Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Scott F. Gilbert
Swarthmore College

Tradução e Revisão
Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corrêa Marques

A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento

Fibroblástico pode ser detectado pela hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que é complementar a essa mensagem. No embrião de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 é encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o cérebro posterior e o cérebro intermediário, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoço e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 é importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papéis críticos no crescimento dos membros e na padronização do desenvolvimento do cérebro. Capítulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto
Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth ® 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -5. ed. -- Ribeirão Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Título original : Developmental biology Vários tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Título. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ Índices para catálogo sitemático: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Ciências da vida 571.8 Direitos para a língua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto que se reserva a propriedade desta tradução. Proibida a reprodução dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorização da editora.

de 20-21 dias nos estágios de “pipping” (bicando a casca internamente) e pré-eclosão. Note o revestimento peridérmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradiça, como uma conseqüência da utilização de minerais pelo embrião para seu crescimento esquelético. Esse estágio desenvolvimental marca a transição do embrião em um pinto que respira ar. Capítulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)

As páginas de título
PÁGINA ESQUERDA: A expressão gênica gera limites nos discos imagi-

nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nesse estágio, a proteína Apterous (vermelho) é expressa somente nos compartimentos dorsais; a proteína Cubitus interruptus (azul) marca os compartimentos anteriores (mas não os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A coloração verde (originária da proteína Vestigial) no interior demarca o limite entre o membro livre e a articulação ligando-o à parede torácica. Capítulo 19. (Fotografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
PÁGINA DIREITA: Expressão do gene paraxis no embrião de pinto no

estágio de 6 somitos. Hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado com “digoxygenin” complementar a uma porção da mensagem paraxis do pinto mostra a expressão desse gene durante a formação do somito. A proteína Paraxis é importante no estabelecimento da estrutura desses grupos mesodérmicos. Capítulos 2 e 9. (Montagem fotográfica cortesia de R. Tuan.)

Para Daniel, Sarah, e David

Tabela de Conteúdos

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Introdução ao desenvolvimento animal 1
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estágios do desenvolvimento animal 3 Nossa herança eucariótica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6
Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária 6 Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reprodução Sexual 12

1

Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35
As origens embriológicas da teoria dos genes 35

2

Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37

A cisão entre a embriologia e a genética 38 Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Evidência para a equivalência genômica 40

39

Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação
As Volvocaceanas 16

16

Informações adicionais & Especulações
Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium 21

Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrição da Potência Nuclear 42 Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas 43

Informações adicionais & Especulações
Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro 45

Informações adicionais & Especulações
Evidência e Anticorpos 25 27

Informações adicionais & Especulações
Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima

Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Síntese diferencial de RNA 49

47

Hibridização de ácido nucléico Seqüenciamento de DNA 59

54
58

Padrões desenvolvimentais entre metazoários
Os Poríferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30

28

Clonagem de DNA genômico 55 Hibridização de DNA: entre e intra espécies

Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA 61 Técnicas de localização de RNA 63
Hibridização In Situ 63 Transferências Northern 64

Tabela dos Conteúdos

vii

Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia 66 Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos 69
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Camundongos quiméricos 70 Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) 70

Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95

Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda 97 A base molecular da afinidade célula-substrato 99
Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular 104 Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla 106

Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Uma conclusão e um alerta 75

Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79
Afinidade celular diferencial 80
O modelo termodinâmico de interações celulares

3
84

Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais 107
A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108

Informações adicionais & Especulações
Evidência para o modelo termodinâmico 87
88

Informações adicionais & Especulações
Mutações negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento 112 Interações recíprocas na superfície celular 113

A base molecular das adesões célula-célula Informações adicionais & Especulações

88

As classes de moléculas de adesão celular

Anticorpos monoclonais e genética reversa

89

Moléculas de adesão celular

92

PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Fertilização: Iniciando um novo organismo 121
Estrutura dos gametas
Espermatozóide O óvulo 125

4

Prevenção da Polispermia

140

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Metabolismo dos Gametas 147

121
121

Ativação do metabolismo do óvulo
Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fusão do material genético

149

Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância 128
Atração do Espermatozóide 128 Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar 129

152

Informações adicionais & Especulações
A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos 154

Rearranjo do citoplasma do óvulo
Preparação para a Clivagem

156
158

Informações adicionais & Especulações
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos 131
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriçosdo-Mar 132 Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos 135

Clivagem: Criando multicelularidade 167
PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA 168 Clivagem holoblástica radial 169
A holotúria, Synapta Ouriço-do-Mar 170 Anfíbios 173 169

5

Fusão de gametas e a prevenção da polispermia
Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide 139

139

Clivagem holoblástica espiral

175

viii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Adaptação pela modificação da clivagem embrionária 178 Clivagem Holoblástica Bilateral 179

Mecanismos de gastrulação em aves

238

Gastrulação em mamíferos

242

Clivagem holoblástica rotacional
Compactação 181

180

Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formação de membranas extra-embrionárias 245

Informações adicionais & Especulações
A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação 184 Formação da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelúcida 185

Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 253
FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais 254
186

7

254

Informações adicionais & Especulações
Gêmeos e células embrionárias precursoras

Clivagem Meroblástica

188

Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Informações adicionais & Especulações
Exceções, Generalizações, e Clivagem Parasítica da Vespa 195

Neurulação primária 255 A mecânica da neurulação primária 257 A formação da placa neural 257 Formação do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260

Informações adicionais & Especulações
A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264

MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem

196
197

Neurulação secundária 264 Diferenciação do tubo neural

265
265

Fator promotor de maturação

Formação das regiões do cérebro

Informações adicionais & Especulações
MPF e Seus Reguladores 198

Informações adicionais & Especulações
Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organização do cerebelo 272 Organização cerebral 274

O mecanismo citoesquelético da mitose 201 A formação de novas membranas 203

Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 209
Gastrulação em ouriço-do-mar 210

6

Tipos de neurônios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados

279

Ingresso do Mesênquima Primário 210 Primeiro estágio da invaginação do arquêntero 215 Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero 217

Dinâmica do desenvolvimento ótico 279 Diferenciação da retina neural 280

Informações adicionais & Especulações
Porque os bebês não enxergam bem Diferenciação do cristalino e da córnea 282 283

Gastrulação em peixes

218

A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular 218 Formação das camadas germinais 220

A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados A crista neural do tronco 285

284

Gastrulação de anfíbios

221

Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios 221 Posicionando o blastóporo 224 Movimentos celulares e a construção do arquêntero 226 Migração do mesoderma involutivo 229

Vias de migração das células da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migração da crista neural do tronco 287

Informações adicionais & Especulações
Análise das mutações que afetam o desenvolvimento das células da crista neural 290

Informações adicionais & Especulações
Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica 230 Epibolia do ectoderma 232

A potência do desenvolvimento das células da crista neural do tronco 291
Diferenciação final das células da crista neural 292

A crista neural cefálica

293

Gastrulação em aves

233
233

Generalidades sobre gastrulação em aves

Vias migratórias das células da crista neural cefálica 293 Potência de desenvolvimento das células da crista neural cefálica 295

Tabela dos Conteúdos

ix

A crista neural cardíaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS
A origem das células epidérmicas Apêndices cutâneos 299 297

297

Conclusões

300

Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

9

Especificidade axônica 307
A geração da diversidade neuronial 307
Especificação do Neurônio Motor de Vertebrado Especificação dos Neurônios Motores em Drosophila 310

8
308

MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos 341
Mesoderma Paraxial 341 Somitômeros e a Iniciação da Formação do Somito 343 Geração de Tipos de Células Somíticas 344 Miogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético 347

Formação de padrões no sistema nervoso 312 Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz extracelular 313
Orientação pelo Terreno Físico: Orientação por Contato 313 Orientação para Gradientes de Adesão: Haptotaxia 314 Condução por Sinais Migratórios específicos do Axônio: A Hipótese das Trajetórias Marcadas 315 Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Crescimento 317

Informações adicionais & Especulações
Construção Muscular e a Família MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos 351

Informações adicionais & Especulações
Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento 357

Mesoderma da Placa Lateral

358

Informações adicionais & Especulações
Sexo,Odor e Adesão Específica 319

Seleção de trajetória: Orientação por moléculas difusíveis 320 Sinais para condução múltipla 323
Neurônios Motores Vertebrados Axônios da Retina 325 323

Formação das Membranas Extra-Embrionárias 359 O Coração 361 Formação dos vasos sangüíneos

366

Informações adicionais & Especulações
Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no Mamífero Recém-nascido 372

O Desenvolvimento de células sangüíneas

373

Seleções de alvos

326

Especificidades Adesivas em Diferentes Regiões do Tectum 328

Seleção de endereço: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivência diferencial após a inervação: Fatores neurotróficos 331 Informações adicionais & Especulações
Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos 334

O Conceito de Célula-tronco 373 Células-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoéticos 374 Desenvolvimento Osteoclástico 377 Locais de Hematopoiese 378

ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados

382
382

O desenvolvimento de comportamentos: constância e plasticidade 334

Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar O Tubo Respiratório 383

x

Tabela dos Conteúdos

PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular
Regulação transcricional da expressão gênica: Fatores de transcrição e a ativação de promotores específicos 391
Éxons e Íntrons 392 Estrutura e função do promotor
Estrutura do promotor 396 Função do promotor 397

10

Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel da competição de histonas 437

Regiões de controle de loco: transcrição do gene da globina 437 Informações adicionais & Especulações
Trocas no gene de globina 440

394

Metilação de DNA e atividade gênica

442

Informações adicionais & Especulações
RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399

Correlações entre metilação do promotor e inatividade gênica 442 Metilação e a manutenção dos padrões de transcrição 443

Estrutura e função dos intensificadores

402

Informações adicionais & Especulações
Metilação e impressão gênica 444

Necessidade de intensificadores 402 Função do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrição 403

Fatores de transcrição: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404
Proteínas de homeodomínio 405 Os fatores de transcrição POU 406

Compensação de dosagem do cromossomo X de mamíferos 446 Informações adicionais & Especulações
O mecanismo de inativação do cromossomo X 449

Associação do DNA ativo com a matriz nuclear

451

Informações adicionais & Especulações
Regulação da transcrição dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alçahélice 415

Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrição gênica 453 Isoladores e domínios 454 Resumo 455

Informações adicionais & Especulações
Regulando as proteínas bHLH miogênicas: Governando a troca entre proliferação e diferenciação de células musculares 416 Fatores de transcrição do zíper básico da leucina 416

Controle do desenvolvimento pelo processamento e tradução diferencial do RNA 461

12

Informações adicionais & Especulações
Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrição Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormônios e Seus Elementos Responsivos a Hormônios 420

CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleção de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando proteínas alternativas a partir do mesmo gene 466
Um gene, Muitas Proteínas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinação Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expressão Gênica 471

Proteínas que dobram o DNA 423 Ativação dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulação da atividade do fator de transcrição 425

Regulação transcricional da expressão gênica: A ativação da cromatina 431
Acessibilidade a fatores trans-reguladores Sítios hipersensíveis à DNAase I 434

11
431
432

Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida

REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da tradução eucariótica 472 Controle da síntese protéica pela longevidade diferencial do mRNA 474
Degradação Seletiva de mRNAs 475

Controle da tradução de mensagens do oócito

476

Tabela dos Conteúdos

xi

Caracterização de RNAs Mensageiros Armazenados em Oócitos 477

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Genoma Embrionário 488

Informações adicionais & Especulações
Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Oócito 480

Regulação dos genes da tradução em larvas e adultos 490
Determinação de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 “Disjuntores” do Controle da Tradução 492 Editoração do RNA 493

Mecanismos para a regulação da tradução das mensagens dos oócitos 481
A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hipótese da Cauda Poli(A) 483 A Hipótese da Eficiência da Tradução 486 Outros sistemas de ativação do mRNA: Mensagens sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas 486

Controle da tradução e síntese protéica coordenada: Produção de Hemoglobina 494 Epílogo: Regulação Pós-tradução 497

PARTE IV Especificação do Destino Celular e os
Eixos Embrionários
Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos 505
Comprometimento celular e diferenciação Pré-formação e epigênese 507
Os Teratologistas Franceses 509

13
510

A genética da especificação axial em Drosophila 543

14

505

Especificações autônomas em embriões de tunicados

Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR 545 Visão Panorâmica 545 Os genes de efeito materno 546
Evidência Embriológica da Regulação da Polaridade pelo Citoplasma do Oócito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no Embrião Precoce 547

O determinante formador de músculos do crescente amarelo 511 Especificação citoplasmática das linhagens endodérmicas e epidérmicas e o eixo ânteroposterior 514

Informações adicionais & Especulações
Modelos de Gradientes da Informação Posicional 551 Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid Constitui o Centro de Organização Anterior 552 O Centro de Organização Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557

Localização citoplasmática em embriões de moluscos 515
O lóbulo polar 517

Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis elegans 521
Controle maternal da identidade do blastômero: O controle genético das células progenitoras faríngeas de C. elegans 524 Regulação em C. elegans 527

Os genes da segmentação

559

Informações adicionais & Especulações
“Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo” 529

Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento tardio 530 Localização citoplasmática de determinantes de células germinativas 531
Determinação de células germinativas em nematódeos 531 Determinação da célula germinativa em insetos Componentes do plasma polar da Drosophila Determinação de células germinativas em anfíbios 536

Uma Visão Panorâmica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar

565

Os genes de Seleção homeótica

569

532 534

Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos 569 Iniciando os Padrões da Expressão dos genes Homeóticos 572 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes Homeóticos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574

Resumo

538

xii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Regulação Molecular do Desenvolvimento: As Proteínas do Homeodomínio 576

Indução de especificidade mesodérmica ventral e lateral 612

A criação da atividade do organizador

613
613

A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A proteína Dorsal: Morfógeno para a polaridade dorsoventral 577
Translocação da Proteína Dorsal 577

Proteínas secretadas do organizador

Informações adicionais & Especulações
BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrição induzidos no organizador 619

Provendo o sinal assimétrico para a translocação da proteína Dorsal 578
Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Foliculares 578 Sinalização das Células Foliculares para o Citoplasma do Oócito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Dorsal 581

Informações adicionais & Especulações
Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621

A especificidade regional de indução

621
621

A determinação das diferenças regionais O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalização neural 624

PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificação dos primórdios dos órgãos 585 Resumo: Alguns princípios do desenvolvimento da Drosophila 586

Informações adicionais & Especulações
Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificação neural 628

Competência e cascatas indutivas 628

Especificação do destino celular por interações célula-célula progressivas 591
Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592

15

Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635
Iniciando o eixo ântero-posterior 635

16

August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos 597 Formação de um organismo integrado: Restringindo a potência das células vizinhas 598

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expressão Gênica em Tecidos Organizadores 636

Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero: A hipótese do código Hox 637
Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos entre Drosophila e Mamíferos 637 Expressão de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Análise Experimental de um Código Hox: Gene Alvo 640 Transformação Parcial de Segmentos por Eliminação de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Análise Experimental do Código Hox: Teratogênese do Ácido Retinóico 643 Evidência para um Código Hox da Anatomia Comparada 645

Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios

600

Hans Spemann: Determinação progressiva das células embrionárias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução embrionária primária 603

O centro de Nieuwkoop

606

A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodérmica 606 A especificação da polaridade dorsoventral na fertilização 607

Informações adicionais & Especulações
Animais como Variações sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646

A base molecular da indução mesodérmica

609

Estabelecendo a regionalização dorsal: o possível papel da β-catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funções para Vg1 e Noggin 610

Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e aves 647

Tabela dos Conteúdos

xiii

PARTE V Interações Celulares Durante a
Formação do Órgão
Interações proximais de tecidos: Indução secundária 655
Interações instrutivas e permissivas Competência e receptores 656 Fatores parácrinos 657 655

17
658

de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Indução da crista ectodérmica apical 704

Produção do eixo próximo-distal dos membros

706

Os Fatores de Crescimento Fibroblástico A família hedgehog 659 A família Wnt 660 A superfamília TGF-ß 661 Sinalização Justácrina 662

A crista ectodérmica apical: O componente ectodérmico 706 A zona progressiva: O componente mesodérmico 708 Genes Hox e a especificação do eixo próximodistal do membro 709 Interações entre a AER e a zona progressiva 711 Mutações nas interações entre a zona progressiva e a AER 711

Interações epitélio-mesênquima

663
663 666 667 668

Informações adicionais & Especulações
A regeneração dos membros da salamandra e a retenção do eixo próximo-distal 714

Especificidade Regional da Indução Especificidade Genética da Indução

Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino 667
Os Fenômenos da Indução do Cristalino A Base Celular da Indução do Cristalino Formação da Córnea 672

Especificação do eixo ântero-posterior dos membros 716
A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interações entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padrão 718 Especificando a ZPA 721

Formação de órgãos parenquimatosos 672
Morfogênese do Rim de Mamífero 673 Os Mecanismos da Organogênese Renal 676

Informações adicionais & Especulações
Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Dente 682

A produção do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informações adicionais & Especulações
Lições de limbless 724

Mecanismos de ramificação na formação de órgãos parenquimatosos 683
A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico na Ramificação 684 Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de Ramificação 686

Morte celular e a formação de dígitos 724 Informações adicionais & Especulações
Evolução do membro tetrápode 726

Indução ao nível de uma única célula

687

Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis elegans 690

Interações celulares à distância: Hormônios como mediadores do desenvolvimento 733
Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfíbia 734

19

Informações adicionais & Especulações
Interações Célula-Célula e Possibilidade na Determinação de Tipos Celulares 692

Desenvolvimento do membro de tetrápode 701
Padronização no membro 701 Formação do broto do membro 702

18

Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735 Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide Durante a Metamorfose 740

Informações adicionais & Especulações
Heterocronia 743

Metamorfose em insetos

746
746

O campo do membro 702 Especificação dos campos do membro: Genes Hox e ácido retinóico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores

Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais

Informações adicionais & Especulações
A determinação dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelação do sistema nervoso 753

xiv

Tabela dos Conteúdos

Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos
A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757

754

Hermafroditismo

795
795

Hermafroditismo no Nematóide C. elegans Hermafroditismo em Peixes 797

Informações adicionais & Especulações
Controle ambiental sobre a forma e a função da larva 761

Determinação ambiental do sexo

798

Interações hormonais múltiplas no desenvolvimento da glândula mamária 762
Estágio embrionário Adolescência 765 Gravidez e lactação 762 765

Determinação Sexual Dependente de Temperatura em Reptéis 798 Determinação Sexual Dependente da Localização em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799

Resumo

800

Determinação do sexo 773
Determinação Sexual Primária 774 Determinação Secundária do Sexo 774 As Gônadas em Desenvolvimento 775

20

Regulação ambiental do desenvolvimento animal 805

21
806

Determinação cromossômica do sexo em mamíferos 774

REGULAÇÃO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Sugestões ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806
A colonização larval 806 Refeições de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento

Determinação sexual primária dos mamíferos: Genes cromossômicos Y para a determinação dos testículos 777
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778

808

Diferenças ambientais previsíveis como sugestões para o desenvolvimento 810
Sazonalidade e sexo: Afídios e Volvox Diapausa 812 810

Determinação sexual primária em mamíferos: Genes autossômicos na determinação de testículos 780
SOX9: Reversão Autossômica na Displasia Campomélica 780 SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias Desenvolvimentais Masculinas 780

Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de reação 813
Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinação sexual dependente do ambiente

Determinação sexual primária em mamíferos: Desenvolvimento ovariano 781
DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovário em um Autossomo 781

817

Fatores ambientais imprevisíveis controlando o desenvolvimento animal 818
Defesas induzíveis contra a predação 819 Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente 820

Informações adicionais & Especulações
Assimilação Genética 821

Determinação sexual secundária em mamíferos
Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormônio Anti-Mülleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785

782
782

A contínua plasticidade do desenvolvimento

822

O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao ambiente 823

Informações adicionais & Especulações
O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787

DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformações e distúrbios 827 Agentes teratogênicos 828
Ácido retinóico como um teratogênico 829 Talidomida como um teratogênico 830 Álcool como um teratogênico 833 Outros agentes teratogênicos 835

827

Determinação sexual cromossômica em Drosophila 788
A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Pivô para a Determinação do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinação Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinação Sexual 794

Informações adicionais & Especulações
Estrógenos Ambientais 836

Interações genética-ambiental Resumo 837

837

Tabela dos Conteúdos

xv

A saga da linhagem germinativa 843
Migração das células germinativas 843
Migração das Células Germinativas em Anfíbios 843 Migração das Células Germinativas em Mamíferos 844

22

Mecanismos desenvolvimentais da mudança evolucionária 883
“Unidade de Tipo” e “Condições de Existência”
A Síntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885

23
883

A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885
A emergência dos embriões 885 Formação de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887

Informações adicionais & Especulações
Teratocarcinomas e Células-Tronco Embrionárias 847 Migração de Células Germinativas em Aves e Répteis 848 Migração de Células Germinativas Primordiais em Drosophila 849

Modularidade: O pré-requisito para mudança evolutiva através do desenvolvimento 891
Modularidade 891 Dissociação: Heterocronia e Alometria Duplicação e Divergência 893 Co-opção 894 Progressão correlacionada 896 891

Meiose 850 Informações adicionais & Especulações
Grandes Decisões: Mitose ou Meiose? Espermatozóide ou Óvulo? 853

Restrições ao desenvolvimento

898

Espermatogênese

855
857

Espermiogênese

Informações adicionais & Especulações
Expressão Gênica Durante o Desenvolvimento do Espermatozóide 858

Restrições Físicas 898 Restrições Morfogenéticas 898 Restrições Filéticas 899 Evolução Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901

Oogênese

860

Meiose oogênica 860 Maturação do Oócito em Anfibios 861 Conclusão da meiose: Progesterona e Fecundação 864 Transcrição Gênica em Oócitos 865 Oogênese Meroística em Insetos 867

O mecanismo genético do desenvolvimento da mudança evolucionária: Genes reguladores homólogos 902
Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfogênese dos Membros 904 Genes Hox e a Evolução dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes 907 Caminhos homólogos do desenvolvimento 909

Informações adicionais & Especulações
A Origem dos Eixos Embrionários de Drosophila Durante a Oogênese 869 Oogênese em Mamíferos 870

Criando novos tipos de células: O mistério evolucionário básico 911 Uma nova síntese evolucionária 912

Informações adicionais & Especulações
O Reinício da Meiose nos Oócitos de Mamíferos 875

Fontes Para as Citações das Aberturas dos Capítulos C-1 Índice de Autores IA-1 Índice de Assuntos IA-2 Índice de Abreviaturas IA-3

Prefácio

O

s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvimento retornando à posição que ela ocupou no início do século: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evolução e fisiologia. Em 1896, a primeira edição de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou “a verdade maravilhosa que uma única célula pode conter em seu interior sua extensão microscópica da soma-total da herança das espécies.” Hoje, a biologia do desenvolvimento está na vanguarda desse estudo de nossa herança natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a química física na sua investigação dos mecanismos bioquímicos pelos quais proteínas diferentes são produzidas em células diferentes do mesmo genoma. Ela também está na liderança dos estudos evolucionários que procuram entender como mudanças macroevolucionárias ocorreram. Ela abriu recentemente uma área nova da biologia do desenvolvimento ecológico, onde mudanças ambientais são vistas criando alterações no desenvolvimento do organismo. Durante os últimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento também expandiu para a medicina, fundindo-se com a genética clínica para criar uma ciência revitalizada da embriologia humana, uma ciência que já se tornou importante na explanação das malformações congênitas. A quinta edição do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revoluções que estão acontecendo. Aconteceram quatro mudanças importantes na estrutura do livro desde sua última edição. Primeiro, tornou-se impossível discutir os princípios fundamentais da embriologia sem o conhecimento da atividade gênica ou vias da transdução de sinais. Portanto, essa informação foi trazida dentro da seção introdutória do livro de modo que interações celulares, tais como fertilização e indução, podem ser apreciadas tanto no âmbito molecular quanto no morfológico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo capítulo. O Capítulo 21, “Regulação Ambiental do Desenvolvimento Animal,” diz respeito às vias pelas quais o meio ambiente afeta o fenótipo do organismo. Interesse na proteção ambiental e em controvérsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratogênicos forçaram uma nova percepção das influências que o meio ambiente representa no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se à frente dos movimentos da conservação ecológica. As primeiras quatro edições deste livro buscaram integrar abordagens molecular, celular e orgânica à biologia do desenvolvimento; esta edição adiciona a dimensão ecológica. Terceiro, esta edição introduz novas ênfases nos papéis dos fatores parácrinos no desenvolvimento. Não somente os estudos da transdução de sinais estão colocados na seção introdutória deste livro, como a Parte V

Prefácio

xvii

da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de crescimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciação. Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e professores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica sobre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desenvolvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o campo, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de crescimento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado também a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presença de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pessoas para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia constituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mesmo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação amplamente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desenvolvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nível de organização, de moléculas a filos. À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentativa para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capítulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão.

Como usar o website
Qualquer pessoa pode entrar no website através de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou através da sua lista de arquivos de capítulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, nós colocamos acessos específicos endereçados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publicação. Todos esses endereços começam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e são seguidos por um código dado no livro texto. Assim, a localização especificada na página 20 do livro é: http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do capítulo. Em adição, clicando no botão “Outros Arquivos” abaixo de cada capítulo, as conexões para outros websites serão facilitadas. Divirta-se.

xviii

Prefácio

Agradecimentos
Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam papéis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escrevendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enorme ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. CebraThomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. BronnerFraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu excelente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biologia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filosofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas construtivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraordinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente reconhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de minha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prático da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês.

SCOTT F. GILBERT 1 DE MARÇO DE 1997

Introdução à Biologia do Desenvolvimento
1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 35 79 2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 3 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial

I

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

1

Introdução ao desenvolvimento animal

1

A natureza parece nunca mudar, ainda que sua aparência esteja sempre mudando. É nosso dever como artistas transmitir juntamente com todos os seus elementos a emoção dessa permanente transformação. Paul Cezanne (ca. 1900) Feliz é a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. Virgílio (37 A.C.)

O

CONCEITO DE EMBRIÃO é assombroso, e a formação de um embrião é a

tarefa mais árdua que alguém haverá de realizar. Para se tornar um embrião, você teve que construir a si mesmo a partir de uma única célula. Teve que respirar antes que tivesse pulmões, digerir alimentos antes que seus órgãos estivessem formados, construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurônios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. Uma diferença marcante entre você e a máquina é que a máquina nunca é requisitada para uma função antes que esteja terminada. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constrói.

O objetivo da biologia do desenvolvimento
Para plantas e animais, o único caminho para o desenvolvimento a partir de uma célula, é desenvolvendo um embrião. O embrião é o intermediário entre o genótipo e o fenótipo, ou seja, entre os genes herdados e o organismo adulto. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e função, a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estágios mais transitórios. Biologia do desenvolvimento é a ciência do vir a ser, a ciência do processo. Dizer que um inseto efêmero vive apenas um dia não significa nada para um biologista do desenvolvimento, porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia, mas passou outros 364 dias como um embrião e larva. As questões levantadas por um biologista do desenvolvimento são freqüentemente questões mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. Dizer que mamíferos XX são geralmente fêmeas e mamíferos XY são geralmente machos, não explica a determinação sexual para um biologista do desenvolvimento. Esse quer saber como o genótipo XX produz um ser feminino e como o genótipo XY produz um ser masculino. Da mesma maneira, um geneticista gostaria de saber como os genes globina são transmitidos de uma geração à outra, e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a função da globina no corpo. Porém, o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemácias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda não sabemos as respostas). Biologia do desenvolvimento é uma ciência excelente para pessoas que querem integrar diferentes níveis da biologia. Diante de um problema, podemos estudá-lo a 1

2

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

níveis molecular e químico (p. ex., Como os genes globina são transcritos, e como os fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?), a níveis celular e tissular (p. ex., Quais são as células capazes de produzir globina, e como o mRNA da globina deixa o núcleo?), a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. ex., Como vasos capilares são formados em cada tecido, e como são instruídos a se conectarem e ramificarem?) e, até mesmo, a níveis ecológicos e evolucionários (p. ex., Como diferenças na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto, e como fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Biologistas do desenvolvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula. Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoção vem dos assuntos estudados, porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biologia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. A biologia do desenvolvimento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia celular, anatomia, pesquisa do câncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia evolucionária. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão de qualquer área da biologia.

Os problemas da biologia do desenvolvimento
O desenvolvimento é realizado por duas funções principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada geração, o que assegura a continuidade da vida que passa de uma geração à outra. Assim, existem duas questões fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto, e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espécie tem suas próprias respostas, mas algumas generalizações podem ser feitas. Tradicionalmente, essas questões têm sido subdivididas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: • O problema da diferenciação. Uma única célula, o ovo fertilizado, se desenvolve e gera centenas de células de diferentes tipos - células musculares, células epidérmicas, neurônios, linfócitos, células do sangue, células gordurosas, e assim por diante. Essa geração de diversidade celular é chamada diferenciação. Desde que cada célula do corpo contém o mesmo conjunto de genes, precisamos entender como esse mesmo conjunto de instruções genéticas pode produzir diferentes tipos de células. • O problema da morfogênese. Nossas células diferenciadas não são distribuídas aleatoriamente; pelo contrário, são organizadas em intrincados tecidos e órgãos. Esses órgãos estão dispostos de tal maneira que: dedos estão nas pontas e não no meio de nossas mãos, os olhos estão na nossa cabeça e não nos pés ou intestinos. Essa criação de forma ordenada, é chamada morfogênese. Como as células se auto-organizam e formam um arranjo correto? • O problema do crescimento. Somos maiores do que um ovo, mas como as células sabem quando devem parar de se dividir? Se cada célula de nossa face realizasse mais uma divisão celular, seríamos considerados horrivelmente mal formados. Se cada célula de nossos braços tivesse realizado apenas mais uma série de divisões, poderíamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. • O problema da reprodução. O espermatozóide e o óvulo são células muito especializadas. Somente eles podem transmitir instruções para produzir um organismo de uma geração para outra. Como essas células são separadas para formar a próxima geração, e quais as informações no núcleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente, tem-se dado grande ênfase a um quinto problema: • O problema da evolução. A evolução envolve mudanças herdadas durante o desenvolvimento. Quando dizemos que o cavalo de um dedo só de hoje, teve um ancestral de cinco dedos, estamos dizendo que mudanças no desenvolvi-

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

3

mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de embriões nos ancestrais do cavalo. Como mudanças no desenvolvimento criam novas formas de corpo? Quais modificações hereditárias são possíveis, dadas as restrições impostas pela necessidade do organismo sobreviver enquanto se desenvolve?

Os estágios do desenvolvimento animal
De acordo com Aristóteles, o primeiro grande embriologista da história, a ciência começa com a curiosidade: “é graças a curiosidade que as pessoas começaram a filosofar, e a curiosidade permanece desde o início do conhecimento.” O desenvolvimento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admiração através da história da humanidade. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu período de incubação de três semanas proporciona uma notável experiência quando se observa desde uma fina camada de células até o total desenvolvimento da ave. Aristóteles realizou esse procedimento e observou a formação dos principais órgãos. Qualquer um pode se admirar com esse fenômeno, ainda que ordinário, mas cientistas são os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. E ainda mais do que dissipar essa admiração, novo conhecimento só faz aumentá-la. Organismos pluricelulares não se formam de imediato, ao contrário, são formados por um processo relativamente lento de mudança progressiva, o qual chamamos de desenvolvimento. Em quase todos os casos, o desenvolvimento de um organismo pluricelular começa com uma única célula - ovo fertilizado ou zigoto, que dividido através da mitose, produz todas as células do corpo. O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia, se referindo ao fato de que entre a fertilização e o nascimento, o organismo em desenvolvimento é conhecido como embrião. Mas o desenvolvimento não cessa no nascimento, ou mesmo na vida adulta, porque a maioria dos organismos nunca pára de se desenvolver. A cada dia nós repomos mais de um grama de células de pele (fazendo com que as células mais velhas se desprendam assim que nos movemos), e nossa medula óssea sustenta o desenvolvimento de milhões de novos eritrócitos a cada minuto de nossas vidas. Portanto, nos últimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento, como a disciplina que estuda processos embrionários e outros do desenvolvimento. As principais características do desenvolvimento animal estão ilustrados na Figura 1.1. A vida de um novo indivíduo é iniciada pela fusão do material genético de dois gametas, o espermatozóide e o óvulo. Essa fusão, chamada fertilização, estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. Os estágios subseqüentes do desenvolvimento são coletivamente chamados de embriogênese. Por todo reino animal existe uma incrível variedade de tipos embrionários, mas a maioria dos padrões de embriogênese compreende variações em quatro temas: 1. Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Clivagem é uma série de divisões mitóticas extremamente rápidas, onde o enorme volume citoplasmático do zigoto é dividido em numerosas células menores. Essas células são chamadas blastômeros e, ao fim da clivagem, eles geralmente formam uma esfera conhecida como blástula. 2. Após a redução na taxa de divisão mitótica, os blastômeros passam por mudanças dramáticas quanto às suas posições, um em relação ao outro. Essa série de redistribuição de células é chamada de gastrulação. Como resultado da gastrulação, o embrião típico contém três regiões celulares chamadas camadas germinativas*. O ectoderma, a camada exterior, produz as células da epiderme e do sistema nervoso; o endoderma, camada interior, produz o
*Do Latim germen, significa “broto” ou “rebento” (a mesma raiz da palavra germinação). Os nomes das três camadas germinativas são do Grego: ectoderma de ektos (“fora”) mais derma (“pele”); mesoderma de mesos (“meio”) e endoderma de endon (“dentro”).

4

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Espermatozóide Mórula Blástula Oócito Célula germinativa (“Germ plasm”) Oócito (gameta feminino) GAMETOGÊNESE Adulto sexualmente maduro Blastóporo Gônada Ectoderma Mesoderma Estágios larvais imaturos Endoderma Local das células embrionárias Blastocele

Espermatozóide (gameta masculino)

INCUBAÇÃO (NASCIMENTO)

Figura 1.1

Histórico do desenvolvimento de um representante animal, um sapo. Estágios que vão da fertilização até o nascimento são coletivamente conhecidos como embriogênese. As regiões responsáveis por produzir células embrionárias são mostradas em cores. Gametogênese, que é completa no adulto sexualmente maduro, começa em épocas diferentes, dependendo da espécie.

revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas, fígado, pulmões, etc.); e o mesoderma, camada do meio, dá origem a diversos órgãos (coração, rins, gônadas), tecidos conjuntivos (ossos, músculos, tendões, vasos sangüíneos) e células sangüíneas. 3. Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas, as células interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos. Esse processo é chamado organogênese. (Nos vertebrados, a organogênese é iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodérmicas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originará o cérebro e a coluna vertebral). Muitos órgãos contêm células de mais de uma camada embrionária, e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra. Também durante a organogênese,

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

5

algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua localização final. Essas células migrantes incluem os precursores das células sangüíneas, células linfáticas, células pigmentadas e gametas. A maior parte dos ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente da região dorsal da nossa cabeça. 4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espécies, uma parte especializada do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas. Essas células são chamadas de células germinativas, sendo destinadas à função reprodutiva. Todas as outras células do corpo são chamadas células somáticas. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que ocorrem durante o desenvolvimento animal. As células germinativas finalmente migram para as gônadas, onde se diferenciam em gametas. O desenvolvimento de gametas, chamado de gametogênese, normalmente não é completado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na maturidade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando início a um novo embrião. O organismo adulto finalmente sofre envelhecimento e morre.

Nossa herança eucariótica
Os organismos estão divididos em dois grupos principais, dependendo apenas se as células possuem um envoltório nuclear ou não. Os procariotos (do grego karion, significa “núcleo”), onde estão incluídas as arqueobactérias e as eubactérias, não possuem um núcleo verdadeiro. Os eucariotos que incluem os protistas, animais, plantas e fungos, possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. Essa diferença fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material genético. Em ambos os grupos, a informação herdada necessária para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequências de ácido desoxirribonucléico (DNA) dos cromossomos. Os cromossomos procarióticos normalmente são hélices duplas de DNA, pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milhão de pares de bases. As células eucarióticas geralmente possuem diversos cromossomos, e um simples protista eucariótico possui 10 vezes, ou mais, a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Além disso, a estrutura de um gene eucariótico é mais complexa do que a de um gene procariótico. A seqüência de aminoácidos de uma proteína procariótica é a reflexão direta da seqüência de DNA do cromossomo. O DNA de um gene eucariótico que codifica uma proteína, geralmente, é dividido de tal forma que a seqüência completa de aminoácidos da proteína é derivada de segmentos descontínuos de DNA (Figura 1.2). O DNA entre os segmentos freqüentemente contém seqüências que estão envolvidas na regulação do momento e lugar em que o gene é ativado. Cromossomos eucarióticos também são muito diferentes dos cromossomos procarióticos. O DNA eucariótico reveste complexos protéicos específicos, chamados nucleossomos, compostos por proteínas histonas. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e são importantes na designação de qual gene irá se expressar em qual célula. Nas bactérias não existem histonas. Mais ainda, células eucarióticas sofrem mitose, na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados são igualmente divididos entre as células filhas (Figura 1.3). Nos procariotos, a divisão celular não é mitótica; não se desenvolve o fuso mitótico e, também, não existe tegumento celular para se partir. Ao invés disso, os cromossomos filhos permanecem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. Esses pontos de ligação são separados entre si pelo crescimento da membrana celular, e finalmente colocam os cromossomos em diferentes células filhas.

6

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.2

(A) CÉLULA PROCARIÓTICA

(B) CÉLULA EUCARIÓTICA Envoltório nuclear

Resumo dos passos pelos quais as proteínas são sintetizadas a partir do DNA. (A) Expressão procariótica (bacteriana) do gene. Regiões codificadoras do DNA são colineares com o produto protéico. (B) Expressão de genes eucarióticos. Os genes são descontínuos e um envoltório nuclear separa o DNA do citoplasma.

Gene DNA Éxon 1

Íntron 1 Éxon 2

Íntron 2 Éxon 3 Núcleo

Transcrição Transcrição RNA nuclear

mRNA Tradução Citoplasma mRNA

Processamento de RNA mRNA Tradução mRNA

Proteína

Proteína

Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene. Em ambos, o DNA é transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. Quando o RNA mensageiro (mRNA) é produzido nos procariotos, ele é imediatamente traduzido em uma proteína enquanto o seu outro terminal está sendo transcrito do DNA (Figura 1.4). Sendo assim, nos procariotos, transcrição e tradução são eventos simultâneos e coordenados. Mas a existência de envoltório nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulação celular totalmente novo. Os ribossomos, que são responsáveis pela tradução, estão de um lado do envoltório nuclear, e o DNA e a RNA polimerase necessária para a transcrição estão do outro. Entre a transcrição e a tradução, o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar através do envoltório nuclear. A regulação pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma, torna a célula capaz de selecionar quais das mensagens recém-sintetizadas serão traduzidas. Assim, um novo nível de complexidade foi adicionado, que é extremamente importante para o organismo em desenvolvimento.

Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares
Todos os organismos eucarióticos pluricelulares se desenvolveram de protistas unicelulares. É nesses protistas que as características básicas do desenvolvimento apareceram primeiro. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfogênese direcionada pelo núcleo, o uso da superfície da célula para mediar cooperação entre células individuais e as primeiras ocorrências de reprodução sexual. Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária Há um século, ainda não havia sido provado se o núcleo continha alguma informação hereditária ou de desenvolvimento. Algumas das melhores evidências para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaços

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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Prófase: O envoltório nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centríolos.

Interfase: DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. Cromatídeos do cromossomo Cromatina Nucléolo Região do centrômero Fuso em desenvolvimento Centríolos Áster Envoltório nuclear Nucléolo Envoltório nuclear rompe

Prometáfase: Os cromossomos se ligam às fibras dos fusos.

Núcleo

Cromossomos filhos Metáfase: Os cromossomos se alinham no equador da célula. Telófase: Os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Anáfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatídeos) são separados.

Figura 1.3

nucleados e anucleados (revisão por Wilson, 1986). Quando vários protistas foram fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que continham núcleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1.5) O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Essa enorme célula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo, o pedúnculo e o rizóide (Figura 1.6A). O rizóide está localizado na base da célula onde essa é presa ao substrato. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. O tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores

Diagrama de mitose em células animais. Durante a interfase o DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. Durante a prófase, o envoltório nuclear quebra e forma-se um fuso entre os dois centríolos. Na metáfase, os cromosssomos se alinham no equador da célula e se inicia a anáfase, os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo é um cromatídeo) são separados. Na telófase os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Cada pólo contém o mesmo número e tipos de cromossomos que continha a célula antes da divisão.

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

DNA

Ribossomos

RNA

Figura 1.4

Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Uma porção de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. Transcrições de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando proteínas (que não podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da esquerda para a direita, indicando a direção da transcrição. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.)

removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro, de outra célula. Nos anos 30, J. Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos entre duas espécies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como é mostrado na fotografia, essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferentes. Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era transplantado para o pedúnculo de outra, o novo disco em formação finalmente assumia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1.6B). Assim, foi considerado que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária. A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo, envolvendo a síntese de um grande número de proteínas, que devem ser acumuladas em certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da espécie. O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco reprodutivo espécie-específico, mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada. Além disso, se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se formará semanas depois, ainda que o organismo irá morrer. Esses estudos sugerem que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto é, contém informação genética que especifica as proteínas necessárias para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. A informação no citoplasma não será usada por várias semanas.
Fragmento anucleado morre Corte Núcleo Fragmento nucleado se regenera

Corte

Figura 1.5

Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por algum tempo, mas finalmente morrem.

Fragmento anucleado morre

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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(B) Disco reprodutivo

(A) Disco reprodutivo

Pedúnculo A. crenulata Pedúnculo A. mediterranea Núcleos transplantados

Núcleo

Núcleo

Rizóide Rizóide 1 cm Rizóide 1 cm A estrutura do disco reprodutivo é a do núcleo doador

Figura 1.6

(A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A. crenulata (direita). Cada unidade é uma célula singular. O rizóide contém o núcleo. (B) Efeitos da troca de núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Núcleos foram transplantados para fragmentos de rizóides anucleados. Estruturas de A. crenulata estão sombreadas; estruturas de A. mediterranea não estão sombreadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)

Uma hipótese atual, proposta para explicar essas observações, é que o núcleo sintetiza um mRNA estável, posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do disco reprodutivo. Essa hipótese é amparada por uma observação publicada por Hämmerling em 1934. Hämmerling fracionou uma Acetabulária jovem em diversas partes (Figura 1.7). A porção com o núcleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma forma o fez a extremidade apical do pedúnculo. No entanto, a parte intermediária do pedúnculo não formou o disco reprodutivo. Por isso, Hämmerling postulou (aproximadamente 30 anos antes de sabermos da existência do mRNA), que as instruções para a formação do disco reprodutivo se originavam no núcleo, sendo de alguma forma guardadas dormentes próximo à extremidade do pedúnculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa região. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formação do disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce a Acetabulária. Em células anucleadas, esse efeito é permanente; uma vez que o RNA é destruído, não pode mais haver a formação do disco reprodutivo. Em células nucleadas, no entanto, um novo disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease, presumivelmente porque um novo mRNA é então produzido pelo núcleo. Garcia e Dazy (1986) também demonstraram que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária. Fica claro pela discussão anterior, que a transcrição nuclear tem um papel importante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. Mas deve ser notado que o

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Disco reprodutivo e pedúnculo regenerados Extremidade apical do pedúnculo

Porção central do pedúnculo

Sem regeneração

Rizóide e núcleo

Regeneração total

Figura 1.7

Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea

citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. O mRNA não é traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma. Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Portanto, a expressão do disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. Nesse organismo unicelular, o “desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução. Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria Um dos casos mais marcantes de “diferenciação” em protistas, é aquele de Naegleria gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma, de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). Durante a maior parte do seu ciclo de vida, a N. gruberi é uma ameba típica, alimentando-se de bactérias do solo e dividindo-se por cisão. No entanto, quando as bactérias são diluídas (tanto pela água da chuva quanto pela água nos experimentos), cada N. gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinâmica e dois longos flagelos anteriores, que são usados para encontrar regiões mais abundantes em bactérias. Nessas condições, ao invés de existirem diversos tipos de células diferenciadas em um único organismo, essa célula única tem estruturas celular e bioquímica diferentes nos diferentes estágios de sua vida. Diferenciação para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1.9). Durante esse período, a ameba tem que criar centríolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtúbulos), assim como criar o próprio flagelo. Os corpos basais e os flagelos são compostos de diversas proteínas, das quais a mais abundante é a tubulina. As moléculas de tubulina são organizadas em microtúbulos; esses são posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria não existe

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 1.8

em seu estágio de ameba. É produzida de novo (“desde o começo”), começando com uma nova transcrição no núcleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam transcrições em vários estágios com actinomicina D, uma droga antibiótica que seletivamente inibe a síntese do RNA. Quando adicionada anteriormente à diluição do alimento, esse antibiótico previne a síntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina D é adicionada 20 minutos após a diluição, a tubulina ainda é produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado logo em seguida. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma, detectável para tubulina flagelar, ao passo que mRNA extraído de células diferenciadas continha muitas mensagens desse tipo (Walsh, 1984). Então, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um processo de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. Notamos também um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas, que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo. Esse arranjo, pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos, e esses por sua vez agrupados de forma ordenada, é visto em toda a natureza. Em mamíferos, está evidente no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório. Mais ainda, não é somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300 outras proteínas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientação adequada dessas proteínas uma em relação a outra. Até mesmo processos celulares têm a sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos de proteína. Tal controle pós-tradução, onde uma proteína não é funcional até que esteja ligada a outras moléculas, será discutido melhor mais tarde. Vimos então, que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de transcrição, tradução e pós-tradução.

Transformação de Naegleria gruberi da forma amebóide ao estado flagelado. Linha superior corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada com um anticorpo fluorescente à proteína tubulina dos microtúbulos. A transformação é iniciada pela eliminação do alimento (bactérias) da colônia de Naegleria. (A) 0 minutos; (B) 25 minutos, mostrando síntese de nova tubulina; (C) 70 minutos, emergência de flagelos visíveis (D) 120 minutos, mostrando flagelos maduros e forma aerodinâmica do corpo (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.9

Diferenciação do fenótipo flagelado em Naegleria. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactéria são lavadas afim de se eliminar as bactérias no tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda a população desenvolveu flagelo. (Segundo Fulton, 1977.)

a lin bu a tu e ç da m e co es r nt l a Sí a g e fl

am o de rp r nç to s co ela ca o en al n t is de lag m ula m ve os e pa cél nda isí ão a f el r i m u v aç m ag gr s, o m or os A asai rred Fl o m p l el or f c ta b a F m ag se to Fl co

co

rp

os

100
Porcentagem da população com flagelo

80 Células de corpo com forma flagelar

60

40

20

0 0 20 40 60 Tempo após suspensão (minutos) 80 100

Figura 1.10

Sexo em bactérias. Algumas células de bactérias estão cobertas de numerosos apêndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma célula recipiente (sem pilos) através de um pilus sexual. Nessa figura, o pilus sexual está realçado por partículas virais que se ligam especificamente àquele estrutura. (Cortesia de C. C. Brinton, Jr. e J. Carnahan.)

As Origens da Reprodução Sexual A reprodução sexual é outra invenção dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. Deve-se notar que sexo e reprodução são dois processos separáveis e distintos. A reprodução envolve a criação de novos indivíduos. Sexo envolve a combinação de genes de dois indivíduos distintos em um novo arranjo. Reprodução na ausência de sexo é uma característica de organismos que se reproduzem por cisão; não há discriminação nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota células para formar uma nova colônia. Sexo sem reprodução também é comum entre os organismos unicelulares. As bactérias são capazes de transmitir genes de um indivíduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1.10). Essa transmissão é independente da reprodução. Protistas são também capazes de reorganizar genes sem reprodução. Os paramécios, por exemplo, se reproduzem por cisão, mas o sexo é realizado através de conjugação. Quando dois paramécios se juntam, eles se unem através de seus aparelhos orais formando uma conexão citoplasmática através da qual podem trocar material genético (Figura 1.11). Cada macronúcleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o micronúcleo passa por meiose para produzir oito micronúcleos haplóides, dos quais todos, exceto um, degeneram. O micronúcleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um micronúcleo estacionário e um micronúcleo migratório. Cada micronúcleo migratório atravessa a ponte citoplasmática e se funde com o micronúcleo estacionário (“fertilizante”), criando um novo núcleo diplóide em cada célula. Esse núcleo diplóide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo micronúcleo e um novo macronúcleo quando os dois parceiros se separam. Ainda que não tenha ocorrido reprodução, houve sexo.

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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Micronúcleo Macronúcleo

Fuso meiótico

Ponte citoplasmática Dois paramécios formam ponte citoplasmática Micronúcleos passam por meiose, formando 8 núcleos haplóides por célula; macronúcleos degeneram Todos menos um dos micronúcleos de cada parceiro degeneram

Micronúcleo estacionário Micronúcleo migratório Micronúcleo restante se divide para formar um micronúcleo estacionário e um migratório Micronúcleos migratórios atravessam a ponte citoplasmática e fertilizam os micronúcleos estacionários do parceiro Núcleo diplóide se forma e sofre divisões mitóticas para gerar um novo macronúcleo e dois micronúcleos quando os paramécios se separam

Figura 1.11

União de paramécios através da ponte citoplasmática, onde dois paramécios podem trocar material genético, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. (Strickberger, 1985.)

A união desses dois processos distintos, sexo e reprodução, em reprodução sexual, é visto em eucariotos unicelulares. A Figura 1.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Esse organismo é geralmente haplóide, portando apenas uma cópia de cada cromossomo (como os gametas dos mamíferos). Os indivíduos de cada espécie, no entanto, estão divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Quando se encontram, juntam-se os citoplasmas e seus núcleos se fundem para formar um zigoto diplóide. Esse zigoto é a única célula diplóide do ciclo de vida e passará por meiose para formar quatro novas células de Chlamydomonas. Aqui está uma reprodução sexual, pois cromossomos são realinhados durante as divisões meióticas onde mais indivíduos são formados. Note que nesse tipo de reprodução sexual protista, os gametas são morfologicamente idênticos e a distinção entre espermatozóide e óvulo ainda não aconteceu. Com a evolução da reprodução sexual, dois importantes avanços foram alcançados. O primeiro é o mecanismo da meiose (Figura 1.13), pelo qual o complemento diplóide dos cromossomos é reduzido ao estado haplóide (discutido em detalhe no Capítulo 22). O outro avanço é o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro. Em Chlamydomonas, o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1.14; Bergman et al., 1975; Goodenough e Weiss, 1975). A aglutinação dos flagelos permite que regiões específicas das membranas celulares se juntem. Esses setores especializados contêm componentes reprodutivos específicos que permitem a fusão dos citoplasmas. Seguindo-se à aglutinação, os indivíduos mais iniciam a fusão estendendo um tubo de fertilização.

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.12

Reprodução assexual (mitótica) Parceiro tipo mais (haplóide) Parceiro tipo menos (haplóide)

Reprodução sexual em Chlamydomonas. Duas linhagens, ambas haplóides, podem se reproduzir assexuadamente quando separadas. Respeitando certas condições, os dois cordões podem se unir para produzir uma célula diplóide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplóides. (Segundo Strickberger, 1985.)

Reprodução sexual Acasalamento

Fusão citoplasmática

Zigoto (diplóide)

Maturação (meiose)

Germinação Dois parceiros tipo mais e tipo menos

Figura 1.13

Sumário da meiose. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Durante a prófase, o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é duplicado, com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. Reagrupamentos cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio. Após a primeira metáfase, os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes. Durante a segunda divisão, o centrômero se divide, deixando cada nova célula com uma cópia de cada cromossomo.

MEIOSE I Envoltório nuclear Núcleo Cromossomos homólogos Cromatídeos homólogos

Cromatina

Interfase

Prófase I precoce

Meia prófase I

Prófase I tardia

Metáfase I

O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo sendo duplo, com os cromatídeos ligados no centrômero) se alinham aos pares. Rearranjos cromossômicos podem ocorrer entre os quatro cromatídeos homólogos neste momento.

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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(A)

(B)

Figura 1.14

Microfilamentos

Duas etapas do reconhecimento no acasalamento de Chlamydomonas. (A) Varredura por micrografia eletrônica (7000x) de par em acasalamento. Os flagelos que interagem, torcemse um em torno do outro, aderindo nas pontas (flexas). (B) Microfotografia eletrônica de transmissão (20.000x) de uma ponte citoplasmática conectando os dois organismos. Os microfilamentos se estendem da célula doadora (abaixo) para a célula recipiente (acima). (de Goodenough e Weiss, 1975 e Bergman et al., 1975; com permissão de U. Goodenough.)

Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. É interessante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerização da proteína actina - também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do ouriço-do-mar. No Capítulo 4, veremos que o reconhecimento e fusão de espermatozóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desenvolvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é controlada pela regulação transcricional, por tradução e pós-tradução; existe um mecanismo para processar o RNA através da membrana nuclear; as estruturas de genes individuais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica; mitose e meiose são aperfeiçoadas; e a reprodução sexual existe, envolvendo a cooperação entre células individuais.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante com a evolução de organismos multicelulares.

MEIOSE II

Anáfase I

Telófase I Os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes

Metáfase II

Anáfase II O centrômero se divide

Telófase II Cada nova célula tem uma cópia de cada cromossomo

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação
Um dos mais importantes experimentos da evolução foi a criação de organismos pluricelulares. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma única célula evoluiu para uma disposição pluricelular; discutiremos apenas dois deles (veja o Capítulo 23 para uma discussão mais completa). O primeiro caminho envolve a divisão ordenada da célula reprodutiva e a subseqüente diferenciação da sua progênie em diferentes tipos de células. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notável série de organismos pluricelulares, coletivamente referidos como a família das Volvocaceas ou volvocaceanas. As Volvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de numerosas células, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um único organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 células, cada uma com seu próprio flagelo. Em um gênero relacionado, Pandorina, 16 células formam uma esfera; e no Eudorina, a esfera contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. Nesses organismos, um princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível. Como ocorre na maioria dos embriões animais, as divisões celulares pelo qual uma única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular. Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio importante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo individual. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. Em todos os gêneros já mencionados, toda a célula pode, e normalmente o faz, produzir um organismo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gêneros Pleodorina e Volvox, porém, relativamente poucas células podem se reproduzir. Na Pleodorina californica, as células da região anterior são restritas à uma função somática; somente aquelas

Figura 1.15

Representante da ordem dos Volvocales. (A) o protista unicelular Chlamydomonas reinhardtii. (B) Gonium pectorale com oito células Chlamydomonas-símiles em um disco convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudorina elegans. (E) Pleodorina californica. Aqui todas as 64 células são originalmente similares, mas as posteriores desdiferenciam e rediferenciam como células assexuadas reprodutivas chamadas gonídios, enquanto as células anteriores permanecem pequenas e biflageladas, como o Chlamydomonas. (F) Volvox carteri. Aqui, células destinadas a se tornarem gonídios são separadas no começo do desenvolvimento e nunca desenvolvem características somáticas. As células menores, somáticas, lembram Chlamydomonas. Todas, menos o Chlamydomonas, são membros da família das Volvocaceas. A complexidade aumenta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular. Barra em A é de 5µm; BD, 25µm; E, F, 50µm (Cortesia de D. Kirk.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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Figura 1.16

(A)

(B)

(C)

Reprodução assexuada nas volvocaceanas. (A) Colônia madura de Eudorina elegans. (B) Cada uma das células de E. elegans se divide e produz uma nova colônia. (C) Volvox carteri maduro. A maioria das células são incapazes de se reproduzir. Células germinativas (gonídia) começaram a se dividir em novos organismos. (A e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

células do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colônia normalmente tem 128 ou 64 células, e a relação do número de células somáticas para o número de células reprodutivas é normalmente 3:5. Dessa maneira, uma típica colônia de 128 células tem 48 células somáticas e uma colônia de 64 células tem 24 células somáticas. Nos Volvox, quase todas células são somáticas, e muito poucas células são capazes de produzir novos indivíduos. Em algumas espécies de Volvox, células reprodutivas como as da Pleodorina, são derivadas de células que originalmente parecem e funcionam como células somáticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova progênie. No entanto, em outros membros do gênero, como o V. carteri, existe uma divisão do trabalho completa: as células reprodutivas que vão criar a nova geração são colocadas de lado durante a divisão das células reprodutivas que estão formando um novo indivíduo. As células reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funções somáticas do indivíduo; são inteiramente especializadas para reprodução. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada célula é capaz de existência independente e perpetuação da espécie), no V. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de células independentes e distintos (somático e reprodutivo), ambos requeridos para a perpetuação da espécie (Figura 1.16C). Embora nem todos os animais separem suas células reprodutivas das células somáticas (e as plantas raramente o fazem), essa separação de células germinativas das células somáticas no início do desenvolvimento é característica de muitos filos animais e será discutida em maior detalhe no Capítulo 13. Embora todas as volvocaceas, incluindo seu parente unicelular Chlamydomonas, se reproduzam predominantemente por meios assexuados, também são capazes de reprodução sexual. Isso envolve a produção e fusão de gametas haplóides. Em muitas espécies de Chlamydomonas, incluindo a ilustrada na Figura 1.12, a reprodução sexual é isogâmica, já que os gametas haplóides que se encontram são similares em tamanho, estrutura e motilidade. No entanto, em outras espécies de Chlamydomonas - assim como as várias espécies de volvocaceas coloniais - gametas nadadores de diversos tamanhos são produzidos por parceiros de acasalamentos diferentes. Isso é chamado heterogamia. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia, chamada oogamia, que envolve a produção de óvulos grandes e relativamente imóveis por um parceiro do acasalamento e espermatozóides pequenos e móveis pelo outro parceiro (veja Visões Colaterais & Especulações). Aqui vemos um gameta especializado para retenção de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de núcleos. Assim, as volvocaceas incluem os organismos mais simples que têm macho e fêmea distinguíveis, e possuem caminhos diferentes para desenvolver o óvulo ou o espermatozóide. Em todas as volvocaceas, a reação da fertilização se assemelha à do Chlamydomonas porque resulta na produção de um zigoto diplóide dormente, inativo, capaz de sobreviver a condições ambientais severas. Quando as condições permitem aos zigotos germinar, eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplóides dos dois parceiros em números iguais. [other.html#intro1]

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Informações adicionais

&

Especulações

Sexo e Individulidade em Volvox

S

imples como é, o Volvox compartilha muitos traços que caracterizam o ciclo de vida e histórico de desenvolvimento de organismos muito mais complexos, incluindo nós mesmos. Como já foi mencionado, o Volvox está entre os organismos mais simples a exibir a divisão de trabalho entre dois tipos de células diferentes. Como conseqüência disso, está entre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular, geneticamente programada, da sua história de vida.

Morte e Diferenciação Organismos unicelulares que se reproduzem através de uma simples divisão celular, tais como as amebas, são potencialmente imortais. A ameba que vemos sob um microscópio não tem ancestrais mortos! Quando uma ameba se divide, nenhuma das duas células resultantes pode ser considerada ancestral ou progênie; elas

são parentes. A morte chega para uma ameba apenas se ela é ingerida ou sofre um acidente fatal; quando isso acontece, a célula morta não deixa prole. Porém, a morte se torna uma parte essencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece divisão de trabalho entre células somáticas e células germinativas (reprodutivas). Considere o histórico de vida do Volvox carteri quando se reproduz assexuadamente (Figura 1.17). Cada adulto assexuado é um esferóide contendo aproximadamente 2000 pequenas células somáticas biflageladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes células reprodutivas assexuadas, chamadas gonídios, dispostas em umas das extremidades do interior. Quando maduro, cada gonídio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. Parte dessa divisão é assimétrica e produz as 16 células grandes que irão se tornar um novo

conjunto de gonídios. No fim da clivagem, todas as células que estarão presentes no adulto, foram produzidas de cada um dos gonídios. Mas o embrião está “virado de dentro para fora”: seus gonídios estão do lado de fora e os flagelos de suas células somáticas estão apontando para o interior da esfera oca de células. Essa condição adversa é corrigida por um processo chamado inversão, pelo qual o embrião se vira com o lado certo para fora através de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulação no embrião animal (Figura 1.18). Um agrupamento de
Figura 1.17

Embriogênese Adulto com juvenis Adulto com gonídios maduros

Expansão de adultos e juvenis

Reprodução assexual em V. carteri. Quando as células reprodutivas (gonídios) estão maduras, entram em um estado semelhante à clivagem do desenvolvimento embrionário para produzir seres juvenis dentro do adulto. Através de uma série de movimentos celulares semelhantes à gastrulação, o volvox embrionário se inverte e é finalmente liberado do progenitor. As células somáticas do progenitor, sem gonídios, passam por senescência e morrem, enquanto a colônia juvenil amadurece. O ciclo sexual total dura dois dias. (Segundo Kirk, 1988.)

Maturação dos gonídios

Expansão continuada da matriz extracelular

Expansão continuada de juvenis Liberação de juvenis

Morte de células somáticas - progenitores

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

19

(A)

(F)

Figura 1.18

(B)

(G)

Inversão dos embriões V. carteri produzidos assexuadamente. A-E são micrografias eletrônicas de varredura de embriões completos. FJ são cortes sagitais através do centro do embrião, visualizado por microscopia diferencial de interferência. Antes da inversão, o embrião é uma esfera côncava de células conectadas. Quando as células mudam a sua forma, um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do embrião (A,B,F,G). As células se curvam e se reúnem em um dos pólos (C-E, H-J). (Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

(C)

(H)

das células que as produzem (Pommerville e Kochert, 1982). Além do mais, nessa morte, as células liberam para o uso de outras, incluindo sua própria cria, todo o nutriente acumulado durante toda a vida. “Dessa maneira emerge”, como assinala David Kirk, “um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver”. Em V. carteri, foi identificado um gene* específico que tem um papel importante regulando a morte das células (Kirk, 1988). Em linhagens laboratoriais possuindo mutações desse gene, as células somáticas abandonam suas tendências suicidas, ganham a habilidade de se reproduzirem
* Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma proteína que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos são requeridos pela célula para se desenvolver como gonídio. Mutações de perda da função impedirão a proteína de agir, e as células serão capazes de se tornarem gonídios (D. Kirk, comunicação pessoal).

(D)

(I)

(E)

(J)

células em forma de garrafa abre um buraco em um dos lados do embrião produzindo tensão sobre a camada de células interconectadas (Figura 1.19). O embrião se utiliza desse buraco para fazer a inversão e depois o fecha. Posteriormente, as colônias juvenis são enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres.

O que acontece às células somáticas do “progenitor” Volvox agora que as jovens “deixaram o lar”? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reprodução, essas células somáticas morrem. Para ser mais exato, elas cometem suicídio, sintetizando um conjunto de proteínas que causam a morte e a dissolução

Figura 1.19

“Células garrafas” próximas à abertura do fialoporo. Essas células permanecem estreitamente conectadas através de pontes citoplasmáticas próximas a seus ápices alongados, desse modo criando a tensão que causa a curvatura da lâmina celular interconectada. ( Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

20

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

assexuadamente e se tornam potencialmente imortais (Figura 1.20). O fato desses mutantes nunca terem sido encontrados na natureza, indica que a morte das células tem um papel importante na sobrevivência do V. carteri sob condições naturais. [intro2.html] Entra o sexo Mesmo o V. carteri se reproduzindo assexuadamente a maior parte do tempo, na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. Quando o faz, uma geração de indivíduos morre, e uma nova geração geneticamente diferente é produzida. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais poética: A ameba e o paramécio são potencialmente imortais...Mas para o Volvox a morte parece inevitável, assim como o é para um camundongo ou o homem. Volvox deve morrer, como Leeuwenkoek observou, porque teve filhos e não é mais necessário. Quando sua hora chegar, tomba em silêncio, vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. Como Hegner, o zoologista de Johns Hopkins, escreveu, “Esse é o primeiro
Figura 1.21

advento da inevitável morte natural no reino animal, e tudo em nome do sexo. ”E pergunta: “Vale a pena?” Para Volvox carteri, certamente que sim. V. carteri vive em pequenas poças rasas que temporariamente se enchem com as águas das chuvas da primavera e secam no calor do verão. Durante a maior parte desse tempo, V. carteri nada livremente, reproduzindo-se assexuadamente. Esses volvox morreriam em minutos se a poça secasse, mas o V. carteri é capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poças, produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e à seca do alto verão e ao frio do inverno. Quando a chuva enche esses pequenos reservatórios na primavera, os zigotos interrompem a sua dormência e criam uma nova geração para reproduzirem-se assexuadamente até que as águas ameacem secar novamente. Como esses organismos tão simples prevêem a chegada de condições adversas com acuidade suficiente para produzir uma geração sexual no tempo certo, ano após ano? O estímulo para mudança do modo assexual para o modo sexual de reprodução em V. carteri é devido a uma proteína

(B)

Figura 1.20

Mutação de um único gene (chamado regenerador somático A) elimina a programação de morte em células V. carteri. Volvox recémeclodido carregando essa mutação (A) é indistinguível do esferóide tipo-selvagem. No entanto, momentos antes das células somáticas do esferóide tipo-selvagem começarem a morrer, as células somáticas desse mutante se rediferenciam como gonídios (B). Finalmente, cada célula do mutante irá se dividir para formar ( regenerar) um novo esferóide que irá repetir esse ciclo do desenvolvimento potencialmente imortal.

Reprodução sexual em V. carteri. Machos e fêmeas são indistiguíveis na sua fase assexuada. Quando a proteína indutora sexual está presente, os gonídios de ambos parceiros passam por uma embriogênese modificada que leva à formação de óvulos nas fêmeas e espermatozóides nos machos. Quando os gametas estão maduros, pacotes de espermatozóide (contendo 64 ou 128 espermatozóides cada), são liberados e nadam para as fêmeas. Ao alcançar a fêmea o pacote se rompe em espermatozóides individuais, que podem fertilizar os óvulos. O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir à seca, calor e frio. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar, sofrendo meiose para produzir machos e fêmeas haplóides que se reproduzem assexuadamente até o calor induzir novamente o ciclo sexual.
Desenvolvimento sexual de gonídios Pacotes de espermatozóide

Indutor sexual Espermatozóide Macho assexuado Gonídio Desenvolvimento embrionário modificado dos gonídios resultando em produção de gametas Macho sexuado

Óvulos Indutor sexual Óvulo Fêmea assexuada Meiose e germinação Fêmea sexuada

Zigotos

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

21

sexual indutiva de 30-kDa. Essa proteína é tão poderosa que concentrações menores que 6x10-17 fazem com que os gonídios sofram um padrão modificado de desenvolvimento embrionário que resulta na produção de óvulos ou espermatozóides, dependendo do sexo genético do indivíduo (Sumper et al.,1993). Os espermatozóides são liberados para nadar para a fêmea onde fertilizam os óvulos para produzir zigotos dormentes (Figura 1.21). Qual é a fonte dessa proteína indutora sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen-

tando placas com V. carteri à temperaturas que poderiam ser encontradas em um reservatório raso durante o fim do verão. Quando isso era feito, as células somáticas dos volvox assexuados produziam a proteína sexual indutora. Sendo a quantidade da proteína secretada por um indivíduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhões de volvox assexuados, um único volvox indutor pode converter um reservatório inteiro para a sexualidade. Essa descoberta explica uma observação feita há quase 90 anos, de que “na intensa radiação solar do verão de Nebraska, Volvox é capaz

de aparecer, multiplicar-se, realizando uma orgia sexual reprodutiva em poças de água da chuva de apenas duas semanas” (Powers, 1908). Ainda que reservatórios temporários formados pela água das chuvas sequem sob o calor do verão, Volvox encontrou um meio de sobrevivência: usa o calor para induzir a formação de indivíduos sexuados cujo acasalamento produz zigotos capazes de sobreviver sob condições que matam o organismo adulto. Observamos, também, que o desenvolvimento está criticamente ligado ao ecossistema ao qual o organismo se adaptou para sobreviver.

Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium
O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Um outro tipo de organização multicelular

derivada de organismos unicelulares é encontrada no Dictyostelium discoideum.* O ciclo de vida desse organismo fascinante é ilustrado na Figura 1.22. Em seu ciclo vegetativo, uma solitária ameba haplóide (chamada myxamoebae ou “ameba social” para distingui-las de espécies de amebas que sempre permanecem solitárias) vive em troncos caídos, se alimentando de bactérias e se reproduz por cisão binária. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida, dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de células que convergem em um ponto central. Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo. Subseqüentemente, uma ponta surge no topo desse monte, que se dobra formando uma lesma migratória (com a ponta na frente). A lesma (geralmente lhe é dado um título mais dignificado de pseudoplasmódio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e é envolvida por uma bainha viscosa. O grex começa a migrar (se o ambiente está escuro e úmido) com sua ponta anterior um pouco levantada; quando atinge uma área iluminada, a migração cessa, e o grex se diferencia em um corpo de frutificação composto de células esporos e pedúnculo. As células anteriores, representando 15 a 20 porcento de toda população celular, formam o pedúnculo tubular. O pedúnculo começa na parte centro-anterior da célula, enquanto as células prépedunculares começam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo através do grex. À medida que as células pré-pedunculares se diferenciam, formam vacúolos e aumentam de tamanho levando a massa de células pré-pedúnculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams, 1991). As células do pedúnculo morrem, mas as células posteriores, elevadas acima do pedúnculo, transformam-se em células-esporo. Essas se dispersam, cada uma tornando-se uma nova mixameba. Em adição a esse ciclo sexual, existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. Duas amebas podem fundir-se para criar uma célula gigante, que digere todas as outra células do agregado. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos, se enquista em uma parede grossa e sofre divisões meiótica e mitótica; e por fim, novas mixamebas são liberadas. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologistas do desenvolvimento, porque células inicialmente iguais são diferenciadas em dois tipos alternativos de células, esporo e pedúnculo. É também um organismo onde células individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de células diferenciadas, parecido com a formação de tecidos em organismos
* Embora chamado coloquialmente um “fungo celular pegajoso”, Dictyostelium não é um fungo (como Neurospora), nem é consistentemente pegajoso. É melhor considerá-lo como uma ameba social.

22

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Lesma (Pseudoplasmódio; grex)

15 h 14 h

16 h 17 h

MIGRAÇÃO

CULMINAÇÃO

20 h

12 h

Esporos

23 h

10 h AGREGAÇÃO Mixamebas 9 h Corpo de frutificação 6 h Fluxos celulares maduro

24h

Figura 1.22

Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplóides originam mixamebas, que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides. A medida que diminui o suprimento alimentar, ocorre agregação em pontos centrais, e forma-se um agregado de pseudoplasmódio. Finalmente, esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação que libera mais esporos. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental.

mais complexos. A agregação de milhares de amebas em um único organismo é um feito incrível de organização e convida à experimentação para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos.
AGREGAÇÃO DE CÉLULAS DE DICTYOSTELIUM. A primeira pergunta é: O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaçamento temporal mostrou que não ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas após carência nutricional. Durante as 5 horas seguintes, porém, as células são vistas mover-se por aproximadamente 20µm / min durante 100 segundos. Esse movimento cessa após aproximadamente 4 minutos, e em seguida recomeça. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central, não é um simples movimento radial. Antes, as células se juntam umas às outras para formar correntes; essas convergem em correntes maiores, e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento é devido à quimiotaxia: as células são guiadas para os centros de agregação por uma substância solúvel. Essa substância foi posteriormente identificada como adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico (cAMP) (Konijn et al., 1967; Bonner et al., 1969), cuja estrutura química está mostrada na Figura 1.23A. A agregação é iniciada à medida que cada célula começa a sintetizar o cAMP. Não há células “dominantes” que começam a secreção ou controlam as outras. Antes, os locais de agregação são determinados pela distribuição das amebas (Keller e Segal, 1970; Tyson e Murray, 1989). Células vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras: ou iniciando sua movimentação de acordo com as pulsações de cAMP, ou acompanhando a liberação de seu cAMP próprio (Robertson et al., 1972; Shaffer, 1975). Em seguida, a células não respondem mais aos pulsos de cAMP por vários minutos. O

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

23

(A)

Adenina

(B)

(C)

(D)

Figura 1.23

resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP, que se propaga através da população de células (Figura 1.23B-D). À medida que chega cada onda, as células dão mais um passo para o centro.* A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) demonstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo, enquanto as células remanescentes, posteriores, em geral estão destinadas a formar esporos. No entanto, a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do grex formar um pedúnculo. Em vez disso, as células que agora se encontram no final anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), agora formam o pedúnculo (Raper, 1940). De alguma maneira, é tomada uma decisão de modo tal, que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores virem esporos. Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais,

* A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligação ocorre, realiza-se transcrição específica de genes, é iniciada movimentação em direção à fonte de cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. O cAMP recém-formado ativa seus receptores próprios, assim como aqueles de seus vizinhos. As células na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfície celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente circular. Porém, à medida que o cAMP interage com as células que recebem e propagam o sinal, as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente daquela das células atrás delas. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na Figura 1.23. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e Murray, 1989).

Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium devida à ondas espirais de cAMP. (A) estrutura química do cAMP. (B) Visualização de várias “ondas” de cAMP no meio. Células centrais secretam cAMP em intervalos regulares, e cada secreção difunde para fora como um onda concêntrica. As ondas são mapeadas saturando-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colônia em agregação. O cAMP das células secretoras dilui o cAMP radiativo. Quando a radioatividade no papel é registada (colocando-o sobre filme de raiosX), as regiões de alta concentração de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentração de cAMP. (C,D) Ondas espirais de amebas movendo-se em direção à fonte inicial de cAMP. (C) Essa microfotografia em campo escuro processada digitalmente mostra cerca de 107 células. Como células móveis e imóveis dispersam a luz diferentemente, a fotografia reflete movimento celular. As bandas claras são compostas de células migratórias alongadas; as bandas escuras são células que pararam de se mover e se arredondaram. (D) As células formam correntes, a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direção ao centro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cortesia de P. Devreotes; C e D de Siegert e Weijer, 1989, cortesia de F. Siegert.)

24

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.24

Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoproteína 24-kDa, pouco após a inanição nutricional. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa proteína não foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui – 10 horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras.

de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro, e assim compensar por partes faltantes, é chamada regulação. Veremos esse fenômeno em muitos embriões, inclusive naqueles dos mamiferos.
MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Como essas células

individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este é o mesmo problema que enfrentam as células embrionárias, e a solução que evoluiu para os protistas é a mesma que aquela usada pelos embriões: moléculas de adesão celular reguladas pelo desenvolvimento. Enquanto estão crescendo mitoticamente em bactérias, células de Dictyostelium não aderem umas às outras. Porém, uma vez que a divisão celular cessa, as células se tornam progressivamente mais adesivas, alcançando um patamar de coesividade máxima aproximadamente após 8 horas de inanição. A adesão célula-célula é mediada por uma glicoproteína de 24.0000 Da (24-kDa) que está ausente em células em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1.24; Knecht et al., 1987; Loomis, 1988). Essa proteína é sintetizada a partir de mRNA recém-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. Se essas células são tratadas com anticorpos que se ligam a essa proteína e a mascaram, as células não irão aderir umas às outras e todo desenvolvimento subseqüente cessa. Uma vez que essa agregação inicial tiver ocorrido, é estabilizada por uma segunda molécula de adesão celular. Essa glicoproteína de 80-kDa também é sintetizada durante a fase de agregação. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas células, lesmas pequenas se formarão, e seus corpos de frutificação só atingirão aproximadamente um terço de seu tamanho normal. Assim, o segundo sistema de adesão celular, parece ser necessário para a retenção de um número de células suficientemente grande para a formação de grandes corpos de frutificação (Müller e Gerisch, 1978; Loomis, 1988). Um terceiro sistema de adesão é ativado tardiamente no desenvolvimento, quando a lesma estiver migrando. A proteína ou grupo de proteínas que intervem no terceiro sistema pode existir somente em células pré-esporo e pode ser responsável pela separação de células pré-esporo de células pré-pedúnculo (Loomis, comunicação pessoal). Assim, Dictyostelium evoluiu para três sistemas de adesão célula-célula regulados pelo desenvolvimento, e que são necessários para a morfogênese de células individuais para formar um organismo coerente. Como veremos em capítulos subseqüentes, células de metazoários também usam moléculas de adesão celular para formar os tecidos e órgãos do embrião. Dictyostelium é um “organismo multicelular em tempo parcial” que não forma muitos tipos de células (Kay et al., 1989), e os organismos multicelulares mais complexos não se formam pela agregação de células anteriormente independentes. No entanto, muitos dos princípios do desenvolvimento demonstrados por esse “simples” or-

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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ganismo também aparecem em embriões de filos mais complexos. A habilidade de células individuais sentir um gradiente químico (como a resposta da ameba ao cAMP) é muito importante para a migração celular e morfogênese durante o desenvolvimento animal. Ainda mais, o papel das proteínas da superfície celular para a coesividade celular pode ser visto através do reino animal, e moléculas indutoras da diferenciação estão agora começando a ser isoladas de organismos metazoários.

Informações adicionais

&

Especulações

Evidência e Anticorpos

A

Biologia, tal como qualquer outra ciência, não trata de fatos; antes, trata de evidências. Vários tipos de evidência serão apresentados neste livro; não são todos de equivalente vigor. Como exemplo, vamos usar a análise da adesão celular em Dictyostelium. O primeiro e mais fraco tipo de evidência é a evidência correlativa. Aqui, são feitas correlações entre dois ou mais eventos, e infere-se que um evento estimule o outro. Como vimos, anticorpos marcados com fluorescência para uma certa glicoproteína de 24 kDa, não marcam células vegetativas em divisão; porém, esses mesmos anticorpos acham a proteína em membranas celulares de mixameba logo que as células param de se dividir e tornam-se competentes para agregar (veja Figura 1.24). Assim, existe uma correlação entre a presença dessa glicoproteína da membrana celular e a capacidade de agregação. Evidência correlativa dá um ponto de partida para investigações, mas não se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em correlações. Embora se possa inferir que a síntese dessa proteína causa a adesão das células, é também possível que adesão celular leve as células a sintetizar essa nova glicoproteína, ou que a adesão celular e a síntese da glicoproteína 24-kDa sejam eventos separados, iniciados pela mesma causa subjacente. A ocorrência simultânea dos dois eventos pode mesmo ser coincidência e os eventos não terem relação um com o outro.*

Como então ir para além da mera correlação? No estudo da adesão celular em Dictyostelium, o próximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloquear a adesão de mixamebas. Usando uma técnica introduzida pelo laboratório de Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e colaboradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoproteína 24-kDa e isolaram seus sítios ligantes de antígeno (as partes da molécula do anticorpo que reconhecem o antígeno). Isso foi necessário porque o todo da molécula de anticorpo contém dois sítios ligantes de antígeno que iriam ligar-se artificialmente de maneira cruzada e aglutinar as mixamebas. Quando esses fragmentos ligantes de antígeno (chamados Fragmentos Fab) foram adicionados às células competentes para agregação, as células não puderam se agregar. Os fragmentos de anticorpo impediram as células de aderir entre si, presu– mivelmente por ligar–se a glicoproteína 24-kDa, bloqueando sua função. Esse tipo de evidência é chamado evidência-deperda-de-função. Se bem que mais forte que a evidência correlativa, ela ainda não exclui outras inferências. Por exemplo, é possível que os anticorpos tenham matado a célula (o que poderia acontecer se a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal de transporte). Isso também impediria a adesão celular. Ou talvez, a glicoproteína 24-kDa nada tinha a ver com a adesão propriamente, mas é necessária para o funcionamento da verdadeira molécula adesiva (como através da estabilização de pro-

* Em uma carta irônica, caçoando de tais inferências correlativas, Sies (1988) demonstrou uma notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos.

teínas de membrana em geral). Nesse caso, bloquear a glicoproteína também causaria a inibição da agregação celular. Assim, a evidência perda-de–função precisa ser amparada por muitos controles demonstrando que agentes causadores de perda de função derrubam especificamente aquela função em particular, e nada mais. O tipo mais forte de evidência é evidência-de-ganho-de-função. Aqui, o início do primeiro evento estimula um segundo e mesmo em situações onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Recentemente, da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidência para mostrar que a glicoproteína 80-kDa é uma molécula adesiva. Isolaram o gene para essa proteína e o modificaram de uma maneira a motivá-lo ser expresso continuamente. Em seguida, recolocaram-no em mixameba bem-alimentada, crescendo vegetativamente, que usualmente não expressa essa proteína e não tem capacidade de adesão. A presença dessa proteína na membrana celular dessas células em divisão foi confirmada por marcação com anticorpos. Tais células agora aderiram umas às outras mesmo nos estados vegetativos, o que normalmente não fazem. Assim, elas tinham ganho uma função adesiva somente por expressar essa glicoproteína em particular nas suas superfícies celulares. Essa evidência de ganho-de-função é mais convincente que outros tipos de análise. Experimentos semelhantes foram recentemente realizados em células de mamíferos (veja capítulo 3), para demonstrar a presença de determinadas moléculas adesivas celulares no embrião em desenvolvimento.

26

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

DIFERENCIAÇÃO EM DICTYOSTELIUM. A diferenciação em uma célula-pedúncu-

lo ou em uma célula-esporo reflete um dos principais fenômenos da embriogênese: a seleção pela célula de uma trajetória desenvolvimental. As células freqüentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas estão disponíveis. Uma determinada célula num embrião de vertebrado por exemplo, pode tornar-se uma célula da epiderme ou um neurônio. Em Dictyostelium, vemos uma decisão dicotômica simples, porque somente dois tipos celulares são possíveis. Como uma célula torna-se uma célula de pedúnculo ou uma célula de esporo? Embora os detalhes não sejam totalmente conhecidos o destino de uma célula parece ser regulado por certas moléculas difusivas. Os dois principais candidatos são o fator indutor de diferenciação (DIF) e o cAMP. DIF parece ser necessário para a diferenciação da célula peduncular. Esse fator, tal como o fator indutor de sexo em Volvox, é eficaz em concentrações muito baixas (10-10M); e, como a proteína de Volvox, parece induzir a diferenciação de um determinado tipo de célula. Quando adicionado às amebas isoladas ou mesmo às células pré-esporo (posteriores), induz a formação de células pedunculares. A síntese desse lipídeo de baixo peso molecular é regulada geneticamente, pois há cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de células-esporo e não de células pedunculares. Quando DIF é adicionado a essas culturas de mutantes, células penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn, 1983; Morris et al., 1987), e novos mRNAs específicos pré-pedúnculo são encontrados no citoplasma celular (Williams et al., 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das células do plasmódio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda é controverso (veja Early et al., 1995). DIF pode agir através da liberação de íons de cálcio de compartimentos intracelulares no interior da célula (Schaulsky e Loomis, 1995). [other.html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se células pré-pedúnculo, a diferenciação de células pré-esporo é mais provavelmente controlada por pulsos contínuos de cAMP. Altas concentrações de cAMP iniciam a expressão de mRNA pré-esporo específico, em amebas agregadas. Além disso, quando lesmas são colocadas em um meio contendo uma enzima que destrói cAMP extracelular, as células pré-esporo perdem suas características de diferenciação (Figura 1.25; Schaap e van Driel, 1985; Wang et al., 1988a,b).

(A)

(B)

Figura 1.25

Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium. (A) e (C) (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplasmódio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões claras). (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que degradam cAMP. Não é visto produto pré-esporo específico. (C) Amplificação maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia). O corante usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares. Todas as células do grex tornaram-se células pedunculares. (A e B de Wang et al., 1988a; C de Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

27

Informações adicionais

&

Especulações

Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima

S

E TODAS AS AMEBAS do grex começarem no mesmo nível, como podem células nos quatro-quintos posteriores da lesma se diferenciar em células-esporo, enquanto células equivalentes do quinto anterior se tornam células pedunculares? A resposta pode estar na observação de que as células originais não são todas iguais. Amebas sujeitas à inanição durante a parte precoce de seu ciclo celular tendem a se mover para a porção anterior do pseudoplasmódio, enquanto amebas expostas à inanição durante o fim do ciclo, tendem a permanecer na porção posterior (McDonald e Durston, 1984; Weijer et al., 1984). Esse trabalho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987), que mostraram que células não-alimentadas durante a parte tardia do ciclo celular, respondem de maneira diferente ao cAMP e mostram adesividade muito mais alta que células jejuadas imediatamente após a mitose. Williams e colaboradores (1989) acharam que células pré-esporo e pré-pedúnculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que estão distribuídas de modo aleatório através desses montes hemisféricos. Assim, as tendências para certos destinos foram estabelecidas até mesmo antes do grex começar a migrar. Dentro de cada agregado, a maioria das células pré-pedúnculo, migram ativamente para o anterior, enquanto células pré-esporo permanecem no que se tornará a região posterior do grex. Essa migração provavelmente é devida a repetidos pulsos de cAMP que ain-

da estão emanando da ponta apical do agregado. Esses pulsos são quimiotácticos para células pré-pedúnculo, mas não para células pré-esporo, de modo que atraem as células pré-pedúnculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston, 1979; Mee et al., 1986; Siegert e Weijer, 1991; Takeuchi, 1991).Portanto, o AMP cíclico parece ter várias funções no desenvolvimento de Dictyostelium. Agrega as células umas às outras, induz diferenciação de células pré-esporo e dirige a migração de células pré-pedúnculo para a parte anterior do agregado. Uma vez completo, o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migratório. A maioria das células pré-pedúnculo estão nos 20 porcento anteriores do grex, porém, há também algumas células pré-pedúnculo espalhadas através da parte posterior. Células pré-pedúnculo podem ser distinguidas pela sua secreção de proteína A da matriz extracelular para espaços intercelulares. No centro da porção anterior do grex, um outro grupo de células pré-pedúnculo começa a secretar uma segunda nova proteína (proteína B), para sua matriz extracelular. Essas células são chamadas células pré-pedúnculo B (pstB), enquanto a maioria das células pré-pedúnculo são conhecidas como células prépedúnculo A (pstA) (Figura 1.26). Outro grupo de células pré-pedúnculo, as células pstO, estão espalhadas de maneira esparsa através das células pré-esporo, e migram mais lentamente em direção ao anterior. Quando o grex se encontra na

luz solar, cessa de migrar e sofre a diferenciação final em esporos e pedúnculo. Durante esse processo (chamado culminação), o grex se apóia em um dos terminais fazendo com que as células traseiras se tornem sua base. Algumas células pstA migram para o tubo central de células pstB, e quando entram em contato com o tubo central, diferenciam-se em células pstB, sintetizando componentes de uma nova matriz extracelular. As células novas são adicionadas à região anterior do tubo, forçando-o mais para dentro da estrutura culminativa. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pedúnculo. Ao mesmo tempo, as células pstA que tinham ficado na região posterior do
Figura 1.26

Regulação da diferenciação de células pedunculares durante a fase de culminação do crescimento de Dictyostelium. Representação esquemática mostrando que células pré-esporo e pré-pedúnculo estão em geral misturadas no estágio precoce da agregação, mas se separam de modo que a maioria das células prépedúnculo se encontrem na parte anterior do grex. As células pré-pedúnculo A constituem a maior parte do anterior do grex, com alguma células similares no posterior. Células prépedúnculo B são vistas na parte central da porção anterior do grex. Nos estágios precoces da culminação, as células pré-pedúnculo do posterior migram para formar o disco basal e os cálices do saco de esporos; as células prépedúnculo A do anterior migram para o centro e se tornam células pré-pedúnculo B. Isso estende o pedúnculo até que esse eleve a caixa de esporos acima da superfície. (Segundo Harwood et al., 1992).
Cálice superior

Células pré-pedúnculo A Células pré-pedúnculo B Células pré-pedúnculo AB Direção do movimento celular Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Guarda da retaguarda Pré-pedúnculo A

Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Disco basal interior Disco basal exterior Cálice Inferior Pré-pedúnculo AB

Pré-pedúnculo B Agregado Grex Culminante precoce Culminante médio

Pré-pedúnculo B Culminante tardio

28

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

grex migram para as bordas da região préesporo e diferenciam-se no invólucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn, 1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, os esporos são levantados 2 mm acima do solo, de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa. O gatilho para a culminação parece ser a luz solar ou a baixa umidade. Experimentos recentes sugerem que esses dois fatores causam a difusão de amônia da lesma. A amônia é produzida copiosamente por lesmas migratórias e reprime a culminação. Sempre que a amônia estiver exaurida (quer naturalmente ou experimentalmente), a culminação começa (Schindler e Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; Bonner et al., 1985). A amônia inibe a conversão de células pstA em pstB e proíbe a continuação da formação do pedúnculo
cAMP

(Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). Bonner e colaboradores (1985), sugeriram que como a luz causa difusão mais rápida da amônia, remove o inibidor permitindo assim, o progresso da culminação. A amônia parece inibir a produção do pedúnculo pelos menos de duas maneiras. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap, 1989), e inibe a produção de cAMP nas células pré-pedúnculo (Schindler e Sussman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse cAMP é necessário para ativar a proteína quinase cAMP-dependente (PKA). Células pré-pedúnculo contendo PKA nãofuncional, não fosforilam certas proteínas. Essas células não migram para a região central anterior, nem se diferenciam em células do pedúnculo (Firtel e Chapman, 1990; Harwood et al., 1992). Os dados sugerem que quando PKA é ativada,

passa a fosforilar um repressor que estava inibindo a expressão dos genes de diferenciação do pedúnculo. No estado fosforilado, o inibidor é inativo. Portanto, uma vez que os níveis de cAMP se elevam (pela remoção da amônia), a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pedúnculo (Figura 1.27). [intro.4html]
Figura 1.27

Uma hipótese para a iniciação coordenada da culminação e diferenciação de células pedunculares em Dictyostelium. A luz solar dissipa a amônia na parte anterior do grex, permitindo maior produção de cAMP nas células pré-pedúnculo. A concentração mais alta de cAMP ativa a PKA, que fosforila um inibidor da expressão gênica do pedúnculo. O inibidor fosforilado não pode mais inibir os genes pedúnculo-específicos. A seqüência pela qual a formação de esporos é inibida, não está clara. (Baseado em modelos de Bonner et al., 1985, e Harwood et al., 1992)

Amônia

Repressor ativo da diferenciação e de genes de migração peduncular PKA inativa cAMP PKA ativa

Migração continuada do grex

Luz solar

Repressor inativo (fosforilado)

Transcrição do gene da proteína B da matriz extracelular; migração de células pré-pedúnculo; diferenciação e culminação peduncular

Padrões desenvolvimentais entre metazoários
Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazoários - animais multicelulares que atravessam estágios embrionários de desenvolvimento - apresentaremos um visão panorâmica dos seus padrões desenvolvimentais.* A Figura 1.28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazoário. A observação mais impressionante é que a vida não evoluiu segundo uma linha reta; apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Podemos ver que a maioria das espécies de metazoários pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas.
*Plantas passam por padrões igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embrionário e pós-embrionário. No entanto, o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais; a inclusão de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extensão deste livro. Por isso, foi tomada a decisão de enfocar neste texto, o desenvolvimento dos animais. Para uma revisão, veja Singer, 1997.

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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BILATERIA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS

RADIATA

PARAZOA

Vertebrados

Ascídios (Tunicados)

Moluscos Equinodermos

Artrópodos Anelídeos

Nematelmintos

Platelmintos

Cnidários (Celenterados)

Poríferos (Esponjas)

Segmentados

Não-segmentados

Larva trocófora Clivagem em espiral gastrulação protostosomal

da

ma

lo

qu

es

ag

em

Li

nh

ag

Clivagem radial gastrulação deuterostomal

nh

Li

SIMETRIA BILATERAL

Platelmintos primitivos (acelomados)

SIM

ET

RA RIA

DIA

Larvas planulóides

Protozoários coloniais primitivos

Protistas flagelados

Figura 1.28

Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. (Outros modelos são possíveis, porém, os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui.)

Os Poríferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de metazoários, ambos passando por estágios embrionários. Um desses grupos é o Porífero (esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qualquer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazoários (chamando-os, “parazoários”). Uma esponja tem três tipos principais de células somáticas, mas um deles, o arqueócito, pode se diferenciar em todos os outros

Li

L

nh

ag

em

ac

elo

Larva dipleura (tornária)

ce

ps

eu

do

ce

lo

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ad em
m ad a

izo

a

30

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

tipos. As células de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar novas esponjas a partir de células individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal reagregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contém somente células de uma espécie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arqueócitos móveis colecionam células de sua espécie, mas não das outras (Turner, 1978). Esponjas não contém mesoderma, não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero; esses seres não têm tubo digestivo, sistema circulatório, nervos ou músculos. Assim, apesar de passarem por estágios embrionários e larvais, esponjas são muito pouco parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell, 1997). Protostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque têm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas, corais e hidras) e ctenóforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma é rudimentar, consistindo de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porém, a maioria dos metazoários tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos bilaterais são classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corpórea), e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporâneos. Enquanto os platelmintos são desprovidos de celoma (cavidade corpórea), os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavidade corpórea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de revestimento mesodérmico. A maioria dos filos são celomados, isto é, possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1.29. Protostomatas (do Grego, “boca primeiro”), incluem os filos dos moluscos, artrópodos e vermes; são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar, junto ou próximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulação. O ânus se forma mais tarde em outro local. A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida corda de células mesodérmicas, tornadas ocas. A outra grande divisão dos Bilateria é a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar, alguns traços embriológicos acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego significando “boca depois”), a abertura bucal é formada depois da abertura anal. Também, enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide), a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do intestino (formação enterocélica). Porém, deve-se mencionar que há muitas exceções a essas generalizações. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. Na maioria dos deuterostomatas, os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Isso é chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrário, têm uma extensa variedade de tipos de clivagem. Muitas espécies formam blástulas compostas por células que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. São por isso considerados sofrer clivagem espiral. Além disso, os blastômeros em estágio de clivagem, na maioria dos deuterostomatas, têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Se um único blastômero é removido de um embrião quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo, tal blastômero irá desenvolver-se em um organismo inteiro, e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver

CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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(A) PROTOSTOMATAS 1. Clivagem espiral

(B) DEUTEROSTOMATAS 1. Clivagem radial

2. Desenvolvimento esquizocélico Celoma Blastocele Mesoderma se divide Mesoderma

2. Desenvolvimento enterocélico Celoma

Blastocele

Bolsa Intestinal Bolsas se destacam Mesoderma

Intestino 3. Tendência a não regulação

Intestino

Intestino 3. Tendência à regulação

Intestino

Embrião de de 4 células

Um blastômero excluído

Desenvolvimento interrompido

Embrião de de 4 células

Um blastômero excluído

Duas larvas normais se desenvolvem

Figura 1.29

normalmente. Porém, se a mesma operação fosse realizada em um embrião de lesma ou de verme, tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvimento. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), é considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis, há cerca de 255 milhões de anos. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de água existentes. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. O ovo é fertilizado internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. Ainda, contém quatro bolsas: o saco vitelínico, que armazena proteínas nutrientes, o âmnio, que contém fluido banhando o embrião, a alantóide, na qual restos do metabolismo embrionário são coletados, e o cório, que interage com o ambiente externo, seletivamente permitindo materiais chegar ao embrião. O todo dessa estrutura está contido em uma casca que permite a difusão de oxigênio, ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrião de agressões ambientais. Desenvolvimento semelhante de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo.

Tendências principais dos prostostomatas e deuterostomatas. Exceções à todas essas tendências gerais evoluíram secundariamente em certos membros de cada grupo. (A maioria dos vertebrados por exemplo, não tem uma formação estritamente enterocélica da cavidade corporal; e os embriões de certos deuterostomatas, como os tunicados, não sofrem regulação se os blastômeros são deles removidos.)

32

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.30

Embrião Intestino Âmnio Cavidade amniótica Alantóide Cório Gema Saco vitelino (A) (B)

Diagrama do ovo amniótico do pinto, mostrando o desenvolvimento das membranas envolvendo o embrião. (A) Incubação de três dias. O mesoderma extra-embrionário se estende do embrião para prover vasos sangüíneos para e de várias regiões fora do embrião. (B) Incubação de sete dias. A origem das membranas será detalhada no capítulo 9. A gema será finalmente rodeada pelo saco vitelínico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangüíneos. O cório é derivado em parte do ectoderma e estende-se do embrião até a casca (onde irá trocar oxigênio e gás carbônico e obter cálcio da casca). O âmnio prove o meio fluido no qual cresce o embrião, e a alantóide coleta resíduos nitrogenados que seriam perigosos para o embrião. Finalmente, o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. A evolução do âmnio e das outras membranas extra-embrionárias constituiu uma grande linha divisória entre aqueles vertebrados cuja reprodução está ligada à água (anamniotas) e aqueles que podem se reproduzir em áreas secas (amniotas).

Alantóide

A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. No presente livro, encontraremos apenas uma pequeníssima amostra deles, servindo para ilustrar os princípios mais importantes do desenvolvimento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal através dos filos, veja Gilbert e Raunio,1997). Estamos apenas observando o conjunto das marés ao nosso alcance, enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende à nossa frente. Após uma breve visão dos princípios genéticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento, investigaremos os estágios precoces da embriogênese animal: fertilização, clivagem, gastrulação e construção do plano do corpo vertebrado. Capítulos posteriores se concentrarão nos mecanismos genéticos e celulares pelos quais ele é elaborado. Embora uma tentativa de cobrir as variações importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita, um certo chauvinismo deuterostossômico pode ter ficado aparente.

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CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

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Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas

2

O que gostaríamos de saber é se a estrutura é determinada diretamente pela informação codificada no DNA, gravada no ovo... na extensão em que estrutura pode ser expressa por informação. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaçam e cativam são em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pêra vira uma pereira em vez de um urso polar. CYNTHIA OZICK (1989)

“E

NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os genes postulados, aos quais os caracteres se referem, está todo o campo do desenvolvimento embrionário”. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926) estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo, passava através de processos desenvolvimentais. No começo do século vinte, embriologia e genética não eram consideradas ciências separadas. Divergiram na década de 1920, quando Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em oposição à embriologia, a ciência que estuda a expressão desses traços. Durante a última década, porém, as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação entre embriologia e genética. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste texto. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há uma década, estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo síntese de ácidos nucléico e hibridização. Este capítulo procura situar essas novas técnicas dentro do contexto do diálogo, ora em curso, entre genética e embriologia.

As origens embriológicas da teoria dos genes
Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen, elementos construtores de formas; nós os chamamos de genes. Porém, é na terminologia de Mendel que vemos como no século dezenove os conceitos de herança e desenvolvimento estavam intimamente entrelaçados. Entretanto, as observações de Mendel não indicaram onde na célula ficavam esses elementos hereditários, nem como eram levados a se expressarem. A teoria dos genes, que viria a ser a pedra angular da genética moderna, teve origem em uma controvérsia no campo da embriologia. Em fins século XIX, um grupo de cientistas começou a estudar, por seu valor intrínseco, como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Dois jovens embriologistas americanos, Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan (Figura 2.1), tornaram-se parte desse grupo de “embriologistas fisiológicos”, cada um tornando-se partidário na controvérsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado - o núcleo ou o citoplasma - controla a herança. 35

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(B)

Figura 2.1

(A)

(A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em aproximadamente 1899), um embriologista cujo trabalho, na fase precoce da embriologia e da determinação sexual, muito avançou as hipóteses cromossômicas do desenvolvimento. (Wilson era também reconhecido como um dos melhores violoncelistas amadores do país.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia - tomada em 1915, quando os elementos básicos da teoria dos genes estavam se encontrando – mostra Morgan usando uma lente manual para identificar moscas. (A) cortesia de W. N. Timmins; (B) cortesia de G. Allen.)

Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa já estava bem ativa. Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus colegas, que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enormes mudanças durante o desenvolvimento; ao contrário, eles acreditavam que os padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas moléculas do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da herança. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do récem-fertilizado ovo ctenóforo (geléia de crista). Em 1897 Morgan relatou: Aqui, embora todo o núcleo de segmentação esteja presente, devido à perda de parte do citoplasma, produz-se embriões com defeito... Parece não haver escape da conclusão que no citoplasma, e não no núcleo, está o poder de diferenciação dos estágios precoces do desenvolvimento.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Wilson, nesse ínterim, tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. Defendeu vigorosamente essa idéia em seu livro A Célula no Desenvolvimento e na Herança (1896), salientando a necessidade da presença do núcleo para regeneração dos protozoários (veja capítulo 1): Esse fato presume que o núcleo é, se não o local da formação de energia, ao menos, o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herança. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da maturação (meiose), fertilização e divisão celular. Todos convergem em direção da conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento. Wilson (1895) não se esquivou das conseqüências dessa conclusão* Agora, a cromatina é sabida ser intimamente semelhante, se não idêntica, à substância conhecida como nucleína...que a análise demonstra ser um composto químico toleravelmente bem definido, composto de ácido nucléico (um complexo ácido orgânico rico em fósforo) e albumina. E assim, chegamos à notável conclusão que a herança pode, talvez, ser efetuada pela transmissão física de um dado composto químico do progenitor para a descendência. Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenóforo, já havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson, 1894, 1904). Para Wilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos parecem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação, e ainda procuramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente.” Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2.2 A), um pesquisador na Estação Biológica de Nápoles. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentrações de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozóides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e dividiram o ovo em quatro, em vez de duas células (veja capítulo 4). Boveri então separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. Assim, Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais. O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adição à evidência de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) demonstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em 92 espécies de insetos (e um cordato primitivo), as fêmeas tinham dois cromossomos sexo-específicos em cada núcleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromossomo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretação de que
*Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes. Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986).
** Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor estudante de pós-graduação. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. Mesmo assim, Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas qualidades como as melhores possíveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação, apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).

(A)

(B)

Figura 2.2

O caráter singular do cromossomo foi mostrado por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) comentou: “conseguiu a verdadeira fusão de citologia, embriologia e genética – um feito biológico que... não fica atrás de qualquer outro de nosso tempo.” Fotografia tirada em 1908, quando os estudos cromossômicos e embriológicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B) Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou tanto com Boveri como com Morgan, vista aqui em 1904 quando era estudante de pósdoutorado, realizando a pesquisa que correlacionou o número de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington.]

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

os cromossomos determinavam o sexo. Ao contrário, ele considerou o conjunto de cromossomos como uma característica sexual secundária, controlada por alguma substância citoplasmática determinadora do sexo. A “conversão” de Morgan para a hipótese cromossômica ocorreu depois de obter dados contrários às suas teorias (veja Allen, 1978; Gilbert, 1978; Lederman, 1989). Enquanto criava Drosophila para uma série de experimentos sobre evolução, Morgan começou a obter várias mutações correlacionadas com o sexo. (Como ele logo iria mostrar, mutações ligadas ao X apareciam antes de mutações em outros cromossomos, porque defeitos no cromossomo X não são mascarados pelo cromossomo homólogo no macho.) Em 1910, Morgan mostrou que os traços para ambos sexos e cor branca dos olhos estão correlacionados de alguma maneira com a presença de um dado cromossomo X; entretanto, evitou considerá-los ligados fisicamente. Porém, em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos, cor do corpo, forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cromossomo X, o que o levou a começar a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. O embriologista Morgan tinha demonstrado que cromossomos nucleares eram responsáveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. [gene1.html]

A cisão entre a embriologia e a genética
A evidência de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. A genética havia sido, em geral, uma ciência empírica sobre procriação de animais e plantas; Morgan deu-lhe um fundamento científico. Movida pelo desejo de progredir no conhecimento da reprodução de animais e plantas (e seres humanos), e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matematicamente verificáveis, a genética logo se tornou a ciência biológica predominante nos Estados Unidos (veja Allen, 1986; Sapp, 1987; Paul e Kimmelman, 1988). Na década de 1930, tornou-se disciplina autônoma, desenvolvendo seu vocabulário próprio, revistas, sociedades, organismos favorecidos, professorados e regras de evidência. Hostilidade entre embriologia e genética também emergiu. Os geneticistas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expressão gênica. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938), “O desenvolvimento, obviamente, é a produção ordenada de um padrão e assim, em última análise, os genes controlam o padrão”. Se os embriologistas não olharem para a embriogênese em termos da atividade dos genes, os geneticistas o farão. Reciprocamente, os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. Embriologistas como Frank Lillie (1927), Ross Granville Harrison (1937), Hans Spemann (1938) e Ernest E. Just (1939) (Figura 2.3), argumentaram que não poderia haver uma teoria genética do desenvolvimento até que ao menos três principais desafios fossem resolvidos: 1. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos – que eram considerados idênticos em cada célula do organismo – direcionam tipos diferentes e variáveis de citoplasmas celulares. 2. Quase todos genes conhecidos na época afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos, forma das cerdas, vascularização alar). Os geneticistas teriam que produzir evidência que os genes controlam os estágios precoces da embriogênese. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison, 1937), os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e não no número de cerdas no seu dorso. 3. Os geneticistas teriam que explicar fenômenos como a determinação do sexo em certos invertebrados (e vertebrados, como répteis), nos quais o ambiente determina o fenótipo sexual.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

39

(A)

(B)

Figura 2.3

(C)

Embriologistas tentaram impedir a genética de “conquistar” seu território na década de 1930. (A) Frank Lillie encabeçou o Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um líder na pesquisa sobre fertilização e endocrinologia reprodutiva. (B) Hans Spemann (à esquerda) e Ross Harrison (à direita) aperfeiçoaram operações de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas não possuíam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. (C) Ernest E. Just fez descobertas cruciais sobre fertilização. Rejeitou a genética e enfatizou o papel da membrana celular na determinação dos destinos das células. (A cortesia de V. Hamburger; B cortesia de T. Horder; C cortesia do Laboratório de Biologia Marinha, Woods Hole.)

O debate tornou-se deveras veemente. Numa retórica, refletindo as ansiedades políticas do fim da década de 1930, Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da genética com a embriologia está sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas começa a impeli-los em nossa direção, não pareceria impróprio apontar para um perigo dessa ameaçada invasão. O prestígio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstáculo para a compreensão do desenvolvimento, por dirigir nossa atenção exclusivamente para o genoma, enquanto movimentos celulares, diferenciação e todos os processos desenvolvimentais são de fato realizados pelo citoplasma. Já temos teorias que referem os processos do desenvolvimento à ação dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecução dos potenciais dos genes. Tais teorias são totais e demasiadamente unilaterais. Até que os geneticistas puderam demonstrar a existência de variantes herdadas durante a fase precoce do desenvolvimento e até que os geneticistas tiveram uma bemdocumentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de células, os embriologistas em geral não sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ação dos genes. [gene2.html]

Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento
Porém, alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a genética estavam completas uma sem a outra. Várias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas, mas sua primeira integração bem-sucedida veio no fim da década de

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

1930, por parte de dois embriologistas, Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido genética nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington, tentaram achar mutações que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por esses genes. Gluecksohn-Schoenheimer (1938, 1940) mostrou que mutações nos genes de Brachyury do camundongo, causavam desenvolvimento aberrante da porção posterior do embrião, e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal.* Além disso, Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camundongos não era possível fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo - alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqüências dessa operação. Em vez disso, um novo tipo de cientista era necessário, o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados, o geneticista do desenvolvimento tem que estudar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto é, os resultados da perturbação do desenvolvimento) para depois, às vezes, chegar a conclusões sobre a natureza do “experimento” realizado pelo gene. Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam malformações alares na mosca das frutas, Drosophila. Também analisava como esses genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas. A asa da Drosophila, conforme proclamou corretamente, “parecia favorável para pesquisas sobre a ação desenvolvimental dos genes”. Assim, uma das principais objeções ao modelo genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de construção – foi contrariada. [gene3.html]

Evidência para a equivalência genômica
Ainda permanecia uma outra grande objeção para uma embriologia baseada na genética: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalência genômica não estava provada mas era assumida (porque cada célula é o descendente mitótico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da genética do desenvolvimento era o de determinar se cada célula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. Metaplasia A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial, por parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados. O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar presentes, embora normalmente não expressos. Na salamandra, a remoção da retina

*As observações de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas através da hibridização do DNA. No entanto, quando o gene do T-locus foi clonado e sua expressão detectada pela técnica da hibridização in situ (discutida mais adiante neste capítulo), Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que “a expressão do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formação do mesoderma e na morfogênese da notocorda”. Embora uma história completa do desenvolvimento precoce da genética do desenvolvimento ainda permaneça por ser escrita, mais informações sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer, 1981; Sander, 1986; Gilbert, 1988, 1991, 1996; Burian et al., 1991; Harwood, 1993; Keller, 1995; e Morange, 1996.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode ser formada a partir das células da íris dorsal. A regeneração do tecido lenticular da íris (a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada. Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e Yamada, 1972) acharam que após a remoção de uma lente, uma série de acontecimentos leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2.4). Os núcleos do lado dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se replica, e divisões mitóticas se sucedem. As células da íris pigmentada começam, em seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados que dão ao olho a sua cor; esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que entram no local da ferida). A íris dorsal continua a se dividir, formando um globo de tecido desdiferenciado na região da lente removida. Essas células começam então a sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares, as proteínas do cristalino. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. Uma vez formada uma nova lente, as células do lado dorsal da íris cessam sua atividade mitótica. Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada. Como será visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de células epiteliais da cabeça, induzida pelas células retinais precursoras subjacentes. A formação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia (ou transdiferenciação), a transformação de um tipo celular diferenciado em outro (Okada, 1991). A íris da salamandra, portanto, não havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciação das células da lente.

Retina pigmentada

Retina neural Íris dorsal

Lente

Figura 2.4

Íris ventral

Regeneração Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da íris. (A) Olho normal, não-operado no estágio larval da salamandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Regeneração da lente, vista respectivamente nos dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estará completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia de R. W. Reyer.)
(B) (C)

(A)

(D)

(E)

(F)

(G)

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Clonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência Nuclear O teste definitivo sobre se, ou não, o núcleo de uma célula diferenciada sofreu qualquer restrição funcional irreversível, seria o de conseguir que esse núcleo gerasse todo outro tipo de célula diferenciada no organismo. Se cada núcleo fosse idêntico ao núcleo do zigoto, o núcleo de cada célula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo, quando transplantado para um ovo ativado enucleado. Porém, antes que tal experimento pudesse ser feito, três técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas: (1) um método para enuclear ovos do hospedeiro sem destruí-los; (2) um método para isolar núcleos doadores intactos; (3) um método para transferir tais núcleos para dentro do ovo sem danificar o núcleo ou o oócito. Essas técnicas foram desenvolvidas na década de 1950, em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleação com a ativação do ovo. Quando um oócito de rã-leopardo (Rana pipiens) é perfurado com uma agulha limpa de vidro, o ovo sofre todas as mudanças citológicas e bioquímicas associadas à fertilização. Ocorre rearranjo citoplasmático interno e a finalização da meiose perto do pólo animal da célula. Esse fuso meiótico pode ser facilmente localizado quando empurra os grânulos pigmentados do pólo animal; a punção do oócito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2.5). O ovo hospedeiro é agora considerado estar ativado (as reações de fertilização necessárias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. A passagem de um núcleo para o ovo é conseguida pela ruptura de uma célula doadora e transferência do núcleo liberado para o oócito por meio de uma micropipeta. Algum citoplasma acompanha o núcleo para seu novo lar, mas a razão do citoplasma doador para o receptor é somente de 1:105, e o citoplasma do doador não parece afetar o resultado dos experimentos. Em 1952, Briggs e King demonstraram que núcleos da célula da blástula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos para o citoplasma do oócito. O que acontece quando núcleos de estágios mais avançados são transferidos para oócitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) estão delineados na Figura 2.6. Enquanto a maioria dos núcleos da blástula podiam produzir girinos completos, houve um dramático decréscimo da capacidade dos núcleos derivados de estágios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto até o estágio de

Pólo animal Agulha de vidro

Fuso meiótico isolado

Micropipeta

Fuso meiótico

Grânulos pigmentados

Remoção dos cromossomos e do fuso da célula

Ovo ativado enucleado

Extração e lise da célula doadora

Núcleo doador inserido na célula enucleada

Figura 2.5

Procedimento para o transplante de núcleos da blástula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens. As dimensões relativas do fuso meiótico foram exageradas para demonstrar a técnica. A bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira. (Segundo King, 1966; fotografia cortesia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)

Membrana cicatriza

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

43

Estágio desenvolvimental dos embriões e girinos dos quais foram retirados os núcleos
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Figura 2.6

Porcentagem de embriões de transplantes nucleares que se desenvolvem normalmente

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Gráfico de transplantes nucleares bem sucedidos, em função da idade do desenvolvimento nuclear. A abscissa representa o estágio no qual o núcleo doador (de R. pipiens) foi isolado e inserido no oócito ativado e enucleado. A ordenada mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blástulas que podiam em seguida direcionar o desenvolvimento para o estágio do girino nadador (Segundo McKinnell, 1978.)

Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente

Horas a 18oC

girino. Quando núcleos de células somáticas de girinos no estágio de broto caudal foram usados como doadores, não ocorreu desenvolvimento normal. Porém, núcleos de células germinativas de girinos do estágio de broto caudal (que irão finalmente dar origem a um organismo completo após a fertilização), foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blástulas que se desenvolveram (Smith, 1956). Assim, células somáticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo à medida que se tornam definidas e diferenciadas, e a progressiva restrição da potência nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral. Porém, é possível que alguns núcleos celulares diferenciados sejam diferentes de outros. Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas John Gurdon e seus colegas, usando métodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na rã Xenopus, obtiveram resultados sugerindo que os núcleos de algumas células diferenciadas podem permanecer totipotentes. Gurdon também achou uma progressiva perda de potência no decorrer do desenvolvimento, embora células de Xenopus tenham retido suas potências por um período de desenvolvimento mais longo (Prancha 1). As exceções a essa regra mostraram ser muito interessantes. Gurdon havia transferido núcleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimentavam, para ovos ativados enucleados. Esses núcleos doadores continham um marcador genético (um nucléolo por célula, em lugar dos dois usuais), que os distinguia dos núcleos do hospedeiro. Entre 276 núcleos transferidos, somente 10 (1.4 porcento) promoveram o desenvolvimento até o estágio do girino que se alimentava. Transplantes seriados (que requeriam colocar um núcleo intestinal em um ovo e quando o ovo tinha se transformado em blástula, transferia-se o núcleo da blástula para vários outros ovos), aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon, 1962). Em alguns casos, núcleos das células intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de células – neurônios, células do sangue, nervos e assim por diante – de um girino vivente. Além disso, sete desses girinos (de dois núcleos originais) se metamorfosearam em rãs adultas férteis (Gurdon e Uehlinger, 1966); esses núcleos eram totipotentes (Figura 2.7). King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) não haviam sido tomadas suficientes precauções para ter certeza que células germinativas primordiais, que podem migrar até o intestino, não foram usadas como fontes de núcleos, e (2) as células intestinais de um girino tão jovem poderiam não se qualificarem

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.7

EXPERIMENTO Ovo não-fertilizado (cepa 2 – nu) Girino (cepa 1 – nu)

Procedimento empregado para obter rãs maduras de núcleos intestinais de girinos de Xenopus. O ovo de tipo selvagem (2 nucléolos por núcleo; 2-nu) é irradiado para destruir os cromossomos maternos, e um núcleo intestinal de um girino marcado (1-nu) é inserido. Em alguns casos não ocorre divisão; em alguns casos o desenvolvimento do embrião é sustado; porém, em outros casos, uma rã inteiramente nova é formada tendo um genótipo 1-nu. (Segundo Gurdon, 1968, 1977.)

Irradiação UV destrói comossomos do ovo

Núcleo intestinal epitelial é inserido no ovo irradiado

Micropipeta Núcleo intestinal

Ovo receptor irradiado RESULTADOS

Blástula

Blástula

Blástula

Sem divisão

Girino

Girino (morre)

Embrião anormal

Rã adulta (Cepa 1 – nu)

como um tipo de célula verdadeiramente diferenciada porque células de girinos que se alimentam ainda contêm plaquetas de gema (DiBerardino e King, 1967; McKinnell, 1978; Briggs, 1979). Para responder a essas críticas, Gurdon e seus colegas cultivaram células epiteliais da membrana natatória de rãs adultas. Essas células mostraram estar diferenciadas; cada uma continha queratina, a proteína característica de células adultas da pele. Quando núcleos dessas células foram transferidos para oócitos ativados e enucleados de Xenopus, nenhum dos transferidos de primeira geração progrediu além da formação do tubo neural, pouco após a gastrulação. Por transplantes seriados, porém, numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al., 1975). Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar, um único núcleo celular diferenciado ainda retinha potências incríveis. Um único núcleo derivado de uma hemácia de uma rã adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divisões após ser transplantado para um oócito ativado e, ainda, reter a habilidade

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

45

de gerar girinos natatórios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino (1987) tenha observado que “até o presente, núcleo algum de uma célula documentadamente especializada, nem de uma célula adulta tenha mostrado ser totipotente”, tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do girino natatório. Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon, podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus. Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito, se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não está acostumado. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente, enquanto alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades foram vistas em muitas células de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. Quando núcleos do endoderma de girinos de Rana pipiens, no estágio de broto caudal, foram tratados dessa maneira, 62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram até a geração de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos núcleos conseguiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas maneiras. Primeiro, reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvimento. Segundo, facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio. Em outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos, existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes. Certamente, muitos genes não usados na pele ou em células sangüíneas, podem ser reativados para produzir os nervos, o estômago, ou o coração de um girino natatório. Assim, cada núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes.

Informações adicionais

&

Especulações

Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro

C

LONAR SERES HUMANOS a partir de células previamente diferenciadas parece ser o objetivo de editores de jornais e novelistas. Deve ter ficado óbvio da discussão precedente que clonar um indivíduo totalmente desenvolvido, a partir de células diferenciadas, é uma formidável tarefa. Mesmo em anfíbios, os núcleos das células diferenciadas não foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em células ativadas e enucleadas. Além disso, mesmo se rãs adultas pu-

dessem ser geradas de núcleos diferenciados, essa habilidade não poderia ser extrapolada para células humanas. Além das dificuldades éticas e técnicas do trabalho com o organismo humano, o citoplasma do oócito humano pode não responder a sinais emitidos por um núcleo de uma célula em estágio avançado. Transplante nuclear foi conseguido em camundongos, pela remoção de pronúcleos (haplóides) de espermatozóide e óvulo de um zigoto, e substituição por pronúcleos de outro (Figura 2.8; McGrath e Solter,

1983). Esses zigotos reconstruídos começam a se dividir e são então implantados no útero. Os camundongos resultantes exibem o fenótipo do núcleo doador. Enquanto mais de 90 porcento dos zigotos enucleados do camundongo, recebendo pronúcleos de outros zigotos, se desenvolvem até o blastócito (blástula), nem um único embrião (de 81), desenvolveu-se até esse estágio quando núcleos de embriões de 4 células foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter, 1984). Similarmente, núcleos de embriões de 8 células

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

(C)

(B)

(D)

Figura 2.8

Procedimento para transferir núcleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Um embrião de célula única, incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesqueleto, é seguro com uma pipeta de sucção. Os núcleos haplóides derivados do espermatozóide e do óvulo, não se juntaram ainda. A pipeta de enucleação perfura a zona pelúcida (a proteína que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a área da célula contendo os pronúcleos. (A) A pipeta de enucleação é retirada e o citoplasma contendo os pronúcleos é removido do ovo. A membrana celular não está rompida; a continuidade do citoplasma limitado pela membrana está indicada pela flexa. (B) A membrana celular forma uma vesícula ao redor dos pronúcleos no interior da pipeta de enucleação. (C) Essa vesícula é misturada com vírus Sendai (que induz a fusão de membranas nucleares) e é inserida no espaço entre a zona pelúcida e o outro ovo enucleado. (D) O vírus Sendai proporciona a fusão do ovo enucleado e os pronúcleos envoltos pela membrana, permitindo que os pronúcleos (flexa) penetrem na célula. (Segundo McGrath e Solter, 1983; cortesia dos autores.)

po de ativação e implantação uterina. Usando modificações técnicas, Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de núcleos transplantados de blastômeros do estágio de 8 células; núcleos de embriões pré-implantados de gado, porcos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para oócitos ativados e enucleados (Prather et al., 1987; Stice e Robl, 1988; Prather et al., 1989; Willadsen, 1989). Porém, em todos esses casos, os núcleos vieram de embriões pré-implantados. Recentemente, Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que é possível clonar um carneiro a partir de um núcleo de célula de glândula mamária adulta. Esse resultado poderá ter importantes conseqüências agrícolas e legais (Prather, 1991). [gene4.html] Clonagem de Plantas Somente nas plantas os núcleos de células diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capazes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em células de cenouras ou tabaco. Em 1958, F. C. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferenciados de raízes de cenouras podiam dar origem a toda uma nova planta (Figura 2.9). Pequenos pedaços de floema são isolados da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco. Esse fluido (é realmente o endosperma da semente do coco) contém os fatores e nutrientes necessários para o crescimento da planta e os hormônios exigidos para a diferenciação. Sob essas condições, os tecidos proliferam e formam uma massa

e massa celular interna (os blastômeros que formam o embrião, mas não a placenta*) também não puderam apoiar o desenvolvimento. Em contraste com núcleos de ouriços-do-mar ou anfíbios, os núcleos dos blastômeros precoces do camundongo
*Cada blastômero da massa celular interna é totipotente no sentido de reter sua capacidade de formar células de qualquer tipo no organismo. Essa capacidade permite o aparecimento de gêmeos.

(cujas células são totipotentes) não dão suporte para o desenvolvimento total. Tais experimentos provavelmente fracassam porque núcleos de blastômeros não funcionam de maneira normal no citoplasma zigótico. Por isso, a clonagem de Elvis Presley a partir de células diferenciadas não é algo com que possamos contar. Nem todos blastômeros mamíferos são os mesmos, todavia, as espécies mamíferas diferem muito em termos de temFigura 2.9

Experimento de Steward demonstrando a totipotência de células do floema da cenoura. Células livre do calo continuam a se desenvolver em suspensão Floema de raiz Corte transversal da raiz Planta jovem Planta embrionária transferida para meio de cultura de agar Planta de cenoura madura no agar

Planta de cenoura madura

Proliferação de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

47

desorganizada chamada calo. A continuação da rotação leva ao desbastamento de células individuais do calo para o meio de suspensão. Essas células dão origem a nódulos celulares semelhantes a raízes que continuam a crescer enquanto permanecem em suspensão. A partir desses nódulos, colocados em um meio solidificado com agar, o resto da planta é capaz de se desenvolver, formando uma planta

de cenoura completa e fértil (Steward et al., 1964; Steward, 1970). Porém, plantas e animais se desenvolvem de maneira diferente; a propagação vegetativa de plantas por corte (i.e, porções de plantas que quando nutridas, regeneram as partes faltantes) é uma prática agrícola comum. Além disso, em contraste com anfíbios e mamíferos (nos quais as células germinativas

são destacadas como uma linhagem distinta de células no início do desenvolvimento), as plantas normalmente derivam seus gametas de células somáticas. Portanto, não é tão surpreendente que uma única célula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de células e formar um clone geneticamente idêntico (clone, do grego klon, significando “ramo”).

Sobre E. coli e elefantes: O modelo operon
Na maioria dos casos estudados, o genoma é o mesmo de célula para célula no organismo. Os genes para a proteína globina podem ser encontrados em células da pele, e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurônios cerebrais. Porém, isso ainda deixa sem resposta outra grande questão levantada pelos embriologistas: Se o núcleo de cada célula no organismo tem os mesmos genes, como podem esses genes fazer com que essas células se tornem diferentes? *Pouco tempo após a 2a Guerra Mundial, muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. É o problema repetidas vezes declarado, porém, até agora não resolvido, de como células com genomas idênticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de confeccionar moléculas com novos, ou no mínimo, diferentes padrões ou configurações específicos. Curiosamente, essa citação vem de Jacques Monod (1947), um geneticista microbiano trabalhando na síntese de enzimas adaptativas, que são proteínas que embora não sejam usualmente sintetizadas por bactérias ou levedos, serão sintetizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. Por exemplo, a bactéria Escherichia coli só sintetiza β-galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose, quando encontram a lactose. Se a lactose está ausente do citoplasma, essas enzimas não são sintetizadas. Mas, com a introdução de lactose no citoplasma, esse grupo de novas enzimas aparecem. Em micróbios, ao menos, o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmáticos funcionalmente diferentes, dependendo da presença ou não de determinado composto (no caso, a lactose). Monod lançou a hipótese que o fenômeno da adaptação enzimática podia oferecer a solução para o problema de como genomas idênticos podem sintetizar diferentes moléculas “específicas”.

*A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é discutida no Capítulo 10. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas, mas em linfócitos, algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O terceiro desafio - a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi prontamente compreendida, uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expressão gênica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada.

48

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam explicar a diferenciação multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. O problema da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos tecidos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais. A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos, mas como “produção controlada de padrões enzimáticos únicos”. Essa redefinição focaliza a atenção para a relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. Além disso, a síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida como uma “indução”. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação de outra. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”. Spiegelman via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião e a indução de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html] No fim da década de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a conceitos embriológicos. Julgavam ser válida a extrapolação, e apelaram para a unidade da natureza e, em última análise, as regras simples que esperavam encontrar. Como sugerido por Monod (veja Judson, 1979), se alguém entender a bactéria, entenderá o elefante. Muitos embriologistas, porém, permaneceram cépticos a respeito da extrapolação de bactérias a embriões, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversidade da performance embriológica. Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase levando à construção do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10). Em sistemas indutivos, uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor que inciaria a transcrição. Estando presente, o indutor liga-se à proteína repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. Com isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando proteína. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, dependendo da presença ou não do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961, Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser parte da regulação gênica universal. Eles conectaram seus resultados ao “problema fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”. O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. O livro de Waddington (1962), Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento, começa com um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Waddington aprovou especialmente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos, mas reativos, respondendo às mudanças no citoplasma. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi também salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), síntese de embriologia com genética por John Moore, que conclui: Na geração anterior, poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a síntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possível por estudos com a bactéria Escherichia coli. No entanto, essa criatura microscópica, sem embrião próprio, mostrou um caminho. Na próxima década, poderá ser difícil perceber a diferença entre um geneticista e um embriologista, à medida que eles avançam em sua ciência para além daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

49

(A) O operon lac

Figura 2.10

Gene indutor

Promotor Operador

Genes estruturais para utilização da lactose

(B) Quando não há lactose disponível Genes estruturais

Proteína repressora produzidas por i liga-se a o (C ) Quando a lactose está disponível

Não há transcrição de genes estruturais

Regulação diferencial de genes em E. coli. (A-C) No estado induzível de tipo-selvagem, não há transcrição de RNA de β-galactosidase a não ser que a lactose esteja presente. (B) Quando a lactose não está disponível, uma proteína repressora produzida pelo gene i liga-se ao sítio repressor (o), inibindo a transcrição pela RNA polimerase do promotor (p). (C) Quando o indutor lactose está presente, combina com a proteína repressora, alterando sua forma, o que faz com que a proteína não possa mais se ligar ao DNA operador , fazendo começar a transcrição. (D) A solubilidade dessa proteína é demonstrada em estudos com o mutante de E. coli. Quando células bacterianas haplóides com um gene indutor nãofuncional (i-) são tornadas parcialmente diplóides com o gene tiposelvagem (i+), forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutível o gene original da β-galactosidase.

Genes estruturais

Lactose mRNA

RNA polimerase β-galactosidase mRNA é transcrito

Lactose combinando com o repressor, previne ligação a o

(D) O repressor da lactose é solúvel Genes estruturais

O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausência de lactose Genes estruturais

Síntese diferencial de RNA
A desejada unificação não ocorreu tão rapidamente como esperado por Moore. Porém, baseado na evidência embriológica a favor da equivalência genômica e do modelo do operon de E. coli, emergiu na década de 1960 um consenso de que as células regulam seu desenvolvimento através da expressão gênica diferencial. Como bactérias eram os modelos para tal atividade, expressão em geral significava transcrição de mRNA. Os três postulados da expressão gênica diferencial eram os seguintes:

50

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

1. Cada núcleo celular contém o genoma completo estabelecido no ovo fertilizado. Em termos moleculares, os DNAs de todas as células diferenciadas são idênticos. 2. Os genes não-usados das células diferenciadas não são destruídos ou mutados, retendo o potencial de serem expressos. 3. Só uma pequena porcentagem do genoma está sendo expressa em cada célula, e uma porção do RNA sintetizado é específica para aquele tipo de célula. Os dois primeiros postulados já foram discutidos. O terceiro – que só uma pequena parte do genoma está ativo produzindo produtos específicos dos tecidos – foi primeiro testado em larvas de insetos. Após a eclosão, uma larva de inseto tem duas populações celulares diferentes, formadas por cerca de 10.000 células. A maior parte tem cromossomos politênicos. Tais cromossomos sofrem replicação de DNA na ausência de mitose, contendo portanto 512 (29), 1024 (210), ou mesmo mais hélices duplas paralelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2.11; Prancha 31). Essas células não sofrem mitose, e crescem expandindo seu volume até 150 vezes. Durante a metamorfose, tais células morrem sendo substituídas por células diplóides não politênicas agrupadas em certas regiões da larva (veja Capítulo 19). Beermann (1952) mostrou que o padrão de distribuição das bandas de cromossomos politênicos era idêntico ao longo da larva e que não se notavam perdas ou adições de qualquer região cromossômica quando diferentes tipos de células eram comparados (Figura 2.12). Porém, Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila, acharam regiões cromossômicas que estavam “estufadas”. Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido; seu aparecimento mudava com o desenvolvimento dessas células (Figura 2.13). Ainda mais, alguns tufos podiam ser

Figura 2.11

Cromossomos politênicos. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros, formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH), aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designadas nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de um cromossomo politênico de Drosophila. As bandas escuras estão altamente condensadas comparadas com as regiões interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung; B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.)
Aldox

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por hormônios (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978). Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxamento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2.14) e que são sítios de síntese ativa de RNA. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encontradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura 2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda; esse tufo não existia nos não-produtores. O cruzamento de produtor com não-produtor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. Cruzando duas moscas híbridas, a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor. Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo), produtores intermediários tinham apenas um, e não-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informação genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma região estufada.

(A)

Glândula salivar (B)

Túbulos de Malpighi

Tecido retal

Intestino

Figura 2.12

Identidade genômica em cromossomos politênicos. (A) Uma região do conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constância do número de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridização do RNA de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval de Drosophila. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar, apesar da proteína não ser aí sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink.

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.13

Seqüência de estufamentos de uma porção do cromossomo 3 da glândula salivar de Drosophila melanogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115 horas; (D,E) estágio pré-pupa (após 4 horas). Notar o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B. Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, porém, a maioria não estufa de modo algum durante o período. (Cortesia de M. Ashburner.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

Prova adicional de que tufos cromossômicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. O BR2 pode ser isolado por microdissecção devido seu tamanho excepcional, e seus produtos podem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt, 1975). A Figura 2.16 A, B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. tentans. Transcrição de BR2 foi demonstrada incubando glândulas salivares isoladas com precursores de RNA

(A)

(B)

Figura 2.14

Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula salivar de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de preparações coradas, mostrando o extenso tufo no cromossomo politênico. (B) Diagrama da região passando por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U. Grossbach; B segundo Beermann, 1963)

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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BR4(SZ)
Alto produtor Não-produtor

BR2
Todos produtos intermediários

BR1

BR3
Alto produtor (A) (B) (C) Produtores Intermediários Não-produtor

Figura 2.15

radioativos. O RNA radioativo pôde, em seguida, ser extraído da porção BR2 do cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande – cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente hibridizado para a região BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas, indicando que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA transcrito de uma banda específica de DNA, que estufa na glândula salivar larval, pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos.

Correlação de padrões de estufamento com funções especializadas nas células das glândulas salivares de Chironomus pallidivitatus. (A) Cromossomo de uma célula produzindo uma secreção granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromossomo 4 de uma célula salivar, mostrando somente anéis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3). (C) Evidência genética que a síntese de uma importante proteína salivar depende da formação de tufos BR4(SZ). Larvas com altos níveis de secreções granulares têm células salivares glandulares com tufos BR4(SZ) em ambos cromossomos 4 (coloridos), enquanto larvas sem essas secreções não têm tais tufos. Produtores intermediários têm somente um cromossomo 4 com uma região estufada BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a secreção. (A e B segundo Beermann, 1961, cortesia de W. Beermann.)

(A)

(B) BR 2

Figura 2.16

(C)

(A,B) Isolamento da região BR2 de Chironomus tentans por micromanipulação. O cromossomo intacto 4 pode ser dividido em três regiões, uma contendo BR2. (C) Transcrição da região BR2 mostrado por uma auto-radiografia in situ após hibridização do BR2 RNA com a preparação cromossômica. (A e B de Lambert e Daneholt, 1975; C de Lambert, 1972; fotografias cortesia de B. Lambert.)

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Portanto, os tufos nos cromossomos salivares estão produzindo mRNA ativamente. Em células que sintetizam essa proteína, o gene está ativado; em células que não usam essa proteína, o gene permanece reprimido.

Hibridização de ácido nucléico
Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politênicos de Chiromonus. E embora esses genes dos tufos eram ativos em células que já se haviam diferenciado (como aquelas da glândula salivar), não eram os genes causadores da diferenciação celular. Para encontrar e analisar os genes que são responsáveis pelo desenvolvimento embrionário, novas técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas. A maioria das técnicas para análise de genes eucariotos baseia-se na hibridização de ácidos nucléicos. Essa técnica envolve fortalecimento de pedaços de fitas simples de RNA e DNA, para permitir a formação de híbridos de fitas duplas. Por exemplo, se o DNA é cortado em pequenos pedaços e cada pedaço dissociado em duas fitas simples – desnaturado – cada fita na solução deverá achar e reunir-se com seu parceiro complementar, quando lhe é dado tempo suficiente para isso. As condições de renaturação devem ser tais que ligação específica entre fitas complementares seja mantida e combinações não específicas sejam dissociadas. Isso é, em geral, conseguido variando a temperatura ou as condições iônicas da solução em que ocorre a renaturação (Wetmur e Davidson, 1968). De maneira semelhante, RNA sintetizado a partir de uma região particular do DNA poderia ser esperado ligar-se à fita do qual foi transcrito (Figura 2.17). Assim, RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. Para medir essa hibridização, uma das fitas de ácido nucléico (a sonda) é em geral marcada pela incorporação de nucleotídeos radioativos. Um problema técnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridização de ácidos nucléicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioatividade na molécula de RNA. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cópia complementar de DNA (cDNA) na presença de precursores radiativos. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA, uma extensão curta de DNA (chamado de iniciador ou primer), precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2.18). O DNA é sintetizado in vitro, não sendo necessário preocupar-se com a diluição

(A)

Condições de desnaturação (calor, álcali)

Condições de re-anelamento

Figura 2.17

Hibridização de ácidos nucléicos. (A) Se a hélice de DNA for separada em duas fitas, essas devem se re-anelar sob condições adequadas de força iônica e tempo. De maneira semelhante, se o DNA for separado em suas duas fitas, o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam. Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparação com o DNA, o RNA irá substituir uma das fitas de DNA nessa região.

(B)

RNA

Desnaturar; adicionar RNA (em grande quantidade em comparação com DNA)

RNA hibridiza com uma fita de DNA

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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dos precursores radiativos. Além disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA, tornando-o extremamente útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos.[other.html#gene6]

mRNA Anelar iniciador mRNA

Clonagem de DNA genômico
Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as técnicas de sua época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embriões. Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: Porque não é somente o núcleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas certas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para análise; essa seria uma pré-condição para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o material hereditário) com mais minúcias que o morfologista. Entretanto, desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regiões específicas do cromossomo. A técnica principal para isolar e amplificar genes individuais é chamada clonagem de genes. A primeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaços distintos, por incubação de DNA com uma endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). De modo geral, essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências específicas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por exemplo, quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens, cepa H), o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência GGATCC. Os produtos são fragmentos de DNA de vários tamanhos, todos terminando com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaços são freqüentemente chamados de fragmentos de restrição.

Transcriptase reversa mRNA cDNA Álcali

cDNA

Figura 2.18

Método para preparar DNA complementar (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn) no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no Capítulo 12); por isso, o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resíduos de desoxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Transcriptase reversa em seguida, transcreve uma fita de DNA complementar, começando no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado aumentando o pH da solução, dessa maneira, desnaturando o híbrido de dupla fita e clivando o RNA.

Tabela 2.1 Sítio enzimático*

Enzimas de restrição comumente usadas Derivação Reconhecimento e clivagem

EcoRI BamHi HindIII SalI SmaI HhaI HaeIII AluI

Escherichia coli Bacillus amyloliquifaciens Haemophilus influenzae Streptomyces albus Serratia marcescens Haemophilus haemolyticus Haemophilus aegyptius Arthrobacter luteus

G AA T T C C T TAA G G G AT C C C C TAG G A AG CTT TTC GA A G TC GAC CAG C T G CCC GGG GGG CCC GCG C C GCG GG CC CC GG AGCT T C GA

* Todos os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição têm um centro de simetria. A seqüência de dupla fita lida em uma direção é idêntica à seqüência lida da frente para trás na outra direção.

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

O próximo procedimento na clonagem do gene é incorporar esses fragmentos de restrição em vetores de clonagem. Usualmente esses vetores são moléculas circulares de DNA, replicadas em células bacterianas, independentemente do cromossomo bacteriano. São usados plasmídeos resistentes a drogas ou vírus especialmente modificados (que são muito úteis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). Por exemplo, um vetor pode ser construído contendo apenas um sítio sensível à BamHI. Esse vetor pode ser aberto por incubação com essa enzima de restrição. Após a abertura, ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano, produzidos também por BamHI. Em muitos casos, os pedaços do DNA cortado serão incorporados a esses vetores (porque seus terminais são complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente, colocando-os em uma solução contendo a enzima DNA ligase. O processo total fornece plasmídeos bacterianos, cada um contendo um único pedaço de DNA humano. Esses são chamados plasmídeos recombinantes ou, geralmente, DNA recombinante (Cohen et al.,1973; Blattner et al., 1978). O plasmídeo ilustrado na Figura 2.19 é pUC18, um vetor freqüentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing,1982). Ele contém (1) um gene resistente a drogas, AmpR, que torna a bactéria imune à ampicilina e permite ao pesquisador selecionar aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo; (2) uma origem para a replicação de DNA, permitindo ao plasmídeo replicar centenas de vezes em cada bactéria; e (3) um poli-ligante, um pedaço curto de DNA artificial que contém os sítios enzimáticos de restrição para várias dessas endonucleases. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a ß-galactosidase de E. coli. O poli-ligante é suficientemente curto (e tem o número correto de pares de bases) de modo a não interferir com a atividade enzimática da β-galactosidase. O processo de clonagem começa quando os fragmentos de restrição do DNA nuclear são misturados aos plasmídeos abertos pUC18 e a eles são ligados, ocasionando o fechamento do plasmídeo. Os plasmídeos recombinantes putativos assim formados são então incubados com células de E. coli sensíveis à ampicilina e sem o gene da β-galactosidase. Mesmo que as bactérias e os plasmídeos sejam misturados em condições que encorajam as bactérias a incorporar os plasmídeos, nem todas as bactérias incorporam um plasmídeo. Para evidenciar aquelas bactérias que incorporaram plasmídeos, as células tratadas de E. coli são cultivadas em ágar contendo ampicilina. Somente aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo (com seu gene dominante, ampicilina-resistente) sobrevivem. Mas nem todos plasmídeos incorporaram um gene estranho, porque é possível que os “terminais adesivos” do sítio da enzima de restrição sofram uma renaturação entre si mesmos. Para distinguir entre colônias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que não o fizeram, o ágar também contém um corante chamado Xgal. Esse composto é incolor, mas quando transformado pela β-galactosidase forma um precipitado azul *.Assim, se um plasmídeo não incorporou um fragmento de restrição ao sítio de enzima de restrição no poli-ligante, o gene da β-galactosidase (lacZ) está funcional e a β-galactosidase resultante torna o corante azul. O resultado é o aparecimento de “colônias azuis”. Entretanto, se o plasmídeo incorporou um fragmento de DNA, o gene da β-galactosidase é destruído pela inserção. Essas bactérias não vão produzir a cor azul do corante; produzem colônias incolores no ágar. Colônias incolores são então selecionadas quanto a presença de um gene específico. Células de cada uma dessas colônias são colocadas em um finíssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. Quando essas células são lisadas, seu DNA adere aos filtros. Em seguida, as fitas de DNA são separadas por aquecimento, e os filtros incubados em uma solução contendo o RNA radioativo (ou sua cópia de cDNA) do gene que se

*O corante é 5-bromo-4-cloroindol, e é azul a não ser quando está complexado com uma molécula como galactose. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformação azul.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Sítio Hind III

Sítio BamHI

Sítio Eco RI Poli-ligante

Plasmídeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleolítica por BamHI

Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmídeo

Plasmídeo recombinante com gene lacZ interrompido

DNA humano Quebra endonucleolítica por BamHI Mistura com bactérias (lacZ–, sensível à amp.)

Figura 2.19

Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a inserção de uma seqüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI.

“Colônias incolores”

quer clonar. Em alguns casos, a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida, devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da proteína). Se o plasmídeo contém aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. Portanto, somente aquelas áreas serão radioativas. A radioatividade nessas regiões é determinada por auto-radiografia. Filme sensível a raios-X é colocado sobre o papel tratado. Os elétrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, sensibilizam os grãos de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme é revelado. Finalmente, uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2.19). Essa colônia é então isolada e cultivada, produzindo bilhões de bactérias, cada uma contendo centenas de plasmídeos recombinantes idênticos. Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por centrifugação, e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contém o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmídico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA purificado contendo o gene específico. Apesar desse procedimento parecer muito lógico e fácil, freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômico. O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero, milhões de clones individuais devem ser selecionados.
*Complexidade se refere ao número de diferentes tipos de genes no núcleo. Apesar que milhões de clones precisam ser selecionados, aproximadamente 100.000 colônias podem, agora, ser selecionadas em uma única placa. Outra maneira comum de selecionar os clones é usar um plasmídeo que tem seu sítio da enzima de restrição próximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para ß-galactosidase). As bactérias transcreverão o cDNA e o traduzirão em proteína. Após a lise das colônias bacterianas no papel de filtro, as proteínas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra àquela proteína. Isso é chamado clonagem de expressão, e os plasmídeos referidos como vetores de expressão.

Meio contendo ampicilina “Colônias azuis” Aplicação das colônias “incolores” nos círculos do papel de filtro; lisar para expor o DNA

mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado

Preparação de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um híbrido com o DNA radioativo

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Hibridização de DNA: entre e intra espécies
Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotídeos radioativos. Portanto, os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espécies. Uma das descobertas mais excitantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos específicos de desenvolvimento em um organismo, podem ser usados para processos similares em outro organismo. Drosophila teve uma importância crítica na descoberta desses genes. Iniciando com Morgan, esses genes foram mapeados e, nos anos 60, E. B. Lewis confirmou que alguns desses genes são responsáveis pela formação de partes básicas do corpo (veja Capítulo 14). Um deles, Antennapedia, é um gene cujo produto protéico é essencial para inibir a formação de estruturas da cabeça no tórax. Se o gene não está presente, antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Se o gene é expresso na cabeça (como sucede em um mutante específico), a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14.28). Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidências desses genes em vertebrados apareceram em transferências de DNA, algumas vezes chamadas de transferências Southern devido a seu inventor, E. M. Southern (1975). DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados, foram tratados com uma enzima de restrição, e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel. As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel, que foi em seguida submetido à uma corrente elétrica. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direção ao pólo positivo, os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. * Como a hibridização não pode ser feita dentro do gel; o DNA deve ser colocado em uma superfície plana, e isso é feito por transferência. Após a desnaturação das fitas de DNA em álcali, os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro úmido suportado por uma estrutura de plástico (Figura 2.20; Mc Ginnis et al., 1984; Holland e Hogan, 1986). Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita única) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com múltiplas camadas de papel-toalha secas. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicação com o interior de uma cuba contendo tampão de alta força iônica. O tampão caminhou para cima através do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. O DNA também foi levado por esse fluxo de tampão, mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose; assim, o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. Após fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles
*Considerando a mesma relação carga/massa, fragmentos menores adquirem uma maior velocidade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Isso é uma função da equação de energia cinética, E=1/2 mv2. Resolvendo para velocidade, encontramos que ela é inversamente proporcional à raiz quadrada da massa. Filtro de nitrocelulose ou nylon Espaçadores Desnaturar fragmentos de DNA à fitas simples em álcali Papel-toalha Contatos de papel de filtro Peso

Figura 2.20

Transferência Southern. DNA é tratado com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são colocados em um gel e separados por eletroforese. Após a separação, o DNA é desnaturado em fitas únicas. O gel é, em seguida, colocado sobre um papel de filtro saturado com tampão de alta força iônica. Papel de nitrocelulose ou um filtro de nylon é colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel. O tampão de transferência atravessa o gel, o papel de nitrocelulose e as toalhas por ação capilar, levando junto o DNA. O DNA de fita única é retido pelo papel de nitrocelulose. As posições do DNA no papel diretamente refletem a posição dos fragmentos de DNA no gel.

Suporte Cuba com solução tampão Gel Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso

Digestão com restrição e eletroforese em gel de agarose

Colocar gel no papel de filtro úmido entre 2 espaçadores

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Figura 2.21

Transferência Southern do DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. Não se espera que as seqüências de espécies tão diversas sejam perfeitamente idênticas e por essa razão o rigor da hibridização é diminuído trocando as soluções salinas. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferências ao longo dos filos é chamado “transferências de zoológico”, por razões óbvias). Autoradiografia mostra que os genes de Drosophila contêm várias porções que são como as do gene Antennapedia em termos de estrutura; também, muitos organismos contêm vários genes que formarão híbridos com esse fragmento gênico radioativo, sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os números ao lado das transferências indicam os tamanhos das bandas, em quilobases. (de McGinnis et al.,1984, cortesia de W. McGinnis.)

Drosophila Besouro melanogaster 10 10

Galinha Camundongo

Ubx ftz

10

10

3

3

3 3

Antp 1 1 1 1

se desprenderiam), o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma porção do gene Antennapedia de Drosophila. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. Os resultados desses experimentos (Figura 2.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos, humanos e pintos) têm genes que hibridizam com essas seqüências. Essa secção radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genômica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espécies. Como veremos no Capítulo 16, pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia; esses genes se mostraram extremamente importantes na formação do eixo do corpo dos vertebrados.

Seqüenciamento de DNA
Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codificada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em comum. A simplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger et al.,1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia molecular. No início, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita única do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqüências dos vetores são conhecidas, iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais nucleotídeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador juntamente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polimerase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G, outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2.23. Enquanto o desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu açúcar, o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbonos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo. Assim, quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador, o novo DNA será complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto, sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a cadeia pára. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G é inserido. (O processo foi comparado à uma dança folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial tem um braço em uma tipóia).

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Fita única desnaturada de DNA de plasmídeo recombinante

Iniciador

Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. coli + dATP, dGTP, dCTP e dTTP

Seqüência da fita do iniciador Seqüência complementar Fragmentos maiores

Fragmentos menores

Figura 2.22

O método didesoxi de seqüenciar DNA. A fotografia contém a região da auto-radiografia que mostra essa seqüência (Cortesia de G. Guild).

Adenina

Adenina

Base 1

Base 2 Adenina Desoxiadenosina trifosfato (açúcar desoxirribose) (A) Didesoxiadenosina trifosfato (açúcar didesoxirribose)

(B)

Figura 2.23

Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotídeos. A diferença é evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerização do DNA.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão uma população de cadeias, algumas interrompidas no primeiro sítio possível, outras no último e algumas em sítios intermediários. O tubo com didesoxi-A, por exemplo, conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o resíduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletroforese. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüência de nucleotídeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a seqüência do DNA complementar àquela do gene clonado.

Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA
Agora podemos retornar à especificidade da transcrição de mRNA: É possível isolar populações de mRNA que caracterizam certos tipos de células e estão ausentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs, podemos “clonar” os mRNA de diferentes tipos de células e compará-los. Como mostra a Figura 2.24A, isso é feito tomando os RNAs mensageiros de uma célula ou tecido e convertendo-os em fitas de DNA complementar. Levando esse procedimento um passo à frente (com o auxílio de DNA polimerase e S1 nuclease), podemos transformar essa população de cDNA de fita única em outra contendo pedaços de cDNA com fitas duplas. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmídeos, adicionando-lhes “finais” apropriados com DNA ligase. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedaço de DNA cria-se um corte artificial de restrição BamHI, o que permite a inserção em um vírus ou plasmídeo clivado por essa enzima (Figura 2.24B). Tais coleções de clones derivados de mRNAs são freqüentemente chamadas de bibliotecas. Assim, podemos ter uma biblioteca de fígado de embrião de camundongo de 16 dias, representando todos os genes ativos produzindo proteínas hepáticas embrionárias. Podemos ter também uma biblioteca de oócitos vegetais de Xenopus, representando mensagens presentes somente em uma parte específica daquela célula. Genes clonados dessa maneira são muito importantes porque eles não têm íntrons. Quando adicionados às células bacterianas, esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas proteínas que codificam. Bibliotecas têm sido extremamente úteis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforços de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenças nos RNAs de diferentes partes do embrião, em gastrulação, do ouriço-do-mar. Para encontrar mRNAs específicos do endoderma em ouriço-do-mar, Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embriões gastrulantes. O mRNA dessas amostras (a maior parte do RNA de células eucarióticas é ribossômico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT, as quais capturam as caudas de poli(A) das mensagens (veja legenda da Figura 2.19). A população de mRNA foi, então, convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2.24A). Usando polimerase I de E. coli o cDNA de fita única foi transformado em fita dupla. No próximo passo, os cDNAs de fita dupla foram ligados a “finais” de EcoRI que estão disponíveis no comércio. Isso os tornou clonáveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrição EcoRI. O DNA foi misturado com os braços de um fago λ geneticamente modificado (veja Figura 2.24B). Esse fago é construído de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri, os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruíram o gene da ßgalactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24C). Dessa forma, foram gerados aproximadamente 4 milhões de fagos recombinantes, cada um contendo um cDNA representando uma molécula de mRNA. O próximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Quais deles representariam mRNAs encontrados no endoderma e não em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populações de mRNAs do mesoderma, ectoderma e endoderma. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populações de mRNA, usando precursores radioativos. Agora, possuíam três coleções de moléculas

62

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

Preparação de cDNA clonável Região codificadora mRNA Anela iniciador oligo (dT)

(B)

Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ)

DNA de fago λ

BamHI Região codificadora mRNA Transcriptase reversa “Braço esquerdo” “Braço direito”

cDNA mRNA Hidrólise alcalina cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago λ; ligar Não é necessário para a replicação do fago Braços contêm todos os genes necessários para a replicação, mas muito pequeno para o empacotamento

cDNA

DNA polimerase I Região codificadora cDNA

S1 nuclease Região codificadora Fita dupla cDNA Adicionar finais Bam HI

cDNA do mRNA, agora clonado em vetores virais

de cDNA radioativos, cada uma representando a população de mRNA de uma das três camadas germinativas. Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrião, em gastrulação, do ouriço-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colônias— cada uma contendo milhares de fagos— colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2.24D). O conjunto foi colocado em solução de álcali para a lise dos fagos e obtenção de DNA de fita única. Um desses papéis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma; o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos, mesoderma e ectoderma. Os filtros foram lavados para a remoção de cDNA radioativo não hibridizado, secos e expostos em filmes para raios-X. Se um mRNA estivesse presente no endoderma, mas não no ectoderma ou mesoderma, o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e não deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. Como resultado, aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma), mas o mesmo clone não deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodérmico ou mesodérmico; isso foi confirmado. Um fago recombinante, em particular, ligou somente cDNA radioativo produzido

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

63

(C) Preparação da biblioteca de clones do fago

(D) Seleção da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose

Fago híbrido Adicionar à camada de células de E. coli

Filtros de nitrocelulose

Infecção de E. coli pelo fago

Lise Placa Zona de lise indicando clones do fago

Tratar filtros com solução alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado

Camada de bactérias E. coli

Incubar com sonda radioativa para endoderma

Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma

Figura 2.24

Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. (A) RNA mensageiro é isolado e feito seu cDNA, que é em seguida transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrição. (B) Os “genes” cDNA são inseridos em vetores especialmente modificados, nesse caso, bacteriófagos. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisarão E. coli formando placas. Técnicas bioquímicas podem distinguir placas de fagos recombinantes daquelas que não têm o gene inserido. (D) As placas são transferidas para papel de nitrocelulose e tratadas com álcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente. Esses filtros são então incubados com sondas radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. Para a seleção da biblioteca diferencial de cDNA, discutida no texto, a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radioativas de dois tecidos diferentes, permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas não em outro.

Sonda radioativa DNA de fago de fita única ligado ao filtro Preparação dos autoradiogramas

Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas não no mesoderma ou ectoderma

de mRNA do endoderma; portanto, representava um mRNA encontrado no endoderma e não no mesoderma ou ectoderma. O fago contendo esse gene pode agora ser cultivado em grandes quantidades e caracterizado.

Técnicas de localização de RNA
Hibridização In Situ O processo de hibridização in situ, desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970), permite ao pesquisador visualizar as posições de ácidos nucléicos específicos dentro de células e tecidos. Se um clone específico é considerado interessante (por exemplo, o clone endoderma-específico que foi mencionado) ele é cultivado em

64

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

grandes quantidades, e o gene clonado é isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrição. Esse é transformado em fita única e tornado radioativo. Quando o cDNA radioativo é adicionado às células fixadas apropriadamente em lâminas de microscópio, o cDNA radioativo se liga unicamente onde está presente o mRNA complementar. Após eliminação do cDNA não fixado, a lâmina é coberta com uma emulsão fotográfica transparente para auto-radiografia. As manchas resultantes, diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado, parecem escuras quando visualizadas diretamente, ou brancas quando vistas com iluminação em campo escuro. Assim, pode-se visualizar aquelas células (ou mesmo regiões dentro das células) que acumularam um tipo específico de mRNA. A Figura 2.25A,B mostra hibridização in situ usando o cDNA específico para células endodérmicas. O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gástrula precoce do ouriço-do-mar. Continuando a gastrulação, o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa — entre a região do intestino posterior e o intestino médio no tubo endodérmico. Trabalhando com sondas radioativas e emulsões, torna-se necessário o uso de secções microscópicas extremamente finas. Uma técnica mais recente para hibridização in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Dessa maneira, cientistas podem observar órgãos inteiros (e organismos) sem seccioná-los, e com uma visão de amplas regiões de expressão gênica. A Figura 2.25C mostra uma hibridização in situ, realizada em montagem integral, em um embrião de camundongo com 10.5 dias. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na página 40), que sintetiza uma proteína necessária para a produção de células mesodérmicas na parte posterior do embrião de camundongo. Transferências Northern Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). Enquanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel, transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à eletroforese lado a lado, em um gel. Após transferência dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto é incubado em uma solução contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene. Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar. Assim, se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio embrionário, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiografia. Autoradiogramas desse tipo, onde vários estágios são comparados simultaneamente, são denominados transferências Northern de desenvolvimento. A Figura 2.26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. Podemos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. A transferência Northern na Figura 2.26B mostra que a acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et al.,1989). Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evidências em favor da transcrição diferencial de RNA, no espaço e no tempo. A transcrição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo. A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por transferência de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. Para isso eles extraíram o mRNA da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gástrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos. Se houvesse hibridização entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula, significaria que o cDNA era derivado

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

65

(B) (A)

(C)

Figura 2.25

Enzima fosfatase alcalina

Corante (precipitado azul escuro) Núcleo Corante

Anticorpo para biotina Biotina

(incolor) Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resíduos de biotina em suas uridinas

mRNA de Brachyury

Hibridação in situ. (A,B) Fotomicrografias, em fundo escuro, de hibridação in situ, mostrando a localização de mRNA endodermaespecífico em embrião de ouriço-do-mar. O cDNA radioativo usado como sonda foi preparado do gene clonado, feito a partir de mRNA endoderma-específico (veja Figura 2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gástrula precoce do ouriçodo-mar (A) e ao endoderma do intestino médio e posterior da gástrula tardia do ouriçodo-mar (B). (C) Hibridização in situ, em montagem integral, de um embrião de camundongo de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Essa mensagem é transcrita em células formando novo mesoderma, e nesse estágio é encontrada na porção posterior do embrião. Embriões fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada. Após eliminar a parte da sonda que não se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qualquer atividade endógena de fosfatase alcalina do embrião), o embrião foi tratado com anticorpos para biotina. Esses anticorpos foram ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina. Colorir para a presença de fosfatase alcalina permite que se determine a localização de um mRNA específico. Fotografias coloridas da hibridização in situ, em montagem integral, estão nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C do laboratório do autor.)

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

Ovo Clivagem Blástula Blástula Mesenquimatosa Blástula precoce Blástula tardia Prisma Plúteo

(B)

Ectoderma / mesoderma Endoderma

Figura 2.26

Transferência Northern para um gene específico no endoderma do ouriço-do-mar, Lytechinus variegatus. (A) Transferência Northern de desenvolvimento, mostrando acumulação de mRNA de acordo com o estágio específico desse gene. mRNA total (10 µg por estágio) foi submetido à eletroforese em gel de agarose. O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-específico. Mostrou-se que esse mRNA é sintetizado durante o estágio de blástula do mesênquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. (B) Transferência Northern no estágio de prisma, mostrando que o mRNA está presente no endoderma (com algum mesoderma aderido) mas não no ectoderma. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar (pista1). Ligação com cDNA radioativo detectou mRNA somente no endoderma. (de Wessel et al., 1989, cortesia de G. Wessel.)

de um mRNA presente em ambos os estágios, oócito e gástrula. Essas moléculas híbridas com dupla fita foram removidas por filtração, deixando uma população de cDNAs gástrula-específico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. Essa técnica é denominada de clonagem de subtração. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA, a clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é encontrado em alguns estágios, mas não em outros, ou em alguns tecidos mas não em outros (Figura 2.27). Sargent e Dawid usaram embriões, dos estágios de zigoto a broto caudal do girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados diretamente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estágios. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro, DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”, foi marcado radioativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estágio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu complemento nos mRNAs daquele estágio, no filtro. Após eliminacão do cDNA não ligado, a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transferência de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17 genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. Nenhum deles é expresso antes da transição da blástula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39) são expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) começam a ser transcritos na gástrula mediana, após aproximadamente 7 horas. Alguns genes (DG76, DG81) são mantidos após a ativação, enquanto a atividade de outros (DG56, DG21) é muito mais transitória.

Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia
A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse método pode ser usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. O método padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. PCR, no entanto, pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa técnica tem sido extremamente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito pequena. Embriões de camundongos, por exemplo, na fase de pré-implantação têm muito pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Se fosse necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o mRNA para uma proteína determinada, seria muito difícil descobrir usando os métodos padrão de clonagem. Entretanto, a técnica do PCR permite encontrar essa mensagem com poucos embriões, por amplificar especificamente somente aquela mensagem, um milhão de vezes (Rappolee et al., 1988). O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2.29. Os mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a população de DNAs de fita única é transformada em uma população de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hélices do DNA, às quais são adicionados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma porção da mensagem procurada. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüências no DNA, então o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotídeos foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados opostos da seqüência alvo. (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína específica de seqüência conhecida, essas regiões laterais podem ser preparadas,

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

67

Extrair mRNA Oócito mRNA total de oócito Hibridizar

cDNA de gástrula que encontra mensagem complementar em mRNA de oócito

cDNA de gástrula sem seqüência complementar a mRNA de oócitos

Extrair mRNA Gástrula mRNA total de gástrula

Fazer cDNA de mRNA cDNA de gástrula

DNA polimerase S1 nuclease

Figura 2.27

cDNA de dupla fita específico de gástrula Adicionar ligantes

Clonagem de subtração de genes de gástrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gástrula e hibridizado com mRNA de oócitos. Os cDNA de gástrula que não encontraram seqüências complementares nos mRNAs de oócitos, eram produtos de genes ativos na gástrula mas não nos oócitos. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua inserção em veículos de clonagem.

Figura 2.28

Colocar em veículo de clonagem

Transferências de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus estão transcrevendo ativamente. Acumulação específica de mRNA no citoplasma é registrada embebendo mRNA total, de genes em estágios embrionários, em papel de nitrocelulose e incubando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA específico de gástrula. Justapondo essas tiras, obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes específicos. A linha r5 representa um controle de RNA ribossômico que deve estar sempre presente. (de Jamrich et al., 1985, cortesia de I. Dawid e M. Sargent.)
Blástula Estágio Clone Gástrula Nêurula

Plasmídeo recombinante contendo DNA para mRNA específico para gástrula

Broto de cauda

Horas após a fertilização

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Finais da seqüência do polipeptídeo

RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1)

RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2

1 cópia

Primeiro ciclo

Aquecer a 95oC para desnaturar DNA. Esfriar a 37oC para permitir hibridização dos iniciadores a DNA

Quando aquecido a 72o C, taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores 2 cópias Primeiro ciclo de sínteses resulta em duas cópias da seqüência alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores

Segundo ciclo

Estende novas fitas de DNA

4 cópias

Segundo ciclo de sínteses resulta em quatro cópias da seqüência alvo de DNA

Figura 2.29

Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular de mRNA está presente, todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são adicionados. Se a seqüência específica estiver presente, os iniciadores se hibridizarão aos seus terminais opostos. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se procura. Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem, prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando DNA polimerase termoestável de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento. Essas fitas são, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas, iniciando o ciclo novamente. Dessa maneira, o número de fitas novas com a sequência entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente.

sintetizando oligonucleotídeos que codificam o amino terminal da proteína e oligonucleotídeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da proteína). Os finais 3' desses iniciadores estão face a face de modo que a replicação é através do DNA alvo. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador, a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

69

Essa enzima não é a DNA polimerase normal de E. coli; é uma polimerase de bactérias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Essas bactérias vivem em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respiradouros térmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores próximos de 900C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura. O segundo iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométrica. Após vinte turnos, aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milhão). Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava presente na amostra. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern, como na Figura 2.30). Além disso, pode-se usar essas cópias amplificadas para clonagem, colocando-as em vetores de clonagem.
Figura 2.30

Ovário de rato
Adulto

Ovário de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pâncreas de camundongo Pulmão de camundongo

Embrião de 14 dias

Sem adição de DNA

Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporoespacial de expressão, o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene no desenvolvimento. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene, tirando e repondo certos genes de células embrionárias. Pedaços de DNA clonados podem ser modificados (se desejado), e colocados em células por vários meios. Uma técnica muito direta é a microinjeção, na qual uma solução contendo o gene clonado é cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi, 1980). Essa é uma técnica especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura 2.31). Em transfecção, o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em uma solução determinada onde a célula o incorpora. A probabilidade de incorporação de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena, sendo necessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras células que o incorporaram, em condições de cultura onde as outras células são destruídas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981). Outra técnica é a eletroporação, onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA para dentro da célula. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Esses são regiões móveis de DNA, de ocorrência natural, que podem ser integrados no genoma. Retrovírus são vírus contendo RNA. Dentro da célula hospedeira eles produzem uma cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa); a cópia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. A integração é consumada devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais do DNA retroviral. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um retrovírus de camundongo. Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes podem ser colocados. Usando enzimas de restrição apropriadas, o pesquisador pode remover genes de um fago ou plasmídeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais. Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%. Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P. Essas seqüências de DNA, são elementos transponíveis de ocorrência natural que podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila. Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemento P. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila, ele pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982).

Evidência fornecida por PCR, para a síntese de um fator de crescimento, activina, de órgãos embrionários de camundongo. O mRNA desses órgãos foi convertido em DNA e amplificado através de 20 ciclos de replicação. O DNA foi submetido sucessivamente à eletroforese e transferência Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. mRNA de activina foi encontrado no ovário do camundongo adulto (como esperado) e também em vários órgãos embrionários. A possível função de activina nesses orgãos será discutida no Capítulo 17. (Cortesia de O. Ritvos.)

70

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.31

Injeção de DNA (de genes clonados) em um núcleo (neste caso, um pronúcleo de um ovo de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cortesia de T. E. Wagner.)

Camundongos quiméricos As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para todas as células do embrião de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimento do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de células: as células externas, que formarão a porção fetal da placenta, e as células internas, que darão origem ao próprio embrião. Essas células internas são chamadas células embrionárias precursoras (células tronco), porque cada uma delas pode, se isolada, gerar todas as células do embrião (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster, 1972). Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultivadas. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorporar novo DNA. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA, mas a célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce. Assim, a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. O resultado é um camundongo quimérico*. Algumas de suas células são derivadas das células embrionárias precursoras do hospedeiro, mas outra porção de células é derivada também das células precursoras tratadas. Se as células tratadas se tornaram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas serão derivados da célula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem, alguns de seus descendentes levarão, portanto, uma cópia do gene inserido. Os descendentes heterozigotos, no acasalamento produzirão 25% de embriões carregando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al.,1986). Assim, em três gerações — o camundongo quimérico, o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo, está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chamados camundongos transgênicos. Essas linhagens têm sido particularmente úteis na determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes. Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) A análise de embriões precoces de mamíferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutações que afetam a fase inicial do desenvolvimento embrionário. Esse problema foi superado pela técnica chamada de endereçamento de genes (às vezes, chamada de “Knockout”). As técnicas são similares àquelas que produzem camundongos transgênicos, mas em lugar de adicionar genes, endereçar genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa técnica para estudar a função do gene Hoxa3 no desenvolvimento do camundongo. Hoxa-3 é semelhante a vários genes de Drosophila que são conhecidos como controladores da expressão gênica de segmentos específicos no embrião precoce; a proteína codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA, exatamente como sua correspondente na Drosophila. Seria possível que Hoxa3 de maneira similar estaria regulando a expressão gênica espaço-específica nos mamíferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3, cortaram-no com uma enzima de restrição e inseriram nesse sítio um gene para resistência à neomicina (Figura 2.33). Em outras palavras, eles mutaram o gene Hoxa-3 pela inserção de um grande pedaço de DNA que continha um gene resistente à neomicina, destruindo a habilidade da proteína Hoxa-3 em se ligar a DNA. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em células embrionárias precursoras que eram sensíveis à neomicina.

* É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. Um híbrido resulta da união de dois genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de genótipo aa é um híbrido Aa. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente aparecem no mesmo organismo. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de leão, corpo de bode e cauda de serpente.

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

71

Células embrionárias precursoras

Trofoblasto

Cultura de células embrionárias precursoras

Gene clonado no vetor Mistura de células embrionárias precursoras com o gene clonado Seleção de células embrionárias precursoras que incorporaram o transgene

Microinjetar células precursoras transgênicas no embrião hospedeiro

Integração das células no hospedeiro

Injetar no útero Camundongos quiméricos

Figura 2.32

Camundongos transgênicos heterozigotos

Camundongos transgênicos homozigotos

Uma vez dentro do núcleo dessas células, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. Aqui, as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante em lugar da cópia normal. Esse é um evento raro, mas tais células podem ser selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina. A maioria das células morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado sobrevivem. As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de camundongo e se integram nas células do embrião. O camundongo resultante é uma quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células heterozigotas Hoxa-3, das células precursoras. As quimeras são acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à linhagem das células germinativas, alguns dos descendentes serão heterozigotos

Produção de camundongos transgênicos. Células embrionárias precursoras de um camundongo são cultivadas e o genoma alterado pela adição de um gene clonado. As células transgênicas são selecionadas e injetadas em um embrião hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Aqui, as células embrionárias precursoras transgênicas se integram às celulas precursoras do hospedeiro. Esse embrião é colocado no útero de um camundongo fêmea grávida e se desenvolve em um camundongo quimérico. Se as células precursoras doadoras contribuíram para a linha germinativa, e o camundongo quimérico é cruzado com um do tipo selvagem, parte dos descendentes serão heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem de camundongos que é homozigota ao alelo adicionado. Essa seria uma linhagem transgênica. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucariótica.

72

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A) Massa celular interna Blastócito neo r Cultura de células embrionárias precursoras (ES)

Eletroporação

Recombinação homóloga Célula precursora embrionária

(B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrição gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Hoxa-3

Figura 2.33

Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo é o Hoxa-3. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima de restrição, e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio de ligação da proteína ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em células ES, onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia mutada. As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina. (C) As células ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um embrião do tipo selvagem, e o blastócito é retornado ao útero. O camundongo resultante é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3.

Seleção de células ES heterozigotas por sua resistência à neomicína

(C)

Injeção de células ES heterozigotas no blastócito

Injeção dos blastócitos no útero

Produção de camundongos quiméricos

Heterozigotos

Cruzamento de quiméricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3+ Heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯

Homozigoto

para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas tireóide, paratireóide e timo! Dessa maneira, endereçando genes pode-se analisar as funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos. [gene7.html]

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense
Outro método para determinar a função de um gene é fazer cópias “antisense” de sua mensagem. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso, próximo a um vigoroso promotor bacteriano, em outro vetor. O promotor bacteriano iniciará a transcrição da mensagem na “direção errada” quando for incubado com RNA polimerase e nucleosídeos trifosfato. Dessa maneira, é sintetizado um transcrito que é complementar aquele natural (Figura 2.34A). O transcrito complementar é chamado RNA antisense porque é o reverso da mensagem original. Quando grandes quantidades de RNA antisense são injetadas ou transfectadas em células contendo o mRNA normal desse gene, o RNA antisense se liga à mensagem normal; o ácido nucléico dupla-fita resultante é degradado (enzimas do citoplasma das células digerem ácidos nucléicos de fita dupla). Isso causa uma depleção funcional da mensagem, como se houvesse uma mutação eliminatória para aquele gene. Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krüppel de Drosophila. Krüppel é crítico para a formação do tórax e do abdômen da mosca. Se esse gene está ausente, as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torácico e abdominal anterior (Figura 2.34B); uma situação semelhante é criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krüppel são injetados em embriões precoces da mosca (Rosenberg et al.,1985). RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a função dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ação dos genes em animais; de outra forma isso seria inacessível à análise genética.

Figura 2.34

Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos
A união da embriologia com a biologia molecular está permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciação de como trabalham os genes na construção de um organismo. Estamos em meio à uma revolução nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento, e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqüenciamentos é a nova “anatomia” do gene eucarioto. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Capítulo 10, mas é importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam proteínas têm vários sítios regulatórios (Figura 2.35). Um sítio, o promotor, está localizado diretamente a montante do gene (antes do início) e é
(A) mRNA de consenso (sense) Krüppel (B) Embrião mutante Krüppel

Producão de RNA antisense para examinar a função dos genes no desenvolvimento. (A) Produção da mensagem antisense (neste caso, ao gene Krüppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krüppel entre dois vigorosos promotores. Os promotores estão em orientação oposta com respeito ao cDNA do Krüppel. Nesse caso, o promotor T3 está em orientação normal e o promotor T7 está revertido. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacteriófagos T3 e T7, respectivamente). T3 polimerase permite a transcrição de mRNA de consenso, ao passo que T7 polimerase produz transcritos antisense. (B) Resultado da injeção da mensagem Krüppel antisense em um embrião precoce (estágio blastodérmico sincicial) de Drosophila antes que a mensagem Krüppel seja produzida. A figura central é um embrião do tipo selvagem pouco antes de eclodir. Acima está o mutante causado pela falta do genes Krüppel. Abaixo está o embrião do tipo selvagem, injetado com a mensagem Krüppel antisense no estágio embrionário precoce. Ambos os embriões, mutante e o tratado com antisense, não possuem os segmentos torácico e abdominal anterior. (B, de acordo com Rosenberg et al., 1985.)

mRNA antisense Krüppel

T7 RNA polimerase

T3 promotor

T3 RNA polimerase

T7 promotor

Embrião normal

Embrião normal infectado com RNA “antisense” Krüppel

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

o sítio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante, ou ainda em um íntron dentro do gene), está uma segunda região chamada intensificadora. Fatores protéicos que se ligam ao intensificador permitem sua interação com o promotor e, conseqüentemente, com a transcrição do gene pela RNA polimerase. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relacionados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificadores, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e células específicos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. Como veremos no Capítulo 10, a ligação de diferentes fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas idênticos. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3. Como detalharemos no Capítulo 4, ZP3 é a principal proteína ligante de espermatozóide na superfície do óvulo de camundongo. É uma glicoproteína sintetisada pelo oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al.,1989). Uma transferência Northern mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em crescimento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.36). O que permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promotor, 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. Como hipótese, consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica podem existir até mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrição para isolar o DNA da região 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. (Não é necessário dizer que essa enzima produtora de luz não é encontrada em camundongos. Está sendo usada aqui como um “gene repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão.) O gene recém-construído, contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutural para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgênicos, levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória ZP3. Em camundongos transgênicos fêmeas, a hibridização in situ localizou mRNA de luciferinase em um único tipo de célula, o oócito (Figura 2.37). Assim, a seqüência de DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no oócito. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma proteína chamada OSP-1. OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação; ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNA no promotor. Parece, então, que ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momento, está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1.
Figura 2.35

Estrutura básica de um gene regulado pelo desenvolvimento. O promotor da maioria dos genes codificadores de proteínas é encontrado no terminal 5' (a montante) do gene. O intensificador freqüentemente está mais acima, a montante, mas pode ser encontrado dentro de um íntron ou no terminal 3'. Proteínas que se ligam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrição do gene. (No exemplo ZP3, o sítio OSP-1, GATAA, está localizado no promotor, aproximadamente 95 pares de bases a montante do sítio de início da transcrição. Um sítio intensificador sensível a estrogênios é encontrado no primeiro íntron do gene ZP3.)

Intensificador Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon

Intensificador “a montante do gene”

Intensificador “a jusante” do gene

CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Figura 2.36

Transferência Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. RNA de vários tecidos (10µg por pista) e oócitos (125ng) foram submetidos à eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA. A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovário, especialmente dentro dos oócitos. (de Roller et al.,1989, cortesia de P. Wassarman).

Oócito Ovário Cérebro Embrião de 13 dias Coração Intestino

Uma conclusão e um alerta
Depois de quase um século, estamos começando a entender como as células regulam a expressão diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes células. Esse conhecimento está ajudando a explicar como a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos específicos de células do organismo em desenvolvimento. Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é necessário relembrar do Capítulo 1, que a distinção entre talo e esporo (Dictyostelium), estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox) é determinada pelo ambiente. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21), veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação de sexo temperatura-dependente em répteis, desenvolvimento em insetos dependente da dieta, e a diferenciação, dependente de experiência, dos neurônios e linfócitos em mamíferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente, mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo.

Rim Fígado Músculo Testículos Útero

(A)

(B)

Figura 2.37

Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase, quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase, a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. (A) Visão do ovário inteiro (60x). (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo oócitos em maturação. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.)

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

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A base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial

3

Mas a natureza não é atomizada. Sua padronização é inerente e primária, e a ordem subjacente à beleza é nela demonstrada; mais ainda, a natureza só pode ser percebida pela mente humana, porque ela mesmo é parte integrante e majoritária daquela ordem. Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosamente. Salmo 139 (ca. 500 a.c).

U

m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao acaso. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular, mas também sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos. Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. Neste Capítulo, introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvimento criam órgãos funcionais do corpo. Existem quatro questões majoritárias participando do arcabouço de discussões sobre morfogênese: • Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo, os vários tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotoreceptores, neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para permitir que a retina seja funcional? • Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata. A retina seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer, onde a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz. Além disso, os neurônios da retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que analisam a informação visual. Todas essas conexões devem estar precisamente ordenadas. • Como células migrantes atingem seu destino, e como se formam órgãos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça, mas em nenhum outro lugar. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo, se todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos, como o de precursores de nossas células pigmentadas, células germinativas e glândula supra-renal, as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu destino final. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma região específica do corpo? • Como crescem órgãos e suas células, e como é esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas, e as células da retina raramente dividem-se após o nascimento. Nosso intestino, entretanto, está constantemente descartando células e regenerando outras, e 79

80

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

ainda assim, sua velocidade mitótica é cuidadosamente controlada. Se mais células fossem regeneradas do que aquelas descartadas, seriam produzidos crescimentos cancerosos. Se o número de células regeneradas fosse menor, o intestino não poderia digerir o alimento. O que controla essas diferenças na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Existem dois grupos principais de células no embrião: células epiteliais, fortemente ligadas umas às outras em camadas ou tubos, e as células mesenquimatosas, isoladas e funcionando como unidades individuais. A morfogênese nessas duas classes de células se dá através de um limitado repertório de processos celulares: (1) direção e número de divisões celulares; (2) mudanças na forma das células; (3) movimento celular; (4) crescimento celular; (5) morte celular; e (6) mudanças na composição da membrana celular e da matriz extracelular. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre células epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3.1). Parecem existir duas vias principais pelas quais células se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfogênese. A primeira é através de substâncias difusíveis que são sintetizadas por um tipo de célula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. Essas substâncias incluem hormônios, fatores de crescimento e morfógenos; cada um será detalhado em capítulos subseqüentes. O segundo método involve contato entre superfícies de células adjacentes. Células podem seletivamente reconhecer outras, aderindo a algumas células ou migrando sobre outras. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de células e sua transformação em tecidos e órgãos, ocorrem na superfície celular. Enquanto o paradigma dominante na genética do desenvolvimento é a expressão diferencial do gene, o paradigma dominante na morfogênese envolve afinidade celular diferencial. Essas afinidades podem ser para superfícies de outras células ou para moléculas da matriz extracelular secretadas pelas células. Neste capítulo veremos como superfícies de células adjacentes interagem durante o desenvolvimento, visando localizar as células em sítios apropriados dentro de tecidos e órgãos.

Afinidade celular diferencial
Assim como a demonstração da importância dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores, também se desenvolveu um debate sobre o papel da superfície celular na formação do embrião. A superfície celular parece a mesma em todos tipos de células, e muitos pesquisadores mais antigos pensavam até que a superfície celular não era uma parte vital da célula. Observações sobre fecundação e desenvolvimento embrionário precoce feitas por E. E. Just (1939) sugeriam que a superfície celular diferia em tipos diferentes de células, mas a análise moderna da morfogênese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. Considerando a descoberta de que tecidos de anfíbios se dissociavam em células isoladas quando colocados em soluções alcalinas, eles prepararam suspensões de células isoladas provenientes de cada uma das três camadas germinativas dos anfíbios, logo após a formação do tubo neural. Duas ou mais dessas suspensões de células isoladas poderiam ser combinadas de várias maneiras, e quando o pH era normalizado, as células aderiam umas às outras, formando agregados em placas de Petri cobertas com agár. Usando embriões de espécies que tinham células de diferentes tamanhos e cores, Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das células recombinadas (Figura 3.2).

Figura 3.1

Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais

±

PROCESSO CÉLULAS MESENQUIMATOSAS

AÇÃO

MORFOLOGIA

EXEMPLO

Condensação cartilagem

Mesênquima se torna epitélio

Mesêquina da cartilagem

Divisão celular

Mitose para produzir mais células (hiperplasia)

Mesênquima dos membros

Morte celular

Célula morre

Mesênquima interdigital

Migração

Célula se move em tempos e lugares determinados

Mesênquima do coração

Secreção de matriz e degradação

Síntese ou remoção da camada extracelular

Mesênquima da cartilagem

Crescimento

Células ficam maiores (hipertrofia)

Células gordurosas

CÉLULAS EPITELIAIS Dispersão Epitélio mesênquima (estrutura inteira) Degeneração do ducto Mülleriano

Delaminação

Epitélio mesênquima (parte da estrutura)

Hipoblastos de de galinha

Mudança de forma ou crescimento

Células permanecem ligadas com alteração da morfologia

Neurulação

Migração celular (intercalação)

Linhas do epitélio se fundem para formar menos linhas

Gastrulação de vertebrados

Divisão celular

Mitose dentro da linha ou outra direção

Gastrulação de vertebrados

Secreção de matriz e degradação

Síntese ou remoção da camada extracelular

Formação de órgãos vertebrados

Migração

Formação de bordas livres

Ectoderma de galinha

82

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Células epidérmicas presuntivas Segregação de tipos de células

Dissociação de células

Reagregação espontânea

Células da placa neural Seção através da bola de células segregadas

Figura 3.2

Reagregação de células da nêurula de anfíbios. Células epidérmicas presuntivas de embriões pigmentados e células da placa neural de embriões não pigmentados são dissociadas e misturadas entre si. As células reagrupamse de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme presuntiva) cobre o outro. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)

Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar, verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja, em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de célula se posicionava em sua própria região. Assim, quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto, as células epidérmicas foram encontradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior. Em nenhum caso as células permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de tecido envolvia o outro completamente. Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posições finais das células reagregadas refletiam suas posições embriônicas. O mesoderma migra centralmente à epiderme, aderindo à sua superfície interna (Figura 3.3A). O mesoderma também migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto, quando as três camadas germinativas são misturadas entre si, o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configuração final, o ectoderma está na periferia, o endoderma é interno e o mesoderma se situa na região entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as células, ectodérmicas e endodérmicas. A mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As células epidérmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as células da placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo neural. Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspensão de células presuntivas, epidérmicas e neurais, a segregação celular resulta em uma camada epidérmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as células têm a capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas. Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974), que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfíbio. Ele verificou que essas células migram para sua camada germinativa apropriada. Células endodérmicas encontram posições no endoderma do hospedeiro, enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

83

Epiderme + mesoderma

Mesoderma + endoderma

Epiderme + Mesoderma + endoderma

Placa neural + epiderme

Placa neural + Mesoderma axial + epiderme

Epiderme

Endoderma

Mesoderma

Epiderme

Epiderme

Mesoderma

Mesoderma (A)

Mesoderma (B)

Endoderma (C)

Placa neural (D)

Epiderme (E)

Placa neural

Figura 3.3

ectoderma. Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação posicional às células embrionárias. A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois células embrionárias não mantêm uma única relação estável com outras células. Para que ocorra o desenvolvimento, células precisam interagir de forma diferente com outras populações celulares em tempos específicos. Essas mudanças na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlação entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. Mais recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comportamento no ouriço-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blástula, todas as células parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada célula tem também uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião, e uma baixa afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). Entretanto, ao iniciar-se a gastrulação, um grupo específico de células, no pólo vegetal da blástula, perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa, enquanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blastocele (Figura 3.4). Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células

Distribuição e reorganização de relacionamentos embrionários espaciais em agregados de células embrionárias de anfíbios. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)

84

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.4

(A) Camada hialina Células da blástula

(B)

Sumário das modificações na adesão celular de células precursoras do esqueleto (encaixadas). (A) Na blástula do ouriço-do-mar, cada célula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato, a camada hialina. (B) Enquanto progride o desenvolvimento, mudanças na superfície celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas células vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas proteínas da cavidade interna da blastocele. O resultado é que essas células migram para a blastocele (flechas) e formarão o esqueleto.

Fibrilas da blastocele

Alta afinidade por células vizinhas e camada hialina

Decréscimo de afinidade por células vizinhas e camada hialina. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele.

com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele, onde elas formarão o esqueleto da larva. Quando elas começam a formar esse esqueleto, suas propriedades adesivas terão que mudar novamente. Essas células, que tinham sido “antisociais” entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esquelético. Essas mudanças na adesão são específicas temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas (McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanças na afinidade celular são extremamente importantes nos processos da morfogênese. A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona, 1952). Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específicas, as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas reconstruíram a organização do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A Figura 3.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundongo de 15 dias. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois agregadas em uma cultura rotatória. As células epidérmicas migram para a periferia, e as dérmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituída, formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal. Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de agregação histotípica. O modelo termodinâmico de interações celulares A células, então, não se distribuem ao acaso, mas se movem ativamente para criar organização tissular. Quais forças dirigem o movimento celular durante a morfogênese? Em 1964, Malcolm Steinberg propôs um modelo que explicava o direcionamento da

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

85

Figura 3.5

Epiderme

Derme

Reconstrução da pele a partir de uma suspensão de células de pele de um embrião de camundongo de 15 dias. (A) Seção através da pele embrionária, mostrando a epiderme, derme e folículos pilosos primários. (B) Suspensão de células isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. (C) Agregados após 24 horas. (D) Seção através de um agregado mostrando migração de células epidérmicas para a periferia. (E) Nova diferenciação dos agregados (72 horas), mostrando epiderme e derme reconstituídas, completa com folículos de pêlo e camada queratinizada. (de Monroy e Moscona, 1979, cortesia de A. Moscona.)

Folículo piloso primário

distribuição celular baseado em princípios termodinâmicos. Usando células derivadas de tecidos embrionários tripsinisados, Steinberg mostrou que certos tipos de células sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de células, mas migram perifericamente quando combinadas com outras. A Figura 3.6 ilustra as interações entre culturas de células pigmentadas e células neurais da retina. Quando suspensões de células isoladas desses dois tipos são misturadas, elas formam agregados de células organizadas ao acaso. Entretanto, após algumas horas, já não se observa células pigmentadas da retina na periferia dos agregados; em dois dias, duas distintas camadas são vistas, com as células pigmentadas localizadas internamente às células neurais da retina. Os mesmos tipos de interações podem ser observados quando agregados esféricos de tecidos são colocados em contato, uns com os outros. Um dos tecidos finalmente envolve o outro, e a topografia final é independente das posições de partida (Figura 3.7). Além disso, tais interações obedecem a uma hierarquia (Steinberg, 1970). Se a posição final de um tipo de célula, A, é interna em relação a um segundo tipo, B, e a posição final de B é interna a um terceiro tipo, C, então a posição final de A será sempre interna a C. Por exemplo, células pigmentadas da retina migram internamente às células neurais da retina, e células do coração migram centralmente em relação à retina pigmentada. Portanto, células do coração migram internamente às células neurais da retina. Essa observação levou Steinberg a propor que as células misturadas, interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3.8). Em outras

(A)

(B)

(C)

(D) Derme

Derme Epiderme Camada queratinizada

(A)

(B)

(C)

Figura 3.6

Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas após a mistura das suspensões de células isoladas, são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. (B) Em 19 horas, as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. (C) Após dois dias, a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas células da retina neural. (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente células mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)

(E) Folículos de pêlo

86

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.7

Tecido A

Tecido B

Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo. A posição final de agregados compostos de dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. Uma condição final idêntica é obtida, se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e, então, reagregadas ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo com Armstrong, 1989.)

Colocar tecidos juntos, bem encaixados

Dissociar os tecidos e reagregar

Movimento do tecido B para envolver o tecido A

Movimento das células A para dentro, distante da periferia

palavras, as células se rearranjam na forma termodinamicamente mais estável. Se as células dos tipos A e B têm diferentes forças de adesão, e se a força da conexão A-A é maior do que aquela entre A-B ou B-B, vai haver distribuição com centralização das células do tipo A. Se a força da conexão A-A é menor ou igual a da conexão A-B, o agregado permanecerá com uma mistura de células ao acaso. Finalmente, se a conexão A-A tiver uma força muito maior do que a conexão A-B – em outras palavras, as células A e B não mostram basicamente nenhuma adesividade entre si – então as células A e B formarão agregados separados. Para que as células sejam distribuídas, o essencial é que tenham diferenças em suas forças de adesão. Na forma mais simples desse modelo, todas as células poderiam ter o mesmo tipo de “cola” distribuída na sua superfície. A quantidade desse produto da superfície celular, ou a arquitetura celular que permite à substância ser concentrada diferencialmente, originará diferentes números de contatos estáveis entre tipos de células. Alternativamente, as diferenças termodinâmicas poderiam ser causadas por vários tipos de moléculas de adesão. Esse modelo termodinâmico é chamado hipótese da adesão diferencial. Nessa hipótese, o embrião precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilíbrio até que alguma mudança na atividade gênica altere as moléculas na superfície celular. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configuração de equilíbrio para as células.

Células A localizadas centralmente às células B (A) DISTRIBUIÇÃO

(B) AO ACASO

(C) SEPARAÇÃO

Figura 3.8

Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. (A) Distribuição ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab) é menor que a força adesiva média homotípica (A-A ou B-B) (ωaa, ω bb). As células mais adesivas se localizam centralmente. (B) Se a força das adesões A-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas, não vai haver distribuição, porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico, e a mistura dos tipos de células será ao acaso. (C) Se as ligações A-B são muito mais fracas que a média das adesões homotípicas, haverá uma completa separação, como é característico para óleo e água.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

87

Informações adicionais

&

Especulações

Evidência para o modelo termodinâmico

E

Blastema não marcado

vidências recentes para a hipótese da adesão diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de responder duas questões: (1) pode o fenômeno da distribuição ser explicado pela tensão superficial gerada pela adesão celular?, e (2) essa distribuição realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratório de Steinberg (1994) analisaram a tensão superficial interfacial em vários tecidos embrionários. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensiômetro, e mediram a tensão superficial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar à forma esferóide original. Dessa maneira, a tensão superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centímetro. Foty e seus colaboradores encontraram uma completa correlação entre a tensão superficial do tecido e sua tendência de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. Tecidos com uma maior tensão superficial sempre se localizavam internamente quando misturados com outros de menor tensão superficial. Parece que a distribuição pode ser explicada unicamente pelas tensões superficiais das células justapostas. [cell1.html] Até recentemente, era muito difícil planejar experimentos para testar, in vivo, esse modelo de distribuição celular; entretanto, estão surgindo evidências para essa hipótese em estudos de regeneração de membros na salamandra. Aqui, o tecido mais proximal (perto do corpo) envolverá o mais distal (Nardi e Stocum, 1983).

Membros de salamandra têm alguns atributos surpreendentes. Quando um membro anterior é amputado no antebraço, o toco remanescente forma na sua ponta, uma massa de células desdiferenciadas (blastema regenerativo), que se divide e diferencia formando um novo membro. O novo tecido do membro se inicia no local da amputação, nesse caso, formando o resto do membro, do antebraço para baixo. Quando o membro é amputado no pulso, forma-se um blastema regenerativo parecido. Entretanto, não é reformado o tecido do antebraço, cotovelo e cúbito; em lugar disso, o local “sendo conhecido” regenera somente o pulso e os dígitos. Como é armazenada essa “memória posicional”? Nardi e Stocum (1983) demonstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nível de origem eles se fundem, mas nenhum envolve o outro (Figura 3.9). Entretanto, quando os blastemas são de níveis diferentes, o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal. Parece, então, que as propriedades adesivas des-

sas células formam um gradiente ao longo do eixo proximodistal; essas propriedades são maiores no pulso e menores no antebraço. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuição de células in vitro ao processo de regeneração de membro ao vivo. Blastemas do pulso, cotovelo ou antebraço foram enxertados na junção blastema-toco de um membro posterior regenerando a partir da meia coxa. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente até o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regeneraram uma nova estrutura (Figura 3.10). O blastema do antebraço imediatamente regenerou um membro completo a partir do nível da meia coxa; o blastema do cotovelo se moveu ao nível do joelho e formou o resto do braço a partir desse ponto; o blastema do pulso foi deslocado até o fim do membro posterior em regeneração, onde formou um pulso ao nível do tarso do pé. Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuição celular, vistas in vitro, refletem diferenças que são usadas pelo corpo, in vivo, na construção de novos órgãos.

Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebraço

Figura 3.9

Distribuição quando blastemas de níveis iguais ou diferentes, de membros anteriores, são colocados juntos em cultura. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distinguílo do outro). Depois de três dias em cultura, os agregados foram fixados e secionados. Blastemas do mesmo nível fundiram em uma linha reta. Quando os blastemas eram de diferentes níveis, o blastema proximal parecia tentar envolver as células mais distais. (de Nardi e Stocum, 1983, cortesia de D. Stocum.)

Antebraço

Cotovelo

Pulso

88

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.10

Distribuição in vivo, onde blastemas de membros anteriores em regeneração (em cores) enxertados em blastemas da coxa mediana (cinza) são deslocados para a região correspondente do membro posterior em regeneração (pulso ao tarso; cotovelo ao joelho; antebraço à coxa mediana) onde iniciam a formação do membro anterior, distalmente daquele ponto. (de Crawford e Stocum, 1988.)

Blastema de pulso

Blastema de cotovelo

Blastema de antebraço

Blastema de coxa mediana

Enxertar blastema no blastema em regeneração da coxa mediana

Permitir crescimento externo dos enxertos

A base molecular das adesões célula-célula
As classes de moléculas de adesão celular A formação de tecidos e órgãos é mediada por eventos que ocorrem na superfície de células adjacentes. A superfície celular inclui a membrana plasmática, as moléculas diretamente abaixo dela e a ela associadas, e as moléculas encontradas no espaços extracelulares. Células eucarióticas são envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmática (ou celular). A membrana plasmática é uma bicamada fluida lipídica que contém proteínas capazes de interagir com o ambiente externo. Certas proteínas têm seus sítios ativos apontando para fora, em direção a outras células; existem três classes de moléculas da membrana celular (principalmente proteínas) que estão particularmente envolvidas no controle de interações específicas com outras células (Edelman e Thiery, 1985): • Moléculas de adesão celular. Essas proteínas participam da adesão célulacélula. Elas podem unir células em lâminas epiteliais e condensar células mesenquimatosas em agregados coesos. Elas têm um papel crítico na separação de diferentes tecidos entre si. • Moléculas da junção celular. Essas moléculas fornecem vias de comunicação entre o citoplasma de células adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e força mecânica às lâminas epiteliais. • Moléculas de adesão a substrato. Essas moléculas permitem ligação das células às suas matrizes extracelulares. Elas incluem componentes da matriz extracelular e seus receptores situados na superfície da célula. Moléculas de adesão a substrato permitem o movimento de células do mesênquima e neurônios, e permitem a separação espacial das lâminas epiteliais. Os padrões locais de expressão dessas moléculas da superfície celular, propiciam uma conexão importante entre o código genético unidimensional e o organismo tridimensional. Modulando o aparecimento dessas moléculas, o potencial genético pode se manifestar no processo mecânico da morfogênese.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

89

Informações adicionais

Anticorpos monoclonais e genética reversa
Monitoramento de modificações da membrana celular através de anticorpos monoclonais.
A expressão de componentes da membrana muda no espaço e no tempo. Diferentes tipos de células possuem componentes da superfície celular que são diversos, e que mudam enquanto a célula se desenvolve. Esses componentes da membrana, tecido-específicos, são freqüentemente reconhecidos por antisoros e, por essa razão, denominados antígenos de diferenciação (Boyse e Old, 1969). Antígenos de diferenciação específicos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3.11). Geralmente, esses anticorpos são produzidos injetando celulas estranhas em camundongos (ou células de camundongos de uma linhagem em animais de outra linhagem). Os linfócitos B do camundongo começarão a produzir anticorpos contra cada um dos componentes estranhos dessas células, sendo que cada linfócito B produz um único tipo de anticorpo. Esses linfócitos são tornados “imortais” pela fusão com células cultivadas de linfócito B de tumores (mielomas), que foram mutados de modo a: (1) não sintetizar seus próprios anticorpos e (2) não ter a enzima de recuperação de purinas, hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). Devido a essa última alteração, as células do mieloma só podem produzir nucleotídeos de purina de novo, não podendo usar as purinas do meio de cultura. Após a fusão, as células são cultivadas em um meio contendo aminopterina, uma droga que inibe a via de síntese de novo da purina. Assim, células do mieloma não fundidas morrem por fome de purinas. Elas não podem produzir nucleotídeos de purina usando a via de recuperação mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia também a via de novo. Linfócitos B normais também não dividem-se em cultura, de modo que eles morrem igualmente. O produto da fusão do linfócito B e da célula do mieloma – o hibridoma – prolifera, porque possui a enzima de recuperação de purina do linfócito B e as propriedades de crescimento do tumor. Mais ainda, cada um
Imunização Células mutantes de mieloma, sem enzima HPRT

&

Especulações

Células de baço de camundongo

Células de mieloma

Fusão

Seleção em meio HAT; selecionar anticorpos

Cultivar clones de hibridomas individuais de poços positivos

Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo

Figura 3.11

Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Células do baço de um camundongo imunizado são fundidas com células mutadas de mieloma, sem a enzima HPRT. Células são cultivadas em um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Células de mieloma não fundidas não podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a única via para sintetizar nucleotídeos purínicos. Células B morrem nesse meio, mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. As células fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. Os poços nos quais crescem os hibridomas são selecionados quanto à presença do anticorpo efetivo, e as células de poços positivos são semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que células individuais originem clones discretos. Esses clones são isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. Tal anticorpo é monoclonal. Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. (de Yelton e Scharff, 1980.)

90

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sináptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sináptica interna

Soma das células ganglionárias Axônios das células ganglionárias (A) (B) (C) (D)

Mas logo em seguida, a célula começa a expressar outra molécula da membrana, o antígeno 24B10. Essa molécula é encontrada somente nos neurônios que se transformarão em fotorreceptores. Nos estágios seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde), o antígeno 21A6 é expresso em certas regiões de fotorreceptores em maturação, e outro antígeno, 28H9, é característico de fotorreceptores retinais terminalmente diferenciados (Zipursky et al.,1984). Assim, membranas celulares de diferentes tipos de células contêm moléculas diferentes, e essas podem mudar durante a maturação da célula.

Da proteína ao gene
Como antígenos de diferenciação são proteínas cuja expressão é regulada no tempo e no espaço, e como essas mudanças são freqüentemente correlacionadas com mudanças morfológicas específicas (como mostra a Figura 3.13), seria interessante saber como seus genes são regulados. Por exemplo, o conhecimento de como a proteína 24B10 se expressa poderia dar indicacões sobre os mecanismos genéticos da diversidade neuronal. Como podemos realizar essa “genética reversa” indo da proteína para o gene? Em primeiro lugar, ligamos anticorpos monoclonais às particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3.14). (Essa é uma coluna de imunoafinidade.) O anticorpo se liga somente ao antígeno reconhecido originalmente, e a proteína ligada à resina é eluída (por soluções salinas) e submetida à eletroforese em gel para separá-la de um possível
Fotorreceptor maduro

Figura 3.12

Especificidade da superíficie celular da retina neural de galinha. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seção da retina neural de um pinto recém-eclodido. (B) Seção de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece células retinais (mas não outras neuronais). (C) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas não corpos celulares na retina. (D) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece antígeno em um subconjunto de processos em células nervosas nas camadas sinápticas externas e internas. (Cortesia de G. Grunwald.)

desses hibridomas secreta o anticorpo específico do linfócito B. O meio no qual estão crescendo os hibridomas é testado quanto à presença de anticorpos que se ligam à população original das células estranhas. Tais anticorpos, tendo um único linfócito B como sua fonte original, é denominado anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reconhecer antígenos (proteínas, lipídeos e carboidratos) que são fracamente expressos (Köhler e Milstein, 1975). Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos específicos de células, demonstraram numerosos antígenos de diferenciação aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvimento. A Figura 3.12 mostra diferentes moléculas da superfície celular, em diferentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recém-eclodido. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molécula diferente na membrana celular. Como está evidente nesta fotografia composta, as membranas de todas as células da retina neural não são iguais. Na verdade, regiões da mesma membrana celular podem ser diferentes; as membranas dos axônios e da soma do nervo, por exemplo, contêm moléculas diferentes. A Figura 3.13 mostra mudanças temporais na membrana

celular de uma única célula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. Anticorpos monoclonais foram obtidos após injetar camundongos com homogenatos de tecido da cabeça de Drosophila, e um painel de anticorpos foi testado em células do disco imaginal do olho larval que se diferenciavam em estruturas do olho. Assim que as células epiteliais, não diferenciadas, do disco mostram propriedades neuronais, elas expressam o antígeno 22C10. Esse antígeno é também encontrado em outros tipos de células neuronais.
Célula epitelial não diferenciada

Fotorreceptor

Neurônio

Neurônio sensorial fotorreceptor

Vários antígenos não específicos

22C10 antígeno 24B10 antígeno 21A6 antígeno 28H9 antígeno

Figura 3.13

Mudanças temporais na membrana celular correlacionadas com a morfogênese de uma célula retinal fotorreceptora da Drosophila. Enquanto se procede a diferenciação, diferentes antígenos se expressam na membrana celular. (de Venkatesh et al., 1885.)

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

91

Anticorpo monoclonal ao antígeno 24B10

Juntar anticorpo marcado ao antígeno 24B10, na seção retinal

1 Cobrir partículas de resina com anticorpo monoclonal

Localização de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluoresceína 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partículas cobertas

Figura 3.14
3 Adicionar homogenato de retina contendo antígeno 24B10 ( ) e outros antígenos ( )

• •

Homogenato retinal

Protocolo para encontrar o gene que codifica a proteína identificada por um anticorpo monoclonal. O oligonucleotídeo decodificado pela estrutura da proteína não precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqüência. (de Venkatesh et al., 1985; fotografia cortesia de S. Benzer.)

4 Depois que outros antígenos ( ) passam através da coluna, eluir material ( ) remanescente nas partículas, separar por eletroforese em gel e corar gel para proteína

Proteína purificada, antígeno 24B10

5 Eluir proteína purificada 24B10 do gel e seqüenciar o amino terminal

Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro 6 Gerar uma seqüência mensageira possível e sintetizar uma seqüência complementar radioativa

AUG - GAA - GAA - AGG - CAG - AAC - CC TAC - C T T - C T T - TCC - GTC - T T G - GG

contaminante. A região do gel contendo a proteína é separada, a proteína eluída da matriz do gel é parcialmente seqüenciada. É necessário sintetizar oligonucleotídeos radioativos que se ligariam a uma seqüência de DNA capaz de codificar tal proteína. No caso da 24B10, essas sondas radioativas foram usadas para selecionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regiões do genoma de Drosophila. O DNA de Drosophila de cada clone positivo foi seqüenciado para verificar se esse complementava a seqüência da proteína original isolada pelo anticorpo monoclonal. Por essa via, podemos ir de uma rara proteína identificada por um anticorpo monoclonal a um pedaço específico do DNA genômico. (Zipursky et al.,1984; Venkatesh et al., 1985.)

7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Drosophila; seqüenciar o clone positivo TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys Seqüência esperada 8 Isolar e caracterizar gene

92

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Moléculas de adesão celular
Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento Os estudos de distribuição de Holtfreter e Steinberg não identificaram as moléculas envolvidas na adesão celular diferenciada. Roth (1968; Roth et al., 1971) demonstrou que diferentes tipos de células mostram uma adesão celular seletiva independente da distribuição das células. Ele modificou o ensaio de agregação rotatório, incubando células de cartilagem marcadas com 3H e hepatócitos marcados com 14C em uma solução em rotação, contendo pequenos agregados de células de cartilagem não marcadas. Medindo as células marcadas com 14C e 3H nesses agregados, ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente células de cartilagem. Experimentos similares estenderam essas conclusões às células do músculo e do fígado (Figura 3.15). Esses estudos indicaram que tipos diferentes de células podiam usar diferentes moléculas de adesão. A tarefa seguinte é identificar as moléculas mediadoras da adesão celular e descobrir como conseguem realizar esse feito. Várias moléculas de adesão celular (CAMs), foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas, cujas propriedades de adesão celular dependem de íons cálcio e as CAMs da superfamília de imunoglobulinas, cujos domínios de ligação às células se parecem aqueles de moléculas de anticorpos. A Tabela 3.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. Caderinas Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. Os íons estabilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chamadas caderinas. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de conexões intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregação espacial de células e para a organização da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de proteínas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si. Mais ainda, como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as células epiteliais em uma unidade mecânica. Em embriões de vertebrados, quatro classes principais de caderinas foram identificadas:

Figura 3.15

Especificidade da associação célula-célula. Agregados coletores, cada um consistindo de um tipo de célula, são colocados em um frasco de cultura giratório contendo células isoladas do mesmo tipo (isotípico) e de tipos diferentes (heterotípico). As células isoladas, isotípicas e heterotípicas, foram previamente marcadas com diferentes radioisótopos. Após seis horas, os agregados foram colhidos, lavados e determinados os números de células isotípicas e heterotípicas que aderiram ao agregado, como mostra a tabela abaixo. (Dados de Roth, 1968.)
Contagem das células radioativas que aderiram ao agregado

Célula isotípica marcada com 3 H (cartilagem) Célula heterotípica marcada com 14 C (fígado) Agregado (cartilagem) Rotação por seis horas

Células isoladas marcadas em suspensão* Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Cartilagem 100 10 38 Fígado 6 100 49 Músculo peitoral 48 0 100

* Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos.

Contar células radioativas que aderiram ao agregado

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

93

Tabela 3.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs)
Classe Caderinas (cálcio-dependente) CAM N-caderina (a.k.a. A-CAM) P-caderina E-caderina (a.k.a. L-CAM, uvomorulina) N-CAM Ng-CAM (a.k.a. L1, NILE) Neurofascina CAM-celular LFA-1 CD4 glicoproteína (HIV receptor) Tipo celular Nervos, rins, lentes, coração Placenta, epitélio Epitélio, blástula de camundongo

CAMs da super família de imunoglobulinas (cálcio-independente)

Músculos, nervos, rins Glia, neurônios Neurônios de Drosophila Hepatócitos Linfócitos Indutor de células T

E-caderina (caderina epitelial, também chamada uvomorulina e L-CAM) é expressa em todas as células embrionárias precoces de mamíferos, mesmo no estágio de uma célula. Mais tarde, essa molécula é restrita a tecidos epiteliais de embriões e adultos. P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em células placentárias do embrião de mamífero, que fazem contato com a parede uterina (as células trofoblásticas) e o próprio epitélio da parede uterina (Nose e Takeichi, 1986). É possível que a P-caderina facilita a conexão do trofoblasto com o útero, pois a P-caderina nas células uterinas é visualizada em contato com a P-caderina das células trofoblásticas de embriões de camundongos (Kadokawa et al., 1989).

Sítios de fosforilação Reconhecimento do sítio de adesão

Figura 3.16

Sítio de ligação de cálcio

Membrana celular

Cateninas Actina

Representação esquemática da adesão celular mediada por caderina. Caderinas estão associadas com três tipos de cateninas. As cateninas podem se associar com o sistema de microfilamentos de actina. A importância dessas interações para o desenvolvimento normal é vista na Figura 3.18; caderinas que não têm o domínio extracelular podem interferir com o desenvolvimento. Presumivelmente, elas competem com as caderinas normais, ligando as cateninas disponíveis com seus domínios citoplasmáticos. (de Takeichi, 1991).

Caderina Ligação caderina-caderina

Caderina

94

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

(B) Ectoderma Crista Neural

Células migratórias Tubo neural E-caderina N-caderina

(C)

Figura 3.17

Localização de duas diferentes caderinas durante a formação do tubo neural no camundongo. Foi usada marcação imunofluorescente dupla para localizar E-caderina (A) e Ncaderina (B) na mesma seção transversal do cérebro posterior de um embrião de camundongo de 8.5 dias. Anticorpos para E-caderina foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um intervalo de comprimento de onda), enquanto anticorpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). Fotografias obtidas em diferentes comprimentos de onda. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente, ao passo que a invaginante placa neural cessa a expressão de E-caderina, mas passa a expressar N-caderina. (C) quando se forma o tubo neural, ele expressa N-caderina, a epiderme expressa E-caderina e as células da crista neural nenhuma das duas. (Fotografias de K. Shimamura e H. Matsunami, cortesia de M. Takeichi; C de Rutishauser, 1988.)

N-caderina (caderina neural) é vista inicialmente nas células mesodérmicas no embrião em gastrulação enquanto elas perdem sua expressão de E-caderina. É intensamente expressa nas células do sistema nervoso central em desenvolvimento (Figura 3.17; Hatta e Takeichi, 1986). • EP-caderina (C-caderina) é crítica na manutenção da adesão celular entre os blastômeros da blástula de Xenopus e é necessária para os movimentos normais de gastrulação (Figura 3.18; Heasman et al., 1994; Lee e Gumbiner, 1995). Caderinas promovem a aderência celular, ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra célula. Assim, células com E-caderina grudam em outras células que têm Ecaderina, e se separarão de outras células contendo N-caderinas em suas membranas. Essa ligação é chamada ligação homofílica. Células expressando N-caderinas rapidamente se isolam de células N-caderina-negativas in vitro, e anticorpos univalentes contra caderinas converterão um agregado de células tridimensional histotípico, em uma camada única (Takeichi et al., 1979). Mais ainda, quando genes ativados de Ecaderina são transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles expressos (usualmente eles não expressam essa proteína), E-caderina é vista em suas superfícies celulares, e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al.,1987). Na verdade essas células começam a se portar como células epiteliais. Expressão de caderinas é freqüentemente correlacionada com agregação e dispersão. Células da crista neural (que estão na porção mais dorsal do tubo neural), inicialmente expressam N-caderina. Em seguida, enquanto deixam o tubo neural, migrando como células individuais (para formar células pigmentadas, neurônios sensoriais e outros tipos de células), elas perdem a expressão de N-caderina (veja Figura 3.17; veja também Capítulo 7). Entretanto, quando as células migrantes chegam ao seu destino e começam a se agregar entre si para formar gânglios nervosos, elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al.,1987). Expressão diferencial de caderina pode também explicar os dados de distribuição homotípica discutida anteriormente. Como foi discutido, Roth e colaboradores demonstraram que células de fígado tendem a coletar células de fígado e que células retinais coletam outras células retinais. Takeichi (1987) demonstrou que células retinais expressam N-caderina e células hepáticas expressam E-caderina, e que a distribuição seria a esperada devido a essa diferença na expressão de caderinas. Ele também sugeriu que as observações de Townes e Holtfreter poderiam ser, da mesma forma, explicadas por expressão diferencial de caderinas. Suporte para essa idéia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camundongo, que não expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina, enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Também, quando tecido pulmonar embrionário foi dissociado e sua recombinação permitida na presença de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento, os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos túbulos epiteliais pulmonares (que expressam E-caderina), enquanto que os fibroblastos não tratados se associaram às células mesenquimatosas (que não expressam caderinas) (Nose et al.,1988). Todos esses experimentos foram realizados com células cultivadas. Recentemente, estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crítico nos fenômenos de distribuição ocorrendo dentro do embrião. Quando o mRNA para N-caderina de galinha é injetado em um dos dois blastômeros da primeira clivagem em embrião da rã Xenopus, N-caderina é freqüentemente expressa em células que normalmente não a possuem. Os embriões que expressam N-caderina extra são muitas vezes caracterizados por amontoados de células e camadas tissulares engrossadas. Normalmente, o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das células que se transformarão em epiderme (a qual expressa E-caderina). Em embriões nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra, o tubo neural não se separa da epiderme (Detrick •

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

95

(A)

(B)

Figura 3.18

Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. (A) Quando oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herdada maternalmente, as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. Em embriões controle (direita), as células internas permanecem juntas. (B) No estágio de quatro células, os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. Durante a neurulação as células com a proteína mutante não formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)

et al., 1990; Fujimori et al., 1990). Assim, as caderinas estão, provavelmente, tendo um papel principal na organização das células em tecidos. [cell2.html] CAMs da superfamília de imunoglobulinas Como discutimos no Capítulo 1, anticorpos foram usados inicialmente para identificar moléculas de adesão celular em Dictyostelium. Gerisch e colegas (Beug et al.,1970), prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regiões monovalentes ligantes de antígeno permanecessem – os fragmentos Fab. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados, porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar células e o efeito não poderia ser medido). Isso levou à descoberta de uma glicoproteína de 80-kDa que é mediadora da adesão célula-célula durante a agregação no fungo pegajoso. A mesma estratégia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al., 1977) que levou ao isolamento de uma molécula de adesão de células neurais (N-CAM). [cell3.html] N-CAM é um membro de uma classe de CAMs que não necessitam íons de cálcio e que têm uma estrutura semelhante (Figura 3.19). Essa estrutura extracelular com seus domínios globulares imobilizados por pontes dissulfeto, se assemelha à molécula de imunoglobulina, e é mesmo possível que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay, 1988; Lander, 1989). Assim, essas glicoproteínas são chamadas CAMs da superfamília de imunoglobulinas*. As CAMs da superfamília de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. N-CAM é necessária para uma ligação adequada de axônios às células musculares alvos (Covault e Sanes, 1986; Tosney et al.,1986). Além disso, N-CAM parece ser crítica para o empacotamento (fasciculação) de axônios para que se movimentem como uma unidade. Anticorpos à N-CAM podem quebrar essas ligações, permitindo que os axônios se dispersem (Fraser et al., 1988; Landmesser et al.,1988). Uma situação similar parece ocorrer em insetos, onde

* A designação superfamília é freqüentemente usada porque as diferentes classes de moléculas de imunoglobulinas também constituem, elas mesmas, uma “família”. Esses outros membros da superfamília têm estruturas semelhantes às imunoglobulinas, mas não são exatamente família “próxima”.

96

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.19

(B)

Moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas. (A) Três membros da superfamília de imunoglobulinas. A forma da molécula de IgM ligada à membrana tem duas cadeias pesadas, cada uma com cinco domínios, e duas cadeias leves, cada uma com dois domínios. N-CAM é um polipeptídeo com cinco domínios. Sua âncora na membrana pode ser a seqüência de aminoácidos de uma proteína transmembrana ou um lipídeo. L1 é uma proteína transmembrana com seis domínios globulares. Fasciclina II, a molécula de adesão celular de insetos, e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1, respectivamente. (B) Modelo para a adesão das CAMs da superfamília de imunoglobulinas.
(A) N N N N N N

ou

N

Domínios semelhantes à imunoglobulina

Domínios semelhantes à fibronectina Extracelular ou Citoplasma CC IgM C N-CAM ou fasciclina II C L1 ou neurogliana

N

ou C Interações de N-CAM célula-célula

Figura 3.20

as CAMs da superfamília de imunoglobulinas, chamadas fasciclinas (Figura 3.20) ajudam a migração de axônios (Harrelson e Goodman, 1988). L1 é necessária para a produção de certos axônios (Lemmon et al., 1989), e mutações de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia, retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al., 1994). Expressão diferencial de CAM é crítica nos limites entre dois grupos de células. Nesses lugares, o corpo segrega diferentes células em diferentes regiões. Células da notocorda não entram no tubo neural e nem células dermais trespassam para a epiderme.

Expressão de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. (A) Estrutura em andaime dos axônios fasciculados em um embrião de gafanhoto como visto em um microscópio de Nomarski. A com e P com são as comissuras anterior e posterior cujos axônios atravessam o segmento; ISN é um neurônio intersegmental e con é um neurônio conectivo. (B,C) Sistema nervoso embriônico como em (A), mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoproteínas fasciclinas da superfície celular. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axônios nas comissuras anterior e posterior, enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoproteína de membrana dos mais longitudinais fascículos de axônios. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). Note que o anticorpo marca somente uma porção de cada axônio. (de Bastiani et al., 1987, cortesia de C. Goodman.)

(A)

(B)

(C)

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

97

Figura 3.21

Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as células mesodérmicas se reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma, as células mesenquimatosas recémagregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman).

Essa segregagação pode ser conseqüência da diferença de CAMs nas populações adjacentes. Por exemplo, penas são induzidas quando células mesenquimatosas derivadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de células imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha. As células ectodérmicas estão ligadas entre si por E-caderina, enquanto as células mesenquimatosas, CAM-negativas anteriormente, começam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3.21). Através do desenvolvimento da pena, diferentes grupos de células se separam umas das outras, como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM, E-caderina, ou ambas as proteínas (Chuong e Edelman, 1985a,b).

(A)

Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda
Junções em fenda são regiões intercelulares especializadas onde células adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distância. Finas conexões servem como canais de comunicação entre células adjacentes (Figura 3.22A,B). Células assim ligadas são chamadas “acopladas”, e pequenas moléculas (MW<1500) e íons podem passar livremente de uma célula para outra. Na maioria dos embriões, pelo menos alguns

(B)

(B)

(D)

Figura 3.22
Espaço intracelular (15-40 nm)

Canais de comunicação

Membranas celulares Conexões (A) (D)

Proteínas das junções em fenda. (A) Micrografia eletrônica de uma fileira de junções em fenda ligando duas células justapostas. (B) Micrografia fluorescente de junções em fenda em túbulo renal de embrião de camundongo de 17 dias. (C) Compartimento formado por proteínas da junção de fenda entre células que se comunicam umas com as outras. Esse compartimento na gástrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um célula e observando sua transferência a um pequeno grupo de células. (D) Estrutura da subunidade da junção em fenda. (A de Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C. Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)

98

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda, dessa forma permitindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. A habilidade de células em formar junções em fenda com algumas células, e não com outras, cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento (Figura 3.22 C). A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma blástula de Xenopus de oito células, a progênie daquela célula que usualmente está ligada por junções de fenda, agora não podia permitir a passagem de íons ou moléculas pequenas de uma célula à outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino desenvolvimental da célula injetada (Figura 3.23). A progênie de tal célula não morreu, mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No embrião de camundongo, os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por junções em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito células se movem juntas para formar um embrião compacto. Se a compactação for inibida por anticorpos contra proteínas da junção em fenda, o desenvolvimento posterior cessa. Os blastômeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactação não ocorre (Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da junção em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo, aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua et al., 1989). Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas. Em cada célula, seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central. O complexo de junção em fenda de uma célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula, permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3.22D). Existem aproximadamente doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina, a comunicação entre células, mediada por junções em fenda, depende da função de caderinas. Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como também modificam as proteínas tipo conexina. Os diferentes tipos de proteína conexina têm papéis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimento normal. Por exemplo, a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. Entretanto, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes, o embrião ainda se desenvolverá. Parece que a função da proteína conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. Mas, logo após o nascimento, esses camundongos têm respiração convulsiva, se tornam cianóticos e morrem. Autópsia desses animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da proteína conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela é crítica para o desenvolvimento normal do coração. [cell4.html] A membrana celular tem, então, vários mecanismos pelos quais pode fazer ligações com membranas de outras células. Podem ser usadas CAMs da superfamília de

Figura 3.23

(B)

Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos blastômeros, no estágio de oito células, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a proteína da junção em fenda. O lado formado pelo blastômero injetado não tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia de A. E. Warner.)

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

99

imunoglobulinas, CAMs dependentes de cálcio e proteínas de junção. Mas isso não esgota seu repertório. Como já mencionado, a célula também pode se ligar a componentes específicos da matriz extracelular. Agora voltamos nossa atenção para esses componentes.

A base molecular da afinidade célula-substrato
Afinidade diferencial a substrato A migração de células, como a migração de pássaros e borboletas monarca, depende da percepção de quando começar a migração, quando cessar a migração e qual rota tomar. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar às células, mas os principais parecem envolver substâncias na matriz extracelular. A hipótese da afinidade diferencial a substrato postula que diferentes células reconhecem diferentes moléculas em várias matrizes extracelulares. Cada tipo de célula migratória prefere certas combinações de moléculas da matriz a outras combinações, e essas moléculas orientam a célula para quando e onde migrar. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a célula, por vezes, pode interagir com seus substratos através do sistema chave-fechadura, ou seja, entre a membrana celular e a matriz extracelular. O relacionamento entre a proteína da membrana celular e a molécula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antígeno. Durante a última década foi demonstrado que esse tipo de interação é muito importante para a migração celular. [cell5.html] A matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu ambiente imediato. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolúvel que pode ter várias funções no desenvolvimento. Em algumas situações, ela pode separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação. Em outros casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram, ou pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares. Um tipo de matriz é mostrado na Figura 3.24. Aqui, uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo. As células epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lâmina basal; as células mesenquimatosas secretam uma frouxa lâmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de células epiteliais. Existem três componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas moléculas de adesão a substrato (Tabela 3.2).

Epitélio

Figura 3.24

Lâmina basal

Colágeno

Localização e formação da matriz extracelular no embrião de galinha. A micrografia eletrônica de varredura mostra a matriz extracelular na junção das células epiteliais (acima) e mesenquimatosas (abaixo). As células epiteliais sintetizam uma lâmina densa com base de glicoproteína, enquanto as células mesenquimatosas secretam a lâmina reticular feita primariamente de colágeno. (Cortesia de R. L. Trelsted.)

100

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Tabela 3.2 Principais constituintes da matriz extracelular
Matriz extracelular mesenquimatosa Lâmina basal das células epiteliais

COLÁGENOS Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum; Tipos II, III, e V-XIII são também encontradas) que se organizam para formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de diâmetro. Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminoglicanos). Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico, uma enorme molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. Proteoglicanos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não conhecidas. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Moléculas às quais células aderem permitindo-lhes que se movam. Elas incluem fibronectina, condronectina e tenascina. Fonte: Adaptado de Bard, 1990.

COLÁGENO IV Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal. Ao contrário de outros colágenos, suas fibrilas são como um fino “arame de galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmina basal. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lâmina. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Laminina, o componente funcional majoritário da lâmina basal. Um trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celular, colágeno IV e glicosaminoglicanos. Lâmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras glicoproteínas adesivas.

COLÁGENO. Colágeno é uma família de glicoproteínas contendo altas porcenta-

gens de resíduos de glicina e prolina. Quase metade das proteínas do corpo são constituídas de colágeno, que é o principal suporte estrutural de quase todos os órgãos dos animais. Existem numerosos tipos de colágeno servindo funções especiais. Colágeno Tipo I, encontrado nas matrizes extracelulares da pele, tendões e ossos, perfaz quase 90 porcento do colágeno do corpo. Colágeno Tipo II é mais evidente como secreção das células cartilaginosas, mas também é encontrado na notocorda e no corpo vítreo do olho. Vasos sangüíneos apresentam colágeno Tipo III, e o Tipo IV é encontrado na lâmina basal produzida por células epiteliais (Vuorio, 1986). Outros tipos de colágeno são encontrados ao longo do corpo, especialmente em cartilagem. Colágeno é importante para a formação da lâmina basal, e também está implicado na ramificação dos túbulos epiteliais nas glândulas salivares, pulmões e outros órgãos. [cell6.html]
PROTEOGLICANOS. São tipos específicos de glicoproteínas nas quais: (1) o peso dos resíduos de carboidratos é muito maior do que o da proteína; (2) os carboidratos são cadeias lineares compostas de dissacarídeos repetitivos. Usualmente, um dos açúcares do dissacarídeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva é chamada glicosaminoglicano (GAG). A Tabela 3.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns; a estrutura básica dos proteoglicanos é mostrada na Figura 3.25. A interconexão de proteína e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede, e em muitos tipos de células móveis, o proteoglicano envolve as células impedindo que elas se juntem (Figura 3.26). A consistência da matriz extracelular depende da relação entre colágeno e proteoglicanos. Cartilagem, que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos, é macia, enquanto tendões, que contêm predominantemente fibras de colágeno, são rígidos. Na lâmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular além de propiciar suporte estrutural.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

101

Monômeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Proteína esqueleto

Ácido D-glucurônico

N-acetil-D-glucosamina

Ácido hialurônico Ácido hialurônico Glicosaminoglicano

Figura 3.25

Glicoproteínas ligantes Agregados de proteoglicanos

A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. O dissacarídeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato; veja Tabela 3.3) se liga a um esqueleto protéico relativamente pequeno (colorido), para produzir as cadeias de proteoglicanos. Essas cadeias podem ser conectadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como ácido hialurônico) para produzir redes complexas. Glicoproteínas ligantes estabilizam essas últimas associações. (Modificado de Cheney e Lash, 1981.)

Tabela 3.3

Unidades dissacarídicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns encontradas em proteoglicanos da matriz
Unidade dissacarídica repetitivaa Distribuição

Glicosaminoglicano

Ácido hialurônico Condroitina sulfato Dermatan sulfato Queratan sulfato Heparan sulfato

Ácido glucurônico-Nacetilglucosamina Ácido glucurônico-Nacetigalactosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilgalactosamina sulfato Galactose-N-acetilglucosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilglucosamina sulfato

Tecidos conjuntivos, osso, corpo vítreo Cartilagem, córnea, artérias Pele, coração, vasos sangüíneos Cartilagem, córnea Pulmão, artérias, superfície celular

a Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regiões de cada GAG podem ter sacarídeos ligeiramente modificados.

102

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A)

(B)

(D)

(C)

Figura 3.26

Capa de proteoglicanos envolvendo células móveis. (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura excluem pequenas partículas (nesse caso, hemácias fixadas) em distância significante da borda celular. (B) quando os mioblastos são tratados com hialuronidase (a qual dissolve ácido hialurônico), essa capa extracelular desaparece. (C) A capa também desaparece quando os mioblastos cessam a divisão e se juntam enquanto se diferenciam. (D) Micrografia eletrônica de hialuronidato em solução aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.)

Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre tecidos adjacentes em um órgão. No órgão, eles reúnem células soltas para formar uma lâmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al., 1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas. Axônios dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas proteínas da superfície celular; a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação ao seu redor, das células de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar é reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de crescimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferenciação quando se ligam a determinadas células. Entretanto, o receptor celular para o fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade. Na verdade, o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possível a ligação com o receptor (Massagué, 1991; Yayon et al.,1991).
GLICOPROTEÍNAS EXTRACELULARES. Matrizes extracelulares contêm uma va-

riedade de outras moléculas especializadas, tais como: fibronectina, laminina e tenascina. Essas glicoproteínas grandes provavelmente são responsáveis pela organização de colágeno, proteoglicanos e células em uma estrutura ordenada. Fibronectina é um dímero de glicoproteína, muito grande (460-kDa), sintetizada por fibroblastos, condrócitos, células endoteliais, macrófagos e certas células epiteliais (como hepatócitos e amniócitos). Uma função da fibronectina é servir como adesivo

*Proteoglicanos de heparan sulfato são considerados como agregadores de condrócitos, as células produtoras de cartilagem. Níveis excessivos de glicose inibem a síntese do esqueleto de proteína do proteoglicano, inibindo a formação da cartilagem. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possível mecanismo para explicar problemas esqueléticos em crianças nascidas de mães severamente diabéticas.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

103

molecular em geral, ligando células a substratos, tais como: colágeno e proteoglicanos. Fibronectina também organiza a matriz extracelular por ter vários pontos de ligação distintos, que interagindo com as moléculas apropriadas produz um alinhamento adequado de células e sua matriz extracelular (Figura 3.27). Como será visto em capítulos posteriores, fibronectina tem também um papel importante na migração celular. As “rodovias” pelas quais se movem certas células migratórias são pavimentadas com essa proteína. A migração de células mesodérmicas na gastrulação é vista na superfície de fibronectina em muitas espécies, e o movimento dessas células cessa quando a fibronectina é localmente removida. Em embriões de galinha, os precursores do coração, as células precardíacas, migram na fibronectina para se mover das laterais do embrião para a linha mediana. Se embriões de galinhas são injetados com anticorpos à fibronectina, as células precardíacas não migram para a linha mediana e desenvolvem dois corações separados. Anticorpos fluorescentes à fibronectina demonstraram um gradiente da proteína no caminho de migração entre o endoderma e o mesoderma. Se essa região for cortada e sofrer uma rotação, as células do coração seguem o gradiente para novas posições se afastando da linha mediana (Linask e Lash, 1988a,b). Assim, a fibronectina parece ter um papel principal na migração das células precardíacas para a linha mediana do embrião. Outros tipos de células, como as células germinativas, precursoras de embriões do sapo, também migram sobre células que secretam fibronectina em suas superfícies (Heasman et al.,1981). Laminina é um componente principal da lâmina basal. É composta de três cadeias peptídicas, e, como fibronectina, pode se ligar ao colágeno, glicosaminoglicanos e células. O colágeno ligado por laminina é do Tipo IV (específico para lâmina basal), e a região ligante de células da laminina reconhece principalmente células epiteliais e neurônios. A adesão de células epiteliais à laminina (na qual elas se assentam e usam) é muito maior do que a afinidade de células mesenquimatosas pela fibronectina (à qual elas devem se ligar e liberar se deverá haver migração). Como a fibronectina, a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular, promovendo adesão celular e crescimento, mudando a forma da célula e permitindo a migração celular (Hakomori et al.,1984). Nem todas grandes glicoproteínas celulares promovem adesão celular. Tenascina (também chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade
Figura 3.27

(A)

(B) H 2N Domínio ligante de fibrina e heparina Domínio ligante de colágeno

Sítio de alta afinidade

Domínios para ligação de células da crista neural de aves RGDS CS1 COOH

Fibronectina no embrião de galinha em desenvolvimento. (A) Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposição de proteína no embrião de 24 horas se situa ao longo da lâmina basal de muitos órgãos. (B) Estrutura e domínios de ligação na fibronectina. Os retângulos representam domínios resistentes a proteases. O domínio para a ligação de fibroblastos compreende duas unidades, o sítio RGD e o sítio de alta afinidade; ambos são essenciais para ligação da célula. Células da crista neural de aves têm outro sítio necessário para sua mobilidade em um substrato de fibronectina. Outras regiões na fibronectina permitem ligações com colágeno, heparina* e outras moléculas da matriz extracelular. (A cortesia de J. Lash; B conforme Dufour et al., 1988.)
*Heparina é uma porção de um proteoglicano de heparina secretada por mastócitos e basófilos. Heparan e heparan sulfato são nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontrados na matriz extracelular ou na superfície da célula. Presume-se que os sítios de ligação para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson, 1990).

Domínios ligantes de células para fibroblastos

Sítio II ligante de heparina

Sítio II ligante de fibrina

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

do comprimento da molécula, e é encontrada transitoriamente em várias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionário. Entretanto, diferentes células reagem de maneira diferente à tenascina. Algumas células aderem a ela, outras são arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.28; Spring et al., 1989). Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vários graus de adesividade. Além disso, tenascinas parecem aumentar a síntese e secreção de proteases das células que nela se localizam (Werb et al., 1990). Ambas as características podem ser importantes na geração de vias para a migração celular, e na remodelação da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al., 1987; BronnerFraser, 1988; Wehrle e Chiquet, 1990). Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular INTEGRINAS. A habilidade de uma célula em ligar essas glicoproteínas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana, que se torna o lugar de ligação na célula para essas grandes moléculas. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação das células à fibronectina (Chen et al.,1985; Knudsen et al., 1985). Foi observado que o complexo receptor de fibronectina é capaz não só de ligar fibronectina no exterior da célula, como também proteínas do citoesqueleto dentro da célula. Então, parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. Dentro da célula, serve como um sítio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a célula; fora da célula, se liga à fibronectina da matriz extracelular (Figura 3.29). Horwitz e colaboradores (1986; Tamkun et al., 1986) denominaram essa família de receptores protéicos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. Proteínas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de células. No lado extracelular, integrina se liga à seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD) de várias proteínas adesivas em matrizes extracelulares, incluíndo vitronectina (encontrada na lâmina basal do olho), fibronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987). No lado citoplasmático, a integrina se liga à talina e α-actinina, duas proteínas que se ligam aos microfilamentos de actina. Essa ligação dupla permite o movimento da célula pela contração dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al., 1993). Tipos diferentes de células podem ter diferentes moléculas de integrinas com diferentes afinidades por moléculas da matriz extracelular (Hemler et al., 1987; Hemler,1990). Cada molécula de integrina tem duas subunidades distintas, α e β, e diferentes combinações binárias das subunidades α e β permitem que a integrina se ligue a determinadas moléculas extracelulares. Por exemplo, α2β1 se liga ao colágeno e laminina, enquanto α4β1 se liga somente à fibronectina. Ambas as unidades α e β são necessárias para a ligação com fibronectina ou laminina, mas somente a unidade β conecta com o citoesqueleto interno. Durante a migração, as ligações unindo a unidade β da integrina ao citoesqueleto, podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e está especificamente localizada em sítios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. É possível que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al., 1987). A importância de integrinas é dramaticamente ilustrada durante a embriogênese de Drosophila. Como as integrinas de vertebrados, as integrinas de Drosophila são compostas de subunidades α e β que atravessam a membrana celular. Nas duas integrinas de Drosophila que são conhecidas, as subunidades β são idênticas, mas as subunidades α são diferentes. Essas duas integrinas freqüentemente funcionam em conjunto efetuando adesão tissular e celular durante o desenvolvimento. No desenvolvimento da asa da Drosophila, duas lâminas epiteliais são aproximadas. A integrina PS1 está situada na superfície basal do epitélio na asa presuntiva dorsal, enquanto a integrina PS2 está na superfície superior do epitélio na asa presuntiva

Figura 3.28

Inibição de adesão celular por tenascina. Fibronectina e tenascina foram colocadas em placas de cultura de tecidos, dispostas em forma de letras. Fibroblastos foram adicionados às placas podendo aderir e migrar. O resultado mostra que fibronectina foi o substrato preferido no plástico da cultura de tecidos, enquanto que as células não aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. (Cortesia de M. Chiquet.)

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

105

(A) Fibronectina

RGD

Sítio de ligação de RGD Subunidade ß de integrina Extracelular Subunidade ß de integrina

Sítios de ligação de cálcio Subunidade α de integrina

Citoplasma

α Actinina

Vinculina

Talina

ventral. Durante a metamorfose, esses dois epitélios se encontram e aderem para formar a lâmina de duas camadas da asa. Mutações nas integrinas produzem asas com regiões onde os dois epitélios se separam, como evidenciado por bolhas entre as duas lâminas (Brower e Jaffe, 1989; Wilcox et al.,1989). Algumas mutações de integrinas em Drosophila são letais, porque integrina é necessária para anexar músculos à epiderme e à parede do intestino. Na mutação letal (1) myospheroid, existe uma deficiência nos genes codificando a subunidade β das integrinas de Drosophila. Na ausência dessa subunidade, nenhuma integrina se forma, e os músculos somáticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al.,1989). Integrinas não são as únicas moléculas capazes de se ligar à laminina e à fibronectina. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqüência RGD na cadeia A de laminina, outro receptor protéico de laminina na membrana celular se liga a uma seqüência diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.,1987; Yow et al., 1988). Os receptores têm afinidade diferente por laminina, e essas podem ser importantes para sua função (Horwitz et al., 1985). A integrina a3β1 de fibroblastos, por exemplo, tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M), enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial é muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). O receptor usado pode ser importante em permitir que as células usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migração (na qual receptores de afinidade menor seriam usados).
GLICOSILTRANSFERASES. Outro grupo de proteínas que pode aderir células a proteínas da matriz extracelular são as glicosiltransferases da superfície celular. Essas enzimas ligadas à membrana são rotineiramente encontradas no retículo endoplasmático e nas vesículas de Golgi, onde elas são responsáveis por adicionar resíduos de açúcar a peptídeos para produzir glicoproteínas. Existem numerosas glicosiltransferases, cada uma específica para um dado açúcar e algumas mostrando também especificidade de substrato. Assim, galactosiltransferase é uma enzima capaz de transferir galactose de um molécula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes moléculas aceptoras. Galactosiltransferases são enzimas funcionais da membrana celular, e sua adesão à matriz extracelular representa uma catálise “frustrada” (Figura 3.30). A enzima necessita de dois substratos para completar a catálise, o carboidrato aceptor e o açúcar ativado. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas

α Actinina

Microfilamento de actina

Figura 3.29

Dupla função de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno. (A) Imunofluorescência indireta corando os microfilamentos de actina de uma célula extendendo um lamelapódio. As fibras de actina irradiam da grade ordenada do citoesqueleto para o lamelapódio. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligação do citoesqueleto à matriz extracelular através da molécula de integrina. (A de Lazarides, 1976, cortesia de E. Lazarides; B conforme Luna e Hitt, 1992.)

106

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

(A) (B) Enzima glicosiltransferase

NDP-açúcar + aceptor

Glicosil transferase

NDP + açúcar-aceptor

Doador de açúcar ativado (NDP-açúcar) Aceptor insolúvel

(C)

Ligação

Ligação de NDP-açúcar à glicosiltransferase

Figura 3.30

Catálise cliva açúcar de NDP e o adiciona ao aceptor

Interações da superfície celular através de glicosiltransferases. (A) A reação padrão de glicosiltransferase, na qual um açúcar é transferido de um carregador nucleosídeo difosfato a um receptor. (B) Interação entre glicosiltransferases e o grupo carboidrato (aceptor) na glicoproteína da matriz extracelular. Se o açúcar ativado está ausente, ocorre a adesão (considera-se que isso ocorra durante a fertilização). Se o açúcar ativado está presente em pequenas quantidades, a migração é permitida. (C) Marcação da glicosiltransferase da superfície celular, incubando seções microscópicas de um embrião de galinha de 10-somitos, com UDP-[3H] galactose. Radioatividade insolúvel vista por radioautografia mostra que esse açúcar radioativo foi transferido às superfícies celulares, especialmente das células mesodérmicas migratórias. (A e B modificado de Pierce et al., 1980; C de Shur, 1977a, cortesia de B. Shur.)

proteínas da matriz extracelular tal como a laminina. Isso causa adesão. Quando o segundo substrato aparece, essas adesões podem ser quebradas pela catálise. Em algumas instâncias (como fertilização no camundongo, onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozóide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo óvulo), a adesão é crítica e a catálise não ocorre. Em células migratórias, tanto adesão como catálise são observadas (Toole, 1976; Shur, 1977a,b; Turley e Roth, 1979; Eckstein e Shur, 1989). Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adesão como unidades separadas, os processos morfogenéticos de interação célula-célula são provavelmente realizados por combinações de moléculas de adesão celular. Por exemplo, a fixação inicial do embrião de camundongo à parede uterina parece ser mediada por vários sistemas de adesão. Primeiro, as células de fora do embrião (as células trofoblásticas) têm receptores para o colágeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endométrio uterino, e interferência com essa ligação pode impedir a implantação (Farach et al.,1987; Carson et al., 1988, 1993). Segundo, Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as células trofoblásticas podem também aderir às células uterinas através das glicosiltransferases da superfície celular. Terceiro, Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que Pe E-caderinas estão presentes tanto no tecido uterino como no trofoblástico no local da implantação. Assim, células podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos específicos. As células também usam sistemas múltiplos para remodelar tecidos por digestão. Por exemplo, quando embriões de mamíferos se embebem no útero, eles “digerem” seu caminho através do epitélio do útero e através de sua membrana basal de laminina, fibronectina e colágeno Tipo IV (Behrendtsen et al., 1992). Crescimento do osso, regressão da cauda do girino e formação de órgãos ramificados (tais como: glândulas salivares, rins e pulmões) também requerem quebra da membrana basal. Essa degradação controlada de moléculas da matriz extracelular é completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian, 1992; Sato et al., 1994). Algumas dessas enzimas estão ligadas à membrana celular, enquanto outras são secretadas diretamente pelas células para dentro da matriz que será dissolvida. Essas metaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colágenos dos Tipo I, II e III; (2) gelatinases que digerem elastina e colágenos IV e V; e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos, fibronectina e laminina. A ativação dos genes das metaloproteinases é realizada coordenativamente, e várias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3.31). Logo após a ativação das metaloproteinases, as células ativam os genes para os inibidores dessas proteínas. A produção e degradação controlada da matriz extracelular é parte essencial do desenvolvimento normal.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

107

Procolagenase Plasminogênio Ativação transcricional Uroquinase Plasmina

Colagenase Ativa Estromelisina Colagenase muito ativa

Prostromelisina

Figura 3.31

Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana. Uroquinase é um ativador de plasminogênio, que cliva o plasminogênio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precursoras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)

Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais
Os destinos das células são freqüentemente determinados pelas interações em suas superfícies, onde uma molécula de receptor encontra seu ligante complementar. Mas como que certas interações na superfície da célula causam a transcrição de genes específicos dentro do núcleo? As vias entre a membrana celular e o genoma são chamadas vias de transdução de sinais. Várias vias foram descobertas, aqui serão mencionadas as principais. Como veremos, elas parecem ser variações de um mesmo tema. O tema é deveras elegante: cada receptor se estende através da membrana tendo uma região extracelular, uma região transmembrana e uma região citoplasmática. Quando um ligante é acoplado na região extracelular, sua forma muda e a porção citoplasmática passa a ter atividade enzimática. Essa atividade é usualmente a de uma quinase, que pode usar ATP para fosforilar proteínas, inclusive a si mesmo. O receptor ativo pode agora catalizar reações que fosforilam outras proteínas, e finalmente, a fosforilação ativa um fator de transcrição, antes dormente. Esse fator de transcrição pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. O ligante iniciador da reação pode estar ligado a uma célula ou matriz extracelular ou, ainda, ser uma molécula difusível. Quando a molécula difusível vem do sangue é considerada um sinal endócrino. Se o sinal vem de células vizinhas difundindo-se de uma para outra é chamado parácrino. JAK-STA A via JAK-STAT No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que um sinal de outra célula produz sua fosforilação. Esses fatores de transcrição são as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle,1995, 1996). As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases, a JAK. A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al., 1994; Groner e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciação se liga a seus receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme dímeros) (Figura 3.32). Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regiões citoplasmáticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vários sítios. Os receptores ativados têm agora sua própria atividade quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerização. Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde se ligam às regiões específicas do DNA.

108

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.32

Receptores de prolactina

Prolactina

A via JAK-STAT— nesse caso, a via de ativação do gene de caseína por prolactina. O gene de caseína é ativado durante a última fase do desenvolvimento da glândula mamária (lactogênica) e seu sinal é a secreção de prolactina, um peptídeo de 9 aminoácidos da glândula pituitária anterior. Prolactina causa a dimerização dos receptores de prolactina nas células epiteliais do ducto mamário. Uma proteína JAK específica (Jak2) está “atrelada” nesses receptores. Quando os receptores são dimerizados, as proteínas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos, ativando a quinase dormente desses receptores. Esses adicionam um grupo fosfato a um resíduo de tirosina (Y) de uma proteína STAT específica (nesse caso Stat5). Isso permite que a proteína se dimerize e seja translocada para o núcleo onde se liga a regiões específicas de DNA. Em combinações com outros fatores de transcrição (que presumivelmente esperavam sua chegada), a proteína STAT ativa a transcrição do gene de caseína. GR é o glucocorticóide receptor, OCT1 um fator de transcrição geral, e TBP o conjunto de proteínas responsável pela ligação de RNA polimerase. (Para detalhes, veja Groner e Gouilleux, 1995.)

Receptores dimerizados ativos

Extracelular

Citoplasma

Envoltório nuclear

Núcleo

Inicio da transcrição

Promotor do gene de caseína

-Ras RTK-R A via RTK-Ras A via de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila, vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o mesmo gene. A via RTK-Ras começa na superfície celular, onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante específico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblásticos, fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimento derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando conectado com seu ligante, sofre uma mudança conformacional que permite sua dimerização. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente, ativada por mudança conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos particulares de tirosina. Assim, a introdução de um ligante no receptor causa uma autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor. A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura 3.33)—especificamente, as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da proteína adaptativa chamada domínio SH2. As proteínas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalização. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2, a proteína adaptativa usa seu domínio SH3 para regular o ativador de uma proteína Ras G. Normalmente, a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catálise é ajudada pelo fator de troca guanina nucleotídeo. A Ras ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o sinal. Após a transmissão, o GTP é hidrolizado a GDP. Essa catálise é muito estimulada

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

109

Ligante Extracelular Citoplasma

Receptor

Figura 3.33

Ativação de eventos dependentes de cálcio e PKC Fator de transcrição ativo Fator de transcrição inativo

A via RTK-Ras amplamente usada. O receptor tirosina quinase é dimerizado pelo ligante. Isso causa a autofosforilação do receptor. A proteína SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as proteínas intermediárias (GRB2 e SOS), as quais ativam a proteína Ras G por permitir a fosforilação da porção GDP da Ras. Ao mesmo tempo, as proteínas GAP estimulam a hidrólise dessa ligação fosfato. A Ras ativa é capaz de ativar a proteína quinase C (PKC), que ao seu turno fosforila uma série de quinases. Por fim, a MAP quinase altera a expressão gênica, fosforilando certos fatores de transcrição (que podem penetrar no núcleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de tradução (que alteram o nível de síntese de proteínas). Em muitos casos, essa via é reforçada pela liberação de íons cálcio.

Núcleo

Modulação da transcrição

pela complexação normal da proteína Ras à proteína ativadora de GTP-ase (GAP). Essa proteína de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes, e retorna a Ras à sua forma inativa (Trahey e McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Realmente, mutações no gene RAS estão relacionadas com uma grande proporção de tumores humanos (Shih e Weinberg, 1982), e as mutações que tornam o gene oncogênico inibem a ligação da proteína GAP. Sem a proteína GAP, a proteína Ras não catalisa eficientemente a hidrólise de GTP permanecendo em sua configuração ativa (Cales et al., 1988; McCormick,1989). A proteína Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A proteína Ras coloca a proteína inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al.,1994; Stokoe et al., 1994). A proteína Raf é chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK). (MAP quer dizer proteína associada à mitose, mas atualmente é considerada como um conjunto maior de fatores de transcrição). A MAPKKK fosforila a MAPKK que, por sua vez, pode fosforilar a MAP quinase. Essa última quinase fosforila os fatores de transcrição que especificam o destino da célula ou a proliferação. Em olhos de Drosophila, por exemplo, considera-se que a cascata ativa o fator de transcrição Sina (Sevenless-in-Absentia), cuja presença é necessária para a diferenciação do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin, 1990; Dickson et al., 1992). Como veremos mais tarde neste livro, essa via é crítica em numerosos processos desenvolvimentais. Em humanos, mutações nessa via dão origem às formas mais comuns de nanismo, incluindo acondroplasia, que ocorre em 1 entre 50.000 nascimentos. Aqui, o tórax e a cabeça crescem normalmente, mas os braços e as pernas são encurtados proximalmente. A deficiência reside na proliferação mínima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. A lesão genética parece estar no gene que

110

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9.19; Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Esse gene é expresso nas células da cartilagem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Quando ativado por um FGF, o FGFR3 sinaliza o condrócito para parar de dividir e começar a diferenciação. As mutações nesse gene causam um fenótipo de ganho de função onde o mutante FGFR3 é ativo constitutivamente (isto é, sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). [cell7.html]

* Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos têm mais de uma função na célula, e o que fazem depende do contexto da célula. Certos “fatores de crescimento” podem inibir o crescimento, e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição. Realmente, alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução. Aqui vemos que moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. Proteínas celulares não respeitam nossas fronteiras disciplinares.

Informações adicionais

&
(A) FGF

Especulações

Mutações negativas dominantes em receptores

O

significado funcional de uma molécula ligante pode ser verificado eliminando seu receptor. Uma maneira de fazer isso é criando mutações dominantes negativas de receptores. Esse tipo de experimento será bem sucedido se a dimerização for crítica para a função do receptor. Os receptores FGF ativos, em um caso, são dímeros de duas moléculas idênticas embebidas na membrana celular. O mutante dominante negativo não formará um dímero ativo, mesmo com um parceiro do tipo selvagem. Portanto, quando presente em concentrações suficientemente altas, o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas proteínas sejam ativadas. Isso pode ocorrer em mutações naturais ou provocadas. Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um receptor FGF em embriões de duas células de Xenopus. Essas blástulas não conseguem responder ao FGF (Figura 3.34). Nesse experimento, embriões que não tinham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramaticamente reduzido (Prancha 3).

FGFR normal: FGF se liga causando dimerização do receptor de FGF

(B)

FGFR dominante negativo

Receptor de FGF

FGFR normal

FGFR mutante

Domínio da tirosina quinase

Sinal

Receptores sem domínios intracelulares são inativos Sem sinal

Excesso do receptor mutante pode seqüestrar o receptor normal do fator de crescimento. Esse heterodímero é inativo. Sem sinal

Figura 3.34

Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. O receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à porção extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal através do citoplasma. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. Quando liga FGF, produz um dímero inativo, mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. Assim, o efeito de FGF não é transmitido à célula.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

111

A via do inositol fosfato Algumas vezes, a transdução de um sinal da superfície celular causa tantas mudanças, que alterações na expressão do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal. A ativação da via do inositol fosfato promove mudanças drásticas na fisiologia da célula pela liberação de íons cálcio do retículo endoplasmático. Essa via é extremamente importante na ativação do espermatozóide e do óvulo, ambos necessitando de um aumento na concentração intracelular de íons cálcio.

Figura 3.35
(A) Extracelular Fosfolipase C

Citoplasma

A via do inositol fosfato. (A) A reação de fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e IP3. (B) Essa reação pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. Primeiro, a via é iniciada quando o receptor transmembrana ligado à proteína G é ativado pela introdução do ligante. Essa ativação resulta na ligação de GTP à proteína heteromérica G e sua dissociação em subunidades ativas. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) que podem catalizar a formação de DAG e IP3. Em segundo lugar, a via pode ser ativada pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar íons cálcio do retículo endoplasmático. Neste ínterim, DAG (em presença dos íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase C. A proteína quinase estimula o transportador sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio celulares por íons sódio extracelulares, assim levando a um aumento do pH.

(B) RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc). Ligante Ligante Extracelular

Citoplasma

Proteína G

Via IP 3 PATHWAY PKC Atividade celular e mitogênese MAP quinase

Receptor IP 3

Retículo endoplasmático

112

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al., 1994). Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase, mencionado anteriormente. Além de ativar a proteína Ras G, as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que também tem um domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 é capaz de abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático, liberando uma grande quantidade de íons cálcio no citoplasma. DAG ativa a proteína quinase C, que por sua vez ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado é a elevação de íons intracelulares de cálcio e um aumento no pH intracelular. Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores, algumas vezes chamado de receptores serpentina, porque têm sete domínios transmembrana e “serpenteiam” através da membrana. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de proteína G, a proteína G heteromérica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse ativa a proteína G. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades, as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-β1 e PLC-β2. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como veremos em capítulos posteriores, as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio, efetuadas por essa via, alteram não somente a transcrição de genes, mas também a tradução de mRNA e a replicação de DNA. Cruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares, onde a informação flui em conduítes únicos. Na verdade, essas vias são apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informação, pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexões entre elas. (Essa pode ser a razão da existência de tantos passos entre a superfície da célula e o núcleo. Cada passo é um ponto de regulação em potencial e um potencial ponto de interseção). Essa comunicação cruzada pode ser vista na Figura 3.35, onde duas vias reforçam uma a outra. Deve-se lembrar também que a célula tem numerosos receptores e está constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. Em alguns casos, a transcrição de genes requer dois sinais. Isso é visto durante o desenvolvimento de linfócitos, onde dois sinais são necessários, cada um produzindo um dos dois peptídeos de um fator de transcrição envolvido na produção de interleucina 2 (IL-2, também conhecida como fator de crescimento da célula T). Um fator, c-Fos, é produzido pela ligação do receptor da célula T ao antígeno (Figura 3.36). Isso ativa a cascata Ras, criando um fator de transcrição, Elk-1, ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. O segundo sinal vem da glicoproteína B7 na superfície da célula que apresenta o antígeno. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases, finalmente produzindo c-Jun. Os dois peptídeos, c-Fos e c-Jun, podem produzir a proteína AP-1, um fator de transcrição que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expressão (Liet al., 1996). A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982; Martins-Green e Bissell, 1995) propuseram que a matriz extracelular é capaz de induzir expressão gênica específica em tecidos em desenvolvimento, especialmente aqueles do fígado e da glândula mamária, onde a indução de fatores de transcrição específicos dependem da ligação célula-substrato (Liu et al., 1991; Streuli et al., 1991; Notenboom et al.1996). Muitas vezes, a presença de integrina ligada previne a ativação de genes que especificam a morte celular (Brooks et al., 1994; Montgomery et al., 1994). Portanto, a matriz extracelular é uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o núcleo para dar expressão gênica específica. Estudos recentes mostraram que a ligação de integrinas à matriz extracelular

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

113

CÉLULA APRESENTADORA DO ANTÍGENO

SINAL 1 Citoplasma

SINAL 2

MHC II Antígeno Receptor da célula T B7 CD28

Extracelular

Citoplasma RAF

T-LINFÓCITO

ELK-1 ativa transcrição de c-fos Intensificador de interleucina 2 Fator de transcrição AP-1

Núcleo Transcrição de IL-2

Figura 3.36

Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T. O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. O segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula apresentante do antígeno. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de transcrição AP-1. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal. As duas subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcrição AP-1 que pode ativar intensificadores específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2.

pode estimular a via RTK-Ras, como também pode estimular a interação da célula com o L1, N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberação de íons cálcio, ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento característicos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al., 1995). Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de adesão celular são também transdutores de sinais. Interações recíprocas na superfície celular Quando duas células interagem durante o desenvolvimento, ambas são modificadas na maioria das vezes. Essa indução recíproca é mediada por interações na membrana

114

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Citoplasma

Molécula de adesão celular

Receptor FGF

Extracelular

Citoplasma

Sinal

Figura 3.37

Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. Os receptores FGF podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. Isso pode ser feito pela interação de moléculas de adesão opostas, ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase.

celular. Uma via intensamente usada é o sistema Wingless-Hedgehog. Nessa via, duas células (ou grupo de células) são adjacentes; uma delas produz a proteína Hedgehog e a secreta. O peptídeo age na célula vizinha ocasionando a produção da proteína Wingless (Wnt). A proteína Wingless, por sua vez, é também secretada e se liga à célula vizinha, estimulando-a a continuar a síntese de Hedgehog. O resultado é a estabilização de uma borda onde o tecido em um lado secreta proteína Hedgehog, enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda é crítica na produção de segmentos e apêndices em Drosophila, como também, subdivisões cerebrais e membros em mamíferos (Figura 3.38; Ingham, 1994; Niswander et al., 1994; Wilder e Perrimon, 1995). [cell8.html] A superfície celular é um lugar extremamente importante para interações desenvolvimentais. Essas incluem adesão diferencial de uma célula a outras, a adesão diferencial de um tipo de célula a uma matriz extracelular e a comunicação de sinais para a diferenciação e divisão celulares. Em 1782, o ensaista francês Denis Diderot pôs a questão da morfogênese no sonho febril de um físico. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma miríade de “pequenos corpos sensíveis” que se juntavam para formar um agregado, mas ele não podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. Estudos recentes mostraram que essa ordenação é devida às moléculas na superfície dessas células. Em capítulos subseqüentes, veremos com mais detalhes essas interações morfogenéticas. Estamos agora no estágio onde podemos iniciar o estudo da embriogênese precoce e ver a integração entre os processos orgânicos, genéticos e celulares no desenvolvimento animal.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese

115

Receptor Frizzled

Wingless / proteína Wnt

Proteína DPP

Figura 3.38

Prot. Dishevelled Quinase Zw3 Prot. Armadillo (ß-catenina)

wingless patched decapentaplegic

engrailed hedgehog Proteína engrailed

Proteína Smoothened

Ci ativo Ci inativo Proteína G

Interações recíprocas entre células na via wingless-hedgehog em Drosophila. A proteína Wingless é secretada por uma célula e se difunde a uma curta distância. A célula vizinha liga a proteína Wingless originando a ativação da proteína, que bloqueia a ação inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a proteína Armadillo (uma catenina). A proteína Armadillo ativada induz a célula a transcrever o gene hedgehog (hh). Essa proteína é secretada e ligada pela célula vizinha. Ligando a proteína Hedgehog faz com que a célula transcreva o gene wingless e secrete a proteína.

Receptor Patched Proteína Hedgehog

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PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

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Padrões de Desenvolvimento
4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 5 Clivagem: Criando multicelularidade 121 167 209

II
253 341

6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

7 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 8 Especificidade axônica 307

9 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

121

Fertilização: Iniciando um novo organismo

4

Desejo e desejo e desejo Sempre o desejo procriativo do mundo. Saindo da obscuridade iguais opostos avançam, Sempre substância e aumento, sempre sexo, Sempre uma tessitura de identidade, sempre distinção, Sempre uma criação de vida.
WALT WHITMAN (1855)

F

ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais

O objetivo final de todas as intrigas amorosas, sejam elas cômicas ou trágicas, é na realidade mais importante que todas as outras finalidades na vida humana. Ele se volta para nada menos que a composição da próxima geração.
A SCHOPENHAUER (CITADO POR C. DARWIN, 1871)

(gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos derivados dos dois genitores. A fecundação, portanto, realiza duas atividades separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução (criação de novos organismos). Assim, a primeira função da fecundação é a de transmitir genes dos pais para a prole, e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo aquelas reações que permitem o desenvolvimento. Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie, os eventos da concepção consistem, em geral, de quatro atividades principais: • Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Na maioria dos casos, isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie. • Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. Somente um espermatozóide pode, em última análise, fecundar um óvulo. Isso é geralmente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro. • Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo. • Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento.

Estrutura dos gametas
Existe um diálogo complexo entre óvulo e espermatozóide. O óvulo ativa o metabolismo do espermatozóide que é essencial para a fecundação, e o espermatozóide retorna a mensagem ativando o metabolismo do óvulo necessário para o início do desenvolvimento. Porém, antes de investigar esses aspectos da fecundação, temos que considerar as estruturas do espermatozóide e do óvulo – dois tipos de células especializadas para a fertilização. Espermatozóide Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holandês que co-descobriu o espermatozóide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vivendo em seu interior (daí o termo espermatozóides, significando “animais do esperma”). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do organismo onde se encontravam, porém, posteriormente chegou a acreditar que cada espermatozóide continha um embrião pré-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que 121

122

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 4.1

A criança humana pré-formada no espermatozóide, conforme representada por Nicolas Hartsoeker (1964).

espermatozóides eram sementes (tanto sperma como sêmen significam “semente”), e que a fêmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram plantadas. Sob esse aspecto, ele estava voltando a uma noção da procriação enunciada por Aristóteles 2000 anos antes. Por mais que tentasse, Leeuwenhoek era continuamente desapontado em suas tentativas de achar um embrião pré-formado nos espermatozóides. Nicolas Hartsoeker, o outro co-descobridor do espermatozóide, desenhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pré-formado (“homúnculo”) dentro do espermatozóide (Figura 4.1). Essa crença de que o espermatozóide continha um organismo embrionário inteiro, nunca recebeu muita aceitação, porque implicava num enorme desperdício de vida em potencial. A maioria dos investigadores consideravam o espermatozóide como sem importância (Veja Pinto-Correia, 1997, para detalhes sobre essa extraordinária história). [fert1.html] A primeira evidência sugerindo a importância do espermatozóide na reprodução veio de uma série de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700. Spallanzani demonstrou que sêmen filtrado de rã, livre de espermatozóide, não fecundava óvulos. Concluiu, porém, que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro, e não o espermatozóide, era o agente da fertilização. Ele acreditava, também, que os “animais espermáticos” eram parasitas. A combinação das melhores lentes de microscópio e da teoria celular, levaram a uma reapreciação da função espermática. Em 1924, J. L. Prevost e J. B. Dumas afirmaram que os espermatozóides não eram parasitas, mas sim os agentes ativos da fertilização. Notaram a existência universal de espermatozóides em machos sexualmente maduros e sua ausência em indivíduos imaturos ou idosos. Essas observações, acopladas à conhecida ausência de espermatozóides na mula estéril, os convenceram que “existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade fecundadora do animal”. Eles propuseram que o espermatozóide penetra o óvulo e contribui materialmente para a geração seguinte. Essas assertivas não foram em geral levadas em consideração até a década de 1840, quando A. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células contidas em testículos adultos. Kolliker ridicularizou a idéia que o sêmen poderia ser normal e ainda assim tolerar a presença de um número enorme de parasitas. Mas ainda assim, negou que haveria qualquer contato físico entre espermatozóide e óvulo. Acreditava que o espermatozóide excitava o desenvolvimento do óvulo de maneira semelhante aquela pela qual o ímã comunica sua presença ao ferro. Somente em 1876, Oscar Hertwig e Hermann Fol, independentemente, demonstraram a entrada do espermatozóide no óvulo e a união de seus núcleos. Hertwig procurou um organismo adequado para observações microscópicas detalhadas e descobriu que o ouriço-do-mar Mediterrâneo, Toxopneustes lividus, era perfeito para isso. Não somente era freqüente na região e sexualmente maduro a maior parte do ano, como seus óvulos eram abundantes e transparentes, mesmo sob alto aumento. Após misturar espermatozóide e óvulo em suspensões, Hertwig repetidas vezes observou o espermatozóide entrando no óvulo e viu a união dos núcleos dessas células. Notou também que apenas um espermatozóide era visto penetrar em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião derivavam dos núcleos fundidos por ocasião da fertilização. Fol fez observações semelhantes e detalhou o mecanismo de penetração do espermatozóide. A fertilização estava finalmente reconhecida como a união de espermatozóide e óvulo, e a união dos gametas do ouriço-do-mar permanece como um dos exemplos de fertilização melhor estudado. [fert2.html] Cada espermatozóide consiste de um núcleo haplóide, um sistema de propulsão para movimentar o núcleo, e um saco de enzimas que permitem a entrada do núcleo no óvulo. A maior parte do citoplasma do espermatozóide é eliminada durante o amadurecimento, deixando somente certas organelas modificadas para exercer a função espermática (Figura 4.2). Durante o transcorrer do amadurecimento, o núcleo haplóide se torna muito aerodinâmico e seu DNA altamente comprimido. Na parte frontal desse núcleo haplóide comprimido está a vesícula acrossômica, derivada do aparelho de Golgi, contendo enzimas que digerem proteínas e açúcares complexos; por isso, pode

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

123

ser considerado como uma vesícula secretória modificada. Essas enzimas armazenadas são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo. Em muitas espécies, tais como os ouriços-do-mar, existe uma região de moléculas globulares de actina entre o núcleo e a vesícula acrossômica. Essas proteínas são usadas para estender um processo de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. Em ouriços-do-mar e várias outras espécies, o reconhecimento mútuo entre espermatozóide e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. Juntos, o acrossomo e o núcleo constituem a cabeça do espermatozóide. Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Em algumas espécies (como o nematelminto parasitário Ascaris), o espermatozóide viaja por movimentação amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espécies, porém, um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu flagelo. Os flagelos são estruturas complexas. A sua principal porção motora é chamada axonema. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos. Realmente, só um microtúbulo está completo, contendo 13 protofilamentos; o outro tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensional de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13 protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica, a tubulina. Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras proteínas também são críticas para a função do flagelo. A força para a propulsão do espermatozóide é proporcionada pela dineína, uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4.3B). A dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em

Golgi remanescente

Centríolo Flagelo Centríolo Flagelo Vesícula acrossômica e grânulo Núcleo Mitocôndrias Cauda Microtúbulos Porção final

Aparelho de Golgi Mitocôndrias

Figura 4.2
Axonema Mitocôndrias Centríolo Núcleo Membrana plasmática Vesícula acrossômica Porção mediana Pescoço Cabeça do espermatozóide

A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de mamífero. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade posterior do espermatozóide, e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica na futura extremidade anterior. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte mediana do espermatozóide. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo se condensa. O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)

124

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 4.3 O aparelho de movimentação do espermatozóide. (A) Seção transversal do flagelo de um espermatozóide mamífero, mostrando o axonema central e as fibras externas. (B) Diagrama interpretativo do axonema, mostrando o arranjo “9 + 2” dos microtúbulos e outros componentes flagelares. O diagrama esquemático mostra a associação de protofilamentos de tubulina em um microtúbulo duplo. A primeira (“A”) porção do par duplo é um microtúbulo normal compreendendo 13 protofilamentos. A segunda (“B”) porção da dupla contém somente 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. (C) Um modelo tridimensional do microtúbulo “A”. As subunidades α-tubulina e β-tubulina são semelhantes, porém, não idênticas, e o microtúbulo pode mudar de tamanho polimerizando e despolimerizando subunidades de tubulina em qualquer um dos lados. (A cortesia de D. M. Phillips; B segundo De Robertis et al., 1975, e Tilney et al., 1973; C de Amos e Klug, 1974, cortesia dos autores.)

(A)

(C)

(B) Membrana plasmática Trave radial Cabeça da trave Nexina Subfibra A Subfibra B Microtúbulo central MICROTÚBULO DUPLO

Braço interno de dineína Braço externo de dineína AXONEMA

energia mecânica que propulsiona o espermatozóide. Essa energia pemite o deslizamento ativo das duplas externas de microtúbulos, levando o flagelo a se curvar (Ogawa et al., 1977; Asai, 1996). A importância da dineína pode ser avaliada em indivíduos com a síndrome genética chamada de tríade de Kartagener. Esses indivíduos não têm dineína em suas células ciliadas e flageladas, o que as torna estruturas imóveis. Machos com essa doença são estéreis (espermatozóide imóvel), susceptíveis à infeções brônquicas (cílios respiratórios imóveis), e têm 50 porcento de probabilidade de ter o coração do lado direito de seu corpo (Afzelius, 1976). Outra importante proteína flagelar parece ser a histona H1. Essa proteína é geralmente vista dentro do núcleo, onde dobra e aperta a cromatina em agregados. No entanto, Multigner e colaboradores (1992), mostraram que essa mesma proteína estabiliza os microtúbulos flagelados impedindo seu espalhamento. O arranjo “9 + 2” dos microtúbulos com os braços de dineína foi conservado nos axonemas em todo o reino eucarioto, sugerindo que é extremamente adequado na transmissão de energia para a movimentação. A energia para mover o flagelo e assim impulsionar o espermatozóide vem dos anéis de mitocôndrias localizadas na região do pescoço do espermatozóide (veja Figura 4.2). Em muitas espécies (notavelmente mamíferos) uma densa camada de fibras se interpôs entre a bainha mitocondrial e o axonema. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozóide. Como sua espessura diminui na direção apical, as fibras provavelmente previnem que a cabeça

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

125

do espermatozóide balance abruptamente. Assim, o espermatozóide sofreu extensa modificação para assegurar a passagem de seu núcleo para o óvulo. Entretanto, a diferenciação do espermatozóide não se completa nos testículos. Após sua expulsão para a luz dos túbulos seminíferos, os espermatozóides são armazenados no epidídimo, onde adquirem a capacidade de se mover. Essa mobilidade é conseguida através de mudanças no sistema gerador de ATP (possivelmente através da modificação da dineína), assim como de alterações da membrana plasmática que permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi, 1994). Os espermatozóides liberados durante a ejaculação podem se mover, mas ainda não têm a capacidade de se ligar ao óvulo e fertilizá-lo. Esses estágios finais do amadurecimento espermático (chamado capacitação) não ocorrem antes do espermatozóide ter permanecido no interior do trato reprodutivo feminino durante um certo tempo. O óvulo Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem que estar armazenado no óvulo maduro. Enquanto o espermatozóide eliminou a maior parte do seu citoplasma, o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material, mas continua a acumulá-lo ativamente. Sintetiza ou absorve proteínas, como a gema, que atuam como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Assim, gametas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas pela acumulação de gema. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são comparativamente grandes. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente 2 x 10-4 µm3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozóide. A representação do óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos relativos, assim como os vários componentes do óvulo maduro. Assim, enquanto o espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais, o óvulo tem ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadurecimento. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas, RNAs, substâncias químicas protetoras e fatores morfogenéticos:* • Proteínas. Será longo o período a transcorrer antes do embrião ser capaz de se alimentar ou obter alimento de sua mãe. As células embrionárias precoces precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. Em muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo. Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado, corpo gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo. • Ribossomos e tRNA. O embrião precoce precisa produzir muitas de suas próprias proteínas; em algumas espécies, ocorre um surto de síntese protéica pouco após a fecundação. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA, preexistentes no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos, e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012 ribossomos durante a prófase meiótica. • RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para proteínas sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no oócito. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25.000 a 50.000 tipos diferentes de mRNA. Porém, esse mRNA permanece dormente até após a fertilização (veja Capítulo 12). • Fatores morfogenéticos. Essas moléculas dirigem a diferenciação celular em certos tipos de células. Parecem estar localizadas em diferentes regiões do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja Capítulo 13).

* Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie. A síntese e a colocação desses materiais será tratada no Capítulo 22, quando discutirmos a diferenciação das células germinativas.

126

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 4.4

Estrutura do óvulo do ouriço-do-mar durante a fertilização. (Segundo Epel, 1977.)

Envoltório vitelínico Camada gelatinosa Espermatozóide

Membrana plasmática Grânulo de gema Grânulo cortical

Mitocôndria

Núcleo

Substâncias químicas protetoras. O embrião não pode fugir de predadores ou movimentar-se para um ambiente mais seguro, necessitando, por isso, estar equipado para enfrentar esses fatores. Muitos óvulos contêm filtros ultravioleta e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar; alguns óvulos contêm moléculas que predadores potenciais acham desagradáveis; a gema de óvulos de aves contém até mesmo anticorpos. [fert3.html] Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande núcleo. Em algumas espécies (por exemplo, ouriços-do-mar), o núcleo já é haplóide no momento da fertilização. Em outras espécies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamíferos), o núcleo do óvulo ainda é diplóide, e o espermatozóide penetra antes das divisões meióticas estarem completas. O estágio do núcleo do óvulo no momento da entrada do espermatozóide está ilustrado na Figura 4.5. Envolvendo o citoplasma está a membrana plasmática do óvulo. Essa membrana deve regular o fluxo de certos íons durante a fertilização e deve ser capaz de se fundir com a membrana plasmática do espermatozóide. Acima da membrana plasmática está o envoltório vitelínico (Figura 4.6). O componente principal desse envoltório forma uma esteira fibrosa sobre o óvulo. Essa esteira é suplementada por extensões de glicoproteínas da membrana plasmática e pontes proteináceas vitelínicas que aderem a esteira à membrana (Mozingo e Chandler, 1991). O envoltório vitelínico é essencial para a ligação espécie-específica do espermatozóide. Nos mamíferos, o envoltório vitelínico é uma matriz extracelular separada e grossa chamada zona pelúcida. O óvulo do mamífero é também rodeado por uma camada de células, as células do cumulus (Figura 4.7). A camada cumular representa células foliculares ovarianas que estavam alimentando o óvulo quando da sua liberação do ovário. O espermatozóide dos mamíferos tem que passar por essas células para fertilizar o óvulo*. Imediatamente abaixo da membrana plasmática do óvulo está uma fina casca (de aproximadamente 5µm) de um citoplasma gel-símile chamado de córtex. O citoplasma nessa região é mais duro que o citoplasma interno e contém altas concentrações de moléculas globulares de actina. Durante a fertilização, essas moléculas polimerizam-se
*Em mamíferos, as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona pelúcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente adjacentes à zona pelúcida; são as células mais internas do cumulus.

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

127

Vesícula germinal

Corpos polares

Pronúcleo feminino

Oócito primário jovem Os vermes anelídeos Dinophilus e Sacocirrrus O verme poliqueta Histriobdella O platelminto Otomesostoma O onicóforo Peripatopsis

Oócito primário totalmente crescido O nematelminto Ascaris O mesozoário Dicyema A esponja Grantia O verme poliqueta Myzostoma O verme concha Nereis O molusco Spisula O verme equiuróide Urechis Cães e raposas

Primeira metáfase

Segunda metáfase

Meiose completa

O verme nemerteano Cerebratulus O verme poliqueta Chaetopterus O molusco Dentalium O verme central Pectinaria Muitos insetos Estrela-do-mar

O anfioxo Branchiostoma Anfíbios Mamíferos (maioria) Peixes

Cnidários (e.g., anêmonas) Ouriços-do-mar

Figura 4.5

para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos são necessários para a divisão celular, e são também usados para estender a superfície do óvulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozóide para dentro da célula (veja Figura 4.6; veja também a Figura 4.19). Ainda, dentro desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas

Estágios de maturação do óvulo no momento da entrada do espermatozóide em diferentes animais. (Segundo Austin, 1965.)

Microvilosidades

Envoltório vitelínico

(A)

(B)

Grânulo cortical

Figura 4.6

A superfície do óvulo do ouriço-do-mar. (A) Micrografia eletrônica de varredura de um óvulo antes da fertilização. A membrana plasmática está exposta onde o envoltório vitelínico foi retirado. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão de um ovo não-fertilizado, mostrando microvilosidades e a membrana plasmática, que estão estreitamente cobertas pelo envoltório vitelínico. Um grânulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmática do óvulo. (de Schroeder, 1979, cortesisa de T. E. Schroeder.)

128

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Cumulus

Óvulo

Zona pelúcida

(A)

(B)

Figura 4.7

Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. (A) O ovo do hamster, ou óvulo, está encaixado na zona pelúcida. Essa, por sua vez, está envolvida por células do cumulus. Uma célula do corpo polar, produzida durante a meiose, também está dentro da zona pelúcida. (B) Em menor aumento, um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. Partículas de carbono coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)

ligadas à membrana são homólogas à vesícula acrossômica do espermatozóide, sendo organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolíticas. No entanto, enquanto cada espermatozóide contém uma vesícula acrossômica, cada óvulo do ouriço-do-mar contém aproximadamente 15.000 grânulos corticais. Além das enzimas digestivas, os grânulos corticais também contêm mucopolissacarídeos, glicoproteínas adesivas e proteína hialina. As enzimas e os mucopolissacarídeos atuam na prevenção da entrada de outros espermatozóides no óvulo após a entrada do primeiro, e as proteínas hialinas e adesivas envolvem o embrião precoce providenciando apoio aos blastômeros do estágio de clivagem. Muitos tipos de óvulos têm uma geléia no exterior do seu envoltório vitelínico (Figura 4.4). Essa rede de glicoproteínas pode ter numerosas funções, mas é principalmente usada para atrair ou ativar o espermatozóide. O óvulo, portanto, é uma célula especializada para receber o espermatozóide iniciando o desenvolvimento.

Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância
Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. Esse ambiente pode ser tão pequeno quanto uma poça de maré ou tão grande como o oceano. Além disso, esse ambiente é compartilhado com outras espécies que podem liberar suas células sexuais no mesmo período. Esses organismos enfrentam dois problemas: 1) Como podem espermatozóides e óvulos se encontrarem quando em concentrações tão diluídas, e 2) que mecanismo inibe o espermatozóide da estrelado-mar tentar fertilizar os óvulos do ouriço-do-mar? Dois mecanismos principais evoluíram para resolver essas dificuldades: atração e ativação espécie-específica do espermatozóide. Atração do Espermatozóide A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi documentada em numerosas espécies, incluindo cnidários, moluscos, equinodermos e urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotático mas também regulam o período de sua liberação. Oócitos em desenvolvimento, em

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

129

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 4.8

vários estágios de amadurecimento, foram fixados sobre lâminas microscópicas, e espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos. Miller encontrou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam completado sua segunda divisão meiótica, não havia atração de espermatozóide pelos óvulos. Porém, após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem prontos para ser fertilizados, o espermatozóide migrava em sua direção. Assim, esses oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem, mas também o momento em que o atraem. Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz, 1978; Ward e Kopf, 1993). Uma dessas moléculas quimiotáticas, um peptídio de 14 aminoácidos chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata (Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia, mesmo em concentração muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de água do mar, contendo espermatozóide de Arbacia, é colocada em uma lâmina de microscópio, o espermatozóide geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. Se uma quantidade mínima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a região da injeção e ali se congrega. À medida que o resact continua a difundir-se, mais espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact é específico para A. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Espermatozóide de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers, 1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concentração desse composto até alcançar o óvulo. Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. Esses peptídios (mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam aumentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio (Hardy et al., 1994). O receptor para resact é uma proteína transmembrana. Quando ela liga o resact ao lado externo da célula, resact causa uma mudança conformacional que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático. Isso aumenta a concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e Babcock, 1993). Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar Uma segunda interação entre espermatozóide e óvulo envolve a ativação do espermatozóide pela geléia do óvulo. Na maioria dos invertebrados marinhos, essa reação acrossômica tem dois componentes: a fusão da vesícula acrossômica com a membrana plasmática do espermatozóide (uma exocitose que resulta na liberação dos componentes da vesícula acrossômica) e a extensão do processo acrossômico (Figura 4.9; Colwin e Colwin, 1963). A reação acrossômica pode ser iniciada pela geléia do óvulo solubilizada, pela geléia que envolve o óvulo, ou mesmo em certas espécies, pelo contato com o próprio óvulo. Também pode ser ativada artificialmente pelo aumento da concentração de cálcio na água do mar.

Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia. Um nanolitro de uma solução 10-nM de resact é injetado em uma gota de 20ml de suspensão de espermatozóide. A posição da micropipeta está indicada em (A). (A) Uma fotografia de 1 segundo, mostrando espermatozóide nadando em círculos estreitos antes da adição de resact. (B-D) Exposições semelhantes de 1 segundo mostrando a migração do espermatozóide para o centro do gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos após a injeção. (de Ward et al., 1985, cortesia de V. D. Vacquier.)

130

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Membrana acrossômica Enzimas acrossômicas Membrana do espermatozóide Actina globular Bindina

Microfilamentos de actina

Núcleos

Figura 4.9

Reação acrossômica em espermatozóide de equinoderma. (A-C) A porção da membrana acrossômica diretamente abaixo da membrana do espermatozóide funde-se com essa liberando o conteúdo da vesícula acrossômica. (D) Enquanto as moléculas de actina se agregam para produzir microfilamentos, o processo acrossômico se estende para fora. Fotografias reais da reação acrossômica no espermatozóide do ouriço-do-mar são mostradas em seguida. (Segundo Summers e Hylander, 1974; fotografias por cortesia de G. L. Decker e W. J. Lennarz.)

Em ouriços-do-mar, o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan, 1967; Franklin, 1970; Levine et al., 1978). A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura 4.9. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do espermatozóide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994 a,b). A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão, mediada pelo cálcio, da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do espermatozóide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*. A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo acrossômico (veja Figura 4.9). Essa protrusão se origina da polimerização de moléculas globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposição do espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utilização de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial. A energia gerada é usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985). Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar são muitas vezes muito específicos. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de seus próprios óvulos. No entanto, o espermatozóide de S. purpuratus também pode ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. punctulata) (Summers e Hylander, 1975). Portanto, a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécieespecífico em algumas espécies, mas não em outras.
* Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. Em todos os casos, há uma fusão mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. Realmente, a semelhança entre a exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda. Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al., 1992; González-Martínez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do espermatozóide ligam essas moléculas, causam a despolarização da membrana que poderia abrir canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica. As proteínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas usadas na ponta do axônio (Bi et al., 1995).

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

131

Membrana celular do espermatozóide Membrana acrossômica Fusão entre a membrana celular do espermatozóide e a membrana acrossômica adjacente

Núcleo

Centríolo

Figura 4.10

Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. (A) Micrografia de transmissão eletrônica de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. A membrana acrossômica pode ser vista formando vesículas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. (A de Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)

Informações adicionais

&

Especulações

Ação à Distância: Gametas de Mamíferos
MUITO DIFÍCIL estudar as interações que podem estar ocorrendo entre gametas de mamíferos antes do contato espermatozóide-óvulo. Um motivo óbvio para isso é que a fertilização ocorre dentro dos ovidutos femininos. Embora seja relativamente fácil mimetizar as condições rodeando a fertilização do ouriço-do-mar (usando água do mar natural ou artificial), ainda não conhecemos os componentes dos vários ambientes naturais encontrados pelo espermatozóide dos mamíferos em sua viajem ao encontro do óvulo. Um segundo motivo para essa dificuldade é que a população de espermatozóide ejaculada para o interior da fêmea é provavelmente muito heterogênea, contendo espermatozóides em diferentes estágios de amadurecimento. Dos 280 x 106 espermatozóides humanos normalmente ejaculados para o interior da vagina, somente 200 atingem a região ampolar do oviduto, onde ocorre a fecundação (Ralt et al., 1991). Como menos de 1 em 10.000 espermatozóides chegam perto do óvulo, é difícil analisar aquelas molé-

É

culas que permitem aos espermatozóides nadar em direção ao óvulo e serem ativados. Há muita controvérsia em relação ao deslocamento do espermatozóide mamífero até o oviduto, a capacitação e as reações de hiperativação que parecem ser necessárias em algumas espécies para ligá-lo ao óvulo, e a possibilidade que o óvulo possa estar atraindo o espermatozóide por quimiotaxia. Translocação e Capacitação O trato reprodutivo de mamíferos femininos exerce um papel muito ativo no processo de fertilização. Enquanto a motilidade espermática é necessária para que o espermatozóide do camundongo, uma vez no oviduto encontre o ovo, a motilidade espermática provavelmente é um fator de menor importância para entrar no oviduto. O espermatozóide é encontrado no oviduto de camundongos, hamsters, cobaia, vacas e seres humanos dentro de 30 minutos após a deposição, um período “demasiadamente curto para ser atingido até mesmo pelo espermatozóide mais olím-

pico, se confiar somente no poder de seus flagelos” (Storey, 1995). É mais provável que o espermatozóide seja transportado para o oviduto por meio da atividade muscular do útero. Espermatozóide mamífero recém-ejaculado é incapaz de sofrer a reação acrossômica sem ter residido por algum tempo no trato reprodutivo feminino (Chang, 1951; Austin, 1952). Esse requisito para capacitação varia de espécie para espécie (Gwatkin, 1976) e pode ser mimetizado in vitro pela incubação de espermatozóide em meios de cultura de tecidos (contendo íons de cálcio, bicarbonato e soroalbumina) ou em fluido dos ovidutos. Os espermatozóides que não foram capacitados são “segurados” na matriz cumular, não atingindo assim o óvulo (Austin, 1960; Corselli e Talbot, 1987). As alterações moleculares que explicam a capacitação ainda são desconhecidas (veja Yanigamachi, 1994), mas existem quatro conjuntos de alteraçõess moleculares que podem ser importantes. Primeiro, a membrana da célula espermática

132

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

pode se alterar, mudando sua composição de lipídios. A concentração de colesterol no espermatozóide é diminuída durante a capacitação do espermatozóide em várias espécies (Davis, 1981), e duas proteínas encontradas tanto no soro como no trato reprodutivo feminino (albumina e proteína 1 de transferência lipídica), foram verificadas remover colesterol do espermatozóide humano (Langlais et al., 1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lugar, certas proteínas ou carboidratos na superfície do espermaozóide são perdidos durante a capacitação (Poirier e Jackson, 1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant, 1987). É possível que essas entidades perdidas durante a capacitação estivessem bloqueando locais de reconhecimento para as proteínas que se ligam à zona pelúcida. Em terceiro lugar, certas proteínas são fosforiladas por um caminho cAMP-dependente. O AMP cíclico pode induzir artificialmente a competência através da proteína quinase cAMP-dependente (PKA), que é necessária tanto para a aquisição de competência como para a fosforilação de tirosino-quinases. É possível que o trato reprodutivo feminino estimule a adenilciclase do espermatozóide a produzir mais cAMP e que esse ative a proteína quinase que inicia a cascata de fosforilação, terminando na fosforilação e ativação das proteínas envolvidas na ligação do espermatozóide à zona pelúcida e mediando a exocitose da vesícula acrossômica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o potencial da membrana do espermatozóide é dramaticamente reduzido (de cerca de – 30 para –50 mV; Zeng et al., 1995). Porém, ainda é incerto se esses eventos são independentes um do outro e até que ponto cada um deles produz capacitação do espermatozóide.

Hiperativação e Quimiotaxia As diferentes regiões do trato reprodutivo feminino podem secretar fatores diferentes, regionalmente específicos. Esses fatores podem influenciar a motilidade espermática assim como a capacitação. Por exemplo, quando os espermatozóides de certos mamíferos (especialmente hamsters, cobaias e algumas variedades de camundongos) passam do útero para os ovidutos, ficam “hiperativados”, passando a nadar com maior velocidade e gerando maior força. Suarez e colaboradores (1991) mostraram que enquanto essas reações não são conducentes a viagens em fluidos de baixa viscosidade, parecem ser muito adequadas para o movimento linear do espermatozóide no fluido viscoso que poderá encontrar no oviduto. Além de aumentar a atividade do espermatozóide, fatores solúveis no oviduto também podem prover o componente direcional do movimento do espermatozóide. Especulou-se que o óvulo (ou, mais provavelmente, o folículo ovariano no qual o óvulo se desenvolve) pode estar secretando substâncias quimiotáticas que poderiam atrair o espermatozóide em direção ao óvulo durante os últimos estágios da migração (veja Hunter, 1989). Ralt e colaboradores (1991) testaram essa hipótese usando fluido de folículos humanos cujos óvulos estavam sendo usados para fertilização in vitro. Realizando um experimento semelhante aquele descrito anteriormente com ouriços-do-mar, os autores microinjetaram uma gota do fluido folicular em uma gota maior da suspensão de espermatozóides. Feito isso, observaram que parte do espermatozóide mudou sua direção de movimentação, passando a migrar ao encontro da fonte de fluido folicular. A microinjeção de outras soluções não teve esse efeito. Esses estudos não eliminam a

possibilidade de que o efeito fosse devido a uma estimulação geral do movimento ou do metabolismo do espermatozóide. No entanto, essas investigações revelaram uma correlação fascinante: o fluido de somente a metade dos folículos testados mostrou um efeito quimiotático, e em quase todos os casos, o óvulo só era fertilizável se, e somente se, o fluido demonstrasse habilidade quimiotática (P < 0,0001). É possível, portanto, que tal como certos óvulos de invertebrados, o óvulo humano secrete um fator quimiotático somente quando estiver capacitado para a fertilização. Deve-se notar que “o prêmio da corrida não vai sempre para o mais rápido”. Embora algum espermatozóide possa alcançar a região ampolar do oviduto (onde ocorre a fertilização) dentro de meia hora após a relação sexual, aquele espermatozóide pode ter poucas chances de fertilizar o óvulo. Wilcox e colaboradores (1995) acharam que quase todas os engravidamentos humanos resultam de relacionamento sexual durante um período de seis dias, terminando no dia da ovulação. Isso significa que o espermatozóide fertilizador poderia demorar até seis dias para fazer a jornada. Eisenbach (1995) propôs a hipótese pela qual a capacitação é um acontecimento transitório, e que é dada ao espermatozóide uma janela de competência relativamente breve, durante a qual pode ter sucesso na fertilização do óvulo. Quando os espermatozóides atingem a ampola, adquirem competência, mas se aí ficam por um período demasiadamente longo, perdem-na. O espermatozóide pode também ter diferentes prazos de sobrevivência, dependendo da sua localização dentro do trato reprodutivo; isso pode permitir que algum espermatozóide chegue mais tarde, porém com uma melhor probabilidade de sucesso do que aquele que chegou dias antes.

Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas
Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-Mar Uma vez que o espermatozóide do ouriço-do-mar tiver penetrado na geléia do óvulo, o processo acrossômico do espermatozóide faz contato com o envoltório vitelínico do óvulo (Figura 4.11). Um importante passo do reconhecimento espécie-específico ocorre nesse ponto. A proteína acrossômica mediando esse reconhecimento é chamada bindina. Em 1977, Vacquier e colaboradores isolaram essa proteína insolúvel, de 30.500Da, do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. Essa proteína é capaz de se

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

133

Figura 4.11

Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma microvilosidade do óvulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.)

Figura 4.12

ligar a óvulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977). Ainda mais, sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S. Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados, mas não aqueles de Arbacia puctulata. Usando técnicas imunológicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico, exatamente onde deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4.13). Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relacionadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. Esse achado implica na existência de

(A)

BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE S. purpuratus S. fransciscanus

(B)

Aglutinação espécie-específica por bindina de óvulos desgeleificados . (A) aglutinação promovida pela adição de 212 µg de bindina em um recipiente plástico contendo 0.25 ml de suspensão a 2% (volume/ volume) de óvulos. Após 2-5 min de agitação branda, os recipientes foram fotografados. Cada bindina somente se ligou a seus próprios óvulos. (B) Fotomicrografia de fluorescência de óvulos de S. purpuratus ligados entre si por partículas de bindina de S. purpuratus marcadas por fluorescência. As partículas de bindina estavam invariavelmente nos lugares onde dois óvulos se encontravam. (A baseado em fotografias de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)

S. purpuratus

OVOS DESGELEIFICADOS

Partículas de bindina

Aglutinação

Sem aglutinação Óvulos

S. fransciscanus

Sem aglutinação

Aglutinação

134

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

DAB + H2O2 Precipitado denso Anti-bindina de coelho

(B) Precipitado DAB

Imunoglobulina porcina anti-coelho conjugada com a enzima peroxidase

(C) Membrana vitelínica do óvulo

Acrossomo

Núcleo

Processo acrossômico
Bindina Espermatozóide

Figura 4.13

Localização de bindina no processo acrossômico. (A) a técnica de localização imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta. Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina, e esses anticorpos foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica. Quando a bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermatozóide. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem, o espermatozóide foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho. Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase. Dessa maneira, moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia bindina. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina (DAB) e água oxigenada. O precipitado só se forma onde há bindina. (B) Localização de bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33.200x). (C) Localização de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. (B e C de Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)

receptores espécie-específicos de bindina no envoltório vitelínico. Tais receptores também foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973), que saturaram óvulos de ouriço-do-mar com espermatozóide. Como pode ser visto na Figura 4.14 A, a ligação do espermatozóide não se dá sobre a superfície inteira do óvulo. Mesmo

(A)

Figura Figura 4.14

Receptores de bindina no óvulo. (A) Micrografia eletrônica de varredura do espermatozóide do ouriço-do-mar ligado ao envoltório vitelínico de um óvulo. (B) ligação do espermatozóide de S. purpuratus a partículas de polistireno que foram cobertas com a proteína purificada do receptor de bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)

(B)

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

135

a níveis saturantes de espermatozóide (aproximadamente 1500), parece haver espaço no óvulo para mais cabeças de espermatozóide, indicando haver um número limitante de locais ligantes de espermatozóide. Um grande complexo de glicoproteínas dos envoltórios vitelínicos de óvulos de ouriço-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina radioativa de maneira espécie-específica (Glabe e Vacquier, 1978; Rossignol et al., 1984). Essa glicoproteína é também capaz de competir com óvulos pelo espermatozóide da mesma espécie. Isto é, se espermatozóide de S. purpuratus é misturado com o receptor de bindina de envoltórios vitelínicos de S. purpuratus, o espermatozóide se liga a ele e não irá fertilizar os óvulos. O receptor isolado de S. purpuratus, porém, não irá interferir com a fertilização de outros ouriços-do-mar relacionados. Esse receptor de bindina é uma glicoproteína transmembrana com quase 1300 aminoácidos (Foltz et al., 1993). A região ligante de bindina se estende para o espaço extracelular e provavelmente se torna um componente do envoltório vitelínico. Esses receptores de bindina se agregam em complexos, e centenas deles são provavelmente necessários para amarrar o espermatozóide no óvulo (Figura 4.14B). Assim, reconhecimento espécieespecífico dos gametas do ouriço-do-mar ocorrem ao nível da atração, ativação e adesão do espermatozóide à superficie do óvulo. [fert4.html] Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos
ZP3: A PROTEÍNA LIGANTE DA ZONA PELÚCIDA DO CAMUNDONGO. A zona pelúcida tem nos mamíferos um papel análogo aquele do envoltório vitelínico nos invertebrados. Essa matriz de glicoproteínas é sintetizada e secretada pelo oócito em crescimento, e tem dois papéis importantes durante a fertilização: liga o espermatozóide, e inicia a reação acrossômica após essa ligação (Saling et al., 1979; Florman e Storey, 1982; Cherr et al., 1986). A ligação de espermatozóide à zona é relativamente, porém não absolutamente, espécie-específica (especificidade por espécie não deveria ser um grande problema quando a fertilização ocorre internamente), e a ligação do espermatozóide do camundongo à zona dessa espécie pode ser inibida pela incubação prévia de espermatozóide com glicoproteínas da zona. Bleil e Wassarman (1980, 1986, 1988) isolaram da zona pelúcida do camundongo uma glicoproteína ZP3, de 83-kDa, que é o competidor ativo nesse ensaio de inibição. As outras duas proteínas da zona, ZP1 e ZP2, não puderam competir pela ligação do espermatozóide (Figura 4.15). Ainda mais, ZP3 radiativamente marcada ligou-se às cabeças do espermatozóide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim, ZP3 é a proteína específica na zona pelúcida à qual se liga o espermatozóide do camundongo. ZP3 também inicia a reação acrossômica após os espermatozóides terem se ligado a ela. O espermatozóide do camundongo pode, dessa forma, concentrar suas enzimas proteolíticas diretamente no ponto de fixação à zona pelúcida.

Figura 4.15

Ligação do espermatozóide à zona pelúcida. (A) ensaio de inibição mostrando a diminuição específica da ligação do espermatozóide do camundongo às zonas pelúcidas quando espermatozóide e zonas são incubados com aumentos crescentes da porção carboidrato da glicoproteína ZP3. A importância da porção carboidrato de ZP3 é também, indicada por essa figura. (B) Ligação de ZP3 marcada radioativamente a espermatozóide capacitado do camundongo. (A segundo Bleil e Wassarman, 1980, e Florman e Wassarman, 1985; B de Bleil e Wassarman, 1986, cortesia dos autores.)

Ligação do espermatozóide (%)

ZP3 sem carboidratos

(A)

Equivalentes da zona pelúcida por µl

(B)

136

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

O mecanismo molecular pelo qual a zona pelúcida e o espermatozóide do mamífero se reconhecem mutuamente está sendo estudado. A hipótese corrente sobre a ligação dos gametas de mamíferos postula um conjunto de proteínas do espermatozóide capazes de reconhecer regiões específicas de carboidratos na zona ZP3 do óvulo (Florman et al., 1984; Florman e Wassarman, 1985; Wassarman, 1987; Saling, 1989). A remoção desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou serina suprime a habilidade de ligar o espermatozóide.
PROTEÍNAS DE ADESÃO ESPERMATOZÓIDE-ZONA. O espermatozóide do camun-

dongo não “fura” para chegar ao interior da zona. Na realidade, os espermatozóides se aproximam paralelamente ao plano da superfície da zona e aí são ativamente fixados (Baltz et al., 1988). Como é a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozóides contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos três proteínas adesivas na membrana do espermatozóide, e milhares desses sítios podem ser necessários para prevenir que essas duas células se separem. Há uma controvérsia significativa sobre a questão de se todas as três proteínas no espermatozóide são necessárias para ligação à zona, e quais as suas respectivas funções (veja Figura 4.16: Snell e White, 1996). Parece que cada uma delas tem papéis específicos, mas um tanto sobrepostos na adesão do espermatozóide e na reação acrossômica. Essas três proteínas são: a proteína ligante de galactose, a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.
A PROTEÍNA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). Uma proteína crítica

ligante da zona do espermatozóide parece ser a proteína que especificamente se liga aos resíduos de galactose de ZP3. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos carboidratos críticos da glicoproteína ZP3 é o grupo galactose terminal. Se essa galactose terminal for removida ou modificada quimicamente, a atividade ligante de espermatozóide é perdida. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa proteína, ligando
Zona pelúcida Óvulo

Espermatozóide

ZP3 (proteína ligante de espermatozóide) na Zona

ZP3 Proteínas candidatas a ligação à zona no acrossomo N-acetil glicosamina Galactose Membrana celular do espermatozóide

GALACTOSILTRANSFERASE Ligação cruzada ativa proteínas G Ativação de síntese de IP3 na membrana acrossômica

SP 56 (proteína periférica da membrana)

P95 Ativação de tirosinoquinase Regulação de canais iônicos ou síntese de IP3

Figura 4.16

Liberação de Ca++

Reação acrossômica

Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do camundongo: alguns possíveis participantes. A proteína ZP3 da zona pelúcida liga espermatozóide. Há evidência da ligação de três proteínas espermáticas – a galactosiltransferase da superfície, sp56 e P95 – à ZP3. Essa ligação induz a reação acrossômica através da ativação do fluxo de cálcio. Os detalhes ainda terão que ser elucidados. (Segundo Snell e White, 1996.)

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

137

Figura 4.17

ZP3 à uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as proteínas isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman, 1990). A maioria das proteínas passou pela coluna; porém um peptídio de 56kDa, ligou-se às partículas recobertas com ZP3, mas não se ligou a partículas recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa proteína foi encontrada exposta na membrana espermática; ligava-se a resíduos de galactose, sugerindo fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de galactose na glicoproteína ZP3. A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados), bloqueando a ligação espermatozóide-óvulo (Figura 4.17; Bookbinder et al., 1995).
GALCTOSILTRANSFERASE. A Segunda proteína do espermatozóide que parece

Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e inibe a ligação de espermatozóide a óvulos de camundongo. (A) Ligação de sp56 à zona pelúcida de ovos não-fertilizados. A pista 1 é o resultado da lise de ovos não-fertilizados, fazendo migrar as proteínas extraídas em um gel, transferindo o gel, e sondando para a presença de sp56 com anticorpo marcado. Não se vê sp56. A pista 2 mostra o resultado positivo obtido quando o ovo não-fertilizado é pré-incubado com sp56, indicando que sp56 se liga aos óvulos. A pista 3 mostra os resultados negativos obtidos quando sp56 foi adicionada a embriões bicelulares. A pista 4 mostra o controle quando sp56 purificada é feita migrar no gel. (O anticorpo reconhece a forma não-reduzida de sp56, que migra em 40 kDa). (B) Espermatozóide ligando-se normalmente a ovos não-fertilizados de camundongo (aproximadamente 76 espermatozóides por óvulo). Os embriões bicelulares (aqui marcados por asteriscos) são controles internos mostrando não ocorrer ligação. (C ) Na presença de sp56, o espermatozóide foi impedido de se ligar à zona. (de Bookbinder et al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)

ser importante para ligação espermatozóides-zona é a enzima da membrana celular do espermatozóide, glicosiltransferase. No laboratório de Shur foi demonstrado que esse receptor para a zona é uma enzima que reconhece o açúcar N-acetilglicosamina na ZP3 (Shur e Hall, 1982a,b; Lopez et al., 1985; Miller et al., 1992). Essa enzima, Nacetilglicosamina:galactosiltransferase, está embebida na membrana plasmática do espermatozóide, diretamentre acima do acrossomo, com seu sítio ativo apontando para fora. A função enzimática dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adição de um açúcar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando em um açúcar N-acetilglicosamina (veja Capítulo 3). No entanto, não há resíduos de UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. Embora a enzima possa se ligar aos resíduos de proteínas da zona, exatamente como qualquer enzima se ligaria a um substrato, ela não pode catalisar a reação porque o segundo reagente está faltando. Portanto, as enzimas (no espermatozóide) ficam ligadas a seus substratos (na zona). Se essa hipótese estiver correta, poderíamos esperar que a ligação óvulo-espermatozóide seria inibida ou pela inibição da enzima, ou pela adição do segundo reagente, UDP-galactose. Isso é exatamente o que Shur e colaboradores acharam ser o caso. A ligação espermatozóide-zona foi bloqueada por: (1) adição de UDPgalactose, (2) remoção de resíduos de N-acetilglicosamina de ZP3, (3) adição de anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase, e (4) colocação de um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se à zona e inibir o espermatozóide de se ligar) (Lopez et al., 1985; Shur e Neely, 1988). Além disso, membranas de espermatozóide de camundongo irão transferir um açúcar de UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al., 1992). Assim, a galactosiltransferase da superfície do espermatozóide parece reconhecer um grupo carboidrato na proteína ZP3 da zona pelúcida do camundongo. A agregação dessas galactosiltransferases ocasiona a ativação de uma proteína G que pode ser importante na iniciação da reação acrossômica (Gong et al., 1995).

138

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). Uma terceira proteína espermática que se liga à zona pelúcida do camundongo parece ser uma proteína transmembrana de 95-kDa com dois sítios funcionais. O sítio extracelular liga especificamente ZP3, enquanto o sítio intracelular tem atividade enzimática de tirosina quinase (Leyton et al., 1992). Essa atividade é estimulada quando a proteína liga ZP3. Isso implica que a proteína de 95-kDa é uma tirosina quinase de receptor, e que pode iniciar a reação acrossômica através da fosforilação das suas proteínas alvo (veja Capítulo 3). O espermatozóide humano tem uma proteína semelhante, e a ZP3 humana estimula a atividade da quinase. Além disso, peptídios sintéticos que mimetizam o domínio extracelular (que liga ZP3) dessa proteína, inibem a ligação do espermatozóide à zona pelúcida humana, sugerindo possível uso como contraceptivo (Burks et al., 1995). INDUÇÃO DA REAÇÃO ACROSSÔMICA EM MAMÍFEROS POR ZP3. Uma vez que o espermatozóide capacitado ligou-se à zona pelúcida, como ocorre a reação acrossômica nos mamíferos? A reação é induzida pela porção protéica de ZP3 (Endo et al., 1987; Leyton e Saling,1989a), e ZP3 parece atuar perfazendo ligação cruzada com seus receptores na membrana espermática. Esse tipo de ligação abre os canais de cálcio, aumentando a concentração do íon no espermatozóide (Leyton e Saling, 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqüente exocitose do acrossomo permanece controversa, mas pode envolver a trajetória IP3 (Florman, 1994; Suarez e Dai, 1995). [fert5.html] LIGAÇÃO SECUNDÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE À ZONA PELÚCIDA. Durante a reação acrossômica, a parte anterior da membrana plasmática do espermatozóide é solta (veja Figura 4.10). É ali que estão localizadas as proteínas ligantes de ZP3 e, ainda assim, o espermatozóide deve permanecer ligado à zona para abrir, por lise, um caminho através dela. Em camundongos, parece que uma ligação secundária à zona é conseguida por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam especificamente a ZP2 (Bleil et al., 1988). Enquanto espermatozóide com acrossomo intacto não irá se ligar à ZP2 glicoproteína, o espermatozóide cujo acrossomo reagiu o fará. Além disso, anticorpos contra a proteína ZP2 não irão impedir a ligação do espermatozóide com acrossomo intacto à zona, mas irão inibir a fixação do espermatozóide que já tenha reagido. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e ZP2, ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4.18). Parece que os espermatozóides com acrossomo que reagiram, transferem sua ligação com ZP3 para as moléculas adjacentes de ZP2. Após a entrada de espermatozóide de camundongo no óvulo, os grânulos corticais do ovo liberam seu conteúdo. Uma das proteínas liberadas é a protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Isso inibe outros espermatozóides, cujo acrossomo já reagiu, de mover-se mais para perto do óvulo. Não é conhecido quais das proteínas do espermatozóide do camundongo se ligam à ZP2. No espermatozóide porcino, ligação secundária à zona parece ser mediada por proacrosina. Proacrosina torna-se a protease acrosina, há muito tempo conhecida por estar envolvida na digestão da zona pelúcida. No entanto, proacrosina é também uma proteína ligante da fucose que mantém a conexão entre espermatozóide que reagiu com acrosina e a zona pelúcida (Jones et al., 1988). É possível que a proacrosina se ligue à zona, sendo depois convertida na enzima ativa que digere localmente a zona pelúcida. Na cobaia, ligação secundária à zona é considerada ser mediada pela proteína PH-20. Quando essa proteína da membrana acrossômica interna foi injetada em cobaias macho ou fêmea, 100% desses animais tornaram-se estéreis por vários meses (Primakoffet al., 1988). O soro sangüíneo dessas cobaias estéreis tinha uma concentração extremamente alta de anticorpos para PH-20. O anti-soro de cobaias esterilizadas por injeções de PH-20 não só se ligou especificamente a essa proteína, como também bloqueou a adesão espermatozóide-zona in vitro. O efeito

ZP1

ZP2

ZP3

Resíduos de carboidratos

Figura 4.18

Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelúcida do camundongo. Filamentos principais da zona pelúcida são compostos por dímeros repetitivos das proteínas ZP2 e ZP3. Esses filamentos estão ocasionalmente ligados por ZP1, formando uma esteira de malhas. (Segundo Wassarman, 1989.)

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

139

contraceptivo perdurou por vários meses, após os quais a fertilidade foi restabelecida. Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O análogo humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido, porém, certos antígenos do espermatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide. As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabelecidas tão claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mostram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado.

Fusão de gametas e a prevenção da polispermia
Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide O reconhecimento do espermatozóide pelo envoltório vitelínico ou zona é seguido pela lise da porção do envoltório ou zona na região da cabeça do espermatozóide (Colwin e Colwin, 1960; Epel, 1980). Essa lise é seguida pela fusão da membrana espermática com a membrana do óvulo. A entrada do espermatozóide no óvulo do ouriço-do-mar está ilustrada na Figura 4.19. A superfície do óvulo está coberta de pequenas microvilosidades; a fusão espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e a extensão de várias microvilosidades para formar o cone de fertilização (Summers et al., 1975; Schatten e Schatten, 1980, 1983). A homologia entre óvulo e espermatozóide é novamente

(A)

(B)

Figura 4.19

Varredura ao microscópio eletrônico da entrada do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar. (A) Contato da cabeça do espermatozóide com microvilosidades do óvulo através do processo acrossômico. (B) Formação do cone de fertilização. (C) Internalização do espermatozóide no óvulo. (D) Micrografia de transmissão ao microscópio eletrônico da internalização do espermatozóide através do cone de fertilização. (A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G. Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
(C) (D)

140

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

demonstrada, porque o cone de fertilização transitório, tal como o processo acrossômico, parece se prolongar pela polimerização da actina. Após a junção, podese encontrar material do espermatozóide na membrana do óvulo (Gundersen et al., 1970). O núcleo e a cauda do espermatozóide passam pela ponte citoplasmática, que é alargada pela polimerização da actina. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que processo semelhante ocorre na fusão de gametas de mamíferos (Figura 4.20). No ouriço-do-mar, todas as regiões do óvulo são capazes de se fundir com o espermatozóide; em várias outras espécies, existem regiões especializadas na membrana para o reconhecimento e fusão com o espermatozóide (Vacquier, 1979). A fusão é um processo ativo, freqüentemente mediado por proteínas “fusogênicas” específicas. Proteínas como a HA do vírus da influenza e a proteína F do vírus Sendai promovem a fusão celular, sendo possível que a bindina também seja uma dessas proteínas. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ouriço-do-mar promove a fusão de vesículas fosfolipídicas e que, tal como as proteínas fusogênicas virais, a bindina contém uma longa região de aminoácidos hidrofóbicos perto do terminal amino. Em abalones, a lisina que dissolve o envoltório vitelínico também demonstrou ter atividade fusogênica (Hong e Vacquier, 1986). As proteínas fertilinas da membrana do espermatozóide dos mamíferos são essenciais para fusão espermatozóide-óvulo (Primakoff et al., 1987; Blobel et al., 1992; Myles et al., 1994). A fertilina do camundongo tem regiões hidrofóbicas semelhantes às das proteínas fusogênicas virais, além de uma seqüência que sugere ligação com uma integrina da membrana do óvulo. Evidência atual sugere que a fertilina do camundongo liga-se à integrina α6β1 da membrana assumindo-se que a região hidrofóbica da fertilina pode, em seguida, mediar a união das duas membranas (Almeida et al., 1995). Quando as membranas se fundem, o núcleo, mitocôndrias, centríolo e flagelo podem penetrar no ovo. Prevenção da Polispermia Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo, a capacidade de fusão da membrana do óvulo, que fora tão necessária para conseguir a penetração, torna-se um risco. No ouriço-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer espermatozóide que penetra o óvulo, pode prover um núcleo haplóide e um centríolo para o óvulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozóide penetra o óvulo, um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o número de cromossomos apropriado para a espécie. O centríolo, provindo do espermatozóide, se dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem. A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conseqüências desastrosas na maioria dos organismos. No ouriço-do-mar, a fertilização por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide, no qual cada cromossomo está representado não duas, mas três vezes. Pior ainda, como o centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico, aqui, em vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células, os cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. Como não há mecanismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o tipo apropriado de cromossomos, esses serão distribuídos de maneira desigual. Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras células não os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html] As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois núcleos haplóides. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um espermatozóide no óvulo. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que evitam a polispermia: uma reação rápida, efetivada por uma mudança elétrica na membrana plasmática do óvulo, e uma reação mais lenta, causada pela exocitose dos grânulos corticais.

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

141

(A)

(B)

(C)

Zona

(E) Membrana acrossômica interna

Núcleo

Segmento equatorial do acrossomo

Figura 4.20

Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrônica de varredura do ato da fusão. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandonado pelo corpo polar. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona. (C ) Micrografia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a zona. (D) Micrografia eletrônica de transmissão, do espermatozóide fundindo em paralelo a membrana do plasma do óvulo. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do espermatozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. (Segundo Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)

O BLOQUEIO RÁPIDO DA POLISPERMIA. A membrana celular do óvulo é notável

não somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermática, mas também por sua capacidade de resistir a uma ulterior fusão imediatamente após a entrada de um espermatozóide (Just, 1919). O bloqueio rápido à polispermia, é conseguido pela mudança do potencial elétrico da membrana do óvulo. Essa provê uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambiente exterior; a concentração iônica do óvulo difere muito daquela do ambiente, uma diferença especialmente pronunciada para os íons de sódio e potássio. A água do mar tem uma alta concentração do íon sódio, ao passo que o citoplasma do óvulo tem relativamente pouco sódio. O oposto acontece com os íons potássio. Essa condição é mantida pela membrana celular, que constantemente inibe a entrada de sódio no

142

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A) Oócito Pronúcleos do espermatozóide

Centrossomo do espermatozóide

Figura 4.21

Pronúcleos do oócito

Desenvolvimento aberrante de um óvulo de ouriço-do-mar fecundado por dois espermatozóides. (A) Fusão de três núcleos haplóides, cada um contendo 18 cromossomos, e divisão dos dois centríolos espermáticos para formar quatro pólos mitóticos. (B, C) Os 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. (D) Na anáfase da primeira divisão, os cromossomos duplicados são arrastados para os quatro pólos. (E) Quatro células contendo números e tipos diferentes de cromossomos são formadas, causando a morte prematura do embrião (F). (Segundo Boveri, 1907.)

Fusão pronuclear (B)

1a clivagem (C)

(D)

(E)

(F)

oócito e impede o escoamento de íons de potássio para o ambiente. Quando inserimos um eletrodo no óvulo e colocamos um outro fora do oócito, podemos medir a constante diferença potencial da membrana plasmática do óvulo. Esse potencial de repouso da membrana é geralmente cerca de 70 mV, e usualmente expresso como –70 mV porque o interior da célula está carregado negativamente em relação ao exterior. [fert7.html] Dentro de 1-3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide, o potencial da membrana muda para um nível positivo (Longo et al., 1986). Um pequeno influxo de íons de sódio no óvulo é permitido, trazendo a diferença de potencial para +20 mV (Figura 4.22 A). Embora o espermatozóide possa se fundir com membranas tendo um potencial de –70 mV, não pode se fundir com membranas com um potencial de repouso positivo. Não é conhecido como a ligação ou a entrada do espermatozóide sinaliza a abertura dos canais de sódio; porém, Gould e Stephano (1987, 1991) forneceram o que poderá ser uma pista importante para a compreensão desse processo. Os autores isolaram do espermatozóide de Urechis (um verme equiuróide marinho) uma proteína cromossômica capaz de abrir canais de sódio de óvulos de Urechis. Quando tais óvulos são expostos a essa proteína, a mudança da velocidade do influxo de sódio e do potencial de membrana resultante são muito parecidos com aqueles produzidos pelo espermatozóide vivo. A abertura dos canais de sódio no óvulo, parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo. Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida quando óvulos foram supridos artificialmente com uma corrente elétrica que mantinha negativo o seu potencial de membrana. Reciprocamente, a fertilização podia ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe, 1976). O bloqueio rápido da polispermia podia também ser evitado baixando-se a concentração do sódio da água (Figura 4.22B-D). Se os íons de sódio não forem suficientes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana, ocorre a polispermia (Gould-Somero et al., 1979; Jaffe, 1980). Não é conhecido como diferenças no potencial de membrana atuam sobre o espermatozóide bloqueando a segunda fecundação. Muito provavelmente, o espermatozóide conduz um componente (possivelmente uma proteína fusogênica carregada positivamente), sendo a inserção desse componente na membrana do óvulo, provavelmente, regulada pela carga elétrica transmembrana (Iwao e Jaffe, 1989). Um bloqueio elétrico à polispermia também ocorre em rãs (Dross e Elinson, 1980), mas provavelmente não na maioria dos mamíferos (Jaffe e Cross, 1983).
O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA. Óvulos do ouriço-do-mar (e muitos ou-

Células em desintegração; morte do embrião

tros) têm um segundo mecanismo para assegurar que múltiplos espermatozóides não penetrem no citoplasma do óvulo (Just, 1919). O bloqueio rápido é transitório, o potencial de membrana do óvulo do ouriço-do-mar somente permanece positivo por cerca de um minuto. Essa curta mudança de potencial não é suficiente para prevenir a polispermia de maneira permanente. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

143

Figura 4.22

Adição de espermatozóide (A) Segundos

Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes e após a fertilização. (A) antes da adição do espermatozóide, a diferença de potencial através da membrana celular do óvulo é de aproximadamente –70 mV. De 1 a 3 segundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em contato com o óvulo, o potencial se desloca na direção positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+ 490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+ 120 mM (colina foi substituída por sódio). Os ovos de Lytechinus foram fotografados durante a primeira clivagem. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia com o decréscimo da concentração do íon sódio. (de Jaffe, 1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)

[Na+] (mM)

Porcentagem de ovos polispérmicos

(B)

(C)

(D)

polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório vitelínico não forem removidos de alguma maneira. Essa remoção é conseguida pela reação dos grânulos corticais, um bloqueio mecânico mais lento da polispermia que se torna ativo cerca de 1 minuto após a primeira ligação bem sucedida espermatozóide-óvulo. Diretamente abaixo da membrana do óvulo do ouriço-do-mar existem 15.000 grânulos corticais, cada um com 1 um de diâmetro (veja Figura 4.6B). Com a entrada do espermatozóide, esses grânulos se fundem com a membrana plasmática do óvulo, liberando seu conteúdo para o espaço entre a membrana e a esteira fibrosa das proteínas do envoltório vitelínico. Há várias proteínas associadas com esse processo de exocitose de grânulos corticais. As primeiras são proteases. Essas enzimas dissolvem os postos vitelínicos que conectam as proteínas do envoltório vitelínico à membrana celular, secionando o receptor de bindina e todo espermatozóide a ele ligado (Vacquier et al., 1973; Glabe e Vacquier, 1978). Outras proteínas, mucopolissacarídeos liberados dos grânulos, produzem um gradiente osmótico que permite a entrada da água no espaço entre a membrana celular e o envoltório e, dessa forma, o envoltório vitelínico se expande e passa a ser chamado de envoltório de fertilização (Figuras 4.23 e 4.24). Uma terceira proteína, produto dos grânulos corticais, uma peroxidase, enrijece o envoltório de fertilização através de ligações cruzadas entre resíduos de tirosina em proteínas adjacentes (Foerder e Shapiro, 1977; Mozingo e Chandler, 1991). Como mostra a Figura 4.23, o envoltório de fertilização começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e continua sua expansão ao redor do óvulo. À medida que esse envoltório se forma, os espermatozóides são liberados. O processo se inicia cerca de 20 segundos após a fixação do espermatozóide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilização. Finalmente, uma quarta proteína granular, a hialina, forma uma capa em volta do óvulo (Hylander e Summers, 1982). A célula estende microvilosidades alongadas cujas extremidades se ligam a essa camada hialina, que fornece apoio para os blastômeros durante a clivagem. Em mamíferos, a reação granular não cria um envoltório de fertilização, porém, o efeito é o mesmo. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozóide da

144

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 4.23

(A)

(B)

Formação do envoltório de fertilização e remoção do excesso de espermatozóide. Espermatozóide foi adicionado a óvulos de ouriço-do-mar, e a suspensão foi fixada em formaldeído para evitar futuras reações. (A) Dez segundos após a adição de espermatozóide, esses foram vistos rodeando o óvulo. (B,C) 25 e 35 segundos após a inseminação, um envoltório de fertilização se forma em volta do óvulo, iniciado no ponto de entrada do espermatozóide. (D) O envoltório de fertilização está completo, e o excesso de espermatozóide é removido. (de Vacquier e Payne, 1973, cortesia de V. D. Vacquier.)

(C)

(D)

zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil e Wassarman, 1980). Essa modificação é chamada reação da zona. Durante essa reação, tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. Florman e Wassarman (1985), propuseram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3, com isso liberando espermatozóide ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide. Esses grânulos corticais contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que após a fertilização, o resíduo de N-acetilglicosamina é removido, ZP3 não serve como substrato para a ligação de galactosiltransferase. ZP2 é cortada pelas proteases granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Wassarman, 1989). Assim, o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação à zona pelúcida e é rapidamente descartado.
CÁLCIO COMO O INICIADOR DA REAÇÃO GRANULAR CORTICAL . O meca-

nismo da reação dos grânulos corticais é semelhante aquele da reação acrossômica. Após a fertilização, a concentração intracelular de cálcio do ovo aumenta muito. Nessas concentrações, as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo, causando exocitose de seu conteúdo (veja Figura 4.24). Após a fusão dos grânulos corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozóide, uma onda de exocitose se propaga ao redor do corte até o lado oposto do ovo. A liberação de cálcio armazenado na região intracelular, pode ser monitorada visualmente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da água-viva luminescente) como a aequorina ativado pelo cálcio, ou de corantes como fura-2. Esses corantes emitem luz quando ligam íons livres de cálcio. Os óvulos são injetados com o corante e fecundados. A Prancha 12 mostra a notável onda de liberação de cálcio que se propaga através do óvulo do ouriço-do-mar; começando no ponto de entrada do

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

145

Membrana plasmática (i) do óvulo Microvilosidade Envoltório vitelínico

Figura 4.24

Grânulo cortical (ii) Espermatozóide supranumerário no envoltório vitelínico

(B)

Enzimas proteolíticas e mucopolissacarídeos são liberados (iii)

(C)

Exocitose de grânulos corticais. (A) Diagrama esquemático mostrando os eventos levando à formação do envoltório de fertilização e a camada hialina. À medida que os grânulos corticais sofrem exocitose, liberam proteases que cortam as proteínas que ligam o envoltório vitelínico à membrana celular. Mucopolissacarídeos liberados pelos grânulos formam um gradiente osmótico, causando a entrada de água e tumefação do espaço entre o envoltório vitelínico e a membrana celular. Outras enzimas liberadas dos grânulos corticais endurecem o envoltório vitelínico (agora o envoltório de fertilização) e liberam espermatozóide a ele ligado. (B,C) Micrografias eletrônicas de transmissão e de varredura do córtex de um ovo não fertilizado de ouriço-do-mar. (D, E) Micrografias eletrônicas de transmissão e varredura da mesma região de um ovo recém-fertilizado, mostrando a elevação do envoltório de fertilização e os pontos nos quais os grânulos corticais fundiram com a membrana plasmática do ovo (flechas em D). (A segundo Austin, 1965; B-E de Chandler e Heuser, 1979, cortesia de D. E. Chandler.)

Microfilamentos Hialina (D) Espermatozóide é liberado

(iv)

Envoltório de fertilização

Camada hialina (A)

Membrana celular (E)

espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al., 1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os íons de cálcio não se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do espermatozóide. Ao contrário, a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do outro. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adicionais & Especulações, página 147). A total liberação de íons de cálcio é completada, a grosso modo, em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar; os íons livres de cálcio são re-seqüestrados pouco após sua liberação. Quando dois espermatozóides entram no citoplasma do óvulo, a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos separados da superfície celular (Hafner et al., 1988). Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo. A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas, permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis. A colocação de

146

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

ovos não-fertilizados de ouriço-do-mar em água do mar contendo A23187, leva à reação granular cortical e à elevação do envoltório de fertilização, mesmo na ausência de íons de cálcio na água do mar. Portanto, A23187 provoca a liberação de íons de cálcio já seqüestrados em organelas dentro do óvulo (Chambers et al., 1974; Steinhardt e Epel, 1974). Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz, 1976; Fulton e Whittingham, 1978; Hamaguchi e Hiramoto, 1981; Kline, 1988) mostraram que o íon de cálcio inicia reações granulares corticais quando injetado em ovos de ouriço-domar, camundongo e rã. Os íons de cálcio internos são armazenados no retículo endoplasmático do óvulo (Eisen e Reynolds, 1985; Terasaki e Sardet, 1991). No ouriço-do-mar e na rã, cujos óvulos sofrem uma reação granular cortical, esse retículo é pronunciado no córtex e rodeia os grânulos (Figura 4.25; Gardiner e Grey, 1983; Luttmer e Longo, 1985). Na rã Xenopus, o retículo endoplasmático cortical fica 10 vezes mais abundante durante o amadurecimento do óvulo e desaparece localmente dentro de um minuto após a ocorrência da onda de exocitose em qualquer região do córtex. Jaffe (1983) compara esse retículo endoplasmático seqüestrador de cálcio, ao retículo sarcoplasmático do músculo esquelético ou cardíaco. Uma vez iniciada, a liberação de cálcio é autopropagada. Cálcio livre é capaz de liberar cálcio seqüestrado de seus locais de armazenamento, causando assim uma onda libertadora do íon cálcio e exocitose granular cortical. Variações em estratégias preventivas da polispermia existem em toda a natureza. Nos mamíferos, a polispermia é minimizada pelo pequeno número de espermatozóides que atingem o local da fecundação (Braden e Austin, 1954). O bloqueio à polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberação de sítios que ligam o espermatozóide na zona pelúcida (Miyazaki e Igusa, 1981; Jaffe e Gould, 1985). Coelhos, no entanto, se apoiam num bloqueio da polispermia a nível da membrana, e ninguém iria disputar o seu grau de sucesso. Finalmente, certos mamíferos têm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. Nos óvulos ricos em gema de certas aves, répteis e salamandras, vários espermatozóides realmente penetram o citoplasma do óvulo. De uma maneira desconhecida, todos menos um são induzidos a se desintegrar no citoplasma após a fusão do pronúcleo do óvulo com um dos pronúcleos do espermatozóide (Ginzburg, 1985; Elinson, 1986). Qualquer que seja o mecanismo, somente um núcleo haplóide de espermatozóide pode fundir-se com o núcleo haplóide do óvulo.

Figura 4.25

Retículo endoplasmático rodeando grânulo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. (A) O retículo foi corado com ósmio-iodeto de zinco para permitir a visualização por micrografia de transmissão eletrônica. O grânulo é visto rodeado pelo retículo. (B) Retrato de um óvulo inteiro corado por anticorpos fluorescentes para os canais de liberação de cálcio. Os anticorpos mostram esses canais no retículo endoplasmático cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cortesia de S. Luttmer; B de McPherson et al., 1992, cortesia de F. J. Longo.)

(A)

(B)

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

147

Informações adicionais

&

Especulações

A Ativação do Metabolismo dos Gametas

S

e a liberação do íon cálcio é necessária para ativação do oócito, como o espermatozóide motiva essa liberação? Realmente não se sabe. Como se pronunciou um investigador (Berridge, 1993): “Exatamente como o espermatozóide dispara o processo explosivo da liberação do cálcio no óvulo, ainda permanece algo misterioso”. Dados recentes sugerem que produção do inositol 1,4,5, trifosfato (IP3) é o evento primário para a liberação de íons cálcio do seu local de armazenamento intracelular. IP3 injetado pode liberar íons cálcio seqüestrados no óvulo e muitos outros tipos de células (Swann e Whitaker, 1986; Berridge, 1993); o aumento na concentração de IP 3 intracelular é visto ocorrer dentro de 10 segundos após a fecundação de ovos do ouriço-do-mar (Ciapa e Whitaker, 1986). A libertação de íons cálcio e a reação dos grânulos corticais rapidamente seguem a formação ou injeção de IP3 (Whitaker e Irvine, 1984; Busa et al., 1985). Os efeitos mediados por IP3 podem ser abortados pela pré-injeção de agentes quelantes de cálcio no óvulo (Turner et al., 1986), confirmando que IP3 estimula a liberação de cálcio armazenado. Canais de cálcio respondendo ao IP3 foram encontrados no retículo endoplasmático do óvulo. O IP3 formado no local da entrada do espermatozóide é considerado ligar-se a esses receptores de IP3 no retículo endoplasmático, ocasionando uma liberação local de cálcio (Ferris et al., 1989; Furuichi et al., 1989; Terasaki e Sardet, 1991). Uma vez liberados, os íons de cálcio podem difundir diretamente, ou facilitar a liberação de mais íons de cálcio de receptores sensíveis ao cálcio localizados no retículo endoplasmático (McPherson et al., 1992). A ligação de íons de cálcio a esses receptores libera mais cálcio, e esse pode continuar a onda, ligando-se a mais receptores e assim por diante. Mohri e colaboradores (1995) mostraram que o cálcio liberado por IP3 é necessário e suficiente para liberação de cálcio. Essa onda de íons de cálcio é propagada por

toda célula, começando no ponto da entrada do espermatozóide; os grânulos corticais se fundem com a membrana celular na presença de concentrações altas de cálcio, respondem com uma onda de exocitose que segue os íons de cálcio. IP 3 é também capaz de liberar íons de cálcio em óvulos de vertebrados, e o bloqueio do seu receptor em óvulos de hamster impede a liberação de cálcio no ato da fertilização. Como em ouriço-domar IP3 também parece mediar a liberação de cálcio de sítios no retículo endoplasmático (Lechleiter e Clapham, 1992; Miyazaki et al., 1992; Ayabe et al., 1995). Xu e colaboradores (1994) mostraram que o bloqueio da mediação por IP3 da saída de cálcio, impede todos os aspectos da ativação do óvulo pelo espermatozóide incluindo exocitose granular, recrutamento de mRNA e recomeço do ciclo celular. A questão então é: o que inicia a produção de IP3? Há dois caminhos que parecem estimular a liberação de cálcio: aquele do receptor ligado à proteína G, largamente conhecido como liberadora de íons de cálcio na contração muscular, crescimento celular, secreção hormonal, percepção sensorial e liberação de neurotransmissores (Berridge, 1993). O outro caminho é o do receptor da tirosinoquinase em cascata, que também é usado na proliferação e diferenciação celular. Conforme apresentado no Capítulo 3, o primeiro caminho se inicia pela ligação de um ligante extracelular (como a acetilcolina ou a serotonina) à uma proteína receptora transmembrana. No interior da membrana plasmática esse receptor é ligado à proteína trimérica G. Esse receptor ativa a proteína G (veja Figuras 3.33 e 3.35), levando à sua dissociação em subunidades, capazes de ativar um conjunto de enzimas chamadas de fosfolipase C. Essa cataliza a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O primeiro é capaz de abrir canais de cálcio. DAG estimula a troca de prótons que permite o efluxo de íons de hidrogê-

nio das células. O resultado disso é a elevação de cálcio e do pH intracelulares. O outro segundo mensageiro, DAG, é considerado ativar a proteína quinase C (PKC) da membrana, que é transferida do citosol para a membrana plasmática do ovo pouco após a fecundação, e pode ser responsável pela ativação da proteína que troca íons de sódio por íons de hidrogênio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986; Shen e Burgart, 1986; Olds et al., 1995). O bloqueio da PKC em óvulos de ouriços-do-mar inibe a alcalinização do citosol observada durante a fertilização normal (Shen e Buck, 1990). A proteína que faz a troca Na + /H+, também necessita de íons cálcio para sua atividade. Assim, tanto DAG como IP 3 estão envolvidos nas ativação do óvulo. A etapa regulatória chave é a ativação da fosfolipase C, que produz esses dois compostos. Jaffe e seus colaboradores encontraram a proteína G em óvulos de ouriço-do-mar e rã; e quando injetaram ativadores da proteína G nesses óvulos, causaram exocitose granular na ausência de espermatozóide (Turner et al., 1986; Kline et al., 1991). Tal ativação foi inibida por quelantes de cálcio, como o EGTA. [fert8.html] Parece, portanto, que uma proteína G pode estar envolvida na regulação de íons seqüestrados de cálcio, e na exocitose de grânulos corticais. Existem várias maneiras pelas quais isso pode acontecer. Em primeiro lugar, a ligação do espermatozóide a um receptor na membrana celular do óvulo pode mudar a sua conformação de modo a ativar a proteína G e iniciar a cascata (Figura 4.26A), conforme demonstrado por Kline e colaboradores (1988, 1991). Eles levantaram a hipótese que se essa proteína mediar a fertilização por ser ativada por um receptor ligante de espermatozóide, então a mesma proteína G poderia ser ativada por um neurotransmissor se o ovo contiver um receptor para neurotransmissor capaz de ativar a proteína G. Eles injetaram mRNA para o receptor de serotonina ou de acetilcolina em óvulos de rã. Esses receptores da superfície

148

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

celular foram sintetizados e foram detectados na membrana celular do óvulo. Os óvulos puderam ser “fertilizados” por serotonina e acetilcolina e foi observado a reação cortical. Experimentos semelhantes mostraram que quando neurotransmissores ativam o caminho da proteína G–IP3 em oócitos de camundongo, são induzidos os eventos da fertilização (Williams et al., 1992; Moore et al., 1993).

Entretanto, a cascata ligada à proteína-G não é o único caminho capaz de gerar IP3 (veja Capítulo 3). Evidências recentes (Moore et al., 1994; Shilling et al., 1994; Yim et al., 1994) demonstram que a ativação do receptor da tirosinoquinase também produz IP3 e ativa a onda de cálcio e a reação granular cortical (Figura 4.26b). Quando o mRNA para o receptor dessa quinase (o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas,
Figura 4.26

PDGF) foi injetado em oócitos de estrela-do-mar, o receptor PDGF foi sintetizado e incorporado nas membranas celulares desse organismo. Quando, após a maturação dos oócitos, PDGF foi adicionado à água banhando os óvulos, esses apresentaram aumento de cálcio intracelular livre, exocitose de grânulos corticais e síntese de DNA. Alguns se desenvolveram em larvas. Quando o mRNA continha um ponto de mutação que impedia

Mecanismos possíveis da ativação do óvulo. (A) Trajetória do fosfatidilinositol mediado pela G-proteína. (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetória da tirosinoquinase citoplasmática. (D) Trajetória na qual a G proteína ou tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo. (E) Trajetórias de ativadores solúveis.
CAMINHOS ANTERIORES À FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (A) Espermatozóide (B) (C)

Fosfolipase C (PLC)

Receptor G-proteína Receptor de Tirosinoquinase Receptor de IP3 Tirosinoquinase

Retículo endoplasmático APÓS A FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (D)

Fator solúvel do óvulo

Fatores solúveis do Espermatozóide

G-proteína

Receptor de IP3

Retículo endoplasmático

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

149

o receptor interagir com a fosfolipase C, nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling et al., 1994). Assim, tanto o caminho ligado ao receptor proteína-G como aquele do receptor da tirosinoquinase, parecem ser capazes de ativar essa fosfolipase, criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no óvulo. O receptor da bindina não oferece pistas para explicar como ocorre essa ativação, por não ter semelhante em outras proteínas transmembrana. No entanto, 5 segundos após ligar a bindina, fica fosforilado em um dos seus resíduos tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz, 1994). Isso sugere que o receptor de bindina ligado, pode interagir com a tirosinoquinase plasmática tal como aqueles que medeiam a liberação de cálcio durante a ativação de células T (Figura 4.26 C; Hall et al., 1993).

Outra possibilidade é que a ativação do caminho do IP3 não é devida à ligação do espermatozóide e óvulo, mas à fusão das membranas do óvulo e do espermatozóide. Mc Culloch e Chambers (1992) obtiveram evidência eletrofisiológica que a ativação dos óvulos do ouriço-do-mar não ocorre até depois da junção do espermatozóide com o óvulo. Eles sugerem que os componentes ativadores do óvulo se localizam na membrana ou no citoplasma do espermatozóide. É até mesmo possível que por ocasião da fusão das membranas, as proteínas G da membrana espermática ou as tirosinoquinases (ativadas pela geléia do óvulo para iniciar a reação acrossômica) ativem a cascata polifosfoinositídica para liberação de cálcio do óvulo. (No cenário apresentado na Fi-

gura 4.26 D, a bindina meramente liga o óvulo ou, talvez, motive a fosforilação de proteínas necessárias em fases mais avançadas do desenvolvimento.) Ainda outra possibilidade é que o agente ativo na liberação de cálcio ligado venha do citosol do espermatozóide. Parrington e colaboradores (1996) isolaram uma proteína de 33-kDA, chamada oscilina, localizada no escasso citoplasma da cabeça do espermatozóide (Figura 4.26 E). A microinjeção dessa proteína em óvulos de camundongo pode iniciar liberação de cálcio, porém, os outros parâmetros da ativação do óvulo (exocitose dos grânulos, recrutamento de mRNA e retomada do ciclo celular) não são observados. Não é conhecido qual o papel que essa proteína pode ter na fisiologia da ativação do óvulo.

Ativação do metabolismo do óvulo
Embora a fertilização seja freqüentemente descrita como mero meio de junção de dois núcleos haplóides, ela tem um papel igualmente importante na iniciação de processos que iniciam o desenvolvimento. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem sem o envolvimento dos núcleos.* O óvulo do ouriço-do-mar maduro é uma célula metabolicamente lenta, reativada pelo espermatozóide. Essa ativação é apenas o estímulo; aciona um conjunto de eventos metabólicos pré-programados. As respostas do óvulo ao espermatozóide podem ser divididas em “precoces” que ocorrem em poucos segundos após a reação cortical e “tardias” que acontecem vários minutos após o inicio da fertilização (Tabela 4.1). Respostas precoces O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à polispermia: o bloqueio rápido, iniciado pelo influxo de sódio na célula, e o bloqueio lento, iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. A ativação de todos os óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro do óvulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do cálcio geralmente entra no óvulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rãs, ouriços-do-mar e mamíferos, a ativação é acompanhada pela liberação de íons de cálcio do retículo endoplasmático, resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo (Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).

*Em certas salamandras, essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divorciada da função genética. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida que consiste somente de fêmeas. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de cromossomos. Esse ovo, porém, não pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozóide desse macho somente estimula o desenvolvimento do ovo; não contribui com material genético (Uzzell, 1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al., 1989.

150

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Tabela 4.1
Evento

Eventos da fertilização do ouriço-do-mar
aproximado Tempo aproximado após a inseminaçãoa

Ligação espermatozóide-óvulo Elevação do potencial de fertilização (bloqueio rápido da polispermia) Fusão das membranas espermatozóide-óvulo Primeira detecção de aumento de cálcio Exocitose das vesículas corticais (bloqueio lento da polispermia) Ativação da NAD quinase Aumento de NADH e NADPH Aumento do consumo de O2 Entrada do espermatozóide Efluxo de ácido Aumento de pH (permanece alto) Descondensação da cromatina do espermatozóide Migração do núcleo do espermatozóide para o centro do óvulo Migração do núcleo do óvulo para o núcleo do espermatozóide Ativação da síntese protéica Ativação do transporte de aminoácidos Iniciação da síntese de DNA Mitose Primeira clivagem

O segundos dentro de 1 sec dentro de 6 sec 6 sec 15-60 sec começa em 1 min começa em 1 min começa em 1 min 1-2 min 1-5 min 1- 5 min 2-12 min 2-12 min 5-10 min começa em 5-10 min começa em 5-10 min 20-40 min 60-80 min 85- 95 min

Principais fontes: Whitaker e Steinhardt, 1985; Mohri et al., 1995. a Tempos aproximados baseados em dados de S. purpuratus (15-17oC), L. pictus (16-18oC), A . punctulata (18-20oC) e L. variegatus (22-24oC). A contagem de tempo para os eventos dentro do primeiro minuto é melhor conhecida para Lytechinius variegatus, assim os tempos apresentados referem-se à essa espécie.

Essa liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião. Se o quelante de cálcio EGTA for injetado no óvulo do ouriço-do-mar, não ocorre exocitose dos grânulos corticais, mudança do potencial da fertilização, descondensação do espermatozóide, nem reinício da divisão celular (Kline, 1988). Reciprocamente, óvulos podem ser ativados artificialmente na ausência de espermatozóide por procedimentos que liberam cálcio livre no oócito. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades micromolares do ionóforo A23187 induzem no óvulo a maioria das respostas características de um ovo fertilizado normalmente. A elevação do envoltório de fertilização, o aumento do pH intracelular, o surto de utilização de oxigênio e o aumento da síntese de proteína e DNA são todos gerados com sua seqüência própria. Essa ativação acontece na ausência total de íons de cálcio na água do mar. Na maioria desses casos, o desenvolvimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda são haplóides e desprovidos do centríolo espermático necessário para a divisão. Essa liberação de cálcio ativa uma série de reações metabólicas (Figura 4.27). Uma delas é a ativação da enzima NAD+ quinase, que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et al., 1981). Essa mudança pode ter importantes conseqüências para o metabolismo lipídico, pois NADP+ (mas não o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para biossíntese lipídica. Assim, a mudança de NAD+ em NADP+ pode ser importante na construção de novas membranas exigidas durante a clivagem. Outro efeito dessa mudança se refere ao consumo de oxigênio. Um surto de redução de oxigênio é visto ocorrer durante a fertilização, e muito desse “surto respiratório” é usado para cruzamento ligado da membrana de fertilização. A enzima responsável por essa redução do oxigênio (para água oxigenada) também é dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro, 1989). Por último, o NADPH ajuda na regeneração da glutationa e de ovotiois (ovothiols) que podem ser cruciais para remoção de radicais livres que poderiam de outra maneira prejudicar o DNA do ovo e do embrião precoce (Mead e Epel, 1995).

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

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Influxo de Na+

Alteração do potencial da membrana

Bloqueio rápido da polispermia

Ativação da NAD+ quinase Ligação e/ou fusão de espermatozóide à membrana celular do óvulo

Conversão de NAD+ em NADP+ Bloqueio lento da polispermia Formação da camada hialina

Produção de IP3 Ativação de fosfolipase C

Liberação de Ca2+

Exocitose de grânulos corticais

Estimulação de proteína G ou de tirosinoquinase?

Produção de diacil-glicerol

Ativação de proteíno-quinase C

Estimulação de síntese protéica, replicação de DNA, e movimentos citoplasmáticos de material morfogenético

Figura 4.27

Troca Na+/H+

Modelo de um possível mecanismo de ativação do óvulo do ouriço-do-mar. (Segundo Epel, 1980 e L. A. Jaffe, comunicação pessoal.)

Aumento do pH intracelular

Respostas tardias Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio, o pH intracelular também aumenta. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização, incluindo a síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio, causando uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*. Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudanças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978). As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas, incluem a ativação da síntese de DNA e da proteína. O surto de síntese de proteína ocorre vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a síntese de proteína nova utiliza mRNAs já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no Capítulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas, tubulinas, actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvimento precoce. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese de DNA e proteína. Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções contendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca Na+/H+), a síntese protéica falha, os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide são prevenidos, e a divisão celular não ocorre (Dube et al., 1985).
*Novamente, a variação espécie-para-espécie está à solta. No óvulo muito menor do camundongo, não há elevação do pH após a fertilização. Similarmente no camundongo, não há um aumento dramático na síntese protéica imediatamente em seguida à fertilização.

152

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 4.28

Surto de síntese protéica na fertilização emprega mRNA armazenado no citoplasma do oócito. (A) Síntese protéica em óvulos do ouriço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência de actinomicina D, um inibidor da transcrição. Durante as primeiras horas, a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos do zigoto ou embrião. Um segundo surto de síntese protéica ocorre durante os estágios medianos de blástula, e isso representa tradução de mensagens recém-transcritas (e, portanto, não é visto em embriões crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcentagem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primeiras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar, especialmente durante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B segundo Humphreys, 1971.)

Incorporação de valina[14C] na proteína/mg proteína (cpm x 10-3)

água do mar normal

Água do mar tratada por actinomicina

Horas após a fertilização

Porcentagem de ribossomos em polissomos

Tempo de desenvolvimento (horas)

Fusão do material genético
Em ouriços-do-mar, o núcleo do espermatozóide penetra o óvulo perpendicularmente à superficie do óvulo. Após a fusão das membranas do espermatozóide e do óvulo, o núcleo do espermatozóide e seu centríolo se separam das mitocôndrias e do flagelo. A mitocôndria e o flagelo se desintegram dentro do óvulo; assim, poucas, se tanto, mitocôndrias derivadas do espermatozóide são encontradas em organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler, 1972; Giles et al., 1980). Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.000 mitocôndrias são derivadas do espermatozóide (Gyllensten et al., 1991). Assim, embora cada gameta contribua para o zigoto com um genoma haplóide, o genoma mitocondrial é transmitido principalmente pelo parente materno. Reciprocamente, em quase todos os animais estudados (o camundongo sendo a principal exceção), o centrossomo necessário para a produção do fuso mitótico das divisões subseqüentes é derivado do centríolo espermático (Sluder et al., 1989, 1993). O núcleo do óvulo sendo haplóide é chamado de pronúcleo feminino. Dentro do citoplasma do óvulo, o núcleo do espermatozóide descondensa para formar o pronúcleo masculino. Uma vez dentro do óvulo, o pronúcleo masculino sofre uma dramática transformação. O envoltório pronuclear forma vesículas com pequenos pacotes, expondo, com isso, a compacta cromatina do espermatozóide ao citoplasma do óvulo (Longo e Kunkle, 1978). As proteínas que prendem a cromatina no seu estado condensado, inativa, são trocadas por proteínas derivadas do citoplasma do óvulo. Essa troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. Em ouriços-do-mar, a descondensação parece ser iniciada pela fosforilação de duas

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

153

(A)

(B)

Pronúcleo do óvulo

Ponte internuclear

Tempo (seg)

Pronúcleo do espermatozóide

Figura 4.29

histonas espermatozóide-específicas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse processo começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteína na geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. (Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1.) Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóideespecíficas interferindo, desse modo, com sua ligação ao DNA (Garbers et al., 1980, 1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento é considerado facilitar a substituição das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. [fert9.html] Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo, o pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. Em seguida, o centríolo espermático age como um centro organizador de microtúbulos, estendendo seus próprios microtúbulos e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*. Esses microtúbulos se estendem através de todo o óvulo, contatam o pronúcleo feminino, e trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980; Bestor e Schatten, 1981). A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4.19). A iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração) ou depois da formação do núcleo zigótico. Em mamíferos, o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12 horas, comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar. O espermatozóide do mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina descondensa, sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. O DNA do núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas; essas proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto. Uma vez no óvulo, a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto, permitindo o desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et

Eventos nucleares na fertilização do ouriçodo-mar. (A) Migração dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide em um ovo de Clypeaster japonicus. O pronúcleo do espermatozóide está rodeado por microtúbulos do seu áster. (B) Fusão de pronúcleos no ovo do ouriço-do-mar. (A de Hamaguchi e Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cortesia de F. J. Longo.)

*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar, chamou-o de “sol dentro do ovo”, e considerou-o feliz indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares. Essa deficiência causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento.

154

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

Figura 4.30

Movimento pronuclear em hamster. (A) Entrada de espermatozóide na célula e tumefação do pronúcleo do espermatozóide. (B) Aposição dos pronúcleos do espermatozóide e do óvulo. (C ) Estágio bicelular mostrando duas células de tamanhos iguais com núcleos bem definidos. Entulho no espaço perivitelínico são os corpos polares em degeneração. (de Bavister, 1980, cortesia de B. D. Bavister.)

al., 1980). O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4.30 A). O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres (principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronúcleo feminino. Então, cada pronúcleo migra ao encontro do outro, replicando seu DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltórios nucleares se desintegram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um núcleo zigótico comum (como acontece na fertilização do ouriço-do-mar), a cromatina condensa-se para formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum. Assim, um núcleo zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto, mas no estágio bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]

Informações adicionais

&

Especulações

A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos

G

ERALMENTE ASSUME-SE que machos e fêmeas portam genomas haplóides equivalentes. Um dos princípios fundamentais da genética Mendeliana é que os genes derivados do espermatozóide são funcionalmente equivalentes aqueles derivados do óvulo. No entanto, estudos recentes mostram que em mamíferos o genoma derivado do óvulo pode ser funcionalmente diferente e ter papel complementar durante certos estágios do desenvolvimento. A primeira evidência dessa não-equivalência veio de estudos de um tumor humano chamado mola hidatidiforme. Esses tumores parecem tecido placentário. A maioria dessas molas se desenvolve de um espermatozóide haplóide ferti-

lizando um óvulo no qual o pronúcleo feminino está ausente. Após penetrar no óvulo, os cromossomos do espermatozóide se duplicam restaurando seu número diplóide. Assim, todo o genoma é derivado do espermatozóide (Jacobs et al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui vemos uma situação em que as células sobrevivem, se dividem e têm um número normal de cromossomos, porém, apresentam um desenvolvimento anormal. Em vez de formar um embrião, o ovo se transforma numa massa de células placentosímiles. Não há desenvolvimento normal quando o genoma inteiro vem do parente masculino. Evidência para a não-equivalência dos pronúcleos mamíferos vem também de tentativas de conseguir que

óvulos se desenvolvam na ausência de espermatozóide. A habilidade de desenvolver um embrião sem contribuição espermática é chamada partenogênese (do grego, significando “nascimento virgem”). Os óvulos de muitos invertebrados e de alguns vertebrados são capazes de se desenvolver normalmente na ausência do espermatozóide se o óvulo for ativado artificialmente. Nessas situações, a contribuição do espermatozóide para o desenvolvimento parece dispensável. Os mamíferos, no entanto, não apresentam a partenogênese. A colocação de oócitos de camundongo em um meio de cultura que artificialmente ativa o oócito, ao mesmo tempo suprimindo a formação do segundo corpo polar, produz

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

155

ovos diplóides de camundongo cuja herança deriva somente do óvulo (Kaufman et al., 1977). Essas células se dividem para formar embriões com medula espinhal, músculos, esqueleto e órgãos, incluindo corações latejantes. Porém, o desenvolvimento não continua e no dia 10 ou 11 (metade do tempo da gestação), observam-se profundas diferenças entre os embriões normais e os partenogenéticos, esses deteriorando e ficando grosseiramente desorganizados (Figura 4.31). Nem no homem nem no camundongo o desenvolvimento pode ser completado com cromossomos derivados somente do óvulo. A hipótese que pronúcleos masculinos e femininos são diferentes, também ganha apoio de experimentos de transplante pronuclear (Surani e Barton, 1983; Surani et al., 1986; McGrath e Solter, 1984). Pronúcleos recém-fertilizados de machos ou fêmeas podem ser removidos e adicionados a outros ovos recém-fertilizados. (Os dois pronúcleos podem ser diferenciados nesse estágio, porque o feminino fica debaixo dos corpos polares.) Assim, podem ser construídos zigotos com dois pronúcleos masculinos ou dois femininos. Embora ocorra a clivagem embrionária, nenhum desse tipos de ovos

Tabela 4.2 Experimentos de transplantes pronucleares
Classe de zigotos reconstruídos Operação Número de transplantes bem-sucedidos Número de sobrevivente

Bimaternal Bipaternal Controles Fonte: McGrath e Solter, 1984.

339 328 348

0 0 18

se desenvolvem até o nascimento, ao passo que alguns ovos controle (contendo um pronúcleo masculino e um feminino de zigotos diferentes) que sofreram tal transplante se desenvolvem normalmente (Tabela 4.20). Ainda mais, os embriões bimaternos ou bipaternos cessam o desenvolvimento ao mesmo tempo que camundongos partenogenéticos. Portanto, embora os dois pronúcleos sejam equivalentes em muitos animais, nos mamíferos existem importantes diferenças funcionais entre eles. A razão para essas mortes embrionárias é que em algumas células somente o alelo de certos genes derivado da mãe é ativo, enquanto em outras célu-

Figura 4.31 (A) Embriões controle e (B) partenogenéticos (dois pronúcleos femininos) de camundongos no 11 o dia de gestação. Os camundongos estavam se desenvolvendo na mesma fêmea. Além de serem menores e em deterioração, os embriões partenogenéticos também tinham placentas muito menores. (de Surani e Barton, 1983, cortesia dos autores.)

las somente o alelo de genes derivado paternalmente é funcional. (Na maioria dos genes, naturalmente, os alelos derivados do macho e da fêmea são equivalentes e são ativados no mesmo grau em cada célula. Aqui estamos tratando de exceções a essa regra Mendeliana.) Por exemplo, o fator de crescimento insulina-símile II (IGF-II) promove o crescimento de órgãos embrionários e fetais. Em embriões de camundongos, o alelo de IGF-II derivado paternalmente é ativo em todo o embrião, ao passo que o alelo derivado maternalmente é em geral inativo (exceto em algumas células neurais). Assim, se um camundongo herda um alelo mutante IGF-II de sua mãe, irá se desenvolver até o tamanho normal (já que o alelo derivado maternalmente não é expresso); porém, se o mesmo alelo mutante for herdado do pai, o camundongo terá crescimento prejudicado (DeChiara et al., 1991). O padrão oposto de expressão alélica se encontra para um dos receptores de IGF-II. Aqui, o gene paterno para o receptor é mal transcrito, enquanto o alelo materno é ativo (Barlow et al., 1991). As diferenças entre os alelos ativos e inativos são consideradas ser causadas por modificações do DNA que ocorrem de maneira diferente nos núcleos do óvulo e do espermatozóide (serão discutidos posteriormente no Capítulo 11). Como certos genes importantes para o desenvolvimento somente são ativos quando provindos do espermatozóide e outros tais genes só são ativos quando vêm do óvulo, tanto pronúcleos maternos como paternos são necessários para o desenvolvimento completo dos mamíferos.

156

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Rearranjo do citoplasma do óvulo
A fertilização pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmáticos do óvulo. Esses rearranjos do citoplasma do oócito são muitas vezes cruciais para a diferenciação nas etapas seguintes do desenvolvimento. Como veremos nos capítulos 13 e 14, o citoplasma do óvulo freqüentemente contém determinantes morfogenéticos que ficam segregados em células específicas durante a clivagem. Esse determinantes, em última análise, conduzem à ativação ou repressão de genes específicos conferindo, dessa maneira, certas propriedades às células que os incorporam. O arranjo espacial correto desses determinantes é crucial para o desenvolvimento adequado. Em algumas espécies, esse rearranjo na orientação pode ser visualizado pela presença de grânulos pigmentados citoplasmáticos. Um exemplo é o óvulo do tunicado Styela partita (Conklin, 1905). O ovo não-fertilizado desse animal está apresentado na Figura 4.32A. Um citoplasma cinzento central está envolvido por uma camada cortical contendo inclusões lipídicas amarelas. Durante a meiose, a desintegração nuclear libera uma substância clara que se acumula no hemisfério animal (superior) do óvulo. Dentro de 5 minutos após a entrada do espermatozóide, o citoplasma interno claro e o cortical amarelo migram para o hemisfério vegetal (inferior) do óvulo. Quando o pronúcleo masculino migra do pólo vegetal para o equador da célula, ao longo do futuro lado posterior do embrião, as inclusões lipídicas migram com ele. Essa migração forma um crescente amarelo, que se estende do pólo vegetal ao equador (Figura 4.32B), trazendo o citoplasma amarelo para a área onde mais tarde células musculares irão se formar na larva tunicada. O movimento dessas regiões citoplasmáticas depende de microtúbulos que são gerados pelo centríolo e por uma onda de íons de cálcio que contraem o citoplasma do pólo animal (Sawada e Schatten, 1989; Speksnijder et al., 1990; Roegiers et al., 1995). Movimento citoplasmático também é visto em óvulos de anfíbios. Na rã, um único espermatozóide pode entrar em qualquer lugar do hemisfério animal; quando o faz, altera o padrão citoplasmático do óvulo. Originalmente, o óvulo é radialmente simétrico em torno do eixo animal-vegetal. Após a entrada do espermatozóide, porém, o citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30° relativos ao citoplasma interno, em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (Manes e Elinson, 1980; Vincent et al., 1986). Em algumas rãs (como Rana), uma região do óvulo que antes estava coberta pelo citoplasma cortical escuro do hemisfério animal fica agora exposta (Figura 4.33). Esse citoplasma subjacente, localizado perto do equador, no lado oposto do ponto de entrada do espermatozóide, contém grânulos pigmentados difusos e, por isso, tem aparência cinzenta. Essa região tem sido referida como o crescente cinzento (Roux, 1987; Ancel e Vintenberger, 1948). Como veremos em capítulos subseqüentes, o crescente cinzento demarca a região onde se iniciará a gastrulação em embriões de anfíbios.

Figura 4.32

Rearranjo citoplasmático no óvulo do tunicado Styela partita. (A) Antes da fertilização, citoplasma cortical amarelo rodeia citoplasma cinzento, tipo gema. (B) Após a entrada do espermatozóide, o citoplasma cortical amarelo e o citoplasma claro derivado da degradação do núcleo do oócito escorrem vegetativamente em direção ao espermatozóide. (C) À medida que o pronúcleo do espermatozóide migra para o pólo animal em direção ao pronúcleo do óvulo, os citoplasmas amarelo e claro os acompanham. (D) A posição final dos citoplasmas amarelo e claro, marcam os locais onde as células dão origem ao mesênquima e aos músculos, respectivamente. (Segundo Conklin, 1905.)
Pólo animal Citoplasma Cortical amarelo Núcleo do oócito

Material do núcleo do oócito

Gema cinzenta

Citoplasma claro

(A) Cório Pólo vegetal

(B) Pronúcleo do Citoplasma espermatozóide amarelo

(C) Pronúcleo do espermatozóide Citoplasma amarelo

(D) Crescente amarelo Material da gema

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

157

(A) Ponto de entrada do espermatozóide

(B) Crescente cinzento

Córtex

Citoplasma interno

Zona de deslizamento

Figura 4.33

Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã. (A) Corte transversal esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozóide entrou por um lado e seu núcleo está migrando para o interior. O córtex está representado como o de Rana, com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparente. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem, o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relação ao citoplasma interno. Essa rotação é importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart et al., 1989.)

Em rãs como Xenopus, nas quais não se vê um crescente cinzento, podemos assim mesmo, observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna, subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986). Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posição por inclusão em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, não inclusos, a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, tornado pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade. O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical do hemisfério vegetal, na direção da rotação citoplasmática. Os rastros dos microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação, e desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988). Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação desses microtúbulos, com isso parando as rotações citoplasmáticas. Usando anticorpos ligantes desses microtúbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo, e que o centríolo espermático direciona sua polimerização, fazendo com que cresçam para o interior da região vegetal do ovo. Ao atingir o córtex vegetal, esses microtúbulos se desviam do ponto de entrada do espermatozóide, em direção ao pólo vegetal. A posição descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização microtubular, proporciona direção à rotação. A força motriz para a rotação é possivelmente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dineína e a miosina, a cinesina pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. Essa ATPase está localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático cortical (Houliston e Elinson, 1991b). O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda movimentação nesse último. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema

158

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 4.34

Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula. (A) Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em gelatina, e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular com fluoresceína (círculos em A). O ponto de entrada do espermatozóide está marcado com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relação à superfície externa imobilizada do ovo. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está marcado com um D. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)

com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante ligado emite fluorescência vermelha). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome), para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). Ao fim da primeira divisão, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião, é distintamente diferente daquele do provável lado ventral. O que havia sido um embrião radialmente simétrico, é agora um embrião bilateralmente simétrico. Como veremos nos Capítulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmáticos iniciam uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. Realmente, os microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983). Preparação para a Clivagem O aumento dos níveis de íons livres de cálcio intracelular também inicia a movimentação de aparelhagem para a divisão celular. O mecanismo iniciador da clivagem provavelmente difere entre espécies, dependendo do estágio de meiose em que

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

159

Figura 4.35

(B)

Arranjo paralelo de microtúbulos se estendem ao longo do hemisfério vegetal, ao longo do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo paralelo de microtúbulos vistos na segunda parte do primeiro ciclo celular por anticorpos fluorescente à tubulina. (B) Antes da rotação citoplasmática (cerca de metade do ciclo) nenhum arranjo pode ser visto. (C) No término da rotação do citoplasma, os microtúbulos despolimerizam. (de Elinson e Rowning, 1988, cortesia de R. Elinson.)

(A)

(C)

ocorre a fecundação. No entanto, em todas as espécies estudadas, o ritmo das divisões celulares é regulado pela síntese e degradação de ciclina. A ciclina mantém as células em metáfase, e a sua degradação permite às células voltarem para interfase. Além de suas outras atividades, os íons de cálcio também parecem iniciar a degradação da ciclina (Watanabe et al., 1991). Uma vez degradada a ciclina, os ciclos de divisão celular podem se reiniciar. A clivagem tem uma relação especial com essas regiões citoplasmáticas. Em embriões tunicados, a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um espelho. Desse estágio em diante, cada divisão em um lado do sulco de clivagem tem uma imagem em espelho do lado oposto. De maneira semelhante, o crescente cinzento é seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfíbios. Assim, a posição da primeira clivagem não é aleatória, mas tende a ser especificada pelo ponto de entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. A coordenação do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmáticos é provavelmente mediada pelos microtúbulos do áster do espermatozóide (Manes et al., 1978; Gerhart et al., 1981; Elinson, 1985). Portanto, perto do fim do primeiro ciclo celular , o citoplasma se rearranja, os pronúcleos se encontram, o DNA está se replicando e novas proteínas estão sendo sintetizadas. O palco está preparado para o desenvolvimento de um organismo multicelular. [fert11.html], [other.html#fert13]
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CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

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PARTE II Padrões de Desenvolvimento

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CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo

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CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

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Clivagem: Criando multicelularidade

5

Para nossa limitada inteligência, pode parecer simples dividir um núcleo em partes iguais. A célula, manifestadamente, abriga uma opinião muito diferente. E. B. WILSON, (1923) Deve-se mostrar o máximo respeito por tudo que cresce exponencialmente, não importa o seu tamanho. GARRETT HARDIN, (1968)

mento. O zigoto, com o seu novo potencial genético e com sua nova disposição do citoplasma, inicia agora a produção de um novo organismo multicelular. Em todas as espécies de animais conhecidas, isso começa por um processo chamado clivagem, uma série de divisões mitóticas pelo qual o enorme volume do citoplasma do ovo é dividido em numerosas pequenas células nucleadas. Essas células em estado de clivagem são chamadas de blastômeros. Na maioria das espécies (mamíferos sendo a principal exceção) a velocidade da divisão celular e a colocação dos blastômeros um em relação ao outro estão completamente sob controle das proteínas e dos mRNAs armazenados no oócito pela mãe. O genoma zigótico transmitido por mitose para todas as outras células, não funciona em embriões com clivagem precoce. Poucos, se alguns, mRNAs são produzidos mais tarde durante a clivagem, o embrião pode dividir-se apropriadamente até mesmo quando produtos químicos são usados para inibir a transcrição. Também em muitas espécies, não há aumento do volume embrionário durante a clivagem. Isso difere da maioria dos casos de proliferação de células, do qual existe um período de crescimento celular entre as mitoses: a célula se expande para quase o dobro de seu volume, daí se divide. Esse crescimento produz um aumento total de células enquanto mantém uma razão relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmático. Durante a clivagem embrionária, no entanto, o volume citoplasmático não aumenta. Antes, o enorme volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez mais em células menores. O primeiro ovo é dividido ao meio, em seguida em quartos, em oitavos, e assim por diante. Essa divisão do citoplasma do ovo, sem o aumento do seu volume, é acompanhada pela abolição do período de crescimento entre as divisões, enquanto a clivagem dos núcleos ocorre numa razão tão rápida nunca vista antes (nem mesmo em células de tumor). Um ovo de rã, por exemplo, pode ser dividido em 37.000 células em apenas 43 horas. A mitose na Drosophila, em estágio de clivagem, ocorre a cada dez minutos por mais de duas horas, e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50.000 células. Esse aumento em número de células pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do desenvolvimento. A Figura 5.1 mostra o logaritmo de números celulares em um embrião de rã representado graficamente em função do tempo de desenvolvimento (Sze, 1953). Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulação. Uma conseqüência dessa divisão rápida é a razão do volume citoplasmático/nuclear se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. Em muitos tipos de embriões, a diminuição da razão entre os volumes citoplasmático e nuclear é crucial na

N

OTÁVEL COMO SÓ ELA É, a fertilização é o passo inicial do desenvolvi-

167

168

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 5.1
Log10 do número de células por embrião

Formação de novas células durante o desenvolvimento precoce da rã Rana pipiens. (Segundo Sze, 1953.)

Clivagem

Gastrulação

Horas a 150C

regulagem do tempo da ativação de certos genes. Por exemplo, na rã Xenopus laevis, a transcrição de novas mensagens só é ativada após 12 divisões. A essa altura, a razão da clivagem diminui, os blastômeros tornam-se móveis e os genes nucleares começam a ser transcritos. É sabido que algo no ovo está sendo titulado pela recém-produzida cromatina, porque o tempo dessa transição pode ser mudado experimentalmente alterando na célula a razão da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner, 1982a,b), ainda que a clivagem comece logo após a fertilização e termine assim que o embrião atinja um novo equilíbrio entre o núcleo e o citoplasma.

PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA
Clivagem é um processo muito bem coordenado e é regulado pelas leis genéticas. O padrão da clivagem embrionária de uma dada espécie é determinado por dois parâmetros principais: (1) a quantidade e a distribuição de proteína do vitelo dentro do citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ângulo do fuso mitótico e na determinação do tempo de sua formação. A quantidade e distribuição de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o tamanho relativo dos blastômeros. Quando um pólo do ovo é relativamente livre de vitelo, a divisão celular ocorre nesse pólo de uma forma mais rápida do que a do pólo oposto. O pólo rico em vitelo é chamado de pólo vegetal; a concentração de vitelo no

Tabela 5.1 Classsificação dos tipos de clivagem Padrão de clivagem Holoblástica (clivagem completa) Posição do vitelo Isolécito (oligolécito) (vitelo escasso, distribuído por igual) Simetria de clivagem Radial Espiral Bilateral Rotacional Radial Bilateral Discoidal Superficial Animais representativos Equinodermos, Amphioxus Maioria dos moluscos, anelídeos, nematelmintos, platelmintos Ascídios Mamíferos Anfíbios Moluscos cefalópodos Répteis, peixes, aves Maioria dos artrópodos

Meroblástica (clivagem incompleta)

Mesolécito (moderadamente telolécito) Telolécito (vitelo denso, concentrado em uma extremidade do ovo) Centrolécito (vitelo concentrado no centro do ovo)

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

169

pólo animal é relativamente baixa. O núcleo do zigoto é freqüentemente deslocado em direção ao pólo animal. No geral, o vitelo inibe a clivagem. A Tabela 5.1 fornece a classificação dos tipos de clivagem e mostra a influência do vitelo no padrão e na simetria da clivagem. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolécitos e mesolécitos) a clivagem é holoblástica, significando que o sulco da clivagem se extende por todo o ovo. Zigotos contendo grande acúmulo de proteína vitelínica sofrem clivagem meroblástica, onde somente uma porção do citoplasma é clivado. O sulco da clivagem não chega a penetrar na porção de vitelo do citoplasma. Clivagem meroblástica pode ser discoidal, como nos ovos das aves, ou superficial, como em zigotos de insetos, dependendo onde o depósito de vitelo estiver localizado, de um lado (telolécito) ou no centro do citoplasma (centrolécito), respectivamente. O vitelo é uma extraordinária adaptação que permite ao embrião se desenvolver na ausência de uma fonte externa de alimentação. Animais desenvolvidos sem grandes concentrações de vitelo, como os ouriços-do-mar, normalmente formam o estágio larval muito rapidamente. Esse estágio larval pode se alimentar por si só, o desenvolvimento continua com a larva nadando livre. Embriões de mamíferos, que também não possuem uma grande quantidade de vitelo, adotam uma outra estratégia: a placenta, como veremos adiante, se torna a primeira diferenciação do embrião mamífero separando as células que irão formar a placenta. Esse órgão fornece alimento e oxigênio para o embrião durante sua longa gestação. No outro extremo estão os ovos dos insetos, peixes, répteis e aves. A maior parte do seu volume celular é vitelo. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais, sendo que eles se desenvolvem sem um estágio larval ou placentário. A correlação entre grandes concentrações de vitelo e a falta do estado larval é conhecida em algumas espécies de rãs. Algumas rãs tropicais, tais como as Eleutherodactylus e a Arthroleptella não passam pelo estágio de girino. Ao contrário, eles provém seus ovos com quantidades enormes de concentração de vitelo (Lutz, 1947). Os ovos não necessitam ser colocados na água porque o estágio de girino foi eliminado. (Isso será discutido mais adiante no Capítulo 19.) No entanto, o vitelo é somente um fator influenciando o padrão de clivagem em uma espécie. Existem também padrões herdados de divisões celulares que são adicionados às restrições do vitelo. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolécitos, nos quais muito pouco vitelo está presente. Na ausência de grandes quantidades de vitelo, quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblástica radial, holoblástica espiral, holoblástica bilateral e clivagem holoblástica rotacional.

Clivagem holoblástica radial
Clivagem holoblástica radial é a forma mais simples de clivagem de se entender. Nesse tipo de clivagem os sulcos têm orientação paralela e perpendicular ao eixo animalvegetal do ovo. Esse tipo de clivagem é característico de equinodermos e do protocordato Amphioxus, assim como de rãs e salamandras. A holotúria, Synapta A clivagem padrão da holotúria, Synapta digita, é ilustrada na Figura 5.2. Após a união dos pronúcleos, o eixo da primeira haste mitótica é formado perpendicularmente ao eixo animal-vegetal do ovo. Para esse fim, o primeiro sulco da clivagem passa diretamente através dos pólos animal e vegetal, criando duas células filhas do mesmo tamanho. Essa clivagem é conhecida como meridional porque passa pelos dois pólos como um meridiano no globo. Os sulcos da segunda clivagem estão no ângulo reto dos sulcos da primeira clivagem, mas continuam perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos blastômeros e também passam pelos dois pólos. Dessa maneira, as primeiras duas divisões são, ao mesmo tempo, meridional e perpendicular uma com a outra. A terceira divisão é equatorial: as hastes mitóticas de cada blastômero estão agora em posição

170

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 5.2

Pólo animal

Clivagem holoblástica no equinodermo Synapta digita, levando à formação de uma blástula oca, conforme mostrado no corte (último painel). (Segundo Saunders, 1982.)

Plano de clivagem meridional

Plano de clivagem equatorial

Pólo vegetal

Metade Animal

Pólo animal

Metade Vegetal

Blástula oca (aberta por corte)

Pólo vegetal

paralela ao eixo animal-vegetal, e o sulco resultante da clivagem separa os dois pólos um do outro, dividindo o embrião em oito blastômeros iguais. Cada blastômero na metade animal do embrião está agora diretamente acima do blastômero da metade vegetal. A quarta divisão é meridional novamente, produzindo duas fileiras de 8 células cada, enquanto a quinta divisão é equatorial, produzindo quatro fileiras de 8 células cada. Sucessivas divisões produzem embriões de 64,128 e 256 células, com divisões meridionais alternando com divisões equatoriais. Os embriões resultantes consistem de blastômeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central. Em ambos os pólos do embrião, os blastômeros se movem, uns em direção aos outros, para criar uma esfera oca composta de uma única camada de células. Essa esfera oca é chamada de blástula, e a cavidade central é referida como blastocele. A qualquer momento durante a clivagem da Synapta, um embrião seccionado através de qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades. Esse tipo de simetria é característico de uma esfera ou cilindro e é chamada de simetria radial. Dessa maneira, Synapta tem clivagem holoblástica radial. Ouriço-do-Mar Ouriço -do-Mar O ouriço-do-mar também apresenta clivagem holoblástica radial, mas com algumas importantes modificações. A primeira e a segunda clivagem são similares as da Synapta; ambas são meridionais e perpendiculares em relação a outra. Similarmente, a terceira clivagem é equatorial, separando os dois pólos um do outro (Figura 5.3). Na quarta clivagem, no entanto, os eventos são bem diferentes. As quatro células da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastômeros, cada qual com o mesmo volume. Essas células são chamadas mesômeros. A camada vegetal, no entanto, sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no pólo vegetal quatro células grandes, os macrômeros, e quatro pequenas, os micrômeros (Figura 5.4; Summers et al., 1993). Assim que a célula com 16 embriões clivar, os oito mesômeros se dividem para formar duas camadas “animais”, an1 e an2, uma se equilibrando em cima da outra. Os macrômeros se dividem meridionalmente, formando uma camada de oito células abaixo de an2. Os micrômeros também se dividem, produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Todos os sulcos de clivagem da sexta divisão são equatoriais; a sétima clivagem é meridional, produzindo uma blástula com 128 células.

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

171

(A)

Pólo animal

Figura 5.3

Pólo vegetal Mesômeros

Metade animal

an 1 an 2

derivados derivados veg1 veg2

Clivagem no ouriço-do-mar. (A) Planos de clivagem nas primeiras três divisões e formação de camadas particulares de células nas divisões 3-6. (B-D) Fotomicrografias de embriões vivos do ouriço-do-mar Lytechinus pictus, visão de cima para baixo do pólo animal. (B) O estágio de 2 células. (C) O estágio de 4 células. (D) O estágio de 32 células, mostrado sem a membrana de fertilização para permitir a visualização dos mesômeros do pólo animal, os macrômeros centrais e dos micrômeros vegetais em ângulo para o centro. (Fotografia cortesia de G. Watchmaker.)

Metade vegetal (B)

Micrômeros

Macrômeros (C) (D)

Em 1939, Sven Hörstadius realizou um experimento simples demonstrando que o controle do tempo e colocação de cada clivagem de ouriço-do-mar é independente de clivagens preexistentes. Ele demonstrou que se inibisse a primeira, a segunda e terceira clivagens, sacudindo os ovos, ou colocando-os em água do mar hipotônica, a clivagem desigual (quarta) que forma os micrômeros, ainda ocorreria no tempo apropriado. Sendo assim, Hörstadius concluiu que existem três fatores que determinam a clivagem em um embrião de 8 células: (1) existem mudanças progressivas no citoplasma,

Figura 5.4

(A)

(B)

Formação de micrômeros durante a quarta divisão de embriões de ouriços-do-mar. Os pólos vegetais dos embriões são visualizados por baixo. (A) A localização e orientação do fuso mitótico na parte baixa das células vegetais são visualizadas com luz polarizada no embrião vivo. (B) A clivagem através desses fusos, colocados assimetricamente, produziu micrômeros e macrômeros. (de Inoué, 1982, cortesia de S. Inoué.)

172

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Cílio

Blastocele

(A) Blástula jovem

(B) Blástula mais velha com placa vegetal achatada e tufo ciliar

(C)

Figura 5.5

Blástulas de ouriço-do-mar. (A) Esquema de um corte controle através de uma blástula precoce de ouriço-do-mar, mostrando uma camada única de células arredondadas rodeando uma grande blastocele. (B) Com a contínua divisão, as células da blástula tardia mostram diferenças de forma à medida que as células da placa vegetal se alongam, (C) Junções apertadas (flecha) formando– se entre células de uma blástula de equinodermo com 1024 células. (A e B segundo Giudice, 1973; C de Dan-Sohkawa e Fujisawa, 1980, cortesia dos autores.)

algum tempo após a fertilização, que direcionam os fusos formados para uma certa direção; (2) deve haver material formador de micrômero no citoplasma vegetal; e (3) deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrômeros seja ativado no tempo correto (Hörstadius,1973). No desenvolvimento do ouriço-do-mar, o estágio de blástula começa na fase de 128 células. Nesse estágio, as células formam uma esfera oca circundando a blastocele central (Figura 5.5A,B). Nessa altura, todas as células são do mesmo tamanho, os micrômeros tendo diminuída sua divisão celular e clivando menos freqüentemente. Toda a célula está em contato com o fluido proteináceo da blastocele e com a camada hialina dentro do envoltório de fertilização. Durante esse tempo, os contatos entre as células são estreitados. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse método em embriões de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esférica é contemporânea com a formação de junções apertadas entre os blastômeros. Essas junções unem as células frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele é isolada do ambiente externo (Figura 5.5C). Dando prosseguimento a sua divisão, a camada celular é expandida e se afina. Durante esse período, a blástula permanece como uma camada unicelular grossa. Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferação de células e formação da blastocele. Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expansão é o influxo de água na cavidade da blastocele. Já que o blastômero secreta proteína na blastocele, seu fluido torna-se espesso. Esse fluido absorve grandes quantidades de água por osmose, exercendo pressão nos blastômeros para se expandirem. Essa pressão também alinha o longo eixo de cada célula para que a divisão nunca seja para dentro da blastocele. Isso criaria uma expansão adicional fazendo com que a população fosse orientada somente para um plano. Wolpert e Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a pressão da blastocele não é necessária para se conseguir esse efeito. Eles enfatizaram o papel de adesividade das células entre si e a camada hialina. Eles mostraram que enquanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina, as células não têm alternativa a não ser a de se expandir. Essa expansão cria a blástula ao invés do contrário. Certamente, a camada hialina é vital para expansão da blastocele, e se a adesão de células da camada hialina é inibida por anticorpos para a hialina, então a expansão da blastocele cessa (Adelson e Humphreys, 1988). Em um trabalho recente (Ettensohn e Ingersoll, 1992) concluíram que é provável que ambos

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

173

mecanismos expandem a blastocele. Durante a clivagem precoce, a adesão à camada hialina parece ser o fator mais importante, enquanto que em estágios mais tardios, a pressão osmótica também parece exercer o seu papel. A células da blástula desenvolvem cílios em sua superfície externa (Figura 5.6), desse modo, causando a rotação da blástula dentro do envoltório de fertilização. Logo após, as células da parte animal do embrião sintetizam e secretam uma enzima de eclosão que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al., 1992), o embrião se torna uma blástula eclodida livre para nadar. Anfíbios Clivagem na maioria dos embriões de rãs e salamandras é radialmente simétrica e holoblástica, como na clivagem do equinodermo. O ovo do anfíbio, no entanto, contém muito mais vitelo. Esse vitelo, que é concentrado no hemisfério vegetal, é um impedimento à clivagem. Sendo assim, a primeira divisão começa no pólo animal e vagarosamente se estende até a região vegetal (Figura 5.7). Na salamandra axolotle, o sulco da clivagem se estende através do hemisfério animal a uma velocidade próxima de 1mm/min. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para menos de 0.02-0.03mm/min ao se aproximar do pólo vegetal (Hara, 1977). A Figura 5.8A é uma varredura no microscópio eletrônico, mostrando a primeira clivagem em um ovo de rã. Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a diferença entre os sulcos nos hemisférios animal e vegetal. A Figura 5.8B mostra que enquanto o sulco da primeira clivagem ainda está tentando clivar o vitelo citoplasmático do hemisfério vegetal, a segunda clivagem já começou próxima ao pólo animal. Essa clivagem está em ângulos retos em relação à primeira, e é também meridional. A terceira clivagem, como era de se esperar, é equatorial. No entanto, por causa do vitelo vegetalmente colocado, esse sulco da clivagem em ovos anfíbios é muito mais próximo do pólo animal. Ele divide o embrião de rã em quatro blastômeros animais pequenos (micrômeros) e quatro grandes blastômeros (macrômeros) na região vegetal. Essa clivagem holoblástica desigual estabelece duas regiões embrionárias principais: uma de divisão rápida de micrômeros, próxima ao pólo animal, e outra de macrômeros, mais lenta (Figura 5.8C). Assim que a clivagem progride, a região animal se torna abarrotada com numerosas células pequenas, enquanto a região vegetal contém uma pequena quantidade de grandes macrômeros carregados de vitelo (ver Figura 5.7). Embriões anfíbios contendo de 16 a 64 células são freqüentemente chamados mórulas (do Latim “amora”, da qual sua forma é vagamente reminiscente). No estágio de 128 células a blastocele se torna aparente e o embrião é considerado uma blástula.

Figura 5.6

Células ciliadas da blástula. Cada célula desenvolve um único cílio. (Cortesia de W. J. Humphreys.)

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 5.7

Crescente Cinzento (E) (F) (G) (H) Blastocele

Clivagem de um ovo de rã. Sulcos de clivagem, designados por números romanos, estão enumerados por ordem de aparecimento. (A, B) O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo com que a segunda divisão comece na região animal do ovo, antes da primeira divisão ter dividido o citoplasma vegetal. (C) A terceira divisão é deslocada em direção ao pólo animal. (D-H) No final, o hemisfério vegetal contém blastômeros mais longos e mais escassos que os da metade animal. (Segundo Carlson, 1981.)

174

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

Figura 5.8

Pregas Sulco de clivagem

Micrografias ao microscópio eletrônico da clivagem de um ovo de rã. (A) Primeira clivagem. (B) Segunda clivagem (4 células). (C) Quarta clivagem (16 células), mostrando a discrepância de tamanho entre as células animais e vegetais aparecendo após a terceira divisão. (A de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores; B e C cortesia de L. Biedler.)

(B)

(C)

Na realidade, a formação da blastocele foi traçada desde o primeiro sulco de clivagem. Kalt (1971) demonstrou que na rã Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se alarga no hemisfério animal para criar uma pequena cavidade intercelular que é isolada do ambiente externo por junções intercelulares muito apertadas (Figura 5.9). Essa cavidade se expande durante clivagens subseqüentes para se tornar uma blastocele. A blastocele provavelmente presta duas principais funções no embrião das rãs: (1) é uma cavidade que permite migração celular durante a gastrulação, e (2) previne células que estão abaixo interagir prematuramente com as células de cima. Quando Nieuwkoop (1973) tirou células do topo da blastocele de um embrião de salamandra aquática e colocou-as junto a células do vitelo vegetal na base da blastocele, essas células animais se tornaram mesoderma ao invés de ectoderma. Como o tecido mesodérmico é normalmente formado dessas células animais, que são adjacentes aos precursores do endoderma, parece plausível que células vegetais influenciam células adjacentes para se diferenciar em tecidos mesodérmicos. Sendo assim, a blastocele aparece para prevenir o contato do endoderma com células destinadas para dar origem à pele e aos nervos. Enquanto essas células estão dividindo-se, numerosas células com moléculas de adesão mantêm as células juntas. Uma das mais importantes dessas moléculas é a EPcaderina. O mRNA para essa proteína é fornecido no citoplasma do oócito, e se essa mensagem é destruída (injetando no oócito oligonucleotídeos antisense complementares para esse mRNA), a EP-caderina não é produzida e a adesão entre os blastômeros é dramaticamente reduzida (Heasman et al., 1994). Isso resulta na obliteração da blastocele (Figura 5.10).

Figura 5.9

Formação da blastocele num ovo de rã. (A) Primeiro plano de clivagem mostrando uma pequena fenda, que posteriormente se desenvolve na blastocele. (B) embrião de oito células mostrando uma pequena blastocele (flecha) na junção de três planos de clivagem. (de Kalt, 1971, cortesia de M. R. Kalt.)

(A)

(B)

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

175

(A)

(B)

Figura 5.10

Depleção de EP-caderina mRNA no oócito de Xenopus, resultando na perda de adesão entre os blastômeros e na obliteração da blastocele. Oligonucleotídeos antisense complementares à mensagem da EP-caderina foram injetados no embrião unicelular, prevenindo a expressão da EPcaderina. A blastocele é obliterada em embriões depletados de EP-caderina, mas (B) não pelos controles. (de Heasman et al., 1994; fotografia, cortesia de J. Heasman.)

Clivagem holoblástica espiral
Clivagem espiral é característica de vermes anelídeos, platelmintos turbelários, vermes nemertinos e todos os moluscos, exceto cefalópodos. Difere da clivagem radial em muitas maneiras. Primeiro, os ovos não se dividem em paralelo ou em orientações perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo; de preferência, a clivagem se dá em ângulos oblíquos, formando a disposição “espiral” de blastômeros filhos. Segundo, as células se tocam entre si em mais lugares do que em embriões clivados radialmente. Na realidade, elas assumem o empacotamento com a orientação termodinamicamente mais estável, parecido com o de bolhas de sabão adjacentes (Figura 5.11). Terceiro, embriões de clivagem espiral normalmente realizam menos divisões antes de começar a gastrulação, tornando possível saber o destino de cada célula da blástula. Quando os destinos das células individuais em embriões de anelídeos, platelmintos turbelários e moluscos foram comparados, as mesmas células foram vistas no mesmo lugar e o seus destinos, de uma maneira geral, foram idênticos (Wilson, 1898). As blástulas então produzidas não têm blastocele e são chamadas de estereoblástulas. As Figuras 5.12 e 5.13 retratam a clivagem de embriões de moluscos. As duas primeiras clivagens são quase meridionais, produzindo quatro grandes macrômeros (marcados A, B, C e D). Em muitas espécies, os blastômeros são de tamanhos diferentes (D sendo o maior), uma característica que permite serem individualmente identificados. Em cada sucessiva clivagem, cada macrômero origina um pequeno micrômero no seu pólo animal. Cada quarteto sucessivo de micrômeros é deslocado para a direita ou para a esquerda de seu macrômero irmão, criando um relacionamento espiral característico da clivagem. Observando o embrião pelo pólo animal, as partes superiores do eixo mitótico parecem alternar entre o sentido horário e o anti-horário. Isso faz com que micrômeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a direita do seu macrômero. Na terceira clivagem, o macrômero A dará origem a duas células filhas, macrômero 1A e micrômero 1a. As células B, C e D se comportam similarmente, produzindo o primeiro quarteto de micrômeros. Na maioria das espécies, os micrômeros estão à direita do seu macrômero (olhando para o pólo animal), uma disposição indicando uma espiral dextra (oposta à sinistra). Na quarta clivagem,

Figura 5.11

Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito bolhas de sabão num prato ligeiramente côncavo. O arranjo termodinâmico maximiza o contato e é muito reminiscente daquele de embriões que se clivam em espiral. (Segundo Morgan, 1927.)

176

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

Vista do pólo animal

(B)

Vista lateral

Figura 5.12

Clivagem em espiral do molusco Trochus vista do pólo animal (A) e de um lado (B). Em B, as células derivadas do blastômero A estão coloridas. Os fusos mitóticos, esquematizados nos estágios precoces, dividem as células desigualmente e em ângulo aos eixos vertical e horizontal.

o macrômero 1A se divide para formar o macrômero 2A e o micrômero 2a; e o micrômero 1a se divide para formar mais dois micrômeros, 1a1 e 1a2. Mais clivagens irão produzir blastômeros 3A e 3a a partir do macrômero 2A; e micrômeros, como por exemplo o 1a2, se dividem para produzir células tais como as 1a21 e 1a22. A orientação da clivagem plana para a esquerda ou para a direita é controlada por fatores citoplasmáticos dentro do oócito. Isso foi descoberto analisando mutações da espiral do caracol. Alguns caracóis têm sua espiral aberta à direita da concha, enquanto outros têm sua abertura para à esquerda. Normalmente, a rotação da espiral é a mesma para todos os membros de uma determinada espécie. Todavia, ocasionalmente, ainda são encontrados mutantes. Exemplificando, em espécies em que a espiral abre para a direita, serão encontrados alguns indivíduos com a abertura espiral para a esquerda. Crampton (1984) analisou os embriões desses caracóis aberrantes e observou que sua clivagem precoce difere da normal.

Figura 5.13

Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. O blastômero D é maior que os outros, permitindo a identificação de cada célula. A clivagem é dextra. (A) estágio de 8 células. PB é o corpo polar. (B) Metade da quarta clivagem; os macrômeros já se dividiram em células grandes e pequenas orientadas espiralmente. (de Craig e Morrill, 1986, cortesia dos autores.)

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

177

(A)

Enrolamento sinistrogiro

(B)

Enrolamento dextrogiro

Figura 5.14

Olhando do pólo animal de caracóis enrolados para a direita e para a esquerda. A origem do enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientação do fuso mitótico na segunda clivagem. Os caracóis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como imagens espelhares uma da outra. (Segundo Morgan, 1927.)

A orientação das células após a segunda clivagem estava diferente (Figura 5.14), graças a uma orientação diferente do aparelho mitótico nos caracóis com enrolamento sinistrogiro. Todas as subseqüentes divisões em embriões de espiral para a esquerda são imagens espelhares daqueles embriões com espirais dextras. Na Figura 5.14, podemos notar que a posição do blastômero 4d (o qual é muito importante, já que sua progênie irá formar os órgãos mesodérmicos) é diferente nos dois tipos de espirais dos embriões. Geralmente, os dois caracóis são formados com seus corpos em lados diferentes da abertura da espiral. A direção da abertura na espiral da concha do caracol é controlada por um único par de genes (Sturtevant, 1923; Boycott et al., 1930). No caracol Limnaea peregra a maioria dos indivíduos são espiralados para a direita. Raros mutantes, exibindo abertura esquerda, foram encontrados e acasalados com caracóis tipo-selvagem. Esses acasalamentos mostraram que existe um alelo D “dextrogiro” que é dominante em relação ao alelo d “sinistrogiro”. No entanto, a direção da clivagem não é determinada pelo genótipo do caracol em desenvolvimento, mas pelo genótipo da mãe do caramujo. Caramujo fêmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra, mesmo quando o genótipo dos herdeiros é Dd. Um indivíduo Dd irá se espiralar tanto para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua mãe. Esses cruzamentos produzem o seguinte quadro:

178

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Os fatores genéticos envolvidos no enrolamento do caracol são trazidos ao embrião no citoplasma do oócito. É o genótipo do ovário, no qual o fenótipo se desenvolve, que determina em que direção a clivagem vai ocorrer. Quando Freeman e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mães dd, uma pequena quantidade de citoplasma proveniente de caracóis com espirais dextras, os embriões resultantes apresentaram espirais para a direita. Citoplasmas de caracóis com espiral esquerda não afetaram os embriões com a espiral direita. Isso confirma a observação que mães do tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou defeituoso nas mães dd. [cleave1.html] Outra descoberta emocionante com relação a clivagem dos moluscos está na comunicação entre os blastômeros. Nos moluscos de blastômeros de igual tamanho no estágio de quatro células*, a determinação de que a célula que originará a célula precursora mesodérmica será alcançada entre a quinta e a sexta clivagem. Nessa altura, o macrômero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrômeros do pólo animal. Sem esse contato, a célula 4d produzida pelos macrômeros 3D não produz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier, 1979). Injetando corantes de baixo peso molecular, de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e não antes), pequenas moléculas são capazes de difundirem-se entre os macrômeros 3D e os micrômeros centrais. Imagens ao microscópio eletrônico mostram que nesse momento, aparecem junções de fenda na superfície dessas células.
*Não se preocupe, daremos no Capítulo 16 mais informações sobre embriões de moluscos com blastômeros de tamanhos desiguais.

Informações adicionais

&

Especulações

Adaptação pela modificação da clivagem embrionária

E

VOLUÇÃO é causada pela alteração hereditária do desenvolvimento embrionário. Às vezes, somos capazes de identificar uma modificação da embriogênese que impediu o organismo de sobreviver diferentemente em ambientes hostis. Uma dessas modificações, descoberta por Frank Lillie em 1898, é causada pela alteração do padrão típico da clivagem espiral na família unionídeo das ostras. Ao contrário da maioria das ostras, Unio e seus aparentados vivem em locais de água corrente. As correntes criam um problema para a dispersão das larvas, porque os adul-

tos são sedentários e as larvas que nadam livremente seriam sempre carregadas correnteza abaixo. Essas ostras, no entanto, resolveram esse problema efetuando duas modificações no seu desenvolvimento. A primeira altera a clivagem embrionária. Na típica clivagem dos moluscos, ou todos os macrômeros são iguais em tamanho, ou o blastômero 2D é a maior célula no estágio embrionário. No entanto, a divisão desse Unio é tal que o blastômero 2d fica com a maior parte do citoplasma (Figura 5.15). Essa célula se divide para produzir a maior parte das estruturas larvais, incluindo uma glân-

dula capaz de produzir uma concha maciça. Essas larvas (chamadas gloquídias) assemelham-se a pequenas armadilhas para urso; possuem pêlos sensíveis que permitem as válvulas da concha fecharem-se abruptamente quando tocadas pelas guelFigura 5.15

Formação de larvas de gloquídia pela modificação da clivagem em espiral. Após formação do embrião de 8 células (A), a disposição do fuso mitótico motiva a maioria do citoplasma D penetrar no blastômero 2d (B). Esse blastômero grande 2d se divide (C), para finalmente originar a grande concha “armadilha de urso” da larva (D). (Segundo Raff e Kaufman, 1983.)

(A)

(B)

(C)

(D)

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

179

ras ou barbatanas dos peixes que por ali estiverem passando. Elas “pegam uma carona” com o peixe até estarem prontas para cair e, através de metamorfose, transformarse em moluscos adultos. Dessa maneira, podem se espalhar correnteza acima. Em algumas espécies, as gloquídias são liberadas da bolsa de criação da fêmea e meramente aguardam um peixe passar. Outras espécies, tal como a Lampsilis ventricosa, aumentaram as chances de suas larvas encontrarem um peixe realizando outra modificação no seu desenvolvimento (Welsh, 1969). Muitos moluscos desenvolvem um manto fino e saliente em volta da concha circundando a bolsa de criação. Em alguns unionídeos, a forma da bolsa de criação (marsúpio) e as ondulações do manto

Figura 5.16

Peixe falso sobre o molusco unionídeo lampsilis ventricosa. O “peixe” é, na verdade, a bolsa da cria e o manto do molusco. (Fotografia, cortesia de J. H. Welsh.)

imitam o comportamento e a forma de pequenos peixes nadando. Para tornar a ilusão mais completa, desenvolveram uma mancha preta em forma de olho (ocelo) de um lado e uma nadadeira do outro. O “peixe” visto na Figura 5.16 não é um peixe real, mas sim a bolsa de criação e o manto abaixo dela. Quando o peixe que estiver ao alcance for atraído, o molusco despeja as gloquídias da bolsa de criação. Dessa maneira, a modificação de padrões de comportamentos já existentes permitiram moluscos unionídeos sobreviver em ambientes hostis.

Clivagem Holoblástica Bilateral Clivagem holoblástica bilateral é encontrada primariamente nos ascídios (tunicados). A Figura 5.17 mostra a clivagem padrão de um tunicado, Styela partita. O fenômeno mais admirável nesse tipo de clivagem é que o primeiro plano de clivagem estabelece o único plano de simetria no embrião, separando o embrião do que será o seu futuro lado direito e esquerdo. Cada divisão sucessiva orienta-se em relação a esse plano de simetria, e o meio embrião formado de um lado da primeira clivagem é a imagem espelhar do meio embrião do outro lado. A segunda clivagem é meridional, como a primeira divisão; mas ao contrário da primeira divisão, não passa através do centro do ovo. Em vez disso, ela cria duas grandes células anteriores (blastômeros A e D) e duas pequenas células posteriores (blastômeros B e C). Cada lado tem agora um blastômero grande e um pequeno. Durante as três próximas divisões, as diferenças no tamanho e na forma destacam a simetria bilateral desses embriões. No estágio de 32 células, uma pequena blastocele se forma e começa a gastrulação. Como foi mencionado no capítulo 4, certos tunicados (incluindo S. partita) contêm regiões citoplasmáticas coloridas. Durante a clivagem, essas se tornam fracionadas em células diferentes. Além do mais, o tipo de citoplasma que a célula recebe determina seu destino. Células recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma; aquelas contendo citoplasma amarelo se transformam em células mesodérmicas; as células

Figura 5.16

Simetria bilateral em um ovo de tunicado. (A) Ovo não-clivado, mostrando os destinos das várias regiões citoplasmáticas. (B) embrião de oito células, mostrando os blastômeros e os destinos das várias células. Pode ser visualizado como duas metades de 4 células; daqui em diante, cada divisão no lado direito do embrião tem uma divisão espelhar do lado esquerdo. (C, D) Vistas de embriões mais tardios do pólo vegetal. (As regiões do citoplasma destinadas a formar determinados órgãos estão marcadas em A e são codificadas por cor em todo o diagrama.) (Segundo Balinsky, 1981.)
(D)

(A

(B)

(C)

Ectoderma

Ectoderma neural Músculo Mesênquima Pólo vegetal Notocorda Endoderma Pólo vegetal Vista do pólo vegetal

180

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

que incorporam inclusões ardósia se tornam endoderma e as células cinza claro, o tubo neural e a notocorda. Esses plasmas coloridos estão localizados bilateralmente em volta do plano de simetria e, assim, eles serão divididos pelo sulco da primeira clivagem em metades direita e esquerda do embrião. A segunda clivagem motiva o provável mesoderma se posicionar nas duas células posteriores, enquanto o provável tubo neural e cordomesoderma serão formados pelas duas células anteriores. Mais adiante, a terceira divisão irá repartir essas regiões citoplasmáticas, de modo que as células formadoras do mesoderma são confinadas aos dois blastômeros vegetais posteriores, e as células do cordomesoderma são restritas as duas células vegetais anteriores. O destino de cada célula do embrião precoce de Styela tem sido acompanhado e será discutido em detalhe no Capítulo 13.

Clivagem holoblástica rotacional
Não é surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamíferos tenha-se tornado um desafio. Os ovos de mamíferos estão entre os menores do reino animal, tornando difícil seu manuseio experimental. O zigoto humano, por exemplo, tem somente 100 µm de diâmetro, praticamente invisível, sendo seu volume menor de um milésimo do ovo de Xenopus. Também, zigotos de mamíferos não são produzidos em números comparáveis aos embriões do ouriço-do-mar ou de rãs. Normalmente, menos de 10 ovos são ovulados por uma fêmea em um determinado tempo, tornando difícil a obtenção de material para estudos bioquímicos. E como uma barreira final, o desenvolvimento dos embriões dos mamíferos se completa dentro de outro organismo ao invés de um ambiente externo. Só recentemente foi possível a duplicação de algumas dessas condições internas e observar o desenvolvimento in vitro. Com todas essas dificuldades, valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem de mamíferos, já que a clivagem nos mamíferos é completamente diferente de outros padrões de divisão celular embrionária. O oócito dos mamíferos é liberado pelo ovário e varrido pelas fímbrias até o oviduto (Figura 5.18). A fertilização ocorre na ampola do oviduto, região próxima ao ovário. A meiose é então completada, e a primeira clivagem começa um dia depois. A clivagem nos mamíferos está entre as mais lentas do reino animal – de 12 a 24 horas de separação. Enquanto isso, os cílios no oviduto empurram o embrião em direção ao útero; a primeira clivagem ocorre durante essa jornada. Existem várias características da clivagem dos mamíferos que as distinguem de outros tipos de clivagem. A primeira é relativa a lentidão das divisões. A segunda diferença fundamental é a singular orientação dos blastômeros dos mamíferos um em relação ao outro. A primeira clivagem é uma divisão meridional normal; no entanto, na

Estágio de 2 células Útero Primeira clivagem

Zona pelúcida

Figura 5.18

Desenvolvimento de um embrião humano desde a fertilização até a implantação. A compactação em embriões humanos ocorre no dia 4, quando ele está no estágio de 10 células. O ovo “eclode” da zona quando alcança o útero, e é provável que a zona evite a adesão das células em clivagem de se colarem ao oviduto, em lugar de viajar para o útero. (Segundo TuchmannDuplessis et al., 1972.)

Oviduto Mórula Blastocisto Ovário Estágio precoce da implantação Fertilização Ovulação

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

181

Plano de clivagem II

Plano de clivagem I

Plano de clivagem IIA

Plano de clivagem I

Figura 5.19

Comparação da clivagem precoce (A) em equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamíferos (clivagem rotacional). Nematóides também têm uma forma rotacional de clivagem, porém, não formam a estrutura blastocística característica dos mamíferos. Detalhes sobre a clivagem dos nematóides serão fornecidos no Capítulo 13. (Segundo Gulyas, 1975.)
Plano de clivagem IIB

(A) EQUINODERMO (Ouriço-do-mar)

(B) MAMÍFERO (Coelho)

segunda clivagem um dos dois blastômeros se divide meridionalmente e o outro se divide equatorialmente (Figura 5.19). Esse tipo de clivagem é chamada de clivagem rotacional (Gulyas, 1975). A terceira principal diferença entre a clivagem nos mamíferos e a da maioria dos outros embriões é marcada pela falta de sincronização das divisões precoces. Os blastômeros de mamíferos não se dividem ao mesmo tempo. Dessa maneira, embriões de mamíferos não aumentam por igual do estágio de 2 para 4 e para 8 células, mas freqüentemente contêm números ímpares de células. Também, diferente dos outros genomas animais, o genoma mamífero é ativado durante a clivagem precoce, sendo o responsável pela produção de proteína necessária para a clivagem. No camundongo e na cabra, a mudança do controle maternal para o zigótico ocorre no estágio de duas células (Piko e Clegg, 1982; Prather 1989). [cleave2.html] Compactação Talvez a diferença mais crucial entre a clivagem de mamífero e todos os outros tipos envolva o fenômeno da compactação. Como mostra a Figura 5.20, blastômeros mamíferos, atravessando o estágio de 8 células, formam um arranjo solto com espaço suficiente entre eles. Seguindo a terceira clivagem, no entanto, os blastômeros passam

(A)

(B)

(C )

Figura 5.20

(D)

(E)

(F)

Clivagem de um único embrião de camundongo in vitro. (A) estágio de 2 células. (B) estágio de 4 células. (C) início do estágio de 8 células. (D) Estágio de 8 células compactado. (E) Mórula. (F) Blastocisto. (de Mulnard, 1967, cortesia de J. G. Mulnard.)

182

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

Figura 5.21

Micrografia ao microscópio eletrônico de embriões de camundongos de 8 células. (A) nãocompactados e (B) compactados. (Cortesia de C. Ziomek.)

por uma mudança espetacular em seu comportamento. De repente, se amontoam, maximizando seu contato com outros blastômeros, formando uma bola compacta de células (Figuras 5.20C,D e 5.21). Esse pacote é estabilizado por junções apertadas que se formam entre as células, selando o interior da esfera (Figura 5.22). As células no interior da esfera formam junções com espaços, desse modo, permitindo pequenas moléculas e íons passarem entre elas. As células do embrião compactado se dividem para produzir uma mórula de 16 células. Essa mórula consiste de um pequeno grupo de células internas rodeadas por um grupo maior de células externas (Barlow et al.,1972). A maior parte dos descendentes das células externas se tornam células do trofoblasto (trofectoderma). Esse grupo de células não produz estruturas embrionárias. Ao invés disso, formam o tecido do cório, a parte embrionária da placenta. O cório permite ao feto conseguir oxigênio e nutrientes da mãe. Também secreta hormônios para que o útero da mãe retenha o feto e produza reguladores de resposta imune, fazendo com que a mãe não rejeite o embrião como faria com um órgão transplantado. No entanto, células do trofoblasto não são capazes de produzir células do próprio embrião. Elas são necessárias para implantar células do embrião na parede uterina (Figura 5.23). O embrião do camundongo é derivado dos descendentes das células internas do estágio de 16 células, suplementada por células divididas do trofoblasto durante a transição para o estágio de 32 células (Pedersen et al., 1986; Fleming, 1987). Essas células geram a massa celular interna que dará origem ao embrião, acompanhada da bolsa com vitelo, alantóide e âmnio. Essas células não aparentam ser somente diferentes das células do trofoblasto, mas também sintetizam proteínas diferentes nesse estágio do desenvolvimento precoce. Durante o estágio de 64 células, a massa celular interna (aproximadamente 13 células) e as células do trofoblasto se tornam camadas de células separadas, nenhuma delas contribuindo para células do outro grupo (Dyce et al., 1987; Fleming, 1987). Dessa forma, a distinção entre os blastômeros do trofoblasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desenvolvimento dos mamíferos. Inicialmente, a mórula não tem uma cavidade interna. No entanto, durante um processo chamado cavitação, a célula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da mórula para criar a blastocele. A massa celular interna fica posicionada de um lado do anel de células do trofoblasto (veja Figuras 5.20, 5.22 e 5.23). Essa estrutura é chamada blastocisto e é outro marco da clivagem de mamíferos.

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

183

(A) Estágio precoce de 8 células: não-polar, porém com efeitos de contato local

Figura 5.22

Compactação e formação do blastocisto de camundongo. (A,B) embrião de 8 células, (C) mórula de 16 células, (D) blastocisto de 32 células. O lado esquerdo representa o organismo inteiro ou sua visão em corte. O lado direito detalha as mudanças associadas com o amadurecimento do trofoblasto. (Figuras à direita segundo Fleming, 1992.)

(B) Compacto de 8 células: polar, correntes iônicas. Basolateral: adesão de E-caderina; junções de fendas, ZO-1. Microtúbulos acetilados. Apical: microvilosidades, actina cortical, endossomos, actina citoplasmática, microtúbulos Apical

Junções apertadas Lateral

Basal (C) 16 células: Adesão basolateral intensificada, laminina, cingulina, mitocôndria, vesículas lipídicas. Basal: lisossomos, Golgi Junções apertadas entre células exteriores

Junções de fendas entre células interiores

(D) 32 células: transporte vetorial de fluido. Basolateral: desmossomos. Basal: Na+, K+ - ATPase. Apical: transportadores e canais Microvilosidades

Massa celular interna (ICM) Blastocele

Trofoblasto

E-caderinaDesmossomos Direção da corrente iônica Na+, K+ - ATPase Junções de fendas Proteínas da membrana apical

Desmossomos Lisossomos secundários Golgi Filamentos de citoqueratina Microtúbulos e actina citoplasmática

Junções apertadas (ZO-1) (ZO-1) + cingulina Actina cortical Microvilosidades Mitocôndrias

184

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 5.23

Implantação de blastocistos de mamíferos no útero. (A) Blastocistos de camundongo entrando no útero. (B) Implantação inicial do blastocisto no útero de um macaco Rhesus. (A de Rugh, 1967; B cortesia da Carnegie Institution of Washington, Chester Reather, fotógrafo.)

(A)

(B)

Informações adicionais

&

Especulações

A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação

C

OMPACTAÇÃO CRIA AS circunstâncias que trazem á tona a primeira diferenciação no desenvolvimento de mamíferos: a separação do trofoblasto da massa celular interna. Como isso é feito? Existe uma crescente evidência que a compactação é realizada por intermédio de eventos que ocorrem na superfície das células dos blastômeros adjacentes. No primeiro estágio da compactação, cada um dos oito blastômeros interage com os seus vizinhos para sofrer polarização da membrana. Componentes diferentes da superfície das células migram para regiões diferentes da célula (veja Figura 5.22; Ziomek e Johnson, 1980). Isso pode ser observado, marcando certas moléculas da superfície celular com corantes fluorescentes. Uma dessas marcações, que reconhece a classe das glicoproteínas, mostra que no estágio de 4 células, essas glicoproteínas são aleatoriamente distribuídas por toda a membrana (Figura 5.24A). No entanto, na metade do estágio de 8 células, essas moléculas são encontradas predominantemente nos pólos mais distantes do centro do agregado (Figura 5.24B). A polarização da membrana é influenciada por interações célula a célula porque acontece somente quando a célula está em contato, no mínimo, com um outro blastômero. Se um blastômero for separado do resto do embrião perde sua polarização. Proteínas específicas da superfície celular cumprem o seu papel na compactação. Uma dessas moléculas, E-caderina (tam-

(A)

(B)

Figura 5.24

Polarização de componentes da membrana em blastômeros de camundongo durante o estágio de 8 células. (A) Distribuição homogênea, não-polar, de componentes da membrana marcados com concanavalina A fluorescente no estágio de 4 células. (B) Distribuição heterogênea, polar, desses componentes no estágio de 8 células. (A de Fleming et al., 1986; B de Levy et al., 1986. Fotografias cortesia dos autores.)

bém conhecida como uvomorulina), uma glicoproteína adesiva de 120-kDa, sintetizada no estágio de 2 células é distribuída uniformemente por toda a membrana celular. No entanto, com a ocorrência da compactação, a E-caderina se torna restrita aqueles sítios da membrana celular que estão em contato com os blastômeros adjacentes. Anticorpos para essa molécula causam a descompactação da mórula (Figura 5.25; Peyrieras et al., 1983; Johnson et al., 1986). A porção de carboidrato dessa glicoproteína pode ser essencial para o seu funcionamento, sendo a tunicamicina (droga que inibe a glicosilação das proteínas) também é capaz de prevenir a compactação. Experimentos recentes mostraram que a via do fosfatidilinositol também pode ser importante para inicializar a compactação. Se embriões de 4 células de camundongo forem colocados em um meio contendo drogas que ativam a proteína quinase C, ocorre compactação prematura. Similarmente diacilglicerídeos podem momentaneamente provocar a compactação de embriões de 4 células. Quando isso ocorre, a E-caderina acumula-se especificamente nas junções entre os blastômeros (Winkel et al., 1990). Esses resultados sugerem que a ativação da proteína quinase C pode iniciar a compactação mudando a localização da E-caderina. E finalmente, a membrana celular pode também ser modificada durante a compactação, por meio de reorganização do citoesqueleto. As microvilosidades, extendidas

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

185

por actino-filamentos, aparecem na superfície de células adjacentes, unindo uma célula à outra. Essas microvilosidades podem ser os sítios onde a E-caderina está funcionando para mediar adesão intercelular. O achatamento dos blastômeros um contra o outro pode, portanto, ter acontecido em virtude do encolhimento do blastômero através da despolimerização da actina (Pratt et al., 1982; Sutherland e Calarco-Gillam, 1983). Dessa maneira, existem evidências crescentes de que a compactação é causada por mudanças na arquitetura da superfície celular dos blastômeros. No entanto, não está totalmente certo como esses eventos se relacionam um com o outro, ou como são coordenados e integrados na cadeia de eventos que causa a compactação.

(A)

(B)

Figura 5.25

Prevenção da compactação por anti-soro contra a glicoproteína da superfície celular, E-caderina, promotora da adesão. (A) Compactação normal ocorrendo em ausência do anti-soro. (B) Proliferação sem compactação ocorrendo na presença de anticorpos contra a E-caderina. (Fotografias cortesia de C. Ziomek.)

Formação da massa celular interna O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamíferos é a criação da massa celular interna distinta do trofoblasto. Como a célula é direcionada para um ou outro desses caminhos? Como a célula é informada que dará origem a uma porção do mamífero adulto ou que dará origem a um singular tecido de sustentação que será descartado no nascimento? As observações de embriões vivos sugerem que essa importante decisão está meramente no fato de a célula estar no lugar certo na hora certa. Até o estágio de 8 células, não existem diferenças óbvias na bioquímica, morfologia ou potência de qualquer um dos blastômeros. No entanto, a compactação forma células internas ou externas com propriedades muito diferentes. Marcando os vários blastômeros, muitos investigadores descobriram que as células que estavam do lado de fora formariam o trofoblasto, enquanto que as células do lado de dentro formariam o embrião (Tarkowski e Wróblewska,1967; Sutherland et al.,1990).*Hillman e colegas (1972) mostraram que quando cada blastômero de um embrião de camundongo de 4 células é colocado na superfície externa de uma massa de blastômeros agregados, as células externas transplantadas somente darão origem ao tecido trofoblasto. Portanto, a opção da célula transformar-se em trofoblasto ou embrião depende se essa célula era externa ou interna após a compactação. Pelúcida Fuga da Zona Pelúcida Enquanto o embrião está se movendo através do oviduto, rumo ao útero, o blastocisto se expande dentro da zona pelúcida (a matriz extracelular do óvulo foi essencial para a ligação do espermatozóide durante a fertilização). As membranas celulares das células trofectodérmicas contêm uma bomba para o sódio (a Na+/K+-ATPase) de frente para a blastocele; as proteínas bombeiam sódio para a cavidade central. Essa acumulação de íons de sódio permite que a água entre por osmose, dessa maneira, dilatando a blastocele (veja Figura 5.22; Borland, 1977; Wiley, 1984). Durante esse período, é essencial que a zona pelúcida previna o blastocisto de aderir às paredes do oviduto. Quando tal aderência acontece em humanos, é chamada de ectópica ou

* As células internas mostraram virem mais freqüentemente da primeira célula a se dividir no estágio de 2 células. Essa célula normalmente produz o primeiro par de blastômeros a alcançar o estágio de 8 células, e essas células se dividem de tal modo que elas estão soltas dentro dos blastômeros agregados (Graham e Kelly, 1977).

186

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figure 5.26

Blastocisto de camundongo eclodindo da zona pelúcida. (Fotografia de Mark et al., 1985, cortesia de E. Lacy.)

gravidez tubária. Essa condição é especialmente grave, porque a implantação do embrião no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Quando o embrião alcança o útero, no entanto, ele deve “livrar-se” da zona pelúcida para que possa aderir à parede uterina. O blastocisto do camundongo se livra da zona pelúcida perfurando um pequeno buraco e se espremendo através dele enquanto se expande (Figura 5.26). Uma protease semelhante à tripsina, a estripsina, localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar da zona pelúcida (Perona e Wassarman, 1986; Yamazaki e Kato, 1989). Uma vez fora, o blastocisto pode fazer contato direto com o útero. O epitélio uterino “agarra” o blastocisto em uma matriz extracelular contendo colágeno, laminina, fibronectina, ácido hialurônico e receptores heparan sulfato. As células do trofoblasto contêm os elementos que irão se juntar ao colágeno uterino, fibronectina e laminina; eles sintetizam o proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior à implantação (veja Carson etal., 1983). Uma vez na célula epitelial uterina, o trofoblasto secreta outro conjunto de proteases, incluindo colagenase, estromelisina e ativador de plasminogênio. Essas enzimas digestoras de proteínas digerem a matriz extracelular do tecido uterino, impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina (Strikland et al., 1976; Brenner et al.,1989).

Informações adicionais

&

Especulações

Gêmeos e células embrionárias precursoras

A

S CÉLULAS PRECOCES do embrião podem substituir uma à outra e compensar uma célula ausente. Isso foi primeiramente demonstrado em 1952, quando Seidel destruiu uma célula de um embrião de coelho e demonstrou que a célula remanescente poderia produzir o embrião por inteiro. Uma vez que a massa celular interna (ICM) se separou do trofoblasto, as células da ICM constituem um “grupo de equivalência” onde cada célula da ICM tem a mesma potência (nesse caso, cada célula pode originar todos os tipos de células do embrião, menos o trofoblasto), e seus respectivos destinos serão determinados por interações entre os seus descendentes. Gardiner e Rossant (1976) também mostraram que se as células da massa celular interna (mas não células do trofoblasto) são injetadas no blastocisto, também contribuem para um novo embrião. Já que seus blastômeros podem gerar qualquer tipo de célula no corpo, a massa celular interna tem sido referida, às vezes, como pluriblasto (Johnson e Selwood, 1996).

Gêmeos humanos são classificados em dois grandes grupos: gêmeos monozigóticos (um ovo ou idênticos) e gêmeos dizigóticos (dois ovos ou fraternos). Gêmeos fraternos são o resultado de dois eventos separados de fertilização, ao passo que, gêmeos idênticos são formados de um único embrião cujas células, de alguma forma, dissociam uma da outra. Gêmeos idênticos são provavelmente produzidos pela separação de blastômeros precoces ou mesmo pela separação da massa celular interna em duas regiões no mesmo blastocisto. [cleave3.html] Casos de gêmeos idênticos ocorrem em aproximadamente 25% dos nascimentos humanos. Cerca de 33 % dos gêmeos idênticos têm dois córios completos e separados, indicando que a separação ocorreu antes da formação do tecido trofoblasto, no quinto dia (Figura 5.27A). O restante dos gêmeos idênticos compartilham do mesmo cório, sugerindo que a separação ocorreu dentro da massa celular interna, após a formação do trofoblasto. No nono dia, o embrião humano já completou a construção de uma outra camada extra-embrio-

nária, o âmnio. Esse tecido forma a bolsa amniótica (ou bolsa de água), envolvendo o embrião com fluido amniótico, protegendo-o da dessecação e movimentos bruscos (veja Capítulo 6). Se a separação do embrião acontecesse após a formação do cório, no quinto dia, mas antes da formação do âmnio, no nono dia, os embriões resultantes deveriam ter um cório e dois âmnios (Figura 5.27B). Isso acontece em aproximadamente dois terços dos casos de gêmeos humanos idênticos. Uma pequena porcentagem de gêmeos idênticos nascem com um único cório e âmnio (Figura 5.27C). Isso significa que a divisão do embrião aconteceu após o nono dia, e tais recémnascidos correm o risco de serem gêmeos ligados (“Siameses”). [cleave4.html] A habilidade de produzir um embrião completo, a partir de células que normalmente iriam produzir somente uma porção, é chamada de regulação e é discutida no Capítulo 15. Regulação é também vista na habilidade que dois ou mais embriões precoces têm para formar um camundongo quimérico ao invés de gêmeos, trigêmeos ou um monstro de múltiplas cabeças. Camun-

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

187

Embrião

Saco vitelínico Âmnio

2 Córios

(A)

2 Âmnios Massa celular interna 1 Cório

(B)

Embrião bicelular Blastocele

2 Âmnios

1 Cório

(C)

1 Âmnio Cório

Figura 5.27

Diagrama mostrando a relação entre a formação de gêmeos monozigóticos humanos e as membranas extra-embrionárias. (A) A cisão ocorre antes da formação da trofectoderma, de modo que cada gêmeo tem o seu próprio cório e âmnio. (B) A cisão ocorre após a formação da trofectoderma, porém, antes da formação do âmnio, resultando em gêmeos que têm sacos amnióticos individuais, porém, compartilhando um cório. (C) Cisão após a formação do âmnio conduz a gêmeos em um saco amniótico, e um único cório. (Segundo Langman, 1981.)

dongos quiméricos são o resultado de duas ou mais clivagens precoces (normalmente 4- ou 8-células) de embriões que foram agregados artificialmente para formar um embrião composto. Como é mostrado na Figura 5.28A, as zonas pelúcidas de dois embriões geneticamente diferentes são removidas e os embriões são unidos para formar um blastocisto em comum. Esses blastocistos preparados são implantados no útero da mãe adotiva. Quando nascem, os descendentes quiméricos têm algumas células de cada embrião. Isso é prontamente observado quando os blastômeros agregados vêm de uma linhagem que difere na cor da pelugem. Quando blastômeros de linhagem preta e branca são agregados o resultado é normalmente um camundongo malhado (Figura 5.28B). Existe até evidência que embriões

humanos podem formar quimeras (de la Chappelle et al.,1974; Mayr et al.,1979). Esses indivíduos têm dois tipos de células diferentes (XX e XY) dentro do mesmo corpo, cada uma com o seu conjunto de características genéticas. A explicação mais simples para tal fenômeno é que esses indivíduos resultaram da agregação de dois embriões, um macho e outro fêmea, que estavam se desenvolvendo ao mesmo tempo. Se essa explicação estiver correta, então dois gêmeos fraternos se fundem para criar um único indivíduo composto. Markert e Petters (1978) mostraram que embriões precoces de 8-células podem se unir para formar uma mórula compactada comum (Figura 5.29) e que o camundongo resultante pode ter a cor da pelugem de três linhagens diferentes (prancha 21).

Além disso, eles mostraram que cada um dos três embriões deram origem a precursores dos gametas. Quando um quimérico (preto/marrom/branco) fêmea de camundongo acasalava com um macho de pelugem de cor branca (recessivo), a ninhada era um de cada cor. De acordo com nossas observações sobre formação de gêmeos e camundongos quiméricos, cada blastômero da massa celular interna deve ser capaz de produzir qualquer célula do corpo. Essa hipótese tem sido confirmada, e terá importantes conseqüências no estudo do desenvolvimento dos mamíferos. Quando as massas celulares internas são isoladas e crescem sob certas condições, permanecem indiferentes e continuam a se dividir em cultura (Evans e Kaufman,

188

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

Figura 5.28

Pronase

Zona pelúcida

Blastômeros

Produção de camundongos quiméricos. (A) Procedimento experimental para a produção de camundongos quiméricos. Embriões de camundongos geneticamente distintos (aqui aqueles com diferentes cores do pêlo) no início do estágio de 8 células são isolados dos ovidutos dos camundongos e reunidos após remoção de suas zonas pelúcidas por ação de enzimas proteolíticas. As células formam um blastocisto composto, que é implantado no útero de uma mãe de criação. (B) Um camundongo adulto quimérico mostrando contribuições dos embriões pigmentados (pretos) e não-pigmentados (brancos). (Fotografia cortesia de B. Mintz.)

(A)

Blastocisto Blastocistos implantados na mãe de criação

1981; Martin, 1981). Essas células são chamadas de células-tronco embrionárias (células ES). Como foi mostrado no capítulo 2, essas células podem ser alteradas na placa de Petri. Genes clonados podem ser inseridos dentro de seu núcleo, ou genes existentes podem ser mutados. Quando essas células ES são injetadas nos blastocistos de um outro gene de camundongo, elas podem integrar a sua massa celular interna hospedeira. O embrião resultante tem células vindas de ambos tecidos, hospedeiro e doador. Essa técnica se tornou extremamente importante para determinar a função dos genes durante o desenvolvimento de mamífero.

(B)

(B) (C )

Figura 5.29
Agregação e compactação de três embriões de camundongo, no estágio de 8 células, para formar um única mórula compactada. Células de três diferentes embriões (A) são agregadas para formar uma mórula (B) que sofre compactação para formar um blastocisto único (C). O camundongo quimérico resultante é mostrado na Prancha 21. (de Markert e Petters, 1978, cortesia de C. Markert.)

Clivagem Meroblástica
Como já foi mencionado anteriormente, concentrações de vitelo cumprem um papel importante na clivagem celular. Em parte alguma isso está tão aparente como nos tipos de clivagem meroblástica. Aqui, as grandes concentrações de vitelo proíbem a clivagem no seu todo, exceto em uma pequena porção do citoplasma do ovo. Na clivagem

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

189

discoidal, a divisão celular é limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no topo de um monte formado por vitelo. Na clivagem superficial, o vitelo centralizado permite a clivagem somente na borda periférica do ovo. Clivagem discoidal Clivagem discoidal é uma característica de aves, peixes e répteis.
AVES. A Figura 5.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. A massa do oócito é
Sulcos de clivagem

tomada pelo vitelo, permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco, uma região de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de diâmetro no pólo animal do ovo. Porque essas clivagens não se estendem para o vitelo citoplasmático, as células da clivagem precoce são, na realidade, contínuas nas suas bases. O primeiro sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco, e outras clivagens se seguem para criar um blastoderma de camada única. Num primeiro instante, essa camada celular está incompleta, já que as células permanecem contínuas ao vitelo subjacente. Daí por diante, clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um tecido de cinco a seis camadas celulares. Essas células permanecem ligadas com junções apertadas (Bellairs et al.,1975; Eyal-Giladi, 1991). Entre o blastoderma e o vitelo existe um espaço chamado cavidade subgerminal, criado quando uma célula blastodérmica absorve fluido da albumina (“branco do ovo”) e secreta-o entre si e o vitelo (New, 1956). Nesse estágio, as células mais profundas do centro do blastoderma são descartadas para criar uma zona pelúcida unicelular (as células descartadas parecem morrer). O anel periférico das células blastodérmicas que não são descartadas constituem a zona opaca. Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo, o blastoderma já contém 60.000 células. Algumas dessas células são delaminadas em cavidades subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5.31). Dessa maneira, logo após a galinha ter botado o ovo, esse contém duas camadas de células: a superior epiblasto e a inferior hipoblasto. Entre elas está a blastocele. Detalharemos a formação do hipoblasto no próximo capítulo.
PEIXES. Nos últimos anos, o peixe zebra, Danio rerio, se tornou o organismo favorito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Esses peixes têm grandes crias, procriam o ano inteiro, são facilmente mantidos, têm embrião transparente que se desenvolve fora da mãe (uma característica importante para a microscopia), e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. Ademais, eles se desenvolvem rapidamente, para que 24 horas após a fertilização, o embrião já tenha formado a maior parte de seus tecidos e órgãos primordiais, apresentando como característica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nüsslein-Volhard, 1996; Langeland e Kimmel, 1997). Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves, com a divisão celular ocorrendo somente no blastodisco do pólo animal. Observações da clivagem de ovos de peixe através de micrografia ao microscópio eletrônico

Blastoderma

Figura 5.30

Clivagem discoidal em um ovo de galinha, vista do pólo animal. Os sulcos de clivagem não penetram no vitelo, e é produzido um blastoderma formado por uma única camada de células.

Figura 5.31

Formação de um embrião do pinto com duas camadas. Essa seção sagital próxima à margem posterior, mostra uma camada superior consistindo de um epiblasto central que irá entrar nas células da foice de Koller (ks) e na zona marginal posterior (mz). Certas células do epiblasto caem (delaminam) da camada superior para formar ilhas de polinvaginação (pi) com 5 a 20 células cada. Essas células serão acrescidas por aquelas células hipoblásticas (hyp) que migraram anteriormente da foice de Koller para formar a camada inferior (hipoblástica). (Sc é a cavidade subgerminal; gwm é a margem da parede germinal). (de Eyal-Giladi et al., 1992, cortesia de H. Eyal-Giladi.)

190

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 5.32

Clivagem discoidal em um peixe-zebra, criando uma região celular acima do vitelo denso. Em (A), BD significa a região do blastodisco. (de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores.)

(E)

(F)

de varredura mostram, de uma bela maneira, a natureza incompleta da clivagem discoidal (Figura 5.32). Como nos embriões de anfíbios e de ouriços-do-mar, divisões com clivagens precoce seguem um padrão altamente reprodutível de clivagem meridional e equatorial. Essas divisões são rápidas, com periodicidade de aproximadamente 15 minutos cada. As primeiras 12 divisões ocorrem sincronicamente, formando um monte celular situado no pólo animal de uma grande célula de vitelo. Inicialmente, todas as células mantêm conexões abertas umas com as outras e com a célula de vitelo subjacente para que células de tamanho moderado (17-kDa) passem livremente de um blastômero ao outro (Kimmel e Law, 1985). Começando por volta da décima divisão, pode ser detectado o início da transição da blástula intermediária: começa a transcrição do gene zigótico, desaceleração das divisões celulares e o movimento celular é evidente (Kane e Kimmel, 1993). Neste ponto, duas populações de células podem ser distinguidas. A primeira é a camada de vitelo sincicial (YSL). A YSL é formada no nono ou décimo ciclo, quando as células da parte vegetal do blastoderma se fundem com a célula do vitelo adjacente. Isso produz um anel de núcleos com essa parte do citoplasma da célula do vitelo localizado bem embaixo do blastoderma. Expandindo vegetalmente, o blastoderma envolve a célula do vitelo, parte do vitelo sincicial se moverá para baixo do blastoderma, para formar a YSL interna e parte dos núcleos se moverá vegetalmente, ficando à frente da margem do blastoderma, para formar a YSL externa (Figura 5.33A,B). A função da YSL ainda não foi esclarecida. A segunda população celular distinguida na transição da blástula intermediária é a camada envolvente (EVL; veja Figura 5.33A). Essas são as células mais superficiais do

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

191

(A) Blastoderma Camada envolvente (EVL) Células profundas

(B)

YSL interna Núcleos sinciciais do vitelo YSL externa Microtúbulos

Célula do vitelo

Figura 5.33
(C) Pólo animal Nariz, olho Epiderme Crista neural Ventral Somito do músculo Prônefron Intestino Cérebro Medula espinhal Mesoderma Cabeça Dorsal
Notocorda Sangue Nadadeiras Coração Músculo

Ectoderma

Faringe Fígado Margem do blastoderma Célula do vitelo

Endoderma

A blástula do peixe–zebra. (A) antes da gastrulação, células profundas estão rodeadas pelo EVL. A superfície animal do vitelo é achatada e contém os núcleos do YSL. Microtúbulos se estendem através do citoplasma vitelínico e da região externa do YSL. (B) Estágio tardio de blástula, mostrando a YSL. Os núcleos dessas células são derivados de células da margem do blastoderma, que liberou seus núcleos para o citoplasma vitelínico. (C) Mapa do destino das células profundas depois que a mistura de células cessou. A vista lateral é mostrada, e não todos os destinos dos órgãos estão identificados (para clareza). O mapa é gerado injetando células com corante de alto peso molecular, determinando em seguida, quais órgãos as células carregadas de corante geraram. (A e C segundo Langeland e Kimmel, 1996; B de Trinkaus, 1993, cortesia do autor.)

Pólo vegetal

blastoderma, e a EVL é uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada de células. A EVL finalmente forma a periderme, uma proteção extra-embrionária cobrindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento. Entre a EVL externa e a YSL interna estão as células profundas, das quais surgirá o embrião propriamente dito. Os destinos das células blastodérmicas precoces não estão determinados, e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente não difusível é injetado em uma das células e os descendentes daquela célula podem ser seguidos) mostram que existe muita mistura de células durante a clivagem. Além do mais, qualquer célula pode dar origem a uma variedade imprevisível de descendentes de tecido (Kimmel e Warga, 1987; Helde et al., 1994). O destino da célula blastodérmica parece ser fixado pouco antes do começo da gastrulação. Nesse período, células em regiões específicas do embrião originam certos tecidos de uma maneira altamente previsível, permitindo que um mapa do destino possa ser traçado (Figura 5.33C; Kimmel et al., 1990). O processo pelo qual a célula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressiva de possíveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada célula. Esse comportamento pode ser observado em algumas das primeiras células a terem seu destino estabelecido - as células precursoras do coração (Stainer et al., 1993; Lee et al., 1994).

192

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 5.34

(A)

(B)

Mapa do destino das células profundas da blástula do peixe-zebra. Injeção de um único blastômero na blástula precoce (estágio de 256-512 células) com rodamino-dextrano. Se a célula estiver perto da margem, a meio caminho entre os pólos dorsal e ventral, a progênie da célula está restrita a formar parte do coração. Nesse estágio, as células marcadas formam descendentes que podem popular tanto a aurícula como o ventrículo. Se a injeção em tais células for feita em um estágio mais tardio da blástula, seus descendentes irão popular uma câmara somente. (Segundo Stainier et al., 1993.)

Ventral

Dorsal

Célula do vitelo

Saco vitelínico

Figura 5.35

Células individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfícies dorsal e ventral de um embrião em estágio de meia clivagem, podem dar origem às células que povoam ambos, o endocárdio e o miocárdio (Figura 5.34A,B). Um pouco mais tarde, os descendentes de qualquer célula podem povoar somente o miocárdio ou o endocárdio. Mais tarde ainda, os descendentes de uma célula somente serão capazes de povoar subcompartimentos específicos de tecido. Por exemplo, células da blástula intermediária podem contribuir para a progênie de ambos, átrio e ventrículo do coração. Clivagem Superficial A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial, onde uma grande quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmática do ovo. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem é que as células não se formam até que os núcleos tenham se dividido. A clivagem de um ovo de inseto é mostrada na Figura 5.35. O núcleo do zigoto sofre várias divisões mitóticas dentro da parte central do ovo. Na Drosophila, 256 núcleos são produzidos por uma série de divisões nucleares durando, em média, 8 minutos cada. Depois o núcleo migra para a periferia do ovo, onde as mitoses continuam, embora com uma velocidade diminuída. O em-

Clivagem superficial em embrião de Drosophila. O numeral acima de cada embrião corresponde ao número de minutos decorrido após a deposição do ovo; o numeral abaixo de cada embrião indica o número de núcleos presentes. Células polares (que formarão as células germinativas) são vistas no estágio de 512 núcleos, embora o blastoderma celular se forme 3 horas mais tarde. Os tempos são representativos, já que a duração de cada ciclo de divisão depende, em parte, da temperatura em que o ovo está sendo incubado.

Núcleos (enérgides)

Enérgides migram para a periferia

Células polares

Blastoderma celular

Células polares

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

193

brião é chamado agora de blastoderma sincicial, significando que todas clivagens nucleares estão contidas em um único citoplasma. Nenhuma membrana celular existe a não ser a do próprio ovo. Aqueles núcleos migrando para o pólo posterior do ovo logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o pólo de células do embrião. Essas células dão origem às células germinativas dos adultos. Dessa maneira, um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos é a separação das futuras células germinativas do resto do embrião. Após as células polares terem sido formadas, a membrana do oócito dobra-se para dentro, entre os núcleos, conseqüentemente, separando cada núcleo somático para uma única célula (Figura 5.36). Isso forma o blastoderma celular, com todas as células arranjadas como uma cobertura de camada única envolvendo o núcleo do ovo. Como qualquer outra formação celular, a criação do blastoderma celular envolve uma interação delicada entre microtúbulos e microfilamentos. A primeira fase da celularização do blastoderma é caracterizada pela invaginação das membranas celulares e sua rede de actina subjacente nas regiões entre o núcleo. Esse processo é inibido por drogas que bloqueiam os microtúbulos. Após as membranas e sua actina terem passado o nível do núcleo, a segunda fase da celularização ocorre. Aqui a velocidade da invaginação aumenta, e o complexo de actino-membranas começa a apertar o que será o terminal basal da célula (Schejter e Wieschaus, 1993; Foe et al., 1994). Na Drosophila, essa camada é composta por aproximadamente 6000 células e é formada 4 horas após a fertilização. [cleave5.html] Embora os núcleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum, isso não significa que o citoplasma seja uniforme. Karr e Alberts (1986) mostraram que cada núcleo dentro do blastoderma sincicial está contido dentro de seu próprio pequeno território de proteínas citoesqueléticas. Quando o núcleo alcança a periferia durante o décimo ciclo da clivagem, cada núcleo fica cercado por microtúbulos e

Superfície do ovo

Fuso mitótico Sulco de clivagem Áster Núcleo

Canal do sulco Microtúbulos

Figura 5.36

Membrana vitelínica

Alongamento nuclear e celularização do blastoderma de Drosophila. (Segundo Fullilove e Jacobson, 1971.)

194

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

Prófase 12

Núcleos

Microfilamentos

Microtúbulos

Figura 5.37

Localização do citoesqueleto em volta de núcleos no blastoderma sincicial de Drosophila. Um embrião de Drosophila entrando na prófase da décima-segunda divisão mitótica, foi secionado e corado triplamente. (A) Os núcleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. (B) Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. (C) Microtúbulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. Domínios do citoesqueleto podem ser vistos em volta de cada núcleo. (de Karr e Alberts, 1986, cortesias de T. L. Karr.)

microfilamentos. O núcleo e suas ilhas citoplasmáticas associadas são chamados enérgides. A Figura 5.37 mostra o núcleo e seu microfilamento essencial e os domínios do microtúbulo na prófase da décima segunda divisão mitótica. Após o núcleo alcançar a periferia, o tempo necessário para completar cada uma das próximas quatro divisões se torna gradualmente maior. Enquanto os ciclos de 1 a 10 duram 8 minutos cada, o ciclo 13, o último ciclo no blastoderma sincicial, leva 25 minutos para se completar. O embrião de Drosophila forma células no ciclo 14 (i.e. após 13 divisões), e o ciclo 14 é assincrônico. Alguns grupos de células completam esse ciclo em 75 minutos, enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe, 1989). A transcrição desses núcleos (que começa por volta do décimo primeiro ciclo) é muito intensificada. A desaceleração da divisão celular da Drosophila e o aumento concomitante na transcrição do RNA é freqüentemente referido como transição da blástula intermediária (midblastula transition). Tais transições também são vistas nos embriões de inúmeros vertebrados e de filos invertebrados. O controle dessa desaceleração mitótica (em embriões de Xenopus, ouriço-do-mar, estrela-do-mar e Drosophila) aparenta sofrer efeito da razão da cromatina para o citoplasma (Newport e Kirshner, 1982a; Edgard et al., 1986). Edgard e seus colegas compararam o desenvolvimento inicial de embriões de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante haplóide. Os embriões haplóides de Drosophila têm a metade da cromatina a cada divisão celular, em comparação com os do tipo selvagem. Daqui para frente, um embrião haplóide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto um embrião do tipo selvagem no sétimo ciclo. Esses investigadores descobriram que enquanto embriões do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente após a décima terceira divisão, os embriões haplóides passaram por uma divisão extra, a décima quarta, antes da celularização. Além do mais, a duração dos ciclos 11 a 14 em embriões do tipo selvagem, corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embriões haplóides. Dessa maneira, os embriões haplóides seguem um padrão similar aos embriões do tipo selvagem, porém, com defasagem de uma divisão celular. Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplóides terem uma razão de cromatina para o citoplasma de metade, em relação a do tipo selvagem, em um determinado ciclo, então seria possível acelerar a celularização amarrando (ligando) algum citoplasma, fazendo com que os núcleos se dividam em um volume menor. Quando essa ligação foi realizada, o padrão mitótico do embrião foi acelerado. A divisão final do blastoderma, sinalizando o fim do período de clivagem,

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade é alcançada quando existe um núcleo para cada 61 µm3 de citoplasma. Em Xenopus, uma desaceleração similar na taxa mitótica é observada após a décima segunda divisão celular. Aqui também, as divisões daqui para frente se tornam assincrônicas. Experimentos de ligação sugerem que o tempo de duração da transição dessa blástula intermediária também é função da razão volumes cromatina/ citoplasma (Newport e Kirschner, 1982a,b). Em ambos, Drosophila e Xenopus, a iniciação da transcrição pode ser induzida prematuramente aumentando artificialmente a duração do ciclo celular. Quando cicloheximida (um inibidor da síntese protéica) atrasa a divisão celular, a transição da blástula intermediária é induzida precocemente em Xenopus, e uma explosão de transcrições ocorre em Drosophila (Edgard et al., 1986; Kimelman et al., 1987).

195

Informações adicionais

&

Especulações

Exceções, Generalizações, e Clivagem Parasítica da Vespa

O

QUE CONSIDERAMOS “normal” e o que marginalizamos como “exceções”, freqüentemente reflete quais animais são mais acessíveis para o estudo e mais facilmente domesticados para o laboratório. Não é necessário dizer, que isso não reflete necessariamente as condições do mundo natural. Pelo contrário, nossas discussões de desenvolvimento animal são freqüentemente dificultadas por certos organismos em particular. O desenvolvimento de anfíbios é geralmente representado pelo Xenopus laevis, e o camundongo e o homem são os únicos mamíferos cujos desenvolvimentos são usualmente estudados. Similarmente, embora haja mais de 800.000 espécies de insetos conhecidas, a maior parte dos biologistas do desen-

volvimento conhecem apenas o desenvolvimento de uma espécie: Drosophila melanogaster. A Drosophila ganhou proeminência somente depois que se fez necessário relacionar fenômenos embriológicos com genes particulares. Em 1941, o maior compêndio do desenvolvimento de insetos (Embriologia dos insetos e Miriápodes, Johannsen e Butt) sequer mencionava essa espécie em seu índice. Insetos são um excepcionalmente bemsucedido e espalhado subfilo, não sendo surpreendente encontrar uma grande variabilidade no seu desenvolvimento. O desenvolvimento da vespa parasita Copidosomopsis tanytmemus difere marcadamente daquele da Drosophila canônica. Como muitas outras espécies parasitárias, a fêmea C. tanytmemus deposita seu ovo den-

tro do ovo de uma outra espécie. Com o desenvolvimento do ovo hospedeiro (normalmente de uma mariposa), o mesmo acontece com o ovo do parasita. No entanto, enquanto o ovo do hospedeiro começa o seu desenvolvimento no padrão superficial usual, o ovo da vespa divide holoblasticamente. Ademais, ao invés de diferenciar o eixo do corpo, as células do embrião parasita dividem-se repetidamente para se tornar uma massa de células não diferenciadas chamadas poligerme. Em duas semanas, a poligerme em crescimento fica suspensa no hospedeiro, permanecendo frouxamente atada ao cérebro e traquéia larvais (Figura 5.38A; Cruz, 1986a).
Figura 5.38

Olho/cabeça da lagarta hospedeira

Desenvolvimento de vespas parasitárias (Encyrtidae). (A) Clivagem holoblástica do ovo de Copidosomopsis tanytmenus produz uma poligerme de células não-diferenciadas. (B) Larvas precoces de um gênero relacionado, Pentalitomastix, atacam a larva de Trathala dentro do mesmo hospedeiro. A fotografia é de um hospedeiro recémaberto. (A segundo Cruz, 1986a; B de Cruz, 1981, cortesia de Y. Cruz.)

Mórula de 4 dias Ovo (A) Poligerme precoce

Esôfago Corpo gorduroso do hospedeiro

Poligerme

(B) Poligerme em expansão

196

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Com o crescimento, a poligerme se divide em dúzias (às vezes milhares, dependendo da espécie) de discretos grupos de células. Cada um desses grupos se torna um embrião! A vespa poliembrionária Copidosoma floridanum produz até 2000 indivíduos de um único ovo fertilizado (Grbic et al., 1996). Essa habilidade que um ovo tem para se transformar em uma massa de células, que rotineiramente forma numerosos embriões, é chamada de poliembrionia. (Poliembrionia é característica de certos grupos de insetos e certas espécies de mamíferos, tais como o tatu de nove bandas, cujos ovos formam quádruplos idênticos.) A maior parte desses embriões de vespa parasita se desenvolvem em larvas normais que levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver. Um grupo menor, de cerca de 10 porcento do número total de embriões, se tornam larvas precoces (Figura 5.38B), que se desenvolvem em uma semana. Elas não só se desenvolvem precocemente, como têm muito pouca estrutura e não sofrem metamorfose. São essencialmente um conjunto de mandíbulas móveis. Essas larvas não se

reproduzem, morrendo assim que as larvas normais se formam. Enquanto elas vivem, no entanto, vão até o embrião hospedeiro matando as larvas parasitas de outros indivíduos (de espécies diferentes e de outros clones da mesma espécie). Em outras palavras, as larvas precoces são formas predatórias que eliminam possíveis competidores (Cruz, 1981, 1986b; Grbic and Strand, 1992). Com a morte das larvas precoces (e suas presas), a larva normal emerge da sua primeira mudança de pele, começa a se alimentar vorazmente dos órgãos da larva hospedeira. Em 40 dias, a criação parasita já se alimentou dos músculos do hospedeiro, gordura corporal, gônadas, glândulas de seda, intestinos, cordões nervoso e hemolinfa, e o hospedeiro é um pouco mais do que um saco de pele segurando cerca de 70 larvas pupantes de vespa. Após outros 5 ou 6 dias, os novos adultos perfuram o tegumento do hospedeiro e, em uma cena recordando o filme Alien, provocam a abertura e a saída do hospedeiro, literalmente por comer o seu corpo. Esses adultos freqüentemente co-

pulam (a maioria das vezes sobre o corpo do hospedeiro morto), acham um novo hospedeiro para depositar os seus ovos e morrem logo em seguida. Tal ciclo de vida incomodava Charles Darwin, fazendo-o questionar o conceito de uma divindade benigna conhecida por todos. Em 1860 ele escreveu ao biologista americano Asa Gray: “Eu não consigo me convencer de que o benevolente e onipotente Deus tenha planejado e criado a Ichneumonidae com a expressa intenção delas se alimentarem dentro dos corpos vivos de lagartas”. No entanto, além de sua utilidade de provocar noções de desconforto no que se refere a ordem natural e natureza da “individualidade”, as vespas parasitas podem ter conseqüências econômicas importantes. Macrocentrus grandii é uma vespa poliembrionária que parasita a broca Européia do milho. A habilidade de um inseto se formar de um embrião por clivagem holoblástica, deve também nos encorajar a apreciar a plasticidade da natureza, desencorajando generalizações precipitadas sobre um completo subfilo de organismos.

I MECANISMO

DE

CLIVAGEM

Regulando o ciclo da clivagem
O ciclo celular das células somáticas é funcionalmente dividido em quatro estágios (Figura 5.39A). Após a mitose (M), temos o intervalo da pré-replicação (G1), em seguida acontecendo a síntese do DNA (S). Após o período da síntese, temos o intervalo pré-mitótico (G2), seguido pela mitose. A progressão dessas fases é regulada por fatores de crescimento. Em blastômeros de clivagem precoce, no entanto, a divisão celular pode ser muito simples. Blastômeros precoces de ouriço-do-mar não têm G1 replicando o seu DNA durante a última parte (telófase) da mitose prévia (Hinegardner et al., 1964). Os núcleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 durante a clivagem precoce. (Embriões de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular, algum tempo após a décima segunda clivagem. Drosophila adiciona G2 durante o ciclo 14 e G1 durante o ciclo 17.) Nas primeiras 12 divisões, Xenopus divide-se sincronicamente em um ciclo celular bifásico: S para M e M para S (Figura 5.39B; Laskey et al., 1977; Newport e Kirschner, 1982a). Os fatores que regulam esse ciclo bifásico estão localizados no citoplasma. Oócitos normais de Xenopus, quando aumentam, são detidos na primeira prófase meiótica. São incapazes de se dividirem. Se os núcleos de células divididas forem transplantados para esses oócitos, também param a divisão. Quando oócitos normais são estimulados por progesterona, retomam sua divisão meiótica e param na metáfase da segunda meiose. Se o núcleo de células não divididas (como neurônios) são colocados no citoplasma de oócitos tratados com progesterona, também iniciam a divisão e param

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

197

(A)
Ciclina B

(B)

Ciclina D Ciclina A

Ciclina E Ciclina A

Figura 5.39

Ciclos celulares de células somáticas e blastômeros precoces. (A) Ciclo celular de uma célula somática típica. A Mitose (M) é seguida por uma condição de “interfase”. Esse último período é subdividido em fases G1, S (síntese) e G2. Células que estão se diferenciando são geralmente “removidas” do ciclo celular e estão numa fase G1 estendida chamada G0. As ciclinas e suas respectivas quinases, responsáveis para progressão através do ciclo celular, são mostradas no seu ponto de regulação do ciclo celular. (B) Ciclo celular bifásico mais simples dos blastômeros precoces de anfíbios, tendo somente dois estados, S e M. (A segundo Nigg, 1995.)

na metáfase (Gurdon, 1968). O citoplasma de oócitos estimulados com progesterona ainda passam por contrações corticais periódicas (característica da divisão), mesmo na ausência de núcleos ou centríolos. Se fragmentos clonados de DNA são injetados nesses embriões anucleados, sua replicação sofre o controle desse ciclo (Hara et al., 1980; Harland e Laskey, 1980; Karsentiket al.,1984). Dessa maneira, a capacidade de divisão celular é regulada pelo citoplasma. Fator promotor de maturação Alguns dos fatores que governam a síntese do DNA e a divisão celular foram identificados. O fator induzido por progesterona que permite o núcleo do oócito retomar suas divisões é uma fosfoproteína de duas subunidades chamada de fator de promoção da maturação (MPF, também conhecida como fator promotor da mitose. O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsável pela retomada das divisões celulares meióticas no ovo ovulado de rã (Smith e Ecker, 1969; Masui e Markert, 1971). Esse mesmo fator continua realizando o seu papel após a fertilização, regulando o ciclo bifásico dos blastômeros precoces de Xenopus. Gerhart e colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanças cíclicas nos níveis de atividade nas células mitóticas. A atividade do MPF de blastômeros precoces de rãs é maior durante M e não detectável durante S. Durante essa fase S, o MPF existe em estado inativo. Essa ciclicidade também é observada em blastômeros anucleados. Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicação do DNA (S) e mitose (M) são dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF, mesmo na ausência de síntese protéica. As células em clivagem pode ficar presas na fase S, incubando-as com um inibidor de síntese protéica. Quando o MPF é microinjetado nessas células, elas entram em M. Seus envoltórios nucleares se partem e suas cromatinas condensam-se em cromossomos. Após uma hora, o MPF é degradado e os cromossomos retornam à fase S.

198

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Informações adicionais

&

Especulações

MPF e Seus Reguladores
A pequena subunidade do MPF: A cdc2 Quinase (QuinaseCiclina-dependente, CDK)
MPF tem uma subunidade grande e outra pequena. A pequena subunidade de MPF é uma proteína quinase que, quando ativada, pode fosforilar uma variedade de proteínas. Dessa forma, MPF funciona adicionando grupos fosfatos às proteínas específicas. Um desses alvos é a histona H1, que se liga ao DNA. A fosforilação dessa proteína pode levar à condensação cromossômica. Outro alvo é o envoltório nuclear. Quinze minutos após a adição do MPF, as três proteínas principais (as lâminas) do envoltório nuclear se tornam hiperfosforiladas, e nos próximos 15 minutos, o envoltório se despolimerizou e está se desfazendo (Miake-Lye e Kirschner, 1985; Arion et al., 1988). A MPF quinase purificada já foi mostrada fosforilar esses envoltórios nucleares de proteínas, e realizar sua despolimerização in vitro (Peter et al., 1990; Ward e Kirschner, 1990). Um terceiro alvo parece ser a RNA polimerase (Cisek e Corden, 1989), e a fosforilação da RNA polimerase pode ser a responsável pela inibição da transcrição durante a mitose. Um quarto alvo da quinase parece ser a subunidade reguladora de miosina citoplasmática. Quando essa proteína é fosforilada, ela se torna inativa e incapaz de funcionar como uma ATPase dirigindo os filamentos de actina envolvidos na divisão celular (Satterwhite et al., 1992). A inibição dessa miosina durante os estágios iniciais da mitose, pode prevenir divisões da célula até depois dos cromossomos terem-se separado. A pequena subunidade de MPF tem sido notavelmente conservada através da evolução e é quase idêntica àquela da fosfoproteína indutora de mitose, p34, sintetizada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988). De fato, o gene humano que codifica a proteína correspondente à pequena subunidade do MPF de Xenopus pode ser inserido no genoma da levedura e causar divisão nos mutantes de levedura deficientes em cdc2 (Lee e Nurse, 1987). A proteína p34 pode existir em formas fosforiladas e desfosforilada. A forma ativa parece ser fosforilada

Figura 5.40 O desenvolvimento da regulação do ciclo celular na embriogênese de Drosophila.

(A) Ciclina e proteína cdc25 (cordão) são abundantes antes da fertilização. Portanto, durante os primeiros sete ciclos celulares, a atividade da MPF quinase permanece constante e as divisões celulares prosseguem tão rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos. À medida que a ciclina é degradada, sua síntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no ciclo 8. No ciclo 14, o mRNA materno para ciclina desapareceu, e deve ser sintetizado de genes nucleares. Além disso, a degradação das proteínas do cordão comanda nova síntese a partir do núcleo. Pré-MPF acumula mas não é ativado até que a fosfatase cordão cliva os fosfatos T-14 e Y-15 da cdc2 quinase. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o término da síntese de DNA e a iniciação da citocinese estão sendo investigados. (Segundo Edgar et al., 1994.)
Regulado zigoticamente

Regulado maternalmente Ciclina maternal e proteínas de cordão presentes MPF ativo Proteína Ciclina Ciclina Ciclina Proteína maternal de cordão presente Ciclina Ciclina mRNA Ciclina Degradação

Pré-MPF Ciclina Síntese de ciclina (zigótica) Desfosforilação cdc 25/cordão fosfatase (zigótica)

MPF ativo Ciclina

Síntese de ciclina

MPF ativo Ciclina Degradação da ciclina

Mitose Quinase ativa de proteínas maternas (limita substrato) Ciclo Divisões nucleares

Mitose Ciclo dirigido pela tradução de nova ciclina de mRNA materno

Mitose Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordão

Mitose

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

199

em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em tirosina-15 (Y-15). Ambas condições são importantes para a atividade da quinase (Gould e Nurse, 1989; Solomon, 1993).

A maior subunidade do MPF: Ciclina
Então, como é regulado o MPF? Desde que a clivagem de Xenopus parecia ser regulada por uma proteína similar àquela que regula a divisão celular da levedura, pensou-se que qualquer regulador da proteína da levedura teria contrapartida no embrião animal. Um dos principais reguladores da proteína MPF de levedura é o produto do gene cdc13, uma proteína 56-kDa chamada p56cdc13. Esse gene foi clonado, e a seqüência de sua proteína codificada foi considerada muito semelhante às proteínas ciclina B encontradas em numerosos animais (Goebl e Byers, 1988; Solomon et al., 1988). As proteínas ciclina B em células em estágio de clivagem mostram um comportamento periódico, acumulando durante a fase S e sendo degradada durante a mitose (Evans et al., 1983; Swenson et al., 1986). Ciclinas são freqüentemente codificadas pelo mRNA armazenado no citoplasma do oócito, e se sua transformação em proteínas é seletivamente inibida, a célula não entrará em mitose (Minshull et al., 1989). A proteína ciclina B combina com a quinase cdc2 do MPF para criar o comple-

xo MPF. A ciclina permite a subunidade quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos resíduos treonina-14 (T14), tirosina-15 (Y15) e treonina-161 (Figura 5.40). A fosforilação no T-161 é necessária para a atividade do MPF, mas fosforilações nos T-14 e Y-15 a inibem. Dessa forma, quando fosforilada nessas posições a quinase permanece inativa, porém, potencialmente funcional. O suprimento de moléculas MPF potencialmente funcionais (pré-MPF) acumula durante o período tardio de S.

A Fosfatase cdc25: Iniciadora de Mitose
A mitose se inicia com uma abrupta desfosforilação de todas essas subunidades MPF quinase na posição 15. Isso é conseguido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 (Edgar e O’Farrell, 1989; Gautier et al., 1991; Jessus e Beach, 1992; Lee et al., 1992). Dessa maneira, a acumulação gradual do MPF é convertida em uma breve explosão de atividade quinase que inicia a mitose. Essa fosfatase (que tem sido encontrada em inúmeros organismos) é ela própria regulada pelo desenvolvimento. Na Drosophila, a fosfatase cdc25 (produto do gene string, de cordão) é inicialmente sintetizada pelo mRNA armazenado no oócito durante os 13 primeiros ciclos celulares. No entanto, durante o pró-

ximo ciclo, o cordão mRNA materno é degradado; se o núcleo não transcrever seu próprio cordão mRNA, as células não se dividirão. Edgard e O’Farrel (1989) mostraram que aquelas células que se dividem estão sintetizando a sua própria fosfatase cdc25, enquanto aquelas que não são capazes de se juntar a esse ciclo, não realizarão a divisão (Figura 5.41). Essa degradação e a necessidade de re-sintetizar essa proteína explicariam a mudança de controle citoplasmático para controle nuclear da divisão como visto no ciclo 14. Em Drosophila, existe uma maturação desenvolvimental da regulação da quinase MPF ativa (veja Figura 5.40; Edgard et al., 1994). Na ovulação, o complexo pré-MPF armazenado no ovo é desfosforilado em T14 e Y-15 pelo recém-traduzido cordão (cdc25) da proteína. Durante os primeiros sete ciclos nucleares, o MPF ativo permanece em níveis altos, e o núcleo divide-se tão rapidamente quanto as enzimas sintetizadoras de DNA permitem. Durante os ciclos 8-13, a ciclina começa a ser degradada na metáfase, levando a flutuações periódicas de atividade MPF-quinase. A síntese da ciclina do mRNA armazenado no oócito armazenado se torna o passo limitante para a mitose. A degradação do cordão da oócito-proteína leva à parada do ciclo celular na interfase do ciclo 14.

(A)

Figura 5.41 Correlação da expressão do gene string (cordão) com a divisão celular em embriões de Drosophila. (A) Nesse exemplo, um embrião de estágio tardio 14 é corado com uma seqüência nucleotídica radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordão (visto aqui como pontos brancos na auto-radiografia). (B) Um embrião ligeiramente mais velho é corado com anticorpos fluorescentes para tubulina para mostrar os microtúbulos dos fusos mitóticos. Uma comparação da microfotografia de fluorescência com a auto-radiografia obtida da ligação da sonda radioativa mostra que somente aquelas células capazes de se dividirem, sintetizam mRNA string. (C) Anticorpos para a proteína ciclina A mostram que ela é degradada após a mitose e não é vista nas regiões que contêm a proteína de cordão. (de Edgar e O’Farrell, 1989, cortesia de B. A. Edgar.)

(B)

(C)

200

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Grandes concentrações de pré-MPF se acumulam. As mitoses para as divisões 14, 15 e 16 são iniciadas somente quando essa pré-MPF é desfosforilada nas posições T14 e Y-15 pela proteína cordão. Essa proteína é derivada de transcrição nuclear ao final de cada período G2. A mitose passou do controle citoplasmático para o nuclear.

Outras ciclinas e quinases ciclinadependentes
MPF é o primeiro membro descoberto de uma família de proteínas diméricas que têm estruturas muito similares. Cada uma dessas proteínas contém uma ciclina e uma quinase ciclina-dependente, que quando dependente do MPF é chamada cdk1. Pelo menos outras sete quinases ciclina-dependentes estão envolvidas em células maduras de vertebrados, e mais de uma dúzia de ciclinas foram identificadas. Os papéis de algumas dessas quinases foram determinados (como mostra a Figura 5.39). Entre essas enzimas, uma das mais críticas é a ciclina E/cdk2. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) é crítica para a entrada na mitose (M), ciclina E/cdk2 é crítica para a habilidade da célula entrar na fase S, permitindo a ocorrência de síntese do DNA. A regulamentação do desenvolvimento dessa proteína é uma fase crítica no desenvolvimento da Drosophila. Embriões de Drosophila adicionam um estágio G2 antes da mitose, quando a proteína de cordão se torna limitante no ciclo 14. A fase G1 é adicionada ao ciclo 17 quando ciclina E se torna o fator limitante para a replicação do DNA. Em embriões precoces, ciclina E e cdk2 estão sempre presentes, seus mRNA sendo fornecidos pelo oócito e traduzidos através de todos os primeiros 15 ciclos de divisão. A mensagem para ciclina é degradada durante o ciclo 16, levando à deficiência dessa proteína no ciclo 17. Dessa forma, a maioria das células param no G1 desse ciclo, não entrando no período de síntese do DNA. Aí começam a diferenciar-se. (As exceções são as células precursoras dos nervos que continuam a proliferar, e as células do intestino, que continuam a produzir DNA na ausência de divisão celular. Nesses casos, a ciclina E é derivada dos genes zigóticos.) Se ciclina E é induzida ectopicamente, as células retidas sofrem uma nova rodada de síntese de DNA (Knoblich et al., 1994). Pensa-se que a ciclina E controla a síntese do DNA, fosforilando certos fatores de transcrição que regulam as transcrições das proteínas necessárias para a

replicação do DNA (Duronio e O’Farrell, 1994). Certamente, quando as células saem normalmente do ciclo para começar a se diferenciarem, expressam a proteína Dacapo, um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al., 1996; de Nooij et al., 1996). A regulação das ciclinas é uma função crítica no desenvolvimento. Primeiro, imagine as células da cartilagem de nossas pernas sofrendo mais uma divisão celular; seríamos muito maiores do que agora. Pior, imagine que essa desregulação ocorresse em somente uma de nossas pernas. Ainda pior, imagine se a divisão da cartilagem não fosse coordenada com a divisão da pele e dos vasos sangüíneos. A regulação desses eventos é coordenada através de hormônios e fatores de crescimento que, por fim, regulam as ciclinas que controlam a passagem através dos ciclos das células. Segundo, quando a ciclina se torna ativa sem regulação externa ou quando ciclinas se tornam estimuladas por proteínas mutantes, o crescimento das células continua sem controle externo, e se desenvolve um tumor. Em células maduras de vertebrados, as ciclinoenzimas D/cdk4,6 cumprem um papel crucial no desenvolvimento. Em diversos tipos de células, controlam a dicotomia entre a divisão e a diferenciação celular. [cleave6.html]

começo da mitose; mas a própria montagem do fuso é necessária para o funcionamento apropriado da ciclina B (Minshull et al., 1994). Se os fusos são formados incorretamente, a ciclina B cessa seu funcionamento, e a mitose pára. Também parece haver retroalimentação entre a cromatina replicante e as quinases ciclina-dependentes, fazendo com que a mitose não comece até que o DNA tenha começado a replicarse, e somente uma rodada de replicação é normalmente permitida durante a divisão celular (Chong et al., 1995; Madine et al., 1995). As moléculas que mediam essas trocas estão agora sendo estudadas.

Fator Citostático
A síntese e a degradação do MPF leva a ciclagem das células. No entanto, se a degradação da ciclina for prevenida, o MPF permanece ativo e a célula é travada na metáfase (Murray et al., 1989). Isso é o que acontece, aparentemente, durante o desenvolvimento do oócito da rã. O oócito maduro da rã cessa a divisão celular produzindo uma proteína chamada fator citostático (CSF), que mantém o oócito preso na metáfase da segunda divisão meiótica (Figura 5.42). Essa proteína contém os produtos dos genes c-mos e cdk-2, e parece agir bloqueando a degradação da ciclina (veja o Capítulo 22). Uma vez que a ciclina não é degradada, MPF permanece ativo, e

Pontos de Controle para Divisão Celular: DNA e Fusos
O ciclo celular exige uma excepcional intricada coreografia da citocinese, replicação de DNA, montagem de fusos e metabolismo celular. Nesse conjunto, ciclinas e quinases ciclina-dependentes são alvos e causadores da regulação. O sistema ciclinaquinase parece coordenar esses eventos. Por exemplo, a fibra do fuso mitótico não pode formar até a ciclina B/cdk1 sinalizar o

Figura 5.42

Níveis do fator promotor de amadurecimento (MPF) durante o desenvolvimento precoce da rã Xenopus laevis. O sinal normal de maturação é o hormônio progesterona, que estimula a ovulação dos oócitos e o início da meiose. (Segundo Murray e Kirschner, 1989.)
Entrada de espermatozóide, aumento de Ca2+ livre, inativação de CSF

Estímulo para amadurecimento (progesterona ou MPF) Alta Atividade de MPF Baixa

CSF estabiliza MPF

Oócito Imaturo

Meiose I

Meiose II

Oócito maduro

Primeira clivagem

Segunda clivagem

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

201

o oócito permanece na metáfase. A liberação de íons de cálcio durante a fertilização ativa a protease que especificamente inativa o CSF (Watanabe et al., 1991). Quando o CSF é degradado, a ciclina pode então ser degradada, e a célula pode retornar à fase S. Dessa maneira, um dos efeitos da

liberação de íons de cálcio na fertilização é de iniciar a degradação da ciclina e permitir que a célula comece a replicação do DNA. Em seguida, os ritmos da divisão celular são controlados pela atividade do MPF, que por sua vez é baseada nos ritmos cíclicos da síntese e degradação da ciclina.

Enquanto os íons de cálcio estão ocupados desligando a mitose, os sinais da fertilização que ativam a proteína quinase C estão estabelecendo condições de interfase: descondensação da cromatina e reforma do envoltório nuclear (Bement e Capco, 1991).

O mecanismo citoesquelético da mitose
Clivagem na verdade é o resultado de dois processos coordenados. O primeiro desses processos cíclicos é a cariocinese, a divisão mitótica do núcleo, cujo agente mecânico é o fuso mitótico, com seus microtúbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de proteína componente do flagelo do espermatozóide). O segundo processo é a citocinese, a divisão da célula. O agente mecânico da citocinese é o anel contrátil de microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de proteína que alonga os microvilos do óvulo e o processo acrossômico do espermatozóide). A Tabela 5.2 apresenta uma comparação desses sistemas de divisão. O relacionamento e coordenação entre os dois sistemas durante a clivagem é representado na Figura 5.43A, onde o ovo do ouriço-do-mar é mostrado passando pela primeira clivagem. O fuso mitótico e o anel contrátil estão perpendiculares um com o outro, e o fuso é interno ao anel contrátil. O sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando, portanto, dois blastômeros geneticamente equivalentes. Os microfilamentos de actina são encontrados no córtex do ovo ao invés do citoplasma central. Sob o microscópio eletrônico, o anel de microfilamentos pode ser visto formando uma banda cortical distinta de 8-10 µm de espessura (Figura 5.43B). Esse anel contrátil existe somente durante a clivagem e se estende por 0.1µm para o centro do ovo. É responsável por exercer a força que separa o zigoto em blastômeros; se interrompido, a citocinese pára. Schroeder (1973) propôs um modelo de clivagem em que o anel contrátil parte o ovo como um “fecho de bolsa” apertando o ovo, enquanto a clivagem continua. Esse aperto dos anéis de microfilamentos cria o sulco da clivagem. Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas, elas são, às vezes, separadas por condições naturais ou experimentais. Nos ovos dos insetos, a cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Outra maneira de induzir esse estado é tratar os embriões com a droga citocalasina B, que inibe a formação e a organização de microfilamentos no anel contrátil, assim, interrompendo a clivagem sem parar a cariocinese (Schroeder, 1972). Em alguns momentos, o núcleo continua a se dividir e expressar proteínas reguladoras do desenvolvimento, mesmo quando a clivagem é bloqueada (Lillie, 1902; Whittaker, 1979).

Tabela 5.2

Cariocinese e citocinese Principal composição protéica Microtúbulos de tubulina Microfilamentos de actina Principal droga disruptora Colchicina, nocodazola Citocalasina B

Processo Cariocinese Citocinese

Agente mecânico Fuso mitótico Anel contrátil

Localização Citoplasma central Citoplasma cortical

a

Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente várias funções da membrana, incluindo a osmorregulação e o transporte de íons e nucleosídeos, nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtúbulos (veja Hardin, 1987).

202

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 5.43

(A) Microfilamentos (anel contrátil)

(B)

Papel dos microtúbulos e microfilamentos na divisão celular. (A) Diagrama da telófase da primeira clivagem. Os cromossomos estão sendo arrastados para os centríolos por microtúbulos, enquanto o citoplasma está sendo apertado pela contração dos microfilamentos. (B) Localização de microfilamentos da actina no sulco de clivagem. Marcação fluorescente dos microfilamentos de actina mostra o anel contrátil no sulco da primeira clivagem (flecha) de um ovo de ouriço-do-mar na telófase. (C) marcação fluorescente da tubulina mostra os ásteres microtubulares de um ovo de ouriço-do-mar durante a telófase da primeira clivagem. (B de Bonder et al., 1988; C de White et. al., 1987.)

Centríolo Cromossomo (C)

Microtúbulos

Um dos mais intrigantes problemas não resolvidos da clivagem embrionária, é como a citocinese e a cariocinese são coordenadas entre si. Pesquisas in vitro sugerem que a replicação do DNA pode controlar a fosforilação da subunidade quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilação pode controlar a habilidade da actina de se contrair (Smythe e Newport, 1992). No entanto, essas observações podem não ser consistentes com as observações feitas em células embrionárias precoces (Ferrell et al., 1991). O número e o local desses sulcos de clivagem parecem ser controlados pelos ásteres dos microtúbulos. Esses ásteres (Figura 5.43C) são “raios” microtubulares que se estendem dos pólos do fuso mitótico para a periferia da célula. Clivagem normal ocorre somente se um par de ásteres está presente (Wilson, 1901), e ovos polispérmicos (obtendo centríolos de cada espermatozóide) formam sulcos de clivagem múltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4.20). Em estudos mais recentes, Raff e Glover (1989) mostraram que no embrião de Drosophila, se os centríolos migram ao pólo posterior, eles podem formar células polares, mesmo na ausência de núcleo. Dessa maneira, parece que os ásteres são elementos sine qua non da clivagem. O segundo tipo de evidência ligando os ásteres com a formação do sulco de clivagem vem de experimentos nos quais a direção de clivagem é mudada pela colocação do ovo sob pressão. Pflüger (1884) descobriu que quando um zigoto de rãs é levemente comprimido entre duas placas de vidro, as direções das primeiras três clivagens são todas perpendiculares ao plano das placas. Ambos, Driesch e Morgan (revisto por Morgan, 1927) fizeram observações semelhantes com embriões de ouriço-

CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

203

Zigotos (A) (B)

Sulco de clivagem normal (C)

Sulco extra de clivagem extra (D)

Bola de vidro deslocando o aparelho mitótico

Ásteres

Interrupção do sulco de clivagem

Fuso

Figura 5.44

do-mar. Em ambos os casos, o plano da terceira clivagem (que é normalmente paralelo ao equador do oócito) foi deslocado em 90o. Dessa maneira, com a mudança do local do fuso mitótico, pode-se alterar a direção do sulco de clivagem. Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento, deslocando os fusos mitóticos para os lados das células. Na Figura 5.44, uma bola de vidro foi usada para deslocar os ásteres do centro da célula em direção à periferia. O sulco de clivagem resultante se estende somente enquanto a bola não aparece do outro lado. Dessa maneira, é formada uma célula binucleada, em forma de ferradura. Na próxima divisão, dois aparelhos de fuso se formam entre quatro ásteres, mas são gerados três sulco de clivagem! Cada braço da ferradura tem o seu próprio fuso mitótico e sulcos de clivagem como esperado, mas um terceiro sulco aparece entre os dois ásteres no topo da ferradura (Figura 5.44C). Isso demonstra claramente que se os dois ásteres estiverem próximos um do outro, suas interações causam a formação de um sulco de clivagem, mesmo na ausência de um fuso mitótico entre eles. Novamente nós observamos que a divisão celular pode ocorrer sem divisão nuclear enquanto os ásteres estiverem presentes.

Criação de um novo sulco de clivagem pelo deslocamento dos ásteres. (A,B) Pela interrupção de um sulco de clivagem com uma bola de vidro, cria-se uma célula com forma de ferradura. Na próxima divisão (C,D), cria-se um novo sulco de clivagem, apesar de não haver fuso mitótico que o atravessa. (de Rappaport, 1961, cortesia de R. Rappaport.)

A formação de novas membranas
Nossa última consideração sobre clivagem embrionária envolve a formação de novas membranas celulares. Serão essas membranas recém-sintetizadas ou são meras extensões da membrana celular do oócito? A resposta é que provavelmente ambos mecanismos contribuem para as membranas celulares internas. Embriões de anfíbios fornecem evidências que novos componentes da membrana estão sendo sintetizados durante a clivagem precoce. A Figura 5.45A mostra o primeiro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de rã. Ao passo que a membrana original tem uma região cortical pigmentada associada a ela, a nova membrana é branca. Essa nova membrana tem também propriedades de condutividade elétrica diferentes daquelas da membrana original. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam componentes de membrana de ovos de Xenopus recém-fertilizados e seguiram a redistribuição dessas moléculas através da clivagem, por auto-radiografia. Durante a primeira clivagem, a membrana da superfície externa do embrião e a membrana da borda principal do sulco de clivagem são altamente marcadas (mostrando serem as regiões originais da membrana). Entre elas há uma grande região desprovida de rótulo radioativo (Figura 5.45B). Dessa maneira, a membrana do sulco é um mosaico de diferentes partes. A membrana da parte onde o sulco termina é derivada de uma superfície externa preexistente do ovo, marcada, mas a maior parte da membrana do sulco é derivada de regiões que são inacessíveis aos marcadores de superfície. Byers e Armstrong especulam que o domínio da membrana intensamente marcada, na borda do sulco, contém as membranas âncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. A borda do

204

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

Nova membrana não-pigmentada

(B)

Figura 5.45

Formação de novas membranas na primeira clivagem do ovo de Xenopus. (A) A membrana antiga tem grânulos de pigmento. A nova membrana aparece clara porque não tem esses grânulos. (B) Auto-radiografia de proteínas de membrana no sulco da primeira clivagem. A superfície celular foi radiativamente marcada antes da divisão. (A de Laat e Bluemink, 1974; B de Byers e Armstrong, 1986, cortesia dos autores.)

sulco em embriões precoces de Xenopus, também contém microtúbulos curtos, dispostos radialmente. Pensa-se que esses microtúbulos poderiam fornecer um caminho para o movimento de vesículas das membranas em direção ao lugar onde são inseridos na membrana (Danilchik e Funk, 1996). Esses processos de clivagem dividem o citoplasma do zigoto em numerosas células. Cada célula pode ter os mesmos genes nucleares, mas seus respectivos citoplasmas podem diferir significativamente. No próximo capítulo veremos como esses blastômeros se locomovem e interagem um com o outro para iniciar a estrutura do corpo.

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Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

6

Meu querido amigo..... a vida é infinitamente mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. Não ousaríamos sequer conceber as coisas que são meros detalhes da existência. A. CONAN DOYLE (1891) Não é o nascimento, o casamento ou a morte, mas é a gastrulação que é verdadeiramente a parte mais importante de nossa vida. LEWIS WOLPERT (1986)

G

ASTRULAÇÃO é o processo pelo qual movimentos altamente integrados

de células e tecidos, dramaticamente, reorganizam as células da blástula. A blástula consiste de numerosas células, cujas posições foram estabelecidas durante a clivagem. Durante a gastrulação, essas células recebem novas posições e novos vizinhos, e é estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. As células que formarão os órgãos endodérmicos e mesodérmicos são trazidas para dentro do embrião, ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso são distribuídas na superfície externa. Assim, as três camadas germinativas – ectoderma externo, endoderma interno e mesoderma intersticial – são produzidas inicialmente durante a gastrulação. Ainda, o palco está montado para as interações desses tecidos recémposicionados. Os movimentos da gastrulação envolvem o embrião inteiro, e migrações celulares em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. Mesmo que o padrão de gastrulação seja extremamente variado em todo o reino animal, relativamente poucos mecanismos estão envolvidos. A gastrulação, geralmente, envolve os seguintes tipos de movimentos: • Epibolia. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de células ectodérmicas) que se espalham como uma unidade e não individualmente, para envolver as camadas mais profundas do embrião. • Invaginação. O dobrar para dentro de uma região de células, de maneira semelhante à cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfície de uma bola de borracha macia. • Involução. A internação ou movimento de interiorizarão de uma camada externa em expansão, de modo a se espalhar na superfície interna das células externas remanescentes. • Ingresso de células. A migração de células individuais da camada superficial para o interior do embrião. • Delaminação. A separação de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. Ao considerarmos gastrulação em diferentes tipos de embrião, devemos levar em conta as seguintes questões (Trinkaus, 1984a): • Qual é a unidade da atividade migratória? É a migração dependente do movimento de células individuais, ou são as células parte de uma camada migrante? Por mais extraordinário que possa parecer, propriedades migratórias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmáticos que 209

210

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

são independentes da celularização. F. R. Lillie (1902) conseguiu ativar, partenogeneticamente, óvulos do anelídeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausência de células. O citoplasma do zigoto se separou em regiões definidas, e os cílios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Ainda mais, o citoplasma claro externo migrou para baixo em direção à região vegetativa, de uma maneira muito parecida à epibolia das células do hemisfério animal durante o desenvolvimento normal. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulação. Assim, a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das células que formam a região migratória. • A expansão ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrínsecos próprios, ou às forças extrínsecas que a estendem ou a distorcem? É essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vários movimentos celulares da gastrulação são integrados. Por exemplo, estão as células involutivas puxando as células epibolizantes para baixo em sua direção, ou são os dois movimentos independentes? • Existe uma expansão ativa do tecido total, ou é a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular, passivamente? • São as mudanças na forma e na motilidade celular, durante a gastrulação, conseqüências de mudanças nas propriedades da superfície celular, tais como adesividade ao substrato ou a outras células? Considerando essas questões, observaremos os vários padrões de gastrulação encontrados em equinodermos, anfíbios, peixes, aves e mamíferos*.

Gastrulação em ouriço-do-mar
A blástula do ouriço-do-mar consiste de uma única camada de mais ou menos 1000 células. Essas células derivadas de diferentes regiões do zigoto têm tamanhos e propriedades diferentes. As Figuras 6.1 e 6.2 mostram o destino das várias regiões do zigoto enquanto ele se desenvolve através da clivagem e da gastrulação na larva pluteus, característica dos ouriços-do-mar. O destino de cada camada pode ser visto através de seus movimentos durante a gastrulação. Ingresso do Mesênquima Primário
FUNÇÃO DAS CÉLULAS PRIMÁRIAS DO MESÊNQUIMA. Logo após a eclosão

da blástula da membrana de fecundação, o seu hemisfério vegetal começa a se espessar e achatar (Figura 6.2, 9 horas). No centro dessa placa vegetativa achatada, um aglomerado de pequenas células começa a se modificar. Essas células apresentam movimentos de vibração em suas superfícies internas, estendendo e contraindo longos e finos processos (30x5 µm) chamados filopódios. As células então se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6.2, 9-10 horas). Essas células são chamadas de mesênquima primário e são derivadas dos micrômeros. As 64 ou mais células mesenquimatosas primárias do ouriço-do-mar são as descendentes dos quatro blastômeros que se formaram pela quarta clivagem assimétrica. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposição contínua para seguir os movimentos microscópicos das células mesenquimatosas dentro da blastocele. No

*A discussão da gastrulação de Drosophila será transferida para o Capítulo 14, quando ela ocorre no contexto da formação do eixo. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulação, Ray Keller (comunicação pessoal) “Estudantes NÃO deveriam ler esse material apressadamente, ao contrário uma cena típica é aquela em que um pobre coitado está debruçado sobre este texto às 2.30 horas da madrugada com uma xícara de café, examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que está se passando”. Gastrulação é (como diz Wolpert na citação no começo deste capítulo) a época mais importante da sua vida. Vale a pena examiná-la criticamente e apreciá-la vagarosamente.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

211

Animal (A)

(B)

(C) Mesômeros

(D)

(E)

(F)

(G)

Macrômeros Vegetal Tufo ciliar (I) Mesênquima secundário Mesênquima primário Endoderma invaginante Micrômetros veg1 veg2 (K) Estomodeu (boca) Envoltório ectodérmico Bastonetes esqueléticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (L) (Vista lateral)

(H)

(J)

(M)

Figura 6.1

Desenvolvimento normal do ouriço-do-mar, seguindo o destino das camadas celulares da blástula. (A-F) Clivagem até o estágio de 60 células (omitindo o estágio de 2-células). (G) Blástula precoce com cílios. (H) Blástula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. (I) Blástula com mesênquima primário. (J) Gástrula com mesênquima secundário. (K) Larva em estágio prismático. (L,M) Larva pluteus. Os destinos do citoplasma zigótico podem ser seguidos pelas variações no sombreamento. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ouriço-do-mar. (A-M segundo Hörstadius, 1939; N cortesia de G. Watchmaker.)

(Vista ventral) (N) Boca

Bastonetes esqueléticos

Ânus

9 hs.

9.5 hs.

10 hs.

10.5 hs.

11 hs.

11.5 hs.

12 hs.

13 hs.

Figura 6.2
15 hs. 13.5 hs. 17 hs. 18 hs.

Seqüência completa da gastrulação em Lytechinus variegatus. O tempo mostra a duração do desenvolvimento a 25oC. (Cortesia de J. Morrill.)

212

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A) (B)

Figura 6.3

Formação dos cordões sinciciais por células mesenquimatosas do ouriço-do-mar. (A) Células mesenquimatosas primárias da gástrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espícula de carbonato de cálcio. (B) microfotografia eletrônica de varredura de espículas formadas pela fusão das células mesenquimatosas primárias para formar os cordões sinciciais. (C) Anel de células mesenquimatosas em volta do arquêntero (intestino primitivo). A metade animal e todo o arquêntero foram removidos. (D) Colocação das células mesenquimatosas primárias na larva precoce de Lytechinus variegatus. (A e D de Ettensohn, 1990; B e C de Morrill e Santos, 1985; todas as fotografias, cortesia dos autores.)

(C) Agregados Ventrolaterais

começo, as células parecem se movimentar ao acaso, ao longo da superfície interna da blastocele, ativamente produzindo e quebrando conexões filopódicas com a parede da blastocele. Finalmente, essas células tornam-se localizadas dentro da provável região ventrolateral da blastocele, onde considera-se que sua aderência seja maior. Aqui, as células mesenquimatosas primárias se fundem em cordões sinciciais, que formarão o eixo das espículas de carbonato de cálcio do esqueleto larval (Figura 6.3). Estudos mais recentes (Cherr et al., 1992) sugerem que a migração inicial das células mesenquimatosas primárias é dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele. As células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da superfície da blastocele e são envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6.4).
IMPORTÂNCIA DA LÂMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE.

Cadeia dorsal (D)

Cadeia ventral

Espícula

Os eventos que se dão no citoplasma e na superfície celular são fundamentais para o ingresso e a migração das células mesenquimatosas primárias. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrômeros se dá através de modificações de sua adesão a outras células e às matrizes extracelulares que os rodeiam. Em 1985, Fink e McClay confirmaram as especulações de Gustafson e Wolpert, medindo as forças de adesão dos blastômeros de ouriço-do-mar, em relação à camada hialina, à lâmina basal e a outras células. Originalmente todas as células da blástula estão ligadas pela sua superfície externa à camada hialina e sua superfície interna ligada à lâmina basal secretada pelas células (veja Capítulo 3). Na sua lateral, cada célula tem outra célula como vizinha. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrômeros e mesômeros, respectivamente) se ligam fortemente entre si e à camada hialina, mas aderem fracamente à lâmina basal (Tabela 6.1). Os micrômeros da blástula mostram, originalmente, um padrão similar de ligação. Entretanto, o padrão de ligação dos micrômeros muda na gastrulação.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

213

(A) (B)

Figure 6.4

Fotografias ao estéreo-microscópio eletrônico de varredura de células mesenquimatosas primárias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. (A) Células mesenquimatosas primárias enredadas na matriz extracelular da gástrula precoce de Strongylus centrotus. (B,C) migração de células mesenquimatosas em estágio de gástrula. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e estão intimamente associadas com as células mesenquimatosas primárias. (de Cherr et al., 1992; cortesia de G. Cherr.)

(C)

Enquanto outras células mantêm sua forte ligação à camada hialina e às células vizinhas, as precursoras do mesênquima primário perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original), enquanto que sua afinidade aos componentes da lâmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. Essa mudança na afinidade faz com que os micrômeros percam suas ligações com a camada hialina externa e com as células circundantes e, atraídos pela lâmina basal, migram para o interior da blastocele (Figura 6.5). As modificações na afinidade celular foram

Tabela 6.1 Afinidades de células mesenquimatosas e não-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Força de deslocamento (em dinas) Tipo celular Micrômeros em estágio de 16 células Células mesenquimatosas em estágio migratório Ectoderma e endoderma gastrular Hialino Monocamadas de células gastrulares 6.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5 Lâmina basal

5.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5

4.8 x 10-7 1.5 x 10-5 5.0 x 10-7

Fonte: Segundo Fink e McClay, 1985.

a Células testadas foram colocadas em placas contendo hialino, lâmina basal extracelular, ou monocamadas celulares. As placas foram invertidas e centrifugadas a várias forças para deslocar as células. A força de deslocamento é calculada pela força centrífuga necessária para remover as células teste do substrato.

214

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lâmina basal

Células Mesenquimatosas primárias

(A)

Camada hialina

Cílios

(B)

(C)

(D)

(E)

Figure 6.5

Ingresso de células mesenquimatosas primárias. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alterações nas interações adesivas nas presumidas células mesenquimatosas primárias (cor). Essas células perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastômeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lâmina basal. Blastômeros não-mesenquimatosos retêm suas originais afinidades pelo hialino e células vicinais. (F) Montagem de micrografia eletrônica de varredura mostrando o ingresso de células primárias de Lytechinus variegatus. (F cortesia de J. B. Morrill e D. Flaherty.)

(F)

correlacionadas com modificações nas moléculas da superfície celular que ocorreram durante esse período (Wessel e McClay, 1985). Como mostra a Figura 6.4, há uma alta concentração de material da lâmina extracelular ao redor das células mesenquimatosas primárias ingressantes (Galileo e Morrill, 1985; Cherr et al., 1992). Além disso, uma vez dentro da blastocele, as células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele, extendendo seus filopódios a sua frente (Galileo e Morrill, 1985; Karp e Solursh, 1985). A orientação das fibrilas, ao longo do eixo animal-vegetal, pode estar guiando as células em sua migração. Três proteínas parecem ser importantes nessa migração. Uma é a fibronectina, uma grande glicoproteína (400-kDa), que é um componente comum das lâminas basais, incluindo aquela da blastocele do ouriço-do-mar (Wessel et al., 1984). Fink e McClay mostraram que durante a gastrulação, a afinidade dos micrômeros por essa molécula específica aumenta dramaticamente. O segundo grupo de moléculas consiste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfície das células mesenquimatosas ingressantes (veja Capítulo 3; Sugiyama, 1972; Lane e Solursh, 1991). Se a síntese (ou sulfatação) desses proteoglicanos é inibida, as células mesenquimatosas entram na blastocele, mas não continuam a migrar* (Figura 6.6; Karp e Solursh, 1974; Anstrom et al., 1987). A terceira proteína, ECM18, é encontrada nas matrizes extracelulares das células da blastocele e é expressa somente durante a gastrulação. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migração mesenquimatosa primária quanto a invaginação secundária do endoderma (Berg et al., 1996). Porém, esses sinais de orientação não são suficientes, pois os micrômeros “sabem” quando parar seu movimento e formar espículas perto do equador da blastocele. As células mesenquimatosas primárias se organizam em forma de anel em uma posição específica ao longo do eixo animal-vegetal. Em dois sítios perto do futuro lado ventral da larva, muitas dessas células mesenquimatosas primárias se agrupam para iniciar a formação de espículas (Figura 6.3). Se um micrômero marcado de outro embrião é injetado na blastocele em gastrulação de um embrião de ouriço-do-mar, ele migra para o local correto

*Em um dos primeiros experimentos em embriologia química, Curt Herbst (1904) observou que embriões de ouriço-do-mar não gastrulavam adequadamente quando colocados em água do mar que não continha íons sulfato. Na época, ele não podia entender o porquê.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

215

(A)

(B)

Figura 6.6

Efeito da privação de sulfato no movimento do mesênquima primário do ouriço-do-mar Lytechinus. (A) Gástrula normal. (B) Gástrula anormal formada quando embriões são cultivados em água do mar livre de sulfato. (de Karp e Solursh, 1974, cortesia de M. Solursh.)

e contribui para a formação das espículas embrionárias (Prancha 35). Se células mesenquimatosas primárias de embriões mais velhos são injetadas em gástrulas mais jovens, elas atrasarão sua diferenciação, migrarão como as células mais jovens e serão incorporadas normalmente no mesênquima do hospedeiro. Além disso, se todas as células mesenquimatosas do hospedeiro são removidas antes da injeção de células mesenquimatosas mais velhas, essas repetirão os estágios iniciais de sua migração, formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto, normalmente (Ettensohn, 1990). Considera-se que essa informação posicional é fornecida pelas futuras células ectodérmicas e suas lâminas basais (von Übisch, 1939; Harkey e Whiteley, 1980). Somente células mesenquimatosas primárias (e não outros tipos de células ou partículas de látex) são capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay, 1986). Miller e colegas (1995) observaram a existência de filopódios extremamente delgados (0.3 µm de diâmetro) no mesênquima esqueletogênico (skeletonogenic); esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6.7). Esses filopódios contêm actina e não são considerados como locomotores. Em lugar disso, são considerados como sensores do ambiente, da mesma maneira que os filopódios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Essas extensões delgadas podem ser responsáveis pela captação de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal, a partir do ectoderma (Malinda et al., 1995). Primeiro estágio da invaginação do arquêntero Enquanto se forma o anel de células mesenquimatosas primárias no pólo vegetal da blastocele, mudanças importantes estão ocorrendo nas células que permanecem na

Figura 6.7

Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopódio longo e fino estendendo-se de uma célula mesenquimatosa primária até a parede ectodérmica da gástrula, assim como um filopódio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. Os filopódios mesenquimatosos estendem-se através da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das células ectodérmicas. (de Miller et al., 1995; fotografia cortesia de D. McClay.)

216

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

placa vegetativa. Essas células permanecem ligadas umas às outras e à camada hialina do ovo, e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesênquima; portanto, a placa vegetal se achata ainda mais. Verifica-se, também, que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou até a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6.2, 10.5-11.5 horas; Figura 6.8A). Então, repentinamente, a invaginação cessa. A região invaginada é chamada de arquêntero (intestino primitivo) e sua abertura no pólo vegetal chamada de blastóporo. Quais forças atuam para invaginar essas células? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento é semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetálica. A camada hialina é, na verdade, formada de duas lâminas: uma externa, formada primariamente de proteína hialina, e uma interna, composta de proteínas fibropelinas* (Hall e Vacquier. 1982; Bisgrove et al., 1991). As células da placa vegetal (e somente essas células) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lâmina interna da camada hialina, diretamente abaixo delas. Essa molécula higroscópica (absorvente de água) incha a lâmina interna mas não a externa. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.8B,C). Um pouco mais tarde, uma
*Fibropelinas são armazenadas em grânulos secretores dentro dos oócitos. São secretadas desses grânulos após a liberação da proteína hialina pela exocitose granular cortical. No estágio de blástula, as fibropelinas já formaram um envoltório, tipo rede, sobre a superfície do embrião. (A)

Figura 6.8

Invaginação da placa vegetal. (A) Invaginação da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrônica de varredura da superfície externa da gástrula precoce. O blastóporo está claramente visível. (B) a camada hialina consiste de lâminas internas e externas. Microvilosidades da placa vegetal estendem-se através da camada hialina e seu citoplasma contém vesículas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). (C) Os grânulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lâmina interna da camada hialina. O proteoglicano absorve água e entumece a lâmina interna, enquanto a lâmina externa, ao qual está fixado, não entumece. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltório hialino e do epitélio a ele ligado. (A de Morrill e Santos, 1985, cortesia de J. B. Morrill e C segundo Lane et al., 1993.)
(B) (C) Células da placa vegetal empurradas para cima

Blastocele interior

Células de placa vegetal

Camada hialina

Lâmina interna Lâmina externa

Microvilosidades

Vesículas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG)

CSPG secretado para a lâmina interna absorve água, causando tumefação

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

217

Gastrulação precoce

Gastrulação tardia

Figura 6.9

blastóporo

Rearranjo celular durante a extensão do arquêntero em embriões de ouriço-do-mar. Nessa espécie, o arquêntero precoce tem 20 a 30 células ao redor de sua circunferência. Mais tardiamente na gastrulação, o arquêntero tem uma circunferência constituída de somente 6 a 8 células. Clones marcados fluorescentemente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. (Segundo Hardin, 1990.)

segunda força resultante dos movimentos das células epiteliais adjacentes à placa vegetal, pode facilitar essa invaginação puxando para dentro a camada envergada (Burke et al., 1991). Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero A invaginação das células vegetais ocorre em três estágios discretos. Após uma breve pausa, começa a segunda fase da formação do arquêntero. Durante essa fase, o arquêntero se estende dramaticamente, algumas vezes triplicando seu comprimento. No processo de extensão, o largo e curto intestino rudimentar é transformado em um tubo longo e delgado; mas não são formadas novas células (veja Figura 6.2, 12 horas; Figura 6.9). Para produzir essa extensão, as células do arquêntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn, 1985; Hardin e Cheng, 1986). Esse fenômeno, onde células se intercalam para estreitar o tecido e, ao mesmo tempo, levá-lo adiante é chamado extensão convergente. Em pelo menos algumas espécies de ouriço-do-mar, ocorre um terceiro estágio no alongamento do arquêntero. Essa última fase é iniciada pela tensão propiciada pelas células mesenquimatosas secundárias, que se formam na ponta do arquêntero e lá permanecem (veja Figura 6.2, 13 horas; Figura 6.10). Os filopódios se estendem dessas células através do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfície interna da

Figura 6.10

(A)

(B)

Estágio de gástrula intermediária do ouriçodo-mar Lytechinus pictus, mostrando extensões de filopódios do mesênquima secundário estendendo-se da ponta do arquêntero até a parede da blastocele. (A) Células mesenquimatosas estendendo filopódios da ponta do arquêntero. (B) Cabos de filopódios conectando a parede da blastocele à ponta do arquêntero. A tensão nos cabos pode ser avaliada pela tração exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixação. (Fotografias cortesia de C. Ettensohn.)

218

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

parede da blastocele (Dan e Okazaki, 1956; Schroeder, 1981). Os filopódios se ligam à parede nas junções entre as células do blastoderma e, em seguida, se contraem, arrastando o arquêntero para cima. Hardin (1988) removeu as células mesenquimatosas secundárias com um laser, e como conseqüência o arquêntero só pode se alongar aproximadamente em dois terços do seu comprimento total. Quando algumas células mesenquimatosas secundárias foram deixadas, o alongamento continuou, embora em velocidade menor do que nos controles. As células mesenquimatosas secundárias têm, então, um papel essencial em elevar o arquêntero até a parede da blastocele durante a última fase da invaginação. Mas, podem os filopódios mesenquimatosos secundários se ligar a qualquer parte da parede da blastocele, ou existe um alvo específico no hemisfério animal que precisa estar presente para que a ligação ocorra? Existe alguma região da parede da blastocele que é predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um “alvo” específico para os filopódios do hemisfério animal, que difere de outras regiões. Os filopódios das células mesenquimatosas secundárias se estendem, tocam a parede da blastocele ao acaso e, em seguida, se retraem. Entretanto, quando os filopódios atingem uma região específica da parede, eles permanecem ligados naquele local, se achatam contra essa região e puxam o arquêntero em direção a ela. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele, de modo que o contato com a região se tornou mais eficiente, os filopódios continuaram a se estenderem e a se contraírem ao tocar a parede daquela região. Somente quando os filopódios encontraram o “alvo” é que cessaram os movimentos. Com a gástrula contraída de modo a impedir que os filopódios jamais atingissem a área “alvo”, as células secundárias mesenquimatosas continuaram sua exploração até que finalmente se afastaram do arquêntero e encontraram o tecido alvo, como células migratórias livres. Parece então, que existe uma região alvo destinada a se transformar na região ventral da larva, que é reconhecida pelas células mesenquimatosas secundárias e que posiciona o arquêntero na região onde se formará a boca. Quando o topo do arquêntero encontra a parede da blastocele nessa região, as células mesenquimatosas secundárias se dispersam no interior da blastocele, onde proliferam para formar os órgãos mesodérmicos (veja Figura 6.2, 13.5 horas). Onde o arquêntero contata a parede se formará, finalmente, uma boca que se fundirá a ele formando um tubo digestivo contínuo. Assim, como é característico para os deuterostomatas, o blastóporo marca a posição do ânus.

Gastrulação em peixes
A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular Durante o décimo ciclo de clivagem do peixe-zebra, as divisões celulares perdem sua sincronia, novos genes são expressos e as células se tornam móveis. Essa transição da blástula intermediária (MBT) também é evidente em rãs e em Drosophila. Como discutido no Capítulo 5, a MBT parece ser regulada pela relação entre cromatina e citoplasma. Peixes haplóides entram na MBT um ciclo mais tarde; peixes tetraplóides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel, 1993). Parece que alguma coisa na cromatina está “removendo por titulação” alguma substância (até agora desconhecida) do citoplasma. O primeiro movimento celular é a epibolia das células blastodérmicas sobre o vitelo. Na fase inicial, as células blastodérmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as células mais superficiais (Warga e Kimmel, 1990). Mais tarde, as células se movem sobre a superfície do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6.11). Esse movimento não é devido a um arrastão ativo dos blastômeros. Pelo contrário, o movimento é propiciado pela expansão autônoma da camada sincicial do vitelo (YSL) “dentro” do citoplasma do hemisfério animal. A camada envolvente (EVL) está

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

219

(A) 30% DE EPIBOLIA (4.7 HS) Camada envolvente Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Pólo animal

Figura 6.11

Movimentos celulares durante a gastrulação do teleósteo Danio rerio. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa. (B) Formação do hipoblasto, por involução de células na margem do blastoderma em epibolização ou por delaminação de células do epiblasto. (C) Detalhe da região marginal. (D) Com 90 porcento de epibolia, o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo, entre o ectoderma e o endoderma. (E) Término da gastrulação. (Segundo Driever, 1995, e Langeland e Kimmel, 1997.)

Célula do vitelo Núcleo do vitelo Pólo vegetal

(B) ESCUDO (6.0 HS.)

(C) Pólo animal Ingresso celular Epiblasto Hipoblasto Escudo Hipoblasto Camada envolvente Epiblasto Dorsal Células em involução Células em nãoinvolução Sinais indutores mesodérmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grânulo do vitelo

Ventral

Sinal indutor mesodérmico Pólo Vegetal

(D)

Pólo animal Mesoderma dorsal Camada envolvente

(E) Anterior

Pólo animal Região cefálica

Camada envolvente Somito #1

Ventral

Dorsal Ventral Dorsal

Mesoderma Ectoderma, neuroectoderma Pólo vegetal Mesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) Coto caudal Posterior Pólo animal 1 SOMITO (10.3 HS) Região do tronco

fortemente ligada à YSL e é arrastada junto com ela. As células mais profundas do blastoderma enchem o espaço entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. Isso pode ser demonstrado cortando a ligação entre YSL e EVL. Quando isso é feito, as células blastodérmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expansão ao redor da célula do vitelo (Trinkaus, 1984b, 1992). A expansão de YSL tem como base uma rede de microtúbulos em sua estrutura, e radiação ou drogas que

220

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

impedem a polimerização de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan, 1993; Solnica-krezel e Driever, 1994). Durante a migração, um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. Experimentos com marcação de células indicam que o lado mais delgado marca o sítio da futura superfície dorsal do embrião (Schmidt e CamposOrtega, 1995). Formação das camadas germinais Depois que as células blastodérmicas cobrem aproximadamente a metade da célula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. Esse espessamento é chamado de anel germinativo, e é composto de uma camada superficial, o epiblasto, e uma camada interna, o hipoblasto. Não entendemos como é produzido o hipoblasto. Alguns laboratórios alegam que o hipoblasto é formado pela involução das células superficiais abaixo da margem, seguida por sua migração para o pólo animal (veja Figura 6.11). A involução começa na futura porção dorsal do embrião, mas ocorre na margem inteira. Outros laboratórios alegam que essas células hipoblásticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus, 1996). (É possível que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espécies diferentes.) Uma vez formado o anel, as células profundas de ambos, epiblasto e hipoblasto, se intercalam no futuro lado dorsal do embrião, para formar um espessamento localizado, o escudo embrionário (Figura 6.12). Esse escudo é funcionalmente equivalente ao lábio dorsal do blastóporo de anfíbios, pois ele pode organizar um eixo embrionário secundário quando transplantado a um embrião hospedeiro (Oppenheimer, 1936; Ho, 1992; veja discussão de gastrulação em anfíbios). Assim, enquanto as células realizam a epibolia em torno do vitelo, elas também estão involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direção

(A)

Pólo animal Extensão Escudo embrionário

Figura 6.12

Convergência Involução Epibolia Célula do vitelo

Convergência e extensão no peixe-zebra. (A) Vista dorsal de movimentos de convergência e extensão durante a gastrulação do peixe-zebra. A epibolia estende o blastoderma sobre o vitelo; a involução ou o ingresso geram o hipoblasto; convergência e extensão trazem células do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionário. Dentro do escudo, a intercalação estende o cordomesoderma em direção ao pólo animal. (B,C) Extensão convergente do cordomesoderma é mostrada por aquelas células exprimindo o gene no tail (sem cauda), um gene que é expresso pelas células da notocorda. (D,E) Extensão convergente de células mesodérmicais adaxiais (marcadas pela sua expressão de gene snail para flanquear a notocorda. (de Langeland e Kimmel, 1997.)

(B)

(C)

(D)

(E)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

221

(A) Vidro para segurar o embrião

(B) Manchas de corante no embrião

(C)

Discos de ágar com corante

Lábio dorsal do blastóporo

Embrião

Figura 6.13

Coloração vital de embriões de anfíbios. (A) Método de Vogt para marcação de células específicas da superfície embrionária com corantes vitais. (B-D) Vistas da superfície do corante em embriões sucessivos. (E) Embrião de tritão dissecado no plano mediano para mostrar células coradas no interior. (Segundo Vogt, 1929.)

Secção em plano de visão (E) (D)

ao escudo embrionário (Trinkaus, 1992). As células hipoblásticas do escudo embrionário convergem e se estendem anteriormente, finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal média do hipoblasto. Esse é o cordomesoderma, o primórdio da notocorda (Figura 6.12B,C). As células adjacentes ao cordomesoderma, as células adaxiais, são as precursoras dos somitos mesodérmicos (Figura 6.12D,E). A convergência e a extensão no epiblasto traz as células presuntivas do cérebro de todo o epiblasto para a linha média dorsal onde formam a quilha neural. O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. O mapa de destino do peixe-zebra, então, não é tão diferente daquele da rã ou outros vertebrados (como logo veremos). Se abrirmos, conceitualmente, uma blástula de Xenopus no pólo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal, o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrião do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel, 1997).

(E)

Gastrulação de anfíbios
O estudo da gastrulação em anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas áreas da embriologia experimental; mesmo considerando que gastrulação de anfíbios foi estudada extensamente no século passado, a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento, foram revisadas na década passada. O estudo da gastrulação em anfíbios foi complicado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulação nos anfíbios. Espécies diferentes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Nos últimos anos, a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus, portanto, daremos ênfase ao seu processo de gastrulação. Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios As blástulas de anfíbios têm as mesmas tarefas que seus companheiros, equinodermos e peixes, ou seja, trazer para dentro aquelas áreas destinadas a formar os órgãos endodérmicos, envolver o embrião com células capazes de formar o ectoderma e colocar as células mesodérmicas no lugar apropriado entre elas. Os movimentos pelos quais isso é conseguido podem ser visualizados pela técnica de coloração vital. Vogt (1929) saturou fragmentos de ágar com corante, como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo, os quais coram mas não danificam as células embrionárias. Esses fragmentos corados de ágar foram pressionados contra a superfície da blástula e uma parte do corante foi transferida para as células contatadas (Figura 6.13). Os movimentos de cada grupo de células coradas foram acompanhados através da gastrulação, e

222

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 6.14

Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastóporo Endoderma abaixo do blastóporo (A) EXTERIOR

Mapas do destino da blástula da rã Xenopus laevis. Mapas de destino (A) de células exteriores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodérmicos são formados de células interiores. Nessa vista lateral, o ponto em que se forma o lábio dorsal do blastóporo está indicado por uma flecha. (Segundo Keller, 1976.)

Mesoderma lateral Blastóporo Somitos (B) INTERIOR

Notocorda

Blastóporo

os resultados sumariados em mapas de destino. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de injeção de corantes (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Estudos com corantes vitais de Løvtrup (1975; Landstrom Løvtrup, 1979) e de Keller (1975, 1976) mostraram que as células da blástula de Xenopus têm diferentes destinos, conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrião (Figura 6.14). Em Xenopus, os precursores mesodérmicos existem somente na camada profunda, enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrião. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodérmicos estão localizados abaixo da superfície, na região equatorial (marginal) do embrião. Em urodelos (salamandras, tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rãs sem ser o Xenopus, os precursores da notocorda e do mesoderma são encontrados em ambas, nas células da superfície e nas células marginais profundas (Purcell e Keller, 1993). A gastrulação em embriões de rã é iniciada no futuro lado dorsal do embrião, logo abaixo do equador na região do crescente cinzento (Figura 6.15). Nesse ponto, as futuras células endodérmicas locais invaginam dando lugar à formação de um blastóporo em forma de fenda. Essas células modificam sua forma dramaticamente. O corpo principal de cada célula é deslocado na direção interna do embrião, mas o contacto com a superfície externa é mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoço (Figura 6.16). Essas células garrafa revestem o arquêntero inicial. Assim, como na gastrulação do ouriço-do-mar, uma invaginação de células inicia a formação do arquêntero. Entretanto, ao contrário da gastrulação em ouriço-do-mar, a gastrulação na rã não começa no pólo vegetativo, mas na zona marginal próxima ao equador da blástula, onde se encontram os hemisférios animal e vegetal. Aqui, as células endodérmicas não são tão grandes e nem tão ricas em vitelo como os blastômeros do pólo vegetativo. A próxima fase da gastrulação envolve a involução das células da zona marginal, enquanto as células do pólo animal sofrem epibolia e convergem no blastóporo. Quando as células marginais migratórias chegam ao lábio dorsal do blastóporo, elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfície interna das lâminas celulares externas. Dessa forma, as células que constituem o lábio do blastóporo estão constantemente mudando. As primeiras células que compõem o lábio dorsal são as células garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquêntero. Essas células, mais tarde, se tornam as células faríngeas do intestino anterior. Enquanto essas primeiras células passam para o interior do embrião, o lábio do blastóporo passa a ser composto de células que involuem para dentro do embrião, tornando-se os precursores do mesoderma da cabeça. As próximas células involuindo para o embrião, através do lábio dorsal do blastóporo, são as células cordomesodérmicas. Essas células formarão a notocorda, uma “espinha dorsal” mesodérmica transitória que é essencial para o início da diferenciação do sistema nervoso. À medida que as novas células migram para dentro do embrião, a blastocele é deslocada para o lado oposto ao lábio dorsal do blastóporo. Enquanto isso, o lábio do blastóporo se expande lateral e ventralmente, bem como os processos de formação das células garrafa e involução continuam no blastóporo. O blastóporo em expansão

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

223

Pólo animal (AP) Arquêntero Blastocele Células superficiais Células profundas Pólo vegetal Lábio dorsal do blastóporo Blastocele deslocada (B) (C) Mesoderma

Endoderma

(A)

Mesoderma dorsal

Ectoderma Arquêntero Notocorda

Mesênquima

Ectoderma Notocorda Lábio lateral do blastóporo

Lábio dorsal do blastóporo

Lábio dorsal do blastóporo Lábio lateral do blastóporo

Endoderma (D) Ectoderma Endomesoderma anterior (E)

Tampo do vitelo Lábio ventral do blastóporo

(F) Mesoderma ventral

Figura 6.15

Movimentos celulares durante a gastrulação da rã. As seções são cortadas através da metade do embrião, e são posicionadas de modo que o pólo vegetal seja inclinado na direção do observador e ligeiramente para a esquerda. Os principais movimentos celulares estão indicados por flechas, e as células superficiais do hemisfério animal estão coloridas para permitir o seguimento de sua movimentação. (A,B) Gastrulação precoce. Células de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lábio do blastóporo, e precursores mesodérmicos involuem sob o teto da blastocele. AP marca a posição do pólo animal, que irá mudar à medida que a gastrulação prossegue. (C,D) Gastrulação intermediária. O arquêntero se forma e desloca a blastocele, e as células migram dos lábios lateral e ventral do blastóporo para dentro do embrião. As células do hemisfério animal migram em direção da região vegetal, movendo o blastóporo para região próxima do pólo vegetal. (E,F) Perto do fim da gastrulação, a blastocele é obliterada, o embrião fica envolvido pelo ectoderma, o endoderma foi internalizado, e as células mesodérmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (Segundo Keller, 1986.)

Figura 6.16

(A)

(B)

Estrutura do lábio do blastóporo. (A) Diagrama de células de uma seção da gastrulação do embrião da salamandra, mostrando a extensão das células-garrafa do blastóporo. (B) Visão de superfície de um lábio dorsal precoce do blastóporo de Xenopus. A diferença de tamanho entre os blastômeros animais e vegetais está claramente aparente. (C) Detalhe da região onde as células do hemisfério animal estão involuindo através do lábio do blastóporo. (A segundo Holtfreter, 1943; B e C, micrografias de varredura eletrônica cortesia de C. Phillips.)
(C)

Célulasgarrafa

Blastóporo

224

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B) i

Lábio dorsal ii iii

Obturador do vitelo Lábio do blastóporo

Lábio lateral

iv

v

Lábio ventral

Obturador do vitelo

Figura 6.17

Epibolia do ectoderma. (A) Movimentos morfogenéticos de células migrando para o interior do blastóporo e em seguida sob a superfície. (B) Mudanças na região ao redor do blastóporo quando se formam sucessivamente os lábios dorsal, lateral e ventral. Quando o lábio ventral completa o círculo, o endoderma torna-se progressivamente internalizado. Números ii-v correspondem às Figuras 6.15B-E, respectivamente. (B de Balinsky, 1975, cortesia de B. I. Balinsky.)

como um “crescente”, desenvolve lábios laterais e, finalmente, um lábio ventral sobre o qual passam células precursoras adicionais, mesodérmicas e endodérmicas. Com a formação do lábio ventral, o blastóporo forma uma anel ao redor das grandes células endodérmicas que permanecem expostas na superfície do pólo vegetativo. Esse pedaço remanescente de endoderma é chamado de rolha ou obturador do vitelo; ele também é finalmente internalizado (Figura 6.17). Naquele ponto, todos os precursores endodérmicos foram trazidos para o interior do embrião, o ectoderma envolveu a superfície e o mesoderma foi colocado entre eles. Posicionando o blastóporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulação em anfíbios, podemos agora nos ocupar de cada passo em detalhe. A gastrulação não existe como um processo independente na vida do animal. Na verdade, a preparação para a gastrulação já pode ser visualizada no preciso momento da fusão óvulo-espermatozóide. O óvulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regiões pode ser previsto antes da fecundação. A superfície do hemisfério animal se transformará nas células do ectoderma (pele e nervos), o hemisfério vegetal formará as células do intestino e órgãos associados (endoderma), e as células mesodérmicas serão formadas a partir do citoplasma interno, ao redor do equador. Assim, as camadas germinativas podem ser mapeadas no óvulo; porém, isso nada diz sobre qual parte do ovo formará a frente e qual as costas. Os eixos dorsoventral (dorso-frente), ântero-posterior e direito-esquerdo ainda não foram determinados. Os eixos dorsoventral e ântero-posterior são especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundação. No Capítulo 4 discutimos a rotação do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da rã. O citoplasma interno permanece orientado em relação à gravidade devido a sua densa acumulação de vitelo, enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direção do hemisfério animal (para cima) em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (veja Figura 4.34).

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

225

Essa rotação faz com que o eixo animal-vegetal da superfície do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. Dessa maneira, um novo estado de simetria é adquirido. Enquanto que o óvulo era radialmente simétrico em relação ao eixo animal-vegetal, o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e é bilateralmente simétrico (tem lados direito e esquerdo). O citoplasma interno também se move, e microscopia de fluorescência de embriões precoces mostrou que os padrões citoplasmáticos das células presuntivas dorsais são diferentes daqueles das células presuntivas ventrais (Prancha 7). Esses movimentos citoplasmáticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozóide, a iniciar a gastrulação (Figura 6.18). O lado pelo qual entra o espermatozóide marca a futura superfície ventral do embrião; o lado oposto, onde se inicia a gastrulação, marca o futuro dorso (costas) do embrião (Gerhart et al., 1981; Vincent et al., 1986). Mesmo que o espermatozóide não seja necessário para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo, ele é importante na determinação da direção dessa rotação. Se um ovo artificialmente estimulado é anucleado, a rotação cortical ainda se dá no tempo correto. Entretanto, a direção desse movimento é imprevisível. (De fato, em ovos dispérmicos existe uma única direção de rotação.) O espermatozóide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotação autônoma do citoplasma, mas é a rotação citoplasmática que é essencial para o futuro desenvolvimento. Além disso, se essa rotação cortical é bloqueada, não há o desenvolvimento dorsal, e o embrião morre como uma massa de células ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart, 1987). A direção do movimento citoplasmático determina qual lado será o dorsal e qual será o ventral. A direção preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozóide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecânico da relação espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. Quando se impede a rotação do ovo (por imersão em um polissacarídeo que provoca o colapso do espaço perivitelino entre o ovo e o envoltório de fertilização) ele pode sofrer uma rotação de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e não vertical e o ponto de entrada do espermatozóide voltado para cima (Gerhart et al., 1981; Kirschner e Gerhart, 1981; Cooke, 1986). Quando ovos fecundados são inclinados dessa maneira por trinta minutos, partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem, o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embriões iniciam a gastrulação no mesmo lado da entrada do espermatozóide (veja Figura 6.18). A discussão precedente sugere que deve ser possível ter dois sítios de iniciação de gastrulação se houver a combinação de rotação orientada pelo espermatozóide com uma rotação do ovo artificialmente induzida. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotação inicial orientada pelo espermatozóide, mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente, de modo que o citoplasma interno se movesse para o ponto de entrada do espermatozóide. Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em água normal, apareceram dois sítios de gastrulação, levando ao aparecimento de larvas gêmeas ligadas (Figura 6.19). A hipótese de Black e Gerhart (1986) é que tal produção de gêmeos é causada pela formação de duas áreas de interação: um eixo se forma onde a rotação cortical normal deu origem às interações citoplasmáticas no pólo vegetal da célula; o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugação interage com os componentes do pólo vegetal. Gêmeos também podem ser produzidos em gravidade normal, colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozóide voltado para cima, após remover o envoltório de fertilização (Gerhart et al., 1981). A possibilidade de se obter dois lábios funcionais dos blastóporos também sugere que não há nada especial a respeito do crescente cinzento, onde se observa pela primeira vez o início da gastrulação. Na verdade, os fatores indutores da gastrulação parecem ser criados pelas interações dos citoplasmas animal e vegetal, interações essas que, provavelmente, ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma série de experimentos de transplante que confirmaram

Normal
Porcentagem de embriões

Girada

Ângulo do lábio do blastóporo do ponto de entrada de espermatozóide

Figura 6.18

Relação entre o ponto da entrada do espermatozóide e o lábio dorsal do blastóporo em ovos de rã normais e naqueles que sofreram rotação. Ovos de Xenopus foram fertilizados, desgeleificados e colocados em Ficoll para desidratar o espaço perivitelino. A entrada do espermatozóide foi marcada com corante. Os ovos sofreram rotação, foram inclinados em 900, com o ponto de entrada do espermatozóide virado para cima, 50-80 minutos após a fertilização. (Segundo Gerhart et al., 1981.)

226

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

Figura 6.19

Blastóporos gêmeos produzidos pela rotação de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do espermatozóide), no momento da primeira clivagem. (A) Dois blastóporos são instruídos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozóide) e o novo, criado pelo deslocamento de material citoplasmático. (B) Esses ovos desenvolvem dois eixos completos, que formam girinos gêmeos, ligados ventralmente. (Cortesia de J. Gerhart.)

a hipótese de que os fatores que iniciam a gastrulação originalmente estão no citoplasma profundo das células vegetativas dorsais, e não no crescente cinzento. Eles demonstraram que em um embrião de Xenopus, no estágio de 64 células, os três blastômeros vegetais mais dorsais são capazes de induzir a formação do lábio dorsal do blastóporo e de um eixo dorsal completo em embriões hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que, de outra maneira, não seriam capazes de iniciar a gastrulação; Figura 6.20A). Além disso, esses três blastômeros, situados abaixo da região do prospectivo lábio dorsal, podem também induzir uma invaginação secundária e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrião normal, no estágio de 64 células, não irradiado (Figura 6.20B). Esse pequeno grupo de blastômeros vegetais permite a invaginação de células marginais adjacentes e a formação do eixo mesodérmico dorsal do embrião. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical, das células vegetativas dorsais do embrião de Xenopus, no estágio de 64 células, era capaz de induzir a formação de eixos secundários quando injetado em células vegetativas ventrais. Nem o citoplasma cortical de células animais e nem o citoplasma profundo das células ventrais puderam induzir esses eixos. Parece, então, que os rearranjos internos do citoplasma, provavelmente orientados pela entrada do espermatozóide, são responsáveis pela distribuição assimétrica de fatores subcelulares. Essa assimetria cria uma distinção dorsoventral no ovo que, em última instância, dirige o posicionamento do blastóporo acima de um conjunto de blastômeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. As moléculas que podem estar envolvidas na formação do sítio vegetal de iniciação da gastrulação (o “centro de Nieuwkoop”) serão discutidas no Capítulo 15. Movimentos celulares e a construção do arquêntero
O INÍCIO DA GASTRULAÇÃO. A gastrulação em anfíbios é iniciada quando um

grupo de células endodérmicas marginais, na superfície dorsal da blástula, penetra no interior do embrião. As superfícies externas (apicais) dessas células se contraem dramaticamente, enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. O comprimento apical-basal dessas células aumenta bastante, originando a forma característica de “garrafa”. Na salamandra, essas células parecem ter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulação. Johannes Holtfreter (1943, 1944) observou que as células garrafa de gástrulas precoces de salamandra poderiam aderir às lamínulas de vidro e guiar o movimento das células ligadas a elas. Até mais convincentes foram os experimentos

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

227

(A) Ponto de entrada do espermatozóide DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL

(B) RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozóide

Ponto de entrada do espermatozóide

UV Sem transplante

Transplante

Peça embrionária ventral carente de eixo corporal

Novo local de gastrulação e forma de eixo corporal

Figura 6.20

de recombinação de Holtfreter, nos quais células da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lábio dorsal do blastóporo) foram combinadas com o tecido endodérmico interno. Quando as células da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodérmico interno, as células precursoras do blastóporo formaram células garrafas e se aprofundaram abaixo da superfície do endoderma interno (Figura 6.21). Mais ainda, ao se aprofundarem, criaram uma depressão reminiscente do blastóporo precoce. Sendo assim, Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma é uma propriedade inata das células da zona marginal dorsal.

Experimentos de transplante demonstrando que as células vegetativas, abaixo das regiões do futuro lábio dorsal do blastóporo, são responsáveis pelo início da gastrulação. (A) Salvamento de embriões irradiados pelo transplante de blastômeros do segmento mais dorsal (cor) de um embrião, no estágio de 64 células, para uma cavidade criada pela remoção de um número semelhante de células vegetais. Um zigoto irradiado sem tal transplante não sofre gastrulação normal. (B) Formação de um novo local para gastrulação e eixo corporal pelo transplante das células vegetativas, mais dorsais, de um embrião de 64 células, para região vegetal mais ventral, de outro embrião de 64 células. (Segundo Gimlich e Gerhart, 1984.)

Implante

Células endodérmicas

Sulco no blastóporo

Figura 6.21

Um implante de células de anfíbios da região do lábio dorsal do blastóporo submerge para dentro de uma camada de células endodérmicas e forma um sulco do blastóporo. (Segundo Holtfreter, 1944.)

228

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

A situação no embrião da rã é um pouco diferente. R. E. Keller e seus orientados (Keller, 1981; Hardin e Keller, 1988) mostraram que apesar das células garrafa terem um papel na iniciação da involução da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa, elas não são essenciais para a continuação da gastrulação. A forma peculiar de garrafa dessas células é necessária para iniciar a gastrulação; é a constrição das células que puxa a zona marginal na direção vegetativa, enquanto empurra as células vegetativas para dentro (Figura 6.22 A,B). O estiramento da zona marginal permite a expansão do ectoderma em direção ao pólo vegetal e o envolvimento do embrião; empurrar as células vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de
(A) Endoderma Intercalação radial de células profundas Células marginais superficiais Célulasgarrafa Futuro mesoderma anterior Lábio dorsal do blastóporo Blastóporo Morfologia de mudanças das células profundas Células garrafa (E) Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Células garrafa re-espalhadas IMZ superficial movendo-se em direção do pólo animal Endoderma Intercalação medianolateral (F) Ectoderma Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Pólo animal Blastocele O lábio se extende lateral e vegetalmente (B) (C) (D) Células marginais profundas Células garrafa

Futuro mesoderma posterior

IMZ profunda

Figure 6.22

Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulação precoce de Xenopus. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulação. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. (B) Constrição das células garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. (D) Ocorre intercalação radial (interdigitação) das células profundas da IMZ. O mesoderma move-se na direção ao pólo animal, arrastando as células superficiais e as células garrafa por involução. (E) À medida que continua a gastrulação, as células marginais profundas se achatam, e as células previamente superficiais formam a parede do arquêntero. (F) Intercalação como em (D), olhando da superfície dorsal para baixo em direção do lábio dorsal do blastóporo. Na NIMZ (zona marginal não involutiva) e parte superior da IMZ, células profundas (mesodérmicas) estão se intercalando radialmente, configurando uma fita estreita de células achatadas. Esse estreitamento de várias camadas em poucas outras causa extensão na direção lábio do blastóporo. Imediatamente acima do lábio, intercalação medianolateral das células produz tensões que arrastam a IMZ por cima do lábio, a intercalação medianolateral continua, alongando e estreitando o mesoderma axial. (Segundo Hardin e Keller, 1988; Wilson e Keller, 1991.)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

229

baixo dos precursores mesodérmicos posteriores e começar a migrar no teto da blastocele (Hardin e Keller, 1988). Entretanto, após começar esses movimentos, as células garrafa do Xenopus não são mais necessárias. Quando as células garrafa são removidas após sua formação, a involução, a formação do blastóporo e o fechamento continuam. O fator principal no movimento das células para dentro do embrião parece ser a involução das células marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Parece que essas células subsuperficiais ou células da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direção ao pólo animal, ao longo das superfícies internas das células profundas remanescentes (Figura 6.22C-E), e que a camada superficial forma o revestimento do arquêntero unicamente porque ela está ligada às células profundas, que estão migrando ativamente. O movimento das células garrafa mais profundamente dentro do embrião depende da sua ligação às células profundas subjacentes. A remoção das células garrafa não afeta a involução das células profundas ou das células superficiais da zona marginal para dentro do embrião, mas a remoção das células marginais dorsais profundas e sua substituição por células do hemisfério animal (que normalmente não sofrem involução) interrompe a formação do arquêntero.
A FORMAÇÃO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAÇÃO DE XENOPUS

A Figura 6.22 (D-F) esboça o comportamento dessas células da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estágios da gastrulação em Xenopus (Keller e Schoenwolf, 1977; Keller, 1980, 1981; Hardin e Keller, 1988). Pouco antes de sua involução através do lábio do blastóporo, as várias camadas de células IMZ profundas se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. Essa intercalação estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Ao mesmo tempo, as células superficiais se espalham se dividindo e achatando. Quando as células profundas atingem o lábio do blastóporo, elas involuem para dentro do embrião e iniciam um segundo tipo de intercalação. Essa intercalação causa uma extensão convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6.22F) que integra várias correntes mesodérmicas para formar um longa e estreita banda. A parte anterior dessa banda migra em direção ao hemisfério animal. Assim a corrente mesodérmica continua a migrar em direção ao pólo animal e a camada superposta de células superficiais (incluindo as células garrafa) são passivamente puxadas em direção ao hemisfério animal, formando o teto do arquêntero (Figuras 6.15 e 6.22E). Portanto, ainda que as células garrafa possam ser responsáveis pela indentação inicial, a força motivadora para essa involução parece vir da camada profunda de células marginais. Mais ainda, a intercalação radial e mediolateral da camada de células profundas parece ser responsável pelo movimento contínuo do mesoderma para dentro do embrião. Migração do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodérmicos, a expansão convergente também continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. A IMZ contém o prospectivo teto endodérmico do arquêntero na sua camada superficial (IMZS) e as prospectivas células mesodérmicas, incluindo aquelas da notocorda na sua região profunda (IMZD). Durante o terço médio da gastrulação, a lâmina em expansão do mesoderma converge em direção à linha mediana do embrião. Esse processo é dirigido pela contínua intercalação mediolateral de células ao longo do eixo ântero-posterior, estreitando ainda mais a banda. No fim da gastrulação, a notocorda localizada centralmente se separa do mesoderma somítico em ambos os lados, e as células sofrem elongação separadamente (Wilson e Keller, 1991). Essa extensão convergente do mesoderma parece ser autônoma, porque os movimentos dessas células ocorrem mesmo se essa região do embrião é isolada do resto (Keller, 1986). Durante a gastrulação, o pólo animal e as células da zona marginal não-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrião. A porção dorsal das células marginais não-involutivas expande-se mais rapidamente que a porção ventral,

230

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

assim, causando o movimento dos lábios do blastóporo em direção ao lado ventral. Enquanto essas células mesodérmicas, entrando através do lábio dorsal do blastóporo, dão origem ao mesoderma dorsal axial, o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o coração, os rins, sangue, ossos e partes de vários outros órgãos) entra através dos lábios ventral e lateral para criar o manto mesodérmico. O endoderma é derivado das células da IMZS que formam o revestimento do teto do arquêntero e das células vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquêntero (Keller, 1986).

Informações adicionais

&

Especulações

Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica

C

omo é que as células involutivas são informadas para aonde ir, uma vez que se encontram no interior do embrião? Na salamandra, parece que os precursores mesodérmicos involutivos migram em direção ao pólo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas células do teto da blastocele. Pouco antes da gastrulação, o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz extracelular que contém fibrilas de fibronec-

Figura 6.23

Fibronectinas e gastrulação de anfíbio. (A) Imunofluorescência revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfície basal de prospectivas células ectodérmicas forrando o teto da blastocele do embrião da salamandra. (B-E) Micrografias ao microscópio eletrônico de varredura de gastrulação normal (B,C) e anormal (D,E) da salamandra. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante à célula de fibronectina, enquanto a blástula gastrulando normalmente foi injetada com a solução controle. (B) Seção durante gastrulação intermediária. (C) O obturador do vitelo ao fim da gastrulação. (D,E) Os estágios finais da gastrulação detida, onde os precursores mesodérmicos, tendo fixado à fibronectina sintética, não conseguem reconhecer a via de migração normal forrada de fibronectina. O arquêntero não se forma, e os precursores nãoinvoluídos do mesoderma permanecem na superfície. (ar, arquêntero; bc, blastocele; bl, blastóporo; ec, ectoderma; en, endoderma; mes, mesoderma; yp, obturador do vitelo.) (A de Boucaut et al., 1985; B-E de Boucaut et al., 1984, cortesia de J. C. Boucaut e J.-P. Thiery.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

231

tina (Figura 6.23A; Boucaut et al., 1984; Nakatsuji et al., 1985). O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. Isso foi confirmado pela síntese química de uma “falsa” fibronectina que pode competir com a genuína da matriz extracelular. Células se ligam a uma certa região da proteína fibronectina que contém uma seqüência de três aminoácidos (Arg-Gly-Asp; RGD). Boucaut e colaboradores injetaram grandes quantidades de um pequeno peptídio contendo essa seqüência na blastocele de embriões de salamandra, pouco antes do início da gastrulação. Se a fibronectina fosse essencial para a migração celular, então as células ligadas a esse fragmento solúvel de peptídio, em lugar da fibronectina real ligante de células, deveriam parar. Impossibilitadas de encontrar sua “estrada”, as células mesodérmicas deveriam cessar sua involução. Isso é precisamente o que ocorreu (Figura 6.23B-E). Não foram vistas células migratórias ao longo do lado de baixo do ectoderma. Em vez disso, os precursores mesodérmicos permaneceram fora do embrião, formando uma massa celular convoluta. Outros pequenos peptídios sintéticos (incluindo outros fragmentos da molécula de fibronectina) não impediram a migração. Considera-se que as células mesodérmicas aderem à fibronectina através da αvβ1 proteína integrina (Alfandari et al., 1995). A migração mesodérmica pode ser também interrompida pela microinjeção de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade β1 de integrina que funciona como parte do receptor de fibronectina (D’Arribère et al., 1988, 1990). Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo após a fecundação, a subunidade αv da integrina é progressivamente perdida das membranas das células do blastômero. Entretanto, pouco antes e durante a gastrulação, a subunidade αv é expressa na superfície das células mesodérmicas migratórias. Parece então, que a síntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma começar e continuar a migração. A matriz extracelular contendo fibronectina, permite a ligação das células mesodérmicas à rede de fibronectina e, além disso, parece fornecer sinais para a direção da migração celular. Shi e colegas (1989) removeram os tetos da blasto-

cele de gástrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plástico com suas matrizes extracelulares tocando o plástico (Figura 6.24A). O eixo do blastóporo ao pólo animal foi marcado e, após 2 horas, o explante foi removido, deixando sua matriz extracelular. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removido de outra gástrula precoce e colocado sobre a matriz com seu próprio eixo blastóporo-pólo animal, perpendicular àquele da matriz. Seria possível às células desse explante migrarem na matriz, e se migrassem o fariam em uma direção particular? Foi verificado que as células migraram, e que a migração podia ser inibida por anticorpos que impedem que a célula

(A) Pólo animal

reconheça a fibronectina. Além disso, as células das DMZ não migraram ao acaso, mas migraram em direção ao pólo animal da matriz extracelular que havia sido absorvida no plástico (Figura 6.24B). Em Xenopus, a extensão convergente empurra as células migratórias para cima, em direção ao pólo animal. Entretanto, a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos podem ocorrer. A fibronectina das gástrulas de Xenopus não forma grades complexas, mas se organiza em pequenos aglomerados fibrilares. Se a fibronectina for sintetizada mas não organizada nessas fibrilas, as células mesodérmicas dorsais vão aderir à superfície basal do ectoderma presuntivo, mas não migrarão (Winklbauer e Nagel, 1991). As fibrilas de fibronectina são necessárias para que as células mesodérmicas da cabeça se achatem e estendam largos processos (lameliformes) na direção da migração (Winklbauer et al., 1991; Winklbauer e Keller, 1996). A importância dessas fibrilas de fibronectina é também vista em híbridos interespecíficos que se detém na gastrulação. Delarue e colegas (1985) mostraram que certos híbridos inviáveis, entre duas espécies de sapos, morrem durante a gastrulação porque não secretam essas fibrilas de fibronectina. Parece então, que a matriz extracelular do teto da blastocele, e particularmente seu componente fibronectina, é importante na migração das células mesodérmicas durante a gastrulação em anfíbios.

Figura 6.24

(B)

AP

A direção da migração das células da zona marginal dorsal (DMZ) depende da orientação da matriz extracelular do teto da blastocele. (A) Explantes do teto da blastocele do blastóforo (BP) para o pólo animal (AP) foram dissecados de embriões de salamandra em estágio precoce de gastrulação e colocados em placas plásticas. A matriz extracelular aderiu à placa, e o tecido foi então removido. Um explante menor de uma gástrula precoce, contendo células da DMZ, foi então colocado sobre essa matriz, com o seu próprio eixo perpendicular aquele da matriz. (B) Células da DMZ do explante migraram para o pólo animal da matriz. A linha pontilhada indica a borda original do explante, e a flecha branca representa seu eixo blastóporo-pólo animal. (de Shi et al., 1989, fotografia cortesia dos autores.)

232

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Epibolia do ectoderma Enquanto a involução está ocorrendo no lábios do blastóporo, os precursores ectodérmicos estão se expandindo sobre todo o embrião. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrônica de varredura para observar as modificações tanto nas células superficiais como nas células profundas das regiões animal e marginal. O mecanismo principal de epibolia na gastrulação do Xenopus parece ser um aumento no número de células (através de divisão), acoplado a uma concomitante integração de várias camadas profundas em uma só (Figura 6.25). Durante a gastrulação precoce, três rodadas de divisão celular aumentam o número de camadas de células profundas no hemisfério animal. Ao mesmo tempo, completa integração de numerosas células profundas em uma camada também ocorre. A camada mais superficial se expande por divisão e achatamento celular. O espalhamento de células nas zonas marginais dorsal e ventral, se dá provavelmente pelo mesmo mecanismo, ainda que mudanças na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfério animal. O resultado dessas expansões é a epibolia das células superficiais e profundas do pólo animal e regiões marginais não involutivas sobre a superfície do embrião (Keller e Danilchik, 1988). A maior parte das células da região marginal, como mencionado anteriormente, involuem para se juntar à corrente de células mesodérmicas dentro do embrião. Gastrulação no Xenopus é uma orquestração de vários eventos distintos. A primeira indicação de gastrulação envolve a invaginação local das células garrafa do endoderma na zona marginal, em tempo e lugar precisamente definidos. Em seguida, a involução das células marginais através do lábio do blastóporo, começa a formação do arquêntero. Essas células involutivas, na margem anterior do manto mesodérmico, migram ao longo da superfície interna do teto do blastóporo, e o prospectivo cordomesoderma atrás delas, se estreita e se alonga posteriormente, por extensão convergente, na porção dorsal do embrião. Ao mesmo tempo, as células precursoras ectodérmicas epibolizam vegetalmente por divisão celular e pela integração de camadas celulares previamente independentes. O resultado desses movimentos celulares é o posicionamento adequado das três camadas germinativas em preparação para sua diferenciação em órgãos do corpo. Estudos moleculares (a serem discutidos no Capítulo 15) estão começando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as células são informadas de como começar e finalizar essas migrações

Estágio

Figura 6.25

Micrografias eletrônicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus, mostrando as mudanças na forma e arranjo das células. Os estágios 8 e 9 são de blástula; estágios 10-11.5 representam gástrulas progressivamente mais avançadas. (de Keller, 1980, cortesias de R. E. Keller.)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

233

Gastrulação em aves
Generalidades sobre gastrulação em aves A clivagem em embrião de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impõe várias restrições aos movimentos celulares, e a gastrulação em aves parece, à primeira vista, ser muito diferente daquela do ouriço-do-mar ou da rã. Realmente, logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulação em aves e as gastrulações que já estudamos. Além disso, veremos que embriões de mamíferos - que não tem vitelo- retém movimentos de gastrulação muito parecidos com aqueles dos embriões de aves e répteis.
FORMAÇÃO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. As células centrais do blastodisco das aves são separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras - por isso, o centro do blastodisco é chamado de área pelúcida. Em contraste, as células da margem da área pelúcida parecem opacas, devido a seu contato com o vitelo, formam a área opaca (Figura 6.26). Enquanto a maioria das células permanece na superfície formando o epiblasto, certas células migram individualmente para a cavidade subgerminativa, para formar as ilhas de polinvaginação (hipoblasto primário), um arquipélago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 células (veja Figuras 6.26 e 5.33). Pouco tempo depois, uma lâmina de células da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrás dele) migra em direção anterior para se juntar às ilhas de polinvaginação e formar o hipoblasto secundário (Eyal-Giladi et al.,1992). O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da área opaca, e o espaço entre as camadas é uma blastocele. Assim, a estrutura do blastodisco das aves não é diferente da blástula de anfíbios ou equinodermos.

Blastoderma Epiblasto

Anterior

Zona marginal posterior

Área opaca Espaço subgerminativo Vitelo Células do hipoblasto delaminando-se do epiblasto Área pelúcida

Figura 6.26

Área opaca

Área opaca

Epiblasto

Blastocele

Células do hipoblasto migrando de células profundas da região posterior

Formação do blastoderma de duas camadas do embrião da galinha. As primeiras células hipoblásticas delaminam individualmente, para formar ilhas de células sob o epiblasto. Células da margem posterior (células de foice de Koller e células marginais posteriores) produzem uma população de células que migra abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas poli-invaginadas. Essa camada inferior tornase o hipoblasto. A camada superior é o epiblasto. À medida que o hipoblasto se move no sentido anterior, células do epiblasto se agregam na região anterior à foice de Koller para formar a linha primitiva.

234

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

O mapa de destino para o embrião de aves é restrito ao epiblasto. Ou seja, o hipoblasto não contribui com células para o embrião em desenvolvimento (Rosenquist, 1966, 1972). Em lugar disso, as células do hipoblasto formam porções da membrana externa, especialmente o saco vitelínico e o pedúnculo, que liga a massa do vitelo ao tubo digestivo endodérmico. Todas as três camadas germinativas do embrião propriamente dito (mais uma quantidade considerável de membrana extra-embrionária) são formadas das células epiblásticas. Mapas de destino de epiblasto de galinha estão representados na Figura 6.27. Esses mapas integram vários tipos de mapeamento. Corantes vitais e transplantes de células radioativas foram úteis no mapeamento de tendências prioritárias, pois com esses métodos se marcam grupos de células que se difundem ao prosseguir o desenvolvimento. Transplantar células marcadas geneticamente, tais como células de codorna colocadas em embriões de galinha, contornou o problema de difusão, mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de células. Recentemente, o uso de vírus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesquisadores acompanhar células individuais através do desenvolvimento (Schoenwolf, 1991). Como pode ser visto nessas figuras, existe uma significante extensão convergente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. Mesmo que células em uma região específica da gástrula tendam a se transformarem em tipos específicos de células, elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra região do embrião.
FORMAÇÃO DA LINHA PRIMITIVA. A estrutura majoritária característica da gas-

trulação em aves, répteis e mamíferos é a linha primitiva. Essa linha é visível inicialmente como um espessamento de uma camada de células do epiblasto, na região posterior do embrião, imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6.27A). Esse espessamento é causado pelo ingresso de células mesodérmicas do epiblasto para dentro da blastocele, e pela migração de células da região lateral do epiblasto posterior em direção ao centro (Figura 6.27B; Vakaet, 1984; Bellairs, 1986; Eyal-Giladi et al., 1992). À medida que a área espessada se estreita, ela se move anteriormente e se contrai para formar a linha primitiva definitiva. Essa linha se estende em 60-75% do comprimento da área pelúcida e marca o eixo ântero-posterior do embrião (Figura 6.27C-E). Enquanto as células convergem para formar a linha primitiva, se forma uma depressão na linha. Essa depressão é chamada fenda primitiva, e serve como um blastóporo, através do qual as células migratórias passam para a blastocele. Assim, a fenda primitiva é análoga ao blastóporo de anfíbios. Na ponta anterior da linha primitiva há um espessamento regional de células chamado nódulo primitivo ou nódulo de Hensen. O centro desse nódulo contém uma depressão em forma de funil (algumas vezes chamada cova primitiva), através da qual as células passam para a blastocele. O nódulo de Hensen é o equivalente funcional do lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. [gast1.html] Tão logo se forma a linha primitiva, as células do epiblasto começam a migrar sobre os lábios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6.28). De maneira similar ao blastóporo de anfíbios, a linha primitiva tem uma população celular se modificando constantemente. Células migrando através do nódulo de Hensen passam para dentro da blastocele, migram anteriormente formando o intestino anterior, o mesoderma da cabeça e a notocorda; células passando através das porções laterais da linha primitiva dão origem à maioria dos tecidos endodérmicos e mesodérmicos (Schoenwolf et al., 1992). Em contraste com o mesoderma de Xenopus, o qual migra como lâminas de células para a blastocele, células entrando no embrião de aves o fazem individualmente. Em lugar de formar uma lâmina de células fortemente organizadas, a população ingressante cria um mesênquima fracamente conectado. Além disso, não se forma um verdadeiro arquêntero na gástrula de aves. Enquanto as células entram na linha primitiva, essa se estende na direção da futura região da cabeça. Ao mesmo tempo, as células do hipoblasto secundário estão continuando a migrar da margem posterior do blastoderma, na direção anterior. A elongação

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

235

(A)

Anterior

(B) Área opaca

(I) Ectoderma

Endoderma Mesoderma Axial Paraxial (vértebras, rins, musculatura) Placa lateral (incluindo o coração) Extra-embrionária

Área pelúcida Área de engrossamento do blastoderma Área opaca Área pelúcida

Posterior (C)

(D) (J)

Linha primitiva tomando forma (E) Nódulo de Hensen Área pelúcida Área opaca Anterior Processo cefálico (F) (K)

Figura 6.27

Nódulo de Hensen Sulco primitivo

(G)

Borda anterior do mesoderma

Ectoderma da dobra cefálica Dobra neural Somito Notocorda

(H)

Dobra cefálica Intestino anterior

Movimentos celulares da linha primitiva do embrião de galinha. (A-E) Visão dorsal da formação e alongamento da linha primitiva. O blastoderma é visto em (A) 3-4 horas, (B) 5-6 horas, (C) 7-8 horas, (D) 10-12 horas e (E) 1516 horas. O movimento precoce das células epiblásticas HNK-1+ é mostrado por flechas. (F-H) A formação da notocorda e somitos mesodérmicos à medida que a linha primitiva regride é mostrada em (F) 19-22 horas, (G) 23-24 horas e (H) no estágio de quatro somitos. (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois estágios da gastrulação. Extensão convergente é mostrada na linha mediana, e as células precursoras endodérmicas ingressam mais rapidamente que as células precursoras mesodérmicas. (Adaptado de várias fontes, especialmente Spratt, 1946, e Balinsky, 1975; I-K segundo Vakaet, 1985.)

Nódulo de Hensen

Placa segmental Linha primitiva

da linha primitiva parece ser coincidente com a migração em direção anterior dessas células do hipoblasto secundário.
MIGRAÇÃO ATRAVÉS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAÇÃO DO ENDODERMA E MESODERMA. As primeiras células a migrarem através da linha primitiva são

aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior. Essa situação, novamente, é similar àquela vista nos anfíbios. Uma vez dentro da blastocele, essas células migram anteriormente e finalmente deslocam as células do hipoblasto na porção anterior do embrião. As células hipoblásticas estão confinadas a uma região na porção anterior da área pelúcida. Essa região, o crescente germinativo, não forma estruturas

236

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 6.28

(A)

Migração de células endodérmicas e mesodérmicas através da linha primitiva. (A) Micrografia eletrônica de varredura mostra células epiblásticas passando para a blastocele, estendendo seus terminais apicais para transformarem em células garrafa. (B) Estereograma de um embrião gastrulante de galinha, mostrando a relação da linha primitiva, das células migratórias e das duas camadas originais do blastoderma. A camada inferior se transforma em um mosaico de células hipoblásticas e endodérmicas; porém, as células hipoblásticas finalmente se separam para formar uma camada abaixo daquela do endoderma e contribuem para o saco vitelínico. (A de Solursh e Revel, 1978, cortesia de M. Solursh; B segundo Balinsky, 1975.)
(B) Nódulo de Hensen

Linha primitiva

Epiblasto

Blastocele Hipoblasto Endoderma Células migratórias (mesênquima)

embrionárias, mas contém os precursores das células germinativas, que mais tarde migram através dos vasos sangüíneos até as gônadas. As próximas células que entram na blastocele através do nódulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha primitiva) também se movem anteriormente, mas não se movem tão ventralmente como as células presuntivas endodérmicas do intestino anterior. Essas células permanecem entre o endoderma e o epiblasto para formar as células do mesoderma da cabeça e do cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern, 1996). Essas células de ingresso precoce se moveram todas anteriormente, empurrando para cima a região medianoanterior do hipoblasto, a fim de formar o processo cefálico (Figura 6.29). Enquanto isso, as células continuam a migrar para dentro, através da porção lateral da linha primitiva. Quando entram na blastocele, essas células se separam em duas correntes. Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua região mediana, deslocando as células hipoblásticas para os lados. Essas células de movimento profundo dão origem a todos os órgãos endodérmicos do embrião, assim como a maioria das membranas extra-embrionárias (o hipoblasto forma o restante). A segunda corrente migratória se espalha através da blastocele como uma camada frouxa, mais ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. Essa camada origina as porções mesodérmicas do embrião e das membranas extra-embrionárias. Após 22 horas de incubação, a maior parte das células presuntivas endodérmicas estão no interior do embrião, apesar das células presuntivas mesodérmicas continuarem a migrar para o interior por um tempo mais longo.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

237

Endoderma faríngeo Processo cefálico (notocorda anterior)

Ilhas de sangue

Dobra cefálica

Intestino anterior Sulco neural

Nódulo de Hensen Linha primitiva Área pelúcida

Somito

Linha primitiva Área opaca (A) (B) (C)

Linha de referência

Regr es da li s ã o p r i m nha itiva

Borda posterior da área pelúcida

Horas (D) (E)

Figura 6.29

Agora começa uma nova fase da gastrulação. Enquanto continua o ingresso do mesoderma, a linha primitiva começa a regredir, movendo o nódulo de Hensen de uma posição próxima do centro da área pelúcida, para uma posição mais posterior (veja Figura 6.29). Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrião e o processo cefálico. Ao mesmo tempo que o nódulo avança posteriormente, a porção remanescente (posterior) da notocorda é estabelecida. Finalmente, o nódulo regride para sua posição mais posterior, formando a região anal. Nesse ponto, o epiblasto é composto inteiramente de células ectodérmicas presuntivas. Como uma conseqüência desse processo de gastrulação em duas etapas, os embriões de aves (e mamíferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvolvimento ântero-posterior. Enquanto células das porções posteriores do embrião estão gastrulando, células da porção anterior já estão começando a formar órgãos. Pelos próximos dias, a ponta anterior estará mais avançada no seu desenvolvimento (podese dizer que teve uma “vantagem” inicial) do que a porção posterior. Enquanto as células presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para dentro, os precursores ectodérmicos proliferavam para se tornar a única população de células remanescente na camada superior. Ainda mais, células ectodérmicas migraram para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia. O enclausuramento do vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfíbios) é uma tarefa de Hércules, que dura 4 dias para ser completada e envolve a produção contínua de novo

Gastrulação do embrião de galinha de aproximadamente 24 até perto de 28 horas. (A) A linha primitiva totalmente estendida (24 horas). O processo cefálico (notocorda anterior) pode ser visto estendendo-se a partir do nódulo de Hensen. (B) Estágio de dois somitos (25 horas). Anteriormente vê-se o endoderma faríngeo, enquanto a notocorda anterior empurra para cima o processo cefálico que estava embaixo. A linha primitiva está regredindo. (C) Estágio de quatro somitos (27 horas). (D) Após 28 horas, a linha primitiva regrediu até a porção caudal do embrião. (E) Regressão da linha primitiva, deixando a notocorda em seu rastro. Vários pontos da linha foram acompanhados após atingir seu comprimento máximo. O tempo representa as horas decorridas após atingir o comprimento máximo em aproximadamente 18 horas. (Fotografias cortesia de K. Linask; E segundo Spratt, 1947.)

Alongamento da notocorda

238

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

material celular e a migração das células ectodérmicas presuntivas ao longo da superfície inferior do envoltório vitelínico. Assim, chegando ao fim da gastrulação em aves, o ectoderma envolveu o vitelo, o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma se posicionou entre essas duas regiões. Mecanismos de gastrulação em aves
O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAÇÃO DOS EIXOS EMBRIONÁRIOS. O eixo dorso-ventral (costa-frente) é crítico para a formação do hipoblasto e para o contínuo desenvolvimento do embrião. Esse eixo é estabelecido quando as células em clivagem do blastoderma, produzem uma barreira entre a albumina básica (pH 9.5) acima do blastodisco e o espaço subgerminativo ácido (pH 6.5), abaixo do disco. Água e íons de sódio são transportados da albumina através das células para dentro do espaço subgerminativo criando uma diferença de potencial de membrana de 25 mV através da camada de células (positivo no lado ventral das células). Isso cria dois lados para as células: um lado frente à albumina negativa e básica, e outro lado frente ao fluido do espaço subgerminativo positivo e ácido. O lado frente à albumina se torna o dorsal, e aquele frente ao espaço subgerminativo se torna o ventral. Isso pode ser revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferença de potencial através da camada de células (revisão em Stern e Canning, 1988). A conversão de um blastoderma radialmente simétrico em uma estrutura simétrica bilateral é determinada pela gravidade. Enquanto o óvulo rola oviduto abaixo, ele gira a uma velocidade de 10 a 15 revoluções por hora. O citoplasma que deverá se tornar a camada celular está sempre girando para baixo, mas é deslocado para cima pelo vitelo mais denso. Portanto, não está em cima do vitelo, mas um pouco deslocado para o lado. A porção mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do blastoderma, a parte onde começa a gastrulação (Kochav e Eyal-Giladi, 1971). Assim, os eixos ântero-posterior e dorsolateral são determinados antes da gastrulação, enquanto o óvulo está lentamente rolando oviduto abaixo. O blastoderma do embrião de galinha age como um sistema único integrado para formar um único embrião; se o blastoderma é separado em partes, cada uma tendo sua zona marginal, cada parte vai formar seu próprio embrião (Spratt e Haas, 1960). O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior, a região onde começa a formação do hipoblasto. Essas células marginais posteriores não só contribuem com as células indutoras do hipoblasto, como também impedem que outras regiões marginais induzam seus hipoblastos. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram que na transposição da zona marginal posterior para uma área marginal lateral (Figura 6.30A), o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem. Similarmente, se uma região posterior é reciprocamente transposta com uma região lateral (Figura 6.30B), somente se forma uma linha primitiva e ela provém da região posterior original. Entretanto, se uma zona marginal posterior é colocada em um embrião que retém sua margem posterior original (Figura 6.30C), somente a margem posterior original do hospedeiro forma o hipoblasto que está subjacente à linha primitiva. Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as células da zona marginal formam um gradiente de atividade cujo pico está na ponta posterior. As células posteriores formarão o hipoblasto e, ao mesmo tempo, evitarão que qualquer célula, com menos atividade, forme hipoblastos próprios.*

*Pesquisadores anteriores (Waddington, 1932; Azar e Eyal-Giladi, 1981) consideravam que o hipoblasto induzia à formação da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade ânteroposterior. Entretanto, Khaner (1995) girou o epiblasto com relação ao hipoblasto, em diferentes estágios do desenvolvimento da galinha, e mostrou que o epiblasto inicia a formação da linha primitiva e mantém sua polaridade independentemente da orientação do hipoblasto.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

239

EXPERIMENTO (A) Anterior Zona marginal Área opaca Epiblasto

RESULTADOS

INTERPRETAÇÃO

Posterior (B)

Cicatriz

Linhas primitivas

(C)

Figura 6.30

ACUMULAÇÃO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. Evidências dos estudos de Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto não é um tecido homogêneo, nãodiferenciado, como foi assumido por muito tempo. Pelo contrário, parece haver diferenciação nas células epiblásticas mesmo antes que a formação da linha primitiva se inicie. Esses estudos mostram que certas células, dispersas ao acaso no epiblasto, podem ser distinguidas por uma molécula específica na superfície celular (HNK-1, uma forma sulfatada do ácido glucurônico). As células expressando HNK-1 ingressam individualmente na blastocele e migram para a região posterior. É provável que o tecido marginal posterior secrete uma substância que atrai as células que expressam HNK-1, enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molécula repelente (Jephcott e Stern, citado em Stern, 1991). As células expressando HNK-1, que se juntam na margem posterior, produzirão o endoderma e o mesoderma, e nenhuma célula expressando HNK-1 formará derivados ectodérmicos. Se as células HNK-1 são seletivamente destruídas (por anticorpos), enquanto ainda estão no epiblasto, o embrião não formará mesoderma nem endoderma. Essas células HNK-1 positivas interagem com as células do epiblasto acima delas, para formar o rudimento inicial da linha primitiva. Esse rudimento de linha sofre um processo de extensão convergente que o estreita e alonga. Quando a linha chega ao seu comprimento quase total, as

Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi demonstrando que a porção posterior da zona marginal (PMZ) contribui para as células indutoras da linha primitiva do hipoblasto e impedem outras regiões marginais de criarem seus próprios hipoblastos. (Segundo Khaner e Eyal-Giladi, 1989.)

240

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

células HNK-1 positivas dissolvem a lâmina basal do epiblasto central para formar uma canal através da linha primitiva. Isso permite que células do epiblasto (que nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que está se estendendo anteriomente e, assim, contribuir (junto com as células HNK-1 positivas) para os mesoderma e endoderma embrionários. Movimento dentro da blastocele amniota é feito por células individuais, e não por uma camada epitelial. Mas, como na gastrulação de anfíbios, células de aves passando pelo blastóporo sofrem uma constrição no seu terminal apical e se tornam células garrafa (Figura 6.28). Na ponta anterior do canal, nódulo de Hensen, a destruição da lâmina basal e a liberação dessas células do epiblasto pode ser realizada por uma proteína de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al., 1990). O fator de espalhamento é secretado somente no nódulo de Hensen, e tem sido implicado na dissociação de células nessa região e na indução do tecido neural a partir do epiblasto, na vizinhança do nódulo (Streit et al., 1995). Quando se implantam resinas contendo o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embriões de galinha, em gastrulação precoce, novas regiões da linha primitiva podem ser induzidas. O fator de espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em células adjacentes, e agindo através da cascata da proteína G, fosforila as β-cateninas que ancoram as E-caderinas à membrana celular (Hartmann et al., 1994). Na ausência de E-caderina funcional, a lâmina epitelial se desmonta naquela região e as células se tornam mesênquima. As células, uma vez liberadas da linha primitiva, entram na blastocele, são achatadas e passam a fazer parte de uma corrente de células migratórias independentes. Polissacarídeos extracelulares podem também ter um papel importante nessa migração. Um desses complexos polissacarídeos é o ácido hialurônico, um polímero linear de ácido glucurônico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3.35). Esse composto é produzido pelas células ectodérmicas e se acumula na blastocele, onde reveste a superfície das células que estão chegando. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse material é digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele), as células mesenquimatosas se aglomeram e não conseguem migrar adequadamente. Muito estudos têm mostrado que o ácido hialurônico é importante para manter as células mesenquimatosas migratórias separadas umas das outras. Além disso, o ácido hialurônico começa a se acumular precisamente no momento em que as primeiras células entram na blastocele. O ácido hialurônico é capaz de manter as células separadas, provavelmente devido a sua capacidade de se expandir em água. Em ambiente aquoso, esse polímero pode expandir em até 1000 vezes o seu volume original. Portanto, o ácido hialurônico pode ser um fator importante para manter as células mesenquimatosas dispersas durante sua migração, assegurando que a migração continue. Ácido hialurônico e outros polissacarídeos facilitam a migração de células individuais (veja Capítulo 3), mas não parecem dirigir o movimento dessas células (Fisher e Solursh, 1979). Na verdade, o movimento dessas células está ligado, mais uma vez, à presença de uma rede de fibronectina na lâmina basal extracelular das células do epiblasto. Essa camada rica em fibronectina aparece na superfície inferior das células da camada de cima, pouco antes da formação da linha primitiva e desaparece na região da linha. Dentro da linha, as células se separam e migram lateralmente ao longo da membrana basal do epiblasto, rica em fibronectina (Duband e Thiery, 1982). Não existe evidência clara de que essa fibronectina é essencial para o direcionamento do movimento celular que afasta as células lateralmente da linha primitiva.
FORMAÇÃO SECUNDÁRIA DA NOTOCORDA. Enquanto a porção anterior da

notocorda é formada pelo ingresso de células através do nódulo de Hensen e a subseqüente migração anterior, a notocorda posterior é formada de maneira diferente. Após o somito 17 (da galinha), a notocorda se forma pela condensação de tecido mesodérmico que ingressou através da linha primitiva (isto é, não através do nódulo de Hensen). Isso se estende posteriormente para o “broto da cauda” do embrião (incluindo os somitos 28-50) (Le Douarin et al., 1996).

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

241

EPIBOLIA DO ECTODERMA. Durante a gastrulação, as células precursoras do ecto-

derma se expandem externamente para envolver o vitelo. Essas células estão ligadas entre si por ligações firmes e migram como uma unidade, mas não individualmente. Nas aves, a superfície superior da área opaca adere fortemente à superfície inferior do envoltório vitelínico e se espalha ao longo dessa superfície interna. O mesmo comportamento é visto em cultura de células. New (1959) demonstrou que o blastoderma isolado se estende normalmente sobre o envoltório vitelínico isolado, e Spratt (1963) demostrou que esse espalhamento não ocorre com outros substratos. Essas observações sugerem que o envoltório vitelínico é essencial para a extensão da lâmina celular. É interessante observar que somente as células marginais (isto é, as células da área opaca) se ligam firmemente à superfície vitelínica. A maioria das células blastodérmicas aderem frouxamente, quando o fazem. As células marginais são inerentemente diferentes das outras células blastodérmicas, pois podem estender longos processos citoplasmáticos (500µm) em direção ao envoltório vitelínico. Esses filopódios alongados são considerados o aparelho locomotor das células marginais. Existem várias linhas de evidência indicando que as células marginais da área opaca são os agentes da epibolia ectodérmica. Em primeiro lugar, o blastoderma se espalha somente quando as margens estão se expandindo. Se as células marginais são removidas, a epibolia do ectoderma cessa. Segundo, quando as células marginais são isoladas do resto do blastoderma, elas continuam a migrar sozinhas. Assim, parece que as células precursoras do ectoderma são levadas junto com as células ativamente migratórias da área opaca (Schlesinger, 1958). Existe também uma relação específica entre as membranas celulares das células marginais e a superfície inferior da membrana vitelínica. New (1959) mostrou que quando o blastoderma é colocado sobre o envoltório vitelínico de forma invertida (camada profunda em contato com o envoltório vitelínico), as bordas do blastoderma se curvam para dentro de modo que as células marginais da camada superior estão, mais uma vez, em contato com a superfície vitelínica (Figura 6.31). Lash e seus colaboradores (1990) expandiram esses resultados mostrando que a fibronectina está presente na superfície interna do envoltório vitelínico. Então, como no experimento discutido anteriormente, no qual Boucaut e colaboradores injetaram o composto sintético contendo a seqüência do sítio de ligação à fibronectina (RGD), na blastocele de salamandra, Lash e colegas aplicaram a seqüência RGD ao envoltório vitelínico enquanto as células migravam sobre ele. Esse tratamento quebrou especificamente o contato entre as células marginais e o envoltório vitelínico, causou retração dos filopódios das células marginais e parou a migração do blastoderma. Identificamos muitos dos processos envolvidos na gastrulação de aves, mas ignoramos como esses processos são realizados; não sabemos ainda como se forma a cavidade subgerminativa, como certas células são destinadas a se tornarem células do hipoblasto, como certas células expressam HNK-1, enquanto suas vizinhas não o fazem, como células expressando HNK-1 migram para a margem posterior e como lá interagem com as células do epiblasto, como a linha primitiva se estende e se retrai, ou como as células são designadas aos seus respectivos destinos. Recentemente, Gary
Figura 6.31

Endoderma Presuntivo (camada profundas) (A)

Ectoderma Presuntivo Envoltório Vitelínico

(B)

Propriedades migratórias dos precursores ectodérmicos de galinha. (A) Quando um blastoderma de galinha é colocado no envoltório vitelínico, com os precursores em contato com a superfície vitelínica, as células marginais migram e cobrem o envoltório vitelínico com ectoderma. (B) Quando as camadas profundas são colocadas em contato com o envoltório vitelínico, a camada blastodérmica se enrola para permitir que as células da camada superficial possam aderir e migrar sobre a camada vitelínica. O resultado é uma vesícula fechada. (Segundo New, 1959.)

242

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Schoenwolf (1991) comentou: “ A despeito de tudo que foi escrito, é certo dizer que o que sabemos sobre gastrulação e neurulação em aves é consideravelmente menos do que ainda resta conhecer”.

Gastrulação em mamíferos
Aves e mamíferos são descendentes de espécies de répteis. Portanto, não é surpreendente que o desenvolvimento de mamíferos se dá paralelamente ao dos répteis e aves. O que é surpreendente é que os movimentos de gastrulação de embriões de répteis e aves, que evoluíram como uma adaptação a ovos com vitelo, são mantidos mesmo na ausência de grandes quantidades de vitelo no embrião mamífero. A massa celular interna nos mamíferos pode ser visualizada como assentada sobre uma bola imaginária de vitelo, seguindo instruções que parecem mais apropriadas a seus ancestrais. Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo Em lugar de desenvolver-se isoladamente dentro do ovo, a maioria dos mamíferos evoluiu para uma admirável estratégia de desenvolvimento dentro da própria mãe. O embrião mamífero obtém seus nutrientes diretamente da mãe e não depende de vitelo armazenado. Essa evolução ensejou uma dramática reestruturação da anatomia materna (tal como a expansão do oviduto para formar o útero) como também o desenvolvimento de um órgão fetal capaz de absorver os nutrientes maternos. Esse órgão fetal -a placenta- é derivado primariamente de células trofoblásticas embrionárias, suplementado por células mesodérmicas derivadas da massa celular interna.

TECIDOS EMBRIONÁRIOS Ectoderma embrionário

Epiblasto embrionário

Mesoderma embrionário

Epiblasto

Linha primitiva

Massa celular interna

Ectoderma amniótico

Endoderma amniótico

Hipoblasto Blastocisto

Endoderma extra-embrionário

Envoltório vitelínico

Mesoderma extra-embrionário TECIDOS EXTRA-EMBRIONÁRIOS

Trofoblasto

Citrofoblasto

Sinciciotrofoblasto

Figura 6.32

Diagrama esquemático mostrando a derivação de tecidos de embriões humanos e do macaco rhesus. (Segundo Luckett, 1978, e Bianchi et al., 1993.)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

243

(A)

Blastocisto, 7 dias Revestimento uterino Capilar maternal Epitélio uterino (endométrio) Massa celular interna Blastocele Trofoblasto

(B)

8 dias

Sinciciotrofoblasto proliferando no tecido uterino

Epiblasto Cavidade amniótica Blastocele Trofoblasto (C) 9 dias Lacunas trofoblásticas (D) 10-11 dias

Cavidade amniótica Lacunas trofoblásticas (suprimento de sangue materno)

Epiblasto Hipoblasto Trofoblasto Cavidade Amniótica Blastocele

Sinciciotrofoblasto

Formação de mesoderma extraembrionário

Retículo extra-embrionário

Figura 6.33

Formação de tecido no embrião humano entre 7 e 12 dias. (A,B) Blastocisto humano imediatamente antes da gastrulação. A massa celular interna delaminam células hipoblásticas que forram o trofoblasto, formando, com isso, o envoltório vitelínico primitivo e um blastodisco de duas camadas (epiblasto e hipoblasto), semelhante aquele visto em embriões de aves. O trofoblasto em alguns mamíferos pode ser dividido em trofoblasto polar, que cobre a massa de células internas, e o trofoblasto mural, que não o faz. O trofoblasto se divide no citotrofoblasto que forma as vilosidades, e o sinciciotrofoblasto que irá ingressar no tecido uterino. (C) Ao mesmo tempo o epiblasto se divide em ectoderma amniótico (que rodeia a cavidade amniótica) e epiblasto embrionário. O mamífero adulto se forma das células do epiblasto embrionário. (D) O endoderma extra-embrionário forma o saco vitelínico. (Segundo Gilbert, 1989, e Larsen, 1993.)

As origens dos tecidos mamíferos precoces estão sumariadas na Figura 6.32. A primeira segregação de células dentro da massa celular interna envolve a formação do hipoblasto (algumas vezes chamado endoderma primitivo) (Figura 6.33). Essas células se separam da massa celular interna para revestir a cavidade da blastocele onde elas originam a endoderme do saco vitelínico. Como em embriões de aves, essas células não produzem partes do organismo neonato. O tecido da massa celular interna remanescente, acima do hipoblasto, é agora chamado de epiblasto. As células do epiblasto são separadas por pequenas fendas que coalescem para separar o epiblasto embrionário das outras células do epiblasto, as quais formam o revestimento do âmnio (Figuras 6.33C e 6.34). Uma

244

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 6.34

(A) Sinciciotrofoblasto Mesoderma Extra-embrionário

Estrutura do âmnio e movimentos celulares durante a gastrulação humana. (A) Embrião humano e conexões uterinas após 15 dias de gestação. Na representação superior, o embrião foi cortado sagitalmente através da linha mediana; a representação inferior olha de cima para baixo sobre a superfície dorsal do embrião. (B) Os movimentos das células epiblásticas para dentro da linha primitiva e o nódulo de Hensen, e por baixo do epiblasto estão sobrepostas na visão da superfície dorsal. Aos dias 14 e 15, o epiblasto ingressante é considerado substituir as células hipoblásticas (que contribuem ao forro do saco vitelínico), enquanto no dia 16, as células ingressantes se espalham como um leque para formar a camada mesodérmica. (Segundo Larsen, 1993.).

Disco germinativo bilaminar

Cavidade amniótica Epiblasto Sulco primitivo Saco vitelínico Hipoblasto

(B) 14-15 dias Cavidade amniótica Sulco primitivo Nódulo de Hensen Epiblasto Sulco Primitivo

Hipoblasto 16 dias Saco vitelínico

Endoderma

Mesoderma Mesoderma extra-embrionário

Endoderma

vez completado o revestimento do âmnio, ele se enche com uma secreção chamada fluido amniótico, que serve como absorvente de choques para o embrião em desenvolvimento, enquanto impede a sua dessecação. O epiblasto embrionário parece conter todas as células que vão dar origem ao próprio embrião e é, de muitas maneiras, semelhante ao epiblasto de ave. Kirstie Lawson e seus colegas (1991) marcaram células individuais do epiblasto com peroxidase de rabanete (horseradish) o que lhes permitiu construir um detalhado mapa de destino do epiblasto de camundongo (Figura 6.35). Como as células do epiblasto de galinha, o mesoderma e o endoderma de mamífero migram através da linha primitiva. Enquanto penetram a linha, as células do epiblasto deixam de expressar E-caderina, que mantém as células unidas, e elas migram como células individuais (Burdsal et al., 1993). As células migrando através do nódulo de Hensen dão origem à notocorda. Na formação da notocorda do camundongo, as células devem se integrar no endoderma do intestino primitivo, portanto, de maneira diferente da formação da notocorda da galinha (Jurand, 1974; Sulik et al., 1994). Essas células podem ser vistas como uma banda de células pequenas e ciliadas se estendendo para cima do nódulo de Hensen (Figura 6.36). Elas formam a notocorda convergindo mediamente e se dobrando em uma direção dorsal com afastamento do teto do intestino.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

245

Figura 6.35

(A)

Mapa do destino do embrião do camundongo. (A) O estágio do ovo cilíndrico, 6 dias após a fertilização. Notar que ao contrário dos epiblastos da galinha e humano, o epiblasto do camundongo é firmemente curvado. Os endodermas parietal e visceral são derivados do hipoblasto, não do trofectoderma. (B) Mapa do destino de um epiblasto de 7 dias na gastrulação precoce. (O mapa do destino do camundongo foi achatado e deve ser visto como enrolado para cima com a linha primitiva nas bordas.) (Segundo Lawson et al., 1991.)

Cone ectoplacentário do trofoblasto Cavidade amniótica

Epiblasto Útero Endoderma visceral Endoderma parietal Saco vitelínico Trofoblasto

Os precursores ectodérmicos estão localizados anteriormente à linha primitiva completamente estendida, posição similar que ocupam no epiblasto de galinha; mas enquanto o mesoderma de galinha se forma de células posteriores ao fim da linha, o mesoderma de camundongos se forma de células anteriores à linha primitiva. Em alguns casos, clones de células dão origem a descendentes em mais de uma camada embrionária ou para ambos os derivados, embrionário e extra-embrionário. Assim, no estágio de epiblasto, as linhagens não se separaram umas das outras. Como nos embriões de aves, as células migrando entre as camadas de hipoblasto e epiblasto parecem estar envolvidas em ácido hialurônico cuja síntese se inicia durante a formação da linha primitiva (Solursh e Morriss, 1977). Considera-se (Larsen, 1993) que a substituição das células hipoblásticas pelos precursores endodérmicos ocorre nos dias 14-15 da gestação, enquanto que a migração de células formando o mesoderma não começa antes do dia 16. Formação de membranas extra-embrionárias Enquanto o epiblasto embrionário está apresentando movimentos celulares reminiscentes daqueles vistos na gastrulação de répteis e aves, as células extra-embrionárias estão produzindo os tecidos distintivos dos mamíferos que permitem ao feto sobreviver dentro do útero materno. Apesar da aparência normal das células trofoblásticas iniciais no camundongo e no homem, elas dão origem a uma população de células onde a divisão nuclear se dá em ausência de citocinese. O tipo inicial de célula trofoblástica constitui uma camada chamada citotrofoblasto, enquanto que o tipo de célula multinucleada forma o sinciciotrofoblasto. O citotrofoblasto adere à parede uterina (endométrio) através de uma série de moléculas de adesão que foram discutidas no Capítulo 3. As células citotrofoblásticas humanas também contêm enzimas proteolíticas que lhes permitem entrar no útero e remodelar os vasos sangüíneos uterinos, de modo que o sangue materno possa banhar os vasos sangüíneos fetais. O

(B)

Anterior

Âmnio Ectoderma Mesoderma Endoderma Notocorda Mesoderma extra-embrionário Linha primitiva

Posterior

Tubo neural presuntivo Mesênquima Endoderma Notocorda presuntiva

Figura 6.36

Tubo neural

Notocorda

(A)

(B)

Formação da notocorda no camundongo. (A) A superfície ventral do embrião de 7.5 dias vista pelo microscópio eletrônico de varredura. As células presuntivas da notocorda são pequenas células ciliadas na linha mediana, flanqueadas pelas células endodérmicas maiores do intestino primitivo. (B) Formação da notocorda pela dobra dorsal das pequenas células ciliadas. (de Sulik et al., 1994, cortesia de K. Sulik e G. C. Schoewolf.)

246

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

tecido do sinciciotrofoblasto parece promover a progressão do embrião para dentro do útero. A atividade proteolítica cessa após a décima segunda semana de gestação (Fisher et al., 1989). O útero, por sua vez, supre essa área com vasos sangüíneos que, por fim, entram em contato com o sinciciotrofoblasto. Pouco depois, o tecido mesodérmico se estende para fora do embrião em gastrulação (veja Figura 6.33). Estudos recentes com embriões humanos e de macaco rhesus sugerem que o saco vitelínico (e portanto o hipoblasto) é a fonte desse mesoderma extra-embrionário (Bianchi et al., 1993), que se junta às extensões trofoblásticas e dá origem aos vasos sangüíneos que levam nutrientes da mãe para o embrião. O estreito pedúnculo de conexão do mesoderma extra-embrionário que liga o embrião ao trofoblasto forma os vasos do cordão umbilical. O órgão completamente desenvolvido, consistindo de tecido trofoblástico e mesoderma contendo vasos sangüíneos, é chamado cório e esse se funde com a parede uterina para formar a placenta. Assim, a placenta tem uma porção materna (o endométrio uterino que é modificado durante a gravidez) e um componente fetal, o cório. Esse pode estar fortemente justaposto ao tecido materno, mas ainda passível de separação (como na placenta de contato no porco), ou tão intimamente integrado que os dois tecidos não podem ser separados sem causar dano para a mãe e para o feto em desenvolvimento (como na placenta decídua da maioria dos mamíferos, incluindo o homem).* [gast2.html] A Figura 6.37 mostra as relações entre os tecidos embrionários e extra-embrionários de embrião humano de 6 semanas. O embrião encontra-se envolvido pelo âmnio e protegido pelo cório. Os vasos sangüíneos se estendendo do cório ao embrião e desse ao cório são facilmente observados, como também as vilosidades que se projetam da superfície externa do cório. Essas vilosidades contém os vasos sangüíneos e

*Existem numerosos tipos de placenta, e as membranas extra-embrionárias se formam de maneira diferente nas diferentes ordens de mamíferos (veja Cruz e Pedersen, 1991). Mesmo que o camundongo e o homem gastrulam e implantam da mesma maneira, suas estruturas extra-embrionárias são distintas. É muito arriscado extrapolar fenômenos de desenvolvimento de um grupo de mamíferos para outro. Até Leonardo da Vinci errou (Renfree, 1982). Seu extraordinário desenho do feto humano dentro da placenta é excelente arte, mas pobre ciência: a placenta é de vaca.

Figura 6.37

Embrião humano e placenta após 40 dias de gestação. O embrião está deitado dentro do âmnio, e seus vasos sangüíneos podem ser vistos estendendo-se para dentro das vilosidades coriônicas. A esfera à direita do embrião é o saco vitelínico. (Instituto Carnegie de Washington, cortesia de C. F. Reather.)

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

247

Para o feto Do feto Do feto

Figura 6.38

Relação entre as vilosidades coriônicas e o sangue materno no útero.

Artérias umbilicais Veia umbilical Âmnio

Vilosidades coriônicas Cório (porção fetal da placenta)

Células trofoblásticas

Porção maternal da placenta (células deciduais)

Para a mãe Da mãe

Veia maternal Artéria maternal

permitem ao cório ampliar a área exposta ao sangue materno. Assim, apesar de não haver fusão dos sistemas circulatórios materno e fetal, a difusão de substâncias solúveis pode ocorrer através das vilosidades (Figura 6.38). Dessa maneira, a mãe proporciona nutrientes e oxigênio ao feto, e o feto envia seus produtos descartáveis (principalmente dióxido de carbono e uréia) para a circulação materna. Os vasos sangüíneos das vilosidades coriônicas são formados do mesoderma extra-embrionário que penetra nos pequenos montes de tecido citotrofoblástico chamados vilosidades primárias (Figura 6.39). As estruturas resultantes, as vilosidades secundárias, se formam na segunda semana de gestação. No fim da terceira semana, uma parte desse mesoderma extra-embrionário produziu vasos sangüíneos, e essas vilosidades terciárias estão aptas a trazer nutrientes e oxigênio da mãe para o embrião. [other.html#gast4] O trofoblasto é necessário para a aderência e entrada do embrião nos tecidos uterinos, e o cório permite troca de gases e nutrientes entre a mãe e o feto. Mas o cório tem uma importância até maior; é também um órgão endócrino. A porção sinciciotrofoblástica do cório produz três hormônios essenciais para o desenvolvimento dos mamíferos. Primeiro, ele produz a gonadotrofina coriônica, um hormônio peptídico que é capaz de induzir outras células da placenta (e do ovário materno) a produzir progesterona. A progesterona é o hormônio esteróide que mantém a parede uterina espessada e cheia de vasos sangüíneos. Nos primatas, os ovários podem ser removidos depois do primeiro terço da gravidez, sem danos para o desenvolvimento do feto, porque o cório tem capacidade para produzir os esteróides necessários para manter a gestação (Zander e von Münstermann, 1956). A progesterona placentária é também usada pela glândula supra-renal fetal como um substrato para a produção de hormônios corticosteróides biologicamente

248

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A) Vilosidade primária Endométrio Espaço entre vilosidades Sinciciotrofoblasto Citotrofoblasto Mesoderma extraembrionário

(B)

Vilosidade secundária Endométrio Casca citotrofoblástica Sinciciotrofoblasto Espaço entre vilosidades Citotrofoblasto Capilares das vilosidades

(C)

Vilosidade terciária

Figura 6.39

Desenvolvimento das vilosidades coriônicas em humanos. (A) Vilosidade primária composta de tecido citotrofoblástico encaixado no sinciciotrofoblasto. (B) Vilosidade secundária formada quando o mesoderma extra-embrionário subjacente penetra na vilosidade primária. Tais vilosidades secundárias juntam-se às vilosidades adjacentes para formar a casca citotrofoblástica que irá ancorar as vilosidades ao endométrio. (C) dentro do mesoderma extra-embrionário, formam-se capilares que irão se conectar aos ramos da artéria e veia umbilicais. (Segundo Gilbert, 1989.)

Mesoderma extra-embrionário

importantes. O terceiro hormônio produzido pelo cório é a somatomamotropina coriônica (freqüentemente chamada lactogênio placentário). Esse hormônio é responsável pelo desenvolvimento do seio materno durante a gestação, assim, permitindo a produção de leite mais tarde. Estudos recentes indicam que o cório pode ter ainda outra função, que é a de proteger o feto da resposta imune da mãe. Uma pessoa com um sistema imune normal reconhece e rejeita células estranhas dentro do seu corpo; esse fato é demonstrado pela rejeição a transplantes de pele e de órgãos de indivíduos geneticamente diferentes. As glicoproteínas responsáveis por essa rejeição são chamadas de antígenos de histocompatibilidade principais e, provavelmente, diferem de indivíduo a indivíduo. Uma criança expressa antígenos de histocompatibilidade principais de ambos, o pai e a mãe, e o corpo da mãe rejeitará a pele ou órgãos de seus descendentes porque eles contêm antígenos derivados do pai. Como então, pode o feto humano permanecer 9 meses dentro do corpo da mãe? Porque a mãe não rejeita imunologicamente o seu feto, como ela rejeitaria um órgão daquela criança? Parece que o cório desenvolveu vários mecanismos pelos quais ele pode inibir a resposta imune contra o feto (Chaouat, 1990). Ele pode secretar proteínas solúveis que bloqueiam a produção de anticorpos, e pode promover a produção de certos tipos de linfócitos que impedem a resposta imune normal dentro do útero. As células citotrofoblásticas também contêm uma forma de antígeno de histocompatibilidade principal, específico da placenta, que parece proteger o embrião de ser reconhecido pelo sistema imune da mãe (Carosella et al., 1996; Pazmany et al., 1996). Assim, as funções da placenta incluem não só suporte físico e troca nutricional, mas também a regulação das relações endócrinas e imunológicas entre a mãe e o feto. [gast3.html] Na gastrulação, observamos uma série incrivelmente bem coordenada de movimentos celulares pelos quais os blastômeros do estágio de clivagem são rearranjados e começam a interagir com seus vizinhos. Além disso, apesar de haver diferenças entre os movimentos na gastrulação de embriões de ouriço-do-mar, anfíbios, aves e mamíferos, certos mecanismos são comuns a todos. Cada grupo tem o problema de trazer as células precursoras do mesoderma e do endoderma para dentro do corpo, e envolver o embrião com precursores ectodérmicos. Dadas as diferentes quantidades e distribuições de vitelo, como também outras considerações ambientais, cada tipo de organismo foi capaz de desenvolver uma maneira de conseguir esse objetivo. O palco está, agora, pronto para a formação dos primeiros órgãos.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

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CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias

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PARTE II Padrões de Desenvolvimento

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CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

253

Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma

7

Porque a verdadeira maravilha, se você quiser se maravilhar, é este processo. Você inicia como uma única célula derivada da união entre um espermatozóide e um óvulo; essa se divide em duas, depois quatro, depois oito e assim por diante e, em um certo estágio aparece uma única célula, cuja descendência total é o cérebro humano. A mera existência de tal célula deveria ser uma das coisas assombrosas da Terra. As pessoas deveriam vagar o dia inteiro, enquanto acordadas, chamando umas às outras, maravilhadas, falando de nada exceto da célula.
LEWIS THOMAS (1979)

E

M 1828 KARL ERNST VON BAER, o mais eminente embriologista de sua

época*, anunciou: Eu tenho dois pequenos embriões preservados em álcool, que esqueci de identificar. No momento, não consigo determinar o gênero ao qual pertencem. Eles podem ser lagartos, pequenas aves ou mesmo mamíferos”. A Figura 7.1 permite-nos apreciar seu dilema e ilustra as quatro leis gerais da embriologia propostas por von Baer. De seu estudo detalhado sobre o desenvolvimento da galinha e da comparação de tais embriões com embriões de outros vetebrados, von Baer estabeleceu quatro generalizações, ilustradas aqui com alguns exemplos de vertebrados. 1. As características gerais de um grande grupo de animais aparecem no embrião mais cedo do que os aspectos especializados. Todos os vertebrados em desenvolvimento (peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos) são muito semelhantes logo após a gastrulação. Somente mais tarde no desenvolvimento que as características especiais da classe, ordem e, finalmente, espécie aparecem (veja Figura 7.1). Todos os embriões de vertebrados têm arcos de guelras, notocordas, medulas espinhais e rins pronéfricos. 2. Caracteres menos gerais são desenvolvidos a partir dos mais gerais, até finalmente aparecerem os caracteres mais especializados. Inicialmente todos os vertebrados têm o mesmo tipo de pele. Somente mais tarde se desenvolvem as escamas de peixes, as escamas de répteis, as penas das aves, ou o pêlo, garras e unhas dos mamíferos. Da mesma maneira, o desenvolvimento precoce de membros é essencialmente o mesmo em todos os vertebrados. Somente mais tarde é que diferenças entre pernas, asas e braços se tornam evidentes. 3. Cada embrião de uma dada espécie, em lugar de passar através de todos os estágios adultos de outros animais, se afasta mais e mais deles. As fendas viscerais em embriões de aves e mamíferos não se parecem em detalhe às fendas das guelras de peixes adultos. Ao contrário, elas se parecem às fendas viscerais de peixes embrionários e outros vertebrados embrionários. Enquanto peixes preservam e elaboram essas fendas tornando-as verdadeiras guelras, os mamíferos as convertem em estruturas tais como os tubos de Eustáquio (entre o ouvido e a boca). 4. Assim, o embrião precoce de um animal superior nunca é como um animal inferior, mas somente como seu embrião precoce. Von Baer verificou que diferentes

Ainda mais atraente do que a mata virgem, era a floresta que se estendia a minha frente naquele momento: o sistema nervoso central.
RITA LEVI-MONTALCINI (1988)

* K. E. von Baer descobriu a notocorda, o ovo de mamífero e o ovo humano, além de contribuir para o progresso conceitual aqui descrito. Seu trabalho será mais discutido no Capítulo 23.

253

254

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 7.1

Ilustração das leis de von Baer. Embriões precoces de vertebrados mostram aspectos comuns ao subfilo inteiro. Com o progresso do desenvolvimento, os embriões se tornam reconhecíveis como membros de sua classe, sua ordem, sua família e, finalmente, sua espécie. (de acordo com Romanes, 1901).

I

II

III

Peixe

Salamandra Tartaruga

Galinha

Porco

Boi

Coelho

Homem

grupos de animais compartilham aspectos comuns durante o desenvolvimento embrionário precoce e que esses aspectos se tornam mais e mais característicos da espécie à medida que progride o desenvolvimento. Embriões humanos nunca passam por estágios equivalentes a um peixe ou uma ave adultos; realmente, embriões humanos inicialmente compartilham características comuns com embriões de peixes e aves. Mais tarde, os embriões de mamíferos e outros divergem, nenhum deles passando pelos estágios dos outros. Von Baer também reconheceu que existe um modelo comum para todo o desenvolvimento de vertebrados: as três camadas germinativas originam diferentes órgãos, e essa derivação dos órgãos é constante se o organismo é um peixe, uma rã ou uma galinha. O ectoderma forma a pele e os nervos; o endoderma forma os sistemas respiratórios e digestivos; e o mesoderma forma o tecido conjuntivo, as células do sangue, o coração, o sistema urogenital e partes da maioria dos órgãos internos. Neste capítulo acompanharemos o desenvolvimento precoce do ectoderma; este, e o capítulo seguinte enfocam a formação do sistema nervoso nos vertebrados. O Capítulo 9 acompanhará o desenvolvimento precoce dos órgãos endodérmicos e mesodérmicos.

FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais
“Talvez a mais intrigante de todas as perguntas é se o cérebro é suficientemente poderoso para resolver o problema da sua própria criação.” Assim Gregor Eichele (1992) terminou, recentemente, uma revisão de pesquisa sobre desenvolvimento do cérebro de mamíferos. A construção de um órgão que reconhece, pensa, ama, odeia, lembra, troca, engana a si mesmo, e coordena nossos processos corporais conscientes ou inconscientes é indubitavelmente o mais desafiante dos enigmas do desenvolvimento. Uma combinação de abordagens genéticas, celulares e orgânicas está fornecendo uma compreensão preliminar de como a anatomia básica do cérebro se torna ordenada.

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

255

O processo pelo qual o embrião forma o tubo neural, o rudimento do sistema nervoso central, é chamado neurulação, e um embrião sofrendo essas transformações é chamado nêurula. Existem dois caminhos principais para a formação do tubo neural. Em neurulação primária, o cordomesoderma estimula o ectoderma, que o recobre, a se proliferar, invaginar e a se destacar da superfície formando um tubo oco. Na neurulação secundária, o tubo neural se origina de um sólido cordão de células que se embebe no embrião e subseqüentemente se torna oco (forma uma cavidade) para formar o tubo neural (veja Schoenwolf, 1991b). O quanto essas formas de construção são usadas depende da classe de vertebrados. A neurulação em peixes é exclusivamente secundária. Em aves, as porções anteriores do tubo neural são construídas por neurulação primária, ao passo que o tubo neural, caudal ao par somito 27 (isto é, tudo posterior aos membros posteriores), é construído por neurulação secundária (Pasteels, 1937; Catala et al., 1996). Em anfíbios, como o Xenopus, a maior parte do tubo neural do girino é produzida por neurulação primária, mas o tubo neural caudal é derivado de neurulação secundária (Gont et al., 1993). Em camundongo (provavelmente no homem, também), a neurulação secundária começa aproximadamente ao nível do somito 35 (Schoenwolf, 1984; Nievelstein et al., 1993).

Neurulação primária
Em vertebrados, a gastrulação cria um embrião com uma camada endodérmica interna, uma camada mesodérmica intermediária e um ectoderma externo. A interação entre o mesoderma dorsal e o ectoderma que a ele se sobrepõem é uma das interações mais importantes em todo o desenvolvimento de tetrápodes, porque ela inicia a organogênese, a criação de tecidos e órgãos específicos. Nessa interação, o cordomesoderma estimula o ectoderma acima dele a formar o tubo neural oco, que se diferenciará em cérebro e medula espinhal. Os eventos da neurulação primária estão no

(A)

Placa neural

Prega neural

(B)

(C)

Crista neural

Figura 7.2

Neurulação em anfíbios e amniotas. (A) Diagrama representativo da formação do tubo neural. As células ectodérmicas estão representadas como precursoras da crista neural (preto) ou como precursoras da epiderme (cor). O ectoderma se dobra no ponto mais dorsal, formando a epiderme externa e um tubo neural interno conectados pelas células da crista neural. (B) Fotomicrografias de neurulação em um embrião de galinha de 2 dias. (C) Formação do tubo neural vista em seções transversais do embrião de galinha na região do futuro mesencéfalo (setas em B). Cada fotografia em C corresponde à outra acima dela. (HF, prega cefálica; HP, processo cefálico; HN, nódulo de Hensen; M, mesencéfalo; NP, placa neural.) (Fotomicrografias, cortesia de R. Nagele.)

Epiderme

Tubo neural

256

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 7.3

Quatro vistas da neurulação em um embrião de anfíbio, mostrando em cada caso nêurulas precoce (esquerda), média (centro) e tardia (direita). (A) Seção transversal no centro do embrião. (B) A mesma seqüência olhando a superfície dorsal do embrião inteiro, de cima para baixo. (C) Seção sagital pelo plano mediano do embrião. (D) Simulação computadorizada em três dimensões da constrição, extensão e levantamento da placa neural. (A-C de acordo com Balinsky, 1975; D de acordo com Jacobson e Gordon, 1976.)
Placa neural Prega neural (A) SEÇÃO TRANSVERSAL

diagrama da Figura 7.2. Durante a neurulação primária, o ectoderma original é dividido em três conjuntos de células: (1) o tubo neural posicionado internamente, que formará o cérebro e a medula espinhal, (2) a epiderme da pele posicionada externamente, e (3) as células da crista neural, as quais migram da região de conexão entre o tubo neural e a epiderme, e irão gerar os neurônios periféricos e a glia, as células pigmentadas da pele e vários outros tipos de células. O fenômeno de indução embrionária, que inicia a neurulação na região dorsal do embrião, será detalhada no Capítulo 15. Neste capítulo estamos considerando a resposta dos variados tecidos ectodérmicos.

Placa neural Notocorda Notocorda Arquêntero Mesoderma Notocorda Mesoderma Cavidade do intestino

Tubo neural Cavidade do intestino

Endoderma Mesoderma Epiderme

Endoderma Endoderma Epiderme Epiderme

Notocorda Prega neural Epiderme (B) SEÇÃO SAGITAL Arquêntero Resto da blastocele Placa neural

Notocorda Prega neural Placa neural Prega neural Blastóporo Blastóporo Cavidade do intestino

Tubo neural

Cavidade do intestino Mesoderma Endoderma Epiderme Mesoderma Endoderma

Mesoderma Epiderme Endoderma Divertículo do fígado Tubo neural

Placa neural (C) VISTA DA SUPERFÍCIE DORSAL

Prega neural

Placa neural

Prega neural Pregas neurais fundidas

Blastóporo

Blastóporo

(D) SIMULAÇÃO COMPUTADORIZADA DA DEFORMAÇÃO DA LÂMINA DE ECTODERMA (LINHA C)

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

257

(A) Formação das pregas neurais

(B) Elevação das pregas neurais

(C)

Epiderme presuntiva Placa neural presuntiva Zona de transição Placa neural

Notocorda Formação de cunha Formação de sulco

Epiderme Notocorda

Ancoragem

Figura 7.4

O processo de neurulação primária em embriões de rã está descrito na Figura 7.3 e parece ser similar em anfíbios, répteis, aves e mamíferos (Galera, 1971). A primeira indicação que uma região do ectoderma está destinada a se tornar tecido neural é uma mudança na forma celular (Figura 7.4). As células ectodérmicas da linha média tornamse alongadas, enquanto as células destinadas a formar a epiderme se tornam mais achatadas. O alongamento das células ectodérmicas dorsais causa a elevação dessas regiões neurais presuntivas acima do ectoderma circundante, criando assim, a placa neural. Até 50% do ectoderma está incluído nessa placa. Logo após, as bordas da placa neural se engrossam e se movem para cima formando as pregas neurais, enquanto um sulco neural, em forma de -U- aparece no centro da placa, dividindo os futuros lados direito e esquerdo do embrião (veja Figuras 7.3 e 7.4). As pregas neurais migram em direção à linha média do embrião, finalmente se fundindo para formar o tubo neural abaixo do ectoderma sobreposto. As células da porção mais dorsal do tubo neural se tornam as células da crista neural. A mecânica da neurulação primária A neurulação ocorre com algumas variações em diferentes regiões do corpo. A cabeça, o tronco e a cauda formam, cada um, sua região do tubo neural de maneira a refletir a relação da notocorda com o ectoderma que a ela se sobrepõe. Tanto as regiões da cabeça como as do tronco, sofrem variantes da neurulação primária, e esse processo pode ser dividido em cinco estágios distintos, mas espacialmente e temporalmente se superpondo estágios (Schoenwolf, 1991a; Catala et al., 1996): (1) a formação da placa neural, (2) a formação do assoalho da placa neural, (3) a modelagem da placa neural, (4) o dobramento da placa neural para formar o sulco neural, e (5) o fechamento do sulco neural para formar o tubo neural. A formação da placa neural A formação da placa neural como uma região distinta de outras células ectodérmicas será discutida em detalhe nos Capítulos 8 e 15. Em geral, considera-se que o mesoderma dorsal subjacente (em colaboração com outras regiões do embrião) sinaliza às células ectodérmicas acima dela para se desenvolverem em células colunares da placa neural (Smith e Schoenwolf, 1989; Keller et al., 1992; discussão posterior neste capítulo). Como resultado dessa indução neural, as células da placa neural presuntiva se distinguem do ectoderma circundante, a qual se transformará em epiderme. As células da placa neural e as células da epiderme possuem seus próprios movimentos intrínsecos (Moury and Schoenwolf, 1995). Se a epiderme ao redor da placa neural é isolada,

Representação esquemática do dobramento do epitélio durante a neurulação na galinha. (A) Formação das pregas neurais ocorre quando as células epidérmicas presuntivas se movem para dentro, na direção da linha média do embrião. Essa epiderme presuntiva empurra a placa neural abaixo dela, enquanto se move. (B) Enquanto as células da linha média da placa neural (células da placa do assoalho) são ancoradas à notocorda, as pregas neurais são elevadas. Esses movimentos parecem continuar enquanto a epiderme, se movendo para o meio, puxa com ela a placa neural, resultando na justaposição das pregas neurais. (C) Nas três regiões de articulação (no ponto de articulação mediano MHP e nos dois pontos de articulação dorsolateral a -DLHP), as células da placa neural mudam seu comprimento e sofrem uma constrição nos seus ápices. (De acordo com Moury e Schoenwolf, 1995.)

258

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

as células se movem em direção ao centro (ou seja, em direção à área onde estava a placa neural). Se a placa neural é isolada, suas células convergem e se estendem para formar uma placa mais delgada, mas não se fundem para formar um tubo neural. Esses movimentos da placa neural e da epiderme originam as pregas neurais. Inicialmente, o ectoderma é “torcido” e logo a epiderme presuntiva começa a recobrir a placa neural. (Realmente, se a “região de transição” contendo os dois tecidos é isolada, ela formará pequenas pregas neurais em cultura). Esses movimentos coordenados finalmente causarão a elevação e o dobramento do tubo neural (veja Figura 7.4; Jacobson e Moury, 1995; Moury e Schoenwolf, 1995). Formação do assoalho da placa neural Anteriormente, considerava-se que somente as células da linha média da placa neural formavam a placa do assoalho do tubo neural. Ou seja, no fechamento da placa para formar o tubo neural, suas células mais centrais se localizariam no fundo do tubo. As partes mais periféricas, as pregas neurais, se tornariam as porções mais dorsais do tubo neural. Provavelmente é assim que se forma a região da cabeça. Evidência recente, entretanto, sugere que o assoalho do tubo neural do tronco tem uma outra origem - que se origina em parte do nódulo de Hensen e é “inserido” no centro da placa neural. Esse modelo foi proposto por Catala e colaboradores (1995) baseado nos seus dados e em estudos anteriores de vários laboratórios. Para acompanhar as células embrionárias individuais do nódulo eles usaram o sistema de quimera galinha-codorna. Embriões de galinha e codorna se desenvolvem de maneira muito semelhante (especialmente no desenvolvimento precoce), e quando porções do embrião de codorna são enxertadas em uma região equivalente do embrião de galinha, as células se integram no embrião e participam da construção dos órgãos adequados. O enxerto pode ser feito enquanto o embrião ainda está dentro do ovo, e o pinto que eclode é uma “quimera”, tendo uma porção do seu corpo composta de células de codorna (Figura 7.5; Le Douarin, 1969; Le Douarin e Teillet, 1973). As células de galinha e codorna, entretanto, têm duas diferenças críticas. Primeiro, na codorna a heterocromatina do núcleo está concentrada ao redor dos nucléolos. Isso cria uma grande massa que se cora intensamente e é facilmente distinta da heterocromatina difusa da galinha. Segundo, existem alguns antígenos que são específicos para a

(A)

Figura 7.5

Uma quimera galinha-codorna. (A) Duas quimeras galinha-codorna e uma galinha controle 4 dias após a eclosão. Nas quimeras, o tubo neural dorsal anterior da codorna substituiu uma região equivalente da galinha no embrião de 12-somitos. Melanócitos de codorna, originários da crista neural, migram para as penas da cabeça, ao nível do enxerto. (B) Uma região do embrião contendo tanto células de codorna (com sua cromatina altamente condensada) como células de galinha (com sua cromatina mais difusa). (de Le Douarin et al., 1996; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)
(B)

Célula de galinha Célula de codorna

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

259

(A)

Somito 6

(B)

Tubo neural Somito

Nódulo de Hensen Codorna Galinha

codorna e não são encontrados em células da galinha. Os dois fenômenos permitem distinguir células individuais de codorna, mesmo quando a população celular é, na sua maioria, de galinha. Esses pesquisadores removeram o nódulo de Hensen e o término caudal da notocorda em alongação de embriões de galinha com 6-somitos (1.5 dias) e os substituiram com seus equivalentes de codorna. Daquele nível até a cauda, tanto a notocorda como a placa do assoalho foram compostas de células de codorna. As paredes do tubo neural foram produzidas da placa neural da galinha (Figura 7.6). É interessante notar que (como previsto pela regressão do nódulo, discutida no Capítulo 6) a placa do assoalho e as células da notocorda, associadas com a placa neural, se localizavam mais em direção à cauda do que o próprio nódulo. Portanto, o nódulo de Hensen contém as células necessárias para a formação da placa do assoalho caudal e da notocorda. As células da placa do assoalho se inserem na parte central do ectoderma dorsal e somente mais tarde é que a notocorda se separa da placa do assoalho pela formação de uma membrana basal entre elas (Figura 7.7).* O tubo neural tem duas fontes distintas - uma ectodérmica e uma do nódulo de Hensen. A modelagem e dobramento da placa neural Forças intrínsecas à placa neural estão envolvidas na sua modelagem. Ao se tornarem mais colunares, as células provocam um estreitamento da placa neural, mas a modelagem mais importante da placa é produzida pelas suas células da linha mediana que se situam diretamente acima da notocorda. Em aves e mamíferos, essas células da linha mediana da placa neural são chamadas células do ponto de articulação mediano (MHP) e são derivadas da placa neural imediatamente anterior ao nódulo de Hensen e da sua linha média anterior (do nódulo de Hensen) (Schoenwolf, 1991a,b; Catala et al., 1996). Tanto em anfíbios como amniotas, as células da placa neural sofrem uma extensão convergente pela intercalação de várias camadas de células no meio de poucas camadas (Jacobson e Sater, 1988; Schoenwolf e Alvarez, 1989). Dessa maneira, elas alongam e estreitam a placa neural (veja Figura 7.3c). O dobramento da placa neural é conseqüência de forças intrínsecas e extrínsecas às suas células. Na galinha, a placa neural começa a dobrar-se mesmo quando ainda está sendo modelada. As células MHP ficam ancoradas à notocorda, abaixo delas,
* A idéia de que a notocorda e a placa do assoalho são derivadas da mesma população de células é de apreciação recente, mas esse fenômeno já havia sido documentado em um famoso livro de embriologia. O livro Indução embrionária e desenvolvimento de Hans Spemann em 1938 tem uma ilustração do famoso experimento de enxerto de Spemann e Mangold. Nas páginas 144 e 146 daquele livro (e reproduzido aqui na Figura 15.12), o enxerto do lábio dorsal do blastóporo é mostrado como dando origem ao mesoderma dorsal (notocorda e somitos) e à placa do assoalho do tubo neural.

Endoderma dorsal

Figura 7.6

A placa do assoalho do tubo neural do tronco da galinha é derivado do nódulo de Hensen. (A) Esquema da operação pela qual o nódulo de um embrião de galinha de 6-somitos é substituído pelo seu correspondente de codorna. (B) Análise do eixo quimérico (marcado com antígeno específico para a codorna) mostrando células de codorna na notocorda (flecha) e placa do assoalho (cabeças de flecha). (B de Catala et al., 1996; fotografia, cortesia de N. M. Le Douarin.)

260

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Placa neural Poço do nódulo de Hensen

Articulação cordoneural

Figura 7.7

O nódulo de Hensen contribui tanto para a notocorda como para a placa do assoalho neural. Seção através do nódulo de Hensen no estágio do somito-6, mostrando que esse contribui para a camada superior das células embrionárias. (de Catala et al., 1996; fotografia, cortesia de N. M. Le Douarin.)

originando uma articulação em forma de sulco na linha média dorsal. Essas células são induzidas pela notocorda a diminuir sua altura e adquirir a forma de cunha (van Straaten et al., 1988; Smith e Schoenwolf, 1989). As células laterais à MHP não sofrem essas mudanças (Figuras 7.4 e 7.8). Logo após, duas outras regiões de articulações formam sulcos próximos à conexão da placa neural ao restante do ectoderma. Essas regiões são chamadas pontos de articulação dorsolateral (DLHPs), e estão ancoradas ao ectoderma da superfície da prega neural. Essas células aumentam sua altura e adquirem a forma de cunha. Essa transformação (modelagem como cunha) está intimamente ligada às modificações da forma celular. Nos pontos de articulação dorsolateral, tanto microtúbulos como microfilamentos estão envolvidos nessas transformações. A colchicina, um inibidor de polimerização de microtúbulos, inibe o alongamento dessas células, enquanto citocalasina B, um inibidor da formação de microfilamentos, impede a constrição apical dessas células impedindo, assim, a formação de cunha (Burnside, 1971, 1973; Karfunkel, 1972; Nagele e Lee, 1980, 1987). Depois da formação inicial de sulcos, a placa neural se dobra ao redor dessas regiões com articulações. Cada uma delas age como um eixo que dirige a rotação das células ao seu redor (Smith e Schoenwolf, 1991). Enquanto isso, forças extrínsecas também estão em ação. O ectoderma superfícial do embrião de galinha empurra na direção central do embrião, fornecendo mais uma força motora para o dobramento da placa neural (veja Figura 7.4 B,C; Alvarez e Schoenwolf, 1992). Esse movimento da epiderme presuntiva e a ancoragem da placa neural ao mesoderma subjacente deve ser também importante para assegurar que o tubo neural se dobre para dentro do embrião e não para fora. Se pequenos pedaços da placa neural são isolados do resto do embrião (incluindo o mesoderma) eles tendem a se enrolar para fora (Schoenwolf, 1991a). Fechamento do tubo neural O tubo neural se fecha ao se aproximarem os pares de dobras neurais na linha média dorsal; as dobras aderem umas às outras e as células das duas partes se reúnem. Em algumas espécies, as células nessa junção formam as células da crista neural. Mas em aves, as células da crista neural não migram da região dorsal até que o tubo neural tenha sido fechado naquele local. Em mamíferos, entretanto, as células da crista neural cranial (que formam as estruturas da face e do pescoço) migram enquanto as dobras neurais estão se elevando (ou seja, antes do fechamento do tubo), enquanto que na região da medula espinhal, as células da crista esperam até que o fechamento ocorra (Nichols, 1981; Erickson e Weston, 1983).

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

261

(A)

(B)

(C)

Figura 7.8

Micrografia eletrônica de varredura da formação do tubo neural no embrião de galinha. (A) Sulco neural rodeado por células mesenquimatosas. (B) Células neuroepiteliais alongadas formam um tubo, enquanto as células epidérmicas achatadas são trazidas à linha média do embrião. As células MHP formam uma articulação no fundo do tubo, enquanto as células da placa neural, ligadas à área basal do ectoderma da superfície formam as regiões de articulações dorsolaterais. Essas três articulações podem ser vistas como sulcos. (C) A formação do tubo neural é completada. As células que eram a placa neural estão agora dentro do embrião. A epiderme presuntiva se localiza acima do tubo, e o tubo neural é ladeado pelos somitos mesodérmicos e no fundo limitado pela notocorda. (Fotografias, cortesia de K. W. Tosney.)

A formação do tubo neural não ocorre simultaneamente ao longo do ectoderma. Isso pode ser melhor observado naqueles vertebrados (como aves e mamíferos) cujo eixo corporal se alonga antes da neurulação. A Figura 7.9 detalha a neurulação em um embrião de galinha com 24 horas. A neurulação na região cefálica (cabeça) está bastante adiantada, enquanto a região caudal (rabo) do embrião está ainda gastrulando. A regionalização do tubo neural também ocorre como resultado de mudanças na forma

262

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Figura 7.9

Ectoderma da cabeça Mesênquima

Anterior

Ectoderma do blastoderma

Estereograma de um embrião de galinha de 24 horas. As porções cefálicas estão terminando a neurulação enquanto as porções caudais estão ainda gastrulando. (de Patten, 1971; de acordo com Huettner, 1949.)

Prega neural Notocorda Espaço subcefálico Celoma extraembrionário Prega lateral do corpo Região pericárdica do celoma Vitelo aderente ao endoderma Sulco neural Prega neural Placa neural Endoderma do intestino médio Somito Divergência das pregas neurais Sulco neural Intestino Mesoderma extraembrionário Vitelo Prega neural Placa neural Endoderma Porta intestinal anterior Somito Mesoderma intermediário Mesoderma somático Celoma Mesoderma esplâncnico

Nó de Hensen Poço primitivo

Ilhota sagüínea

Mesoderma

Linha primitiva

Sulco primitivo Margem primitiva

Posterior

do tubo. Na ponta cefálica (onde se formará o cérebro) a parede do tubo é larga e grossa. Aqui, uma série de inchaços e constrições definirão os vários compartimentos do cérebro. Na parte caudal à região da cabeça, entretanto, o tubo neural permanece um simples tubo que se afina em direção à cauda. As duas pontas abertas do tubo neural são chamadas neuróporo anterior e neuróporo posterior. O fechamento do tubo neural nos mamíferos, diversamente da galinha, se inicia em vários locais ao longo do eixo ântero-posterior (Golden e Chernoff, 1993; Van Allen et al., 1993). Vários defeitos no tubo neural são causados pelo não fechamento em alguns segmentos (Figura 7.10). Falha no fechamento na região posterior do tubo neural humano aos 27 dias (ou a ruptura subseqüente do neuróporo posterior logo em seguida) resulta na condição denominada espinha bífida, cuja severidade depende de quanto da medula espinhal permanece aberta. Falha no fechamento do

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

263

(A) Prega neural Intumescência pericardíaca Placódio ótico Somitos Ectoderma da superfície Crista neural

(B)

Neuróporo anterior Intumescência pericardíaca

(C)

(D)

(E)

Tubo neural

Somitos

Borda cortada do âmnio 22 dias

Sulco neural 23 dias

Neuróporo posterior Normal Anencefalia Espinha bífida

Figura 7.10

Neurulação em embriões humanos. (A) Seções dorsal e transversal de um embrião humano de 22 dias, iniciando a neurulação. Ambos neuróporos, anterior e posterior, estão abertos ao líquido amniótico. (B) Vista dorsal de um embrião humano em neurulação, um dia depois. A região do neuróporo anterior está se fechando, enquanto o neuróporo posterior permanece aberto. (C) Regiões de fechamento do tubo neural postulado por evidência genética (superimposta ao corpo do recém-nascido). (D) Anencefalia devido a falta de fusão da placa neural na região 2. (E) Espinha bífida devida a falta de fusão na região 5 (ou pela falta de fechamento do neuróporo mais posterior). (C-E de acordo com Van Allen et al., 1993.)

tubo neural anterior resulta em uma condição letal, anencefalia. Aqui, o cérebro anterior permanece em contato com o líquido amniótico e em seguida degenera. O desenvolvimento do cérebro anterior fetal cessa, e a abóboda do crânio não se forma. Essas anormalidades não são raras em humanos, pois estão presentes em aproximadamente um em cada quinhentos nascimentos viáveis. Defeitos de fechamento do tubo neural podem freqüentemente ser identificados durante a gravidez por vários testes físicos e químicos. O fechamento do tubo neural humano envolve uma complexa interação entre fatores genéticos e ambientais. Certos genes, Pax3, sonic hedgehog e openbrain, são essenciais para a formação do tubo neural de mamíferos, mas fatores da dieta como colesterol e ácido fólico parecem ser críticos.* Foi estimado que aproximadamente 50% dos defeitos do tubo neural poderiam ser evitados se as mulheres grávidas tomassem suplementos de ácido fólico (vitamina B12), e o Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos da América recomendam que todas as mulheres em idade fértil tomem 0.4mg diários de folato para reduzir o risco de defeitos do tubo neural durante a gravidez (Milunsky et al., 1989; Czeizel e Dudas, 1992; CDC, 1992). [ecto1.html] O tubo neural finalmente forma um cilindro fechado que se separa do ectoderma da superfície. Considera-se que essa separação é mediada pela expressão de diferentes moléculas de adesão celular. As células que se tornarão o tubo neural, originalmente expressam E-caderina, mas elas param de expressar essa proteína ao se formar o tubo e, em vez disso, sintetizam N-caderina e N-CAM (veja Figura 3.17). Como resultado, os dois tecidos não aderem mais um ao outro. Se o ectoderma da superfície passar a expressar N-caderina (injetando mRNA de N-caderina em uma das células do embrião de Xenopus de duas cabeças), a separação do tubo neural da epiderme presuntiva é dramaticamente impedida (Detrick et al., 1990; Fujimori et al., 1990).
*Colesterol parece ser necessário para a autoclivagem da proteína Sonic hedgehog. Mutações da Sonic hedgehog podem impedir o fechamento do tubo neural em camundongos e no homem (Chiang et al., 1996; Roessler et al., 1996); a porção ativa da Sonic hedgehog é sua região N-terminal. Essa região é clivada da molécula precursora em uma reação que requer colesterol como um cofator (Porter et al., 1996). No homem, certas síndromes envolvendo falhas no fechamento do tubo neural foram relacionadas às mutações na síntese de colesterol (Kelley et al., 1996).

264

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Informações adicionais

&

Especulações

A modelagem dorsoventral do sistema nervoso

E

NQUANTO O TUBO NEURAL está sendo formado, ele está recebendo sinais de dois outros conjuntos de tecidos. Esses sinais são instruções para que o tubo neural tenha uma determinada polaridade dorsoventral. O tubo neural ventral parece ser modelado pela proteína Sonic hedgehog originária da notocorda e das células da placa do assoalho (veja Figura 7.7B; Ericson et al., 1996). Essa proteína induz certas células do lado ventrolateral do tubo neural a expressar genes que as transformam em neurônios motores (Figura 7.11A; Prancha 32). Sonic hedgehog também funciona reprimindo a expressão de genes como dorsalin, Pax3 e msx1 da porção ventral do embrião. Esses genes seriam expressos normalmente ao longo do tubo neural mas são inibidos pelo sinal, ventralmente produzido pela

Sonic hedgehog. O destino dorsal do tubo neural é determinado pelas proteínas morfogenéticas do osso, provavelmente BMP4 e BMP7. Essas proteínas são expressas na epiderme dorsal presuntiva (Figura 7.11B,C) e foi demonstrado que elas contrariam o efeito da Sonic hedgehog (permitindo a expressão de genes como
(B)

msx1 e Pax3 na porção dorsal do tubo neural), além de promover a expressão de outros genes dorsalmente específicos (Figura 7.11D). O papel dessas proteínas foi confirmado por experiências in vitro nas quais tubos neurais isolados foram expostos a produtores desses sinais (Yamada et al., 1993; Liem et al., 1995).
Figura 7.11

(C)

A modelagem dorsoventral do tubo neural. (A) Diferenciação de neurônios motores é vista nos neurônios ventrolaterais; se as células da placa do assoalho ou as células que expressam o Sonic hedgehog são transferidas para uma posição lateral, neurônios motores também serão formados. (B) BMP4 expresso na epiderme dorsal presuntiva durante a formação do tubo neural. (C) Expressão de BMP7 enquanto o tubo neural se fecha. (E) Resumo das interações pela quais Sonic hedgehog promove o desenvolvimento de neurônios motores e inibe sinais de dorsalização. (de Yamada et al., 1993; Liem et al., 1995; fotografias, cortesia de K.Liem.)
(E)

(A)

Conjunto secundário de neurônios motores Placa do assoalho ventral doada por outro embrião

Sinais dorsais

(D) Inibição dos sinais dorsais por Sonic hedgehog

Neurônios motores Indução de neurônios motores ventrolaterais Placa do assoalho ventral

Neurulação secundária
A neurulação secundária envolve a formação do cordão medular e seu subseqüente esvaziamento interno formando o tubo neural. Na rã e na galinha, esse tipo de neurulação é geralmente identificado na formação das vértebras lombar e da cauda. Em ambos os casos, a neurulação secundária pode ser vista como continuação da gastrulação. Entretanto, as células do lábio dorsal do blastóporo continuam a crescer

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

265

Notocorda Blastocele Placa neural presuntiva Movimentos de extensão posterior

Medula espinhal Canal ependimário Intestino Assoalho Te t o Notocorda Articulação cordoneural Parede posterior

Movimentos involutivos

Ectoderma (A) (B)

Lábio dorsal tardio (articulação cordoneural)

(C)

Ânus

Canal neurentérico

Figura 7.12

Movimentos celulares durante a neurulação secundária em Xenopus. (A) Involuçào da mesoderma no estágio de gástrula média.(B) Movimentos do lábio dorsal do blastóporo nos estágios de gástrula tardia/ gástrula precoce. A involução cessou e ambos, o ectoderma e o mesoderma do lábio tardio do blastóporo se movem posteriormente. (C) Estágio de girino precoce, onde as células revestindo o blastóporo formam o canal neurentérico, parte do qual se torna o lúmen do tubo neural secundário. (de Gont et al., 1993.)

ventralmente, em lugar de involuir para o embrião (Figura 7.12A,B). A região em crescimento, na ponta do lábio, é chamada articulação cordoneural (Pasteels, 1937), e contém precursores da porção mais posterior da placa neural e a porção posterior da notocorda. O crescimento dessa região converte a gástrula aproximadamente esférica, 1.2mm de diâmetro, em um girino linear com 9mm de comprimento. A ponta da cauda é um descendente direto do lábio dorsal do blastóporo, e as células que revestem o blastóporo formam o canal neurentérico. A parte proximal do canal neurentérico, funde com o ânus, enquanto que a porção distal se torna o canal ependimário (isto é, o lúmen do tubo neural) (Figura 7.12C; Gont et al., 1993). Na galinha, os tecidos localizados posteriomente ao neuróporo recentemente fechado são chamados de broto da cauda. Como o broto da cauda da rã, essa estrutura não é uma massa não diferenciada de células. Enxertando pequenas regiões do broto da cauda da codorna no broto da cauda da galinha, Catala e colaboradores (1995) mostraram que o broto de cauda precoce, já tem células com um destino determinado. Exatamente como no Xenopus, existe uma articulação cordoneural, e essa região contém as células que dividem-se para formar ambas, a notocorda e a corda medular. Como se dá na rã, essas células se movem posteriomente. O tubo neural se forma à medida que a corda medular produz pequenas cavidades, que se fundem umas às outras (Figura 7.13).

Diferenciação do tubo neural
A diferenciação do tubo neural nas várias regiões do sistema nervoso central ocorre simultaneamente de três maneiras diferentes. Em nível anatômico macro, o tubo neural e seu lúmen se expandem e se contraem para formar as câmaras do cérebro e a medula espinhal. A nível de tecido, a população celular da parede do tubo neural se rearranja para formar as regiões funcionalmente diferentes do cérebro e da medula espinhal. Finalmente, no nível celular, as próprias células neuroepiteliais se diferenciam em numerosos tipos de neurônios e células de suporte (gliais) presentes no corpo. Formação das regiões do cérebro O desenvolvimento precoce da maioria dos cérebros de vertebrados é parecido, mas como o cérebro humano é provavelmente a matéria mais organizada do sistema solar e o órgão mais interessante do reino animal, nos concentraremos no desenvolvimento daquele que supostamente faz o Homo sábio.

266

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

Figura 7.13

Formação do tubo neural secundário no embrião de galinha de 25-somitos. (A) A formação do cordão medular na ponta mais caudal do broto da cauda da galinha. (B) Cordão medular pouco mais anterior no broto da cauda. (C) Formação de cavidades do tubo neural e formação da notocorda. (D) Lumens coalescem para formar o canal central do tubo neural. (de Catala et al., 1995; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)

(B)

(C)

Notocorda

O tubo neural precoce de mamíferos é uma estrutura reta. Entretanto, mesmo antes que a porção posterior do tubo se forme, a porção mais anterior está sofrendo mudanças drásticas. Nessa região anterior, o tubo neural se expande em três vesículas primárias (Figura 7.14): cérebro anterior (prosencéfalo), cérebro médio (mesencéfalo) e cérebro posterior (rombencéfalo). Quando se fecha a ponta posterior do tubo neural, dilatações secundárias -as vesículas ópticas- se estendem lateralmente de cada lado do cérebro anterior em desenvolvimento. O cérebro anterior se subdivide no telencéfalo anterior e o diencéfalo mais caudal. O telencéfalo formará os hemisférios cerebrais, e o diencéfalo formará o tálamo e o hipotálamo e também a região que recebe os impulsos neurais da retina. Na verdade, a própria retina é uma derivação do diencéfalo. O mesencéfalo não se subdivide e seu lúmen se tornará o aqueduto cerebral. O rombencéfalo se subdividirá em um mielencéfalo posterior e um metencéfalo mais anterior. O mielencéfalo vai dar origem à medula oblongata (Bulbo), cujos neurônios dão origem aos nervos que regulam os movimentos respiratórios, gastrointestinais e cardiovasculares. O metencéfalo dá origem ao cerebelo, a parte do cérebro responsável pela coordenação dos movimentos, postura e equilíbrio. O cérebro posterior (rombencéfalo) desenvolve um modelo segmentado que especifica os lugares de onde se originam certos nervos. Alargamentos periódicos chamados rombômeros dividem o

(D)

Figura 7.14

Desenvolvimento precoce do cérebro humano. As três vesículas cerebrais primárias são subdivididas enquanto o desenvolvimento continua. A direita estão os derivados em adultos, formados pelas paredes e cavidades do cérebro. (De acordo com Moore e Persaud, 1993.)
Derivados Adultos Lobos olfativos - Cheiro 3 vesículas primárias Parede Cavidade Telencéfalo Cérebro anterior (Prosencéfalo) Cérebro médio (Mesencéfalo) Diencéfalo Retina Epitálamo Tálamo Hipotálamo Mesencéfalo Cérebro médio - Fibras nervosas entre os cérebro anterior e posterior, lobos ópticos e tectum. Cerebelo Mielencéfalo Ponte - Coordenação de movimentos musculares complexos - Fibras nervosas entre o cérebro e o cerebelo (somente mamíferos) - Centro reflexo de atividades involuntárias - Visão - Glândula pineal - Centro de retransmissão para neurônios ópticos e auditivos - Temperatura, sono e regulação respiratória 5 vesículas primárias Hipocampo Cérebro - Armazenamento de memória - Associação

Metencéfalo Cérebro posterior (Rombencéfalo)

Medula espinhal

Medula

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

267

rombencéfalo em compartimentos menores. Os rombômeros representam “territórios” separados de desenvolvimento onde células de cada rombômero podem se misturar livremente dentro dele, mas não com células de rombômeros adjacentes (Guthrie e Lumsden, 1991). Além disso, cada rombômero tem um destino de desenvolvimento diferente. Isso foi extensivamente estudado na galinha, onde os primeiros neurônios aparecem nos rombômeros de número par, r2, r4 e r6 (Figura 7.15; Lumsden e Keynes, 1989). Neurônios dos gânglios r2 formam o quinto nervo cranial (trigêmeo); aqueles do r4 formam o sétimo nervo cranial (facial) e o oitavo (vestibuloacústico); o nono nervo cranial (glossofaríngeo) nasce do r6. [ecto2.html] A expansão do cérebro embrionário precoce é notável em sua velocidade, extensão e no fato de que isso resulta primariamente em um aumento de tamanho de cavidade e não de crescimento de tecido. Em embriões de galinha, o volume do cérebro expande 30 vezes entre os dias 3 e 5 do desenvolvimento. Considera-se que essa rápida expansão é causada por uma pressão fluida positiva, exercida contra as paredes do tubo neural pelo fluido no seu interior. Seria de se esperar que essa pressão do fluido fosse dissipada pela medula espinhal, mas isso parece não acontecer. Na verdade, enquanto as pregas neurais vão fechando a região entre o cérebro presuntivo e a medula espinhal, o tecido dorsal circundante empurra para dentro, produzindo uma constrição no tubo, na base do cérebro (Figura 7.16; Schoenwolf e Desmond, 1984; Desmond e Schoenwolf, 1986; Desmond e Field, 1992). Essa oclusão (que também ocorre no embrião humano) efetivamente separa a região cerebral presuntiva da futura medula espinhal (Desmond, 1982). Se for removida a pressão do fluido na porção anterior de um tubo neural assim ocluído, o cérebro da galinha aumenta a uma velocidade muito menor e contém um número menor de células, quando comparado com embriões controles, normais. A região ocluída do tubo neural abre novamente após a expansão inicial, rápida, dos ventrículos cerebrais.

2

4

6

Figura 7.15

O cérebro posterior (Rombencéfalo) de um embrião de galinha de 2 dias, aberto para mostrar as paredes laterais. Neurônios foram visualizados pela marcação com anticorpo para proteínas de neurofilamentos. Rombômeros 2, 4 e 6 podem ser identificados pela alta densidade de axônios nesse estágio precoce do desenvolvimento. (de Lumsden e Keynes, 1989, cortesia de A. keynes.)

(A)

(B)

(D)

Figura 7.16

Oclusão do tubo neural para permitir a expansão da futura região do cérebro. (A) Corante injetado na porção anterior do tubo neural de galinha de 3 dias, enche a região do cérebro mas não passa para a região espinhal. (B,C) Seção do tubo neural da galinha na base do cérebro (B) antes da oclusão e (C) durante a oclusão. (D) A reabertura da oclusão, após aumento inicial do cérebro, permite a passagem do corante da região do cérebro para a da medula espinhal. (Cortesia de M. Desmond.)

268

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Informações adicionais

&

Especulações

Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio

A

identidade ântero-posterior de cada vesícula do cérebro de mamíferos é especificada durante a gastrulação pelo mesoderma precordal e pela notocorda. Essa especificação parece ser estabilizada no estágio de placa neural, por interações a nível do ectoderma. Somente as moléculas principais envolvidas na especificação dos cérebros anterior e médio serão aqui discutidas; os detalhes da especificação do cérebro posterior e da medula espinhal pelo gene Hox serão discutidos no Capítulo 16. As regiões dos cérebros anterior e médio são definidas pelo mesoderma subjacente e pela notocorda anterior. Os genes Lim1 e Otx2 são expressos por esses tecidos mesodérmicos anteriores. Se um deles não está presente, o embrião não forma o cérebro anterior ou o médio. Na parte caudal, em relação ao rombômero 2, os embriões parecem normais (Figura 7.17; Acampora et al., 1995; Shawlot e Behringer, 1995). Rubenstein e Puelles (1994) propuseram que o cérebro anterior é composto por seis regiões neuroméricas chamadas prosômeros. Os prosômeros p1-p3 correspondem ao diencéfalo e os prosômeros p4-p6 ao hipotálamo (ventralmente) e ao telencéfalo (dorsalmente). Os limites prosoméricos coincidem com os limites de expressão de vários genes que são considerados importantes na especificação neural. Eles também são considerados como limitantes de respostas a certos estímulos externos. A interface p2/p3

pode ser crítica na modelagem da região do cérebro anterior. Essa interface corresponde a uma zona limitans e é também a fonte de Sonic hedgehog, uma proteína difusível considerada indutora de modelagem durante a gastrulação e formação de membros (Figura 7.18; Rubenstein e Puelles, 1994). Uma das regiões críticas para o desenvolvimento do cérebro médio é a borda entre o metencéfalo/mesencéfalo que normalmente dará origem aos tecidos do istmo. Aqui não se verifica uma fronteira morfológica, mas ela é marcada pela porção mais posterior, onde se expressa o gene Otx2. Quando tecido da junção mesencéfalo médio e anterior é transplantado ao diencéfalo ou rombencéfalo, ele induz as células que o rodeiam a desenvolver destinos mesencefálicos (no diencéfalo) ou cerebelares (no rombencéfalo) (Figura 7.19A; Bally-Cuif e Wassef,

Prosencéfalo

Mesencéfalo Mes/Met limite

Metencéfalo

Rombencéfalo

Medula espinhal En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) shh (Sonic hedgehog)

Figura 7.18

Estrutura neuromérica do cérebro com superposição dos hipotéticos eventos indutivos. A área limite mesencéfalo/metencéfalo é positiva para a expressão dos genes Fgf8 e Wnt1. A borda p2/p3 é considerada a fonte da proteína Sonic hedgehog. (de acordo com Bally-Cuif e Wassef, 1995.)

Figura 7.17

Fenótipo sem cabeça de camundongo deficiente em Lim1. Dois camundongos com “knockout” de Lim1 estão na parte de baixo da figura; um filhote do tipo selvagem está na parte de cima. A maioria dos mutantes Lim1 morrem antes do nascimento. As pinas do ouvido (flechas) são as estruturas mais anteriores nesses mutantes. (de Shawlot e Behringer, 1995; cortesia dos autores.)

1994; Marin e Puelles, 1994). Se a junção for girada pode se dar uma “triplicação”, pois tecidos em ambos os lados do enxerto são induzidos (Figura 7.19B). Essa região indutora mes/met parece ser controlada pelo fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8). Crossley e colegas (1996) verificaram que esse tecido formador de istmo secreta FGF8. Mais ainda, quando transplantaram partículas contendo FGF8 para o diencéfalo ou o rombencéfalo, eles obtiveram duplicadas as mesmas estruturas do cérebro médio. Partículas controle embebidas em salina não mostraram essa duplicação. As partículas

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

269

com FGF8 também induziram a expressão de três genes nos tecidos circundantes Wnt1, Engrailed-2 e o próprio Fgf8. Esses três genes são normalmente expressos na região do istmo. Wnt1 e Engrailed são considerados importantes na formação do cerebelo. Mesmo que o cerebelo não expresse genes Wnt1, camundongos

deficientes em Wnt1 não possuem a região do cérebro médio e nem o cerebelo (McMahon e Bradley, 1990; Thomas e Cappecchi, 1990). Wnt1 parece manter a expressão do gene Engrailed nas células precursoras cerebelares, permitindo a sua proliferação (Dickinson et al., 1994; Danielian e McMahon, 1996). [ecto3.html]

Figura 7.19

(A) Mesencéfalo Diencéfalo Mes/Met limite Cérebro médio e cerebelo Tectum

A região da junção mesencéfalo/metencéfalo (“mes/met”) pode agir como um indutor do desenvolvimento do cérebro médio e da expressão “engrailed” quando rodada ou transplantada a outras regiões do cérebro. (A) O transplante da junção mes/met induz a expressão do gene engrailed e das estruturas do cérebro médio e cerebelo em posições ectópicas. (B) Rotação da junção mes/met causa “triplicação” de certas estruturas, como o tectum óptico. Abreviações: gt, griseum tectale; TS, torus semicircularis: P1, segmento pre-tectal; P2, segmento talâmico dorsal; cb, cerebelo; ot, tectum óptico; ist, istmo; III, terceiro nervo cranial ou oculomotor; IV, quarto nervo cranial ou troclear. A polaridade postulada é representada por flechas. (B de acordo com Rubenstein e Puelles, 1994.)

Região expressando En Telencéfalo En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) Cérebro posterior (B) Diencéfalo Mesencéfalo ist/cb istmo/ cerebelo Rombencéfalo Metencéfalo Cérebro médio Rombencéfalo Cerebelo

Peça invertida

Indução da estrutura mesencefálica

Duplicação e polarização relativa ao tecido cerebelar En mais próximo

Mesencéfalo Diencéfalo Diencéfalo

Mesencéfalo

Eixo longo Rombencéfalo Rombencéfalo

270

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Tecido Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central Os neurônios do córtex cerebral estão organizados em camadas, cada uma tendo diferentes funções e conexões. O tubo neural original é composto de um neuroepitélio embrionário, formado por uma única camada de células. Essa população de células divide-se rapidamente. Sauer (1935) e outros mostraram que essas células estão presentes na parede do tubo neural continuamente, da borda luminal até a borda externa, mas como seus núcleos estão em diferentes alturas, tem-se a impressão que a parede do tubo neural é composta por diversas camadas de células. A síntese de DNA (fase S) ocorre quando o núcleo está na borda externa do tubo, e o núcleo migra luminalmente enquanto a mitose continua (Figura 7.20). A mitose ocorre no lado luminal da camada celular. Durante o desenvolvimento precoce de mamíferos, 100% das células do tubo neural incorporam timidina radioativa ao DNA (Fujita, 1964). Logo em seguida, certas células não mais incorporam esses precursores de DNA, indicando que não estão mais participando da síntese de DNA e da mitose. Essas células neurônicas e da glia podem, agora, se diferenciar na periferia do tubo neural (Fujita, 1966; Jacobson, 1968). Se células em divisão são marcadas com timidina radioativa em um único estágio de seu desenvolvimento e seus descendentes são identificados no córtex externo do cérebro adulto, isso significa que os neurônios tiveram que migrar para sua posição cortical a partir do neuroepitélio embrionário. Isso acontece quando a célula se divide “verticalmente” em lugar de “horizontalmente”. Nesses casos, a célula adjacente ao lúmen fica ligada à superfície ventricular, enquanto a outra célula filha se afasta (Chenn McConnell, 1995). Essa divisão é a ultima do neurônio e é chamada de “aniversário” do neurônio. Diferentes neurônios e células gliais têm seus aniversários em tempos diferentes. Marcação em diferentes pontos do desenvolvimento mostra que células com aniversários mais precoces migram distâncias mais curtas. Células com aniversários mais tardios, migram através dessas camadas para formar as regiões superficiais do córtex. A diferenciação que se segue depende da posição que esses neurônios ocupam uma vez fora da região de células em divisão (Letourneau, 1977; Jacbson, 1991).

Figura 7.20

Seção esquemática do tubo neural de um embrião de galinha, mostrando a posição do núcleo de uma célula neuroepitelial como função do ciclo celular. Células mitóticas são encontradas próximo ao centro do tubo neural, adjacente ao lúmen. (B) Micrografia eletrônica de varredura de um tubo neural de galinha, recém-formado, mostrando células em diferentes estágios do ciclo celular. (A de acordo com Sauer, 1935; B, cortesia de K. Tosney.)
(A) Estágio do ciclo celular

(B)

Lúmen do tubo neural

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

271

Placa cortical (CP) Zona intermediária (I) Medula espinhal Camada ependimária (E) Zona ventricular germinal (V) Camada granular externa (EG)

Lâmina dissecans (L) Zona marginal (M) Camada granular (GL) Zona subventricular (S) Camada das células de Purkinje (P)

“Camada molecular” de axônios das células granulares

Cerebelo

Tubo neural Camada molecular

Neocórtex Córtex cerebral Massa branca

Enquanto as células adjacentes ao lúmen continuam a se dividirem, as células migratórias formam uma segunda camada ao redor do tubo neural original. Essa camada se torna progressivamente mais espessa à medida que mais células do neuroepitélio embrionário são adicionadas. Essa nova camada é chamada zona do manto (ou intermediária) e o epitélio embrionário é agora chamado de zona ventricular (e, mais tarde, epêndima) (Figura 7.21). As células da zona do manto se diferenciam em neurônios e células gliais. Os neurônios fazem conexões entre si e emitem axônios se afastando do lúmen, criando portanto uma zona marginal pobre em células. Células gliais cobrem muitos desses axônios da zona marginal com bainhas de mielina, dando-lhes uma aparência esbranquiçada. Assim, a zona do manto, contendo os corpos celulares, é freqüentemente referida como massa cinzenta, e a camada marginal, axonal, como massa branca. O esquema básico de três camadas: a ependimária, a do manto e a marginal é mantido durante todo o desenvolvimento, tanto na medula espinhal como no bulbo. A massa cinzenta (manto) gradualmente adquire uma estrutura com forma de borboleta rodeada pela massa branca; ambas são envolvidas por tecido conjuntivo. À medida que o tubo neural amadurece, um sulco longitudinal -sulcus limitans- aparece para dividi-lo em duas partes, dorsal e ventral. A porção dorsal recebe estímulos dos

Figura 7.21

Diferenciação das paredes do tubo neural. Seção de um tubo neural humano de 5 semanas, contendo 3 zonas: ependimária, manto e marginal. Na medula espinhal e no bulbo (linha superior), o epêndima é a única fonte de neurônios e células gliais. No cerebelo (linha do meio) uma segunda camada mitótica, a camada granular externa, se forma na região mais remota do epêndima. Neuroblastos dessa camada migram de volta para a zona intermediária para formar as células do grânulo. No córtex cerebral (linha inferior), os neuroblastos ou glioblastos em migração formam uma placa cortical contendo seis camadas. (De acordo com Jacobson, 1991.)

272

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

(D) Epiderme

Região presuntiva basal

Região presuntiva alar

Sulcus limitans

(E)

Gânglio da raiz dorsal Nervo espinhal Neurônio sensorial Neurônio somático motor

Figura 7.22

Neurônio de associação Raiz dorsal

Desenvolvimento da medula espinhal humana. (A-D) O tubo neural é funcionalmente dividido nas regiões dorsal (alar, A) e ventral (basal, B), separadas pelo sulcus limitans. Enquanto os condroblastos da região esclerótoma do somito formam as vértebras espinhais, o tubo neural se diferencia nas zonas ependimária, do manto e marginal, e o teto e o assoalho se tornam distintos. (E) Um segmento da medula espinhal com suas raízes sensoriais (alar) e motoras (basal). (De acordo com Larsen, 1993.)

Camada marginal

Camada do manto

Camada ependimária (ventricular)

neurônios sensoriais, enquanto a porção ventral está envolvida na realização de várias funções motoras (Figura 7.22). Organização do cerebelo No encéfalo, a migração celular, o crescimento diferencial e a morte celular seletiva produzem modificações no modelo de três camadas, especialmente no cerebelo e no cérebro. Alguns neurônios penetram a massa branca para diferenciarem-se em aglomerados de neurônios chamados núcleos. Cada núcleo desempenha o papel de uma unidade funcional, servindo como uma estação de retransmissão entre as camadas externas do cerebelo e outras partes do encéfalo. Além disso, as células neurônicas precursoras, em divisão, neuroblastos, migram para a superfície externa do cerebelo em desenvolvimento, formando uma nova zona embrionária, camada embrionária externa, próxima ao limite externo do tubo neural. No limite externo da camada embrionária externa (na espessura de uma ou duas células), os neuroblastos proliferam. Na parte interna da camada estão os neuroblastos pós-mitóticos que são os precursores dos neurônios mais importantes do córtex do cerebelo, as células granulares. Essas células neuronais pré-granulares migram de volta para a massa branca do cerebelo em desenvolvimento para produzir células neurônicas granulares em uma região chamada camada granular interna. Enquanto isso, a camada ependimária original do cerebelo origina uma grande variedade de neurônios e células gliais, incluindo os notáveis e grandes neurônios de Purkinje. Cada um deles tem um enorme aparelho dendrítico, que se espalha como um leque sobre o corpo celular em forma de bulbo. Uma célula de Purkinje típica pode formar até 100.000 sinapses com outros neurônios, mais do que qualquer outro neurônio estudado. Cada neurônio de Purkinje também emite um axônio delgado que se comunica com outras células nos núcleos cerebelares profundos. O desenvolvimento de uma organização espacial é crítico para o funcionamento correto do cerebelo. Todos os impulsos regularão a atividade da células de Purkinje, que são os únicos neurônios que liberam impulsos para fora do córtex cerebelar. Para

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

273

que isso aconteça, as células adequadas devem se diferenciar no tempo e local adequados. Como isso acontece? Um mecanismo considerado importante para posicionar neurônios jovens dentro de encéfalo de mamíferos em desenvolvimento é o direcionamento glial (Rakic, 1972; Hatten, 1990). Através do córtex, os neurônios parecem caminhar no “monotrilho da glia” para seu respectivo destino. No cerebelo, os precursores das células granulares caminham nos longos prolongamentos da glia de Bergmann (Figura 7.23; Rakic e Sidman, 1973; Rakic, 1975). A interação neuroglial consiste em uma complexa e fascinante série de eventos, envolvendo reconhecimento recíproco entre a glia e o neuroblasto (Hatten, 1990; Komuro e Rakic, 1992). O neurônio mantém sua adesão à célula da glia através de várias proteínas, a mais importante sendo uma proteína de adesão chamada astrotactina. Se a astrotactina na célula nervosa é mascarada pelo seu respectivo anticorpo, a célula nervosa não adere ao prolongamento da glia (Edmondson et al., 1988; Fishell e Hatten, 1991). A análise de mutações neurológicas no camundongo poderá, em breve, fornecer conhecimentos novos sobre os mecanismos de ordenação espacial. Mais de 30 mutações conhecidas afetam o arranjo de neurônios cerebelares. Muitos dos mutantes cerebelares foram encontrados porque o fenótipo de tais mutantes - principalmente a inabilidade de manter o equilíbrio ao andar - pode ser facilmente reconhecido. Por razões óbvias essas mutações são identificadas na língua inglesa com nomes como weaver, reeler, staggerer e waltzer. [ecto4.html], [ecto5.html]

Figura 7.23

Migração neurônica em prolongamentos gliais. (A) Diagrama com um neurônio cortical migrando em um prolongamento da célula glial. (B) Micrografia eletrônica da região onde a soma do neurônio adere ao prolongamento glial. (C) Fotografias seqüenciais de um neurônio migrando em um prolongamento de glia cerebelar. A extremidade anterior do neurônio apresenta várias extensões filopódicas. Ela atinge velocidades de 60 µm/hora em sua migração nos prolongamentos gliais. (A de acordo com Rakic, 1975; B de Gregory et al., 1988; C de Hatten, 1990, cortesia de M. Hatten.)

(B)

(A)

Processo condutor do neurônio

(C)

Neurônio em migração

Processo da célula glial

274

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Organização cerebral A disposição em três zonas é também modificada no cérebro, que é organizado de duas maneiras distintas. Primeiro, de maneira análoga ao cerebelo, a organização vertical é feita em camadas que interagem entre si (veja Figura 7.21). Certos neuroblastos da zona do manto migram na glia através da massa branca para dar origem a uma segunda zona de neurônios. Essa nova zona de manto é chamada córtex do neopáleo. Esse córtex se estratifica em seis camadas de corpos celulares e a forma adulta desses neurônios do neopáleo só se completa na metade da infância. Cada camada do córtex cerebral é diferente da outra em relação às suas propriedades funcionais, os seus tipos de neurônios e os conjuntos de conexões que produzem. Por exemplo, neurônios da camada 4 recebem seu principal estímulo do tálamo (a região que se forma do diencéfalo), enquanto os neurônios na camada 6 enviam sua maior produção de volta para o tálamo. Segundo, horizontalmente o córtex cerebral está organizado em mais de 40 regiões que regulam, anatomica e funcionalmente, processos distintos. Por exemplo, neurônios da camada cortical 6 do córtex visual projetam axônios para o núcleo lateral geniculado do tálamo, enquanto neurônios da camada 6 do córtex auditivo (localizado mais anteriormente que o córtex visual) projetam axônios ao núcleo médio geniculado do tálamo. Nem a organização vertical e nem a horizontal são especificamente clonadas. Na verdade, existe um grande número de movimentos celulares que misturam a descendência de várias células precursoras. Após sua mitose final, a maioria dos neurônios recém- gerados migram radialmente, ao longo dos prolongamentos da glia, para fora da zona ventricular (ependimária) e formam a placa cortical abaixo da pia-mater do cérebro. Assim como no córtex cerebelar, os neurônios com os “aniversários” mais cedo formam a camada mais próxima do ventrículo. Os neurônios subseqüentes caminham distâncias maiores para formar as camadas mais superficiais do córtex. Isso forma um gradiente de desenvolvimento “ao avesso” (ou “invertido”) (Figura 7.24; Rakic, 1974). Uma única célula germinativa pode produzir neurônios (e células gliais)

Figura 7.24

“Gradiente invertido” na formação do córtex cerebral no macaco rhesus. Os “aniversários” dos neurônios corticais foram determinados injetando [3H]-timidina endovenosamente nos animais em determinados tempos de gestação. Após o nascimento dos animais, verificou-se que as células mais fortemente marcadas eram aquelas que estavam na fase S do seu último ciclo de divisão. Essas células migraram para várias regiões e foram detectadas por autoradiografia de cortes microscópicos. A figura representa a posição desses neurônios indicados no córtex visual. O tempo de gestação no macaco rhesus é de 165 dias. Os neurônios mais jovens estão na periferia do tubo neural (De acordo com Rakic, 1974.)

Injeções de [3H] - timidina Camadas corticais

Massa branca Camada ventricular

Dias de gestação

Nascimento

CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma

275

(A)

[3H]-timidina no dia embrionário 29

(C)

(D)

Migração neural do hospedeiro Migração neural do hospedeiro
Camadas corticais

Porcentagem de neurônios marcados com [3H]-timidina

Camada intermediária

Massa branca Camadas corticais [3H]-timidina no dia pós-natal 1

Camada ventricular

Célula glial Destino condicionado ao hospedeiro quando transplantado na fase S.

Destino independente da célula quando transplantada após última fase S.

Figura 7.25

Massa branca Camadas corticais

Determinação de identidade laminar em cérebro de doninha. (A) Precursores neuronais “precoces” (aniversários no dia embrionário 29) migram para a camada 6. (B) Precursores neuronais “tardios” (aniversários no dia pós-natal 1) migram mais adiante para as camadas 2 e 3. (C) Quando os precursores precoces (vermelho) são transplantados em zonas ventriculares mais velhas, após sua última fase S mitótica, os neurônios que eles formam migram para a camada 6. (D) Se esses precursores são transplantados antes ou durante sua última fase S, seus neurônios migram (com os neurônios do hospedeiro) para a camada 2. (De acordo com McConnell e Kaznowski,1991.)

em qualquer das camadas corticais (Walsh e Cepko, 1988). Mas, como é que a célula reconhece a camada na qual deve entrar? McConnell e Kaznowski (1991) mostraram que a determinação da identidade laminar (isto é, para qual camada a célula migrará) é feita durante a divisão celular final. Células transplantadas de cérebros jovens (onde elas formariam a camada 6) para cérebros mais velhos, cujos neurônios migratórios estão formando a camada 2 após sua última divisão, mantêm seu destino e migram somente para a camada 6. Entretanto, se as células são transplantadas antes de sua divisão final (na metade da fase S), elas não têm destino fixo e podem migrar para a camada 2 (Figura 7.25). Os destinos de células progenitoras mais velhas são mais determinados. As células cerebrais corticais progenitoras precoces têm o potencial para transformarem-se em qualquer neurônio (nas camada 2 ou 6, por exemplo), mas as células corticais progenitoras tardias dão origem somente a neurônios da camada superior (camada 2) (Frantz e McConnell, 1996). Ainda não conhecemos a natureza da informação transmitida à célula ao ser fixado o seu destino. Nem todos os neurônios migram radialmente. O’Rourke e seus colegas (1992) marcaram neurônios jovens com corante fluorescente e seguiram sua migração através do cérebro. Enquanto mais ou menos 80% dos jovens neurônios migraram radialmente em processos gliais, da zona ventricular para a placa cortical, aproximadamente 12% deles migraram lateralmente de uma região funcional do córtex para outra. Essas observações estão de acordo com aquelas de Walsh e Cepko (1992), que infectaram células ventriculares com um retrovírus e conseguiram corar essas células e seus descendentes após o nascimento. Eles descobriram que os descendentes neurais de

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PARTE II Padrões de Desenvolvimento

uma única célula ventricular estavam dispersos através das regiões funcionais do córtex. Quando neurônios do córtex do cérebro anterior foram transplantados para a região que formaria o corpo estriado, essas células adquiriram a morfologia do estriado (Fishell, 1995). Portanto, a especificação de funções determinadas pelas áreas corticais ocorre após a neurogênese. Considera-se que chegando a seu destino final, as células produzem moléculas adesivas específicas que as organizam e as agrupam como núcleos cerebrais (Matsunami e Takeichi, 1995). O cérebro é bastante plástico e o desenvolvimento do córtex neopáleo humano é particularmente notável a esse respeito. O cérebro humano continua a se desenvolver na velocidade do desenvolvimento fetal, mesmo após o nascimento (Holt et al., 1975). Baseado em critérios morfológicos e de comportamento, Portmann (1941, 1945) sugeriu que, comparada com outros primatas, a gestação humana deveria durar 21 meses em lugar de 9. Entretan