INDICE

Introducción ......................................................................................................................1
Marco Teórico...................................................................................................................2
Objetivos:..........................................................................................................................3
6.1 Objetivo General ..................................................................................................3
6.2 Objetivos Específicos ...........................................................................................3
Marco Metodológico.........................................................................................................3
7. 1 Toma de la muestra..............................................................................................3
7.2 Procesamiento de la muestra.................................................................................3
7.2.1 Determinación de pH..................................................................................3
7.2.2 Pre enriquecimiento y Aislamiento............................................................4
7.2.3 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias.............................4
7.3 Mejoramiento y Diseño de Medio ................................................................4
7.5 Determinación de actividad enzimática. Método p-nitrofenil fosfato...................5
Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias........................................5
Bibliografía......................................................................................................................11
11.1 ANEXO I. Método de Determinación de pH ...................................................13
11.2 ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS...................................14
ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática p-nitro fenil fosfato
.....................................................................................................................................15
10.3.1 Curva Patrón...................................................................................................15
11.3.2 Preparación Buffer fosfato......................................................................15

Introducción
Es frecuente que en los suelos tropicales, los bajos niveles de nutrientes
disponibles para las plantas, principalmente aquellos indispensables como
el fósforo, condicionen la productividad de los cultivos; especialmente en las
regiones sometidas a temperaturas altas. El fósforo es un limitante del
crecimiento de las plantas en regiones como El Chaco, por lo que es muy
poco soluble. El fenómeno de fijación del fósforo en el suelo, (el que es
altamente dependiente del pH), causa una baja eficiencia de los fertilizantes
fosforados solubles, el cual tiende a precipitarse en forma de fosfato
dicálcico o fosfatos de aluminio y hierro; los microorganismos
solubilizadores de fosfatos son un componente del suelo, el cual puede
solubilizar fósforo precipitado y otros compuestos fosfatados.

El problema radica en los sustratos orgánicos que son fuente importante de

fósforo y que deben pasar a hacer fuente disponible, pasando de fósforo
orgánico a inorgánico, por que las plantas solo pueden tomarlos como ión
ortofosfato, esto se logra mediante hidrólisis por enzimas fosfatasas ácidas,
pues el fósforo soluble es un nutriente limitado en un ecosistema natural.

Localización de la zona de estudio

1
El muestreo del suelo se realizó en la provincia del Napo en la zona del
Chaco, la región tiene una temperatura aproximada de 23°C, el sector de
estudio abarca 1 hectárea y va a ser destinada para uso agrícola.

En un análisis previo de fósforo en el suelo se obtuvo 159.23 mg/kg de

fósforo total; 4.08 mg/kg de fósforo soluble, por lo tanto 155.15 mg/kg
corresponde al fósforo insoluble lo que representa a una alta cantidad de
fósforo que no puede ser aprovechado por las plantas para crecer y
desarrollar su potencial genético.

Niveles de P en el suelo son obligatorios para mantener la productividad y

promover la eficiente utilización de nitrógeno en los cultivos. Una deficiencia
de fósforo en las plantas se manifiesta con signos en las hojas, influye en el
crecimiento haciéndolo lento y retrasando la maduración, con la posibilidad
de un menor desarrollo radicular y menor floración.

Es de gran importancia la presencia de microorganismos que desarrollen

mecanismos para incrementar la disponibilidad del fósforo para los cultivos
siendo capaces de movilizar el fosfato insoluble a formas solubles
disponibles para las plantas.

Por esta razón el suelo presenta una gran alternativa de solución a este
problema, pues su elevada carga enzimática y bacteriana aumenta la
solubilización de los nutrientes haciendo que puedan ser asimilables por las
raíces. De esta manera incrementar la viabilidad de fósforo en el suelo
ayudando a reducir la aplicación de fósforo en forma de fertilizantes
químicos, reduciendo la contaminación química en los suelos y promover
una agricultura sostenible.

Marco Teórico
IMPORTANCIA DEL FOSFORO

Luego del Nitrógeno, el Fósforo es un fertilizante esencial para el desarrollo

y el crecimiento de las plantas como para microorganismos. Su principal
función fisiológica es intervenir en procesos de acumulación y liberación de
energía durante el metabolismo celular; sin embargo, el fósforo soluble es
un nutriente limitado para producción de biomasa en un ecosistema natural.

Dependiendo del tipo de suelo, se puede decir que entre un 50-60%

corresponde a la fracción orgánica, mientras que el resto se encuentra en
forma inorgánica. Las plantas absorben el fósforo en forma inorgánica en
estado soluble, pero cuando se introduce al suelo, más del 90% de esta
pasa rápidamente a formas solubles no disponibles. De esta manera, gran
parte de los fertilizantes fosfatados que se aplican no son utilizados por las
plantas, sino que se almacenan en el suelo.

Las plantas deben absorber el elemento del suelo, donde se encuentra en

muy baja concentración. Estos índices bajos del nutriente se deben a que el
fosforo soluble reacciona con iones como el calcio, el hierro o aluminio que
provocan su precipitación o fijación, disminuyendo su disponibilidad para los
vegetales.

2
pH

La disponibilidad del Fósforo depende del pH del suelo, porque solo puede
ser tomado como ion ortofosfato, el pH óptimo para que el ortofosfato sea
viable en el suelo es alrededor de 6.5 ya que la precipitación de los fosfatos
de aluminio y calcio disminuye.
Un pH alto o bajo puede desnaturalizar la enzima y por consiguiente
inactivarse. El pH del medio es importante para el crecimiento de los
microorganismos, la mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un
pH neutro, un inadecuado pH puede inhibir en crecimiento o alterar los
procesos metabólicos normales.

Objetivos:
6.1 Objetivo General

 Aislar y seleccionar microorganismos solubilizadores de

fosfatos a partir de un suelo para uso agrícola de la provincia
del Napo.

6.2 Objetivos Específicos

 Aislar en medios de cultivo: SMRS y un medio diseñado,

microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de suelo
para uso agrícola de la provincia del Napo.
 Diseñar un medio de cultivo con una solución de fosfato.
 Evaluar la actividad fosfatasa mediante la técnica p-
nitrofenilfosfato

Marco Metodológico
7. 1 Toma de la muestra

Se toma 500 g de muestra por 5 muestras puntuales obtenidas en muestreo

aleatorio simple, se depositan en bolsas plásticas selladas. Se almacenan a
temperatura ambiente para su transporte y luego se conservan bajo
condiciones de refrigeración a 4˚C hasta su procesamiento en el laboratorio.

7.2 Procesamiento de la muestra

El procesamiento previo de la muestra de suelo se compone de los pasos
que se describen a continuación:

7.2.1 Determinación de pH

El pH influye en el proceso del suelo debido a la acción que ejerce sobre los
microorganismos presentes; en los procesos el pH varía de acuerdo al
tiempo, en respuesta a los materiales que son utilizados, a los productos y
compuestos intermedios de la degradación de estos.

3
Se realiza la medición de pH de las muestras de suelo por el método de
pasta de saturación según el ICONTEC. (ANEXO I)

7.2.2 Pre enriquecimiento y Aislamiento

Se pesan 10g de muestra de suelo las cuales se homogenizan en

erlenmeyers con 90 ml de agua de peptona 0.1% (p/v) y se adiciona 0.5g de
fosfato ácido de calcio y 0.5g de goma arábiga. Los recipientes de las
muestras se mantienen a 30˚C en agitación a 150 rpm por 72 horas.

A partir de los erlenmeyers en los que se hizo el pre enriquecimiento, se

realizan diluciones seriadas desde 10-1 a 10-8 en tubos de ensayo con 4.5 ml
de agua peptonada al 0.1% (p/v) con el fin de aislar microorganismos de
interés. Para determinar la población microbiana se siembra en medio
diseñado con adición de Cloranfenicol, cuando el medio esté estéril (ver a
ANEXO II), y se aplica el método de recuento por extensión.

Se realizan las diluciones mencionadas anteriormente, se inoculan 0.1 ml de

muestra en la superficie del medio. Las placas de agar se dejan secar por 15
minutos sin invertir a temperatura ambiente; posteriormente se llevan a
incubar a 30˚C por hasta 48 horas hasta que se observen halos de
solubilización alrededor de las colonias, este halo se mide en cada colonia
con un criterio de selección según el índice de solubilización.

IS = A/B
Donde:
A = Diámetro total (diámetro de la colonia + diámetro del halo)
B = Diámetro de la colonia

Se escogen las placas que tienen colonias aisladas y además son menos de
40 colonias (entre 10 y 20) para realizar el recuento.

7.2.3 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias

La identificación macroscópica de las colonias se realiza teniendo en cuenta

características de su aspecto como tamaño, color y textura, se identifica la
morfología microscópica realizando tinción Gram y tinción azul algodón de
lactofenol.

7.3 Mejoramiento y Diseño de Medio

El requerimiento nutricional se basa en la composición química de la célula,

se forma primordialmente de C, H, O, N y otros en menor cantidad pero
también importantes como el P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe entre otros, incluye
vitaminas, aminoácidos purinas y pirimidinas. El pH del medio es importante
para el crecimiento de los microorganismos la mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro.

Se modificará la formulación del medio SMRS reemplazando el fosfato

tricálcico por una solución de fosfato, utilizando goma arábiga y
CaHPO4.2H2O

4
TABLA I. Medio De SMRS TABLA II. Medio Diseñado

REACTIVO CANTIDAD REACTIVO CANTIDAD

(g/l) (g/l)
Glucosa 10 Glucosa 10
Fosfato tricálcico 5 Solución de (ver Anexo
Cloruro de sodio 0.2 fosfato II)
Sulfato de 0.5 Cloruro de sodio 0.2
amonio Sulfato de amonio 0.5
Sulfato de 0.3 Sulfato de 0.3
magnesio magnesio
Extracto de 0.5 Extracto de 0.5
levadura levadura
Cloruro de 0.2 Cloruro de potasio 0.2
potasio Sulfato de Hierro 0.002
Sulfato de Hierro 0.004 Sulfato de 0.004
manganeso
Cloranfenicol 0.1
Condiciones ambientales: temperatura 30°C.

7.5 Determinación de actividad enzimática. Método p-

nitrofenil fosfato

El principio de la técnica se basa en el uso de una fracción artificial de un

sustrato orgánico (p-nitro fenil fosfato) el cual es hidrolizado por fosfatasas
del tipo fotomonoestereasas para obtener HPO4.

Para probar la actividad de la fosfatasa basta con ajustar el pH del medio de

incubación, estableciendo condiciones ácidas o alcalinas, y en casi todos los
ensayos para fosfatasa se emplea p-nitrofenilfosfato como sustrato, ya que
es incoloro y por acción de la fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a partir
del cual se genera p-nitrofenolato que produce color amarillo en condiciones
alcalinas.

El aumento de coloración con el tiempo de incubación, medido a 450 nm

con un espectrofotómetro, es un indicador del nivel en el que el sustrato es
hidrolizado por la fosfatasa una vez que la reacción se detiene y la solución
se alcaliniza. (Técnica ver anexo III)

RESULTADOS
Una vez aisladas las cepas se prosigue a:

Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias

BACTERIAS
Características macro y microscópica de las cepas aisladas.

CEPA CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS

MICROSCOPICAS MACROSCOPICAS
Cepa 1 Cocos Gram positivos Colonias lisas, bordes irregulares, blancas
(BSP1)

5
Cepa 2 Cocos Gram positivos Colonias lisas, estrellada, blancas
(BSP2
Cepa 3 Cocos Gram negativos Colonias lisas, redondas, amarillas

De las cuales únicamente se conservaron 2 cepas pues mostraron mayor actividad

enzimática.
HONGOS
Características macro y microscópica de las cepas aisladas.

CEPA CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS

MICROSCOPICAS MACROSCOPICAS
Cepa 1 Mucor Tienen hifas tabiculares y Blancos, bordes definidos,
conidioforas cuya cabeza está
localizada en el extremo de un
hifa, compuesta por una vesícula
rodeada por una corona de
fiálides en forma de botella
directamente insertadas sobre la
vesícula.8 De las fiálides se
desprenden las esporas
Cepa 2 Chysosporium: conidiosporas Lilas,
muchas con hifas hialinas
vegetativas y ramificadas
irregularmente
Cepa 3 Acremonium: conidias Blancos,
elipsoidales que se acumulan en
los extremos de fiálides largas y
finas; clamidosporas ovales.
Surgen como ramas laterales de
la hifa.
Cepa 4 Aspergillus conidias oscuras Verdes,
formando un racimo de esporas;
los conidióforos aparecen de
color pardo amarillento claro y
septos tabiques gruesos.

Cepa 5 Cladosporium: hongo Café verdosa

filamentoso con conidióforos
con cadenas ramificadas de
conidios elipsoides de extremos
redondeados.

De las cuales únicamente se conservaron 3 cepas pues mostraron mayor actividad

enzimática.
HONGOS
 Chysosporium

 Cladosporium

6
  Acremonium

 Aspergillus

 Mucor

1. Comportamiento de la Actividad enzimática en función del

tiempo

Datos de la Curva de Calibración

A
Concentración A 450nm A 450nm promedio
umol/ml
0.05 0.046 0.051 0.049
0.1 0.062 0.065 0.064
0.2 0.205 0.209 0.207
0.3 0.298 0.289 0.294
0.4 0.346 0.356 0.351
0.5 0.398 0.402 0.400
0.6 0.469 0.478 0.474
0.7 0.612 0.62 0.616
0.8 0.709 0.715 0.712
0.9 0.823 0.815 0.819
1 0.905 0.916 0.911

7
Datos de la experimentación:
PARA HONGOS:
UP UP UP
HOR Concent (µmol/min Concentra (µmol/min Concentra (µmol/min
A ABS ración L) ABS ción L) ABS ción L)
muc muc
aspergillus umol/ml aspergillus or umol/ml mucor or umol/ml Mucor
0.03 0.01
0 0.041 0.053 0.879 0 0.040 0.674 0 0.018 0.302
0.05 0.05
0.5 0.077 0.093 1.550 0 0.063 1.047 0 0.063 1.047
0.08 0.06
1 0.098 0.116 1.941 7 0.104 1.736 8 0.083 1.379
0.09 0.09
1.5 0.111 0.131 2.183 9 0.118 1.960 8 0.116 1.932
0.10 0.11
2 0.120 0.141 2.351 0 0.119 1.978 3 0.133 2.221
0.10 0.12
4 0.147 0.171 2.854 3 0.122 2.034 8 0.150 2.500
0.14 0.15
6 0.160 0.186 3.096 0 0.163 2.724 0 0.175 2.910
0.22 0.24
8 0.245 0.281 4.680 5 0.258 4.307 0 0.275 4.587
0.10 0.29
10 0.357 0.406 6.766 0 0.119 1.978 0 0.331 5.518

8
PARA BACTERIAS:
UP UP
(µmol/min (µmol/min
ABS Concentración L) ABS Concentración L)
HORA BSP1 umol/ml BSP1 BSP2 umol/ml BSP2
0 0.020 0.029 0.488 0.015 0.024 0.395
0.5 0.036 0.047 0.786 0.030 0.040 0.674
1 0.057 0.071 1.177 0.067 0.082 1.364
1.5 0.079 0.095 1.587 0.089 0.106 1.774
2 0.100 0.119 1.978 0.099 0.118 1.960
4 0.134 0.157 2.612 0.103 0.122 2.034
6 0.159 0.185 3.078 0.140 0.163 2.724
8 0.200 0.230 3.841 0.183 0.211 3.525
10 0.234 0.268 4.475 0.100 0.119 1.978

9
 2. Preservación

HONGOS
Se conservaron aquellas cepas que presentaron mayor actividad enzimática
 Aspergillus
 Mucor
 Cladosporium
En crioviales en agua esteril a temperatura de refrigeración

BACTERIAS
Se conservaron:

En crioviales en BHI con el 20% de glicerol

CONSLUSIONES
1. A partir del suelo de la región del Chaco provincia del Napo fue
posible aislar 3 cepas de hongos y 2 cepas bacterianas.

2. El medio diseñado puede ser alternativa para el aislamiento y

desarrollo de bacterias fosfato solubilizadoras.

3. Se determino la actividad de los Hongos, el Aspergillus tiene 6.766 UP

(µmol/min L), en tanto los otros dos géneros Mucor y Cladosporium
presentaron una actividad menor. 1.978 UP (µmol/min L) y 5.518 UP
(µmol/min L).

4. En tanto en las bacterias la mayor actividad enzimática se consiguió

con la bacteria SP1 con un valor de 4.475 UP (µmol/min L), en tanto la
bacteria SP2 tiene un valor de 1.978 UP (µmol/min L); siendo la más
eficiente la bacteria SP1

10
 5. Al comparar los resultados de actividad enzimática se determino que
los hongos aislados tienen mejor actividad frente a las bacterias, pues
los valores obtenidos son más altos.

RECOMENDACIONES
1. Realizar identificación bioquímica de hongos y bacterias aislada

FIGURA I. Cepas Aisladas de Hongos Solubilizadores de Fosfato.

Bibliografía

1. BROCK, T. D. y M- T. MADIGAN, “Ecología

Microbiana”, Prentice Hall Hispanoamericana, México, Págs. 655 –
685.
2. PLASTER, EDWARD J., “La ciencia del suelo y su
manejo”. Primera Edición, Madrid, Editorial Thomson, 2005.
3. National Plant Food Institute, “Manual de
Fertilizantes”, Segunda Edición, México, Editorial Limusa, 1992

Direcciones Electrónicas

11
1. http://www.slideshare.net/desarrollo_sostenible/como-hacer-y-
usar-el-compost-1444481?src=related_normal&rel=1444478

2. http://www.uteq.edu.ec/u_investigacion/uict/guias/Triptico_Estudio
%20de%20Mercado_Poster.pdf

3. http://www.quito.cipotato.org/PRESENTACIONES/Resumenes/Articu
lo%20cientifico%20de%20Wilian%20Viera%20y%20Gustavo
%20Bernal.doc

4. http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/Compostaje_Pescador.pdf

12
 1. ANEXOS

11.1 ANEXO I. Método de Determinación de pH

Norma Técnica Colombiana 5167. ICONTEC.

Determinación del pH del Suelo: La determinación del pH se puede

realizar en pasta de suelo saturada en agua. Para ello se añade a la
muestra, sin pesar, cantidades de agua hasta obtener una pasta espesa. Se
deja macerar durante media hora y se procede a la medida potenciométrica
del pH.

pH (pasta saturado)

• Valor normal entre 6.5 - 7.5

Preparación de la Pasta Saturada

Colocar de 500 g de suelo en un recipiente de saturación se le agrega agua

destilada lentamente y se va amasando hasta obtener una pasta lo más
homogénea posible. Se agrega tanta agua como sea necesaria para obtener
una pasta Saturada. Se debe eliminar el aire lo más completamente posible.
Esto permitirá obtener una alícuota volumétrica de suelo lo suficientemente
representativa. A partir de esta pasta es posible obtener tantas alícuotas
como sea necesario.
Para determinar el pH de la Pasta Saturada preparada tal como se describió
anteriormente, se introduce el electrodo del potenciómetro directamente en
la pasta saturada y se toma la lectura.

En la pasta del suelo Saturado

1. Pese aproximadamente 500 g de suelo.

2. Colóquelos en un recipiente apropiado y añada agua destilada en
pequeñas cantidades, mezclando bien después de cada adición hasta
lograr su saturación, la cual se alcanza cuando, sin quedar agua libre
en la superficie del suelo, ésta adquiere una apariencia brillante, fluye
ligeramente al inclinar el recipiente donde se encuentra y no se
adhiere a la espátula al introducirla en la pasta de suelo.
3. Si observa agua en la superficie de la pasta, debe añadir un poco más
de suelo hasta lograr la saturación de la misma.
4. Proceda a tomar la lectura del pH en el potenciómetro, introduciendo
con cuidado el electrodo.

13
11.2 ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS

Fuente de carbono: Glucosa

Fuente de fósforo: Fosfato Tricálcico

COMPONENTE g/L
Glucosa 10
Extracto de
0.5
Levadura
Púrpura de
0.1
Bromocresol
Ca3(PO4)2 5
Agar 15

Medio base: (NH4)2SO4 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSO4.H2O 0,3 g; FeSO4.7H2O 0,004 g;
NaCl 0,2 g;

ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo Diseñado

Fuente de carbono: Glucosa

Fuente de fósforo: Solución de fosfato (goma arábiga 0.5 g, CaHPO4. 2H2O
0.5 g) en 100 ml de agua destilada.

COMPONENTE g/L
Glucosa 10
Extracto de
0.5
Levadura
Cloranfenicol 0.1
Agar 18

Medio base: (NH4)2SO4, 0,5 g; KCl, 0,2 g; MgSO4.H2O, 0,3 g; MnSO4.H2O, 0.004 g;
FeSO4.7H2O, 0,002 g; NaCl, 0,2 g. en 900 ml de agua destilada

NOTA: Ajustar el pH del medio a 7.2 con una solución de NaOH 0.1 N

14
ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática
p-nitro fenil fosfato

10.3.1 Curva Patrón

Preparar una solución de p – nitrofenil a una concentración de

1umol/ml, simultáneamente preparar 100 ml de una solución buffer
de fosfato (Na2HPO4 1M) a pH 7.0. Preparar concentraciones
conocidas de p – nitro fenol empleando buffer fosfato (ANEXO 10.3.2).
Los cálculos se realizarán mediante una ecuación:

C1V1 = C2V2

Donde:
C1 = p – nitro fenil 1umol/ml
V1 = volumen de nitro fenil requerido
C2 = concentración en umol/ml a la que se quiere llegar
V2 = volumen de muestra en cada tubo

Medir los valores de absorbancia en un espectrofotómetro a una

longitud de onda de 450 nm.

Tomar 0.7ml de cada una de las muestras, las cuales fueron

adicionadas a tubos con 0.9 ml de p – nitrofenil fosfato al 0.08%, 1%
y 1.5% (v/v) dejando actuar durante 1 hora a 35ºC, adicionar 1.6 ml
de NaOH 0.02N para frenar la reacción. Las muestras someter a
centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos, luego leer las
absorbancias a 450 nm en espectrofotómetro.

11.3.2 Preparación Buffer fosfato

Para un volumen de 100 ml se adiciona 57.7ml de Na2HPO4 1M para

obtener un pH de 7.0.

Curva patrón de p – nitro fenol

Preparar una solución de p – nitro fenol de 1 umol/ml en buffer fosfato

pH 7.0 a partir de esta y utilizando la ecuación C1V1 = C2V2
Se utilizará espectrofotómetro, la lectura se realizara a 450 nm,
colocando 3 ml del blanco (buffer fosfato solo) y los demás de cada
concentración, realizando la lectura por triplicado.
Realizar regresión lineal determinado de la ecuación de la recta y el
coeficiente de correlación lineal debe ser mayor de 0.9.

Concentraciones para la curva de calibración 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,

0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 µmol/ml

15