PRACTICASDEMICROBIOLOGIA

INDICE
Introduccinyobservacionespreliminares
Materialporpareja
Mediosdecultivo
Esterilizacin
Siembrademicroorganismos
Fermentacindeazcares
Observacindelasbacterias
Ensayosbioqumicosestandarizados
Antibiosis
Actividadcatalasa
Anlisismicrobiolgicodeaguascontaminadas
TransferenciagenticaentrebacteriasGramnegativas
Conjugacin
Transformacin
TitulacindeunvirusbacterianoyTransduccin
Crecimientobacteriano
Aislamientodebacteriaslcticasyproduccindeyogur

Pgina
1
2
3
4
5
6
6
8
9
11
11
13
14
15
17
18

OBJETIVOS
Elobjetivodeestasprcticasconsisteenfamiliarizaralalumnoconalgunasdelastcnicasms
comnmenteutilizadasenloslaboratoriosdeMicrobiologaypermitirlaobservacinexperimentalde
losconceptosaprendidosdurantelasclasesdeteora.
NORMASDESEGURIDAD
Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patgenos habituales, su ingestin
masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos problemas. Por ello hay que seguir unas
cuantasnormasdeseguridad:
1)

Nosepuedefumarnicomerenellaboratorio

2)

Esobligatoriolautilizacindelabata

3)

Laropaylosobjetospersonalesnodebenmantenersecercadelaszonasdetrabajo

4)

Al comenzar las prcticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de

manipulacin,yretirarloalterminarelda.

5)

Lavarselasmanoscuidadosamenteantesdesalirdellaboratorio

CALIFICACIN
Cada alumno deber completar un cuaderno donde anotar con detalle los fundamentos de la
prcticacorrespondiente,losresultadosobtenidos,ylaexplicacindestos.Dichocuadernopodrser
1

utilizadoenelexamendeprcticasobligatorioqueseefectuareneldayhoraqueseaanunciado. No
podremplearseesteguinenelexamen.
ORGANIZACION
Lasprcticassedesarrollarnporparejasendosperiodosdeunasemanacadauno.Elprograma
diarioquese describeacontinuacinpuede ser sujetoa modificaciones dependiendodel calendario
concretodecadagrupo.

SEMANA1

SEMANA2

Lunes

Martes

Mircoles

Jueves

Viernes

Preparacinde
mediosde
Cultivo

Siembra

SiembraAntib.
OMac.
OMic.I

SiembraAPI
Antib.
OMicII

Rdo.API
Rdo.antib.
Catalasa
Rdo.BacProb
SiembraYogur

AnAguasI
Conjug.I
TransformacinI
Inoculacin
Leche

AnAguasII
Conjug.II
Transformacin
II
AnYogur

AnAguasIII
Rdo.Conjug.
Rdo.Transf.
TVirus
Transduc.

RdoTVirus
SEMINARIO
Rdo.Transduc.
CrecBact.

Abreviaturas. An.AguasI, II, III, Rdo.) Anlisis de aguas y resultados; Antib.) Antibiosis;
Rdo.Antib) Resultado antibiosis; Conjug.I,II, Rdo.) Conjugacin y resultados; CrecBact.)
Crecimientobacteriano;OMac)Observacinmacroscpica:OMicI)Observacinporcontrastede
fases y tincin de Gram; RdoBacProb) Resultados de identificacin de la bacteria problema.
OMicII)Tincindeesporas;TVirus)Titulacindeunvirusbacterifago;API)Ensayosbioqumicos
estandarizados.Transduc)Transduccin.AnYogur)Anlisismicroscpicodeyogur.
MATERIALPORPAREJA
Acadaparejaseleasignarunaclaveconsistenteenelnmerodelamesaseguidodeunaletrade
laAalaDydispondrdeunataquillanumerada.Enesataquilladebedeencontrarseelmaterialpara
prcticasqueseindicaenellistado, yes responsabilidadde cadapareja comprobarsuestadoal
principiodelaprcticayasegurarsedequequedacompletounavezconcluidasstas.Diariamentehay
queabrirlataquillaconlallavelocalizadaeneltablerojuntoalaspizarras(nodejeislasllavespuestas
enloscandadosporquesedoblan!).
Equipo:
Untrpode
Uncristalizador
Unaspinzas
Unrotulador
UnaPropipeta

Rejillaparatrpode
Unpuentedetincin
Unasadesiembra
UnMicroscopio
2

Coleccindecolorantesyreactivos.
Cristalvioleta
Safranina
Verdemalaquita
Frascolavadorconagua

Lugol
Azuldemetileno
Etanol
Aceitedeinmersin.

MEDIOSDECULTIVO
ParaempezaratrabajarencualquierlaboratoriodeMicrobiologaserequieredisponerdeunaserie
demediosdecultivoestriles.Aunquesedarnyapreparadosporfaltadetiempo,resultanecesario
conocerlosmtodosdepreparacinyesterilizacinutilizadoshabitualmenteenellaboratorio.
Losmediosdecultivoquevamosautilizarsonindefinidosonaturales,porqueensupreparacin
siempre se incluye algn extracto de composicin qumica desconocida. El ms utilizado, el caldo
comnosuversinsolidificadaconagar,esunmedioquepermiteelcrecimientodelamayoradelas
bacterias que se van a utilizar en estas prcticas, pero tambin se emplean otros que contienen
inhibidoressemiespecficoscomoelagardeMcConkey,cuyassalesbiliaresinhibenelcrecimientodela
mayora de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarn medios que contienen
componentestalescomoindicadoresdepHquecambiandecolorcuandoelmicroorganismorealizauna
actividadmetablicapreferentesobresubstratosconcretos(Ej:fermentacin).
Preparacindemediosdecultivo:
Caldocomn.Composicinporlitro.
Extractodecarne
Peptonabacteriolgica
Clorurosdico

3g
10g
5g

Para prepararlo, se aaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en
agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado
directamente) y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una
jeringa hasta acabar con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50 y
75 ml. Los recipientes se aslan con tapones metlicos o de algodn graso envuelto en gasa y se
esterilizan a 1 atm de sobrepresin durante 20 minutos.
Agarnutritivo.Lacomposicineslamismaqueladelcaldocomn,peroseaadeantesdeesterilizar15
gdeagarporlitro,disolvindolodurantelaesterilizacin.Cuandoanestcaliente,seagitaparahacer
ladisolucindeagarhomogneayseextiendeenplacas(a45C)yentubos,queseguidamenteson
inclinadosparaobtenerunasuperficiemsextensa.
Medio base para la fermentacin de azcares. Inicialmente se prepara un medio base pobre en
aminocidosdelasiguientecomposicinporlitro:
Extractodecarne
Peptonabacteriolgica
Clorurosdico

1g
10g
5g

Unavezdisueltosloscomponentes,seajustaelpHa7yseaaden2mldesolucindeprpurade
bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se disuelve inicialmente en etanol al 95 y
posteriormentesediluyeconagua)porlitro.EsteesunindicadordepHqueviraaamarillopordebajo
depH5.2,porloquepermiteladeteccindelaproduccindecidoenelmedio.Elmediosereparteen
tresvolmenesigualesalosqueseaade10gporlitrodeglucosa,lactosa(GalGlu)osacarosa(Glu
Fru).Una vez disuelto, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 7 ml/tubo,
en el que previamente se ha introducido una campana Durham, pequeotubodeensayoquesedispone
enposicininvertidaparadetectarlapresenciade gases. Elmedioha deocuparcompletamente el
interior de estas campanas para poder detectar posteriormente el desprendimiento de gases en la
4

fermentacin.(Noolvidarmarcarcadatuboconlainicialdelazcarquecontenga).Una vez taponados,

se esterilizan a 0.5 atm de sobrepresin durante 20 min.
Elrestodelosmediosutilizadosyavienenpremezcladosenformadeshidratadaylistosparasu
reconstitucin.Lasprincipalescaractersticasadestacardesucomposicinson:
AgardeMcConkey.ContienelactosayunindicadordepH(rojoneutro)quevirahaciarojoapHcido
cuandolalactosaesfermentada.Adems,contienesalesbiliaresqueinhibenelcrecimientodemuchas
bacterias,especialmenteGrampositivas.
Agaralverdebrillante(AVB).Contienelactosa,sacarosa,unaelevadaconcentracindeaminocidos,
verdebrillantecomoinhibidordecrecimientodemuchosfermentadores,yrojodefenolcomoindicador
de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminocidos y generan color rosa. Los
fermentativosonocrecenodancoloramarillo.
Agardetresazcaresehierro(TSI).Contienelactosa,sacarosayglucosa,citratofrricoytiosulfatode
sodio, elevada concentracin de aminocidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos
inclinadosperodemuchovolumen.Lasbacteriasseinoculanenpicadura(microaerobiosis)yextensin
superficial.Lasfermentadorasgenerancoloramarilloporacidificacinylasoxidativasrosasobrela
superficie(basificacin).Lassulfitoreductorasdansulfurodehierroqueresultaenprecipitadosnegros
enlazonaanaerbica.
AgarEosinaAzuldeMetileno(EMB).Setratadeunmedioricolactosadocondoscolorantes,eosinay
azuldemetileno,quetambinfuncionancomoinhibidoresdelcrecimientodeGrampositivos.Eneste
medioE.colicrececomocoloniasnegrasconbrilloverdemetlico.
CaldodeureaIndol.Esunmediomuypobreybastantetamponado quepermitedeterminarlapresencia
delaactividadureasaylaproduccindeindolapartirdetriptfano.Enestasprcticasseemplear
slamenteparadeterminarlapresenciadeactividadureasa,cuyaactividadprovocaladegradacindela
ureapresenteenelmedio(un2%p/v)aCO2yAmonio,conlaconsiguintealcalinizacin.Estecambio
depHesdetectadoporcambiodecolordelindicadorazuldebromotimoldesdeeelverdeoriginalal
azulintenso.Sisequisieradeterminarlaproduccindeindolbastaraaadiralmediotraslaincubacin
0.3mlelreactivodeKovacs(reactivoINDdelensayoAPI),siendopositivasiseproducecambiode
coloralrojo..
AgarMRS(Man,RogosaySharpe). Setratadeunmedionaturalmuyricoquecontienepolisorbato,
acetato,magnesioymanganesoqueactancomofactoresdecrecimientoparamuchoslactobacilos.El
crecimiento se efectuar en medios microaerfilos empleando jarras para el cultivo de organismos
anaerbicosyunsistemacomercialparalaeliminacindeloxgeno.
ESTERILIZACIN
Lapresenciademicroorganismosentodoslosmediosambientaleshaceimprescindiblequepara
estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir todas aquellas que pudieran encontrarse
contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la
ESTERILIZACION,consistenteenladestruccindetodomicroorganismo.
Enestasprcticasvamosautilizarespecialmenteelcalorcomomtododeesterilizacinrutinario,
aunquetalycomosehaexplicadoenclaseexistenotrasposibilidades.Losmediosconcontenidoacuoso
5

handeseresterilizadosenelAUTOCLAVEmediantecalorhmedo,obtenidoporcalentamientoenun
depsitohermticoquecontieneaguaydelquepreviamentehasidoevacuadoelaireconelfinde
limitarlasoxidaciones.Enestesistemaelvapordeaguasobrecalentadoa121(2atm)o111C(1.5atm)
difundemuyrpidamente,haciendoqueloselementostermosensiblesdelasclulassedesnaturalicen,
especialmentesusenzimas.
Porlotanto,unavezpreparadoslosmediosdecultivohayqueprocederasuesterilizacinen
autoclave,realizadahabitualmentea1atmdesobrepresin(121C)durante1520min.,salvoenel
caso de medios cuyos componentes sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el
crecimiento.Esteeselcasodelosazcaresutilizadosenlosensayosdefermentacin, que se suelen
esterilzar a menor presin [0.5 atm. de sobrepresin (111C)] para evitar su"caramelizacin" , una
modificacin consistente en su oxidacin y consecuente conversin en formas txicas para el
metabolismodelasbacterias,oenelcasodelaurea,queconvieneesterilizarlaindependientementepor
filtracin.
Porotraparte,todoelmaterialdevidrioseesterilizamediantecalorsecoenelHornoPasteur.Una
vezlimpio,elmaterialseenvuelveenaluminiooseintroduceenuncontenedor(ej:pipetasenpipetero)
ysemantieneenelhornodurantedoshorasa160C.Enelcasodelosportainculosqueseestn
utilizandoconstantemente,seutilizaelcalordirectodelmechero,quetambinsirveparaflamearlos
bordesdetubos,matraces,pipetas,etc.
Prctica:
En esta prctica vamos a proceder a la preparacin de caldo comn, de medios para la
fermentacin de azcares y de placas de agar comn siguiendo los protocolos descritos anteriormente
(ver "caldo comn", "medio base para la fermentacin de azcares" y "agar nutritivo", respectivamernte) y
las instrucciones de los monitores.
SIEMBRADEMICROORGANISMOS
EnMicrobiologaseentiendecomosiembraelprocesomedianteelcualsellevaunaporcindeuna
poblacin de microorganismos, denominada entonces inculo, de un cultivo crecido a un medio
nutritivoparasucrecimiento.Todoesteprocesohayquellevarloacaboconinstrumentosymedios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prcticas. La principal
advertenciaconsisteentrabajarsiempreprximosalallamadelmecheroque,debidoalascorrientesde
conveccinverticalesquegenera,escapazdecrearunambienteestrilenlazonainmediatamente
alrededorydebajodelallama.
Comoinstrumentoportainculosmsfrecuenteseutilizaelasadesiembra,conelquesepuede
tomarinculoapartirdecoloniasodemediolquido,debidoaquemantieneunpequeovolumende
aguaportensinsuperficial.Paradepositarelinculoenlquidobastaconintroducirelextremoenel
medioyagitarligeramente.Sobreslidohayquehacerunrecorridolargosobrelasuperficiesalvoenel
caso del medio TSI, en el que tambin hay que inocular picando en profundidad para observar
reaccionesmetablicasenanaerobiosis.Avecesseutilizanpipetasparatransportarvolmenesgrandes
deinculoscomoenlaprcticadecrecimientobacteriano.
Procedimiento:
Cadaparejadeberinocularymantenerdurantelamayorpartedelasprcticasuna
seriedebacteriasconocidasquedenominaremoscoleccinyunabacteriasinnombrequeconstituirel
problemayquedeberdeseridentificadodespusderealizartodaunaseriedeensayos.Lasbacteriasde
lacoleccinysustemperaturasdecrecimientoson:
6

Escherichiacoli
Pseudomonasaeruginosa
Staphylococcusaureus
Micrococcusluteus
Nocardiacorallina
Bacilluscereus

37C
37C
37C
30C
30C
37C

Gramnegativa
Gramnegativa
Grampositiva
Grampositiva
Grampositiva
Grampositiva(Cuidadoporqueformaesporas!)

Enestaprcticaseinocularncadaunadelasbacteriasdelacoleccinenuntubodecaldocomny
enotrodeagarinclinado.Labacteriaproblema,ademsdeenestosmedios,serinoculadaenunaplaca
deagarcomnalobjetodeobtenercoloniasaisladas,bienporagotamientodelasiembraobienpor
siembrayesterilizacinentrerecorridossolapantes,segnlasexplicacionesdelosmonitores.Unavez
inoculado,incubarcadabacteriaasutemperatura ptimadecrecimientoynoolvidarsedemarcarel
nombredelabacteriaylaclavedeparejadeprcticas.

FERMENTACIONDEAZUCARES
Seentiendeporfermentacinareaccionesdemantenimientoquenorequierenlaparticipacinde
unacadenadetransportedeelectrones,aunqueenciertoscasosstaspuedenjugarpapelesauxiliares.En
el caso de azcares se trata de procesos de xidoreduccin capaces de regenerar NAD y que
comnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, nbutanol, etc.), cidos
(actico,frmico,lctico,etc.)acompaadosonoporlaformacindegases.
Ademsdesuintersbioqumico,lacapacidadparafermentardiferentesazcaresesunapropiedad
utilizadamuyfrecuentementeentaxonoma.Ennuestrocasoutilizaremosunprocedimientoclsicopara
ensayarlacapacidaddefermentacindetresazcares:Glucosa,SacarosayLactosa.Laproduccinde
cidosseobservarporelvirajeaamarillodelPrpuradeBromocresol.Laproduccindegasporsu
acumulacin en las Campanas Durham, de donde habr desplazado parte del lquido inicialmente
includo.Ambasdeterminacionesseefectuarnalas24y48horasdeincubacinparaastenerunaidea
delarapidezdesuproduccin.Asmismo,seharunacuantificacinenfuncindelaextensindel
virajedelindicadorydelacantidaddegasproducida.
Procedimiento:
Inocularconlabacteriaproblemayconunadelacoleccin(escogidasdeformaquenoestn
repetidasenlamesa)einocularcadaunadeellasentrestubosquecontengancadaunodelostres
azcares (G,S,L). Incubarlos a las correspondientes temperaturas de crecimiento. Hacer las
determinacionesalas24y48horasyapuntarlosdatosdelproblemaydetodalacoleccinenel
cuadernodeprcticas.
OBSERVACIONDELASBACTERIAS
a)

Observacinmacroscpica.
Eltamaodelasbacteriasimpideverlasasimplevista.Sinembargo,lascoloniasqueformansobre
mediosslidosssonvisibles,yenellassepuedeestudiarunaseriedecaractersticasquenosayudana
suidentificacin.Anivelmorfolgico,podemosestudiarlaformadelascolonias,sutamao,aspecto
delborde(liso,rugoso,ondulado,ramificado,etc.),presenciadebrillo,color,etc.Inclusosobremedio
7

lquido las bacterias producen modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver
esencialmenteconlascaractersticasdesumetabolismo.Asseobservasilaturbidezesuniforme,si
crecenenelfondo,silohacenenlazonasuperficial,siproducenpigmentos,etc.
b)

Observacinmicroscpica.
Puestoquelainmensamayoradelasbacteriassonincoloras,lanicaformadeobservarlasbienen
elmicroscopiopticoconsisteenincrementarsucontrasteconrespectoalmedio.Estoseconsigue
mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial de contraste,
generalmentedefases,enelmicroscopio.
La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y
determinaralgunascaractersticastalescomosumovimiento.Paraello,disponerunagotadecultivo
lquido,previamenteagitado,sobreunportaobjetosytaparloconuncubredeformaqueseestablezca
unadelgadapelculaentreamboscristales.Posteriormente,seobservaconelobjetivodecontrastede
40x(ojo!,tieneunabandarojaynotodoslosmicroscopiosdisponendel)yelcondensadoranular(se
desplazahorizontalmenteyconsuavidadhastaalcanzarsuposicinenelcaminoptico).Coneste
sistemasedebendepoderdistinguiraquellasbacteriasconflagelacinpolar,quesemuevenenzigzags
muyrpidos,delapertricas,demovimientosmssuavesyondulados.Enlasinmvilesseproducen
desplazamientosgeneralesporlaexistenciadecorrientesyvibracionesenelmediodeobservacin.
Determinarlaformaycapacidaddemovimientodelabacteriaproblema,yobservartambinalguna
preparacindelasdelacoleccin:Pseudomonas(polar),E.coli(pertrica),etc.
Paraobservarlasbacteriasteidas,hayqueprocederpreviamenteasufijacin.Inicialmentese
preparaunfrotisapartirdemediolquidoodispersandoenunagotadeaguaunaporcindeclulas
crecidasenslido.Posteriormentesedeshidrataelfrotisporcalentamientosuaveutilizandoelreverso
delamanocomocontroldetemperaturatraspasarrepetidamenteelportaobjetossobrelallamadel
mechero.Traslafijacinporcalorseprocedealatincin.
TincindeGram.Setratadeunatincindiferencialmuyutilizadaquedistinguelasbacteriasporlas
caractersticasdesuparedcelular.Conelfindedisponerdecontrolesinternosquenospermitansabersi
latincinhasidocorrectaseefectantrestincionescomomnimo:unaconlabacteriaproblemasla,y
otras dos en las que sta es mezclada (a nivel del frotis!) con una bacteria G+ o con una G de
morfologadistintaalaproblema.As,sitodovacomodebelabacteriaproblemahademantenersu
coloracin Gram constante en los tres frotis, apareciendo en una de las mezclas otras bacterias de
coloracinGramcontraria.Elprocesodetincinseefectasiguiendoelsiguienteprotocolo:
1)
2)
3)
4)
5)
6)

Hacerunfrotisyfijarsegnseindicaanteriormente.
Cubrirconcristalvioletadurante1minuto.Enestepaso,todaslasclulasquedanteidaspor
elcolorante.
Eliminarelcristalvioletavolcandoelportaytratarconlugoldurante1minuto.Deesta
formaserefuerzalainteraccinentreelcoloranteylaparedcelular.
Lavarconalcoholporgoteocontinuadodurante20segundos.Aadirinmediatamenteagua
paraevitarelarrastrecompletodetodoelcolorante.Enestafaseseproduceladecoloracin
diferencialdelasGramnegativas.
Tratarconsafraninadurante1minutocomocolorantedecontraste.
Lavarconaguaabundante,secaralaireyobservareninmersin(100x).Enestafaselas
Gram negativas adquirirn color rojo de la safranina mientras que las Gram positivas
continuarnconelcolorazulpropiodelprimercolorante.

Tincindeesporas.Setratadeotratincindiferencialqueseefectadeformaseparadaconlabacteria
problemayconBacillussubtilis(delacoleccin)comoproductordeesporas.Elprocedimientoaseguir
eselsiguiente:
1)
2)
3)

4)

5)
6)

Hacer dos frotis de cultivos procedente de medio slido de la bacteria problema y de

Bacillusdelacoleccin.Fijarlosporcalordelaformayadescrita.
Colocar los portas sobre el trpode y cubrir la preparacin con tres papeles de filtro
recortadosdeformaquenosobresalgan.
Aadirverdedemalaquitahastaquelospapelesquedenempapadosypegadosalosfrotis.
Coger el mechero por su base y calentar lentamente las preparaciones hasta que estas
empiecenaemitirunvaporblanquecino(detectablemejorsobrefondonegro).Manteneresa
emisinconelmecherodurante5a7minutossindejarquesesequenlasmuestras(seaade
mscolorante).Enestafasesetienlasformasvegetativasylasesporas.
Cogerlaspreparacionesconpinzas(queman!)ylavarlasintensamenteconaguafrahasta
queseobservemuypocacoloracin.Duranteestelavadodiferencialelaguaarrastrael
colorantedelasformasvegetativas,mientrasqueelincluidoenlasesporassemantieneenel
interiordebidoalenfriamientodelasenvolturas,quesevuelvendeestaformamuchomenos
permeables.
Teirconuncolorantedecontrastecomolasafranina,ahoraenfro,durante1minuto.Este
sloteiralasformasvegetativas,mientrasquelasesporaspermanecernrefractariasasu
entrada.
Desteirconaguafra.Secaralaireyobservarconelobjetivodeinmersin.

Sitodovacomodebe,lasesporasaparecerndecolorverdeylasformasvegetativasenrojo.
Determinarsilabacteriaproblemaformaesporasono.

ENSAYOSBIOQUIMICOSESTANDARIZADOS(API20E)
Ademsdelasfermentacionesdeazcares,existeunagrandiversidaddeensayosbioqumicosque
permiten identificar a un determinado organismo. No obstante, el desarrollo individualizado de un
conjuntodeestosensayosesmuylento,yrequierelamanipulacindegrancantidaddematerial,loque
a efectos prcticos los hace inviables en laboratorios de anlisis rutinarios. Para stos, se han
desarrollado sistemas miniaturizados que permiten el ensayo a gran escala y de forma sencilla de
muchosensayosbioqumicossimultneos. UnodeestosensayoseseldenominadogaleraAPI20E,
especialmentediseadosparaEnterobacterias,peroquepuedeseraplicadoaotrasbacterias.Ennuestro
caso,usaremosunagaleradeensayodeestetipoparacaracterizaralgunasreaccionesbioqumicasdela
bacteriaproblema.
Actividadesaensayar.LagaleraAPI20Econstade10reaccionesespecficasdefermentacinparalos
azcaresyotras10reaccionesdeutilizacindesustratosopresenciadedeterminadasenzimassegnse
detallaenelsiguientecuadro:
TESTS
SUBSTRATOS
REACCIONES/
NEGATIVO
POSITIVO
ENZIMAS
ONPG
Ortonitrofenil
incoloro
amarillo(1)
galactosidasa
galactsido
ADH
Arginina
argininadihidrolasa
amarillo
rojo/naranja(2)
LDC
Lisina
lisinadescarboxilasa
amarillo
naranja
ODC
Ornitina
ornitinadescarboxilasa
amarillo
rojo/naranja(2)
(CIT)
Citratosdico
utilizacindecitrato
verdeplido/
azulverde/azul(3)
amarillo
H2S
Tiosulfatosdico
produccindesulfdrico incoloro/gris
depsitonegro
URE
Urea
ureasa
amarillo
rojo/naranja
TDA
Triptfano
triptfanodeaminasa
amarillo*
marrn*
IND
Triptfano
produccindeindol
anarillo*
anillorojizo*
(VP)
piruvatosdico
produccindeacetona
incoloro*
rojorosa
(GEL)
gelatinadeKohn
gelatinasa
Nodifusin
difusin

de
pigmentonegro
GLU
Glucosa
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
MAN
Manitol
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
INO
Inositol
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
SOR
Sorbitol
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
RHA
Ramnosa
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
SAC
Sacarosa
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
MEL
Melibiosa
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
AMY
Amigdalina
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
ARA
Arabinosa
fermentacin/Oxidacin Azul/verdoso
Amarillo
(4)
*) Requierelaadicindereactivos
1) Unamarillomuyplidodebeconsiderarsepositivo
2) Uncolornaranjaplidodespusde24horasdeincubacinpodraconsiderarsenegativo
10

3)
4)

Lalecturadebehacerseenlacpula(aerobiosis)
Lafermentacincomienzaenlaparteinferiordelostubos,laoxidacinenlasuperior

Materialesyreactivos:
GaleradeidentificacinAPI20E
P200ypuntasestriles
Pipetasde5mlestriles
Tubo5mlestril
Solucinsalinaestril(Clorurosdico0.9%)
Aceitedeparafinaestril
ReactivoTDA
Clorurofrrico
Agua
ReactivoIND
Paradimetilaminobenzaldehido
Alcoholisoamlico
HCl37%

3.4g
100ml
5g
75ml
25ml

ReactivoVP1

KOH
Agua

40g
100ml

ReactivoVP2

1naftol
Etanol

6g
100ml

Procedimiento:
1) Prepararunacmaradeincubacinconsutapacorrespondienteyrepartir5mldeaguaenlos
alveolosparaproporcionarunatmsferahmeda.Anotarelnmerodeparejaenellateraldelagalera.
2) Colocarlagaleraenlacmaradeincubacin.
3) Disponer5mldesolucinsalinaestrileneltubo.Tomarmedianteelasadesiembraunacolonia
aisladayhomogeneizarlasuspensinconelagitador.
4) Inoculacindelagalera(verelesquema)
Llenarlostubosperonolascpulas(A)delostestssalvolosindicadosabajo.
Llenareltuboylacpula(B)delostest(CIT),(VP)y(GEL)conlasuspensinanterior.
Llenarlacpuladelostest ADH, LDC, ODC, URE, H2S conaceitedeparafina(C)para
obteneratmsferaanaerobia.
5) Cerrarlacmaradeincubacineincubara3537Cdurante24horas.

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?AA 

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?AA 

11

Lecturadelagalera(Anotadtodoslosdatosobtenidosenelcuaderno!):
1) Leerlosresultadosdelasreaccionesespontneasdeacuerdoconlatabladepositivosynegativos.
Anotadloenelcuaderno.
2) Reveladode(VP):Aadir1gotadereactivoVP1yotradeVP2.Esperar10min.Sisalerojoorosa
espositivo.
3) ReveladoTDA:AadirunagotadereactivoTDA.Laaparicininmediatadeuncolormarrn
oscuroesresultadopositivo.
4) ReveladoIND:Aadirunagotade reactivoINDyesperardos minutos.Unanillorojoindica
reaccinpositiva.
ANTIBIOSIS
Existen diferentes tcnicas para estudiar la actividad de los antibiticos frente a distintos
microorganismos,utilizndoseenclnicapruebasesencialmentecualitativas,aunqueenmuchoscasosse
requierendeterminacionescuantitativas.Enestasprcticasvamosaefectuarensayosdeambostipos.
Laspruebascualitativasoantibiogramasevanaefectuarconlabacteriaproblemamientrasquelas
cuantitativaslasharemosconunabacteriaconocida(E.coli ).Cadaparejadeberpuesinocularelda
anterioraldelensayosubacteriaproblemaE.coliensendostubosdecaldocomn,procurandoevitar
contaminaciones.
Laspruebasquevamosarealizarsebasanenladifusindelantibiticosobreunaplacademedioa
partirdeunpuntocentral.Enestecaso,unacantidadconcretadelantibiticoseencuentraincluidoenun
discodepapelquesedepositasobreunaplacadeagarcomn,quehasidopreviamenteinoculadacon
unafuertedosisdelabacteriaaensayar.As,eldiscodepapelabsorbeaguadelaplaca,sedisuelveel
antibiticoyseiniciaelprocesodedifusindestehacialaszonasquelorodean,generndoseun
gradiente de concentracin cuyo nivel mximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se
inocularon crecern durante su incubacin all donde la concentracin del antibitico sea lo
suficientementebajacomoparanoimpedrselo(normalmentealejadodeldisco),mientrasquenopodrn
hacerloenlasproximidadesdeldiscodondelasconcentracionesdelantibiticosonelevadas.Puestoque
loslmitesdeconcentracindeantibiticoqueafectanalcultivosonporreglageneralmuyestrechos,se
suelen formar halos de inhibicin, esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes
bastantesdefinidosycuyodimetrotienequeverconlaconcentracindeantibiticoquehabaenel
discoyconlasensibilidadastedelasbacteriasensayadas.
Procedimiento:
Antibiograma:Elobjetivoesdeterminaraquantibiticosessensiblelabacteriaproblema.Seutilizarn
discoscomercialesconlosantibiticosydosisqueseespecificanenlatabla.
Antibitico

Abreviatura

Dosis(

g/disco)

EfectoInhibidor
Cloranfenicol
Cefalotina
Tetraciclina
A.Nalidxico
Eritromicina
Estreptomicina

C
CR
TE
NA
E
S

30
30
30
30
15
10

Sntesisdeprotenas
Sntesisdepeptidoglicano
S.deprotenas
Replicacin
S.deprotenas
S.deprotenas
12

Trimetoprim

TMP

SntesisA.flico

Inicialmenteseextiendeconlabolitasdevidriouninculode0,2mldelabacteriaproblemaa
partirdeuncultivodensoenmediolquido(Utilizandolaspipetasautomticascomopotainculos:No
seosocurraflamearlas,quesondeplstico!).Despussevandisponiendolosdiscosdecadaantibitico
sobre la placa (hay que presionar ligeramente) y a distancias equivalentes, empleando unas pinzas
esterilizadasporcalentamientoyenfriadasalaire.Paraextraerlosdiscosdesuscontenedoreshayque
seguirlasinstruccionesdelosmonitores.
Pruebacuantitativa.Setratadedeterminarelgradodesensibilidadoconcentracinmnimainhibitoria
(CMI)deunantibiticofrentealabacteriaensayada.Cadaparejasembrardelaformadescritaun
cspeddeE.coli,ycolocarcincodiscosconcantidadescrecientesdeEstreptomicina.Paraprepararlos
discos, cada pareja preparar 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estril) a partir de una disolucin
valoradaqueledarnlosmonitores,yaadirn10ldecadaunadestasdilucionesasendosdiscosde
papelestriles.Puestoquelosdiscosnoestnmarcados,esimprescindibleindicarsuconcentracin
debajodelaplaca.Siempreresultaconvenientemantenerunordencrecienteenladisposicindelos
discos.
Unavezcolocadoslosdiscosdeambosexperimentos,lasplacasseincubanenposicininvertida
durantetodalanochealatemperaturaptimadecrecimientodelabacteriaqueseestutilizando.Ala
maanasiguientehayquemedireldimetrodeloshalosdeinhibicinyanotarlosenelcuaderno.

Resultados:
Enelcasodelantibiograma,seharuncuadrodesensibilidad(S)oresistencia(R)paracadaunode
los antibiticos frente a esta estirpe, y posteriormente sern utilizados como criterio para la
determinacindelabacteriaproblema.Elcriterioaseguir,internacionalmentereconocido,ser:
Sensible(S)sieldimetrodelhaloesmayorde15mm
Resistente(R)sieldimetrodelhaloesmenorde13mm
Intermedio(R/S)sieldimetrodelhaloestcomprendidoentre13y15mm
Enelcasodelensayocuantitativoserepresentareldimetrodelhalofrenteallogaritmodela
concentracincorrespondiente.Lospuntosobtenidosentoncesseajustarnaunarecta,delaquese
extrapolarlaconcentracinnecesariaparagenerarunhalode15mm,queserconsideradacomola
concentracinmnimainhibitoria(CMI)deesteantibiticofrentealabacteriaensayada.
ACTIVIDADCATALASA
Setratadeunensayomuysimplequeintentadeterminarsilabacteriaproblematienecapacidad
paradegradarelperxidodehidrgeno,unodelosagentesoxidantesproducidoscomoconsecuenciade
determinadasreaccionesmetablicasoxidativaspropiasdelmetabolismoaerobio.Laenzimaencargada
dedegradaresteproductoesdenominadacatalasayapareceencasitodoslosmicroorganismosaerobios
obligadosofacultativos.Existensinembargoorganismosanaerobiosomicroaerfilosquecarecende
dichaactividad,constituyendoestapruebaunimportanteelementotaxonmico.
Elensayoesmuysencillo,puesbastaconaadirunagotadeaguaoxigenadasobreunacoloniadel
cultivoyobservarsidestaseempiezanadesprenderburbujasdeoxgenocomoconsecuenciadela
actividadenzimticadelacatalasa:
13

2H2O2==========>2H2O+O2
ANALISISMICROBIOLOGICODEAGUASCONTAMINADAS
Ladeteccindemicroorganismoscontaminantesenalimentosybebidasconstituyeunaprctica
habitualencualquierlaboratoriodeBromatologa.Paraelloseutilizanmediosselectivos,indicadoresy
generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente slo se
detectaunaciertapartedelapoblacintotal)hastagruposdebacteriasconcretas,deespecialinters
como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos
sufridosporelproductodurantesumanufacturadooalmacenamiento.
Porrazonesprcticas,enesteexperimentoslovamosatratardedistinguirlapresenciaycantidad
decuatroposiblestiposdebacteriascontaminantes:
Escherichiacoli
Samonellatyphimurium
Morganellamorganii
Enterobacteraerogenes.
Elmtodoaseguirconsistirenefectuarunaseriededilucionesdecimalesdelaguacontaminadaen
solucinfisiolgica,siguiendoelesquemaqueserepresentaacontinuacin:

SF

Apartirdeestasdilucioneshayqueinocularlossiguientesmedios:
Pararecuentodebacteriastotalesporml,hayqueextender0.1mldelasdiluciones10 5,104y10
3 sobretresplacasdeagarcomn,eincubarlasa37Cdurantelanocheenposicininvertida.Tras
incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de dilucin
correspondientes.
Determinacindebacteriasfermentadorasdelactosa.Seextiende0.1mldelasdiluciones10 4y
103 sobredosplacasdeagarMacConkey,incubndolasdelaformadescrita.Una vezcrecidas,se
cuentanlascoloniasrojasylasrosceasysemultiplicanambosnmerosporlosfactoresdedilucin.
Unavezefectuadoelrecuento,setomanvariascoloniasrojasy/orosasalazaryseextiendeuninculo
densosobrelasuperficiedeunaplacadeagarEMB,incubandoacontinuacina37Cdurantetodala
noche.Enestemedio,confirmativoparaE.coli,estaespeciedebedarlugaracoloniasnegrasconreflejos
verdesmetalizados,mientrasqueEnterobacterdacoloniasmsrosceasynuncareflejos.Utilizandoeste
criterio,determinarelporcentajedeE.coli,sobreeltotaldecoliformes.
14

DeterminacindeSalmonellayMorganella.Seextienden0.1mldelasdiluciones10 5y104en
placasdeagaralverdebrillante,yseincubana37Cdurante2448horas.SobreestemedioSalmonellay
Morganellageneranmetabolitosalcalinosquehacenquelosalrededoresdelascoloniassevuelvanrosa,
mientrasqueloseminentementefermentadoresnocrecenoviranhaciaelamarillo(unabuenaformade
detectarcoliformes).
Conestosdatos,hayquededucirelnmerodebacterias(porml)deaguacontaminadaquedan
coloniasrosas.ParaconfirmarsisetratadeSalmonellaoMorganella,hayquereinocularlasencaldode
ureaindolyenTSI.Sobrecaldodeurealaestirpede Morganella debegenerarcolorazul,yenTSI
nicamentelaestirpedeSalmonelladebeaparecerconprecipitadosnegros(porproduccindeSH 2que
generasulfurodehierro),apareciendoelrestodeloscaracteressiguientes:

Fondo*

Pendiente

Ennegrecimiento
S.typhimurium
A+G
Alcalino
S
M.morganii
A+G
Alcalino
No
*)AindicaproduccindecidoyGdegas

TRANSFERENCIAGENETICAENTREBACTERIASGRAMNEGATIVAS
I)Conjugacin
Unodelosmecanismosmscomunesdediseminacindegenesenlanaturalezaeslaconjugacin,
unfenmenomedianteelcualunacepaportadoradeunplsmido,denominadoconjugativo,escapazde
transferirunacopiade steaunabacteriareceptoracasisiempredelamismaespecie.Noobstante,
existenlos denominados plsmidosconjugativospromiscuos,estoes capacesde saltarlabarrerade
especiey,enciertoscasos,ladegnero.Estemecanismoeselcausanteprimariodeladifusindegenes
deresistenciaaantibiticosy,portanto,delaprdidadeefectividaddestosobservadadurantelos
ltimosaos.
Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecfica de plsmidos se encuentra la
movilizacindelosgenesderesistenciaaantibiticospromovidaporelementosgenticosdenominados
transposones. Un transposn es un fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localizacin
dentrodelamismamolculadeDNAoentremolculasdistintas(ej:plsmidoacromosomaoalrevs)
yqueenmuchasocasionesesportadordegenesderesistenciaaantibiticos,contribuyendodeesta
formaasudiseminacin.
Objetivos: VamosatransferiruntransposnqueconfiereresistenciaaKanamicinadesdeunacepade
E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium, utilizando plsmidos derivados del conjugativo y
promiscuoRP4.Comomedidasdeseguridad,tantolascepasdonadorasyreceptorascomolosplsmidos
quevamosaemplearsonderivadosinocuosdelasformasnaturalesobtenidosenellaboratorio.

Materialbiolgico:
Plsmido:seutilizarelplsmidopUT(5.2kpb).Esteplsmidocontieneelorigendereplicacinde
R6K,queslofuncionaencepasdeE.coliqueexpresenlaprotenadesdeunbacteriofagolisognico
(pir),yelorigendetransferenciadelplsmidoconjugativoRP4.Elplsmidocontienetambinel
gen de la transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O de
15

recombinacin (transferible mediante la actividad transposasa). Como elemento de seleccin del

plsmido, tambin lleva un gen de resistencia a Ampicilina (una lactamasa, bla). Para que sea
transferido,esteplsmidorequiereotrasfuncionespropiasdeRP4,quesoloseencuentranenlacepaE.
coliS171pir.Elmapaderestriccindelplsmidosepresentaacontinuacin:
|

|

CepasdeE.coli:seemplearnlascepasdeE.coliCC118piryS171pirtransformadasconelplsmido
pUT.SlolacepaS171pirposeelacapacidaddetransferirelplsmidoaotrascepas,puescontieneen
elcromosomagenesdeRP4necesariosparalaconjugacin.LacepaCC118pirserempleadacomo
controlnegativoenlatransferencia.
Cepade Salmonella. Utilizaremoscomoreceptorlacepade S.typhimurium LB5010R2(resistentea
EstreptomicinayaRifampicina).Estacepaposeeotrascaractersticasespeciales:esrestriccinmenos,
permitiendounamayorfrecuenciadetransferencia,ycarecedelaprotena ,porloqueelplsmido
pUTnopuedereplicarseenella.
Materialnobiolgico:
Placasdeagarcomn.
Placasdeseleccin:seemplearagarcomnconRifampicina(80g/ml),yKanamicina(10g/ml).
Solucindelavado.SolucinestrildeClNaal0.9%(p/v).
Solucindeconjugacin:SO4Mg10mM(estril).
Procedimiento:
1) Crecimientodelascepas(loharnlosmonitores):Seemplearncultivosde24horascrecidosen
caldocomnconteniendo,paralasdoscepasde E.coli Ampicilina(100 g/ml) yKanamicina(30
g/ml),yparalacepade Salmonella,Rifampicina(80 g/ml). Unavezcrecidas,lasclulassern
lavadasporcentrifugacinyresuspendidasen1/10delvolumeninicialdeSO 4Mg10mM.
2) Sobreunaplacadeagarcomn,depositardosfiltrosestrilesdenitrocelulosaseparados(actuarn
desoporteslidoparalaconjugacin).MarcadenlasplacasdebajodecadafiltroCC118yS17.Aadir
10ldelasuspensindeSalmonellaencadaunodeellos,dejarqueabsorbaellquidoyaadirsobre
unodelosfiltros10ldelasuspensindeE.coliCC118pir,ysobreelotro10ldeladeS171pir.
Incubartodalanochea37C.
16

3)

Aldasiguiente,tomarcadafiltroconlaspinzas(encondicionesdeesterilidad),introducirloen

sendostubosestriles.Aadir5mldeSO 4Mg10mM,agitarintensamentey extender100 lendos

placasdeseleccin(Rifampicina80,Kanamicina10).Dejarcrecera37Cdurantetodalanoche.
Resultados: Confirmarlaaparicindecoloniasnicamenteenlaconjugacinentre E.coli S17piry
Salmonella.Contarlascolonias.Explicadlosresultadosobtenidosenelcuadernodeprcticas.
II)Transformacin
La transformacin es un proceso a travs del cual el DNA es introducido dentro de un
microorganismo.Enalgunasbacteriaslatransformacinesunprocesonaturaleinduciblequelespermite
laadquisicindemaneraactivadeDNAexgeno.Enotrosmuchoslatransformacinpuedeproducirsede
formaartificialmediantetratamientosqumicosofsicos.Enestaprcticavamosaprocederaintroducir
plsmidosdeclonajeenunacepadeE.colimedianteeltratamientoqumicodestas.
Materiales:
CepadeE.coli

JM83.Setratadeunacepacarentedeactividadgalactosidasa,aunquedisponede
laspermeasasespecficasdelactosa.Enausenciadeplsmidosestacepaessensibleaampicilinaeincapaz
defermentarlalactosa,porloquegeneracoloniasblancasenagarlactosadodeMcConkey.Cuandoesta
cepaestransformadaconunplsmidoqueportaunfragmentodelgendela galactosidasa(fragmento
alfa)laactividadenzimticaesfuncionalyseobtienenbacteriasfermentadorasdelactosa(coloniasrojasen
estemedio).Cuandoelgendelagalactosidasaportadoporelplsmidoesinterrumpidoartificialmente
mediantelaintroduccindeunfragmentodeDNAexgeno,estegendejadefuncionardandolugara
coloniasblancas,unapropiedadmuyutilizadaencomoindicadordeclonaje.
Plsmidos:cadaparejadispondrdeunamezcladelosplsmidospUC119ypUC119X.Setrata
de plsmidos con un origen de replicacin autnoma funcional en E. coli, un gen de resistencia a
ampicilina,yelsistemadeseleccindeclonesconinsertodependientesdelgengalactosidasacomentado
msarriba.EnpUC119estesistemaestintacto,mientrasqueenpUC119Xelgendelagalactosidasaha
sidointerrumpidoporlainsercindeunfragmentodeDNA(X)deotroorganismo.
X

-gal
pUC119
Amp

Amp

pUC119-X

Materialnobiolgico:
SolucionesfrasdeCl2CayCl2Mga100mM
DosplacasdeagarlactosadodeMcConkeycon100g/mldeampicilina(AgarMcdeseleccin)
Caldocomnestril
Procedimiento:
1)Cadaparejadebercentrifugar1,5ml(~untuboEppendorflleno)decultivoexponencialdelabacteria
(5mina5.000rpm)yresuspenderlasconcuidadoyencondicionesdeesterilidaden1mldeCl 2Mgfro(4
C).Trasvolveracentrifugarenlasmismascondiciones,lasclulassernresuspendidasen200 lde
17

Cl2Ca100mM,tambinfro,ydejadasenlaneverahastaeldasiguiente.Duranteestetiemposeproduce
unainduccindecompetenciaartificialenE.colimediadaporlassalesdecalcio.
2)Trasestaincubacin,distribuirlasclulastratadasconelCl2Caendostuboscon100 lcadauno.
Aadir10ldelamezcladeplsmidosaunodeellos,dejandoelotrosinDNA(controlnegativo).Incubar
ambos en hielodurante 20min. Someterlos posteriormente a un choque trmicoa 42C durante 90
segundosexactamenteenunbaodeaguapreviamenteestabilizadoaestatemperatura.Volveraenfriaren
hielo(2minutos),aadir800ldecaldocomneincubarlosenlaestufade37Cdurante30minparaque
seexpreseelgenderesistenciaalantibitico.Trasesetiempo,extender100ldecadatubosobresendas
placasdeagarMcdeseleccineincubarlasa37Cdurante24h
3)Observarlacantidadytipodecoloniasqueaparecensobrecadaunadelasplacas.
III)Transduccin(Verlaprcticadetitulacin)

TITULACIONDEUNVIRUSBACTERIANOyTRANSDUCCION
Titularunasuspensindevirusconsisteendeterminarelnmerodeunidadesinfectivasporml
presenteenlamisma.Enelcasodelosvirusbacterianoslticos,latitulacinserealizaasumiendoque
cadaunidadinfectivaescapazdeproducirunaplacadelisissobreuncspedbacteriano,loqueescierto
parabajasmultiplicidadesdeinfeccin.As,determinandoelnmerodeplacasdelisisproducidasal
infectarcondistintasdilucionesdelasuspensindevirus,podremoscalcularelnmerodeunidades
infectivaspresentesenlamuestraoriginal.
Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresin de un bacterifago lambda
utilizadoeningenieragentica(derivadode RS45) queporta el gendela galactosidasa bajoel
controldeunpotentepromotordetranscripcinconstitutivo,yungenderesistenciaakanamicina,de
formaquepodremosseleccionarydetectarlaintegracinenlaprcticasimultneadetransduccin.
Comomediosparaelcultivoeinfeccinsepuedeutilizardirectamentecaldoyagarcomnalosquese
aadesiempreCl2Mgaunaconcentracinfinalde10mM,alobjetodeevitarladisgregacindelos
componentesdelacpsidadelvirus.Tambinseutilizaragarblando,queseobtieneaadiendo0.6%
(p/v)deagaralcaldocomn(conelCl 2Mgpresente),yquetienecomofuncinelpermitirunadifusin
limitadadelaprogenievricatraslalisisdelabacteria. Paraelensayodetransduccinemplearemos
placasdeagardeMcConkeyconelantibiticokanamicina
Procedimiento:
1)Sepreparauninculodelacepade E.coli ainfectar(ojo!NOeslamismaqueseempleaenla
coleccin)enunmedioquecontiene10mMdeCl2Mgymaltosaal0.2%,ysedejaincubandoa37Cy
conagitacindurantelanocheanterior(Estolohacenlosmonitoresparatodoelgrupo).
2)Sefundenlosmatracesconelagarblando(con10mMdeCl 2Mg)ysemantienenenestadolquidoen
losbaosa50C(Losmonitoreshacenesto).
3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensin de virus
utilizandoelcaldocomnconelmagnesio.

18

4)Disponer0.2mldelcultivodebacteriasyacrecidoencincotubosestriles,yaadiracadauno0.1
mldetresdilucionesconsecutivasdelvirus,siguiendolasindicacionesdelosmonitores.Homogeneizar
suavementeeincubara37Cdurante15minutosconelfindepermitirlaadsorcindelvirusala
superficiedelasbacterias.
5)Aadirtambin0,1mldeladilucin101aotrotubocon0,1mldelabacteriaparalaprcticade
transduccin.Incubarenlaestufacomoenelpunto4.Haceruncontrolparaleloconigualcantidadde
bacterias,perosinvirus.

6) Aadir 34ml del agar blando(a4550C) sobre los tres tubos ms diludos, homogeneizar y
extendersobreplacasdeagarcomnprocurandoquenoquedenburbujas.Dejarquesesolidifiqueeste
agarmanteniendolasplacassobrelamesadurante510minutos.
7)ExtenderdirectamentelostubosparalatransduccinsobreplacasdeseleccindeMcConkeycon
kanamicina,empleandoparaellobolitasdecristalestriles.
8)Incubara37Cenposicininvertidadurantetodalanoche.
9)Aldasiguientecontarlasplacasdelisisquesehanformadoenlasplacasconelagarblando.Puesto
quecadaunadeellascorrespondeaunprocesodeinfeccinporunvirusnico,multiplicandoporlos
factoresdedilucincorrespondientesencadacasosepodrdeterminarelTITULOdelfago,estoes,el
nmerodeunidadesinfectivasporml.
10)EnlasplacasdeMcconkanamicinaobservarsiaparecencoloniasyelcolordestas.Laaparicin
decoloniasrojasindicarqueelfagosehaintegradoenelcromososomaconfirndoaestabacteria
resistenciaalantibiticodeseleccinycapacidaddeutilizacindelactosamediantelaintroduccinde
genesprocedentesdeotrasbacterias(Transduccin).

CRECIMIENTOBACTERIANO
Enestaprctica,realizadaengruposde4personas,seguiremoselcrecimientodeuncultivoesttico
de E.coli yobservaremoselefectoproducidosobre steporalgunosagentesantibacterianosdeuso
habitualenmedicinacomolaAmpicilinaylaEstreptomicina.
Procedimiento:
19

Apartirdeuncultivocrecidoqueosdarnlosmonitores,inocularencondicionesdeesterilidad5
mldesteenunmatrazquecontenga75mldecaldocomnenriquecidocon0.2%(p/v)deglucosa
(aadir 0.75 ml de glucosa al 20% en el matraz en condiciones de esterilidad si no lo hicieron
previamentelosmonitores).Acontinuacin,tomardelamezcla5mlconunapipetaestril,dejarlosen
untubodeensayo(quenotieneporquserestril),eintroducirinmediatamenteelmatrazenelbaode
incubacin(hayqueprocurarquelasbacteriasnoseenfrenalolargodelprocesodecrecimiento),
apuntandolahoraalaquesetomestamuestraqueserconsideradacomotiempo0.
Conlos5mldelamuestrahayqueefectuarmedidasdepHyturbidez.ElpHsemideparavalorar
laproduccindecidocomoconsecuenciadelmetabolismobacteriano,yeselparmetroquehayque
medirenprimerlugar.Despussemidelaturbidezodensidadpticaenuncolormetroaunalongitud
deondade550nm.Estevalorreflejaunparmetroproporcionalalaconcentracindemasacelular
(siguiendo la ley de LambertBeer) hasta un valor de 0.5, a partir del cual se pierde esta
proporcionalidad.Porestarazn,cuandoalmedirobtengamosunvalorsuperiora0.5seprocederala
dilucin(1mldecultivo+4mldecaldo)conmediodecultivo,deformaqueelvalorqueseobtenga,
multiplicadoporelfactordedilucin(5x),mantengalaproporcionalidadconlaconcentracindela
masabacteriana.
Apartirdeltiempoconsideradocomo0seseguirntomandomuestrasde5mlcada45mlenlas
quesemedirelpHylaturbidezparareflejarloconposterioridadenunagrfica.
Cuando los cultivos alcancen una DO de 0.40.5, las parejas CD de las mesas aadirn las
concentracionesdeantibiticosqueseindican,continuandolaincubacinylatomademuestrascada45
min.
Mesa1
Mesa2
Mesa3
Mesa4

100(g/ml)de
100(g/ml)de
100(g/ml)de
100(g/ml)de

Ampicilina
Estreptomicina
Ampicilina+Estreptomicina
Estreptomicina

20

Resultados:
LosresultadosdeDOdecadaunodelosexperimentosseirnapuntandoenlapizarraparaque
seanacontinuacinrepresentadossobrepapelsemilogartmico(enste,laescalalogartmicatransforma
directamentelosvaloresobtenidosenlasposicionesdesuslogaritmoscorrespondientes),deformaque
enelcuadernillofinalaparezcanunagrficadelcultivonotratadoyotrastresdelostratadosconlos
antibiticos.Deestasgrficassepodrobservar:1)Fasesexponencialyentradaenestacionaria(lafase
delatencianoseveenestemedioycondiciones,ylademuertetardamuchoenllegar);2)Tiempode
generacin,calculableapartirdelapendientedelagrficaensufaseexponencial.;3)Efectosdelos
antibiticos,lticoparaAmpicilinaynolticoparaEstreptomicina.

AISLAMIENTODEBACTERIASLCTICASYPRODUCCINDEYOGUR
Las bacteriaslcticasestnimplicadas enuna granvariedaddeprocesos de transformacinde
alimentos.Enestaprcticavamosaaislarbacteriasdeyogurylasvamosaemplearparainocularleche
ycomprobarsucapacidadfermentativa.
Materiales: Cadaparejaseencargardetraerunyogurnaturalcomofuentedelactobacilos.Parael
aislamiento,emplearemoselmedioMRS(Man,RogosaySharpe).Setratadedeunmedionaturalmuy
ricoquecontienepolisorbato,acetato,magnesioymanganesoqueactancomofactoresdecrecimiento
paramuchoslactobacilos.Elcrecimientoseefectuarenmediosmicroaerfilosempleandojarraspara
elcultivodeorganismosanaerbicosyunsistemacomercialparalaeliminacindeloxgeno.Parala
produccindeyogurseemplearlecheestril(UHT)ytubosdeplsticode5ml.

Procedimiento:
1)Tomar50 ldelsuerodeyogurconunapipetaestril(puntasamarillas) ydiluirlosen1mlde
solucinsalina.Hacerunaovariasdiluciones1/10ensolucinsalinasegnindiquenlosmonitores,y
extender50ldelamsdiludasobreunaplacadeagarMRS(quenoestmuyseca)empleandobolitas
esttiles.Incubarbocaabajoencondicionesdemicroaerofiliadurante48horasa37C.
2)Observarsilascoloniascrecidassobrelaplacasonhomogneasycalcularsunmeroaproximado.
Utilizarvariascoloniasparainocularconelasadesiembrauntuboconteniendo5mldelecheestril
(UHT).Mantenerelsegundotubosininocular.Incubarambostubosa37Chastaeldasiguiente.
3)Observarelgradodegelificacindeltuboinoculadoycompararloconelnoinoculado.Abrireltubo
yprocedercomoenelpaso1paraobtenerunasuspensindelcontenidodelyogur.Hacerunfrotisy
unatincinsimpleparaobservarlosorganismosquehancrecido.

21