formează ca şi anamorful
său Sporobolomyces, ballistospori
Mugurii se formează la nivelul unor
extensii celulare denumite sterigme; se
formează şi pseudohife şi hife adevărate

Leucosporidium

Rodosporidium

Unele specii fermentează zaharurile; nu
formează pigmenţi şi teleospori; izolate din
băuturi alcoolice, alimente fermentate şi surse
clinice

Celule înmugurite; unele tulpini formează Majoritatea speciilor fermentează zaharurile;
hife şi pseudohife înainte de conjugare
izolate din ape marine şi solul Antarcticii

Celule înmugurite, pseudohife şi hife
adevărate formate de unele specii înainte
de conjugare

9

Nu fermentează zaharurile; culturile sunt de
culoare galben stins, portocaliu sau roşie
datorită prezenţei pigmenţilor carotenoizi;
izolate din ape marine şi curgătoare, sol,
plante şi surse clinice
Nu fermentează zaharurile; culturile sunt de
culoare roz sau roşie; izolate din sol, ape, aer,
surse clinice şi de pe frunze
Nu fermentează zaharurile; izolate de pe pasta
de celuloză

Tabelul 10.3. Drojdiile imperfecte (anamorfe ) şi caracteristicile lor

Aspectul
teleomorfii asociaţi

Genul

celulele vegetative

Aciculoconidium

Celule ovale sau elipsoidale
înmugurite şi conidii aciculare; se
formează hife adevărate
Înmugurire multipolară, celule
frecvent ogivale la un capăt, se
formează pseudohife dar nu hife
adevărate
Celule înmugurite, pseudohife şi
hife adevărate; formează
balistospori
Înmugurire multipolară, pseudohife
şi hife adevărate
Celule înmugurite şi ocazional
pseudohife

Ascomicete pe baza testului DBB
(diazonim blue B) negativ

Fermentează slab zaharurile; izolate de la
Drosophila

Genul Dekkera

Vezi genul Dekkera din tabelul 10.1

Bazidimicete pe baza testului DBB
pozitiv şi prezenţa balistosporilor

Nu fermentează zaharurile; nu au pigmenţi
carotenoizi; izolate din aer, debriuri vegetale

Multe genuri de ascomicete şi câteva
genuri de bazidiomicete
Testul DBB pozitiv indică specii de
bazidiomicete

Îmugurire bipolară şi ocazional
pseudohife rudimentare

Testul DBB negativ indică un teleomorf
ascomicet

Caracteristicile sunt cele ale partenerilor
teleomorfi
Nu fermentează zaharurile; inozitolul
reprezintă sursa de carbon; izolate din aer,
apă, alimente, materiale vegetale, insecte,
animale, om
Fermentează zaharurile; izolate din bere;
acest gen este neobişnuit, deoarece prezintă
înmugurire bipolară, dar în acelaşi timp o
serie de caracteristici ale genului
Brettanomyces, incluzând producerea de acid
acetic şi un timp scurt de viaţă în cultură

Brettanomyces

Bullera
Candida
Cryptococcus

Feniella

10

Alte trăsături

Fellomyces

Înmuguririre din vârful sterigmelor
cu un punct de septare adiacent
mugurelui; celulele mamă au în
general câteva sterigme; formează
pseudohife şi hife adevărate
Celule în formă de lămâie, cu
înmugurire bipolară; pot să formeze
psudohife, dar nu hife adevărate
Celule cu înmugurire unipolară;
fornează hife adevărate

Creşterea vegetativă este similară cu cea
de la Strigmatosporidim, gen ce
reprezintă starea teleomorfă

Nu fermentează zaharurile; izolate din aer,
apă marină, brânzeturi, insecte, animale, om

Partenerul teleomorf este Hanseniaspora

Vezi genul Hanseniaspora în tabelul 10.1

Pe baza testului DBB bazidiomicete

Izolate de pe piele, de la om şi animale

Oosporidium

Înmugurire multipolară; se pot
forma pseudohife

Pe baza testului DBB ascomicete

Phaffa

Celule înmugurite; clamidospori;
pseudohife rudimentare

Testul DBB pozitiv indică specii de
bazidiomicete

Rhodotorula

Înmugurire multipolară; formează
pseudohife şi hife adevărate

Starea sexuală este reprezentată de
Rhodosporidium

Nu fermentează zaharurile; sunt prezenţi
pigmenţi non-carotenoizi roz sau orange;
izolate din materiale vegetale
Fermentaţia slabă a zaharurilor; culturile sunt
de culoare roşie darorită acumulării
pigmenţilor carotenoizi
Nu fermentează zaharurile; culturi de culoare
roşie, oranj sau galbenă; izolate din aer, apă,
sol, materiale vegelale, insecte, animale, om

Sarcinosporon

Celulele înmugurite care se separă
sau rămân legate în agregate de
tipul celor formate de Sarcina
Înmugurire bipolară; pseudohifele
sunt rudimentare sau absente, nu
formează hife adevărate
Celule înmugurite; unele tulpini
formează pseudohife sau hife
adevărate; formează balistospori

Testul DBB pozitiv indică specii de
bazidiomicete

Nu fermentează zaharurile; izolate din leziuni
ale pielii

Testul DBB negativ indică specii de
ascomicete

Nu fermentează zaharurile; izolate din sol şi
conţinut stomacal

Partenerul teleomorf este Sporodiobolus

Nu fermentează zaharurile; culturile sunt roz
sau roşii, datorită pigmenţilor carotenoizi;
izolate din sol, apă, aer, frunze, surse clinice

Kloeckera
Malassezia

Schizoblastosporium
Sporobolomyces

11

Sterigmatomyces

Înmugurire din vârful sterigmelor;
nu formează pseudohife sau hife
adevărate

Testul DBB pozitiv indică specii de
basidiomicete

Nu fernentează zaharurile; izolate din aer, apă
de mare, surse clinice

Sympodiomyces

Celule înmugurite; unele celule
formează conidiofori care produc
conidii terminale; eliberarea
succesivă a conidiilor determină
formarea unui patern de cicatrici de
tip simpodial; se formează şi hife
adevărate
Celule înmugurite şi artrospori care
se formează printr-un proces de
fuziune; sunt prezente pseudohife şi
hife adevărate; se pot forma şi
endospori asexuaţi
Înmugurire multipolară cu celule
elipsoidale sau triunghiulare; nu se
formează pseudohife sau hife
adevărate

Testul DBB negativ indică asocirea cu
ascomicetele

Nu fermentează zaharurile; izolate din apă
marină

Asocierea unor specii de basidiomicete
şi a altora cu ascomicete

Pot să realizeze sau nu fermentarea
zaharurilor; izolate din apă, aer, sol, alimente,
material vegetal, de la om şi animale

Testul DBB negativ indică asocierea cu
ascomicetele

Nu fermentează zaharurile; din bere şi must

Trichosporon

Trigonopsis

12

X.1. Metode convenţionale de identificare a drojdiilor
Separarea drojdiilor în genuri şi specii se realizează, într-o primă etapă, pe baza
analizei aspectului microscopic al stărilor vegetative şi sexuate.
Testele fiziologice reprezintă etapa următoare de identificare a drojdiilor la nivel de
specie. Majoritatea taxonomiştilor utilizează aceste teste asociate cu cele morfologice, dar
există numai câteva scheme care permit o identificare completă a unui taxon numai pe baza
reacţiilor de fermentaţie şi asimilaţie. Principalul dezavantaj în utilizarea exclusivă a acestor
teste constă în faptul că există o variabilitate mare în reacţiile test, fie datorită procedeelor
utilizate, fie datorită răspunsului tupinii, ceea ce duce la o identificare eronată.
1. Teste morfologice
Morfologia stărilor vegetative
Marea majoritate a drojdiilor prezintă înmugurire multipolară, un tip de diviziune
celulară în care mugurii se formează pe o arie extinsă a suprafeţei celulare.
Au fost identificate şi specii cu înmugurire bipolară sau unipolară.
Speciile genului Schizosaccharomyces diferă de celelalte drojdii, prin faptul că
înmulţirea vegetativă se realizează exclusiv prin fisiune binară, proces care presupune
formarea unui perete celular în partea centrală a celulei şi separarea celor două celule fiice.
O altă variaţie se întâlneşte în cazul speciilor genului Trichosporon, care se divid şi prin
înmugurire şi prin fisiune binară.
Unele specii, pe lângă diviziunea prin înmugurire sau fisiune, pot să formeze hife sau
pseudohife. Hifele adevărate se caracterizează prin lipsa constricţiilor la nivelul pereţilor
despărţitori, în timp ce pseudohifele, deşi sunt alungite, se formează prin înmugurire şi
prezintă constricţii în punctele de ataşare celulară. Formarea hifelor şi a pseudohifelor este
stimulată de reducerea oxigenului, fapt ce se poate realiza în laborator într-o placă Petri, prin
plasarea unei lame de sticlă pe suprafaţa agarului, în zona inoculului.
Morfologia stărilor sexuate
În cazul drojdiilor ascomicete, o semnificaţie taxonomică deosebită o prezintă o serie
de caracteristici ale stărilor sexuate, cum ar fi:
 dacă au un sistem de împerechere homo- sau heterotalic;
 tipul de conjugare, dacă există, înainte de formarea ascosporilor;
 forma, topografia şi numărul ascosporilor.
Speciile heterotalice sunt uneori izolate din natură sub formă de haploizi asporogeni,
care ulterior sunt intermixaţi cu tipul de împerechere complementar, pentru sporulare şi
analiză genetică.
Tulpinile homotalice prezintă un proces de autofertilizare, formând diploizi pornind de
la o cultură monosporală, spre deosebire de tulpinile heterotalice, care prezintă fertilizare
încrucişată şi formează diploizi prin conjugarea celulelor de tip opus de împerechere.
Ascosporii prezintă o varietate de forme şi ornamentări de suprafaţă. Forma cea mai
comună este cea de pălărie. Alte forme sunt sferice, elipsoidale, alungite, cu apendice în
formă de bici, etc. Unii spori prezintă pe suprafaţă cutări şi creste.
13

Bazidiosporii produşi de bazidiomicete sunt, în general, celule neornamentate,
elipsoidale sau alungite, dar evenimentele ce duc la formarea lor pe suprafaţa bazidiilor sunt
extrem de complexe. Depinzând de gen, bazidiile pot să apară din teleospori cu peretele
îngroşat sau apar direct din hife. Speciile pot să fie homo- sau heterotalice, iar împerecherea
poate fi controlată de o pereche sau două perechi de alele, spre deosebire de ascomicete, unde
o singură pereche de alele controlează conjugarea.
2. Teste fiziologice
După cum am mai discutat, separarea drojdiilor în genuri s-a realizat iniţial pe baza
observaţiilor microscopice. Recunoaşterea până la nivel de specie pune, însă, problema
realizării unor teste de asimilaţie şi fermentaţie.
Testele de fermentaţie
Drojdiile prezintă o mare variabilitate în ceea ce priveşte fermentarea zaharurilor (de
la o fermentaţie foarte viguroasă până la lipsa completă a capacităţii fermentative), proces
evidenţiat de majoritatea taxonomiştilor prin tehnica Durham, metodă extrem de simplă şi
eficientă.
Metoda constă în cultivarea drojdiilor pe medii cu extract de drojdie (Yeast Extract
0,5g/l), incluzând ca sursă de carbon diferite zaharuri în concentraţie de 50 mM. Capacitatea
de fermentaţie a diferitelor zaharuri se estimează pe baza procentului de gaz (CO 2) acumulat
în tuburile Durham. Zaharurile utilizate sunt D-glucoză, D-galactoză, zaharoză, maltoză,
lactoză, rafinoză şi trehaloză. Ocazional, sunt incluse în test, pentru comparaţie, şi melibioza,
D-xiloza, amidonul şi inulina.
Testele de asimilaţie
Testele de asimilaţie presupun creşterea drojdiilor în condiţii de aerobioză pe diferite
zaharuri. Se realizează în eprubete care conţin mediu lichid standard (YNB-yeast nitrogen
base-5ml ), sursa de carbon fiind adăugată în concentraţie de 50 mM. Citirile se realizează
după 1, 2, 3 şi 4 săptămâni. Pattern-urile de asimilaţie pentru diferte specii pot fi găsite în
determinatoare de genul: The Yeasts. A Taxonomic Study (Kreger-van Rij, 1984) şi Yeast:
Characteristics and Identification ( Barnett et al., 1983).
Au fost puse la punct şi metode rapide de identificare, de tipul kiturilor de testare, care
sunt, însă, valabile în special pentru drojdiile cu importanţă medicală. Deoarece spectrul
compuşilor cu carbon este limitat, aceste kituri au o aplicabilitate mai mică în cazul celorlalte
tipuri de drojdii (Baker et al., 1981).
Alte tipuri de teste
Alte teste de creştere includ răspunsul la compuşi cu azot, absenţa vitaminelor din
mediu variaţia presiunii osmotice, prezenţa în mediu a cicloheximidei şi variaţia temperaturii.

14

O problemă majoră care se pune este, în cazul drojdiilor anamorfe, identificarea
partenerilor teleomorfi, care pot să aparţină ascomicetelor sau bazidiomicetelor. Van der Walt
şi Hopsu-Havu (1976) au pus la punct un test simplu de culoare, care distinge cele două clase.
Colorarea se realizează cu albastru de diazonium B (DBB-Diazonium Blue B) care
reacţionează cu celulele ce aparţin culturilor de bazidiomicete, peretele celular colorându-se
în roşu aprins. Ascomicetele nu răspund la reacţia cu DBB.
Tabelul 10.4. Compuşii organici utilizaţi în mod obişnuit în testele de asimilaţie şi
fermentaţie la drojdii

CLASA

COMPUŞII

Hexoze

D-glucoză, D-galactoză, D-ramnoză, D-sorboză

Pentoze

D-xiloză, D-riboză, D-arabinoză

Dizaharide

zaharoză, maltoză, celobioză, trehaloză, lactoză, melibioză

Trizaharide

rafinoză, melezitoză

Polizaharide

amidon solubil, inulină

Alcooli

eritritol, ribitol, D-manitol, inozitol, metanol, etanol, glicerol,
galactitol, sorbitol

Acizi organici

acid succinic, acid citric, acid lactic, acid malic, acid gluconic, acid
gucuronic, 2-cetoglucuonat, 5-cetoglucuonat

Glicozide

α-metil-D-glucozid, arbutin, salicin
glucono-β lactonă, D-glucozamină, hidroclorid, decani, hexadecani

Alţi compuşi

3. Sisteme generale de identificare utilizate de taxonomişti
Identificarea definitivă
Pentru a obţine o identificare definitivă este necesară compararea rezultatelor obţinute
pentru o tulpină necunoscută cu caracteristicile unor tulpini standard.
Barnett şi colab (1983) au realizat un sistem relativ simplu, computerizat, de încadrare
cu ajutorul unor chei de identificare, care se bazează în special pe teste fiziologice.
Dezavantajul sistemului constă în faptul că, utilizând un număr mare de chei de identificare,
comportarea atipică a tulpinii necunoscute într-un singur test poate da rezultate eronate.
Kirshop şi colab. (1986) au pus la punct un sistem mai rapid de identificare, ce se
bazează pe o matrice probabilistică ce cuprinde răspunsul la 46 de teste morfologice şi
fiziologice pentru 400 de specii de drojdii, reproductibile şi aplicabile la o gamă largă de
specii. Identificarea se bazează pe răspunsul unei tulpini necunoscute la toate testele, iar un
răspuns atipic la un test este inclus în calculul probabilistic. Sistemul, denumit COMPASS
(computer assay) este accesibil Colecţiilor Naţionale de Culturi de Drojdii conectate la
Internet.

15

Tabelul 10.5. Teste utilizate în sistemul COMPASS de identificare a drojdiilor
TESTUL

Creşterea pe mediu lichid
Creşterea pe mediu agarizat

INFORMAŢIILE OBŢINUTE

Diviziunea celulară; formarea de pelicule
Caracteristicile creşterii vegetative
Formarea de pseudomicelii
Formarea de hife adevărate
Prezenţa artrosporilor
Prezenţa balistosporilor

Creşterea pe mediu solid cu acetat de
potasiu sau carbonat de calciu

Formarea de ascospori

Fermentarea zaharurilor

Capacitatea de a fermenta 5 zaharuri

Creşterea în aerobioză pe medii cu surse de
carbon

Capacitatea de creştere aerobiotică pe 31 de
carbohidraţi

Creşterea în aerobioză pe surse de azot

Capacitatea de creştere aerobiotică pe 2 surse de
azot

Creşterea pe mediu fără vitamine

Capacitatea de creştere fără adaos de vitamine

Activitate ureazică

Prezenţa activităţii ureazice

X.2. Nomenclatura drojdiilor
Caracteristicile cele mai importante utilizate frecvent în definirea unui taxon de
drojdii sunt, după cum s-a menţionat şi anterior:
 aspectul microscopic al celulelor;
 tipul de reproducere sexuată;
 caracterele fiziologice şi
 caracterele biochimice.
Speciile care prezintă o înmulţire sexuată cunoscută sunt denumite teleomorfe, în
timp ce starea anamorfă este caracteristică drojdiilor imperfecte, care nu prezintă
sexualitate.
Unul dintre punctele cardinale ale taxonomiei este faptul că, în clasificare, se porneşte
de la starea teleomorfă în construirea de arbori filogenetici.
Dacă se determină capacitatea de reproducere sexuată şi respectiv apartenenţa la forma
teleomorfă, un gen poate fi clasificat alături de un alt gen, anamorf, care prezintă aceleaşi
caracteristici morfologice şi fiziologice. De exemplu, Candida utilis este anamorful speciei
Pichia jadinii, în timp ce Candida pulcherrima are ca partener teleomorf specia
Metschnikowia pulcherrima.
Taxonii cunoscuţi ca având doar reproducere asexuată sunt listaţi ca genuri anamorfe.
Odată cu identificarea unor forme sexuate, genul respectiv se asimilează cu partenerul
teleomof şi se renunţă la denumirea dată formei anamorfe.
O altă problemă care apare în clasificarea diferiţilor taxoni este prezenţa sinonimelor.
Sinonimele apar din modificări făcute în nomenclatura unei specii sau din redescrierea
neadecvată a unei specii deja cunoscute.
Un exemplu pentru primul caz ar fi cel al drojdiei utilizate în sinteze proteice Torula
utilis, reclasificată drept Torulopis utilis. Mai târziu a fost transferată genului Candida şi a
16

devenit Candida utilis. Ca urmare, numele de Torula utilis şi Torulopsis utilis au devenit
sinonime cu Candida utilis. În prezent, Candida utilis este cunoscută şi ca anamorful speciei
Pichia jadinii.
Un alt sinonim al drojdiei C. utilis este C. guillermondii. Acest termen a rezultat din
denumirea incorectă a unei tulpini de C. utilis identificată ca o specie nouă.
Alte exemple includ speciile Saccharomyces diastaticus şi S. italicus care în urma
analizelor ADN s-au dovedit identice cu S. cerevisiae şi deci au devenit sinonime.
Cunoaşterea sinonimelor prezintă o importanţă deosebită şi pentru biotehnologi, care
pot să evite confuziile care apar în urma unei clasificări eronate.
De exemplu, descoperirea că o anumită reacţie poate fi mediată de S. cerevisiae, S.
beticus, S. chevalieri, S. gaditensis, S. hispalensis şi Zygosaccharomyces paradoxus a sugerat
iniţial o funcţie metabolică comună; ulterior s-a stabilit că sunt conspecifice cu S. cerevisiae şi
sunt sinonime.

X.3. Taxonomia moleculară a drojdiilor
Aplicarea tehnicilor moleculare în sistematica drojdiilor a dus la identificarea mai
precisă a diferitelor specii şi a permis reevaluarea arborilor filogenetici existenţi. Prin
aplicarea unor metode genotipice, fenotipice şi a unor criterii filogenetice s-au pus bazele aşa
numitei taxonomii polifazice.
Informaţiile genotipice sunt aduse de studiile realizate pe acizii nucleici (ADN şi
ARN); cele fenotipice derivă din studiul proteinelor şi al funcţiilor lor, al unor markeri
chemotaxonomici şi al altor trăsături exprimabile - morfologie, fiziologie, enzimologie,
serologie.
1. Analize taxonomice pe ADN cromozomal
Metodele genotipice sunt cele care aduc datele cele mai rapide şi acurate privind
încadrarea taxonomică a unei anumite specii. Aceste tehnici moleculare vizează la drojdii
analiza întregului ADN cromozomal:
 determinarea compoziţiei în baze azotate, respectiv a procentului molar de guanină/
citozină - % mol GC;
 determinarea gradului de omologie prin reasocieri ADN/ADN;
 analiza profilului de lungime a fragmentelor de restricţie - RFLP (Restriction
Fragments Length Polimorfism);
 studii de omologie a ARNr şi a genelor corespunzătoare;
 compararea profilurilor cromozomale obţinute prin tehnici electroforetice speciale
(electrocariotipare).
Determinarea conţinutului în guanină/citozină (% mol GC)
În ultimii ani au fost puse la punct o serie de tehnici de analiză a ADN cromozomal, ce
oferă informaţii cu valoare taxonomică despre microorganisme. Una dintre cele mai folosite
analize este reprezentată de determinarea compoziţiei ADN genomic în baze azotate.
Complementaritatea bazelor azotate şi structura dublucatenară a ADN asigură existenţa în
moleculă a unor cantităţi echivalente de guanină - citozină şi adenină – timină.
17

Este important de subliniat faptul că similaritatea în compoziţia în baze azotate nu
înseamnă în mod necesar că două microorganisme sunt înrudite, pentru că pot avea acelaşi %
mol GC, dar secvenţă diferită de nucleotide. Reciproca nu este însă valabilă, pentru că două
tulpini cu valori foarte diferite ale mol % GC, au şi secvenţă diferită de nucleotide. Ca urmare,
compoziţia în baze azotate – exprimată în % mol GC – reprezintă un criteriu taxonomic de
excludere şi nu de includere (criteriu negativ de încadrare a taxonilor).
Estimarea procentului G+C al moleculelor ADN se poate realiza prin trei principale
metode:
 determinarea cromatografică a bazelor azotate obţinute în urma hidrolizei ADN
cromozomal, utilizându-se tehnica HPLC (High Performance Liquid Chromatographycromatografie în fază lichidă, Nakaseetal, 1989);
Această metodă este extrem de acurată, dar este laborioasă şi costisitoare, iar la
eucariote prezintă şi dezavantajul existenţei şi a ADNmt în fracţie.
 ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal în gradient de densitate de CsCl
urmată de calcularea densităţii de plutire a macromoleculelor de ADN din probă cu
ajutorul densităţii de plutire a unei probe standard de ADN;
Procentul molar G+C se calculează pe baza relaţiei:
Densitatea de plutire = 1,66 x mol % GC
Şi această metodă este laborioasă şi costisitoare, deşi nu la fel de acurată ca HPLC.
 denaturarea termică, metoda utilizată în prezent cel mai frecvent în stabilirea
procentului molar de guanină + citozină dintr-o probă de ADN.
În această tehnică, moleculele de ADN sunt încălzite între 20 şi 100o C, timp în care
este măsurată spectrofotometric variaţia absorbanţei la lungimea de undă  = 260 nm (A260).
Datorită creşterii temperaturii, are loc denaturarea termică a moleculelor ADN.
Procesul constă în ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene şi trecerea
moleculelor de ADN din formă dublucatenară în formă monocatenară.
În timpul denaturării termice, valoarea A260 creşte cu până la 40%, proces denumit
shift hipercromic. Temperatura la care jumătate din cantitatea de ADN se află sub formă
monocatenară este denumită temperatură de topire, Tm, şi este corelată linear cu % mol GC
din probă.
În decursul timpului, au fost elaborate mai multe ecuaţii de corelaţie între cei doi
parametrii (%mol GC), în funcţie de tipul de microorganism şi de încărcătura ionică a
tamponului în care a fost dizolvat ADN-ul (în special concentraţia ionilor de sodiu).
Astfel, pentru bacterii au fost elaborate două ecuaţii de corelaţie:
a)

% mol GC = 2,44 x Tm – 169

(Franck, 1971)

utilă când ADN este dizolvat în 0,1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1,5 mM), rezultând o
concentraţie mai mare a ionilor de sodiu.
b)

% mol GC = 2,08 x Tm – 106,4

utilă când ADN este dizolvat în tampon TE pH= 8,0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la o
concentraţie mai mică a ionilor de sodiu.
Pentru drojdii este valabilă o altă formulă, şi anume:
%mol GC = 2,08 x Tm – 106,4

(Owen, 1985)

Valorile % mol GC oferă posibilitatea diferenţierii claselor şi genurilor şi la drojdii.

18

Astfel, procentul G+C al drojdiilor ascomicete este cuprins între 30 şi 50 %, în timp ce
la basidiomicete variază între 50 şi 70% (Nakase şi Komagata, 1968; Kurtzman, Phaff şi
Meyer, 1983). Şi genurile clasei de drojdii imperfecte, cu excepţia celor cu valori apropiate,
cuprinse între 48 şi 52 %, pot fi determinate pe baza conţinutului în baze azotate.
În general, variaţia % mol GC pentru diferitele specii ale unui gen nu este mai mare de
10%, fapt confirmat pentru majoritatea genurilor de drojdii. Există, însă şi excepţii, cum ar fi
în cazul speciilor genului Pichia la care diferenţa ajunge până la 22%, sau la Rhodotorula,
până la 14%. Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenţierii unor asemenea taxoni în mai
multe genuri de drojdii.
Studii de hibridizare ADN-ADN
Hibridizarea sau reasocierea ADN nuclear reprezintă o metodă indirectă de estimare a
gradului de înrudire dintre două specii (Kurtzman şi Phaff, 1987), ce oferă o rezoluţie mai
mare comparativ cu determinarea procentului molar de baze azotate.
Până în prezent au fost descrise diferite metode de evaluare a gradului de hibridizare
ADN, dintre care amintim :
Metodele spectrofotometrice (DeLey şi colaboratorii, 1970)

Metodele spectrofotometrice permit:
 decelarea între formele mono- sau bicatenare, absorbanţa la 260 nm fiind mult mai
mare pentru ADN monocatenar decât pentru ADN dublucatenar;
 studierea renaturării ADN în funcţie de timp (diminuarea absorbanţei), la o temperatură
optimă:
TOR = (0,51 x % molGC) + 47 (OR = renaturare optimă)
Hibridizarea pe suport solid

Această metodă utilizează filtre de nitroceluloză şi sonde marcate de ADN şi se poate
realiza prin:
 metode directe: ADN-ul monocatenar A, neradioactiv, fixat ireversibil pe filtre de
nitroceluloză ; incubarea filtrelor la Tm - 25 0C în prezenţa sondei monocatenare
marcate radioactiv;
 metode prin competiţie: filtrul pe care s-a fixat ADN de referinţă, neradioactiv – A este
incubat în prezenţa ADN radioactiv, denaturat, A* homolog şi o cantitate mai mare de
ADN denaturat - B, aparţinând tulpinii luate în studiu (competitorul).
Martori:- negativ : fără ADN competitor B = 100% reasociere cu A* = 0% competiţie ;
- pozitiv: ADN competitor este ADN-ul A) = 0% reasociere cu A* = 100%
competiţie.
Hibridizarea în soluţie

Se realizează ţinând cont de anumiţi parametrii:
19

ADN radioactiv să fie în cantitate foarte mică (reasocierea este improbabilă);
ADN neradioactiv să fie în cantitate de 1500 de ori mai mare.
Hibridizarea în NaCl 0,42 M, sau în tampon fosfat 0,28 M, la temperatură optimală (de
la Tm – 25 la Tm – 30o C ): prin aplicarea acestei metode se impune în final separarea ADN
hibrid (bicatenar) de ADN rămas monocatenar, fie prin cromatografie pe hidroxiapatită, fie
prin tratament cu nuclează S1, care hidrolizează specific ADN monocatenar (Vandamme et
al., 1996).
Rezultatele obţinute prin aplicarea metodelor de reasociere ADN se exprimă în
procente de omologie, dar există anumite semne de întrebare în deciderea punctului în care
două tulpini sunt considerate specii diferite. Unii cercetători au sugerat faptul că un procent de
reasociere mai mare de70 –80 % demonstrează conspecificitate (Price et al., 1978).
Kurtzman şi colab. (1980) au analizat această problemă la tulpinile de drojdii
heterotalice şi au constatat că o complementaritate crescută a moleculelor de ADN este
corelată cu fertilitatea. Astfel, au constatat că speciile Pichia amylophila şi P. missippiensis
care prezintă capacitate de împerechere, dar sporii nu sunt viabili, au un procent scăzut de
omologie ADN, în jur de 25%. Ca urmare, se poate face o corelaţie între fertilitatea scăzută şi
un grad mic de complementaritate ADN.
În acelaşi timp, însă, relaţia dintre alte tulpini, cum ar fi Issatchenikia scutulata var.
scutulata şi I. scutulata var. exigua este oarecum diferită. Aceşti doi taxoni prezintă o
omologie ADN de numai 25%, dar încrucişările genetice dau o viabilitate a ascosporilor de 36 %. Mai mult, încrucişarea descendeţilor din F1 a dat o viabilitate de 17% în generaţia F 2.
Aceste rezultate sugerează faptul că toţi descendenţii au în general cromozomi omologi şi nu
apar nici amfiploizi, nici aneuploizi.
Este clar că limita minimă a valorii procentului de reasociere ADN-ADN, care
sugerează delimitarea speciilor, nu este bine definită, iar diferenţa în secvenţa de nucleotide,
estimată din compararea întregului genom, poate fi chiar de 75% fără ca să apară modificări
genetice.
Tabelul 10.6 cuprinde principalele date referitoare la corelaţiile dintre procesul de
împerechere şi complementaritatea ADN.
În aceste studii se demostrează că descreşterea procentului de reasociere este asociată
cu scăderea competenţei de împerechere şi a fertilităţii.
Existenţa unor excepţii în ceea ce priveşte omologia ADN genomic şi fertilitatea
descendenţilor pune problema că procentul de reasociere reprezintă un indicator puternic, dar
nu infailibil al înrudirii speciilor. Aceste excepţii se datoresc unor mutaţii genetice de tipul
inversiilor, translocaţiilor, autoploidiei şi aloploidiei, care afectează fertilitatea. Majoritatea
acestor modificări nu pot fi detectate în urma comparării ADN genomic total. Doar
amfiploidia poate fi decelată, în cazul în care apar variaţii în mărimea genomului la specii
foarte înrudite.
De exemplu, S. carlsbergensis este înalt înrudită şi cu S. cerevisiae şi cu S. bayanus,
deşi aceste două ultime specii sunt foarte puţin înrudite între ele. Compararea mărimii
genomurilor sugerează că S. carlsbergensis este un amfiploid parţial care apare ca un hibrid
natural între S .cerevisie şi S. bayanus. (Vaughn Martin şi Kurtzman, 1985). În acest caz, s-a
presupus că S. carlsbergensis este infertil cu parentalii, în ciuda omologiei mari a ADN.
Studiile de reasociere ADN au avut un impact extraordinar în definirea speciilor şi
genurilor de drojdii (Tabelul 10.7).
Astfel, speciile genurilor Candida şi Torulopsis au fost iniţial încadrate în taxoni
diferiţi pe baza faptului că primele produc pseudohife. În prezent, aceşti taxoni sunt
consideraţi sinonimi, pe baza studiilor de reasociere ADN, şi denumirea de Candida a avut
prioritate, fiind prima descrisă.
Este şi cazul speciilor Pichia lindneri şi Hansenula minuta (Kurtzman, 1984), care au
fost iniţial încadrate ca taxoni diferiţi pe baza capacităţii diferite de asimilare a azotului, iar în
prezent sunt considerate ca aceeaşi specie, prezentând un procent de omologie ADN de 75%.

20

Tabelul 10.6. Corelaţia dintre reacţia de împerechere şi complementaritatea ADN între
ascomicete heterotalice strâns înrudite şi bazidiomicete

SPECIILE

Filobasidiela neoformans x
F. bacillispora

REACŢIA DE ÎMPERECHERE

% OMOLOGIE ADN

Conjugare slabă; viabilitatea
bazidiosporilor 0-30% (descendenţa
F 1, 2 nedeterminată)

55-63
(Aulakh, 1981)

Issatchenkia scutulata var.
exigua x I.scutulata var.
scutulata

Conjugare bună; ascospori viabili:
F1= 5%; F2 =17%

21-26
(Kurtzman et al., 1980)

Pichia amylophila x P.
mississippiensis

Conjugare bună; ascospori neviabili

20-27
(Kurtzman et al., 1980)

P. bimunadalis x P.americana

Conjugare slabă; nu se produc
ascospori

21
(Kurtzman et al., 1980 )

P.alni x P. canadensis

Conjugare slabă; nu se produc
ascospori

6
(Fuson et al., 1979)

Issatchenkia orientalis x I.
occidentalis

Conjugare slabă; nu se produc
ascospori

3-8
(Kurtzman et al., 1980 )

Tabelul 10.7. Utilizarea criteriilor de reasociere a ADN în taxonomia drojdiilor

SPECIA

CARACTERISTICILE /+ SAU /-

%REASOCIERE ADN

Candida slooffi
Torulopsis pintolopesii

pseudohife/+
/-

80
(Mendonsa-Hagler & Phaff, 1975)

Hansenula wingei
Hansenula canadensis

hife adevărate/+
/-

78
(Fuson,1979)

fermentarea glucozei/+
/-

96
(Price et al., 1978)

asim. lactozei /+
/-

97
(Price et al., 1978)

asim. azotatului /+
/-

75
(Kurtzman, 1984)

asim. azotului/+
/-

100
(Kurtzman,1984)

Debaryomyces formicarius
Debaryomyces vanriji
Schwanniomyces castellii
Schwanniomyces occidentali
Hansenula minuta
Pichia lindneri
Sterigmatomyces halophilus
Sterigmatomyces indicas

21

2. Studii de omologie pe ADN mitocondrial
Studiile de omologie pe ADN mitocondrial (ADNmt) se realizează prin compararea
pattern-urilor de restricţie şi prezintă avantajul că, ADN mitocondrial având dimensiuni mai
mici decât ADN nuclear, analiza fragmentelor de restricţie este mai facilă.
Deşi structura genetică a ADNmt este aceeaşi pentru toate speciile de drojdii,
profilurile de restricţie sunt diferite, datorită modificărilor de dimensiune ce apar frecvent, fie
în urma unor mutaţii ireversibile ce afectează întregul genom, fie datorită variabilităţii genelor
mozaicate.
Astfel, locusul cob-box, care codifică pentru apoproteina citocromului b, este format la
unele tulpini din 4 exoni şi 3 introni, în timp ce la alte tulpini conţine 6 exoni şi 5 introni,
datorită inserţiei a 3 introni în exonul 1. De asemenea, gena pentru ARNr 21S prezintă, la
unele tulpini, un intron de 1,1 Kpb, în timp ce la alte tulpini acest intron este deletat.
Recent, a fost pusă la punct o tehnică simplă şi rapidă de analiză a pattern-ului de
restricţie a ADNmt (Querol,1996), care nu necesită în prealabil izolarea şi purificarea ADN
mt, prin ultracentifugare izopicnică, permiţând caracterizarea facilă a unui număr mare de
tulpini naturale de drojdii.
Metoda constă în tratarea ADN total (izolat printr-o micrometodă) cu endonucleaze de
restricţie care recunosc secvenţe tetranucleotidice (AluI, HaeIII, Hpa, RsaI, Sau3A, MboI) sau
pentanucleotidice (DdeI, HinfI, MaeIII). Pentru aceste enzime de restricţie sunt prezente
foarte multe situsuri de recunoştere în ADN-ul nuclear, în timp ce în ADNmt sunt foarte
puţine secvenţe specifice. Datorită dimensiunii lor mari, aceste fragmente pot fi observate cu
uşurinţă în gelul de agaroză, profilurile RFLP obţinute permiţând decelarea diferitelor tulpini
de drojdii, având astfel o valoare taxonomică deosebită.
3. Studii de omologie pe ADNr pe baza reasocierii ARNr-ADNr
În ultimul timp, studiile de taxonomie la drojdii apelează, ca de altfel şi în cazul altor
organisme, şi la analiza genelor pentru diferitele tipuri de ARNr (25 S, 18 S, 5,8 şi 5 S).
S-a ajuns la concluzia că secvenţele ADNr şi implicit moleculele de ARN ribozomal
corespunzătoare prezintă, în scară evolutivă, un grad ridicat de constanţă funcţională şi de
secvenţă, constituind cele mai bune cronometre moleculare. Astfel, interesul pentru studiile
realizate pe ARNr/ ADNr se datorează unor caracteristici importante, cum ar fi:
 ribozomii sunt prezenţi la toate organismele şi au aceeaşi origine evolutivă, ceea ce
presupune o origine moleculară comună pentru toate organismele vii;
 unele secvenţe ARNr/ADNr sunt înalt conservate şi, ca atare, omoloage la toate
organismele, reprezentând puncte de referinţă pentru identificarea secvenţelor variabile,
markeri de identificare a relaţiilor filogenetice dintre specii;
 genele ADNr sunt organizate în unităţi repetitive dispuse în tandem, fiind prezente la
eucariotele inferioare, inclusiv la drojdii, în 100-200 copii. Din acest motiv reprezintă
un material perfect pentru reacţiile de restricţie (Kurtzman, 1994 ).
Studiile de taxonomie moleculară s-au axat iniţial pe analiza moleculelor de ARNr,
ţinând cont de faptul că metodele de izolare şi purificare a acestor molecule se realizează
relativ facil, datorită cantităţii mari de ARNr existent în celule.
Tehnicile de caracterizare a diferitelor tipuri de ARNr, de dimensiuni mici şi mari,
constau în secvenţierea moleculelor ARNr prin aplicarea metodei Sanger sau, mai recent, a
moleculelor ADNc rezultate prin utilizarea unor primeri oligonucleotidici specifici şi a
reverstranscrierii (Lane şi colab, 1985). De altfel, s-a constatat că se obţin rezultate mai
22

acurate prin secvenţierea ADNr, utilizând primeri oligonucleotidici şi reacţia PCR
(Kaltenboecker şi colab., 1992).
În sistematica drojdiilor, primele studii de reasociere ARNr-ADNr au fost realizate în
1970, de Bicknell şi Douglas.
Prin estimarea gradul de reasociere dintre probe de ARNr 25S marcate radioactiv şi
ADN nuclear au stabilit înrudirea strânsă dintre genurile Saccharomyces, Kluyveromyces,
Zygosaccharomyces, Torulopsis şi Arxiozyma şi o divergenţă crescută între aceşti taxoni şi alte
drojdii, cum ar fi Pichia jadinii (specia anamorfă, Candida utilis). O metodologie similară a
fost utilizată şi de Segal şi Zylan (1974) în compararea speciilor de Candida, inclusiv
Candida albicans.
Şi la bazidiomicete studiile de reasociere ARNr-ADN au reevaluat relaţiile dintre
diferite specii, stabilind, de exemplu, că speciile cu pigmentaţie roşie, Rhodosporidium
toruloides şi Sporidiobolus salmoniocolor sunt mult mai puţin înrudite între ele decât R.
toruloides şi specia Leucosporidium scotti, care nu produce pigmenţi carotenoizi.
Deşi hibridizările ARNr/ADNr dau informaţii generale privind relaţiile dintre taxoni,
prezintă unele impedimente în aplicarea lor extensivă în studiile de taxonomie, deoarece sunt
laborioase, iar în cazul în care cresc distanţele filogenetice se ajunge la un punct în care
secvenţele de nucleotide sunt atât de diferite, încât nu permit hibridizări moleculare. De altfel,
s-a sugerat că similaritatea de secvenţă trebuie să fie în jur de 80%, pentru a se realiza
reasocierile moleculare.
Studiul paternurilor de restricţie pe ADNr
Studiile realizate pe diferiţi taxoni de drojdii au demonstrat că pattern-urile de
restricţie pe ADNr dau rezultate concludente, atât în identificarea speciilor, cât şi a tulpinilor
unei anumite specii.
Primele cercetări care au vizat încadrarea taxonomică a drojdiilor prin RFLP pe ADNr
au avut ca obict de studiu drojdiile patogene, cu importanţă medicală. În cazul tulpinilor
patogene această tehnică prezintă valoare de diagnostic.
Astfel, au fost stabilite relaţiile filogenetice între diferite specii aparţinând genurilor
Candida şi Cryptococcus (Magee şi colab., 1987; Vigalys şi Hester, 1990). Aceste estimări
sunt însă mai puţin acurate decât cele derivate din compararea secvenţelor de nucleotide,
deoarece cu cât distanţele filogenetice sunt mai mari, cu atât estimarea similarităţilor
paternurilor de restricţie este mai puţin sigură.
Secvenţierea ARNr 5S
Majoritatea studiilor de secvenţiere a ARNr 5S s-au realizat la bazidiomicete şi
prezintă o importanţă deosebită în stabilirea relaţiilor filogenetice, datorită analizei facile a
acestor molecule de dimensiuni mici (circa 120 nucleotide) şi cu o secvenţă de nucleotide
înalt conservată (Kurtzman, 1993).
La ascomicete, aceste studii au fost mai puţin abordate, dar au avut o mare relevanţă în
stabilirea evoluţiei divergente a speciilor Schizosaccharomyces pombe şi Saccharomyces
cerevisiae (Mao şi colab., 1985 ).
Rezultate similare au fost obţinute şi de Walker (1985), care a demonstrat pe baza
studiilor de secvenţiere a ARN 5S că ascomicetele prezintă o divergenţă mult mai mare decât
s-a crezut iniţial şi se divid în trei grupe mari: 1. Schizosaccharomyces şi Protomyces; 2.
drojdiile care se înmulţesc prin înmugurire; 3. fungii filamentoşi.
23

Secvenţierea ARNr 18S şi 25S
Compararea secvenţelor ARNr 18S şi 25S (Guttel şi Fox, 1988 ) a demonstrat faptul
că la capetele 5’ aceste molecule prezintă un grad ridicat de variabilitate, ceea ce permite
decelarea speciilor înalt înrudite. Astfel, Peterson şi Kurtzman (1991) au arătat că regiunea
desemnată 25S-635 (domeniul D2, Guadet şi colab., 1989) prezintă o variabilitate destul de
mare, care permite separarea speciilor stâns interrelate (Tabelul 10.8).
Există şi excepţii, cum ar fi perechea Saccharomyces bayanus/ S. pastorianus, cu o
variabilitate de 0% în regiunea D2. Se presupune că S. pastorianus este un amfidiploid parţial
rezultat din hibridizările S. cerevisiae x S. bayanus, care a reţinut ADNr de la S. bayanus
(Peterson şi Kurtzman, 1991).
Tabelul 10.8. Variabilitatea regiunii 25S-635- criteriu de diferenţiere a speciilor strâns
înrudite

SPECIILE PERECHE

OMOLOGIE ADN
(%)

VARIABILITATE ÎN
REGIUNEA 25S-635 (%
NUCLEOTIDE DIFERITE)

58
10
70
25
21
25

5,4
5,4
0
2,0
1,0
5,1

30
30
43

0,7
2,0
0

Specii heterotalice
Saccharomyces cerevisiae x S.pastorianus
S.cerevisiae x S. bayanus
S.pastorianus x S. bayanus
Pichia mississippiensis x P. amylophila
P. bimundalis x P. americana
Issatchenkia scutulata x var. esigna
Specii homotalice
Debaryomyces melissophilus x D.sp.n.
Saturnospora saitoi x S. ahearnii
Williopsis saturnus x sargentensis

Astfel, regiunea D2 este suficient de variabilă pentru a permite, cu câteva excepţii,
identificarea speciilor de drojdii aparţinânâd ascomicetelor şi bazidiomicetelor, chiar şi a celor
cu un grad mare de înrudire.
Speciile conspecifice prezintă în mod obişnuit o divergenţă de 0-1%, în timp ce la
speciile îndepărtate filogenetic, cum ar fi Pichia bimundalis şi Schizosaccharomyces
japonicus var. versatilis, se observă o varabilitate de circa 47% (Peterson şi Kurtzman, 1991).
Analiza comparativă a regiunii D2 şi a regiunilor 25S-1841 şi 18S-1627 la diferite
specii de drojdii a permis construirea arborilor filogenetici la genurile Debaryomyces,
Saccharomyces şi Schizosaccharomyces.
S-a constatat că în cele trei regiuni pot să apară substituţii de perechi de baze, cu rate
variabile în funcţie de gen, reprezentând, astfel, un criteriu important în clasificarea drojdiilor.
Identificarea drojdiilor prin tehnici electroforetice speciale
Tehnicile de electrocariotipare permit separarea prin electroforeză în gel de agaroză a
moleculelor de ADN cu dimensiuni de peste 25 kpb a căror migrare este blocată în condiţiile
electroforezei clasice datorită imposibilităţii de înaintare prin ochiurile reţelei gelului de
24

agaroză. O soluţie ar fi utilizarea unei agaroze de concentraţie mai mică de 0,5% ceea ce
ridică însă dificultăţi de manipulare a gelului.
Aceste tehnici fac posibilă evidenţierea celor 16 cromosomi de la S. cerevisiae a căror
dimensiune medie (determinată prin tehnicile clasice de cartare genetică) variază între 500 1000 kpb.
În prezent se utilizează diferite tehnici de electrocariotipare care diferă atât prin
numărul şi dispunerea electrozilor cât şi prin tipul de câmp electric generat, fapt care
determină grade diferite de rezoluţie a benzilor electroforetice:
Tehnica OFAGE (ortogonal field alternation gel electrophoresis)
Această tehnică a fost introdusă de Carle şi Olson în 1984, utilizează 2 perechi de
electrozi astfel plasaţi încât produc câmpuri electrice în diagonală la unghiuri mai mari de 90o.
Datorită neomogenităţii câmpului aplicat moleculele de ADN migrează pe o traiectorie curbă
departându-se de centru, asigurând totuşi apariţia unor benzi clare (Figura 10.1). Actualmente
tehnica a fost înlocuită cu altele mai performante.

Figura 10.1. Tehnici electroforetice speciale
25

Tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis)
În tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) – Olson şi Carle (1984) - este
schimbată cu 180o polaritatea câmpului electric la fiecare ciclu cu un timp mai mare (aproape
dublu) pentru direcţia spre anod. Relaţia între viteza de migrare şi dimensiunea moleculelor de
ADN este complexă şi, de regulă, impune creşterea timpului de schimbare a direcţiei de migrare,
proces numit “ramping”. La unele drojdii care prezintă cromosomi de dimensiuni mari, cum este
cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuşit separarea cromozomilor fără “ramping”.
Pentru cei 16 cromosomi de la Saccharomyces cerevisiae, s-au evidenţiat 13 benzi
electroforetice datorită co-migrării unor cromozomi cu dimensiuni apropiate (XIII şi XVI, VII şi
XV, V şi VIII) (Fig. 4. 18). Mărimea cromosomului XII variază de la o tulpină la alta (2 Mb –
3Mb) în funcţie de numărul de copii (100 – 200) ale genelor ADNr prezente la nivelul acestui
cromosom. Acest aspect s-a dovedit a fi de mare importanţă în taxonomia drojdiilor.
CROMOZOM

DIMENSIUNE

IV
XII
VII + XV
XIII + XVI
II
XIV
X
XI
V + VIII
IX
III
VI
I

1625
1095+ADNr
1120+1170
965+1015
840
825
760
680
585+595
440
350
270
245

(KPB)

Figura 10.2. Cromosomii de S. cerevisiae evidenţiaţi prin
FIGE

Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields)

Descrisă de Chu (1989), Meese şi Meltzer (1990), această tehnică foloseşte o arie
hexagonală în care sunt plasaţi mulţi electrozi mici conectaţi în serie astfel încât câmpurile
electrice se întretaie în unghiuri de 120 o. Benzile rezultate sunt mai clare şi pe acelasi gel poate
fi încarcat un număr mare de probe (Fig. 4. 17). O variantă a acestei tehnici este RGE (rotating
gel) în care se utilizează câmpuri electrice întretăiate omogene rezultate prin rotirea gelului cu
90o la fiecare ciclu.

26

Tehnicile electroforetice speciale permit: (I) separarea şi caracterizarea cromosomilor
(molecule de ADN intacte) în scopul determinării polimorfismului cromosomal a diferitelor
tulpini de drojdii; (II) identificarea poziţiei genelor pe cromosomi; (III) prepararea şi
screening-ul bibliotecilor YAC (Yeast Artificial Chromosomes).

27