PENINGKATAN EFISIENSI LEPTIN

PADA LEMAK VISERAL TIKUS OBESITAS (Rattus novergicus)

DENGAN MENGGUNAKAN EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN
(Nephelium lappaceum L.)
M. Fitri Athoillah1, Umie Lestari2, Sri Rahayu Lestari2
1) Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
2) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Malang, Jl Semarang No.5, Malang, Indonesia
e-mail: 1athoillah.mf@gmail.com

ABSTRAK: Kulit Buah Rambutan mengandung polifenol yang dapat digunakan

sebagai agen antiobesitas. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis pengaruh
ekstrak kulit buah rambutan terhadap efisiensi leptin pada lemak viseral tikus
obesitas. Parameter efisiensi yang digunakan meliputi kadar leptin pada lemak
viseral, berat badan, dan asupan nutrisi tikus obesitas. Lemak viseral diambil setelah
tiga belas minggu perlakuan dan diukur kadar leptinnya dengan menggunakan teknik
indirect ELISA. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kulit buah rambutan dosis 15
mg/kgbb dan 60 mg/kgbb belum menunjukkan peningkatan efisiensi leptin pada
lemak viseral tikus obesitas, namun pada ekstrak kulit buah rambutan dosis 30
mg/kgbb menunjukkan kecenderungan penurunan kadar leptin, berat badan, dan
asupan nutrisi tikus obesitas.
Kata Kunci: ekstrak kulit buah rambutan, obesitas, efisiensi leptin

Obesitas merupakan masalah kesehatan di dunia yang telah terjadi selama

lebih dari tiga puluh tahun. Prevalensi obesitas di dunia mengalami peningkatan
secara signifikan dalam kurun dua dekade terakhir. Kasus obesitas akan terus
mengalami peningkatan dan diperkirakan sekitar 1,12 miliar orang di dunia akan
mengalami obesitas pada tahun 2030 (Meydani dan Hasan, 2010; Derdemezis et
al., 2011).Obesitas merupakan gangguan metabolisme yang diakibatkan oleh
ketidakseimbangan energi dalam homeostasis. Obesitas ditandai dengan peningkatan massa jaringan adiposa yang disebabkan oleh energi yang masuk melebihi
energi yang dikeluarkan, sehingga terjadi akumulasi dalam bentuk lemak. Akumulasi dalam bentuk lemak akan mengakibatkan hipertrofi dan hiperplasia pada
jaringan adiposa (Derdemezis et al., 2011; Enns et al., 2011). Faktor kunci yang
menyebabkan obesitas adalah kelebihan asupan nutrisi, seperti tingginya
konsumsi karbohidrat, lemak, dan protein (Dann et al., 2007; Enns et al., 2011).
Nutrisi yang dikonsumsi tubuh dalam jumlah besar akan meningkatkan
produksi Reactive Oxygen Species (ROS). Produksi ROS yang lebih besar
daripada aktivitas antioksidan yang ada dalam tubuh, akan menyebabkan terjadi
stres oksidatif dalam lingkungan sel. Beberapa penelitian yang telah dilakukan
menunjukkan bahwa obesitas dapat menginduksi stres oksidatif dan menimbulkan
gangguan pada produksi adipokin. Salah satu adipokin yang memiliki peran
dalam menjaga homeostasis energi dalam tubuh adalah leptin (Wellen dan
Thompson, 2010; Sanchez et al., 2011). Leptin merupakan hormon yang disintesis
oleh sel adiposa. Leptin berfungsi untuk menurunkan jumlah makanan yang
masuk, meningkatkan energi yang dikeluarkan melalui sinyal spesifik pada
hipotalamus, dan memelihara homeostasis berat badan (Rodrigues, 2009; Sahu,
1

2011). Kadar leptin yang bersirkulasi dalam darah orang normal diketahui sebesar
1-3 ng/mL, sedangkan kadar leptin yang bersirkulasi dalam darah penderita
obesitas sebesar 100 ng/mL (Hoda et al., 2012). Kadar leptin yang meningkat
pada penderita obesitas berhubungan dengan menurunnya kemampuan leptin
untuk menekan makanan yang masuk, dan menekan penambahan berat badan,
suatu keadaan yang disebut dengan resistensi leptin. Kadar leptin dalam sel
adiposa dapat dijadikan sebagai indikator seberapa efisien leptin bekerja dalam
menjaga homeostasis energi. Efisiensi leptin merupakan kadar leptin yang
diproduksi dalam sel adiposa yang mampu menjaga homeostasis energi melalui
regulasi berat badan.
Rambutan adalah salah satu tanaman buah yang tumbuh di Indonesia dan
sering dikonsumsi oleh masyarakat, karena harganya murah. Daging buah
rambutan yang dikonsumsi merupakan sumber antioksidan, namun kulit buahnya
selama ini masih belum banyak dimanfaatkan secara optimal dan hanya dianggap
sebagai limbah. Kulit buah rambutan mengandung senyawa fenol dengan
komponen utama asam elagat, korilagin dan geraniin (Thitilertdecha et al., 2010).
Hasil penelitian Lestari dan Wulandari (2009) menyebutkan 30 g/ml ekstrak
kasar kulit buah rambutan memiliki kemampuan meredam radikal bebas sebesar
67,50% melalui pengukuran Inhibitor Concentration (IC50). Hal ini menunjukkan
ekstrak kulit buah rambutan memiliki kapasitas antioksidan yang kuat. Pemberian
ekstrak kulit buah rambutan yang mengandung polifenol diharapkan mampu
menurunkan obesitas melalui aktivitas antioksidan yang dimiliki, sehingga
mampu meningkatkan efisiensi leptin pada lemak viseral tikus obesitas.
METODE
Tikus jantan obesitas berumur dua belas minggu sejumlah dua puluh lima
ekor dibagi dalam lima kelompok yakni Nt, Plc, P 1, P2, dan P3. Kelompok Nt
tanpa perlakuan, kelompok Plc per oral aquades, kelompok P 1 per oral dengan
ekstrak 15 mg/kgbb, kelompok P2 per oral dengan ekstrak 30 mg/kgbb, kelompok
P3 per oral dengan ekstrak 60 mg/kgbb. Perlakuan diberikan setiap dua hari sekali
selama tiga belas minggu. Berat badan tikus diukur setiap satu minggu sekali,
selama tiga belas minggu. Kriteria tikus obesitas ditentukan dengan menggunakan
indeks Lee (Campos et al., 2008). Penimbangan berat pakan yang dikonsumsi
tikus dilakukan pada saat tikus berada di dalam kandang metabolik, yakni pada
minggu ke- 1, 4, 7, 10, dan 12. Sampel yang digunakan dalam pengambilan data
pakan ialah dua ekor tikus untuk tiap kelompok perlakuan. Parameter yang
digunakan untuk asupan nutrisi tikus obesitas antara lain, konsumsi pakan (g),
energi masuk (kJ/hari), dan efisiensi pakan (%). Pada minggu ke-13 setelah
perlakuan, tikus dibedah dan diambil lemak viseral daerah intraperitoneal. Lemak
viseral selanjutnya diukur kadar leptinnya dengan menggunakan teknik indirect
ELISA.
HASIL
Data rerata kadar leptin pada lemak viseral, berat badan awal, berat badan
akhir, berat badan awal-akhir, konsumsi pakan, energi masuk, efisiensi pakan, dan
indeks Lee tikus jantan obesitas tertera pada Tabel 1. Data disajikan dalam bentuk
rerata standar error (SE).

Tabel 1. Pengaruh Ekstrak Kulit Buah Rambutan Terhadap Peningkatan Efisiensi Leptin
Parameter
Kadar Leptin (ng/mL)
Berat Badan Awal (gram)
Berat Badan Akhir
(gram)
Berat Badan Awal-Akhir
(gram)
Konsumsi Pakan (gram)
Energi Masuk (kJ/hari)*
Efisiensi Pakan (%)

Nt
1304 540,5
363,54 7,8

Plc
1517,5 766
346,10 8,8

Kelompok
P1
1489,5 107,6
367,08 20,7

P2
1020,5 212
354,48 17,2

P3
1808 366,1
348,34 18,9

443,66 10,4

423,98 11,8

434,98 17,5

425,04 22,4

425,04 22,4

409,51 7,6

391,04 12,1

394,70 18,3

375,06 13,4

382,78 18,4

20,11 0,6

18,09 0,6

19,38 0,1

22,56 1,8

18,26 0,9

320,66 9,1

288,33 9,6

308,94 1

359,66 29,3

291,14 13,9

3,65 0,3

2,54 0,3

2,69 2,4

2,16 2,3

2,90 1,9

0,327

0,327

Indeks Lee
0,332
0,327
0,329
Keterangan:
Nt
= Tanpa perlakuan
Plc
= Plasebo
P1
= Dosis 15 mg/kgBB
P2
= Dosis 30 mg/kgBB
P3
= Dosis 60 mg/kgBB
(*)
= Energi masuk hanya diperoleh dari jumlah pakan (gram) yang dikonsumsi

Berdasarkan hasil uji normalitas dan homogenitas untuk kadar leptin dapat
diketahui nilai sebaran data secara berurutan adalah 0,176 dan 0,150, sedangkan
hasil uji normalitas dan homogenitas untuk berat badan dapat diketahui nilai
sebaran data secara berurutan adalah 0,735 untuk berat badan awal dan 0,89 untuk
berat badan akhir, dan 0,111. Hal tersebut menunjukkan data kadar leptin dan
berat badan berada pada rentang sebaran data normal dan homogen dikarenakan
nilai p > 0,05. Data kadar leptin dianalisis menggunakan Anava tunggal,
sedangkan data berat badan dianalisis menggunakan Anakova tunggal yang
menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang bermakna pada perlakuan yang
diberikan terhadap kadar leptin dan berat badan, karena Fsig secara berurutan (0,81;
0,936) > p (0,05).
Hasil analisis secara deskriptif menunjukkan asupan nutrisi kelompok
tikus P2 pada minggu ke 1, 4, 7, 10, dan 12 menunjukkan kecenderungan
penurunan konsumsi pakan dan energi masuk selama perlakuan (data tidak
ditampilkan). Efisiensi pakan terendah ditunjukkan oleh kelompok tikus
perlakuan P2. Data efisiensi pakan mendukung parameter lainnya, yakni kadar
leptin, berat badan, konsumsi pakan, dan energi masuk. Asupan nutrisi pada
kelompok tikus perlakuan P2 yang diberi ekstrak kulit buah rambutan dosis 30
mg/kgbb memiliki kecenderungan mengalami penurunan selama perlakuan bila
dibandingkan dengan kelompok tikus Nt dan Plc.

PEMBAHASAN

Obesitas merupakan gangguan metabolisme yang kompleks, akibat dari

energi yang dikonsumsi lebih besar bila dibandingkan dengan energi yang
digunakan. Obesitas berkaitan dengan tingginya konsumsi lemak dan gula serta
rendahnya aktivitas fisik. Hasil dari beberapa penelitian menyatakan sel adiposa
menghasilkan ROS, sehingga meningkatkan stres oksidatif pada jaringan adiposa
putih (Sanchez et al., 2011). Komponen bioaktif seperti polifenol memiliki
potensi dalam menurunkan lipogenesis, dan meningkatkan oksidasi asam lemak.
Peran polifenol sebagai antioksidan dalam jalur signaling gen inflamasi, mampu
meningkatkan pertahanan beberapa jaringan terhadap stressor elektrofilik dan
stres oksidatif. Aktivitas antioksidan pada jalur yang mengkode gen inflamasi,
merupakan strategi untuk mencegah dan menangani penyakit metabolik akibat
stres oksidatif seperti obesitas (Alves et al., 2012).
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kulit buah rambutan pada dosis 30
mg/kgbb memiliki kecenderungan untuk menurunkan kadar leptin pada lemak
viseral, berat badan dan asupan nutrisi tikus obesitas. Penurunan kadar leptin,
berat badan, dan asupan nutrisi pada tikus setelah diberi ekstrak kulit buah
rambutan dosis 30 mg/kgbb, menunjukkan resistensi leptin mengalami penurunan.
Kulit buah rambutan mengandung polifenol dengan komponen utama asam elagat,
korilagin dan geraniin (Thitilertdecha et al., 2010). Struktur asam elagat, korilagin
dan geraniin memiliki kemiripan dengan struktur komponen polifenol yang
terdapat pada teh, yaitu catechin dan epigallocatechin gallate (EGCG) dengan
ikatan rangkap lebih banyak. Park dan Kim (2011), Alves et al. (2012)
menyatakan kandungan EGCG pada teh hijau mampu menurunkan kadar leptin,
dan energi yang masuk dengan cara meningkatkan oksidasi asam lemak.
Kandungan catechin mampu menekan ekspresi PPAR- dan C/EBP-, sehingga
menurunkan diferensiasi dan proliferasi sel adiposa. Peningkatan oksidasi asam
lemak dan penekanan pada ekspresi PPAR- dan C/EBP-, akan menghambat
proses adipogenesis, sehingga leptin yang diproduksi oleh sel adiposa juga ikut
berkurang. Struktur kimia polifenol pada kulit buah rambutan yang mirip dengan
catechin dan EGCG pada teh hijau diduga memiliki kemampuan untuk menekan
akumulasi trigliserida pada sel adiposa, sehingga diikuti dengan menurunnya berat
badan.
Sakurai et al. (2008) melaporkan kandungan polifenol pada ekstrak
perikarp buah leci, mampu menurunkan tingkat stres oksidatif dan inflamasi
melalui down regulation faktor transkripsi NF-kB, akibatnya gangguan pada gen
yang memproduksi adipokin menjadi berkurang. Produksi adipokin yang kembali
stabil disertai dengan menurunnya tingkat stres oksidatif, akan memberi efek
menguntungkan dalam mencegah gangguan metabolik akibat obesitas. Efektivitas
dari ekstrak kulit buah rambutan dosis 30 mg/kgbb diduga mengalami
peningkatan, sehingga efisiensi leptin ikut meningkat. Hal ini ditunjukkan oleh
menurunnya kadar leptin, berat badan, dan asupan nutrisi pada tikus yang diberi
diet tinggi kalori. Efisiensi leptin yang meningkat, akan mengurangi resistensi
leptin, dan meningkatkan sensitivitas leptin, sehingga gangguan metabolik akibat
obesitas dapat berkurang.
Pada penelitian ini, kadar leptin, berat badan, dan asupan nutrisi pada
kelompok tikus perlakuan ekstrak kulit buah rambutan dosis 15 mg/kgbb dan 60
mg/kgbb menunjukkan kecenderungan peningkatan bila dibandingkan dengan
kelompok tikus tanpa perlakuan dan plasebo. Hal ini menunjukkan pada

kelompok tikus perlakuan ekstrak kulit buah rambutan dosis 15 mg/kgbb dan 60
mg/kgbb terjadi resistensi leptin. Fuji et al. (2007) dalam Sakurai et al. (2008)
melaporkan bentuk molekul polifenol yang kompleks lebih sulit dicerna daripada
bentuk molekul polifenol yang lebih sederhana. Hasil penelitian Sakurai et al.
(2008) menunjukkan bentuk oligomer polifenol dari ekstrak perikarp buah leci,
yakni oligonol memiliki aktivitas antioksidan lebih kuat daripada ekstrak perikarp
buah leci biasa, baik secara in vivo maupun in vitro. Hal ini menunjukkan tingkat
penyerapan polifenol berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan pada sel adiposa.
Kadar leptin yang tinggi pada tikus kelompok dosis 15 mg/kgbb dan 60
mg/kgbb berbanding lurus dengan data berat badan tikus yang tinggi bila
dibandingkan berat badan dengan kelompok tikus plasebo. Oswal dan Yeo (2010)
menyatakan kadar leptin berbanding lurus dengan massa sel adiposa. Peningkatan
massa sel adiposa akan meningkatkan produksi leptin. Wellen dan Thompson
(2010) menyatakan diet tinggi kalori memicu timbulnya stres nutrisi. Hal ini akan
memicu tingginya produksi ROS, sehingga mempengaruhi regulasi gen yang
berperan dalam mengontrol adipogenesis. Ketidakseimbangan regulasi gen yang
mengontrol proses adipogenesis akan memicu pembentukan sel adiposa secara
berlebih, sehingga mengakibatkan bertambahnya berat badan.
Kadar leptin dan berat badan yang meningkat pada kelompok tikus yang
diberi ekstrak kulit buah rambutan dosis 15 mg/kgbb dan 60 mg/kgbb juga diikuti
dengan kecenderungan meningkatnya konsumsi pakan dan energi yang masuk
selama berada di dalam kandang metabolik. Kadar trigliserida dalam darah yang
tinggi diduga merupakan faktor yang mempengaruhi kelompok tikus perlakuan
mengalami kecenderungan peningkatan asupan pakan. Oswal dan Yeo (2010),
Banks et al. (2004), Morris dan Rui (2009) menyatakan dalam kondisi
hipertrigliseridemia, senyawa trigliserida akan menghambat transport leptin
melewati blood brain barrier menuju hipotalamus, sehingga mengakibatkan
ketidakmampuan leptin berikatan dengan reseptornya di hipotalamus. Hal tersebut
menyebabkan leptin tidak mampu menekan asupan makanan yang masuk,
sehingga pada kelompok tikus perlakuan dosis 15 mg/kgbb dan 60 mg/kgbb
memiliki kecenderungan peningkatan pakan yang dikonsumsi.
Pada penelitian ini, ekstrak kulit buah rambutan yang digunakan masih
berupa ekstrak kasar (crude extract), dan diduga kandungan polifenol dalam
ekstrak kulit buah rambutan dosis 15 mg/kgbb dan 60 mg/kgbb diserap dalam
kuantitas rendah, sehingga tidak mampu menurunkan tingkat stres oksidatif pada
sel adiposa. Tingkat stress oksidatif yang tinggi menyebabkan efisiensi leptin
tidak meningkat, sehingga kadar leptin pada lemak viseral, berat badan, dan
asupan nutrisi tikus tetap tinggi, dan resistensi leptin tidak mengalami penurunan.
PENUTUP
Kesimpulan
Ekstrak kulit buah rambutan dosis 15 mg/kgbb dan 60 mg/kgbb belum
menunjukkan peningkatan efisiensi leptin, namun ekstrak kulit buah rambutan
dosis 30 mg/kgbb memiliki kecenderungan untuk menurunkan kadar leptin pada
lemak viseral, berat badan, dan asupan nutrisi tikus obesitas.
Saran

Perlu diadakan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh ekstrak kulit

buah rambutan dengan menggunakan rentang dosis yang lebih kecil, pengamatan
dengan parameter aktivitas, dan penelitian lebih lanjut tentang tingkat ekspresi
reseptor leptin pada hipotalamus dengan menggunakan teknik immunohistokimia,
sehingga pengaruh ekstrak kulit buah rambutan terhadap efisiensi leptin dapat
lebih diketahui.
DAFTAR RUJUKAN
Alves, N. E. G., Valds, S. T., Silveira, C. M. M., Martino, H. S. D. D., Milagro, F.
I., Aliaga, M. J. M., dan Ribeiro, S. M. R. 2012. Studies on Mechanistic
Role of Natural Bioactive Compounds in the Management of Obesity
An Overview. The Open Nutraceuticals Journal, 2012, Volume 5, 193206
Banks, W. A., Coon, A. B., Robinson, S. M., Moinuddin, A., Shultz, J. M.,
Nakaoke, R., dan Morley, J. E. 2004. Triglycerides Induce Leptin
Resistance at the Blood-Brain Barrier. Diabetes, Vol. 53, May 2004
page 1253-1260
Campos, K. E., Volpato, G.T., Calderon, I.M.P., Rudge M.V.C., dan Damasceno,
D.C.2008. Effect of Obesity on Rat Reproduction dan on The
Development of Their Adult Offspring. Brazillian Journal of Medical
and Biological Research (2008) 41: 122-125 ISSN 0100-879X
Dann, S. G., Selvaraj, A. dan Thomas, G. 2007. mTOR Complex1S6K1
Signaling: At The Crossroads Of Obesity, Diabetes and Cancer. Trends
Mol. Med. (2007) doi:10.1016/j.molmed.2007.04.002
Derdemezis, C. S., Kiortsis, D. N., Tsimihodimos, V., Petraki, M. P., Vezyraki, P.,
Elisaf, M. S., dan Tselepis, A. D. 2011. Effect of Plant Polyphenols on
Adipokine Secretion from Human SGBS Adipocytes. Biochemistry
Research International Volume 2011, Article ID 285618, 5 pages
Enns, J. E., Taylor, C. G. dan Zahradka, P. 2011. Variations in Adipokine Genes
AdipoQ, Lep, and LepR are Associated with Risk for Obesity-Related
Metabolic Disease: TheModulatory Role of Gene-Nutrient Interactions.
Journal of Obesity Volume 2011, Article ID 168659, 17 pages
doi:10.1155/2011/168659
Hoda, M. R., Theil, G., Mohammed, M., Fischer, K., dan Fornara, P. 2012. The
Adipocyte-Derived Hormone Leptin Has Proliferative Actions on
Androgen-Resistant Prostate Cancer Cells Linking Obesity to Advanced
Stages of Prostate Cancer. Journal of Oncology Volume 2012, Article
ID 280386, 8 pages
Lestari, S. R., Wulandari, N., dan Riawan, W. 2009. Uji Sitotoksisitas Ekstrak
Etanol Kulit Buah Rambutan (Nephelium lappaeceum) Sebagai
Sumber Antioksidan Antioksidan Alami. Laporan Penelitian.
Universitas Negeri Malang
Meydani, M. dan Hasan, S. T. 2010. Dietary Polyphenols dan Obesity. Nutrients
2010, 2, 737-751
Morris, D. L., dan Rui, L. 2009. Recent Advances in Understanding Leptin
Signaling and Leptin Resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab 297:
E1247E1259, 2009

Oswal, A. dan Yeo, G. 2010. Leptin and the Control of Body Weight: a Review of
Its Diverse Central Targets, Signaling Mechanisms, and Role in the
Pathogenesis of Obesity. Obesity (2010) 18, 221 229. doi: 10. 1038/
oby.2009.228
Park, T. dan Kim Y. 2011. Phytochemicals as Potential Agents for Prevention and
Treatment of Obesity and Metabolic Diseases. Anti-Obesity Drug
Discovery and Development, Volume 1 page 1-48
Rodrigues, A. L., Moura, E. G., Passos, M. C. F., Dutra, S. C. P., dan Lisboa, P. C.
Postnatal Early Overnutrition Changes the Leptin Signaling Pathway in
the HypothalamicPituitaryThyroid Axis of Young and Adult Rats.
Journal Physiol 587.11 (2009) pp 26472661
Sahu, A. 2011. Intracellular Leptin-Signaling Pathways in Hypothalamic Neurons:
The Emerging Role of Phosphatidylinositol-3 Kinase Phosphodiesterase-3B-cAMP Pathway. Neuroendocrinology
2011;93:201210
Sakurai, T., Nishioka, H., Fujii, H., Nakano, N., Kizaki, T., Radak, Z., Izawa, T.,
Haga, S., dan Ohno, H. 2008. Antioxidative Eects of a New Lychee
Fruit-Derived Polyphenol Mixture,Oligonol, Converted into a LowMolecular Form in Adipocytes. Biosci. Biotechnol. Biochem., 72 (2),
463476, 2008
Snchez, A. F., Santilln, E. M., Bautista, M., Soto, J. E., Gonzlez, A. M.,
Chirino, C. E., Montiel, I. D., Rivera, G. S., Vega, C. V., dan Gonzlez,
J. A. M. 2011. Inflammation, Oxidative Stress, and Obesity. Int. J. Mol.
Sci. 2011, 12, 3117-3132; doi:10.3390/ijms12053117
Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J. D., dan Rakariyatham, N.
2010. Identification of Major Phenolic Compounds from Nephelium
lappaceum L. and Their Antioxidant Activities. Molecules 2010, 15,
1453-1465; doi:10.3390/molecules15031453
Tortora, G. J., dan Derrickson, B. 2009. Principles of Anatomy and Physiology
12th edition. United States of America : John Willey & Sons Inc
Wellen, K. E., dan Thompson, C. B. 2010. Cellular Metabolic Stress: Considering
How Cells Respond to Nutrient Excess. Review: Molecular Cell,
October 22, 2010 2010 Elsevier Inc page 323-332