BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Tujuan Operasional Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menghitung jumlah presentase
Eritrosit dan kadar Haemoglobin dari tikus putih (Rattus norvegicus L.)
jantan, setelah diberi ekstrakKacang Kedelai(Glycine max L.)
B. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-September tahun 2015.
Di Green House Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka, Jl. Tanah
Merdeka, Pasar Rebo, Jakarta Timur
C. Metode dan Desain Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode
eksperimental. Rancangan penelitian berupa Rancangan Acak Lengkap
(RAL) dengan 4 perlakuan dan 6 ulangan, yang diperoleh berdasarkan
rumus Federer, yaitu : (t-1) (n-1) 15, dimana t adalah jumlah kelompok
perlakuan, dan n adalah jumlah ulangan (hewan percobaan setiap
kelompok perlakuan).
Menurut perhitungan dengan menggunakan rumus Federer
didapatkan banyak ulangan (n) adalah 6 kali ulangan, berarti setiap
kelompok perlakuan terdiri dari 6 ekor tikus. Dengan adanya 4 perlakuan
maka diperlukan 24 ekor tikus jantan. Tikus dipilih sebagai objek

22

23

penelitian karena memiliki kesamaan metabolik, organ dan fisiologi

sistematik serta gen yang mirip dengan manusia.
D. Populasi dan Sampel
Populasi penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus L.)
jantan galur Sprague dawley yang diperoleh dari Laboratorium Kedokteran
Hewan IPB.Sampel penelitan sebanyak 24 ekor yang dipilih secara acak
yang dibagi dalam 4 kelompok. Kriteria tikus yang digunakan adalah :
1. Tikus putih jantan galur Sprague Dawley sehat (bergerak aktif)
2. Berumur 2,5-3 bulan
3. Memiliki berat badan 150-200 gram
4. Tikus yang belum mendapat perlakuan
E. Variabel Penelitian
Variabel bebas penelitian ini adalah pemberian ekstrak Kacang
Kedelai (Glycine max L.)dengan dosis berbeda
Variabel terikat penelitian ini adalah jumlah eritrosit dan kadar
haemoglobin (Hb) tikus putih (Rattus norvegicus L.)
F. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat Penelitian
a. Kandang Hewan
Kandang hewan penelitian kali ini yaitu tikus dengan ukran (60 x 30 x
30 cm) yang terbuat dari plastik dan penutupnya berupa anyaman kawat.
Pada alas kandang diberi sekam parut kayu. Kandang tersebut dilengkapi
dengan botol minuman dan makan.

24

b. Alat Laboratorium
Pipet, jarum sonde lambung/gavage, mikroskop listrik, timbangan
untuk menimbang tikus, satu set haemometer Sahli, Hand tally
counter, dan hemometer
2. Bahan Penelitian
a. Bahan Uji
Bahan yang digunakan adalah Kacang kedelai (Glycine max L.)
yang dibeli dipasar tradisional
b. Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih
(Rattus norvegicus L.) jantan galur Sprague-Dawley. Hewan uji yang
digunakan sebanyak 24 ekor tikus putih jantan dengan berat badang sama
yang dipilih secara acak.
c. Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan adalah Anilin, HCl 0,1 N, larutan
Hayem untuk menghitung jumlah eritrosit, aquades, dan alkohol 70%
d. Makanan dan minuman hewan uji
Makanan yang digunakan adalah pellet ayampetelur dan diberikan
minum yang berasal dari air isi ulang secara ad libitum
e. Sekam kayu yang digunakan sebagai dasar dari kandang hewan uji

25

G. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Ekstrak Kacang Kedelai (Glycine max L.)
Untuk menghasilkan ekstrak dari Kacang kedelai(Glycine max
L.)dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi adalah proses ekstrasi
simplisia yang paling sederhana, menggunakan pelarut yang cocok dengan
beberapa kali pengadukan pada temperatur ruangan (kamar) (Ditjen POM,
2000). Pembuatan dengan metode ini dimaksudkan agar bahan aktif yang
terkandung di dalamnya sedapat mungkin tidak berubah dari material awal
dan menjamin pemeliharaan jangka panjang dari kandungan bahan selama
proses penyimpanan. Proses pembuatan ekstrak Kacang Kedelai (Glycine
max L.) dalam penelitian ini menggunakan etanol 69% sebagai pelarut.
Beberapa tahapan bembuatan ekstrak kacang kedelai yaitu : kacang
kedelai yang di beli dipasar tradisional dicuci dengan air,setelah dicuci
kacang merah dimasukkan ke dalam oven hingga kering, lalu digiling
hingga berbentuk serbukhalus kemudian di tambahkan larutan etanol
dengan kadar 69% yang dilanjutkan maserasi selama 24 jam. Setelah itu
masuk tahap filtrasi yang akan diperoleh filtrat dan residu. Filtrat yang
didapatkan akan diteruskan ke tahap evaporasi dengan Rotary evaporator
pada suhu 70% untuk memperoleh larutan pekat.
2. Pemilihan tikus putih (Rattus norvegicus L.)
Tikus ditempatkan di dalam kandang kelompok perlakuan yang
dilengkapi dengan tempat makan dan minum. Tikus diadaptasi selama
seminggu agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Tikus

26

yang nampak sakit (aktifitas kurang, bulu-bulu banyak yang berdiri, dan
lebih banyak diam) tidak diikutsertakan dalam penelitian.
3. Pembuatan Dosis Anilin
a. Menyiapkan Anilin yang sudah dibeli di toko kimia
b. Menyiapkan aquades sebagai pelarut anilin
c. Menyiapkan panci untuk memanaskan anilin yang dicampur dengan
aquades.
d. Panaskan aquabides sebanyak 9 ml kedalam panci pdan panas kan
hingga mendidih.
e. Ambil anilin meggunakan spuit (alat suntik) sebesar 1 ml, dan
masukkan kedalam paquades yang telah dipanaskan. Aduk hingga
anilin menyatu dengan aquades
f. Disuntikkan pada vena ekor tikus yang sebelumnya telah dibersihkan
dengan alkohol dengan dosis 0,05 ml/ kg bb tikus putih
4. Penghitungan Dosis Kacang Kedelai
Penentuan dosis Kacang Kedelai dalam penelitian ini berdasarkan
konversi dosis maksimal yang digunakan oleh manusia ke tikus. Sample
perlakuan pada masing-masing kelompok sebagai berikut :

Kelompok I : 6 ekor tikus diberikan aquades sebanyak 1,5 ml sebagai

kelompok kontrol, diberikan secara oral sebanyak satu kali

Kelompok II : 6 ekor tikus diberikan ekstrak kacang kedelai dengan

dosis 200 mg/kg bb, diberikan secara oral sebanyak satu kali

27

Kelompok III : 6 ekor tikus diberikan ekstrak kacang kedelai dengan

dosis 225 mg/kg bb, diberikan secara oral sebanyak satu kali

Kelompok IV : 6 ekor tikus diberikan ekstrak kacang kedelai dengan

dosis 250 mg/kg bb, diberikan secara oral sebanyak satu kali

5. Pengambilan sample darah

Cara kerja pengukuran eritrosit adlah sebagai berikut :
a. Darah dari ekor tikus dikeluarkan secara perlahan-lahan dengan
menekan pangkal ekor, kemudian diurut sampai ke ujung ekor
b. Darah dihisap dengan pipet thoma sampai angka 0,5 atau 0,1
c. Larutan pengencer hayem dihisap dengan pipet thoma sampai angka
101.
d. Kedua ujung pipet ditutup menggunakan ibu jari dan jari tengah,
pengocokan dilakukan dengan cara bolak-balik
e. 1-2 tetes cairan dalam pipet thoma dikeluarkan dari tabung, kemudian
pada tetesan selanjutnya ujung pipet mikro ditempelkan pada salah
satu sisi bilik hitung yang yang telah diberi gelas penutup dan kertas
tissue pada sisi lainnya.
f. Cairan dalam pipet thoma akan mengalir memenuhi bilik hitung dan
selanjutnya bilik hitung diletakkan dalam mikroskop.
g. Eritrosit yang ada di dalam 5 bilik hitung R dihitung . perhitungan
dimulai dari sebelah kiri secara zigzag. Untuk menghindari
perhitungan yang kurang tepat, eritrosit yang ada digaris batas sebelah
kiri dan atas satu bilik kecil dhitung sebagai eritrosit yang ada dalam

28

bilik kecil tersebut. Pengambilan sampel darah dilakukan selama 7

hari.
6. Penentuan Hemoglobin

Pengukuran kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan

metode Sahli. Penggunaan metode ini adalah membandingkan warna
sample darah dengan warna merah standar yang telah disediakan. Cara
kerja pengukuran kadar hemoglobin dengan metode Sahli adalah sebagai
berikut:
a. Memasukkan kurang lebih setetes asam klorida atau HCl 0,1 N
kedalam tabung pengencer hemometer sampai tanda 2
b. Menghisap darah yang telah diambil dengan spuit sampai garis
0,5 tepat
c. Menghapus kelebihan darah yang masih menempel pada bagian
luat pipet menggunakan tissue
d. Selanjutnya memasukkan darah kedalam pipet

dasar tabung

pengencer (hati-hati jangan sampai terjadi gelembung udara)

e. Mencampurkan isi tabung tadi supaya darah dan HCl bersenyawa
f. Lalu tambahkan tetes demi tetes aquadest sambil aduk dengan
batang pengaduk hingga warna sama dengan warna standar pada
aalat hemoglobinometer
g. Kemudian baca kadar hemoglobin ang tertera pada tabung
pengencer tersebut.

29

7. Teknik Pengumpulan Data

Pada

penelitian

ini

pengumpulan

data

dilakukan

dengan

menghitung data jumlah eritrosit dengan hemositometer dan kadar

haemoglobin sampel darah tikus putih setelah diberi perlakuan selama 1
hari dan pengambilan sampel darah selama 7 hari berturut-turut.
8. Hipotesis
Ho : Tidak ada pengaruh pemberian perlakuan ekstrak kacang
kedelaidengan berbagai dosis pada jumlah eritosit dan kadar hemoglobin
darah tikus
Hi : Terdapat pengaruh pemberian ektrak kacang kedelai dengan
berbagai dosis pada peningkatan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin
tikus putih
9. Analisis Data
Hasil penelitian peningkatan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin
berupa data yang dianalisi secara statistika dengan analisis of variance
(ANOVA) dua faktor yang dilanjutkan dengan tingkat perbedaan 5%
menggunakan software SPSS Release for windows versi 21.

30