SECUENCIACIN

En la Unidad se realiza la secuenciacin automtica del DNA mediante electroforesis

capilar y mediante el uso de la qumica BigDye Terminator v3.1 de Applied Biosystems.
Todas las muestras son purificadas mediante precipitacin con el fin de eliminar el ruido de
fondo y los terminadores sobrantes colaborando en la obtencin de unos resultados
satisfactorios. Los cebadores utilizados para la reaccin de secuenciacin pueden ser
universales o especficos.
1. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la pureza y
correcta cuantificacin de las muestras de ADN proporcionadas. Se recomienda
utilizar protocolos de extraccin, purificacin y cuantificacin fiables que permitan
verificar la integridad y concentracin de la muestra.

Es muy importante que el usuario prepare siempre LAS MUESTRAS SIEMPRE

DILUIDAS EN AGUA. Evitar el tampn TE y los buffers de elucin del ADN de
los kits comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra inhibe la reaccin de
secuenciacin.

1.1. ADN clonado

Pueden utilizarse cualquier protocolo de obtencin de ADN, pero todos tienen que
producir un ADN libre de ARN, fenol, sales, etanol, EDTA, protenas, etc... Cada usuario
puede elegir el protocolo que ms se adapte a sus necesidades pero funcionan mejor los
que conllevan mtodos de purificacin con minicolumnas.

1.1.1. Purificacin mediante columnas.

Por lo general todos los kits comercializados que comprenden una etapa de
purificacin en columna dan plsmidos de buena calidad para la secuenciacin
(Quiagen, Roche, Eppendorf, Biorad, etc...), a excepcin de algunas slicas/resinas
comerciales que dejan impurezas. Se recomienda centrifugar la columna dos veces
despus del paso de lavado y a continuacin eluir el DNA con agua. Para asegurar
la eliminacin del etanol presente en la solucin de lavado de la muestra.

1.1.2. Protocolos manuales.

- Los mtodos tipo "boiling" pueden dar buenos resultados si se realiza
tratamiento posterior con fenol/cloroformo, cloroformo, precipitacin con
isopropanol y lavados con etanol.

-1-

- Los mtodos de "lisis alcalina" no son recomendable a no ser que vaya

seguido de una purificacin posterior con un kit especfico o mediante
precipitacin.
- Si en la purificacin del DNA se ha utilizado algn solvente orgnico como
fenol o cloroformo, el DNA debe purificarse al menos dos veces mediante
precipitacin con etanol, para eliminar cualquier traza del solvente orgnico.
- Si se utiliza etanol o isopropanol para precipitar el DNA, realizar la
precipitacin utilizando acetato de amonio en lugar de acetato de sodio. Lavar el
precipitado despus de la centrifugacin al menos una vez con etanol al 70%. Secar
el precipitado el mximo posible y resuspender en agua. La presencia de trazas de
etanol en el molde es una de las principales causas de fallo de la secuenciacin.
En cualquier caso, el ADN siempre debe ser resuspendido en agua-miliQ estril.
Evitar cualquier tampn que contenga EDTA pues ste interfiere en la reaccin de
secuenciacin.
1.2. Productos de PCR
La mezcla de PCR debe ser purificada (precipitacin, kits comerciales...) con objeto de
eliminar subproductos, cebadores y dNTPs contaminantes que impidan la secuenciacin.
La secuenciacin de fragmentos de pequeo tamao es algo problemtica por lo que se
recomienda que los productos sean al menos de 150 pb. Los fragmentos ms pequeos se
pueden comportar como primers y son difciles de purificar con buen rendimiento.

1.2.1. Purificacin mediante Columna.

Con cualquiera de los kits existentes en el mercado (Quiaquick, Quiagen,
Millipore, Amersham, Roche, etc...). Este mtodo slo puede utilizarse si la banda
de inters es producto nico de amplificacin y no una PCR mltiple, en tal caso la
secuenciacin ser fallida

1.2.2. Precipitacin.
Existen varios protocolos: a) con acetato amonico slo si la concentracin total
de cebadores en la PCR no es superior a 5 pmol; b) Tambin se puede usar Etanol
y acetato sdico, etc Aplicables todos solo si el producto de amplificacin es
nico, aunque se puede realizar una precipitacin selectiva, pero no es
recomendable.

1.2.3. Dilucin directa del producto de PCR.

Este mtodo implica diluir una alcuota del producto de PCR entre 5 y 10 veces
en agua y emplearlo directamente en la secuenciacin automtica. Para ello, es
necesario emplear bajas concentraciones de dNTPs y primers en la reaccin de PCR,
de tal manera que, las concentraciones finales de los primers sean de 0,2 M o menos
y las concentraciones de dNTPs sean de 100 M o menos. La principal desventaja
de este mtodo es que se requiere una optimizacin individual de las condiciones
para cada producto de PCR.

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1.2.4. Purificacin del producto de PCR de un gel de agarosa.

Cuando existan artefactos o ms de un producto de amplificacin, es necesario
el aislamiento de la banda de inters mediante electroforesis en gel de agarosa
Adems, permite la eliminacin de primers y dNTPs. Se trata de correr el producto
de PCR en un gel de agarosa de bajo punto de fusin, cortar la banda
correspondiente (procurar no contaminar la banda con oligos y cortar la menor
cantidad de agarosa posible) y fundir la agarosa. Finalmente, extraer y purificar el
DNA con sucesivos pasos de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y
precipitacin con etanol y sales. Alternativamente, se puede emplear para la
purificacin kits comerciales.

1.2.5. Purificacin enzimtica del producto de PCR.

Consiste en el tratamiento del producto de PCR con Exonucleasa I y SAP.
Recomendado para productos pequeos de PCR. No puede aplicarse en el caso de
productos de PCR contaminados con subproductos secundarios. El tratamiento
con exonucleasa I degrada los primers de PCR residuales mientras que la SAP
(Shrimp Alkaline Phosphatase) defosforila los dNTPs restantes. Tras la inactivacin
por calor de ambas enzimas puede utilizarse el producto de PCR para secuenciacin
automtica.
1.3. Lambda, Csmidos, BACs
Recomendamos para la extraccin de ADN maxipreps obtenidas por gradiente en
ClCs. Para cualquier consulta en relacin a este tema ponerse en contacto con la Unidad
2.CUANTIFICACIN DE LAS MUESTRAS
Otro factor determinante en el xito de las reacciones de secuenciacin es la correcta
cuantificacin del ADN. Si la cantidad de ADN presente en la muestra es inferior a la
necesaria, casi con toda probabilidad la reaccin de secuenciacin fallar produciendo datos
con baja seal, ruido de fondo, errores y ambigedades. Demasiado DNA molde tambin
puede producir efectos similares.
Se puede realizar mediante espectrofotometra a 260 nm. Puesto que la
contaminacin del DNA molde con RNA o protenas pueden afectar negativamente a los
resultados de la secuenciacin, hay que medir tambin la absorbancia de la muestra a 280 y
230 nm y comprobar las ratio A260/A280 y A260/A230. El DNA molde debe tener una
ratio entre A260 y A280 nm de 1.8-2.0.
Aun asi, debido al amplio margen de error de los espectrofotmetros, nosotros
recomendamos realizar la cuantificacin mediante electroforesis en gel de agarosa
con un control de concentracin conocida. De esta forma se comprueba tanto la cantidad
como la calidad del ADN a secuenciar.

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3. CEBADORES DISPONIBLES
El Servicio suministra los cebadores universales siguientes:
T7
T3
Universal M13
forward -20
Reverso
SP6
T25(A,G o C)

5-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3

5-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3
5-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3
5-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3
5-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3
5-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T(A,G o C)-3

Adems de los cebadores descritos se puede utilizar cualquier cebador sintetizado por
el usuario. Para un correcto diseo de cebadores que vayan a ser utilizados en
secuenciacin, recomendamos lo siguiente:

Los cebadores debern tener, al menos, 18 bases para asegurarnos que hibriden con
el ADN a secuenciar y evitar hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto.
Deben tener una Tm entre 50 C-65 C. Se puede utilizar la siguiente formula para
calcular la Tm . Tm=69.3+0.41x(%GC)-650/longitud del primer
Debe evitarse la utilizacin de cebadores con secuencias que formen estructuras
secundarias, especialmente en el extremo 3, o puedan hibridar formando dmeros
intercatenarios. Para ello, evitar en lo posible la utilizacin de cebadores que tengan
en su secuencia repeticiones de ms de 3 4 Gs Cs seguidas y % GC entre 40-50
%.
No deben emplearse cebadores con errores, ni cebadores que hibriden en ms de
un sitio en la secuencia o que puedan formar dmeros.
Disear el primer al menos 50 bases upstream de la secuencia de inters. La
secuencia inmediatamente posterior al primer o no se obtiene o puede ser bastante
imprecisa.

3. PROGRAMAS

El formato ABI es compatible con los visores habituales disponibles en las

siguientes direcciones:
- EditView en Mac: http://www.appliedbiosystems.com
- Chromas en PC http://technelysium.com.au

En la siguiente direccin web: http://www.appliedbiosystems.com/support/software

/3100/conversion.cfm el usuario puede descargarse el programa de conversin de los
ficheros AVI de PC a MAC.

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4. REPETICIONES
4.1. Secuencias fallidas
Los procedimientos empleados en la Unidad se han diseado para minimizar la
variabilidad y la frecuencia de secuencias fallidas. No obstante se pueden producir fallos
debido a tres tipos de causas:
a. Caractersticas de las muestras, bien del molde bien de los cebadores.
b. Informacin insuficiente por parte del usuario.
c. Error operativo del funcionamiento interno del servicio.
Las secuencias fallidas se facturan cuando se estima que las causas de error son del tipo
a o b. Las producidas por errores del tipo c se repiten. Si la repeticin vuelve a fallar se
asumir que no se trataba de un error operativo. Para cualquier duda o consulta ponerse en
contacto con la Unidad. Cuando las muestras enviadas sean repeticiones indicarlo en
el Formulario de Solicitud que se adjunta con las muestras para hacer los cambios
oportunos con el fin de conseguir un resultado satisfactorio.
4.2. Causas de error
Las causas de error ms habituales que se asocian con el DNA de partida y que afectan,
principalmente, a la calidad del mismo, son las siguientes:
a. Para muestras en vectores de clonacin, son dos los factores ms importantes:

Las condiciones de crecimiento del cultivo. Los cultivos bacterianos para la

purificacin de plsmidos deben obtenerse de colonias frescas crecidas en
medios selectivos o de pequeos precultivos obtenidos de stocks de glicerol o
de agar.
La cepa bacteriana donde se propaga el molde puede afectar a su calidad. Se
obtienen resultados fiables con DH1, DH5, DH10B, XL1-blue y C600. Las
cepas MV1190, HB101 y JM101 no son recomendables puesto que contienen
una gran cantidad de carbohidratos y poseen el locus endA con lo que
producen relativamente grandes cantidades de nucleasa.

b. Caractersticas del ADN. Formacin de estructuras en la clonacin que impiden

una correcta secuenciacin, clones o pcrs mltiples, poliT, presencia de
microsatlites, etc En general, caractersticas del fragmento u organismo a
secuenciar de las cuales no se tiene conocimiento hasta un primer paso de
secuenciacin. Una vez conocidas tales caractersticas, se requieren uno o varios
pasos de optimizacin para conseguir resultados ptimos.
c. Cantidad insuficiente de DNA molde. Se recomienda cuantificar el DNA
mediante electroforesis, empleando diluciones y comparando con marcadores de
masa conocida y comprobar la concentracin.
d. Calidad del molde. Aunque para su preparacin se hayan utilizado kits
comerciales pueden permanecer impurezas que interfieran con la secuenciacin:

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Para productos de PCR las impurezas ms habituales son los fragmentos que
copurifican con el molde como por ejemplo primer-dimers, que contienen
sitios de unin para los cebadores de secuenciacin.
Contaminacin por nucleasas: por ejemplo la DNasa causa un cambio de la forma
del plsmido superenrollada a lineal lo que reduce gradualmente la intensidad
de la seal y la longitud de la secuencia obtenida. Por lo tanto hay que evitar las
cepas hospedadoras que produzcan nucleasas.
Contaminacin por RNA: esto ocurre ms frecuentemente cuando los cultivos
han crecido demasiado tiempo y el tampn de lisis es insuficiente para lisar
todas las clulas. Las muestras contaminadas con RNA muestran un ruido de
fondo alto. El tratamiento del DNA molde con RNasa (libre de DNasa)
degradar el RNA con lo que se pueden mejorar los resultados de las
secuenciacin. Por otro lado, la presencia de RNA falsea la cuantificacin del
ADN.
Contaminacin por sales: la presencia de sales inhibe la reaccin de
secuenciacin (disminuye la procesividad de la polimerasa). Sin embargo el tipo
de sal influye en la severidad del efecto: por ejemplo el cloruro de sodio o de
potasio tiene un efecto mayor que la misma concentracin de acetato de sodio.
Un concentracin de acetato de sodio mayor de 20mM inhibe severamente la
reaccin de secuenciacin. Las causas ms comunes de contaminacin por sales
son: la coprecipitacin de stas con el etanol en la precipitacin del DNA, sobre
todo si esta se realiza a baja temperatura; una eliminacin insuficiente del
sobrenadante; o un lavado con etanol 70% insuficiente. Por lo tanto la
precipitacin del DNA molde y los lavados deben realizarse muy
cuidadosamente y a temperatura ambiente.
Contaminacin por etanol: se produce por la resuspensin del DNA molde tras
la precipitacin sin que se haya secado suficientemente. La presencia de
pequeas cantidades de etanol (5%) puede causar la terminacin prematura de
las cadenas y por lo tanto la obtencin de secuencias cortas. Una contaminacin
con etanol superior al 10% tiene como consecuencia normalmente el fallo total
de la reaccin de secuenciacin.
Contaminacin con fenol: algunos mtodos de preparacin de DNA
plasmdico utilizan un paso de extraccin con fenol. La contaminacin con este
reactivo tiene como resultado la degradacin severa de la secuencia resultante,
especialmente en lecturas largas. Ms de un 1,4% de fenol en el DNA molde
produce secuencias totalmente inutilizables.

e. Problemas con los cebadores especficos del molde. La muestra puede

contener distintos sitios de unin, o el cebador no unirse al molde o cantidad
insuficiente del cebador, error en el clculo de la Tm, DNA subclonado que
arrastre polilinker y existan varios sitios diana para cebadores universales, etc
5. INFORMACIN ADICIONAL
El Servicio pone a disposicin de los usuarios la asesoria cientfica-tcnica necesaria
para ser usuarios de este Servicio. Tambin prestamos la asesora informtica necesaria,
para realizar los anlisis relacionados con el ensamblaje, edicin, alineamiento, bsqueda de
secuencias homlogas, relaciones filogenticas, deteccin de motivos, anlisis de uso de
codones, comparacin de la secuencia problema con las publicadas en las bases de datos,
etc...

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En caso de dudas sobre cualquier punto, pueden ponerse en contacto con la Unidad a
travs de nuestro telfono o e-mail.
957 21 85 87 o genomica@uco.es
6. PROBLEMAS MS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIN
A) No se produce reaccin o esta decae poco despus de comenzar

Posible causa
No hay ADN o hay menos del necesario
No hay cebador o la concentracin es inferior a la
necesaria. El primer puede estar degradado
El cebador no encuentra el sitio de hibridacin
El ADN presenta contaminacin
El cebador est mal diseado o la temperatura de
melting no es la adecuada
El sitio de unin del cebador en el vector se ha
perdido o daado. Durante la clonacin pueden
crearse artefactos con una delecin cerca del sitio
de insercin del DNA a clonar o deleciones que
eliminan la secuencia del primer del vector.
En los productos de PCR puede que los
amplificados no sean el producto de la
amplificacin con los dos cebadores. Si el
amplificado se genera a partir de uno de los dos
primers slo se obtendr secuencia con ste. Este
efecto se puede producir cuando se utilizan para
secuenciar los mismos primer que se han utilizado
en la amplificacin del DNA molde y alguno de
ellos no funciona correctamente.

Posible solucin
Aumentar la cantidad de ADN
Aumentar la concentracin o cantidad de
cebador, Cambiar la alcuota.
Cambiar el cebador. Asegurarse del diseo
Volver a preparar el ADN
Redisear el cebador

Volver a clonar en el vector

Cambiar de cebador

B) Seal de baja intensidad. Unin dbil del cebador.

Posible causa
Mala calidad del ADN
ADN presenta estructura secundaria en el sitio
de hibridacin del cebador
La concentracin del ADN inferior a la
necesaria

Posible solucin
Volver a purificar el ADN
Cambiar de cebador
Aumentar la concentracin

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El cebador utilizado en la secuenciacin no es el

adecuado:
- Estructura secundaria (afecta ms en
extremo 3)
- Tm del cebador demasiado baja (muy corto,
poco contenido GC, etc)

Cambiar el cebador

C) El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo

Posible causa
Existe un sitio secundario de unin del cebador
que da lugar a picos extra
La cantidad de ADN es insuficiente y la seal es
demasiado baja
El ADN presenta contaminacin1
La PCR no fue especifica y existen amplicones
contaminantes en la muestra
Cebador mal purificado2 o degradado
Fragmento de PCR mal purificado

Posible solucin
Intentar eliminar aadiendo DMSO en la
secuenciacin o cambiar de cebador
Aumentar la cantidad de ADN
Purificar el ADN
Cambiar de cebador
Cambiar de cebador o purificar
Eliminar los cebadores de la amplificacin

1. En la secuenciacin en capilares este problema (contaminacin del ADN) es an mayor al

ser ms sensible.
2. Puede verse una secuencia sombra (N-1). El cebador est compuesto por cadenas
completas (N), pero una proporcin de ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar
a un cromatograma ilegible al tener picos superpuestos y desfasados.

D) El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas

Posible causa
Posible solucin
El cebador tiene varias dianas
Cambiar de cebador
Primer drimer: Esto puede ocurrir cuando los
primers empleados en la amplificacin forman Volver a purificar el producto de PCR
dmeros y estn presentes en la reaccin de

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secuenciacin debido a una mala purificacin

del producto. Cuando termina la secuencia de
los dmeros la lectura es correcta.
Cebador degenerado
ADN subclonado existiendo dos sitios diana
para el cebador universal utilizado1
Posible causa
PCR inespecfica: diana del cebador en ambos
extremos, es decir, amplicn inespecfico
generado por un solo cebador
Hay ms de un ADN molde en la muestra3

Cambiar de cebador
Secuenciar con otro cebador
Posible solucin
Cambiar de cebador
Repreparar el ADN

1. Comprobar, si se ha arrastrado polilinker durante la subclonacin porque esto implicara que

el/los cebadores universales tienen sitio de hibridacin duplicado y no se pueden utilizar en
la secuenciacin de esa muestra. Aseguraros de que partimos de una nica colonia o que no
es PCR mltiple con amplificaciones secundarias inespecficas.

-Primer Drimer
Si el producto de PCR no est purificado o en la purificacin no se ha eliminado totalmente los
restos de primer que no se utilizaron en la amplificacin, se pueden formar dimeros de primer que
actan como molde en la reaccin de secuenciacin. Esto genera lecturas superpuestas. El rango o
longitud de la superposicin depender del tamao del molde contaminante.
- En el caso de productos de PCR: la mezcla de lecturas comienza desde el principio. Si a partir
de las 20-60 pb de bases la mezcla desaparece es indicativo de primer drimer.
- En el caso de un clon mltiple: la mezcla de lecturas comienza a partir de las 30-90 pb de bases,
es decir, la lectura de ambas colonias coincide solo en el vector. Una vez comienza el inserto, si son
distintos, se mezclan las lecturas.
Ejemplo:
La reaccin comienza de
forma normal pero existe
doble lectura a partir de un
determinado punto (30-90
pb aprox.)

-Insercin/Delecin

La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto
(ms de 150 pb aprox.)

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Posible causa
Regin heterocigtica para ese fragmento
Mutaciones frame shift

Posible solucin
Digestin para eliminarlo

E) La secuencia pierde bruscamente la seal y cae

Posible causa
Efecto de una estructura secundaria (presencia
de secuencias repetidas, palindromicas, etc)
La cantidad entre el ADN y el cebador no es la
equilibrada
Formacin de estructuras en la clonacin que
impiden una correcta secuenciacin
Presencia de compuestos contaminantes en la
muestra (EDTA, sales, etanol, fenol, etc.)
ADN cortado, digerido a ese nivel o
finalizacin de producto de pcr

Posible solucin
Aadir DMSO, secuenciar la cadena
complementaria, digerir el molde, subclonarlo y
secuenciar los subclones o utilizar un kit
alternativo para las reacciones de secuenciacin
cmo el kit dGTP Big Dye de ABI.
Respetar las concentraciones y cantidades
indicadas en las tablas de entrega de muestras
Realizar PCR sobre el clon (cebadores
universales o propios) y mandar a secuenciar el
amplicn resultante y no el clon
No resuspender nunca el ADN en solucin que
contenga EDTA

F) Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma

Posible causa
Demasiada cantidad de ADN

Posible solucin
Reducir la cantidad de ADN ( segn figura en
las tablas de entrega de muestras)

G) La secuencia es normal pero aparece un pico de forma repentina

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Posible causa
Terminadores no incorporados (entre 0-180 pb)

Posible solucin
Repetir la reaccin de secuenciacin

H) Aparicin de un pico anmalo con los colores correspondientes a todas las

bases

Posible causa
Burbuja producida por el capilar

Posible solucin
Volver a analizar la muestra o repetir la reaccin
de secuenciacin

I) Aparicin de picos muy abiertos con la consecuente prdida de resolucin

Posible causa
Exceso de ADN (capilar)
Presencia de sales o contaminantes en la
muestra
Problema del capilar

Posible solucin
Respetar la cantidad y concentracin de ADN
Volver a purificar la muestra
Repetir la secuencia

J) Secuenciacin de regiones ricas en GCs, GAs

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Posible causa
Formacin de dplex que alteran estabilidad del
cebador

Posible solucin
Usar temperaturas de secuenciacin ms bajas
que la estndar

Posible causa

Posible solucin
Secuenciar cadena complementaria
Repetir la secuenciacin con un kit alternativo
(dGTP Big Dyes).
Aadir DMSO en la secuenciacin
Cambiar condiciones de PCR: aumentar la t de
desnaturalizacin a 98, el n de ciclos de PCR o
la cantidad de Taq; incluir un paso de predesnaturalizacin de 5 min
Linearizar el vector y secuenciar productos tras
subclonarlos

Composicin nucleotdica (Repeticiones

dinucletidos GT, GC, GA.)
Estructura secundaria, efecto de la alta Tm del
tratamiento del ADN

Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan
con la muestras a secuenciar
1. Las repeticiones de AG pueden ser problemticas pues la Taq produce una seal dbil de G
despus de A cuando se utilizan terminadores marcados. En este caso conviene secuenciar la
cadena complementaria.

K) Presencia de microsatlites

Posible causa
Presencia Microsatlites: SSRs, VNTRs, en el
caso de productos de PCR son ms
problemticos que en productos clonados,
sobre todo si son de elevada longitud. Se puede
producir el deslizamiento de la polimerasa y no
se puede obtener secuencia de esa regin.

Posible solucin
Secuenciar a partir del plsmido no del
producto de PCR y aadir DMSO en la
reaccin de secuenciacin

Repeticiones dinucletidos GC

Cambios ya recomendados

Crear delecciones seriadas en esas zonas y

secuenciar

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L) Presencia de largos homopolmeros

Posible causa

Presencia de poliA/poliT1

Posible solucin
Secuenciar cadena complementaria
Empleando cebador degenerado del tipo
T25(A, G C)2 si no se conoce la base siguiente
a la regin poliA/poliT o los cebadores
individuales especficos T25A, T25G T25C.
La base 3 del cebador permite anclar este a la
secuencia al final del homopolmero, mejorando
los resultados obtenidos

1. La polimersa patina dando lugar a una lectura ilegible despus de la regin

homopolimrica, aunque los datos de antes de esa regin sean de buena calidad. Este
problema se puede producir en la reaccin de secuenciacin o en la de amplificacin,
aunque en este ltimo caso no son aparentes cuando el fragmento se visualiza en un gel de
agarosa.
2. Se denominan primer anclado: Son primers que se unen al homopolmero, tipo T25-(N) y
que terminan en una base degenerada para obligar al oligo a pegarse en la posicin 3.

Posible causa

Posible solucin

Secuenciar cadena complementaria

Homopolmero de Gs o Cs (causa
deslizamiento de la polimerasa generndose una Usar un cebador ms interno que hibride 20-30
bases antes del homopolmero para forzar a la
secuencia ilegible)
polimerasa a pasar sobre l
Realizar deleciones seriadas y secuenciarlas
En los productos de PCRs pueden existir saltos,
problemas que no existen en el material clonado

Secuenciar el material clonado, adems del

amplificado. Si es posible, es mejor verificar la
especificidad de la secuencia a partir de otros
clones

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M)Primer N-1

Secuencia sombra N-1

Posible causa
Posible solucin
El cebador est compuesto por cadenas
completas (N), pero una proporcin de ellas
contiene una base menos (N-1), esto da lugar a
un cromatograma ilegible, en algunos casos, al
tener picos superpuestos y desfasados. Puede Prepara una nueva alcuota del primer
verse una secuencia sombra (N-1) de menor
altura, donde cada pico sombra es igual que el
pico siguiente de mas altura y/o intensidad de
fluorescencia.

N) Solo terminadores

Posible causa

Posible solucin

Aparecen solo los terminadores debido a que la

cantidad de ADN es insuficiente

Poner mas cantidad de ADN o de mejor calidad

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O) No inserto

Posible causa
Inserto no clonado correctamente
Falso positivo

Posible solucin
Clonar de nuevo
Seleccionar otra colonia

P)Heterocigosis (No fallo)

G C + T C

Heterozigoto:
GT

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