You are on page 1of 45

UNIVERZITET U NOVOM SADU

TEHNOLOŠKI FAKULTET

Instrumentalne metode analize

ODREĐIVANJE SELENA U PREHRAMBENIM PROIZVODIMA


ELEKTROTERMALNOM ATOMSKOM APSORPCIONOM
SPEKTROFOTOMETRIJOM

-diplomski rad-

Branislava D. Milić

Novi Sad, 2009. godine


UNIVERZITET U NOVOM SADU
Tehnološki fakultet

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Redni broj:
RBR

Identifikacioni broj:
IBR

Tip dokumentacije:
TD Monografska publikacija

Tip zapisa:
TZ Tekstualni štampani materijal

Vrsta rada:
VR Diplomski rad

Autor:
AU BRANISLAVA D. MILIĆ

Mentor/Ko-mentor:
MN Dr JAROSLAVA ŠVARC-GAJIĆ

Naslov rada:
NS Određivanje selena u prehrambenim proizvodima
elektrotermalnom atomskom apsorpcionom
spektrofotometrijom
Jezik publikacije:
JZ srpski (latinica)

Jezik izvoda:
JI srpski/engleski

Zemlja publikovanja:
ZP Srbija

Uže geografsko područje:


UGP Vojvodina

Godina:
GO 2009.

Izdavač:
IZ autorski reprint

Mesto i adresa:
MS 21000 Novi Sad, Srbija, Bulevar Cara Lazara 1

Fizički opis rada:


FO broj poglavlja: 5
broj strana: 33
lit. citata: 22
tabela: 3
slika/grafikona: 8

Naučna oblast:
OB Hemija
Naučna disciplina:
DI Analitička hemija

Predmetna odrednica/Ključne reči:


PO selen, atomska apsorpciona spektrofotometrija

UDK

Čuva se:
ČU U biblioteci Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu, 21000 Novi
Sad, Srbija, Bulevar Cara Lazara 1

Važna napomena:
VN Nema

Izvod: U ovom radu je definisana metoda za određivanje selena u


prehrambenim proizvodima iz grupe čajnog peciva i testenine
primenom atomske apsorpcione spektrofotometrije u grafitnoj
kiveti. Pored osnovnih eksperimentalnih uslova tehnike u radu je
ispitano i više različitih modifikatora. Definisana je metoda
pripreme uzoraka mikrotalasnom digestijom. Primenom
definisanog postupka sadržaj selena je određen u većem broju
prehrambenih proizvoda, tipa testenine i čajnog peciva, domaćih i
stranih proizvođača.

Datum prihvatanja teme od strane NN Veća:


DP 15.05.2009.

Datum odbrane:
DO

Članovi komisije:
(Naučni stepen/ime i prezime/zvanje/fakultet)
KO
Predsednik: Prof. Zvonimir Suturović, redovni profesor Tehnološkog fakulteta
u Novom Sadu
Mentor: Dr Jaroslava Švarc-Gajić, docent Tehnološkog fakulteta u Novom
Sadu
Član: Dr Biljana Pajin, docent Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu
UNIVERSITY OF NOVI SAD
Faculty of Technology

KEYWORDS DOCUMENTATION

Accession number:
ANO

Identification number:
UNO

Document type:
DT Monographic publication

Type of record:
TR Textual material, printed

Contents code:
CC B. Sc. thesis

Author:
AU BRANISLAVA D. MILIĆ

Menthor/co-menthor:
MN Assistant Professor JAROSLAVA ŠVARC-GAJIĆ

Title:
TI Determination of selenium in foodstuffs by electrothermal
atomic absorption spectrometry
Language of text:
LT Serbian (Times New Roman) (scr)

Language of abstract:
LS Serbian (Times New Roman) (scr)/English

Country of publication:
CP Serbia

Locality of publication:
LP Vojvodina

Publication year:
BY 2009.

Publisher:
PB author’s reprint

Publ. Place:
PL 21000 Novi Sad, Serbia, Bulevar Cara Lazara 1

Physical description:
PD Chapters: 5
Pages: 33
References: 22
Tables: 3
Figures/Graphs: 8

Scientific field:
SF Chemistry
Scientific discipline:
AD Analytical Chemistry

Subject/Key words:
SX Selenium, Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry

UC

Holding data:
HD Library of the Faculty of Technology, Novi Sad, 21000, Novi
Sad, Serbia, Bulevar Cara Lazara 1

Note:
N B. Sc. thesis= Diplomski rad
Faculty of Technology=Tehnološki fakultet

Abstract:
AB This study describes a method development for the determination
of selenium in pastry and pasta dietary products by electrothermal
atomic absorption spectrometry. Besides basic experimental
parameters of the technique the influence of several different
modifiers was investigated. Sample preparation method by
microwave digestion was defined. Using the defined method
selenium was determined in domestic and foreign pastry and pasta
food products.

Accepted by the Scientific Board on:


ASB 15.05.2009.

Defended on:
DE
Thesis defend board:
(Degree/name/surname/title/faculty)
DB

President: Prof. Zvonimir Suturović, Sr. Professor, Faculty of Technology,


University of Novi Sad
Menthor: Ph. D. Jaroslava Švarc-Gajić, Assistant Professor, Faculty of
Technology, University of Novi Sad
Member: Ph. D. Biljana Pajin, Assistant Professor, Faculty of Technology,
University of Novi Sad
Najsrdačnije se zahvaljujem mentoru Dr
Jaroslavi Švarc-Gajić, docentu Tehnološkog
fakulteta u Novom Sadu na velikoj pomoći pri izradi
ovog rada. Na saradnji i pomoći se zahvaljujem
gospodinu Saši Popov. Na moralnoj i svakoj drugoj
pomoći i podršci zahvaljujem se svojoj porodici i
Slobodanu.
SADRŽAJ

1. Uvod ................................................................................................................................ 1
2. Teorijski deo ................................................................................................................... 2
2.1. Atomska apsorpciona spektrofotometrija (AAS)..................................................... 2
2.1.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar ............................................................. 3
2.1.1.1. Svetlosni izvori .......................................................................................... 3
a. Šuplja katodna lampa ................................................................................... 3
b. Lampa sa električnim pražnjenjem .............................................................. 4
c. Kontinualni izvor .......................................................................................... 5
2.1.1.2. Elektrotermalni atomizeri .......................................................................... 6
a. Grafitni atomizer .......................................................................................... 7
2.1.1.3. Atomizacija u plamenu .............................................................................. 8
2.1.1.4. Modifikatori matriksa ................................................................................ 8
2.1.1.5. Smetnje u AAS .......................................................................................... 9
a. Hemijske smetnje ......................................................................................... 9
b. Fizičke smetnje........................................................................................... 10
c. Spektralne smetnje...................................................................................... 10
d. Jonizacione smetnje.................................................................................... 10
e. Smetnje usled apsorpcije pozadine............................................................. 10
2.1.1.6. Optimizacija uslova plamene atomizacije ............................................... 12
2.1.2. Hidridna tehnika.............................................................................................. 12
2.2. Metode razaranja uzorka ........................................................................................ 13
2.2.1. Suvi postupak razaranja organskog materijala ............................................... 14
2.2.2. Razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina ............................... 14
a. Razaranje u otvorenom sistemu.................................................................. 14
b. Razaranje u zatvorenom sudu .................................................................... 15
2.2.2.1. Razaranje mikrotalasima.......................................................................... 15
a. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u otvorenom sistemu ................. 15
b. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u zatvorenom sistemu................ 16
2.2.3. Razaranje UV-zracima .................................................................................... 16
2.2.4. Razvoj metode razaranja uzorka mikrotalasima u zatvorenom sudu.............. 17
2.3. Selen....................................................................................................................... 17
2.4. Metode određivanja selena .................................................................................... 19
3. Eksperimentalni deo...................................................................................................... 22
3.1. Aparatura i pribor................................................................................................... 22
3.2. Hemikalije i rastvori .............................................................................................. 23
3.3. Uzorci ..................................................................................................................... 23
3.4. Priprema uzorka ..................................................................................................... 24
4. Rezultati i diskusija ....................................................................................................... 25
4.1. Ispitivanje uticaja i odabir modifikatora ................................................................ 25
4.1.1. Linearnost ....................................................................................................... 25
4.1.2. Reproduktivnost .............................................................................................. 26
4.2. Granica detekcije ................................................................................................... 27
4.3. Određivanje selena u realnim uzorcima ................................................................. 28
5. Zaključak....................................................................................................................... 31
6. Literatura ....................................................................................................................... 32
1. UVOD

Poslednjih decenija određivanje selena privlači značajnu pažnju, pre svega zbog
njegovog velikog biološkog značaja. Selen se u organizam unosi putem hrane i spada u
mikroelemente koji su neophodni za normalno funkcionisanje ljudskog organizma. Količina
selena koja se unosi u organizam zavisi od vrste hrane i tipa zemljišta na kojem se ta hrana
uzgaja.
Zbog velikog biološkog značaja selena razvijano je mnogo metoda za njegovo
određivanje u prehrambenim proizvodima. Neke od tih tehnika uključuju: gasnu hromatografiju,
elektrohemijsku striping analizu, atomsku apsorpcionu spektrofotometriju, nuklearnu magnetnu
rezonancu, induktivno spregnutu plazmu-atomsku emisionu spektrofotometriju [1].
Pomenute tehnike se zasnivaju na različitim principima i svaka od njih ima prednosti, u
odnosu na druge tehnike, ali i mane. Najznačajnije prednosti atomske apsorpcione
spektrofotometrije u grafitnoj kiveti u odnosu na druge tehnike su: potrebna mala količina uzorka
za analizu, niska granica detekcije, malo spektralnih smetnji nastalih usled preklapanja
apsorpcione linije analita sa apsorpcionim linijama drugih prisutnih elemenata u rastvoru uzorka,
kao i činjenica da je instrument veoma robustan [2].
Kako bi se uzorak uspešno analizirao njegova priprema se mora vršiti na adekvatan
način. Različite tehnike zahtevaju različitu pripremu uzoraka. Neki od načina pripreme uzoraka u
zavisnosti od analita, matriksa, uzorka i primenjene tehnike su: ekstrakcija, suvi postupak
razaranja organskog materijala, razaranje UV-zračenjem, razaranje mikrotalasima [3]. Prednosti
razaranja mikrotalasima u odnosu na druge načine pripreme su to što je potrebno kratko vreme
za potpuno razaranje uzorka. Razaranjem u zatvorenom sudu izbegnuti su gubici analita usled
isparavanja i smanjena je mogućnost kontaminacije. Elektronska kontrola postupka obezbeđuje
veoma reproduktivne uslove razaranja a samim tim je smanjeno angažovanje čoveka.
Cilj ovog rada je da se razvije brza, selektivna i reproduktivna metoda za određivanje
selena u nekim prehrambenim proizvodima. U skladu sa tim biće ispitan i definisan uticaj
različitih modifikatora na određivanje selena atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom u
grafitnoj kiveti. Uzorci će biti pripremljeni razaranjem mikrotalasima u zatvorenom sudu.
Metoda će biti primenjena za analizu prehrambenih proizvoda iz grupe testenina i čajnog peciva
domaćih i stranih proizvođača.

1
2. TEORIJSKI DEO

2.1. Atomska apsorpciona


spektrofotometrija (AAS)
Atomska apsorpcija je proces koji se dešava kada atom u osnovnom stanju apsorbuje
energiju u obliku elektromagnetnog zračenja specifične talasne dužine, rezonantne talasne
dužine, i biva preveden u ekscitovano stanje. Apsorpcioni spektar elementa sastoji se od serija
rezonantnih linija koje nastaju kada element iz osnovnog elektronskog stanja pređe u različita
ekscitovana stanja. Uglavnom je prelaz između osnovnog i prvog ekscitovanog stanja praćen
linijom najjačeg intenziteta koja se najčešće koristi za određivanje elementa.
Prelaz elementa iz osnovnog u ekscitovano stanje se dešava kada atomi u osnovnom
energetskom stanju prime određeni iznos energije koji je proporcionalan frekvenciji njegovog
prelaza do sledećeg energetskog nivoa. Pri tome se samo deo energije ukupnog zračenja izvora
(P0 ) apsorbuje. Intenzitet propuštene svetlosti dat je sledećom formulom:

P = Po e − ( εl)
Gde je:
ε - apsorpcioni koeficijent analita,
l - horizontalna putanja dužine zračenja kroz plamen.
Atomska apsorpcija se meri merenjem razlike ukupnog zračenja rezonantnih linija u
prisustvu i odsustvu atoma analita. Širina emitovane linije svetlosnog izvora mora biti reda
veličine apsorpcione linije analita. Ovaj zahtev izvora svetlosti ispunjava cev sa šupljom
katodom o kojoj će u daljem tekstu biti više reči.
Količina apsorbovane energije iz snopa zračenja na talasnoj dužini rezonantne linije će
zavisiti od količine atoma u osnovnom energetskom stanju. Odnos između količine apsorbovane
energije i koncentracije ispitivanog elementa se može odrediti pomoću serije standardnih
rastvora. Nepoznate koncentracije elementa u uzorcima se određuju upoređivanjem količine
zračenja koje apsorbuju uzorci prema zračenju apsorbovanom od strane standardnih rastvora pri
istim uslovima atomizacije. Savremeni softveri instrumenata automatski izračunavaju
koncentraciju određivanog elementa u uzorku.

2
Tehnika AAS omogućava prilično osetljivo određivanje većine elemenata. Tako se npr.
atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom u grafitnoj kiveti bor može odrediti sa osetljivošću
od 43 µg / l , kadmijum i kalijum sa osetljivošću od 0,02 µg / l a magnezijum sa osetljivošću od
0,01 µg / l [1].

2.1.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar

Atomski apsorpcioni spektrofotometar se sastoji iz četiri osnovna dela: emisionog,


apsorpcionog, selekcionog i mernog dela. Uloga emisionog dela je da obezbedi izvor zračenja
rezonantne talasne dužine. Apsorpcioni deo je najvažniji deo aparata i ima zadatak da stvara
atome elementa u osnovnom stanju. U zavisnosti od načina atomizacije, ovi aparati se mogu
podeliti u dve grupe: plamene i besplamene [4]. Kod besplamenih instrumenata atomizacija se
može vršiti laserskim zracima, pomoću električnog luka u grafitnim kivetama ili katodnim
isparavanjem. Selekcioni deo, monohromator, ima ulogu da iz snopa svetlosnih zraka izdvoji uži
snop zraka. Kod ovih instrumenata uloga monohromatora je svedena na minimum jer izvor
zračenja obezbeđuje monohromatsko zračenje. Merni deo može biti fotoćelija ili
fotomultiplikator.
Moderni aparati imaju mogućnost biranja talasne dužine preko prekidača ili tastature.
Instrumentom se veoma jednostavno upravlja pomoću softvera integrisanog u instrument.
Softver u sebi sadrži prozore i padajuće menije koji korisniku pokazuju sve mogućnosti
aparature i omogućavaju da se na jednostavan način odaberu željeni uslovi analize. Ovakav način
upravljanja instrumentom korisniku dozvoljava da prati napredak bilo koje automatske sekvence
uključujući detalje metoda, signalnu grafiku, kalibraciju, izmerene parametre rastvora u
momentu posmatranja kako u toku analize tako i po njenom završetku, a moguće je i paralelno
štampanje izveštaja.

2.1.1.1. Svetlosni izvori

Svetlosni izvori u atomskom apsorpcionom spektrofotometru treba da obezbede


monohromatsko zračenje rezonantne talasne dužine. Najčešće korišćeni izvor svetlosti je šuplja
katodna lampa i lampa sa električnim pražnjenjem. Kontinualni izvori zračenja su novijeg
datuma ali će na ovom mestu i o njima biti reči.

a. Šuplja katodna lampa

Šuplja katodna lampa je najčešće korišćen izvor zračenja u atomskoj apsorpcionoj


spektrofotometriji. Njeni osnovni delovi su anoda, katoda i stakleni ili kvarcni izlazni prozor,
koji su zatvoreni u Pyrex cilindar [5] napunjen inertnim gasom (argon ili neon) pod pritiskom od
4-10 torr (1/760 atm=1 torr). Neonski gas obezbeđuje veći intenzitet emitovanih elementovih
linija. Neon se kao inertni gas koristi samo kada neonska emisiona linija leži u blizini rezonantne
linije katodnog elementa. Anodna žica se najčešće pozicionira duž cilindrične katode. Katoda je
izgrađena u vidu šupljeg cilindra prevučenog elementom čiji spektar treba proizvesti, ili u nekim
slučajevima, legure pažljivo odabrane mešavine metala koje spektralno ne interferiraju. Zaštitni
omotač (neprovodan) oko spoljašnjosti katode odmah iza oboda sprečava neželjena pražnjenja

3
oko spoljašnjosti katode. Izvori zračenja se u glavnom zagrevaju strujama do 30 mA. Šematski
prikaz šuplje katodne lampe sa svim njenim delovima prikazan je na slici 1.

Slika 1 - Šuplja katodna lampa

Šuplje katodne lampe emituju svetlost prolazeći kroz nekoliko faza. Saopštavanjem
potencijala između anode i katode gasno punjenje se jonizuje. Pozitivno naelektrisani joni se
sudaraju sa negativno naelektrisanom katodom. Atomi metala se nakon izbijanja iz katode dalje
ekscituju preko sudara sa jonizovanim gasom emitujući svetlost specifične talasne dužine za taj
element prilikom vraćanja iz ekscitovanog u osnovno atomsko stanje.
Pošto katoda lampi sadrži jedan element određivanje svakog pojedinačnog elementa
zahteva posebnu lampu. Ovo predstavlja osnovni nedostatak šupljih katodnih lampi.
Komercijalne lampe su dostupne za 65 pojedinačnih elemenata, ali je dostupno i 20
multielementnih lampi [5]. Lampe za pojedinačne elemente izrađene su za neke metale: Cs, Ln,
Os, Th, U, za radioaktivne elemente, plemenite gasove, dok su lampe za halogene, C, N, O i S
nedostupne. Male širine emisionih linija šupljih katodnih lampi obezbeđuju visoku selektivnost
određivanja iako, u zavisnosti od elementa, može doći do preklapanja apsorpcionih linija
različitih elemenata. Spektralna interferencija se može desiti kada različiti atomi apsorbuju
energiju na talasnim dužinama koje se razlikuju za 0,05 nm i manje. Spektralna preklapanja se
jedino mogu prevazići uklanjanjem interferentnog elementa ili, ako je moguće, izvođenjem
određivanja na drugoj apsorpcionoj liniji.

b. Lampa sa električnim pražnjenjem

Lampa sa električnim pražnjenjem (electrodeless discharge lamp - EDL) se sastoji od


elementa ili soli elementa smeštenih u kvarcnu cev ispunjenu atmosferom inertnog gasa.
Kvarcna cev se nalazi u keramičkom cilindru na koji je namotan radiofrekventni kalem. Kada se
primeni radiofrekventno polje dovoljne jačine, inertni gas se jonizuje i udružena energija izaziva
isparavanje elementa i ekscitovanje atoma unutar cevi, što rezultira emisijom karakterističnog
spektra. U većini instrumenata EDL i njeno postolje često su lako zamenljivi sa šupljom
katodnom lampom.
Šematski prikaz lampe sa električnim pražnjenjem dat je na slici 2.

4
Slika 2 – Lampa sa električnim pražnjenjem

U poređenju sa šupljom katodnom lampom EDL izvori obezbeđuju veći intenzitet


zračenja a samim tim i veću osetljivost određivanja. Ovi izvori nude veću preciznost a njihova
primena se preporučuje za analize u kojima je velik intenzitet šuma posledica slabe katodne
emisije. Izvori ovog tipa su dostupni za sledeće elemente: As, Bi, Cd, Cs, G, Hg, K, P, Pb, Rb,
Sb, Se, T, Ti, Tl, Zn [5].

c. Kontinualni izvor

Kontinualni izvori zračenja u AAS su savremeni izvori koji još uvek nemaju široku
primenu. Ovi savremeni izvori zračenja omogućavaju određivanje velikog broja elemenata, što
predstavlja značajnu prednost u odnosu na klasične katodne lampe koje se koriste uglavnom za
po jedan element. Odgovarajuća selektivnost se postiže primenom uz kontinualni izvor čak i do
dva-tri savremena monohromatora dobijena fotolitografskim postupkom. Izdvajanje trake
elektromagnetnog zračenja reda veličine atomske apsorpcione linije je postignuto sa najmanje
dva monohromatora. Izuzetne selektivnosti, a velik intenzitet upadnog zraka se postiže
specifičnom konstrukcijom ksenonskih lampi. Postoji tri vrste ksenonskih lampi [6]:
1. kontinualne ksenonske lampe kratkog električnog luka (xenon short-arc lamps)
2. kontinualne ksenonske lampe dugog električnog luka (xenon long-arc lamps)
3. ksenonske blic lampe (xenon flash lamps)
Osnovna konstrukcija svih tipova lampi je ista. Lampa se sastoji od balona izrađenog od
stakla ili kvarca sa elektrodama od volframa na svakom kraju. U staklenom balonu je vazduh
zamenjen ksenonom. Veoma mali luk između elektroda omogućava da se svetlost veoma tačno
usmerava iz lampe. Izgled ksenonske lampe prikazan je na slici 3.

5
Slika 3 - Ksenonska lampa

U AAS tehnikama se koristi prvi tip ksenonskih lampi, kratkog električnog luka. Omotač
lampe je izrađen od kvarca a elektrode od volframa su impregnirane torijumom. Kvarc je jedino
ekonomično rešenje za izradnju omotača jer podnosi visok pritisak (25 atm) i visoku temperaturu
a pri tom ostaje optički proziran. Torijum u elektrodama u velikoj meri poboljšava emisiju
elektrona sa elektroda. Kvarc i volfram imaju različite koeficijente toplotnog širenja, pa se
elektrode od volframa obmotavaju trakama čistog molibdena ili legure gvožđa i nikla (invar),
koje imaju nizak koeficijent toplotnog širenja, i zatim se utope u kvarc kako bi se obezbedilo
idealno zaptivanje.
Postoje dve modifikacije ksenonske lampe kratkog električnog luka: lampa sa čistim
ksenonom i mešavinom koja sadrži male količine žive.
U čistoj ksenonskoj lampi najveći deo svetlosti se stvara unutar malenog oblaka plazme,
veličine glave čiode, koji se nalazi u blizini vrha katode. Oblak je oblika kupe i intenzitet
emitovane svetlosti eksponencijalno slabi približavanjem anodi. Elektroni posle prolaska kroz
oblak plazme udaraju u anodu prouzrokujući njeno zagrevanje. Iz tih razloga anoda mora da
bude ili veća od katode ili da se hladi vodom. Ove lampe daju spektar koji je veoma blizak
sunčevoj svetlosti.
U ksenon-živa lampama svetlost koja se emituje se nalazi u malom oblaku plazme na
vrhu obe elektrode, veličine glave čiode. Oblik ovih oblaka je kao dve presecajuće kupe i
intenzitet emitovane svetlosti eksponencijalno opada ka vrhu svake kupe. Ove lampe emituju
belo-plavičast spektar i izuzetno snažnu emisiju u UV oblasti. Pored primene u analitici, ove
lampe se koriste još i u medicini, za sterilizaciju predmeta i stvaranje ozona.
Kako bi se postigla maksimalna efikasnost ksenonskih lampi, ksenon se unutar nje nalazi
pod velikim pritiskom (do 300 atm) što nosi sa sobom određene faktore rizika kao što je opasnost
od pucanja lampe. Čak pod ovako visokim pritiskom nedostatak ovih lampi predstavljaju snažne
emisione linije u infracrvenoj oblasti spektra, oko 850-900 nm, koje mogu činiti i do 10 %
ukupne emitovane svetlosti.

2.1.1.2. Elektrotermalni atomizeri

Elektrotermalna atomizacija se najčešće izvodi električnim lukom u grafitnoj kiveti iako


se može izvesti i laserskim zracima ili katodnim isparavanjem. Elektrotermalni (bezplameni)
atomizeri nude nekoliko značajnih prednosti u odnosu na plamenu AAS:
1. Potrebne su male količine uzorka, 10−8 − 10−11 g čvrstog ili 5-100 µ l tečnog

6
2. čvrste materije se mogu analizirati direktno, često bez posebne pripreme,
3. pozadinski šum je veoma mali, i
4. osetljivost se povećava zato što je proizvodnja slobodnih atoma analita efikasnija u
poređenju sa atomizacijom u plamenu.
Sa druge strane, komponente matriksa često mogu izazvati velike smetnje, i preciznost,
tipično 5-10 % (izraženo kao relativna standardna devijacija), ide u prilog plamenoj AAS.
Prilikom atomizacije analita besplamenim postupkom zagrevanje grafitne kivete se
izvodi postepeno, po fazama, kako bi se izveli sledeći koraci: sušenje, spaljivanje, i atomizacija.
1. U ciklusu sušenja uzorak se zagreva 20-30 s na 110 ° C da bi se ispario sav rastvarač i
isparljive komponente matriksa.
2. Korak spaljivanja se izvodi pri umereno visokoj temperaturi ( ∼ 500 ° C) da bi se
komponente matriksa visoke tačke ključanja isparile (masti i ulja) i organski deo
matriksa spalio. U ovom koraku može doći do gubitka analita ukoliko se analit
predugo drži na toj temperaturi ili ako je temperatura spaljivanja previsoka.
3. U atomizacionom koraku primenjuje se maksimalna snaga zagrevanja da bi se
temperatura kivete podigla do odabrane atomizacione temperature ili maksimalne
temperature kivete. Prisutni analit se ispari i razloži do slobodnih atoma koji će
apsorbovati svetlost iz AAS izvora. Poželjno je brzo merenje apsorpcionog signala u
ovoj fazi.

a. Grafitni atomizer

Grafitni atomizer se sastoji iz šupljeg grafitnog cilindra 28 mm dugačkog i 8 mm u


prečniku, unutrašnjosti prevučene pirolitičkim grafitom. Ranije je uobičajena konstrukcija
podrazumevala da je otvor kivete za unošenje uzorka bio okrenut na dole da bi se povećala
temperatura na tom mestu ili su se kivete sužavale ka sredini kako bi se oblikovale po optičkom
zraku i povećala gustina slobodnih atoma u njihovom središtu. Moderne kivete nemaju ni jednu
od ovih konstrukcija. Grafitna kiveta se nalazi između dve elektrode postavljene u liniji sa
svetlosnim izvorom. Dve najveće mane grafita su njegova poroznost i tendencija ka obrazovanju
karbida. Ove mane se delimično mogu prevazići presvlačenjem kivete pirolitičkim grafitom koji
je daleko manje porozan. Neki proizvođači proizvode cele kivete od pirolitičkog grafita. Staklasti
ugljenik se takođe može koristiti za izgradnju kiveta, ali to nije čest slučaj.
Grafitna kiveta se zagreva pomoću struje niskog napona (obično 10 V) i velike jačine (do
500 A) koji se reguliše potenciometrom. Zagrevanje treba da je veoma brzo kako bi se za kratko
vreme dostigle visoke temperature (2500 °C ). Atomizer se hladi vodom kako bi se postigao brz
povratak na niže temperature. Pri izboru temperature atomizacije treba voditi računa o tome da
temperatura ne bude previše visoka kako se ne bi nepotrebno oštetila kiveta, ali ne sme biti ni
previše niska da se ne izgubi na osetljivosti određivanja.
Grafitni atomizeri pružaju mogućnost analize tečnih i čvrstih uzoraka. Tečni uzorci se u
grafitnu kivetu uvode pomoću mikrošprica kroz mali otvor na sredini kivete. Inertni gas, često
argon, se u kivetu uvodi sa oba kraja i izlazi kroz prolaz kroz koji se uvodi uzorak. Tok inertnog
gasa otklanja otparene komponente matriksa i sprečava oksidaciju grafitne kivete u procesu
zagrevanja. U atomizacionom koraku se tog inertnog gasa isključuje. Čvrsti uzorci se mogu

7
postaviti u kivetu korišćenjem posebnih grafitnih čamčića. Korak uvođenja uzorka može biti
izvor zagađenja pa je poželjno koristiti autouzorkivač.

2.1.1.3. Atomizacija u plamenu

Plamena AAS je 60-tih i 70-ih godina 20. veka bila najčešće korišćena tehnika za analizu
metalnih tragova. Pojavom drugih tehnika kao što su ICP-MS, ICP-AES, nuklearna magnetna
rezonanca i dr. njena upotreba je smanjena, ali ne i potisnuta [7]. Primenjuje se kada je uzorak
tečan ili se lako prevodi u tečno stanje. Tečni uzorci se tankom cevčicom uvode u plamen. Pri
prolasku analita kroz plamen odigravaju se sedeći procesi:
1. isparavanje rastvarača: voda ili drugi rastvarač isparavaju ostavljajući sitne čestice
suve soli elementa;
2. sublimacija nastalih čestica: na visokoj temperaturi plamena suva so prelazi u gasno
stanje;
3. disocijacija molekula: deo ili svi molekuli disociraju oslobađajući atome u osnovnom
stanju.
U plamenoj AAS jedan od najčešćih uzroka smetnji predstavlja reakcija nastalih atoma
elementa sa radikalima ili atomima koji potiču od plamenih gasova. Čest je slučaj da atomi
određivanog elementa reaguju sa hidroksilnim radikalima ili atomskim kiseonikom iz plamena
pri čemu nastaju oksidi, hidroksidi ili hidridi metala. Tako nastali molekuli takođe se mogu
ekscitovati u plamenu emitujući elektromagnetno zračenje i time prouzrokujući značajne
smetnje.

2.1.1.4. Modifikatori matriksa

Modifikatori matriksa su hemijska jedinjenja koja se dodaju rastvoru uzorka kako bi se


analit lakše izdvojio iz matriksa oslobađajući ga od drugih jedinjenja prisutnih u matriksu koja
mogu izazvati interferencije. Ovo se može postići na dva načina. Prvi način je da se dodatkom
hemikalije snizi temperatura isparavanja matriksa i tako ubrza njegovo otklanjanje. Primeri ovih
reagensa su amonijum-nitrat, azotna kiselina, kiseonik ili vazduh. Pomenuti gasovi se često
koriste pri analizi bioloških uzoraka. Gasovi potpomažu sagorevanje organskog matriksa
oslobađajući analit.
Veliki broj modifikatora matriksa su namenjeni termalnoj stabilizaciji analita, smanjujući
njegovu isparljivost i time omogućavajući više temperature spaljivanja bez gubitka analita. Na
ovaj način se može ukloniti veća količina matriksa omogućavajući određivanje analita sa manje
interferencije. Primeri modifikatora ovog tipa uključuju neke prelazne metalne jone, npr. Ni, Pd
koji obrazuju stabilna jedinjenja sa analitom. Organske kiseline kao što su askorbinska, limunska
ili oksalna se takođe mogu koristiti u ovu svrhu. Često se koristi i kombinacija modifikatora.
Jedna od uobičajenih kombinacija je Mg i Pd-nitrat. Ova kombinacija se koristi u velikom broju
analiza pa se može označiti i kao univerzalni modifikator matriksa. Koncentracija modifikatora
je bitan parametar i zahteva pažljivu istragu u razvijanju metoda.

8
2.1.1.5. Smetnje u AAS

AAS spada u relativne metode kod kojih se pomoću rastvora poznate koncentracije
definiše zavisnost apsorbancije od koncentracije analita. Na osnovu definisane zavisnosti i
dobijenog kalibracionog dijagrama merenjem apsorbancije uzorka određuje se nepoznata
koncentracija analita u uzorku. Standardni rastvori i rastvori uzorka mogu biti različitog
hemijskog sastava pa nastaju različite greške. To rezultuje time da se pri istoj koncentraciji
analita u standardnom i rastvoru uzorka atomizacijom dobije različit broj atoma u osnovnom
stanju koji su sposobni za apsorpciju. Smetnje koje nastaju u AAS mogu se podeliti u pet
osnovnih grupa [4]:
1. hemijske smetnje
2. fizičke smetnje
3. spektralne smetnje
4. jonizacione smetnje
5. smetnje usled apsorpcije pozadine.

a. Hemijske smetnje

Hemijske smetnje predstavljaju najveći izvor problema u AAS. One mogu nastati kada
ispitivani element obrazuje hemijsku vezu sa drugim atomima ili radikalima prisutnim u plamenu
što onemogućava da se ukupna količina analita atomizuje i tako nastaje greška u određivanju. Još
jedan način nastajanja ovih smetnji je kada u plamenu nastaju teško isparljive soli koje ne
disociraju u potpunosti pa se ne prevede ukupna količina elementa u atomsko stanje već jedan
njen deo ostaje u vezanom obliku. Ove smetnje se mogu umanjiti ili izbeći na više načina. Jedan
od načina je korišćenje plamena više temperature ili korišćenje plamena pogodnijeg hemijskog
sastava.
Drugi način smanjenja hemijskih smetnji je dodatak pogodnog katjona ili anjona koji će
vezati druge anjone i katjone koji mogu reagovati sa ispitivanim elementom i na taj način se
ispitivani element „oslobađa“ i može se u celokupnoj količini atomizovati u plamenu. Dakle, ako
anjoni izazivaju smetnju dodaje se odgovarajući katjon i obrnuto. To su takozvani „oslobađajući
reagensi“ [4, 8]. Ovi reagensi se dodaju i u standardne rastvore iako u njima nema katjona ili
anjona koji izazivaju smetnje.
Oslobađanje analita od drugih atoma prisutnih u rastvoru se može vršiti na veoma
jednostavan način tečno-tečnom ekstrakcijom [8]. Često je dovoljno da se prostom jednostrukom
ekstrakcijom izdvoji najveći deo interferirajućeg jedinjenja tako da smetnje koje proizvodi budu
zanemarljive. Ukoliko je potrebno ukloniti svu količinu elementa koji stvara smetnje, ekstrakcija
se može ponoviti više puta.
Još jedan od načina uklanjanja hemijskih smetnji je izjednačavanje sastava rastvora
matriksa i standardnih rastvora. Ovo je moguće samo ukoliko je sastav matriksa jednostavan.
Hemijske smetnje je moguće umanjiti i vezivanjem ispitivanog elementa u kompleksno
jedinjenje koje će u plamenu lako disocirati. U rastvoru je, dakle, ispitivani element zaštićen
kompleksirajućim agensom i onemogućena je njegova reakcija sa drugim atomskim vrstama. Po

9
dostizanju u plamen, kompleksno jedinjenje lako disocira stvarajući na taj način atome u
osnovnom stanju. Kao kompleksirajući agens se može koristiti npr. EDTA.

b. Fizičke smetnje

Fizičke smetnje mogu nastati usled različitih fizičkih osobina standardnih rastvora i
rastvora uzorka. Fizičke osobine ovih rastvora koje se mogu razlikovati su viskoznost, površinski
napon, gustina rastvora, isparljivost rastvarača koji se koristi za pripremu rastvora uzorka.
Fizičke smetnje su često kombinovane sa hemijskim smetnjama a mogu ih izazvati različite
organske i neorganske materije. Efekti ovih smetnji su smanjenje brzine raspršivanja i povećanje
veličine raspršenih kapljica. Različite organske materije mogu izazvati redukcioni efekat u
plamenu jer se povećava broj ugljeničnih radikala u plamenu. Različita organska jedinjenja
takođe mogu uticati i na temperaturu plamena a mogu proizvesti i tipične hemijske smetnje
stvaranjem organskih jedinjenja sa metalima.

c. Spektralne smetnje

Spektralne smetnje nastaju kada dva elementa apsorbuju energiju na istoj talasnoj dužini.
Talasne dužine na kojima pojedini elementi apsorbuju svetlost su dobro definisane. Primenom
šupljih katodnih lampi koje emituju zračenje tačno određene talasne dužine spektralne smetnje su
svedene na minimum.

d. Jonizacione smetnje

Na visokim temperaturama dolazi do značajne jonizacije atoma većeg broja metala,


naročito onih atoma koji imaju niže jonizacione potencijale. Jonizovani atomi ne apsorbuju
elektromagnetno zračenje rezonantne talasne dužine. Jonizacija se dešava u plamenu viših
temperatura. Da bi se ona sprečila preporučuje se dodatak jonizacionog pufera u rastvor
ispitivanog uzorka. Kao jonizacioni pufer se koristi element koji ima niži jonizacioni potencijal.
To mora biti element koji neće interferirati spektralnim linijama ispitivanog elementa. Često se u
tu svrhu rastvorima dodaju elementi kao što su K, Cs, ili Cr u približno 100 puta većoj
koncentraciji. Elementi koji služe kao jonizacioni puferi će jonizovati na nižim temperaturama
nego ispitivani element povećavajući na taj način koncentraciju elektrona u plamenu čime će biti
suzbijena jonizacija ispitivanog elementa. Jonizacione pufere je pogodno koristiti kada se radi sa
uzorcima u kojima se određuj lako-jonizujući alkalni i zemnoalkalni metali.

e. Smetnje usled apsorpcije pozadine

Jedan od najznačajnijih tipova smetnji u AAS predstavlja pozadinska apsorpcija.


Pozadinska apsorpcija je odgovorna za smanjenje intenziteta upadnog zračenja do kojeg dolazi
usled rasipanja svetlosti na tečnim i čvrstim česticama prisutnim u plamenu i usled apsorpcije od
strane molekula ili radikala u plamenu. Ovi efekti se mogu kompenzovati uz pomoć UV lampi,
magnetnim poljem ili primenom velikih naponskih impulsa.
Jedan od najjednostavnijih načina pozadinske korekcije podrazumeva primenu
deuterijumske lampe ukoliko se određuju elementi sa rezonantnom talasnom dužinom u opsegu
od 180-350 nm, odnosno volfram halidnu lampu za elemente sa rezonantnom talasnom dužinom

10
u opsegu od 350-800 nm. Halidi su dvokomponentna hemijska jedinjenja koja se sastoje od
halogenog elementa (flor, hlor, brom, jod) i elementa ili radikala koji je manje
elektronegativnosti od halogena. Pri emisiji iz linijskog izvora zračenja kao što je šuplja katodna
lampa mereni signal odgovara atomskoj apsorpciji, apsorpciji molekulskih vrsta i čestičnog
rasipanja. Čestična rasipanja mogu se označiti kao nespecifična apsorpcija. Kada se koristi
kontinualni izvor, npr. deuterijumska lampa, količina atomske apsorpcije od strane ispitivanog
analita je zanemarljiva dok je količina nespecifične apsorpcije jednaka kao u slučaju korišćenja
linijskog izvora. Greška usled pozadinske apsorpcije se uklanja oduzimanjem signala merenog
pri korišćenju kontinualnog izvora od signala merenog pri korišćenju linijskog izvora.
Razvijene su i drugi načini pozadinske korekcije. Jedna od njih je sistem korekcije
apsorpcije pozadine Zeeman-ovim efektom. Atomska spektralna linija se u prisustvu snažnog
magnetnog polja može podeliti na tri komponente bliskih talasnih dužina. Magnetno polje se
može primeniti na više načina. Može se primeniti na izvor ili na same atome u transferzalnoj
(magnetno polje i zrak su pod uglom od 90 ° ) i longitudalnoj (paralelni su) konfiguraciji. U
najprostijem obliku transferzalnog Zeeman-ovog efekta atomska apsorpciona linija se pojavljuje
kao trokomponentna. π komponenta je smeštena na talasnoj dužini linije koju koristimo u
određivanju, σ+ i σ− komponente su smeštene na podjednakoj razdaljini sa obe strane osnovne
apsorpcione linije. σ komponente su linearno polarizovane normalno na magnetno polje. Ako je
polje dovoljne jačine ove komponente će ležati van atomskog apsorpcionog domena. Pri
korekciji pozadinske apsorpcije ovim postupkom primenjuje se magnetno polje frekvencije ~ 50-
60 Hz. Svaki ciklus merenja se sastoji od dve faze. U jednoj fazi je magnet isključen a u drugoj
uključen. Kada je magnet isključen meri se i atomska i pozadinska apsorpcija. Kada je magnet
uključen, atomske apsorpcione linije su podeljene i dve σ komponente ne uključuju atomsku
apsorpciju ali sadrže pozadinsku apsorpciju. Atomski signal se, dakle, može dobiti oduzimanjem
signala kada je magnet uključen od signala kada je magnet isključen.
Još jedna vrsta sistema pozadinske apsorpcije razvijena je od strane Smith-a i Hiefste-a.
Ova tehnika je korisna kada postoje snažne molekulske interferencije. Napajanjem šuplje
katodne lampe jednosmernom strujom mereni signal će poticati i od atomske i od molekulske
apsorpcije. Ako se lampa pulsira periodično na mnogo jače struje sprečene su praktično sve
atomske apsorpcije dok molekularne apsorpcije ostaju nepromenjene. Prostim oduzimanjem ova
dva signala dobija se signal atomske apsorpcije. Ovaj metod korekcije negativno utiče na životni
vek šuplje katodne lampe u odnosu na druge metode korekcije.
Pozadinska apsorpcija samog plamena potiče od vodonikovih molekula, OH radikala i
delimično sagorelih molekula gorućeg gasa i rastvarača. Ove vrste, zajedno sa oksidima i
hidroksidima metala sačinjavaju pozadinu plamena čija se korekcija može izvršiti na dva načina:
metodom skeniranja i modulacijom talasne dužine. Metoda skeniranja podrazumeva merenje
apsorbancije na talasnim dužinama nešto većim i manjim u odnosu na apsorpcionu liniju
elementa. Talasna dužina se podešava tako da se izmeri pozadinska apsorpcija na višoj pa zatim
na nižoj talasnoj dužini i te vrednosti se oduzmu od čitanja apsorpcione linije analita sa
pozadinom. Modulacija talasne dužine se može postići korišćenjem oscilatornog refraktornog
tanjira, vibrirajućeg ili rotirajućeg ogledala i oscilirajućih slitova. Sistem se postavlja pre ulaznog
slita (proreza) ili pre izlaznog slita monohromatora. Optički snop zraka refraktuje se i
prouzrokuje male oscilatorne pomeraje svetlosnog snopa koji napušta monohromator. Analitova
linija, linija pozadine i susedne pozadine se mere naizmenično i njihovi signali se oduzmu.

11
2.1.1.6. Optimizacija uslova plamene atomizacije

U radu sa plamenim AAS potrebno je obratiti pažnju na neke karakteristike plamena kao
što su temperatura, brzina sagorevanja, profil plamena i reakciona zona plamena.
U plamenoj AAS rastvor uzorka se u plamen uvodi kao aerosol. Za ove tehnike veoma je
bitan hemijski sastav gasa koji se koristi za sagorevanje. Neke mešavine gasova koje se koriste
su acetilen/vazduh, azot-suboksid/acetilen, acetilen/kiseonik. Veoma su bitne oksidaciono-
redukcione osobine plamena kao i odnos pojedinih gasova u smeši. Od ovog odnosa, gorivo-
oksidant zavisi tačna temperatura plamena i generalno je najveća za stehiometrijske mešavine
[5]. Acetilen/vazduh je najčešće korišćen plamen, stabilan je, lak za korišćenje i omogućava
dovoljnu atomizaciju analita u plamenu oslobađajući ga od interferencije mnogih elemenata i
time omogućavajući dobru osetljivost određivanja. Što je plamen bogatiji gorivom ima jača
redukciona svojstva i poboljšava atomizaciju elementa ali se paralelno sa povećanjem
redukcionog svojstva temperatura plamena smanjuje. Plamen azot-suboksid/acetilen ima visoku
temperaturu i ima redukciona svojstva. Njegova visoka temperatura doprinosi efikasnoj
disocijaciji analita. Elementi koji se najbolje određuju u ovom plamenu su: Al, B, Ba, Be, Mo,
Si, Ta, V, W, Zr, lantanidi i aktinidi. Sa ovim plamenom se mora raditi pažljivo vodeći računa da
se talog ugljenika ne gomila u plameniku.
Za bilo koju smešu gorućih gasova mora se voditi računa o brzini sagorevanja plamena.
Ako njegova brzina premašuje približno 40 cm3 / s može se desiti da se plamen uvuče u komoru
u kojoj se nalazi mešavina gorućih gasova što može dovesti do eksplozije. Kada se koristi
acetilen/azot-suboksid plamen, prvo treba pustiti vazduh, zatim upaliti acetilen/vazduh plamen i
potom treba postepeno nadvladati tok vazduha tokom azot-suboksida sve dok plamen ne pokaže
karakterističnu crvenkastu boju u središnjoj zoni plamena. Ovaj redosled treba obrnuti kada se
gasi plamen. Moderni aparati imaju sposobnost da ove operacije izvedu automatski.
Pored brzine sagorevanja plamena, veoma je bitno u kom delu plamena će se desiti
atomizacija analita. Najefikasnija atomizacija se dešava u središnjoj, reakcionoj zoni plamena, tj.
plavom delu plamena. Stoga je potrebno podesiti visinu plamenika, tako da se središnja zona
plamena nalazi u optičkoj osi instrumenta. Visina plamenika se podešava ručno pomoću zavrtnja
ili automatski u modernim instrumentima

2.1.2. Hidridna tehnika

Pri određivanju nekih elemenata pomoću AAS, npr. As i Se, javljaju se određene
poteškoće zato što su na rezonantnim talasnim dužinama ovih elemenata interferencije znatno
izražene s obzirom da su one u UV oblasti. Plamena AAS nije pogodna za određivanje ovih
elemenata u tragovima. Značajnom povećanju selektivnosti doprinosi prevođenje ovih elemenata
u hidride. Generisani lako isparljivi hidridi se izdvajaju iz matriksa uzorka čime su interferencije
znatno smanjene a osetljivost znatno povećana.
Postupak generisanja hidrida je prikazan na slici 4.

12
Slika 4 – Generisanje gasovitog hidrida analita

Hidridi se formiraju u reakcionoj komori. U reakcionu komoru se uvodi kiselina, HCl,


koja zakišeljava uzorak a potom se redukcija vrši uvođenjem NaBH 4 stabilizovanog sa NaOH.
Obrazovani hidridi se izdvajaju iz rastvora tokom gasa nosača i dovode do kvarcne kivete koja se
zagreva izazivajući raspad obrazovanog hidrida elementa do atoma u osnovnom stanju.
Iako povećava osetljivost određivanja, ova tehnika je ipak sklona određenom broju
sistematskih grešaka. Uz generisanje hidrida istovremeno nastaje i višak vodonika koji može
izazivati smetnje. Još jedan vid grešaka u određivanju se može javiti ukoliko se analit u rastvoru
nalazi u različitim oksidacionim stanjima čija je efikasnost redukcije sa NaBH 4 različita. U tom
slučaju, pri određivanju se neće određivati ukupna koncentracija ispitivanog elementa već samo
jedan njen deo. U slučaju selena Se(VI) se ne redukuje lako sa NaBH 4 kao što je to slučaj sa
Se(IV). Stoga se pre operacije generisanja hidrida selena, sav selen mora prevesti u Se(IV) kako
bi se pri određivanju odredila ukupna koncentracija prisutnog selena. Iz prethodnog se može
videti da je veoma bitno da elementi koji grade hidride moraju biti u tačno definisanom
valentnom stanju što zahteva prethodnu pripremu uzorka. Pri određivanju selena bi to bila
prethodna redukcija Se(VI) u Se(IV) koja se može vršiti ključanjem u HCl. Prevođenje svog
prisutnog analita u jedno oksidaciono stanje je neophodno jer se za različita oksidaciona stanja
istog elementa postižu različite analitičke osetljivosti i javljaju se različite interferencije pri
njihovom određivanju.

2.2. Metode razaranja uzorka


Većini analitičkih tehnika prethodi priprema uzorka koja može biti veoma složena u
zavisnosti od analita i matriksa uzorka. Tokom pripreme uzoraka mora se voditi računa da ne
dođe do njihove kontaminacije. Instrumentalne metode često zahtevaju da analit koji se određuje
bude oslobođen matriksa što se može postići nekom od metoda razaranja ili ekstrakcije uzorka
od kojih su najčešće primenjivani: suvi postupak razaranja organskog materijala, razaranje uz

13
dejstvo mikrotalasa, razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina i razaranje UV-
zračenjem. Postupci ekstrakcije novijeg datuma uključuju ubrzanu ekstrakciju dejstvom
rastvarača na povišenim temperaturama i pritiscima (ASE – Accelerated Solvent Extraction),
ekstrakciju fluidima u super- i subkritičnom stanju, ekstrakciju potpomognutu ultrazvukom,
ekstrakciju u električnom polju (PEF- Pulsed Electric Field) i dr.

2.2.1. Suvi postupak razaranja organskog materijala

Ova metoda se koristi za razaranje uzoraka koji sadrže veliku količinu organske materije.
Pogodna je kada se određuju tragovi neisparljivih metala. Ova metoda je veoma jednostavna i
podrazumeva spaljivanje i žarenje uzorka u odgovarajućim vatrostalnim posudama koje su
najčešće izrađene od porculana ili platine [9]. Uzorak se prvo spaljuje na plameniku dok se ne
izdvoje svi gasoviti produkti spaljivanja a potom se stavlja u peć za žarenje. Spaljivanje se može
vršiti bez ili sa dodatkom reagensa, ukoliko je to potrebno. Reagensi kao što su sumporna ili
azotna kiselina se dodaju da bi se izvršilo završno razaranje, omogućila bolja rastvorljivost
ostatka u drugim kiselinama i sprečilo isparavanje lako isparljivih hlorida metala. Žarenje se
može vršiti na atmosferskom pritisku ili na povišenom pritisku u atmosferi kiseonika.
Ovaj postupak je pogodan za pripremu uzoraka u kojima se određuju elementi kao što su
Fe, K, Ca, Mg, Mn prisutni u hrani u značajnim količinama [9]. Takođe se ova metoda može
koristiti za pripremu uzoraka u kojima se određuju elementi u tragovima kao što su Zn, Co, Cr,
Mo, Ba i Fe [10].
Nedostaci ove metode su: moguć gubitak metala usled njihovog isparavanja,
kontaminacija uzorka iz vazduha i adsorpcije metala na zidovima suda.

2.2.2. Razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina

Razaranje koncentrovanim mineralnim kiselinama se može vršiti u otvorenim i


zatvorenim sistemima.

a. Razaranje u otvorenom sistemu

Ovo je jedna od najstarijih i najčešće korišćenih tehnika za razaranje organskih i


neorganskih uzoraka. Glavna prednost u odnosu na suvo spaljivanje je njena brzina, mada je
ograničena niskom temperaturom ključanja kiseline ili mešavine kiselina koje se koriste na
atmosferskom pritisku. Često oksidaciona moć azotne kiseline nije dovoljna na temperaturi od
122°C, koja odgovara njenoj tački ključanja na atmosferskom pritisku, pa se dodatkom
sumporne kiseline poveća tačka ključanja smeše i pojačava oksidaciona moć [11]. U praksi se
najčešće koristi smeša kiselina, a sastav smeše zavisi od vrste uzorka koji treba razoriti.
Univerzalna smeša kiselina koja bi se mogla koristiti za sve tipove uzoraka ne postoji.
Ova metoda ima određene nedostatke kao što su opasnost od gubitka elemenata u
tragovima, mogućnost zagađenja iz vazduha i velike količine potrebnih reagensa kao i zahtevi za
njihovom velikom čistoćom [11].

14
b. Razaranje u zatvorenom sudu

Zatvoreni sistemi imaju određene prednosti u odnosu na otvorene sisteme koje se


ogledaju u činjenici da je smanjena mogućnost kontaminacije uzorka i gubitka lako isparljivih
analita. U zatvorenom sudu usled povećanja pritiska povećava se temperatura ključanja kiselina i
pojačava njihovo oksidaciono dejstvo. Prvi put je ovakav sistem opisan od strane Cariusa i
Mitscherlicha 1860. godine [11] i poznat je pod nazivom Cariusova tehnika. Carius je razorio
organske materijale koncentrovanom azotnom kiselinom u zapečaćenoj kvarcnoj ampuli
smeštenoj u metalnu posudu koja je u pećnici zagrevana na 250-300 °C nekoliko sati. Ova
tehnika je vremenom unapređena i današnje posude se sastoje od reakcionog dela , najčešće, od
teflona i čeličnog omotača sa poklopcem [10]. Izrađuju se u različitim dimenzijama a vreme
razaranja zavisi od vrste i količine uzorka.

2.2.2.1. Razaranje mikrotalasima

Jedan od najsavremenijih izvora energije za procedure mokrog razaranja su mikrotalasi.


Zagrevanje reakcione smeše je efikasnije od konvencionalnog zagrevanja. Osnovni princip
zagrevanja uzoraka mikrotalasima se zasniva na dva mehanizma: dipolnoj rotaciji i jonskoj
kondukciji. Polarni molekuli imaju tendenciju da izjednače svoj dipolni momenat sa
mikrotalasnim elektromagnetnim poljem. Kako se elektromagnetno polje konstantno menja
molekuli rotiraju i sudaraju se sa obližnjim molekulima. Joni prisutni u rastvoru, imaju
tendenciju da se kreću u mikrotalasnom polju što prouzrokuje sudare sa drugim molekulima u
rastvoru uz oslobađanje energije sudara u vidu toplotne energije.
Osnovna prednost ove tehnike nad ostalim tehnikama razaranja ogleda se u činjenici da je
tehnika veoma brza i da se mogu razoriti neki uzorci koji se drugim tehnikama veoma teško
razaraju [11]. Takođe, mogućnost automatizacije eliminiše potrebu za angažovanjem analitičara
tokom procesa.
Mikrotalasno razaranje uzoraka se može vršiti u otvorenim i zatvorenim sistemima.

a. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u otvorenom sistemu

Mikrotalasni sistem razaranja u otvorenom sudu, koji se može koristiti i za ekstrakciju, se


sastoji od magnetrona za generisanje mikrotalasa, usmerivača talasa za navođenje i fokusiranje
mikrotalasa, i šupljine u koju se stavlja kiveta sa uzorkom. Dizajn otvorenog suda sprečava
porast pritiska u kiveti tokom procesa razaranja i omogućava dodatak reagensa tokom samog
procesa, ukoliko je potrebno. Ovom tehnikom se mogu razarati relativno velike količine uzorka,
do 10 g za čvrste i 50-100 ml za tečne uzorke. Kisela isparenja koja nastaju se uklanjaju
aspiratorom. Fokusirani mikrotalasi omogućavaju brže zagrevanje uzorka a mikrotalasna
energija usmerena samo na deo suda koji se nalazi na putanji fokusiranih talasa obezbeđuje da
vrat kivete i refluksna jedinica ostaju hladni tokom procesa. Uzorci se stavljaju u kivete od
borosilikatnog stakla zapremine 250 ml. Ovakav sistem može biti potpuno automatizovan, a
često se koristi i za izvođenje ekstrakcije čvrstih uzoraka.

15
b. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u zatvorenom sistemu

Mikrotalasna digestija u zatvorenom sudu, ima nekoliko prednosti u odnosu na metode


razaranja u otvorenom sudu. Kivete za mikrotalasno razaranje u zatvorenom sistemu imaju
određene prednosti u odnosu na keramičke ili staklene sudove. Reakcione posude su napravljene
od polimernih materijala koji podnose visoke temperature. Mogućnost kontaminacije materijama
koje su prisutne u vazduhu je smanjena jer se razaranje vrši u zatvorenom sudu. Zatvoreni sud,
kiveta, sprečava isparavanje i smanjuje potrebnu količinu kiselina za razaranje, eliminiše gubitke
isparljivih metalnih vrsta, koji mogu da budu problem pri razaranju uzorka u otvorenom sistemu,
naročito pri spaljivanju do pepela. Još jedna prednost ovog sistema je mogućnost automatizacije
postupka čime se umanjuje potreba za angažovanjem analitičara tokom procesa i omogućava
velika reproduktivnost uslova razaranja.
Sistem mikrotalasnog razaranja uzorka se sastoji od mikrotalasne pećnice, rotora u koji se
smešta više „digestionih bombi“ i sistema za učvršćivanje istih i kontrolu uslova razaranja [9].
Sistem u mikrotalasnoj pećnici obezbeđuje praćenje i merenje temperature i pritiska u
sudovima. Na početku razaranja temperatura se polako povećava i razaranje je sporo. Tek kada
je najveći deo matriksa razoren pristupa se razaranju na visokim temperaturama. Regulator
temperature prati temperaturu i na osnovu nje podešava snagu magnetrona održavajući pri tome
temperaturu u rasponu ± 3 ° C.
Sudovi za uzorke, koji se smeštaju na rotor unutar pećnice, su napravljeni od materijala
koji dobro podnose visoke temperature i pritiske. Najčešće su to polikarbonat ili
politetrafluoretilen (PTFE). Sudovi za uzorke, kivete, koji su komercijalno dostupni se mogu
koristiti za razaranje uzorka na temperaturi do 300 °C i pritisku do 55,2 bar. Pod ovakvim
uslovima se čak i vatrostalni materijala mogu uspešno razoriti, Al2 O3 kao izuzetno tvrd
neorganski materijal se može ovim postupkom razoriti na 280 °C pri pritisku od 2,76 bar u
mešavini H 2SO 4 i H 3 PO 4 [9]. Slični materijali se mogu digestirati hlorovodoničnom kiselinom
na nešto nižoj temperaturi, 240 °C, ali na znatno višem pritisku, 45,5 bar.
Kivete, u kojima se vrši razaranje uzoraka kiselinom, ili smešom kiselina, se na
odgovarajući način zatvore. Zatvaranje kiveta se vrši sistemom poklopaca preko kojih se stavlja
sigurnosni prsten i potom se one pričvrste u ramove koji se stavljaju na rotor unutar peći za
mikrotalasno razaranje. Svaka pojedinačna ovako napravljena „bombica“ ima ventil za
kontrolisanje pritiska. S obzirom da je svaka reakciona posuda baždarena na određenu vrednost
pritiska, pri dostizanju pritiska iznad maksimalnog, sigurnosni ventil će omogućiti ispuštanje
gasovitih proizvoda do ponovnog uspostavljanja pritiska baždarenja. Novije konstrukcije
reakcionih posuda omogućavaju ponovno zaptivanje reakcione posude čime su gubici analize
umanjeni. Starije izvedbe reakcionih posuda su sadržale membranu, po čijem je pucanju uzorak
bio nepovratno kompromitovan.

2.2.3. Razaranje UV-zracima

Razaranje UV zracima spada u grupu fotolitičkog razaranja. Izvor zračenja je živina ili
ksenonova lampa. Uzorci se razaraju UV-zračenjem u prisustvu malih količina vodonik
peroksida ili kiseline, najčešće azotne [11]. Mehanizam razaranja se može objasniti formiranjem

16
OH˙ iz vode i vodonik-peroksida koje započinje usled dejstva UV-zraka. Nastali radikali mogu
da oksiduju organske materijale do CO 2 i vode. Da bi se dobio bistar rastvor ponekad je potrebno
dodavati vodonik-peroksid više puta. Ovom metodom se ne mogu razoriti neka organska
jedinjenja kao što su nitro-fenoli, hlor-fenoli, heksahlorbenzen [11].

2.2.4. Razvoj metode razaranja uzorka mikrotalasima u zatvorenom sudu

Pri razvoju metode za razaranje uzorka u zatvorenom sudu treba ispitati uticaj snage
magnetrona, vreme razaranja kao i različite smeše kiselina. Poželjno je početi sa malim
količinama uzorka i kiseline. Pritisak u kiveti se prati pomoću senzora i te vrednosti se upoređuju
sa vrednostima koje je pomoću kompjutera, koji je u sastavu aparature, zadao analitičar. Ako
pritisak u sudu premašuje zadatu vrednost, regulator pritiska će otvaranjem sigurnosnog ventila
ispuštati gasovite produkte dok se pritisak ne snizi. Istovremeno se snižava i snaga magnetrona.
Ovo omogućava da se koristi maksimalna snaga peći za određeno vreme i dopušta da sistem
nenadgledan dovrši razaranje.
Uzorci neorganskog porekla kao što su metali, voda, minerali i sedimenti, se relativno
lako razaraju u kiselinama uz oslobađanje male količine gasovitih produkata. Uzorci koji sadrže
visok procenat organskog materijala proizvode obilne količine gasovitih proizvoda i zahtevaju
više temperature razaranja da bi se razorile u potpunosti. Na temperaturama iznad 250 °C većina
polimernih materijala počinje da se topi, prelazi u tečno stanje ili se razlaže. Za polimerne uzorke
kao što su poliimidi u mikrotalasnu peć se stavlja keramička rotaciona ploča na koju se stavljaju
otvoreni sudovi od borosilikata, kvarca ili staklastog ugljenika, koji mogu da podnesu znatno
više temperature u odnosu na polimerne materijale.
Uzorak se smatra razorenim kada više nema vidljivih čvrstih ostataka i kada rastvor
ostaje bistar pri razblaživanju. Pošto kiveta nije providna teško je ustanoviti da li je razaranje
izvršeno u potpunosti, pa se kiveta mora ohladiti, otvoriti i osloboditi gasovitih nusproizvoda.
Ukoliko razaranje nije potpuno, kiveta se ponovo zatvori i postupak razaranja ponovi.

2.3. Selen
Selen (Se, latinski - sellenium) je metaloid VI-a grupe, atomskog broja 34 i mase 78,96
g/mol. Otkriven je 1817. godine od strane Jons Jakob Berzelijusa. Ime je dobio od grčke reči
selene koja znači mesec (zato što se uvek javljao uz telurijum, latinski tellus-zemlja). Poznato je
nekoliko njegovih izotopa čije se atomske mase nalaze između 69-91. Tačka topljenja kristalne
alotropske modifikacije selena je 217 ° C a tačka ključanja 685 ° C [12]. Selen može imati sledeće
valentnosti: +6, +4, +2, 0 i -2.
U zemljinoj kori selen je zastupljen u količini od 0,05-0,09 mg/kg [6, 13], u zavisnosti od
područja, kao pratilac nekih ruda sumpora. U industriji se dobija kao sporedni proizvod
prečišćavanja ruda bakra i sumpora. U laboratoriji se selen dobija redukcijom selenitne kiseline
hidrazinom. Slobodan selen se može dobiti rastvaranjem selen-dioksida u azotnoj kiselini, i
propuštanjem rastvora kroz rastvor sumpor-dioksida, čime se selen izdvaja kao crveni talog [6].

17
Selen ima veliku primenu u foto industriji i najviše se koristi za izradu foto-ćelija. Koristi
se i kao dodatak staklu i čeliku. Sulfid selena se koristi u šamponima protiv peruti.
Zbog položaja u periodnom sistemu osobine selena podsećaju na osobine sumpora.
Selenatna kiselina, slično kao i sumporna kiselina, je veoma jaka kiselina sa oksidacionim
delovanjem. U oksidacionoj sredini dvovalentni selen veoma lako prelazi u viša oksidaciona
stanja.
Selen je jedan od esencijalnih mikroelemenata koji se mora unositi hranom. On je
neophodan za funkciju enzimskog sistema glutation peroksidaze koja razlaže štetne perokside i
tako štiti ćelijsku membranu od oštećenja. Ovaj esencijalan element je veoma bitan za
funkcionisanje odbrambenog sistema organizma i rad štitne žlezde. Selen pojačava
antioksidativno delovanje vitamina E i zajedno sa drugim antioksidansima štiti srce, smanjujući
rizik od srčanih bolesti. Takođe ima ulogu u zaštiti od slobodnih radikala, pomaže pri depresiji,
premoru i prevelikoj nervozi. Elemenat još redukuje količinu štetnih jedinjenja koja izazivaju
nastanak reumatskih zapaljenja. Smatra se da sprečava nova izbijanja herpesa, mutaciju ćelija iz
kojih često proizilazi kancerogeneza i pomaže u lečenju AIDS-a (pacijenti imaju manje infekcija,
popravlja im se apetit i funkcija creva).
Prosečna odrasla osoba sadrži oko 20 mg selena a najveći deo se nalazi u jetri, skeletnim
mišićima, bubregu, srcu, slezini i testisima. Selen se u organizam unosi hranom a njegov sadržaj
u hrani zavisi od vrste namirnice i količine selena prisutne u zemljištu na kojem se uzgajaju
sirovine za proizvodnju različitih prehrambenih proizvoda. Proizvodi bogati selenom su pšenica,
neprerađena riža, ovas, semenke dinje, mleko, posno meso i riba.
Selen u hrani može biti prisutan u obliku neorganskog selena (selenit- SeO32− ) ili kao
aminokiselina selenocistein i selenometionin koji predstavljaju analoge aminokiselinama sa
sumporom-cisteina i metionina. Biljke koje rastu na zemljištu sa velikom količinom selena
formiraju selenometil-cistein i selenohomocistein koji se mogu u biljkama akumulirati u
količinama i do 5000 mg/kg uzrokujući time trovanja selenom ljudi i životinja koji ih
konzumiraju.
Smatra se da se neorganske soli selena, kao i organski vezani selen relativno dobro
resorbuju iako ima malo informacija o mehanizmu i regulaciji resorpcije. Od ukupne količine
resorbovanog selena oko 55-60% se izbacuje urinom, oko 5% znojem i manje od 1% disanjem
[6]. Ukoliko dođe do trovanja selenom onda se procenat selena izbačen dahom znatno povećava
(dah na beli luk).
Preporučena količina selena koju odrasle osobe treba da unesu dnevno iznosi 55
mikrograma. Višak selena je štetan i smatra se da unošenjem preko 400 mikrograma dnevno
može da izazove trovanje [6].
Trovanje selenom je opisano kod ljudi i životinja, ali još nije jasan mehanizam trovanja.
Rani simptom je miris belog luka u dahu što je posledica izdisanja dimetil selenida, jednog od
njegovih metabolita. Do akutnog trovanja selenom može doći zbog inhalacije značajnih količina
selena u elektronskoj industriji i u industriji stakla i boja. Problem trovanja selenom se javlja i u
područjima gde je relativno visok nivo selena u zemljištu.
Specifično stanje, selenoza, je povezana sa hroničnim unosom preko 12 µ mola (~1 mg)
Se dnevno koje može dovesti do gojenja, zamora, povraćanja. Kod dece može doći i do pojave

18
karijesa. Kao posledica selenoze može dogoditi depigmentacija kože, gubitak i oštećenje noktiju,
sušenje i gubitak kose. Takođe se javljaju neurološke abnormalnosti koje uključuju paraesteziju,
paralizu i hemiplegiju.
Simptomi nedostatka selena se sreću samo kod ljudi koji žive na područjima gde ima
malo selena u zemljištu. Područja Evrope, delovi SAD, Novi Zeland i deo Kine su područja gde
ima malo selena u zemljištu.
Nedostatak selena često se javlja i kod kritičnih grupa ljudi, kao što su alkoholičari, osobe
koje se u znatnoj meri hrane industrijski obrađenom hranom i tzv. „brzom hranom“, osobe
obolele od HIV-a, osobe obolele od bolesti jetre, osobe sa Daunovim sindromom i oboleli od
fibrocističnog oboljenja dojke [14].
Nedostatak selena uzrokuje proširenje srca, koje konačno dovodi do kongestivnog
zatajivanja srca, kao i gubitak aktivnosti ćelija pankreasa. Ostali poremećaji koji se javljaju usled
nedostatka selena su: Kešanova bolest, Kašin-Bekov sindrom, kancer, razne kardiovaskularne
bolesti, problemi u trudnoći, astma, reumatoidni artritis, katarakta, anemija, otežano disanje,
mišićna slabost, depresija i povišen krvni pritisak [14].
Kako je uloga selena u normalnom funkcionisanju ljudskog organizma velika on se može
koristiti u lečenju većeg broja bolesti i poremećaja kao što su kancer, bolesti srca, astma,
reumatoidni artritis, detoksikacija organizma usled trovanja arsenom, kadmijumom i živom,
angina, katarakta, visok krvni pritisak u trudnoći. Selen se koristi u preparatima za tretiranje
kose, kože i noktiju, kao i u lekovima za poboljšanje raspoloženja, lečenje depresije i umora
[14].

2.4. Metode određivanja selena


Selen se može određivati velikim brojem metoda. Izbor metode zavisi od količine selena
u uzorku kao i od vrste uzorka koji ispitujemo. Neke od metoda će biti pomenute u ovom
poglavlju.
Od optičkih analitičkih tehnika najčešće primenjivane su elektrotermalna atomska
apsorpciona spektrofotometrija (ETAAS) [15], hidridna tehnika atomske apsorpcione
spektrofotometrije (HGAAS) [16], koje su obrađene u prethodnim poglavljima, induktivno
spregnuta plazma/masena spektrometrija (ICP-MS) o kojoj će biti reči u daljem tekstu. U okviru
hromatografskih tehnika kombinovane tehnike kao što su tečna hromatografija visokog
pritiska/induktivno spregnuta plazma/masena spektrometrija (HPLC-ICP-MS) omogućava
određivanje različitih organskih formi selena. Elektroanalitičke tehnike kao što su anodna
striping voltametrija (ASV), katodna striping voltametrija (CSV), redukciona striping analiza i
hronopotenciometrijska striping analiza (CSA) takođe pružaju mogućnost određivanja selena u
većem broju realnih uzoraka.
ICP MS je metoda koja se koristi za određivanje selena u velikom broju uzoraka, npr. u
pijaćoj vodi, otpadnim i podzemnim vodama. Metoda je takođe uspešno primenjena za
određivanje selena u prehrambenim dodacima pri čemu je ostvarena granica detekcije Se(IV) od
0,048 ng/g i Se(VI) od 0,84 ng/g [17]. ICP MS metoda je korišćena za rutinska određivanja Se u
krvnom serumu i za uzorke crvenih krvnih zrnaca (eritrocita). Razlog za korišćenje ove metode u

19
biološkim određivanjima je to što je potrebno veoma malo uzorka, 100 µ l, čime je i priprema
uzoraka znatno pojednostavljena. Vreme određivanja je kratko i iznosi 140 s za serum i 160 s za
krvna zrnca. Postignuta granica detekcije Se(IV) za serum je iznosila 0,02 µ mol/l [18].
HPLC ICP MS je tehnika koja se veoma lako automatizuje pa se može koristiti za
rutinske kontrole totalnog selena u uzorcima životne sredine i prehrambenim proizvodima [19].
Ova tehnika se najviše koristi za određivanje selena u vodi.
Primena gasne podeone hromatografije za određivanje selena u biološkim uzorcima
omogućava eliminisanje interferencije iz biološkog matriksa. GC zahteva prethodno razaranje
organskog materijala sa HNO3 . Tehnike gasne hromatografije se uglavnom baziraju na merenju
količine piazo-selenola formiranog u reakciji Se(IV) sa odgovarajućim reagensima u kiselom
medijumu. Korišćenjem 1,2-diamino-3,5-dibrombenzena kao reagensa Shimoishi je ostvario
granicu detekcije 1 × 10−9 g Se/g uzorka [1].
Masena spektrometrija zasnovana na određivanju pomoću izotopa Se, primenjena nakon
gasno-hromatografskog razdvajanja (IDGC/MS) je tehnika visoke tačnosti koja je korišćena za
određivanje selena u hrani, plazmi, serumu i crvenim krvnim zrncima. U ovoj metodi stabilni
izotop selena se dodaje uzorku pre digestije. Ova procedura eliminiše potrebu za primenom
standardnih rastvora selena, odnosno za kalibracijom. Mana ove tehnike je da su obogaćeni
izotopski standardi skupi [1].
Striping analiza je veoma jednostavna i osetljiva metoda za određivanje Se(IV). CSV je
primenjena za određivanje ukupnog selena u različitim uzorcima. Postupak koji su razvili
Filichkina, Zakharova i Slepchenko uključuje mineralizaciju uzorka sa magnezijum-nitratom u
6M HCl radi redukcije Se(VI) do Se(IV) i određivanje selena katodnom voltametrijom na živa-
grafitnoj elektrodi u rastvoru HCl u prisustvu jona bakra i žive [20].
Pored uobičajeno korišćenih živinih radnih elektroda selen je uspešno određen i
primenom tankoslojne bizmutove elektrode formirane na pirolitičkom grafitu. Tehnika se
zasniva na redukciji Se(IV) trovalentnim jonima bizmuta uz obrazovanje vodonika koji
proizvodi jasan katalitički talas na -1150 mV u odnosu na srebro/srebro-hloridnu referentnu
elektrodu. Određivanje pomenutim postupkom izvedeno u prirodnim vodama je pokazalo da se
ovaj metod može koristiti za određivanje i Se(IV) i Se(VI). Se(IV) je redukovan na potencijalu
od -500 mV 30 s mešanjem bez prisustva vazduha u rastvoru. Nakon pauze od 10 s merenje je
izvršeno skeniranjem elektrodnog potencijala od -400 mA do -1400 mA [21].
Bryce, Izquierdo i Castro su ASV primenili kao kontinualni metod za određivanje selena.
Posle prekoncentracije Se (IV) na radnoj elektrodi od zlata na primenjenom potencijalu od 0,4 V,
izvedeno je anodno skeniranje od 0,4-1,6 V pomoću kojeg je selen rastvoren na potencijalu od
~0,912 V. Proizvedena struja je proporcionalna Se(IV) u uzorku. Samoj analizi je prethodilo
uklanjanje smetajućih jona pomoću on-line separacije korišćenjem katjonskog izmenjivača jona
u koloni. Primenjeni metod ima opseg linearnosti određivanja između 5-100 ng/ml Se(IV) sa
korelacionim koeficijentom r 2 od 0,9969 i relativnom standardnom devijacijom analitičkog
signala selena (RSD) od <4,7% [22].
CSA je primenjena za određivanje selena u stočnoj hrani od ribljeg brašna i kvasca. Kao
radna elektroda korišćen je film žive formiran na staklastom ugljeniku. Tačnost metode je

20
potvrđena analizom standardnog referentnog materijala- žitnog durum brašna. Vreme elektrolize
iznosilo je 600 s na potencijalu od -0,1 V, a ostvarena je granica detekcije od 0,5 µg / dm3 [10].

21
3. EKSPERIMENTALNI DEO

3.1. Aparatura i pribor


Sva ispitivanja u ovom radu su izvedena na sistemu za atomsku apsorpcionu
spektrofotometriju u grafitnoj kiveti „Thermo, electron corporation; Spectrometer: S Series
GE711344 v 1,26“ u Enološkoj stanici u Vršcu. Ovaj instrument je predstavljen na slici 5.

Slika 5 - Atomski apsorpcioni spektrofotometar

Uzorci su pripremani u aparatu za mikrotalasnu digestiju „Milestone Sr1“ koji je prikazan


na slici 6.

Slika 6 - Aparat za mikrotalasnu digestiju u zatvorenom sistemu

22
U svim određivanjima korišćen je uobičajeni pribor kao što su pipete, normalni sudovi i
dr., opran i održavan na odgovarajući način. Za pripremu standardnih rastvora korišćena je
mikropipeta „Tranferpette“ sa promenljivom zapreminom (5-50 µ l).

3.2. Hemikalije i rastvori


U radu su korišćene sledeće hemikalije:
- Azotna kiselina 65% najveće čistoće „Merck“
- Vodonik peroksid 35% medicinske čistoće „Merck“
- Standardni rastvori SeO 2 u HNO3 0,5 mol/l; 1000 mg/l Se (IV) „Merck“
- Sirćetna kiselina p.a. „Merck“
- Askorbinska kiselina p.a. „Merck“
- Magnezijum-nitrat p.a. „Merck“
- Nikl (II) nitrat- heksahidrat „Merck“
- Paladijum (II)nitrat „Merck“
- Ultra čista voda otpornosti 18,2 MΩ / cm
Pored pomenutih hemikalija korišćeni su i sledeći rastvori:
- Standardni rastvor selena (IV) 10 µg / l pripremljen tako što je odmereno 0,1
ml standardnog rastvora selena u normalni sud od 100 ml i sud dopunjen do
marke ultra čistom vodom
- Nikl (II) nitrat 0,4 g/100 ml koji je pripremljen tako što je odmereno 0,63 g
nikl(II)-nitrata heksahidrata i rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u
normalnom sudu od 100 ml
- Magnezijum nitrat 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g magnezijum-nitrata i
rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml
- Paladijum (II) nitrat 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g paladijum(II) nitrata i
rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml
- Askorbinska kiselina 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g askorbinske kiseline i
rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml
- Sirćetna kiselina 0,4 ml/100 ml, pripremljena je tako što je odmereno 0,4 ml
sirćetne kiseline i razblaženo ultra čistom vodom do marke u normalnom sudu
od 100 ml

3.3. Uzorci
U radu je određivan sadržaj selena u različitim uzorcima testenina i čajnog peciva
domaćih i stranih proizvođača dostupnih na tržištu. Korišćeni su sledeći uzorci:
- K1- Wellness integralni keks sa ovsenim pahuljicama; Bambi, Beograd

23
- K2- Doria Bucaneve Cereali; Banli, Verona, Italia
- K3- Plazma; Bambi, Beograd
- K4- Frollini con granelli di zucchero; Conad s. c. Bologna, Italia
- K5- Petit Beurre keks sa maslacem; Bambi. Beograd
- K6- Jo D’oro inspiracija sa cimetom; Bambi, Beograd
- K7- Posni keks LALA; Swisslion Takovo, Vršac, Srbija
- T1- Del Castello Pastificio Bragagnolo 57 fusilli integrali; Pasta zara S. p. A.
Italia
- T2- Integralna testenina Fillipili; „Ambrosia“ D.O.O. Beograd
- T3- Pasta Adria; Adria MM doo Banja Luka, BiH
- T4- Buitoni Farfalle; Nestle Italiana, Milano, Italia
- T5- Granoro Pasta di Semoladi Grano Duro Spirali n. 32; Italia
- T6- La Perfetta Testenina Spirala; Kikindski mlin, Kikinda, Srbija
- T7- Barilla G. eR- Frateli; Parma, Italia

3.4. Priprema uzorka


Uzorci su razarani u aparatu za mikrotalasnu digestiju koji je ranije pomenut. Uzorci su
bili samleveni u mlinu za kafu. 0,5 g samlevenog uzorka je odmereno i premešteno u kivetu za
mikrotalasnu digestiju, nakon čega je dodato 7 ml azotne kiseline i 1 ml vodonik peroksida.
Kiveta je zatvorena na odgovarajući način i postavljena u pećnicu. Vreme zagrevanja je iznosilo
10 minuta do temperature od 200 °C pri snazi od 700 W. Korak razaranja je trajao 15 minuta na
temperaturi od 200 °C i pri snazi od 700 W. Po završenom razaranju, uzorci su ohlađeni i
prenešeni u normalne sudove od 25 ml u digestoru. Normalni sudovi su potom dopunjeni ultra
čistom vodom do marke. Uzorci su do analize čuvani u polietilenskim bočicama u frižideru.

24
4. REZULTATI I DISKUSIJA

U radu je ispitan uticaj većeg broja modifikatora na analitički signal selena. Pri ovim
ispitivanjima, menjan je samo modifikator matriksa dok su ostali uslovi analize ostali
nepromenjeni.

4.1. Ispitivanje uticaja i odabir


modifikatora
Ispitivanje uticaja modifikatora na analitički signal selena je izveden tako što je
ponavljana analiza standarda selena, poznate koncentracije (10 µ g/l), pod istim opštim uslovima
analize, na različite modifikatore. Kao modifikatori ispitivane su sledeće supstance: nikl-nitrat,
magnezijum-nitrat, paladijum-nitrat, askorbinska kiselina i sirćetna kiselina. Poređene su
reproduktivnost analitičkog signala selena i linearnost zavisnosti apsorbancije od koncentracije
selena u prisustvu različitih modifikatora. Treba napomenuti da je jedan od bitnih faktora pri
odabiru modifikatora bila i visina analitičkog signala selena. Uticaj pojedinačnih modifikatora
koje smo upoređivali, i na osnovu kojih smo doneli odluku o optimalnom modifikatoru, biće
izložene u narednim poglavljima.

4.1.1. Linearnost

U cilju optimizacije uslova spektrofotometrijskog određivanja neophodno je bilo ispitati


linearnost analitičkog signala selena u prisustvu različitih modifikatora matriksa. Poželjno je da
je zavisnost apsorbancije od koncentracije analita linearna, da je nagib linije što veći a odsečak
što manji. Slaganje zavisnosti apsorbancije od koncentracije selena sa pretpostavljenom
linearnom zavisnošću, kao i visina analitičkog signala, dati su za različite ispitane modifikatore
na slici 7.

25
0,9
0,8 y = 0,0133x + 0,0377
R² = 0,9961 nikl-nitrat
0,7 y = 0,0121x + 0,0229
R² = 0,9997 magnezijum-nitrat
0,6 sirćetna kis.
apsorbancija

0,5 askorbinska kis.


0,4 y = 0,0089x + 0,0447 paladijum-nitrat
R² = 0,9822
0,3 nikl-nitrat
y = 0,0006x + 0,0254
0,2 y = 0,0014x + 0,0173 R² = 0,9015 magenizijum-nitrat
0,1 R² = 0,9945
sirćetna kis.
0 askorbinska kis.
0 10 20 30 40 50 60 70 paladijum-nitrat
koncentracija (µg/l)

Slika 7 – Linearnost analitičkog signala selena uz različite modifikatore

Iz slike možemo videti da je najbolje slaganje eksperimentalnih rezultata sa


pretpostavljenom linearnom zavisnošću bilo uz primenu magnezijum-nitrata kao modifikatora
dok je nagib najveći u slučaju primene nikl-nitrata. Zavisnost analitičkog signala selena od
koncentracije sa pretpostavljenom linearnom funkcijom je takođe bilo dobro i uz paladijum-
nitrat kao modifikator, čineći ga jakim konkurentom nikl-nitratu. Pri korišćenju sirćetne i
askorbinske kiseline kao modifikatora, selen je imao znatno nižu visinu signala, znatno manji
nagib kalibracione prave i visinu odsečka sličnu kao kod drugih modifikatora.

4.1.2. Reproduktivnost

Reproduktivnost analitičkog signala je računata na bazi pet merenja apsorbancije


standardnog rastvora selena, sadržaja 10 µg / l . Vrednosti relativne standardne devijacije za
ispitane modifikatore date su u tabeli 1.

26
Tabela 1 - Relativne standardne devijacije analitičkog signala selena na različite primenjene modifikatore

Relativna
standardna
Modifikator devijacija
analitičkog
signala selena(%)

paladijum-nitrat 8,97

nikl-nitrat 7,37
magnezijum-
14,69
nitrat
askorbinska
13,59
kiselina
sirćetna kiselina 44,7
Iz tabele vidimo da je vrednost relativne standardne devijacije (koeficijenta varijacije)
najniži u slučaju korišćenja nikl-nitrata kao modifikatora.
Na osnovu prethodno iznesenih podataka možemo zaključiti da su nikl-nitrat i
magnezijum-nitrat pokazali znatno bolje osobine od preostalih modifikatora. Slaganje zavisnosti
analitičkog signala selena od koncentracije sa pretpostavljenom linearnom zavisnošću je najbolja
u slučaju primene magnezijum-nitrata kao modifikatora sa većim koeficijentom korelacije i
manjim odsečkom od nikl-nitrata. Korišćenju nikl-nitrata kao modifikatora u prilog ide najveći
nagib dobijene kalibracione prave, najveća visina analitičkog signala i najmanji koeficijent
varijacije. Iz tih razloga, za dalja merenja, odabrali smo nikl-nitrat kao modifikator.

4.2. Granica detekcije


Postoje različiti pristupi određivanju granice detekcije i samim tim i različiti načini
njenog definisanja. Granica detekcije se može definisati kao najniža koncentracija analita koja
može biti detektovana i statistički opravdana. Granica detekcije se često definiše kao vrednost
analitičkog signala dobijenog u slepoj probi, koja je uvećana za reproduktivnost (3SD) ostvarenu
pri analizi slepe probe. Osetljivost ne zavisi samo od signala registrovanog u slepoj probi nego i
od vrednosti šuma aparata i u spektrofotometrijskim i hromatografskim tehnikama granica
detekcije se često definiše onim sadržajem elementa u rastvoru koji proizvodi trostruko jači
signal u odnosu na signal šuma aparata.
U ovom radu kao granica detekcije usvojena je vrednost od tri standardne devijacije
analitičkog signala selena dobijenog pri analizi standardnog rastvora koji daje trostruko veći
signal od signala šuma aparata. Standardni rastvor selena koji je proizvodio analitički signal
dovoljno visok da bude usvojen kao kriterijum za definisanje granice detekcije je sadržao 10
µg / l Se(IV). Kao rezultat dvanaest analiza KV je iznosio 2,90 %. Nakon prevođenja 3SD u
jedinicu koncentracije , interpolacijom u zavisnost apsorbancije od koncentracije, dobijena je
granica detekcije od 0,75 µg / dm3 Se(IV).

27
4.3. Određivanje selena u realnim uzorcima
Nakon definisanja optimalnih uslova tehnike i pripreme uzoraka, definisani metod je
primenjen za određivanje selena u većem broju realnih uzoraka.
Selen je određivan na atomskom apsorpcionom spektrofotometru koji je ranije pomenut.
Pripremljeni uzorci su stavljani na automatski uzorkivač (autosampler). Uslovi analize dati su u
tabeli 2.
Tabela 2 - Uslovi analize pri određivanju selena

Brzina
Temperatura Tok gasa
Korak Vreme (s) zagrevanja
(°C) (l/min)
(°C/s)
Sušenje 100 30 10 0,2
Spaljivanje 1100 30 150 0,2
Atomizacija 2200 3 0 Isključen
Čišćenje 2500 3 0 0,2
U svim analizama je kao modifikator matriksa korišćen nikl-nitrat. Korekcija pozadine je
vršena uz pomoć deuterijumske lampe. Karakteristična talasna dužina na kojoj je izvedeno
merenje apsorbancije selena iznosila je 196 nm. Za analizu je korišćeno 20 µl pripremljenog
uzorka.
Koncentracija selena je određivana metodom kalibracione krive. Srednje vrednosti
određenih sadržaja selena (pet ponavljanja) u ispitivanim uzorcima date su u tabeli 3.
Tabela 3 - Sadržaj selena u realnim uzorcima određen definisanom metodom

sadržaj sadržaj
uzorak KV (%) Uzorak KV (%)
(µg/kg) (µg/kg)
T1 45,9808 4,11 K1 3,9308 7,06
T2 41,3724 7,53 K2 17,6109 8,31
T3 65,5478 3,80 K3 26,9406 5,19
T4 48,9609 5,48 K4 23,1396 7,29
T5 198,6710 5,25 K5 14,4059 6,72
T6 60,6904 3,64 K6 20,1046 7,29
T7 52,5532 7,13 K7 21,9080 5,04
Originalan zapis softvera integrisanog u primenjenom spektrofotometru: S Series
GE711344 v 1,26; Thermo, electron corporation, pri jednoj seriji analize svih uzoraka je
prikazan na slici 8.

28
Slika 8 - Originalni rezultati određivanja selena

29
Slika 8 – Originalni rezultati određivanja selena (nastavak)

30
5. ZAKLJUČAK

1. Definisana je metoda za određivanje selena u različitim uzorcima tipa čajnog peciva i


testenine primenom atomske apsorpcione spektrofotometrije u grafitnoj kiveti.
2. Razvijen je i definisan postupak pripreme uzoraka mikrotalasnom digestijom u
zatvorenom sistemu.
3. Ispitan je i odabran najpogodniji modifikator matriksa za ovakva određivanja.
Ustanovljeno je da je najbolja reproduktivnost analitičkog signala selena i najbolje
slaganje zavisnosti apsorbancije od koncentracije selena sa pretpostavljenom
linearnom zavisnosti postignuto sa nikl-nitratom kao modifikatorom. S obzirom na
navedene kriterijume magnezijum-nitrat može biti dobra alternativa nikl-nitratu.
4. Sadržaj selena u različitim uzorcima tipa čajnog peciva i testenine određen je
metodom kalibracione krive, i kretao se u intervalu od 4 µg / kg do 198 µg / kg .
5. S obzirom na jednostavnost, reproduktivnost i brzinu definisane metode, ona se može
koristiti za rutinska određivanja selena u ovakvim uzorcima, iako cena eksploatacije
nije zanemarljiva.

31
6. LITERATURA

1. J. Risher, A. R. McDonald, M. J. Citra, S. Bosch, R. J. Amata, „Toxicological


profile for Selenium“, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and
Disease Registry, 2003.
2. Thermo Elemental, ”AAS, GFAAS, ICP or ICP-MS? Which tehnique should I
use? An elementary overview of elemental analysis”, Thermo Elemental, 2001.
3. J. V. Švarc-Gajić, „Magistarski rad“, Tehnološki fakultet, Novi Sad, 2001.
4. N. J. Marjanović, I. F. Jankovitš, „Instrumentalne metode analize“, Tehnološki
fakultet - Zavod za izdavanje udžbenika, Novi Sad, 1983.
5. P. Patnaik, „Dean’s amalytical chemistry handbook“, Mc Graw-Hill companies,
2004.
6. http://sh.wikipedia.org/wiki/Selen
7. http://www.cofc.edu/~deavorj/521/History%20of%20Spectroscopy.html
8. G. H. Jeffery, J. Bassen, J. Mendham, Re. Denney, „Vogel’s textbook of
Quantitative chemical analysis“, John Wiley & Sons, Inc., 1989.
9. S. Mitra, „Sample preparation techniques in Analytical Chemistry“, John Wiley &
Sons, Inc., 2003.
10. J. V. Švarc-Gajić, Z. J. Suturović, N. J. Marjanović, S. Ž. Kravić,
„Chronopotenciometric Stripping Analysis of Selenium in Feed“, Asian Journal
of Animal and Veterinary Advances 1, 2006., 13-22
11. Z. Mester, R. Sturgeon, „Sample preparation for trace element analyses“, Wilson
& Wilson’s, 2003.
12. http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3427000092.html
13. http://www.chemistryexplained.com/elements/P-T/Selenium.html
14. http:/www.chem.bg.ac.yu/~srðan/mineravita/min/se/se.html
15. P. Viòas, M. P. Martin, M. Hernándes-Cordoba, „Rapid determination of
selenium, lead and cadmium in baby food samples using electrothermal atomic
absorption spectrometry and slurry atomization“, Analytica chimica acta, 412,
2000., 121-130
16. V. Kos, M. Veber, V. Hudnik, „Determination of selenium in soil by hydride
generation AAS“, Fresenius Journal of Analytical Chemistry 360, 1998., 225-229

32
17. M. Nash, „Determination of Selenomethionine in Nutritional Supplements using
HPLC coupled to the X Series ICP-MS with CCT“, Thermo Electron
Corporation, 2003.
18. C. E. Sieniawska, R. Mensikov, H. T. Delves, „Determination of total selenium in
serum, whole blood and erythrocytes by ICP-MS“, Journal of Analytical Atomic
Spectrometry, 14, 1999., 109-112
19. M. Bueno, F. Pannier, M. Potin-Gautier, „Determinatin of Organic and Inorganic
Selenium Species Using HPLC-ICP-MS“, Agilent Technologies, Inc.,
Applications, 2007.
20. O. G. Filichkina, E. A. Zakharova, G. B. Slepchenko, „Determination of Selenium
in Fodstufs by Cathodic Stripping Voltametry at Mercury-Graphite Electrode“,
Journal of Analytical Chemistry, 59, 2004., 481-486
21. J. Long, Y. Nagaosa, „Determinaton of selenium (IV) by Catalytic Stripping
Voltametry with in sity Plated Bismuth-film Electrode“, Analytical Sciences, 23,
2007., 1343-1346
22. D. W. Bryce, A. Izquierdo, M. D. Luque De Castro, „Flow-injection anodic
stripping voltametry at a gold electrode for selenium (IV) determination“,
Analytica Chimica Acta, 308, 1995., 96-101

33

You might also like