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Labo de Microbiologie-2012

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Labo de Microbiologie-2012

Horaire ............................................................................................................................................ 5
BARÈME ........................................................................................................................................ 6
LABO NO 1 ..................................................................................................................................... 7
DILUTIONS ET CONCENTRATIONS ........................................................................................ 7
POURCENTAGE ..................................................................................................................... 7
POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME ............................................................................. 8
MOLARITÉ.............................................................................................................................. 9
POIDS/VOLUME .................................................................................................................... 9
LES DILUTIONS EN SÉRIE: PRÉPARATION POUR LE LABO No2 .............................. 12
PRÉPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS .............................................. 12
LABO NO 2 ................................................................................................................................... 14
INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE .......................... 14
MILIEUX MICROBIOLOGIQUES ...................................................................................... 14
LA TECHNIQUE ASEPTIQUE ............................................................................................ 15
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) ......................... 15
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES ....... 17
TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR ÉCHANTILLONNER
L’ENVIRONNEMENT .......................................................................................................... 19
LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE ................................... 19
METTRE DES BACTÉRIES SUR GÉLOSE : ÉTALEMENT ............................................. 19
ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMÉDIATION .......................................... 21
VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE ..................... 22
DÉNOMBRER LES BACTÉRIES ........................................................................................ 23
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) ...... 23
MORPHOLOGIES CELLULAIRES ..................................................................................... 25
LABO NO 3 ................................................................................................................................... 26
DÉNOMBRER LES BACTÉRIES .............................................................................................. 26
COMPTES VIABLES ............................................................................................................ 26
LES COMPTES LES PLUS PROBABLES ........................................................................... 27
COMPTES DIRECTS ............................................................................................................ 28
COMPTE LES PLUS PROBABLES ..................................................................................... 30
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM ............................... 34
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE............ 36
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES .......................... 37
LABO NO 4 ................................................................................................................................... 39
LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTÉRIES DU SOL ......................................... 39
BACTÉRIES DU SOL ........................................................................................................... 40
LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST ............................................................................ 41
COMPTE DE BACTÉRIES AÉROBIES HÉTÉROTROPHES ............................................ 41
COMPTE DE BACTÉRIES ANAÉROBIES HÉTÉROTROPHES ...................................... 41
COMPTE DE BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET POSITIVES .................................... 42
CYCLE DE L'AZOTE............................................................................................................ 43
BACTÉRIES QUI FIXENT L'AZOTE .................................................................................. 44
BACTÉRIES NITRIFIANTES .............................................................................................. 44
L'ASSIMILATION DU CARBONE ...................................................................................... 45
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Labo de Microbiologie-2012
BACTÉRIES QUI DÉGRADENT L'AMIDON .................................................................... 45
BACTÉRIES QUI DÉGRADENT LA GÉLATINE .............................................................. 46
ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS ............................................ 49
LABO No 5 ................................................................................................................................... 51
DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM POSITIVES ........................................... 51
IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS ....................................................... 51
MORPHOLOGIE COLONIALE ........................................................................................... 51
COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 51
MÉTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES .............................................. 52
FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU
D'ACÉTOINE ......................................................................................................................... 53
URÉASE ................................................................................................................................. 53
L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE ................................ 54
UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES
EXOCELLULAIRES ............................................................................................................. 54
RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE ................................................................... 54
TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS .................................... 55
CYTOCHROME OXYDASE ................................................................................................ 56
LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE .......................................................................................... 56
CATALASE ........................................................................................................................... 57
IDENTIFICATION
DES
COCCI
GRAM
POSITIFS;
FAMILLES
DES
MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE .................................................. 58
Les Micrococcaceae ............................................................................................................... 58
Les Streptococcaceae ............................................................................................................. 58
DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NÉGATIF ................................ 59
HÉMOLYSE SANGUINE ..................................................................................................... 59
BILE-ESCULINE ................................................................................................................... 60
SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE ............................................. 60
DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE .......................................................................... 61
GÉLOSES DE MANNITOL + SELS .................................................................................... 61
AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER ................................................ 61
SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE ................................................................................. 61
COAGULASE ........................................................................................................................ 67
TEST DE COAGULASE SUR LAME .................................................................................. 67
LABO NO6 .................................................................................................................................... 69
CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE .............................................................. 69
COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS - ANTIBIOTIQUES ...................................................... 69
ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER ...................................................................... 69
DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE ..................................................... 70
DÉSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES ............................................................................ 72
L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS ........................................................................... 72
DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE ..................................................... 75
L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS ........................................................................... 76
CINÉTIQUE DE MORTALITÉ ............................................................................................ 76
LABO NO 7 ................................................................................................................................... 78
MICROBIOLOGIE DE L’EAU ET DES ALIMENTS................................................................ 78
3

............................... 92 URÉASE ................ 108 COMPTE DE GLOBULES ROUGES .. 104 SÉROLOGIE MICROBIENNE ................................................................................ 112 4 ................................................................................................... 92 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) ............ 83 SALMONELLOSE ..................................................Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU ......................... 78 MICROORGANISMES INDICATEURS D’UNE CONTAMINATION FÉCALE ................................................................... 108 L'HÉMATOCRITE ...................................................................................................... 92 COLORATION DE GRAM .............................................................................. 81 TEST DES ENTÉROCOQUES ..................................................................................................................................................................................... 95 LABO NO 9 ................................... 87 ESSAI DE SALMONELLA CONFIRMÉ ...................................................................... 104 HÉMATOLOGIE/ SÉROLOGIE ........................................................................................................................................................................................................................................................................... 91 Les Nesseriaceae ......................... 88 STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU ....................................... 91 Les Enterobacteriaceae .............................................. D’INDOLE ET LA MOTILITÉ ......................................... 92 L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE ........ 92 CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY ...................................... 79 TEST DE COLIFORME PRÉSOMPTIF ...................... 91 DIAGNOSTIQUE D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS .......................................................................................................................... 94 PRODUCTION DE H2S .................... 88 COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS ..... 92 OXYDASE ........... 110 VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) ........... 89 LABO NO8 ............................................. 91 Les Pseudomonaceae ........ 82 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS ............................................................ 87 STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU EN ONTARIO .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 94 PRODUCTION D'INDOLE SUITE À LA DÉGRADATION DU TRYPTOPHANE ... 104 ELISA ......................................................... 85 TEST DE COLIFORME CONFIRMÉ...................................................................................................................... 94 LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE ....................................................................................................................................................................... 91 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ........................................... 81 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES FECAUX .................................................................................................................................................................................. 111 LES LEUCOCYTES ................................................................................................... 79 ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE L’EAU POUR DES COLIFORMES ............................................................................... 94 API 20E SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE .. 104 L'HÉMATOLOGIE ............. 94 MOTILITÉ ............................................................................................... 83 BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES .............................................................................................................................................................................................................................................................. 93 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE................................... 78 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES ..............................

11 oct. 30 oct. 1 dec. . 13 et 15 nov. 6 et 8 nov. 25 et 27 sept. et 1 nov. 20 et 22 nov. 18 et 20 sept. 2 et 4 oct.Labo de Microbiologie-2012 Horaire Labo 1 Labo 2 Labo 3 Labo 4 Labo 5 Labo 6 Labo 7 Labo 8 Labo 9 Dilutions et concentrations Introduction au travail dans le labo de microbiologie Compter les bactéries Les milieux de croissance et les bactéries du sol EXAMEN DE MI-SESSION Diagnostic bactérien – Bactéries Gram positives SEMAINE D’ÉTUDE Contrôle de la croissance microbienne Microbiologie de l’eau et des aliments Diagnostic bactérien – Bactéries Gram négatives Hématologie/Sérologie EXAMEN PRATIQUE EXAMEN FINAL 5 11 et 13 sept. 21 au 27 oct. 16 et 18 oct. 29 nov.

Labo de Microbiologie-2012 BARÈME Quiz Devoirs Examen de mi-session Examen pratique Examen final 5 20 30 15 30 6 .

la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une solution. Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les deux. Une autre façon est le pourcentage par poids. une autre façon est un hybride appelé le pourcentage par poids/volume. Alternativement. que vous connaissez. Ceci veut dire que 100 ml de solution contient 70 mL d’alcool isopropyl. Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution. le pourcentage du poids/volume. Une variété de différentes façons existent pour calculer et exprimer les concentrations des solutions. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou 1000 ml) de cette solution contient 700 mL d’alcool isopropyl et assez d’eau pour compléter le volume à un total de 1 litre ou 1000 ml. ou les deux. Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en mélangeant deux liquides. Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment concentrée est une solution. la concentration est une propriété variable. plusieurs types de concentrations seront présentés. sans doute. Par exemple. En général. Pour travailler avec des concentrations. Une façon. Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes qui doivent être présentes dans la solution. Pourcentage par volume = volume du soluté volume de solution 7 x 100 . vous devez comprendre la distinction entre le soluté. Elles incluent le pourcentage par volume. Enfin.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 1 DILUTIONS ET CONCENTRATIONS Jour 1 Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration. le solvant et la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une solution préexistante. on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les composés chimiques réagissent entre eux (moles). POURCENTAGE L’utilisation des pourcentages est une façon commune d’exprimer la concentration d’une solution. Dans les pages qui suivent. d’exprimer les concentrations est le pourcentage par volume. l’alcool à friction est habituellement 70% par volume d’alcool isopropyl. le pourcentage par poids. la molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume. Les pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100.

Elle contient 5 g de NaCl pour chaque 100 ml de solution. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). et ensuite ajouter 88 grammes d’eau. Pour préparer une telle solution. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes. Pourcentage par volume = Poids du soluté (en g) Volume de solution (en mL) x 100 Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en pourcentages. Puisque les masses sont conservées. 12 g NaCl afin que la masse totale de la solution soit de = 12% NaCl solution (12 g NaCl + 88 g eau) 100 grammes. Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution. vous devez diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage. 8 . Pourcentage par poids = Poids du Poids de la solution soluté x 100 À titre d’exemple.Labo de Microbiologie-2012 Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le poids du soluté/poids de la solution. vous pourriez peser 12 grammes de NaCl. mais mesure la quantité de la solution en millilitres. considérons une solution 12 g NaCl 12 % NaCl solution = de 12% NaCl par poids. Une telle solution 100 g solution aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100 grammes de solution. POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le pourcentage masse/volume. les masses des composantes de la solution s’additionneront à la masse totale de la solution.

qui stipule que la concentration d’une solution est 0. La concentration. Gram/Litre Molécules/Litre Moles/Litre Nombre d'organismes/Litre Etc. le facteur de dilution. et la dilution. soit chimiques ou vivants.1 mole. si vous désirez réduire la concentration de matières grasses dans du lait de 3. par 1 ml ou 1 µL ou 1L. Plutôt d’écrire moles par litre. Les Molarité = litre de solution unités sont donc moles par litre. une solution qui est à une concentration de 1mg/ml contient 1mg de soluté dans 1 ml de solution. Essentiellement. cela ne veut pas dire que c’est 0. vous devrez effectuer une dilution de facteur 10. La concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution. plus précisément. l’abréviation ―M‖ est utilisée pour ces unités. Vous devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. Par exemple. 9 . Les dilutions servent à réduire de façon précise la concentration d'éléments. ceci veut dire qu’elle possède 0. la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. La molarité c’est le nombre de moles de soluté moles de soluté dissout dans un litre de solution. c’est les moles de soluté par litre de solution. ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. etc.1 M. quand vous voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). les concentrations sont exprimées comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final.Labo de Microbiologie-2012 MOLARITÉ Une autre façon d’exprimer une concentration s’appelle la molarité. POIDS/VOLUME Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Ex.35%. Par exemple. La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. "Moles" est une mesure de la quantité que vous avez d’une composante. Plus communément. Alors quand un problème vous est donné. Contrairement au pourcentage.5% à 0. ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une quantité donnée de la solution. se retrouvant en solution.1 mole pour chaque litre de solution. "molarité" mesure la concentration de la composante. La formulation des dilutions est essentielle dans tous les domaines des sciences ainsi que dans la vie de tous les jours. Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons. Alors. Par exemple.

Voici quelques directives générales : Choisir la pipette dont la capacité se rapproche le plus du volume désirez. Changer de pipette pour chaque solution différente. Afin de correctement préparer des dilutions. le facteur de dilution. Par exemple. Par exemple. si une solution contient 30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à 0. Minimiser le nombre de pipetages afin de minimiser les chances de faire des erreurs.0 ml plutôt qu’une de 10ml. Pipetter le volume désiré de cette éprouvette (« A ») puis livré dans la prochaine éprouvette (« B »). Par exemple. Le facteur de dilution = Concentration initiale Concentration finale La dilution représente la fraction du composé étant examiné. dans le problème précédent. La dilution est exprimée comme une fraction de 1 sur le facteur de dilution. Par exemple. .3 Gramme/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100. pour faire la mesure de 0. il n’est pas nécessaire d’utiliser plusieurs pipettes. Rincer la pipette de haut en bas plusieurs fois (dans « A » dans l’image ci-dessous). une dilution de 1/100 a été effectuée. Utiliser les directives suivantes afin de minimiser le nombre de pipettes utilisées : Source Passer d’une concentration plus élevée à une solution de concentration plus faible : Pipeter le volume désiré de la source puis livrer à la nouvelle éprouvette (« A » dans l’image ci-dessous). si vous désirez distribuer 1 ml dans dix éprouvettes il est préférable de pipetter 10ml une fois et de distribuer 1 ml dix fois plutôt que de pipetter 1 ml dix fois et de distribuer 10 fois. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution.1ml il est préférable d’utiliser une pipette de 1. vous devez apprendre à utiliser les pipettes de façon appropriée. Répéter cette procédure de « A » à « B » avec la même pipette.Labo de Microbiologie-2012 Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale. A B C 10 Livrer puis rincer la pipette dans cette éprouvette avant de faire la prise du volume désiré de cette nouvelle solution. Faire des transferts en série : quand vous faites des transferts en série telle que pour les dilutions en série.

à-d. Par exemple. Calcul des dilutions en série Les dilutions sont essentiellement des fractions et suivent donc les mêmes principes arithmétiques. vous pouvez utiliser la formule suivante pour déterminer quel volume de la solution mère de diluer : Concentration que vous voulez Concentration que vous avez X Le volume final désiré = Le volume de la solution mère à ajouter au mélange Les dilutions en séries sont toutes simplement des dilutions séquentielles où la solution mère utilisée pour chaque dilution représente la dilution précédente. Ce que ceci signifie est que 1/4 = 12. Pour ce faire. la dilution (ou la fraction) indique quelle fraction du total est représentée par le composé étant dilué. la fraction est donc 1/4. Aucun équilibrage ou de rinçage n’est requis dans ce cas-ci. Si vous connaissez la concentration finale que vous désirez. Utiliser tout simplement la même pipette pour le transfert du volume voulu d’une solution de concentration moindre à une solution de concentration plus élevée.5. qu’un quart du volume total doit être représenté par la chose étant dilué. deux fractions qui sont égales. 11 .Labo de Microbiologie-2012 Passer d’une concentration moindre à une solution de concentration plus élevée : dans ce cas-ci le pipetage et plus facile. Vous désirez diluer une solution par un facteur de 4. finale = Dil. Donc. 1/4 du 50 doit être le composé étant dilué. La dilution finale pour la série est le produit de chacune des dilutions individuelles.5/50.5 ml) de solvant. Ceci étant dit. Ex. Donc pour préparez cette dilution vous ajouteriez 12.5 ml de la solution à être dilué dans (50 ml -12. c. Dil. 3 etc. Puisque je désire un volume final de 50ml. 2 X Dil.1 X Dil. La fraction désirez est donc 1/4 où le dénominateur représente le total. donc 12. quel est le facteur de dilution désiré et quelle est la concentration finale que je désire (si celle-ci est connue). par exemple 2/4 et 4/8 représentent les mêmes dilutions et facteurs de dilutions.5 ml = 37. je désire avoir un volume final de 50 ml et un facteur de dilution de 4X. Préparation des dilutions : Les choses que vous devez déterminer avant de préparer une dilution sont quel est le volume total final que je désire.

Rédiger une méthode sur la façon dont celles-ci doivent être préparées. Finale 2g/L 4mM 2. Ajouter après la stérilisation 12 .1% FeSO4 + 0.5% (m/v)* - Quantité Compléter à 200 ml Milieu de fixation d’azote Ingrédient Conc. vous diluerez des échantillons d'eau pour déterminer le nombre de bactéries.5M CaCO3* Eau * Ajouter après la stérilisation Conc. stock Ammonium Sulfate MgSO4 20% (m/v) NaCl 20% (m/v) K2HPO4 0. Celles-ci doivent représenter des dilutions de 10X. Votre matériel initial sera de l'eau d'un cours d'eau navigable que vous devrez diluer par 105X.002g/ml K2HPO4 7mM CaCO3 0.5% (m/v) Microéléments 1X Eau 1L Milieu d’essai de fixation d’azote Glucose 1% (m/v) CaCl2 5mg/ml K2HPO4 7mM MgSO4 4mM Microéléments 1X Eau 1L Compléter et soumettre le tableau suivant Milieu d’ammonium Ingrédient Conc. RECETTES Milieu d’ammonium Ammonium sulfate 2. Utilisez des schémas et des instructions détaillées qui pourront être suivis par tout étudiant.0mg/ml 7mM 0.0g MgSO4 4mM NaCl 0.05% Na2MoO4). Matériaux Éprouvettes stériles Eau stérile Échantillon d’eau PRÉPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS Pour vous familiariser avec la formulation de divers milieux de croissance. Finale Quantité Glucose 1% (m/v) CaCl2 10% (m/v) 5mg/ml K2HPO4 10% (m/v) 7mM MgSO4 1M 4mM Microéléments* 100X 1X Eau Compléter à 200 ml *Microéléments: 100 X (0. vous devrez préparer différents milieux de croissance qui seront utilisez pour certaines expériences au labo no4.Labo de Microbiologie-2012 LES DILUTIONS EN SÉRIE: PRÉPARATION POUR LE LABO No2 La semaine prochaine. stock Conc.

Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 Compléter et soumettre pour la fin de cette période de laboratoire la partie I du premier devoir. 13 .

à moins qu'un très grand nombre de cellules (de l'ordre de plusieurs millions) ne soient présentes dans un petit secteur. les microorganismes sont très petits. Des milieux de culture semi-solides et solides sont obtenus en ajoutant au milieu de croissances liquides des agents de solidification. Par conséquent.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 2 INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE Jour 1 Plusieurs faits doivent être considérés avant de se lancer dans l’étude des microorganismes.) sont extrêmement diverses. synthétiques ou non. il serait impensable d’examiner l'effet d'un antibiotique nouvellement développé sur la croissance d'un pathogène bactérien chez l’être humain. Ainsi. De plus. les conditions optimales requises pour la croissance d'une espèce microbienne donnée (par exemple les exigences d'alimentation. sont contrôlées par des équipements spéciaux. En outre. des méthodes ont été établies pour croitre les bactéries en laboratoire en utilisant une variété de milieux de croissances. Par exemple. les microorganismes ne peuvent pas être observés à l’œil nu. L’Agar possède plusieurs propriétés avantageuses : 1) il est facilement liquéfiable par un chauffage à 100°C dans une solution aqueuse. etc. le bout de vos doigts est probablement recouvert d’au moins dix différentes espèces microbiennes à des niveaux relativement bas (de l'ordre de quelques centaines à quelques milliers). 14 . Tous les milieux de culture doivent inclure les substances nutritives nécessaires pour la croissance et la survie bactérienne. MILIEUX MICROBIOLOGIQUES Il est habituellement peu pratique d'étudier un microorganisme dans son environnement naturel. Un autre agent de solidification est la gélatine. Les milieux solides peuvent être soit sous la forme de géloses ou de pentes. D'autres conditions. Son utilisation est moins commune puisque plusieurs espèces bactériennes la digèrent. comme la température et la présence ou l'absence d'oxygène. mais en outre plusieurs espèces cohabitent habituellement au même endroit. l'effet sur l’espèce bactérienne visée serait difficile à interpréter compte tenu de l'hétérogénéité des populations bactériennes présentes. comme un incubateur à température contrôlée. un polysaccharide dérivé d’une algue. L'agent de solidification le plus commun est l’Agar. 3) il se solidifie à des températures en dessous de 45°C et enfin. Dans leurs milieux naturels. L'utilisation de conditions appropriées permet au microbiologiste de croitre et de maintenir les espèces bactériennes à l'étude. non seulement le nombre de microorganismes est-il relativement bas. Par exemple. les microbiologistes ont développé plusieurs stratégies aptes à permettre l'étude des microorganismes. semi-solide ou solide. En tenant compte de ces caractéristiques. Les milieux de croissances sont disponibles sous forme liquide. 4) la plupart des bactéries ne le digèrent pas. de température. 2) sa forme liquide est maintenue à des températures aussi basses que 45°C. Premièrement. de pH. Les milieux de culture liquides sont souvent appelés "bouillons de culture".

Ne pas confondre cet instrument avec l’aiguille d’inoculation qui possède une extrémité droite plutôt qu’une boucle. des pipettes et de l’étaleur de verre. Permettre à la boucle de refroidir pour une minute avant de l’utiliser. 2. Matériaux Gélose d’E. L’utilisation de la flamme d’un bruleur Bunsen est centrale à l’exécution de cette technique. Une fois refroidie.Labo de Microbiologie-2012 LA TECHNIQUE ASEPTIQUE Dans le domaine de la microbiologie.coli Une gélose TSA Une pente TSA Méthode 1. Avant d’utiliser la boucle. la technique aseptique est une des procédures utilisées par les microbiologistes afin de prévenir la contamination de soi-même. Elle est utilisée dans tous les cas où un transfert de cultures ou de milieu microbiologique est impliqué. Répéter pour inoculer la pente telle qu’illustrée. 3. Maintenant. Pour ce faire. La technique aseptique vous sera démontrée pour l’utilisation de la boucle d’inoculation. strier la surface d’une nouvelle gélose telle qu’illustrée 4. la contamination de l’environnement dans lequel ils travaillent et la contamination des matériaux ou des spécimens avec lesquels ils travaillent. L’instrument utilisé dans ce cas-ci est la boucle d’inoculation. ramassé des bactéries de la culture sur gélose fournie. 15 . ce qui pourrait mener à une infection. Vous utiliserez cette technique tout au cours de la session et il est donc important pour vous de la maitriser. NE PAS LA DÉPOSER SUR LA TABLE. Attention de ne pas en ramasser trop. placer la boucle dans la flamme du bruleur Bunsen jusqu’a ce quelle devienne rouge. contrairement aux étalements qui sont toujours faits à partir d’un milieu liquide. qui est essentiellement un fil de fer utilisé pour faire la prise de bactéries. INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) Les stries peuvent être faites à partir de milieu solide ou liquide. elle doit être stérilisée.

Labo de Microbiologie-2012 5. Gélos e Pente 16 . Placer vos échantillons à l’endroit désigné pour qu’ils soient incubés à 37oC jusqu'à la prochaine période de labo.

(Voir la figure ci-dessous). 17 Répéter une troisième fois. Stériliser la boucle d’ensemencement encore une fois. Comme mentionnée ci-dessus. Faire des stries de ¼ de la gélose en commençant par des stries qui traverse les stries originales au moins deux fois. Il existe plusieurs méthodes différentes pour générer des cultures pures. Les stries pour colonies simples permettent d’accomplir cela. . la dilution d’une culture hétérogène de départ génère habituellement des cultures pures. la diluant donc encore plus. Faires des tries de gauche à droite pour recouvrir approximativement ¼ de la gélose. Tourner la gélose de 90o. des bactéries sont ramassées d’un bouillon ou d’un milieu solide avec la boucle d’inoculation. Restériliser la boucle d’ensemencement et la refroidir en touchant une partie libre de la gélose. Prenons par exemple une population de millions d'individus à partir de laquelle vous ne voudriez en choisir qu'un seul.Labo de Microbiologie-2012 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES (Individuellement) Faire des stries pour colonies simples est une méthode plus élaborée de stries utilisée pour générer des cultures pures où seulement qu’un organisme est présent. Si vous pouviez diviser la population de telle façon à ce qu'il y ait dans un secteur que quelques individus. La boucle et ensuite stériliser encore une fois puis utilisée pour strier une nouvelle région de la gélose en ramassant des bactéries de la strie originale. Ces méthodes reposent généralement sur le principe de dilutions pour isoler l'organisme désiré de tous les autres. Les bactéries sont ensuite striées sur une région de la gélose. il vous serait plus facile de choisir et d’isoler l'individu qui vous intéresse. La procédure est essentiellement comme suit : initialement. Notez : vous devez stériliser la boucle entre chaque série de stries et vous ne devez pas retourner à la source. ainsi là diluant.

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture mixte Gélose d’E. répéter la procédure pour l’isolation de colonies simples à partir de bouillon de culture mixte.coli 2 géloses TSA (Jour 1) Méthode 1. Placer les deux isolations pour colonies simples à l’endroit désigné pour quelles soit incubées 37oC jusqu'à la prochaine période de labo. 3. SÉRILISER VOTRE BOUCLE après cette série de stries initiale. à l’aide de la boucle d’inoculation stérile ramasser un peu de bactéries de la culture sur gélose fournit et strier la gélose TSA comme illustrée dans le premier panneau de la figure sur la page précédente. Telle que précédemment. 2. Faire une deuxième série de stries avec la boucle stérile telle qu’illustrée. Sur une nouvelle gélose. 4. 5. Répéter autant de fois que possible en vous assurant de stériliser la boucle entre chaque série de stries pour isoler des colonies simples. 18 .

LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE (Groupes de 2) Des techniques microbiologiques de base seront utilisées pour poser des questions sur les bactéries présentes dans un cours d'eau et de déterminer si les résultats obtenus sont les mêmes sur différents milieux. et partiellement identifier certains de ces OEM. Heureusement. vous initierez un projet à long terme concernant la biorémédiation. l'environnement contient des milliards de microorganismes qui travaillent à débarrasser l'eau de cette huile. Donc. la destruction. d'isoler. Dans les prochaines semaines. Le processus d'utilisation de microbes pour décomposer les substances dangereuses (telles que le pétrole) en leurs éléments fondamentaux non toxiques est un exemple de biorémédiation. contrairement aux stries. Par contre. si des dilutions sont requises. nous allons tenter d'enrichir pour. en plus de l'intervention humaine. Matériaux Échantillon d'eau d'un cours d'eau navigable (emplacement indiqué) Eau stérile Tubes stériles PRÉPARATION DE VOS DILUTIONS Méthode (voir la méthode élaborée la semaine dernière) 1. environ 100 millions de gallons de pétrole sont déversés dans l'environnement. Tout comme avec la boucle. Ce sont des bactéries qui utilisent normalement des huiles dans l'environnement comme source de nourriture. Bâton de hockey 19 . celles-ci doivent être faites au préalable.5 ml de votre échantillon d'eau pour préparer une série de dilutions de facteurs 10 jusqu'à un facteur de dilution finale de 105 X. cette méthode ne permet pas à des dilutions d’être faites sur la gélose elle-même. METTRE DES BACTÉRIES SUR GÉLOSE : ÉTALEMENT Contrairement aux stries. L’instrument utilisé est un étaleur de verre communément appelé « bâton de hockey ». la neutralisation ou la fabrication de contaminants inoffensifs.Labo de Microbiologie-2012 TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR ÉCHANTILLONNER L’ENVIRONNEMENT Dans l'exercice suivant. Ces organismes microscopiques sont appelés bactéries oléophiles ou microbes qui consomment l'huile (OEM). Chaque année. l’étalement est seulement utilisé avec des liquides. L’assainissement est défini comme un processus utilisé pour rendre l'environnement sécuritaire par l’absorption. Il permet de répandre les bactéries de façon égale sur la surface d’une gélose. l’étaleur doit être stérilisé préalablement à chaque utilisation. Utiliser un maximum de 0.

Étiqueter de façon appropriée 6 géloses TSA.1ml de chacune de vos dilutions. 20 . Transférer et étaler 0. Amener toutes vos géloses à l’endroit désigné pour qu’elles soient incubées à 28oC jusqu'à la prochaine période de labo.1% glycérol (Groupes impairs) Méthode 1. aux géloses correspondantes. Ne pas garder l’étaleur dans la flamme. ce dernier est trempé dans l’éthanol. Incuber vos géloses dans l’orientation inversée.Labo de Microbiologie-2012 o STÉRILISATION DE L’ÉTALEUR Afin de stériliser l’étaleur. 2. incluant l’échantillon non dilué. Éthanol Tremper l’étaleur dans l’éthanol Allumer l’éthanol Permettre à l’éthanol de bruler Étaler les bactéries Matériaux Dilutions d’eau préparées précédemment 6 Géloses TSA (Groupes pairs) 6 Géloses TSA + 0. puis on laisse bruler l’éthanol. car il deviendra trop chaud! On permet ensuite à l’étaleur de refroidir. allumé. puis il est utilisé pour étaler l’échantillon de bactéries sur la surface de la gélose. 3.

6. & 1 mai Labo 7 6 & 8 nov. 8. La quantité exacte n’est pas importante. 5.13-16) Flacon de 250ml 1% (m/v) Solution de chlorure de triphenyltetrazolium (TTC) Méthode 1. huile d’arachides (Gr.Labo de Microbiologie-2012 ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMÉDIATION Matériaux Échantillon d’eau d’une voie navigable Engrais pour plantes Huile de Canola (Gr. Labo 4 2 & 4 oct. votre section et le type d’huile. Labo 3 25 & 27 sept. Faire les taches suivantes d’après cet horaire dans les semaines suivantes. 3. 30 oct. Ajouter 50 ml de l’échantillon d’eau d’une voie navigable au flacon de 250ml. Faire et enregistrer vos observations quant à l’apparence du mélange. Labo 5 Labo 6 16 & 18 oct. Labo 9 20 & 22 nov. Ajouter approximativement 10ml de l’huile assignée au flacon. 4. Inoculer nouveau milieu avec échantillon de 10ml Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme faire des comptes viables sur tous les échantillons incluant celui prélevé cette semaine Choisir et strier pour colonies simples le type de colonie prédominant obtenu lors du dernier prélèvement Faire une coloration de Gram sur le type de colonie prédominant obtenu lors du dernier prélèvement Soumettre une proposition des tests a faire pour l’identification du genre Faire une deuxième coloration de Gram sur l’isolation de colonies simples Faire un deuxième striage pour colonies simples Préparer des cultures en bouillon à partir du deuxième striage pour colonies simples Faire les tests proposés pour l’identification du genre 21 . 9-12). 2. 7. Ajouter de l’engrais de plantes pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v). mais vous désirez avoir une quantité qui est suffisante afin d’obtenir une fine couche d’huile qui recouvre la surface. Amener le flacon à l’endroit désigné pour qu’il puisse être incubé avec agitation à la température de la pièce (groupes pairs) ou à 40C (groupes impairs). Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0. Étiqueter de façon appropriée votre flacon avec votre numéro de groupe. huile de maïs (Gr. Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme.01% (m/v). Soyez aussi détaillé que possible. 1-4). et huile diesel (Gr. 5-8). Labo 8 13 & 15 nov.

Demander à un aide enseignant d’évaluer vos stries pour colonies simples. Référez-vous à la figure ci-dessous pour distinguer les morphologies des colonies observées. Remarquez la grande variété de couleurs. Chaque colonie simple représente une population de cellules bactériennes originaire d'une seule et unique cellule qui. Obtenir et examiner vos géloses sur lesquelles vous avez fait vos stries pour colonies simples.Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 STRIES POUR COLONIES SIMPLES 1. Ceci vous permettra d'obtenir une estimation préliminaire du nombre d'espèces qui se retrouvaient dans vos échantillons. Comparer vos stries pour colonies simples aux stries régulières et vos pentes. de formes et de textures qu'assument les colonies de différentes espèces.MORPHOLOGIES COLONIALE L’identification préliminaire des microorganismes peut être fondée sur la morphologie coloniale. 3. des textures et des odeurs distinctes. a généré une colonie de cellules s’empilant les unes sur les autres selon une forme caractéristique au type bactérien (tout comme un amas de bananes a une apparence différente d’un amas de pommes de terre). La morphologie d'une colonie bactérienne est une fonction de plusieurs facteurs tels que la forme de la cellule. Forme Circulaire Irrégulière Filamenteuse Rhizoïde Élévation Convexe Bombé Élevée 22 Bossue Cratère . vous devriez pouvoir voir des colonies typiques de bactéries. Après une période d'incubation appropriée de vos comptes viables. sa taille et sa physiologie. VISUALISATION MACROSCOPIQUE. Avez-vous obtenu des colonies isolées? 2. après de multiples cycles de division cellulaire. Il est aussi important de noter que les colonies d'un type bactérien donné ont souvent des couleurs.

Labo de Microbiologie-2012
DÉNOMBRER LES BACTÉRIES
Le but de cet exercice était d'utiliser des techniques microbiologiques de base pour répondre aux
questions suivantes:
Combien de bactéries et d'espèces différentes est-ce qu’il y a dans la voie navigable?
Est-ce que les résultats obtenus sont les mêmes sur différents milieux?
À cet effet, obtenir vos étalements d’eau et compter le nombre de bactéries obtenues. Choisissez
la dilution la plus appropriée (pas trop ou trop peu de colonies, idéalement environ 100 - 300).
Enregistrez vos comptes de colonies et enregistrer les sur le chiffrier Excel à l'ordinateur au
podium. Vous aurez besoin des données de toute la classe pour votre devoir.
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2)
Les cellules microbiennes sont incolores et donc difficiles à visualiser. Donc, plusieurs méthodes
de colorations ont été développées pour visualiser et classifier les microorganismes. Les types de
colorations sont généralement classifiés comme simples ou différentiels. Dans le cas des
colorations simples, un seul colorant non spécifique et non discriminatoire, tel que le bleu de
méthylène, est utilisé afin d’examiner les morphologies et les agrégations cellulaires bactériennes
au microscope. (Voir la figure sur la page 26)
Matériaux
Lames de microscope
Pipettes Pasteurs
Échantillons environnementaux
Colorants
Méthode
1. Préparer des frottis de trois différentes colonies de votre échantillonnage environnemental.
Utiliser une boucle d’ensemencement stérile pour transférer des bactéries (TRÈS PEU) à une
goutte d’eau déposée sur une lame de microscope.
2. Suspendre les bactéries dans la goutte d’eau et étaler sur une petite surface de la lame.
3. Laisser les frottis s’assécher complètement à l’air sur votre table de travail.

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Labo de Microbiologie-2012
4. Fixer vos frottis bactériens à la chaleur en les passants rapidement dans la flamme du brûleur
Bunsen. Ne chauffez pas trop vos lames!! Les bactéries brûlées ne se colorent pas bien.
5. Assembler votre station de coloration comme suit :
Tapis de papier absorbant (côté plastique en dessous)
Contenant pour la coloration (« Gladware »)
6. Déposer vos lames au-dessus des ouvertures du contenant « Gladware ». Ajouter une goutte
d’un des colorants suivants à chacun de vos frottis.
Bleu de méthylène
Cristal violet
Safranine

7. Laisser le colorant sur les frottis pour approximativement 30 secondes.
8. Rincer l’excédant du colorant avec de l'eau distillée.
9. Assécher en tamponnant la lame entre les couches de papier absorbant.
10. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Sauvegarder.
Jetez vos solutions des colorations dans les tonneaux fournis à cet effet.
NE PAS DÉVERSER LES COLORANTS DANS LES ÉVIERS
Présentation PowerPoint
1. Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. La première diapo
de la présentation doit inclure un titre, les noms de tous les membres du groupe, le numéro du
groupe et la date. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :
2. Un exemple de chacune des colorations simples avec les différents colorants incluant les
informations suivantes (3 images)
Type de coloration et le colorant utilisé
Morphologie cellulaire
Agrégation cellulaire
Grossissement

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Labo de Microbiologie-2012
MORPHOLOGIES CELLULAIRES

Neisseria

Micrococci

Micrococci

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1mL 9. Il existe plusieurs variantes des comptes viables. 5.0mL SP 0. est-ce que vous désirez échantillonner une surface. ou un échantillon liquide? COMPTES VIABLES (Groupes de 2) Matériaux Bouillon de culture d’E. un échantillon solide.0mL SP 0. Préparer des dilutions en série dans de la saline physiologique (SP) de la culture d’E.9mL TSB SP 2 1.9mL SP 4.0mL 9.coli telle qu’illustrée ci-dessous : 1. Étaler 0. Puisqu'on présume qu’une colonie simple est le fruit d'une cellule unique. Placer vos géloses dans le sac fourni à cet effet. 26 . suite à leurs croissances.coli 6 éprouvettes de 10ml 100 ml de saline physiologique (0. le chercheur peut évaluer le nombre de différentes espèces présentes d’après les différentes morphologies observées. Un des critères qui dicte le choix de la méthode est la source de l’échantillon.1mL H2 O 2.0mL 1.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 3 DÉNOMBRER LES BACTÉRIES Jour 1 Il existe plusieurs façons d’obtenir une estimée du nombre de bactéries dans un environnement donné.1mL 9.0mL 9.0mL SP 9.1ml de chacune des dilutions (10-2-10-9) sur des géloses TSA étiquetées de façon appropriée. le nombre de colonies représente le nombre de bactéries viables présentes dans l'échantillon. Parmi la plus commune est le compte viable que vous avez vu la semaine passée. Fermer le sac avec du papier collant sur lequel est indiqué votre nom et numéro de groupe. Cette méthode nécessite la croissance des bactéries sur un milieu approprié jusqu’à l'obtention de colonies simples. Par exemple. Répéter l’étape 1 sur un deuxième jeu de géloses. 3. De plus. Le compte viable détermine le nombre de bactéries vivantes dans un échantillon.9mL SP Culture microbienne 0.9% m/v) 16 géloses TSA Méthode 1. Incuber les géloses à 28oC. 4.5mL 9.

27 .0ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-4. Transférer 1.1ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-5.Labo de Microbiologie-2012 LES COMPTES LES PLUS PROBABLES (Groupes de 2) Une variante des comptes viables dépend de la probabilité pour déterminer le nombre de bactéries dans un échantillon. 2. Transférer 0. 10-4 and 10-6. 10-4. 6. la détection est fondée sur la présence ou l’absence de croissance ou la production d’un sous-produit. 7. 8. cette méthode nécessite la croissance dans un milieu approprié.1ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-3. 9. 10-2.0ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-2. 3. Transférer 0. 10-5 et 10-6.1ml de l’échantillon d’eau non dilué aux trois bouillons TSB étiquetés 10-1. Préparer les dilutions suivantes de votre échantillon d’eau d’une voie navigable dans un volume final de 10ml d’eau : 10-2. Transférer 1. contrairement aux comptes viables. Incuber vos tubes à 28oC. 10-3. 5. 4. Transférer 1. Étiqueter 6 jeux de 3 tubes contenant 5ml de TSB 10-1. Matériaux Échantillon d’eau d’une voie navigable Eau stérile 18 X 5 ml de bouillon TSB 3 éprouvettes stériles Méthode 1.0ml de la dilution (10-6) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-6. Transférer 0. Mais. Comme les comptes viables.

14 et 6 cellules dans trois carrés indépendants. qui sont constituées de neuf carrés aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm. La moyenne est ensuite calculée et le nombre total de cellules dans l'échantillon original est déterminé.1 mm3 ou 10 bactéries/0.0001 cm3 ou 10 bactéries /0. Lorsque la lame d'hemacytomètre est recouverte d'une lamelle. Il est important de noter qu'un compte direct ne permet pas de distinguer les microorganismes vivants de ceux qui sont morts. Pour obtenir une estimation rapide et précise du nombre de cellules dans un échantillon donné.1 mm3 ou 10-4 cm3.Labo de Microbiologie-2012 COMPTES DIRECTS (Groupes de 2) Comme le nom l’indique. Hémacytomètre Y Y 28 . Ceci est accompli en utilisant une lame spéciale possédant une cavité à laquelle un volume de liquide connu peut être appliqué. La cellule de comptage d'une lame d’hemacytomètre standard possède deux cellules de comptage identiques burinées dans le verre.0001 ml La concentration totale de bactéries dans l'échantillon examiné est donc de 1 X 105/ml. Le volume de chaque carré est donc de 0. un compte direct implique l’énumération directe du nombre de microorganismes présents dans un échantillon. Une fois que l'échantillon à dénombrer est appliqué. l'espace libre disponible est d’une profondeur de 0. sans avoir à les faire croître a priori. l'on a une moyenne de 10 bactéries par carré. on peut faire un compte direct.1 mm. voir la figure). les cellules sont visualisées et énumérées. Ce nombre équivaut à avoir 10 bactéries/0. Exemple de calcul: Si l'on compte 10. Les cellules dans chacun de trois carrés de tailles moyennes sont comptées.

4. 2.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Suspension de levure Lame d’hémacytomètre Eau stérile Tubes Pipettes Pasteurs Méthode 1. Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements. préparer une dilution plus élevée d’un facteur de 10. Remplir la cellule de comptage de la lame d’hémacytomètre avec un échantillon de la dilution la plus élevée (voir l’image ci-dessous ou demander à un aide enseignant de vous le démontrer). et 10-3. 3. Enregistrer les données suivantes sur le fichier Excel au podium à l’avant : Groupe Dilution No de cellules Dimensions du carré 29 No de cellules/ml original . Si le nombre de cellules est trop élevé. Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements. Préparer les dilutions suivantes de la suspension de levure : 10-1. Compter le nombre de cellules dans chacun de trois carrés de la taille indiqué par un « Y » dans l’image sur la page précédente. 10-2. 5. Si le nombre de cellules est trop petit. recommencer avec la dilution précédente.

coli. 2. Ceci est tout aussi vrai pour n’importe lesquelles des dilutions desquelles des inocula sont pris. Répéter l’étape 2 avec votre deuxième jeu de géloses. ou même jamais. Dans l’exemple suivant.Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 COMPTES VIABLE 1. Si le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-3 démontre de la croissance. mais en moyenne tous les dix aliquotes dans l’échantillon entier de 10ml sera 30. si un échantillon de 10ml contient un total de 300 organismes. le nombre de tubes qui démontre de la croissance est enregistré. il est donc possible de dire qu’il y avait plus de 1X103 organismes par ml de l’échantillon original. puis un tableau de NPP standardise est consulté afin de déterminer le nombre le plus probable d’organismes (qui causent les résultats positifs) par unité de volume de l’échantillon original. les bouillons sont observés pour la présence ou l’absence de croissance. pensez à des dilutions en série de facteurs 10 qui sont faites avec des échantillons de 1ml de chaque dilution inoculé dans différents tubes qui contiennent un milieu donné. les dilutions sont si élevées. un jeu de 3 tubes de bouillons est inoculé avec 1 ml à partir de chacune des dilutions de facteur 10. mais que le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-4 n’en démontre pas. certains contiendront plus ou moins de 30 organismes. Les bactéries ne sont que rarement. Après l’incubation. Compter le nombre de colonies sur les géloses qui possèdent entre 30-300 colonies. si au moins un organisme était présent dans n’importe lequel des inocula. le patron de tubes positifs et négatifs est noté. COMPTE LES PLUS PROBABLES Afin de comprendre la théorie du nombre le plus probable (NPP). qu’aucun organisme ne se retrouvait dans l’inoculum 30 . 5 ou 10 tubes par dilution. Après l’incubation. Après l’incubation. pas toutes les aliquotes de 1 ml contiendront 30 organismes. plus d’un bouillon est inoculé pour chaque dilution. À un certain point. Obtenir vos géloses sur lesquelles vous avez fait l’étalement de vos dilutions d’E. Par exemple. Pour augmenter la précision statistique de ce type de test. distribuées de façon uniforme dans un échantillon. une croissance visible devrait être observée pour ce tube. Le NPP standard utilise un minimum de 3 dilutions et 3. Théoriquement. mais moins que 1X104 par ml. 3.

démontre tous une extinction (0 de 3). Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilué) qui donne des résultats négatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans l’exemple ci-dessus). ex. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilué) qui donne des résultats négatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans l’exemple ci-dessus). Choisir les trois dilutions les plus faibles (moins dilué. (Tableau: ex.-à-d. Une ou plusieurs des dilutions démontrent toutes des tubes négatifs. Si le nombre de dilutions testées n’était pas suffisamment élevé pour pouvoir choisir trios dilutions après lesquelles une extinction est observée. les observations faites dans une série de trois dilutions successive sont utilisées d’après les critères suivants : Cas 1. démontre tous une extinction (0 de 3). Cas 3. Si des résultats positifs sont observés dans les dilutions plus élevées qui n’ont pas été choisies. 10-2 et 10-3 dans l’exemple ci-dessus). Choisir les trois jeux de dilutions précédentes (10-1. Afin d’estimer le nombre d’organismes par ml d’échantillon qui serait responsable du patron de croissance observe. Cas 2. Si une extinction n’est pas observée dans le prochain jeu de dilutions non sélectionné (c. Aucune des dilutions ne démontre toute des tubes positifs. alors choisir les trois dilutions les plus élevées (ex. 31 . additionnez ces résultats positifs de ces dilutions plus élevées aux résultats de la dilution la plus élevée choisie (ex. d). Vérifier que les prochains jeux de dilutions après la série choisie (10-4 dans l’exemple ci-dessus). Il y a encore des tubes positifs dans les dilutions plus élevées non choisies) additionner les résultats positifs de ces dilutions plus élevées aux résultats pour le jeu de dilutions le plus élevé choisis (ex. c).Choisir les trois jeux de dilutions précédente (10-1. une extinction est observée. Vérifier que les prochains jeux de dilutions après la série choisie (10-4 dans l’exemple ci-dessus). 10-2 et 10-3 dans l’exemple ci-dessus).Labo de Microbiologie-2012 (enregistré comme négatif). Les dilutions n’étaient pas suffisamment élevées pour démontrer une extinction. f). Une extinction n’est pas observée dans toutes les prochaines séries de dilutions qui n’ont pas été choisies. Cas 4. e). a et b).

une inoculation de 0. La quantité de milieux dans le tube n’a aucune importance puisque la même croissance serait observée dans tous les cas. À noter: Des quantités autres qu’un millilitre peuvent être inoculées. Par exemple.1 ml d’une dilution de 10–3 est équivalente à une inoculation de 1 ml d’une dilution de 10–4.9 11 0. les résultats de ces trios jeux sont utilisés pour déterminer le NPP dans le deuxième jeu de tubes à partir du tableau de NPP standard sur la prochaine page.36 2.03 0.6 0.35 Une fois qu’un jeu approprié de dilutions a été choisi.Labo de Microbiologie-2012 Tableau Exemple 100 10-1 10-2 10-3 10-4 a b c d e f 3 2 3 3 0 2 3 3 2 3 0 2 1 1 2 3 1 1 0 0 0 3 0 1 0 0 1 2 0 0 Combinaison de positifs 3-1-0 3-1-0 3-2-3 3-3-2 0-0-1 2-2-2 NPP/ml 4. 32 .

5 2.15 0.20 0.34 0.24 0.093 0.11 0.20 0.26 0.20 0.75 1.11 0.21 0.14 0.094 0.16 0.6 0.27 0.9 2.36 0.23 0.1 2.03 0.16 0.073 0.35 0.12 0.13 0.15 0.11 0.2 1.15 0.16 0.24 0.19 0.95 0.12 0.42 0.036 0.39 0.29 NPP de l’inoculum du 2e jeu de tubes 0.20 0.53 0.06 0.072 0.09 0.93 1.19 0.03 0.43 0.062 0.Labo de Microbiologie-2012 Tableau de NPP à trois tubes No de tubes positifs dans: 1er 2e 3e Jeu Jeu Jeu 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 No de tubes positifs dans: 1er 2e 3e Jeu Jeu Jeu 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 NPP de l’inoculum du 2e jeu de tubes <0.29 0.4 4.092 0.6 11 >24 Vos Résultats: o Enregistrer vos résultats pour vos NPP: Groupe 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 33 10-6 Combinaison de positifs NPP/ml .44 0.15 0.03 0.091 0.061 0.64 0.28 0.

la paroi des organismes Gram négatifs n’est pas facilement déshydratée par l'éthanol en raison de sa haute teneur en lipides. Ainsi. Ces cellules deviennent donc rouge suite à leurs contre coloration avec le Safran. La technique de coloration de Gram utilise quatre composés chimiques: Le violet de cristal. la paroi des cellules est très facilement déshydratée en raison de son faible contenu de lipides: ces cellules ont tendance à conserver le complexe d'iode de Gram/violet de cristal. L’éthanol. Le docteur Christian Gram a développé une technique de coloration différentielle. Typiquement. selon leur espèce. qui lui confère ses propriétés discriminatoires. Ces méthodes colorent les bactéries de façon différentielle en fonction de différentes propriétés de la cellule. vous avez fait des colorations simples qui vous ont permis de comparer les tailles. Les bactéries Gram négatives ont plutôt des parois cellulaires relativement minces constituées de 1-3 couches de peptidoglycanes avec un contenu élevé de lipides. Dans le cas d’organismes Gram positifs. L’ajout séquentiel de ces 4 composés aura pour effet de colorer en mauve (Gram positif) ou en rouge (Gram négatif) les bactéries.Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE . Le potentiel différentiel de la coloration de Gram est une fonction de la composition des parois cellulaires des bactéries. les formes et les agrégations cellulaires. Plusieurs autres méthodes de colorations ont été développées qui se disent différentielles. est le rinçage à l'éthanol. le traitement à l'éthanol réussit à laver efficacement les complexes d'iode de Gram/violet de cristal. composées de 10-20 couches de peptidoglycanes contenant très peu de lipides. un colorant primaire qui teint bleu toutes les cellules sans distinction. mais aussi de les classifier dans un de deux groupes: Gram positif ou Gram négatif. La coloration de Gram permet non seulement d'observer la forme et la taille des bactéries. un colorant qui teint rouge toutes les cellules sans distinction. les bactéries Gram positives possèdent des parois cellulaires très épaisses. Par contre. la coloration de Gram. 34 . rendant les cellules incolores. L'iode de Gram. qui cause la déshydratation des parois cellulaires et le Safran. qui s’associe avec le colorant primaire agissant comme un mordant. L’étape critique dans la technique de coloration de Gram.COLORATION DE GRAM (Groupe de 2) Précédemment. ce qui lui permet de conserver une grande perméabilité.

Préparer des frottis fixés à la chaleur de chacun des bouillons de culture fournis. aureus et d’E. Contre-colorer avec le Safran durant 45 secondes. 9. 10. 5. 11. Laver l’excédant de colorant avec de l’eau distillée.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Lames de microscope Culture en bouillon de S. 7. Préparer des frottis fixés à la chaleur de la dilution la plus élevée et de la dilution la plus faible de l’essai de NPP qui a démontré de la croissance. Appliquer l'iode de Gram pour une minute. 4. Laver l’excédant d'éthanol avec de l'eau distillée. 12. Sauvegardé. Colorer avec le violet de cristal pour une minute. 3. 2. Laver soigneusement à l’éthanol 95% en appliquant le solvant goutte à goutte jusqu’à ce que l’afflux d’alcool soit incolore. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Laver soigneusement l’excédant du colorant avec de l’eau distillée. Assécher la lame à l'aide de papier bilbueu. 35 . Laver soigneusement l’excédant d’iode de Gram avec de l'eau distillée. 8. 6. coli NPP des échantillons d’eau Colorants Méthode 1.

De par leur couche cireuse. 5. comme les Mycobacteriaceae dont certains membres causent la tuberculose et la lèpre. 3. Matériaux Lames de microscope Culture sur pentes de B. pénètre facilement la couche cireuse des Mycobactéries. étant miscible dans les lipides. Cependant. Ce composé. Inonder les frottis avec fuchsine de carbol pour 5 minutes.COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE (Groupe de 2) La coloration acido-résistante est une autre procédure de coloration spécialisée. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. 4. une fois que le colorant a pénétré. Contre colorer avec du bleu de méthylène pour 30 secondes. il ne peut pas être facilement retiré par des décolorants tels que l’éthanol. 36 . une composante semblable à la cire. smegmantis Carbol Fuschine de Kinyoun Alcool acide Méthode 1. Rincer le colorant avec de l'eau distillée. 8. 7. Sauvegardé. La haute teneur en acide mycoïque. 9. 6. Préparer un frottis fixé à la chaleur de chacune des cultures bactériennes. subtilis et de M. 2. Le principe de la technique est de rendre les bactéries perméables au colorant et ensuite de vérifier leur résistance à une décoloration ardue. les bactéries résistent au dur traitement de décoloration subséquent effectué avec de l'alcool acide. Cette technique est particulièrement utile pour colorer des bactéries ayant des constituants semblables à de la cire dans leurs parois cellulaires. des parois cellulaires des les rend littéralement imperméables aux colorants. Les microbes de ce type incluent plusieurs pathogènes de l’être humain. Assécher la lame à l'aide de papier bilbueu. Ces objectifs sont atteints en employant la fuchsine de carbol comme colorant primaire. Rincer avec de l’eau distillée. Décolorer avec de l’alcool acide jusqu'à ce qu’il n’y a pu de colorant. Rincer avec de l’eau distillée.Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE .

Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables à la croissance. le vert de malachite.Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE . Quand les conditions environnementales deviennent défavorables à la poursuite de la croissance des cellules végétatives. colore les cellules en rouge. Éventuellement. Assurez-vous que le colorant ne s'assèche pas. la cellule végétative et la spore sont colorées en vert. Suite à cette étape. sous la forme d’une spore. Le frottis est ensuite rincé à l’eau pour enlever l’excédant de colorant. telle que la semence d’une plante. Voir la lame de démonstration 1.COLORATION DES SPORES Les cellules d'espèces bactériennes appartenant aux genres Bacillus et Clostridium peuvent prendre la forme de cellules végétatives qui sont métaboliquement actives ou la forme de spores qui sont métaboliquement inactives. Le vert de malachite ayant peu d’affinité pour la cellule. l’endospore est relâchée comme entité indépendante de la cellule végétative. 7. la coloration des spores se fait de la façon suivante. les cellules végétatives sont aisément décolorées alors que les spores demeurent vertes. les spores germent et reprennent la forme de cellules végétatives. 3. 2. Contre-colorer avec le rouge de safran. 5. Comme les spores sont imperméables. Ajouter du colorant au besoin. de façon à augmenter la perméabilité des spores. En bref. Finalement. lequel ne colore pas les spores. La résilience des spores les rend résistantes aux méthodes de coloration standard. L’endospore. 6. Rincer à l'eau distillée. l’endospore. mais par contre. 37 . Examiner au microscope. Les cellules sont traitées avec un colorant primaire. Rincer le frottis à l'eau distillée. le colorant est appliqué en chauffant le frottis. 4. est recouverte de plusieurs couches successives qui lui confèrent une grande résistance. Les spores représentent une forme cellulaire dormante qui possède un grand niveau de résistance à des conditions environnementales extrêmes telles que la chaleur et la sécheresse. Faire bouillir sur la flamme du brûleur de Bunsen pendant cinq minutes. puis assécher. ce qui nécessite l'utilisation d'une méthode de coloration spécialisée. le frottis est contre-coloré avec le Safran. Inonder les frottis avec le vert de malachite. Préparer des frottis fixés à la chaleur. celles-ci initient la sporogenèse pour générer une nouvelle structure intracellulaire.

Mélanger la culture au vortex pour vous assurez que le glycérol et bien dispersé 5. 3.Labo de Microbiologie-2012 Présentation PowerPoint Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. 6. doit être sauvegardé sur le disque K:\ dans un fichier nommé comme suit : Colorations_Groupe (votre numéro de groupe) BIOREMÉDIATION (Partie 2) Matériaux Flacon de Bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. subtilis (2 images) Chacune des images doit être accompagnée d’une légende appropriée qui inclut l’information suivante : o Genre et espèce bactérienne (si connue) ou la source o Type de coloration utilisé o Morphologie cellulaire o Agrégation cellulaire o Grossissement Le fichier PowerPoint. La première diapo de la présentation doit inclure un titre. le numéro du groupe et la date. 4. v/v). Ajouter 0. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) : Une coloration de Gram de chacune des cultures en bouillon fourni. Enregistrer toute observation en ce qui à trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 38 . Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 2. les noms des membres du groupe. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme. Transférer 0.15 ml de glycérol stérile (15%. contenant toutes les images. (2 images) Une coloration de Gram à partir des NPP (2 images) Une coloration acido-résistante de Mycobacterium smegmantis et de B.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression.

Par contre. Différents milieux de croissance différentiels ont été conçus afin d'évaluer le type de métabolisme utilisé. Ces derniers incluent habituellement un indicateur de pH qui change de couleur en fonction des sous-produits générés à partir du métabolisme et de la source de carbone utilisée. différents métabolismes bactériens. La source de carbone et le métabolisme par lequel celui-ci est utilisé sont très variés parmi différentes bactéries. les milieux dits sélectifs contiennent des composés qui préviennent la croissance de certains microorganismes. Généralement. Certaines bactéries utilisent exclusivement un métabolisme oxydatif. d'après leurs capacités et leurs préférences. Par contre. Leur particularité est que la composition exacte du milieu et tous les ingrédients qui les composent sont connus. les milieux complexes sont créés à partir d’ingrédients dont la composition exacte est inconnue. D'autres utilisent un métabolisme fermentatif qui requière un capteur final organique. différentiel ou sélectif. les bactéries font des choix. 39 . du type de métabolisme utilisé. qui requière un capteur d'électrons final inorganique. ces milieux peuvent être rendus soit différentiels ou sélectifs. tel que l'oxygène. Ils peuvent contenir très peu ou beaucoup d’ingrédients. Les milieux définis sont très variés et diffèrent beaucoup dans leurs compositions. Par contre.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 4 LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTÉRIES DU SOL Jour 1 Il existe plusieurs types de milieux microbiologiques. la présence d'acide indique le métabolisme d'un sucre par un mode oxydatif ou de fermentation. Les milieux différentiels possèdent des composés qui permettent de distinguer visuellement. par exemple un milieu fait d’extraits de bœuf. En présence de plus d'une source de carbones et de différentes conditions environnementales. habituellement par des changements de couleur. l'accumulation de sous-produits alcalins indique le catabolisme de protéines par un mode oxydatif. qui se classent comme étant complexe défini. Dans les deux cas.

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES DU SOL Les bactéries représentent les microorganismes les plus abondants dans les sols. Bactéries qui fixent l'azote : Parmi ce type de bactéries sont les Rhizobiums qui peuvent établir des relations symbiotiques avec les racines des plantes. Bactéries dénitrifiantes: Ces bactéries convertissent le nitrate à l'azote gazeux. Elles peuvent être généralement classifiées parmi les catégories suivantes: Les décomposeurs : Ces bactéries ont un rôle important dans la décomposition de matières organiques. Azospirillum. Leurs nombres peuvent atteindre 1 X 108 par g de sol. Ces bactéries font l'extraction de l'azote gazeux de l'atmosphère qu'ils convertissent en une forme utilisable par les plantes. N’utilisent pas l’oxygène pour la croissance et ne peuvent croître en sa présence. mais sont non symbiotiques. tels qu’Azotobacter. mais la croissance en sa présence est optimale. Aérobie Anaérobie Anaérobie Anaérobie strict strict Facultatif Croissance en présence d’O2 + + + Croissance sans O2 + + + – Capteur e final : O2 + + La présence ou l’absence d’oxygène moléculaire peut être un facteur qui déterminera si une espèce bactérienne peut croître. les exigences parmi les bactéries et très diverses. tels que les êtres humains et quelques espèces bactériennes. En ce qui à trait à leurs exigences. Agrobacterium. Aérobie strict Anaérobie facultatif Anaérobie Anaérobie strict Le besoin d’oxygène est absolu pour survivre. Puisque la majorité des composés organiques initialement présents dans les sols représente des polymères complexes tels la cellulose ou l'amidon. 40 . plusieurs de ces bactéries ont la capacité de sécréter dans leurs environnements des enzymes exocellulaires qui peuvent dégrader ces polymères en unité plus facilement digérés. des anaérobies. D'autres genres bactériens. Gluconobacter. Celles-ci sont des bactéries qui vivent en absence d'oxygène. Flavobacterium et Herbaspirillum fixent eux aussi l'azote. Aérobies et anaérobies : La disponibilité d'oxygène étant très variable dans les sols. mais peuvent croître en sa présence. comme capteur final d’électrons dans la respiration en aérobie. les bactéries peuvent être placées dans des classes différentes d’après leurs capacités d’utiliser l'oxygène comme capteur final d’électrons et leurs capacités de croître en présence d'oxygène. Bactéries nitrifiantes : Ces bactéries changent l'ammonium (NH4+) au nitrite (NO2-) et ensuite au nitrate (NO3-) – une source d'azote qui est préférée par la majorité des plantes. L'oxygène peut être employé par quelques organismes. Le besoin d'oxygène est facultatif. N’utilise pas l'oxygène pour la croissance. Les bactéries du genre Bacillus et Pseudomonas sont des exemples de décomposeurs.

ceci représente une dilution de 10-2). 41 . (Notez. 3. 105X et 106X. COMPTE DE BACTÉRIES AÉROBIES HÉTÉROTROPHES (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses TSA + 0. 6 Éprouvettes stériles Eau stérile Méthode 1. 5.1% glycérol étiquetées de façon appropriée.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses TSA + 0. 7. 2. Laisser reposer pour 5 minutes sur votre table. Prudemment déverser approx.1% glycérol étiquetées de façon appropriée. Faire la pesée d'un gramme de compost. 6. 2. Ajouter le composte à la bouteille d'eau stérile.1% glycérol Méthode 1. 4.Labo de Microbiologie-2012 LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST (Groupe de 2) Préparation de l'échantillon Matériaux Composte (à côté de la balance) Bouteille de 250 ml qui contient 90 ml d'eau stérile Tube Falcon stérile de 50 ml. Préparer une série de dilution dans 10 ml d'eau stérile représentant les facteurs de dilutions suivantes 102X. Mélanger vigoureusement pour 1-2 minutes. puis répéter l'étape 3 une fois de plus. Étaler 0. 103X. Incuber dans la cuve d'anaérobie à 28oC. COMPTE DE BACTÉRIES ANAÉROBIES HÉTÉROTROPHES (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses TSA + 0. 20-30 ml du surnageant à un tube Falcon stérile de 50 ml.1% glycérol Méthode 1. 2. Étaler 0. Incuber à 28oC.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses TSA + 0. 104X. Laisser reposer pour 10 minutes sur votre table. Éviter autant que possible de récolter du sédiment.

L'inclusion de l'acide nalidixique et du colistin rend ce milieu sélectif pour les bactéries Gram positives. tandis que les non-fermenteurs sont incolores. L'acide nalidixique bloque la réplication de l'ADN tandis que le colistin perturbe la membrane plasmique d'organismes Gram négatifs. Étaler 0. Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses MacConkey (Groupes pairs) 5 Gélose CNA de Colombie (Groupes impairs) Méthode (Groupes pairs) 1.Labo de Microbiologie-2012 COMPTE DE BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET POSITIVES Afin d'obtenir une estimation de la distribution de bactéries Gram négatives et positives dans le sol.1 ml de chacune des dilutions (10-2 à 10-6) du compost sur des géloses de MacConkey étiquetées de façon appropriée. La sélectivité de ce milieu est attribuable à l'ajout du cristal violet qui inhibe la croissance d'organisme Gram positif et des levures. Incuber à 28oC. L'Agar CNA de Colombie est un milieu riche qui contient une combinaison de peptones (peptides protéiques) obtenues de tissus animaux et d'extrait de bœuf. De l'extrait de levure est inclus comme source des vitamines B. Incuber à 28oC. 2.1 ml de chacune des dilutions (10-2 à 10-6) du compost sur des géloses de CNA de Colombie étiquetées de façon appropriée. nous utiliserons des milieux différentiels et sélectifs. Étaler 0. 42 . L'aspect différentiel du milieu permet de distinguer la fermentation du lactose par l'inclusion d'un indicateur de pH. 2. Les bactéries qui fermentent le lactose sont rose. Méthode (Groupes impairs) 1. l'Agar de MacConkey et l'Agar CNA de Colombie L'Agar MacConkey est un milieu sélectif et différentiel qui contient du lactose et des protéines en tant que sources de carbones potentielles.

et la dénitrification -. produits par la décomposition au nitrate. car c'est la seule façon que les organismes peuvent obtenir d'azote directement de l'atmosphère. La fixation (N2 → NH4+) est un procédé par lequel le N2 est converti en ammonium. La nitrification (NH4+ → NO3-) plusieurs bactéries obtiennent de l'énergie en convertissant une partie de l'ammonium.→ NO2-) est faite par les bactéries dénitrifiantes qui convertissent le nitrate (NO3-) en nitrite (NO2-) et dans certain cas à de l'azote gazeux : NO3. La minéralisation (N organique → NH4+) survient souvent par la décomposition. les bactéries ou d'autres organismes. la nitrification.la fixation. Sous la forme d'ammonium. l'azote est disponible pour l'utilisation par les plantes ou pour être transformé en nitrate (NO3-) par un procédé appelé la nitrification. qu'ils utilisent comme source d'électrons. composé essentiel. La dénitrification (NO3.qui sont tous entrainés par des microorganismes.→ NO → N2O → N2.→ NO2. 43 . l'absorption. la minéralisation. Quand les organismes meurent.Labo de Microbiologie-2012 CYCLE DE L'AZOTE Le cycle de l'azote implique cinq procédés -. L'absorption de l'azote (NH4+ → N organique) produit par les bactéries est rapidement incorporée dans les protéines et d'autres composés azotés organiques par les plantes. des décomposeurs tels que les bactéries consument la matière organique et convertissent des quantités importantes de l'azote dans l'organisme mort en ammonium.

1 ml 1. Faire un compte NPP tel qu’indiqué ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d’essai de fixation d’azote pour les dilutions de 100 à 10-3. Faire un compte NPP tel qu’indiqué ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d'ammonium pour les dilutions de 100 à 10-3.0 ml 0. 2. Incuber à 28oC.0 ml 0.1 ml 44 Dilution finale 10-0 10-1 10-2 10-3 . Incuber à 28oC.Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES QUI FIXENT L'AZOTE (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 150ml de milieu d’essai de fixation d’azote 20 éprouvettes stériles Méthode 1. Échantillon de compost 100 100 10-2 10-2 Volume d’inoculum Vol. du milieu 5 tubes 5ml 5ml 5ml 5ml 1. 2. BACTÉRIES NITRIFIANTES (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 150ml de milieu d’ammonium 20 éprouvettes stériles Méthode 1.

forme principale de stockage des sucres chez les plantes. et l'amidon. composante des parois végétale.Labo de Microbiologie-2012 L'ASSIMILATION DU CARBONE La grande majorité du carbone initialement disponible dans les sols est de sources végétales et représente des polymères de sucres. L'utilisation de ces composés requiert la production et la sécrétion d'enzyme exocellulaire qui ont pour but de faire la dégradation de ces derniers en composés plus simples qui peuvent être transportés à l'intérieur de la cellule et métabolisés. 45 . tel que la cellulose. Incuber à 28oC. 2. Étaler 0.1ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses d’amidon étiquetées de façon appropriée. Ces enzymes sont donc très communes chez les microorganismes décomposeurs. Amylase ou Cellulase Amidon ou Cellulose BACTÉRIES QUI DÉGRADENT L'AMIDON (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 Géloses d'amidon Méthode 1.

2. 3. Laisser les boîtes de Pétri coulées refroidir jusqu'à la solidification de l’Agar. 8. Incuber les géloses à 28oC. 4.Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES QUI DÉGRADENT LA GÉLATINE (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent Agar fondu de tryptone + 4% gélatine 5 boîtes de Pétri Bêcher de 1L Méthode 1. Bien mélanger quelques secondes. Laisser couler l’eau chaude du robinet jusqu'à ce qu’elle atteigne la température maximale. 7. Remplir d’eau chaude approximativement à moitié d'un bécher. 46 . 6.1ml de votre dilution de compost de 10-2 au premier tube d’agar fondu. puis verser dans une première boîte de Pétri étiquetée de façon appropriée. Obtenir 5 tubes d’agar fondus de tryptone + gélatine et les placer dans le bécher d’eau chaude. Répéter l’étape 4-5 pour chacun des dilutions suivantes (10-3-10-6). 5. Transférer 0.

Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies qui dégradent l'amidon et de deux colonies qui dégradent la gélatine. Compter les colonies qui démontrent un halo d'iode qui ne réagit pas avec l'amidon. Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies obtenues sur le compte hétérotrophe en aérobie et de deux colonies du compte hétérotrophe en anaérobie. En absence d'amidon. 47 . regarder pour des zones autour des colonies.Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST Chaque groupe doit obtenir les comptes suivants et déterminer le compte bactérien/g de compost original : Compte hétérotrophe en aérobie Compte hétérotrophe en anaérobie Compte de bactéries Gram positives Compte de bactéries Gram négatives NPP des bactéries qui fixent l'azote NPP des bactéries nitrifiantes Compte de bactéries qui dégradent l'amidon Afin de déterminer quelles bactéries dégradent l'amidon. COLORATIONS DE GRAM (Groupes de 4) Faire des colorations de Gram et la prise de photo de la croissance obtenue pour les NPP des bactéries qui fixent l'azote et les bactéries nitrifiantes. L’iode de Gram réagit avec l'amidon générant une couleur bleue à noir. Compte de bactéries qui dégradent la gélatine Afin de déterminer quelles bactéries dégradent la gélatine. inonder les géloses d'amidon avec de l'iode de Gram. l'iode demeure brunâtre. Compter les colonies qui démontrent un halo nuageux autour d’elles.

Labo de Microbiologie-2012 Tableau de NPP à 5 tubes À noter : Les NPP sont donnés par 100g ou 100ml d’échantillon 48 .

Notez: ne pas utiliser la colonie au complet. 3.Labo de Microbiologie-2012 ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS (Groupes de 2) Matériaux 2 géloses TSA Méthode 1. (3 images) Colorations de Gram de bactérie qui dégradent la gélatine. Incuber à 28oC. Pour ce faire. les noms des membres du groupe. 4. contenant toutes les images. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) : Coloration de Gram de bactéries qui fixent l'azote. faites des colorations de Gram de quelques colonies. retrouver deux différentes colonies qui représentent des bacilles Gram positifs. le numéro du groupe et la date. Présentation PowerPoint Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. Prendre des photos des colorations de Gram des colonies choisies. 2. doit être sauvegardé sur le disque K:\ dans un fichier nommé comme suit : Colorations_Groupe (votre numéro de groupe) 49 . Faire des stries pour colonies simples sur des géloses TSA des colonies choisies. (1 image) Coloration de Gram de bactéries nitrifiantes. (1 image) Colorations de Gram de bactérie qui dégradent l'amidon. car vous devrez faire des stries pour colonies simples des colonies choisies. La première diapo de la présentation doit inclure un titre. (3 images) Colorations de Gram d'inconnus bactériens isolés d'une gélose CNA (2 images) Le fichier PowerPoint. À partir de la gélose CNA.

Ajouter 40 ml d’eau distillée à un nouveau flacon de 250ml. 12.15 ml de glycérol stérile (15%. 50 . et huile de diesel (Gr. Soyez aussi détaillé que possible. 8. Étiqueter de façon appropriée le flacon avec votre numéro de groupe. Amener le flacon à l’endroit désigné pour qu’il soit incubé avec agitation à la température de la pièce (Groupes pairs) ou à 40C (Groupes impairs). 9. huile d’arachide (Gr. 13. Transférer 10ml de votre culture de bioremédiation à ce nouveau milieu frais. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme.01% (m/v). huile de maïs (Gr. Mélanger la culture au vortex pour assurer une dispersion uniforme du glycérol. 5-8). 1-4).Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 3) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Huile de Canola (Gr. 4. v/v). Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence du mélange. mais vous voulez avoir une quantité qui est suffisante pour obtenir une fine couche qui recouvre la surface. 7. 5. 10. Ajouter de l’engrais de plante pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v). 6.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression.13-16) Engrais pour plantes Flacon de 250ml Tube à capuchon Bouton-pression 1% (m/v) Solution de triphenyltetrazolium chloride (TTC) Méthode 1. 11. 14. 3. 9-12). Transférer 0. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. La quantité n’est pas importante. Ajouter 0. Ajouter approximativement 10ml de l’huile assignée au flacon. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0. votre section et le type d’huile. 2.

COLORATION DE GRAM 1. un aérobie ou microaérophile. avec des exigences nutritionnelles très complexes. Les familles prédominantes des bacilles Gram positifs incluent les Bacillaceae. Certains produisent de l’acide lactique de la fermentation des hydrates de carbone. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus. protéolytiques. Rarement pathogène. la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire. À l’aide du microscope à dissection. Enregistrerez la morphologie coloniale ainsi que les couleurs de chaque inconnu. Ces familles sont divisées en deux groupes généraux. Examiner les géloses sur lesquelles vous avez strié vos inconnus pour des colonies simples. Les organismes dans la famille des Lactobacillaceae peuvent des anaérobies ou des aérobies facultatifs. possède des caractéristiques très semblables aux Bacillaceae. et la capacité de dégrader des composés de carbones complexes. obtenir des photos numériques de colonies typiques de chacun de vos inconnus.Labo de Microbiologie-2012 LABO No 5 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM POSITIVES Jour 1 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS (Groupes de 2) Les deux formes principales des bactéries Gram positives sont les bacilles et les coques. les Lactobacillaceae. à l’exception du genre Listeria. mais ceux-ci se distinguent par le fait qu’ils sont des anaérobies stricts. Les Bacillaceae comportent le genre bactérien Bacillus qui inclut des aérobies et des anaérobies facultatifs. les Clostridiaceae et les Lactobacillaceae. et les non-sporulantes. Prendre en note la coloration de Gram. 2. 3. Faire la prise de photos pour votre rapport. La famille des Clostridiaceae. Ces bactéries ont une vaste diversité d’exigences de croissance. qui inclut le genre bactérien Clostridium. Matériaux Géloses sur lesquelles vous avez isolé et strié des bacilles inconnus Gram positifs Méthodes MORPHOLOGIE COLONIALE 1. Une variété d’activités biochimiques est notée dans cette famille incluant des activités de fermentation. 51 . 3. les bactéries sporulantes qui incluent les Bacillaceae et les Clostridiacea. 2. Les coques seront traitées dans une section ultérieure.

Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec mannitol que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. Le phénol rouge tourne au jaune en milieu acide et tourne au rouge en milieu alcalin. l’indicateur de pH. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec arabinose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. Ces bouillons contiennent deux sources de carbones. 10. Généralement. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec glucose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 8. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + xylose avec 0. De plus. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + arabinose avec 0. 11.1 ml d’un des bacilles. La croissance en bouillons de phénol rouge est très utilisée pour évaluer le métabolisme des sources de carbones simples. 6.1 ml d’un des bacilles. 5. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + mannitol avec 0. De plus. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 pairs de bouillons de phénol rouge avec glucose. Vous désirez obtenir une turbidité qui est détectable. xylose ou mannitol Saline physiologique (0. 4. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + glucose avec 0. Répéter les étapes 2-9 avec le 2e inconnu. tandis qu’une croissance en absence de gaz indique un métabolisme oxydatif. tandis que des sous-produits alcalins indiquent le catabolisme de protéines. Noter. la présence d'acide et de gaz indique un métabolisme de fermentation.1 ml d’un des bacilles. 1 PRG: PRG: Méthode 1. un sucre de votre choix et des protéines. Donc 8 tubes/inconnu pour un total de 16 tubes.Labo de Microbiologie-2012 MÉTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES La source de carbone et le métabolisme utilisé sont très variés parmi différentes bactéries.1ml de la même suspension bactérienne. 9. une fiole inversée est utilisée pour déceler l’accumulation de gaz.9% m/v) Huile minérale 2 éprouvettes stériles Bact. Préparer des suspensions de 1 ml de chacun de vos inconnus dans de la saline physiologique. Tube 1 représente des conditions d’aérobie Tube 2 est recouvert d’huile minérale pour créer des conditions d’anaérobies 52 .1 ml d’un des bacilles. Incuber à 28°C. arabinose. 1 Bact. le phénol rouge est inclus. 2. la production de sous-produits neutres ou acides indique le catabolisme d'un sucre. 3. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec xylose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 7. Huile minérale Paire de bouillons phénol rouge glucose (PRG) inoculées avec 0.

1 Matériaux Suspensions. Un indicateur de pH dans le milieu de culture. Ces acides sont facilement décelés en présence du réactif méthylrouge. 53 Bact. Incuber à 28oC. MR/VP : Bact. 1 Bact. Urée: Matériaux Stries pour colonies simples d’un bacille inconnu Gram positif isolé la semaine passée 2 Pentes d’Agar d’urée . Le test de Méthyl-Rouge-Vogues-Proskauer est utilisé pour déterminer le type de fermentation utilisé par un microorganisme donné.Labo de Microbiologie-2012 FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE Certaines bactéries fermentant le glucose génèrent de grandes quantités d'acides de toutes sortes. Inoculer avec 0. 2 Méthode 1. Incuber à 28oC.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons MR-VP. des bacilles inconnus 2 bouillons MR-VP URÉASE Certains microorganismes peuvent d'utiliser l'urée comme source de carbone et ou d’azote. L'ammoniac relâché dans le milieu de culture le rend alcalin. une enzyme hydrolysant l'urée en l'ammoniac. du bioxyde de carbone et de l'eau. préparées dans l’exercice précédent. mais de grandes quantités de sousproduits neutres comme l'éthanol et le butanediole. Un des intermédiaires de la production de ces sous-produits est l'acétoine. MR/VP : Bact. 2. 2. L'urée est un sous-produit généré par le catabolisme des protéines chez les vertébrés. Strier vos bacilles inconnus sur des pentes d’Agar d’urées. D'autres espèces bactériennes ne génèrent que de faibles quantités d'acides. permet de déceler la présence de produits alcalins. 2 Urée: Méthode 1. le phénol rouge. Le catabolisme de l'urée par les microorganismes nécessite l’uréase. composé qui peut être décelé à l'aide d'un réactif chimique. en changeant de couleur au rose.

6 ou plus. de lait. plus maniables. les sources de carbones complexes. puis réduire le nitrite en ammoniac. un polysaccharide. Enfin. la caséine. Répéter l’étape 1 avec votre deuxième bacille inconnu. L'utilisation du citrate génère des sous-produits alcalins qui sont décelés par l'inclusion d'un indicateur de pH. un polymère d’acides nucléiques. la tributyrine. Le clivage des molécules polymériques en unités monomériques est fait par la sécrétion d'enzymes exocellulaires spécialisées qui fonctionnent à l'extérieur de la cellule. 2. Certaines bactéries synthétisent aussi des protéases telles que la caséinase. Certaines espèces bactériennes peuvent synthétiser et excréter l' amylase. de tributyrine et une d’ADN. Ces réactions sont faites par des enzymes nommées "nitrates réductases". UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES EXOCELLULAIRES Les sources de carbone simple. le brome thymol bleu. Incuber à 28oC.Labo de Microbiologie-2012 Bact. un polypeptide (protéines).4 joignant les monomères de glucose dans l'amidon. 2 de lait. Incuber à 28oC. Les lipides peuvent être réduits en acides gras simples par les lipases. les disaccharides et les acides aminés pénètrent la cellule par diffusion simple ou par un système de transport spécifique. une enzyme qui clive le lien -1. ces molécules doivent d'abord être clivées en unités plus petites.8 et bleu à un pH de 7. sont des molécules trop grosses pour pouvoir employer l’un ou l’autre de ces mécanismes de transports. Strier chacun de vos inconnus à la surface d’une pente de citrate de Simmons 2. Des exemples de sources de carbone complexes utilisées par certaines bactéries sont l'amidon. qui est vert à un pH de 6. Bact. 3. Par contre. 2 de tributyrine et 2 d’ADN Méthode 1. Afin d’être utilisées. tels les polysaccharides et les protéines. qui clive le lien peptidique joignant les monomères d’acides aminés. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 géloses d’amidon. Faire des stries pour colonies simples d’un de vos bacilles inconnus sur chacune des géloses d’amidon. lesquelles 54 . l’ADNase clive les liens phosphodiestères entre les nucléotides d’une chaîne polynucléotidique. 1 Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 Pentes de citrate de Simmons Citrate L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE Cet essai est conçu pour déterminer si un microorganisme peut utiliser le citrate comme source unique de carbone et des sels d'ammoniums inorganiques comme source unique d'azote. tels les monosaccharides. 2 Citrate Méthode 1. un polymère d’acides gras (un lipide) et l’ADN. RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE Certaines espèces bactériennes peuvent réduire le nitrate en nitrite.

55 . 2. Les organismes tolérants au sel n’auront aucun problème pour croître sous un tel environnement. TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS À des concentrations élevées.Labo de Microbiologie-2012 sont requises pour l'assimilation du nitrate. Incuber à 28oC.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons de nitrates. le sel agit comme un agent sélectif qui interfère avec la perméabilité des membranes et l’équilibre osmotique de la majorité des bactéries. L'utilisation du nitrate comme capteur final d'électrons représente un exemple de respiration anaérobie.5% NaCl Méthode 1. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 bouillons TSB + 6. NO3NO2NH4+ N2 Nitrate réductase Nitrite réductase d'autres enzymes Matériaux Suspensions d’inconnus bacilles préparés dans l’exercice précédent 2 bouillons de nitrates Méthode 1. D'autres espèces bactériennes utilisent le nitrate plutôt que l'oxygène comme capteur final d'électrons. 2. La réduction du nitrate au nitrite constitue un sentier dissimilatoire du nitrate. Incuber à 28oC. Inoculer chacun de vos inconnus dans un des bouillons TSB + NaCl. L'ammoniac produit par ces réactions peut ensuite être utilisé pour la synthèse d'acides aminés. Inoculer avec 0.

de la colonie et non pas du milieu. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 tubes profonds de TSA contenant 0. La présence du cytochrome oxydase est facilement déterminée par l’ajout de p-aminodimethylaniline oxalate. réactif pouvant faire don d'électrons (devenant ainsi oxydé) à la cytochrome oxydase. Examiner s'il y a un changement de couleur. Du triphenyl tetrazolium chloride est souvent inclus dans ces milieux pour aider à la visualisation. le rendant rouge. LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE Plusieurs bactéries peuvent nager en utilisant le flagelle. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée Réactif p-aminodimethylaniline oxalate Méthode 1. Le flagelle est semblable à ceux des eucaryotes. Demander à un aide enseignant d’ajouter une goutte du réactif permettant la détection du cytochrome oxydase sur une des colonies de vos inconnus bactériens. mais de structure très différente. ces dernières sont beaucoup plus commune chez les bacilles.5% d’agar 56 .Labo de Microbiologie-2012 CYTOCHROME OXYDASE Plusieurs espèces de bactéries aérobies et quelques espèces de bactéries anaérobies facultatives possèdent le cytochrome oxydase dans leur chaîne de transport d’électrons. Pas toutes les bactéries possèdent des flagelles. De ce fait. Le cytochrome transfère des électrons à l'oxygène. après 1-2 minutes. produisant de l'eau. Le fait qu’une bactérie soit motile ou non peut être utilisé pour permettre à leur identification. Cet indicateur est réduit par la majorité des bactéries. 2. mais il y a quelques rares coques qui les possèdent aussi. Une des façons de déceler la motilité est de faire croitre les cultures dans des milieux contenant une faible concentration d’Agar et d’observer si les bactéries se sont éloignées de site initial de l’inoculation. le p-aminomethylaniline oxalate devient rose et éventuellement noir quand il est oxydé.001% triphenyl tetrazolium chloride et 0.

comme les microorganismes aérobies et facultatifs. 2. Ajouter 1-2 gouttes de peroxyde 3% sur une des colonies de vos inconnus. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée Peroxyde 3% (v/v) Méthode 1. Répéter avec votre deuxième inconnu dans un autre tube profond. Utiliser une aiguille d’inoculation stérilisée (pas la boucle) afin de récolter de la croissance d’un de vos inconnus puis l’enfoncer dans le milieu d’essai de motilité en piquant au centre. Observer s'il y a formation de bulles.Labo de Microbiologie-2012 Méthode 1. 57 . Incuber à 28oC. 2. Afin de se protéger. ces microorganismes génèrent la catalase qui réduit le peroxyde en le convertissant en eau et en oxygène par le sentier suivant : 2H2O2 2H2O + O2 L'émission d'oxygène est facilement décelée en tant que petites bulles. CATALASE La catalase est une enzyme qui se retrouve dans la plupart des organismes vivants en présence d'oxygène. 3. qui endommage la cellule. tel le peroxyde. Le métabolisme de l'oxygène génère des radicaux libres.

Cette bactérie est la cause principale des streptococcies de la gorge et dans de rares cas cause la détérioration massive des tissus (« mangeuse de chair »). pyogenes. aureus. Saprophyticus. cause des septicémies chez les nouveau-nés. les membres du genre Micrococcus sont des aérobies stricts tandis que ceux du genre Staphylococcus sont des aérobies facultatifs. epidermidis. qui inclut les streptocoques d’importance pour l’industrie laitière. Les Streptococcaceae Cette famille inclut les bactéries du genre Streptococcus. les Staphylococcus et les Micrococcus. mutans et S. Contrairement aux Micrococcus. FAMILLES DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE (Groupe de 2) Les Micrococcaceae La famille des Micrococcaceae inclut des organismes pathogènes et non pathogènes souvent associés à la flore naturelle humaine. roseus. S. qui inclut des espèces pathogènes et non pathogènes. mitis responsables des caries dentaires. Cette famille inclut deux genres principaux. étant plutôt un opportuniste. ce genre bactérien est rarement pathogène. Les trois espèces principales du genre Staphylococcus sont S. est non pigmenté et souvent associé aux infections urinaires. Les entérocoques du groupe D. D’autres Streptococci qui ne sont pas classifié d’après les groupes de Lancfield incluent. sont impliqués dans les infections du système urinaire. S. aureus.Labo de Microbiologie-2012 IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS. S. 58 . agalactiae. Cette classification est fondée sur la réaction immunologique des polysaccharides de leurs parois. et le choc toxique. Ces dernières sont classifiées d’après le système de classification de Lancefield. des méningites. (rose). Plusieurs espèces de Micrococcus ont des colonies pigmentées. tel que M. divisant ces bactéries en 8 groupes (A-H et K-U). S. causant la mort dans 75% des cas. seul membre du groupe B. les endocardites. Les membres d'importance clinique du genre Streptococcus incluent celle du groupe A. pneumoniae. luteus (jaune) ou M. Leurs cellules ont souvent un arrangement de tétrade. Résident de la peau. la cause principale des pneumonies ainsi que S. S. epidermidis est un organisme non pigmenté non pathogène habituellement retrouvé sur la peau ou les muqueuses. les Lactococcus. qui regroupe la majorité des espèces pathogènes. les pneumonies. ainsi que les infections des plaies. S. un autre organisme souvent retrouvé sur la peau. est souvent associé à l’acné. En effet. les Staphylococci sont des parasites humains qui peuvent sous certaines conditions être la cause de maladies graves. Ce genre est divisé en trois groupes d’espèces apparentées. une espèce de couleur jaune. les Enterococcus. S. Tous deux peuvent utiliser l’oxygène et possèdent un métabolisme typiquement respiratoire. saprophyticus et S. qui inclut les streptocoques d’origine fécale et les Streptococcus. les Micrococcus produisent de l’acide du glucose seulement en conditions d’aérobie tandis que les Staphylococcus le font sous des conditions d’aérobies et d’anaérobies. Plus spécifiquement.

Il est utile pour la croissance d’organisme fastidieux et pour la détermination des capacités hémolytique. Ceci se dit une hémolyseα. Plusieurs espèces non pathogènes des Streptococcus sont de ce groupe. Incuber à 37oC dans la cuve à chandelle.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) Bouillon de culture catalase négatif (C-No) 2 géloses de chocolat Méthodes Morphologie Coloniale 1. Incuber la culture catalase négative à 37oC dans la cuve à chandelle. Ceci s’appelle une hémolyse-γ. La plupart des Streptococcus de ce groupe ne sont pas pathogènes. DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NÉGATIF HÉMOLYSE SANGUINE L’Agar de sang (BA) contient des nutriments généraux et 5% de sang de mouton. o 3. la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire. Ceci résulte en une zone d’éclaircissement complète. 2. il n’y aura pas d’éclaircissement. Certaines bactéries produisent des exoenzymes qui lysent les globules rouges et dégradent l’hémoglobine. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Gélose de sang Méthode 1. Incuber la culture catalase positive à 37 C. 3. Les Beta-hémolysines lyse les globules rouges et dégradent l’hémoglobine complètement. Plusieurs espèces pathogènes des Streptococcus et quelque une des Staphylococcus appartiennent à ce groupe. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus. 2. Il existe différents types d’hémolysines. un sous-produit de la dégradation. De tels résultats se disent une hémolyse-β. La couleur verdâtre est causée par la présence de biliverdine. Coloration de Gram 1. Faire des stries pour colonies simples de chacun de vos inconnus sur des géloses de chocolat. 59 . Faire la prise de photos numériques pour votre rapport. Prendre en note la coloration de Gram. Faire des stries pour colonies simples de l’inconnu catalase négatif sur une gélose de sang. Si l’organisme ne produit pas d’hémolysines et ne dégrade pas les globules rouges. 2. les hémolysines. L’hémolysine alpha dégrade partiellement les globules rouges laissant une couleur verdâtre.

le citrate ferrique. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Pente de bile esculine Méthode 1. SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE La sensibilité à ces antibiotiques permet l’identification présomptive de différents membres du genre S.Labo de Microbiologie-2012 BILE-ESCULINE Ce test est utile pour l’identification des streptocoques de groupe D. 4. 3. 2. les Enterococcus. pyogenes et S. Étaler la bactérie sur la surface d'une gélose de chocolat. 2. générant complexe brun foncé ou noir. Incuber la gélose à 37°C dans la cuve à chandelle. Utiliser des forceps stériles pour déposer un disque de bacitracine et un disque d’optochine sur la surface de la gélose. L’esculitine réagit avec un sel du fer. Strier une pente de bile-esculine avec votre inconnu catalase négatif. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Applicateur à embout de coton stérile 1 Gélose de chocolat 1 disque de bacitracine 1 disque d’optochine Méthode 1. Plonger un applicateur à embout de coton stérile dans la culture de votre inconnu catalase négatif. Incuber à 37oC. De la bile est incluse pour inhiber la croissance de bactéries Gram positive autre que les Enterococci. Ceux-ci font l’hydrolyse de l’esculine à l’esculitine et du glucose. recouvrant autant de la superficie que possible. 60 . pneumoniae.

Les staphylococci qui possèdent la lecithinase dégradent le jaune d’œuf causant une zone d’éclaircissement autour des colonies. 4. SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE La sensibilité à la novobiocine permet de discriminer S. AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER Ce milieu est sélectif pour l’identification présomptive de staphylococci coagulase positifs. saprophyticus étant résistant. aureus. tel que S. La sélectivité de ce milieu est due au chlorure de lithium et une solution de 1% de Potassium de Tellurite. La discrimination de staphylococci coagulase-positif est fondée sur le Potassium Tellurite et une émulsion de jaune d’œuf. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) Une gélose de chocolat Applicateur à embout de coton stérile Méthode 1. L’inclusion d’un indicateur de pH. Incuber à 37oC. une caractéristique des staphylococci coagulase-positifs. Comme les bouillons phénol rouges. cause le noircissement des colonies. le mannitol ou des protéines. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) 1 Gélose mannitol + sels Méthode 1. permet de discriminer les Staphylococcus fermenteurs.5%) qui permet d’enrichir les bactéries du genre Staphylococcus. Incuber la gélose à 37°C. Strier pour colonies simples l’inconnu catalase positif sur une gélose de Tellurite. 2. Étaler la bactérie sur la surface d'une gélose de chocolat. des non-fermenteurs. déposer un disque de novobiocine sur la surface de la gélose. S. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) 1 gélose d’agar de Tellurite Méthode 1. qui inhibent la croissance d’organismes autres que les staphylococci.Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE GÉLOSES DE MANNITOL + SELS Ce milieu contient une concentration élevée de sels (7. Avec des forceps stériles. 2. Strier pour colonies simples l’inconnu catalase positif sur une gélose de mannitol + sels. La réduction du Potassium de Tellurite. 3. ce milieu fournit deux sources de carbones. Incuber à 37oC. 61 . saprophyticus des autres bactéries du genre Staphylococcus. le phénol rouge. Plonger un applicateur à embout de coton stérile dans la culture catalase positive. 2. recouvrant autant de la superficie que possible.

6. 62 Negatif Positif Positif Negatif . Afin de compléter les tests de MR et VP. Observer la couleur à la surface du bouillon. Le développement d'une couleur rouge indique la présence d'acétoine. Bien mélanger et laisser la réaction se poursuivre pour 10-15 minutes. Ajouter 3 gouttes de KOH à 40% au tube. Pour le test de MR. Une couleur rouge indique la présence d'une grande quantité d'acides. transférer 1 ml du bouillon de culture MRVP que vous avez préparé au labo précédant à chacun de deux nouveaux tubes. 4. Afin de compléter le test de VP. Observer s'il y a un changement de couleur. D’après vos observations. FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE 1. 3.Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS – INTERPRÉTATION DES TESTS Métabolisme de sources de carbone simples 1. 2. 5. Obtenir vos pairs de tubes de phénol rouges et faire les observations suivantes : Est-ce qu’il y a eu croissance De quelle couleur est le bouillon Est-ce qu’il y a accumulation de gaz Acide Alcalin Acide + Gaz 2. ajouter 6 gouttes d'alpha-naphtol au deuxième tube. ajouter 2 gouttes de méthyl rouge à l'un des deux tubes. déterminez quels sucres ont été utilisés et par quel métabolisme. tandis qu'une couleur jaune indique une absence d'acides.

3. de tributyrine et d’ADN que vous avez inoculées. Examiner vos pentes pour tout changement de couleur au rose. Examiner vos pentes pour un changement de couleur au bleu. de tributyrine et d’ADN pour un éclaircissement autour de la croissance. Examiner les géloses de lait. Un tel éclaircissement indique la production de l’enzyme exocellulaire. Cette couleur indique la présence de produits alcalins générés par l’action de l’uréase. Obtenir les géloses d’amidon. de lait. inonder la croissance sur la gélose avec de l’iode de Gram. 2. L’iode de Gram réagit avec l’amidon pour donner une couleur bleu foncé. L’absence de cette couleur indique la dégradation de l’amidon Amylase Caséinase Lipase 63 ADNse . Negatif Positif Negatif Positif UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES EXOCELLULAIRES 1.Labo de Microbiologie-2012 URÉASE 1. UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE 1. Dans le cas de la gélose d’amidon. Cette couleur indique que des sous produits alcalins ont été générés ce qui indique que le citrate a été utilisé comme source de carbone.

http://mysite. 3.Labo de Microbiologie-2012 RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE 1. Afin de déterminer si vos inconnus peuvent réduire le nitrate. ajouter 3 gouttes d'acide sulfanilique et 3 gouttes d'alpha-naphtylamine à votre culture dans le bouillon de nitrate.uottawa. Résultats après l’ajout de l'acide sulfanilique et alpha-naphtylamine Résultats après l’ajout de zinc LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE Examiner vos tubes profonds afin de déterminer si vos inconnus bactériens sont motiles.pdf 64 . Le zinc réduit les nitrates aux nitrites qui réagissent avec l'acide sulfanilique et alpha-naphtylamine générant une couleur rouge. TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS Examiner vos cultures pour une croissance abondante.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts. Ces réactifs réagissent avec le nitrite générant une couleur rouge. 2. Observer s'il y a un changement de couleur après une minute. IDENTIFICATION DE VOS BACILLES GRAM POSITIFS INCONNUS Utiliser l’organigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espèces bactériennes de vos inconnus.science. S'il n'y a pas changement. ajouter un peu de poussière de zinc. Observer s'il y a un changement de couleur.

Examiner vos pentes de bile esculine. respectivement. BILE-ESCULINE 1. 65 . Seules ces deux espèces de Streptococcus sont sensibles aux antibiotiques respectifs quand le test est fait. Examiner vos géloses de sang et déterminer le type d’hémolyse observé : alpha. L’assombrissement du milieu indique la présence d’esculitine qui résulte de l’hydrolyse de l’esculine SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE Les tests de sensibilité à la bacitracine et à l’optochin sont utilisés pour identifier Streptococcus pyogenes et Streptococcus pneumoniae. bêta ou gamma.Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE NÉGATIF HÉMOLYSE SANGUINE 1.

aureus est faite. 66 . faire le test de Coagulase indiqué ci-dessous. Si une identification positive présomptive de S.Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE POSITIF GÉLOSES DE MANNITOL + SELS Négatif Positif AGAR DE TELLURITE Vérifier votre étalement sur l’agar de Tellurite pour déterminer si des colonies typiques de Staphylococcus aureus sont observées.

Ajouter une goutte de plasma de lapin citré à la région test et bien mélanger. 3. 5. 6. Elle crée des liens croisés entre les chaînes α et β du fibrinogène du plasma formant des caillots de fibrine qui se dépose sur la paroi cellulaire. TEST DE COAGULASE SUR LAME Principe: La coagulase liée est aussi connue comme le facteur d’agglutination.Labo de Microbiologie-2012 COAGULASE Ce test est utile pour différentier S. aureus pourraient ne pas produire de Coagulase liée et de telles souches doivent être identifiée par le test de coagulase en tube. Ajouter une petite goutte d’eau à chaque côté. les coccus individuels se collent les uns aux autres et une agglutination est observée. En conséquence. 67 . La coagulase libre est détectée en tube tandis que la coagulase liée est détectée sur lame. 4. Avec la boucle d’inoculation stérile. libre et liée. tandis que celle liée est associée à la paroi. À noter: Quelques souches de S. Diviser une lame en deux sections avec un crayon-feutre tel qu’illustré ci-dessous: Test Control 2. L’agglutination des cocci observée dans les 5-10 secondes est interprétée comme positif.aureus suspecte sur gélose de chocolat Plasma citré de lapin Eau stérile Méthode 1. Matériaux Colonies simples de la culture de S.aureus produisent 2 types de coagulases. La majorité des souches de S. Étiqueter un côté ―Test‖ et l’autre ―Contrôle‖. Bien mélanger pour obtenir une bonne suspension turbide. suspendre deux à trois grosses colonies de la bactérie suspecte dans chacune des gouttes d’eau. La libre est une enzyme sécretée extracellulairement.aureus des autres staphylococci coagulase négatifs.

Un organigramme serait une bonne idée pour cette section. 6. Introduction : Cette section devrait traiter des raisons pourquoi l’isolation et l’identification d’organismes bactériennes est importantes ainsi que les techniques générales qui sont utilisées a cette fin (Non seulement celle vue en labo).pdf BIOREMÉDIATION (Partie 4) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. 1. Ajouter 0. Références : Lister toutes les références utilisées d’après le style recommandé par le « Journal of Bacteriology ». importance clinique et traitement. Mesurer la zone d'inhibition. Contrairement aux staphylocoques. Vous devriez trouver de l’information sur leurs caractéristiques générales. 2. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit: A.15 ml de glycérol stérile (15%. les microcoques sont oxydase positive. http://mysite.uottawa. Ajouter une goutte du réactif de l’oxydase sur la croissance de votre inconnu. v/v).85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression. impacte environnementales (s’il y en a) utilités. physiologie. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. Résultats : Présenter les tests qui ont été faits.Labo de Microbiologie-2012 SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE 1. D. Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section. Discussion : Dans cette section vous devez écrire (environ une page pour chaque organisme) une description détaillée de l’organisme identifié. Identification de vos inconnus de la famille des Micrococcaceae Utiliser l’organigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espèces bactériennes de vos inconnus. Un diamètre de 17mm ou moins indique une résistance. RAPPORT SUR L’IDENTIFICATION D’INCONNUS BACTÉRIENS Chaque personne ou équipe de deux doit rédiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs résultats. 68 . E. C. Titre et les noms des auteurs B.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts. Transférer 0. 3. Présentez comment certains ou tous les résultats obtenus ont permis d’identifier l’organisme inconnu.science. 4. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme. Examiner s'il y a un changement de couleur après 1-2 minutes. OXYDASE Ce test permet de discriminer les bactéries du genre Staphylococcus de celles du genre Micrococcus. 2. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 5. tandis qu’un diamètre de plus de 17mm indique que l’isolat est sensible. quelles observations ont été faites et leurs interprétations respectives. Mélanger au vortex afin de vous assurer que le glycérol est dispersé uniformément.

Les bactériolytiques tuent les bactéries en lysant les cellules alors que les bactéricides tuent sans lyse concomitante. Cela est habituellement fait par un essai semi-quantitatif appelé « la méthode de sensibilité de disque de Kirby-Bauer ». semi-synthétiques ou naturels qui inhibent ou tuent les bactéries. Le diamètre du halo formé constitue une mesure de la sensibilité relative de la bactérie à l'antibiotique (voir la figure) Les recommandations des tailles des zones d’inhibitions pour l’interprétation de l’essai de KirbyBauer (résistant. Après une période d'incubation appropriée pour la croissance optimale de la bactérie examinée. Initialement. Les antibiotiques bactériostatiques inhibent les bactéries sans les tuer. Des disques contenant des quantités connues d'antibiotiques à être évaluées sont alors déposés sur la surface de la gélose. L'essai est fait sur une gélose sur laquelle est étalé un inoculum de la bactérie étant examinée. 69 . Cet essai consiste à évaluer la sensibilité d'une espèce bactérienne à une variété d’antibiotiques. l’efficacité des antibiotiques est évaluée en fonction des étendues des zones d’inhibitions de la croissance bactérienne à proximité des disques. les zones d'inhibition forment des halos autour des disques.ANTIBIOTIQUES (Groupe de 2) Les antibiotiques sont des composés synthétiques. Les antibiotiques sont généralement classés selon leurs modes d’action : bactériostatique. intermédiaire. la sensibilité du pathogène cible à une variété d'antibiotiques est testée afin de déterminer lesquels peuvent être utilisés.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO6 CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE Jour 1 COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS . ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER Avant de pouvoir utiliser un antibiotique sur un nouveau pathogène il est essentiel d'évaluer la sensibilité du pathogène à l'antibiotique. bactériolytique ou bactéricide. sensible) ont été établies par des organisations impliquées dans le contrôle des maladies.

Enlever le surplus de la suspension de l’écouvillon en exerçant une pression contre la paroi de l’éprouvette. Immergé un écouvillon dans le bouillon de culture jusqu’à ce qu’il soit complètement imbibé. on doit au préalable déterminer sa concentration efficace minimale. Étaler la culture appropriée sur la surface entière de chaque gélose appropriée. Croissance CMI 70 Pas de Croissance . 6. Incuber les géloses inversées à 37°C. à défaut de quoi. aureus Bouillon de culture de 5 ml de S. Streptococcus et E. Utiliser des forceps stériles pour appliquer une légère pression sur chaque disque afin d’assurer un bon contact avec l’Agar.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture de 5 ml de S. Une distribution égale est essentielle. Étiqueter trois géloses de chocolat d’après la souche bactérienne à être testée (Staphylococcus. La plus basse concentration d'antibiotique pour laquelle aucune croissance bactérienne n'est observée. DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE Lorsqu'un antibiotique est utilisé à des fins thérapeutiques. après une période d'incubation appropriée. Cette méthode consiste à ensemencer une quantité constante de bactéries dans un bouillon de croissance avec différentes concentrations de l'antibiotique à être évalué. Pourquoi l’un ou l’autre de ces scénarios représente-t-il un problème? La méthode de dilution de bouillon est la façon la plus courante de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale bactéricide (CMB) d'un antibiotique. 4. Déposer les disques d’antibiotiques sur vos géloses. permettez aux inocula de s’assécher pour 3 à 5 min.coli 3 géloses de chocolat Écouvillons stériles Disques imprégnés d'antibiotiques Forceps Méthode 1. epidermididis Bouillon de culture de 5 ml d’E. étalé de façon uniforme dans trois directions afin qu’un étalement égal et une croissance confluente en résulte. Les géloses étant recouvertes. 5. un dosage trop élevé ou trop faible pourrait être prescrit. 3.coli) 2. représente le CMI.

coli que vous avez dilué précédemment. 71 . Bien mélanger. Poursuivre cette démarche pour les 8 éprouvettes. 10. aureus Bouillon de culture de 5 ml de S. Incuber les éprouvettes ensemencées à 37oC.5ml du deuxième tube de chaque jeu au troisième tube de chaque jeu. 12.5ml de la solution stock de l’antibiotique assigné au premier tube de chaque jeu de huit. 8. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes de la troisième série avec 0. 4.5ml de milieu sauf pour la dernière. 11. Toutes les éprouvettes devraient contenir 2. 5.5ml de la dernière éprouvette de chaque jeu.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture de 5 ml de S. Dilué dans du TSB chacune des cultures fournit afin d’obtenir 5 ml de bouillon qui représente un facteur de dilution de 1 000X. Étiqueter trois jeux de 8 éprouvettes (Un jeu/espèce bactérienne) avec l’espèce bactérienne étant testée. Transférer 2. 100 ml de TSB 27 Éprouvettes stériles Antibiotique Ampicilline Kanamycine Acide naladixique Tétracycline Érythromycine Classe Bêta-lactamine Aminoglycoside Quinolone Tétracycline Macrolide Abréviation A K N T M Méthode 1. epidermididis Bouillon de culture de 5 ml d’E. Ajouter 2.coli 10 ml de l'antibiotique assigné (1mg/ml dans du TSB) Approx.1 ml de la culture d’E. Retirer et jeter 2. 7. 6. Transférer 2. Vous devriez donc avoir généré huit jeux de dilutions en série de facteurs 2 de l’antibiotique assigné. 9. 2. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes de la deuxième série avec 0. l’antibiotique testé et votre numéro de groupe. Bien mélanger.5ml du premier tube de chaque jeu au second tube de chaque jeu. Bien mélanger. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes d’un jeu avec 0.1 ml de la culture de Staphylococcus que vous avez dilué précédemment.5ml de TSB à chacune des éprouvettes. 3. Ajouter 2.1 ml de la culture de Streptococcus que vous avez dilué précédemment.

L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS Probablement les désinfectants/antiseptiques les plus couramment utilisés dans la vie de tous les jours sont les savons. L'utilisation des antiseptiques et des désinfectants vise à réduire de façon significative le nombre de bactéries dans un secteur donné et d’empêcher leurs croissances. mais aussi. tels les antiseptiques et les antibiotiques tandis que d’autres sont utilisés pour des buts préventifs ou esthétiques. tels que les antiseptiques. Cette flore naturelle est principalement constituée de bactéries non pathogènes du genre Staphylococcus. Certains ont un usage thérapeutique. dans les couches profondes de la peau. Ceux-ci ont tous pour but de soit réduire le nombre de bactéries. tandis que les désinfectants sont destinés aux objets. nous évaluerons l'efficacité de différents savons à mains et de différents antiseptiques pour les mains. la stérilisation des mains n'est pas possible. avec qu’il opère sur un individu. Le but de se laver les mains est double. Grice & Julia A. Les antiseptiques sont des composés chimiques destinés à l'utilisation humaine. Éliminer les bactéries que vous auriez pu acquérir de la manipulation de différents objets (la flore transitoire) et de réduire le nombre de bactéries qui résident normalement sur vous (la flore résidente). Une de leurs utilisations populaires est le lavage des mains. 244-253 (April 2011) 72 . The skin microbiome Elizabeth A. car les microorganismes vivent non seulement à la surface. les désinfectants et les antibiotiques. soit avant de commencer à cuisiner ou dans le cas d’un chirurgien. tels les désinfectants. Segre Nature Reviews Microbiology 9. Dans l'exercice suivant.Labo de Microbiologie-2012 DÉSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES (Individuellement) Il existe plusieurs classes de produits antibactériens. Évidemment. de les éliminer ou d’inhiber leurs croissances.

Ces géloses sont celles sur lesquelles vous étalerez des échantillons de votre main dominante (celle avec laquelle vous écrivez) 4. 8. Répéter le lavage de vos mains pour 2 minutes additionnelles. 11. Eau 4 géloses de chocolat Écouvillons stériles Eau stérile Méthode 1. 2. Savon antibiotique. Remplir le questionnaire suivant : Genre (male ou femelle) Main dominante (Droite ou gauche) Traitement 73 . Assigner à chacune des personnes du groupe de 4 un des traitements ci-dessus. la lettre « M » (pour mineure) et « 0 » (pas de traitement). Étiqueter la quatrième gélose avec votre nom. 3. 7. Cette gélose sera celle sur laquelle vous étalerez des échantillons de votre autre main (celle que vous utilisez le moins souvent) 5. Répéter les étapes 3 et 4 pour votre main dominante et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D0‖. Échantillonner la paume de votre main dominante telle que précédemment et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D1‖. Après votre échantillonnage initial. la lettre « D » et le numéro du traitement (0. puis échantillonner la paume de votre main dominante telle que précédemment et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D2‖. Chaque personne devra obtenir 4 géloses de chocolat. Étiqueter trois des géloses avec votre nom. 1 et 2). 9. Incuber les géloses inverses à 37oC. 10. Nettoyer avec l’écouvillon humecté autant de la surface de la paume de votre main mineure (votre main gauche si vous êtes droitier). Étaler sur toute la surface de la gélose étiquetée ―M0‖ avec cet échantillonnage. Humecter un écouvillon stérile avec un peu d’eau stérile. Savon naturel (glycérine). lavez vos mains pour deux minutes avec le traitement assigné. 6.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Savon assigné: Purell.

Utiliser les données du tableau ci-dessous afin de déterminer la susceptibilité de chacune des bactéries.ANTIBIOTIQUES ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER Obtenir les diamètres des zones d’inhibitions pour chacun des antibiotiques avec chacune des cultures bactériennes testées. I = mm étendue AMC R = mm ou moins 19 S = mm ou plus 20 AMC 13 14-17 18 Ampicilline (Staph) AM 28 Ampicilline (autre bactéries) AM 11 12-13 14 Carbénicilline (Pseudomonas) CB 13 14-16 17 Carbénicilline (autres bactéries) CB 17 18-22 23 Céfoxatime CTX 14 Céphalothin CF 14 15-17 18 Chloramphénicol C 12 13-17 18 Érythromycine E 13 14-22 23 GM 12 13-14 15 M (or DP) 9 10-13 14 Pénicilline P 28 Streptomycine S 11 12-14 15 SXT-TMP 10 11-15 16 TE 14 15-18 19 Agent antimicrobien CODE Amoxicilline (Staph) Amoxicilline (autres bactéries) Gentamycine Méthicilline (Staph) Sulfamethoxazole-trimethoprim Tétracycline 74 29 23 29 .Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS .

2. Incuber jusqu’a demain à 37oC. Étiqueter chaque tube avec la concentration d'antibiotique à laquelle aucune croissance n'a été observée. La méthode utilisée est la même que celle utilisée pour la détermination du CMI sauf que des sous-cultures sont préparées à partir des essais du CMI pour lesquels aucune croissance n'a été observée. Ensemencer chaque tube avec 0. 4. il faut avoir recours à la détermination du CMB. Croissance CMI Pas de Croissance Inoculation à partir du CMI dans du milieu dépourvu d’antimicrobien Matériaux Essai de CMI fait précédemment Tubes contenant 5ml de TSB CMB Méthode 1. Pour ce faire. Obtenir un tube contenant 5 ml de bouillon TSB pour chaque concentration à laquelle aucune croissance n'a été observée dans l'expérience de la détermination du CMI. 3. dans du bouillon de croissance dépourvu d’antibiotiques: La concentration d'antibiotique pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est réchappée représente la CMB.Labo de Microbiologie-2012 DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE Puisque la plupart des antibiotiques sont bactériostatiques à de faibles concentrations. Déterminer la plus basse concentration d'antibiotique où la croissance bactérienne ne pouvait pas être réchappée. 5. il n'est pas possible de déterminer par le CMI la dose à laquelle un antibiotique bactéricide a une efficacité maximale. 75 .1 ml du bouillon de culture qui correspond aux tubes d’essais du CMI où aucune croissance n'a été observée.

Donc. afin de répondre aux questions pertinente dans votre devoir. 76 . puis tracer le contour sans inclure la région de votre poignet. vous allez vouloir déterminer la superficie approximative de la paume de vos mains.Labo de Microbiologie-2012 L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS 1. coli est 1 minute. Les valeurs D sont influencées par l’espèce bactérienne. Tout comme pour la croissance bactérienne. Une feuille de papier standard (8po X 11po) possède une superficie d’approximativement 603 cm2. si la valeur D d’E. ceci indique qu’une exposition d’une minute est requise pour réduire la population bactérienne de 90%. Déterminez la relation entre le poids et la superficie. En premier lieu. Ensuite. ainsi que les conditions dans lesquelles elles se retrouvent. s’appelle la valeur D. pour réduire une population de 1 x 106 à 1 x 104 cellules d’E. Le temps de réduction décimale. la mortalité survient de façon exponentielle. les spores sont particulièrement résistant. Après avoir déterminé le poids de la feuille. De telles fonctions sont utiles pour déterminer le temps minimal requis pour réduire une population microbienne sous un seuil néfaste. coli cela prendrait 2D se qui équivaut à 2 minutes. paume vers le bas. 2. 3. des fonctions mathématiques qui décrivent le profil de la mort cellulaire sous une condition donnée ont été formulées. placer votre main. qui représente la durée de temps sous de conditions donnée nécessaire pour réduire une population de microorganismes par une valeur de un log ou de 90%. Déterminer le nombre d’UFC sur chacune des géloses et enregistrer vos données comme suit dans le chiffrier Excel au podium: Genre Traitement Superficie de la main dominante UFC D0 D1 D2 M CINÉTIQUE DE MORTALITÉ Différents microorganismes possèdent des susceptibilités variées aux traitements Par exemple. leur forme. En autres mots. la valeur D pour des spores est habituellement beaucoup plus élevée que celle de cellules végétatives. sur une feuille de papier tel qu’illustré. découpez le profil de votre main et déterminez son poids. Donc. Par exemple. déterminez le poids de la feuille de papier. Lire l’article de recherche disponible sur la page web de ce cours sous la rubrique Devoirs. puis utilisez cette même relation afin de déterminer la superficie approximative de votre paume. Pour ce faire.

Ajouter 0. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme. 2. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 6. Transférer 0. Mélanger au vortex afin de vous assurer que le glycérol est dispersé uniformément. 4.Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 5) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 3. 77 .15 ml de glycérol stérile (15%. v/v). 5.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression.

Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 7
MICROBIOLOGIE DE L’EAU ET DES ALIMENTS

Jour 1
QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU (Groupe de 2)
L'importance de l'approvisionnement en eau potable (buvable) ne peut pas être surestimée. Avec
l'industrialisation croissante, les sources d'eau disponibles pour la consommation et les loisirs ont
été corrompues par des déchets industriels ainsi que de source animale et humaine. En
conséquence, l'eau est devenue un formidable facteur de transmission de maladies. Les eaux
polluées contiennent de grandes quantités de matière organique qui sont d'excellentes sources
nutritionnelles pour la croissance et la multiplication des micro-organismes. La présence et le
nombre de bactéries coliformes, des bactéries qui sont normalement résidents de l'intestin des
mammifères, et d'autres organismes entériques dans l'eau est un signe de contamination fécale et
peut suggérer la présence d'agents pathogènes. Ces agents pathogènes sont responsables
d'infections intestinales telles que la dysenterie bacillaire, la fièvre typhoïde, le choléra et la
fièvre paratyphoïde. L'analyse des échantillons d'eau sur une base routinière ne serait pas
possible si la détection de chacun des pathogènes était requise. Par conséquent, l'eau est
examinée pour détecter les micro-organismes indicateurs tels qu’Escherichia coli. Il convient de
souligner que la présence de bactéries indicatrices ne signifie pas que l'eau contient des microorganismes pathogènes, mais plutôt que le potentiel existe pour la présence de pathogènes
puisque les bactéries indicatrices signalent la présence de matières fécales dans l'échantillon.
Des méthodes qualitatives et quantitatives sont utilisées pour déterminer l'état sanitaire de l'eau.
La contamination de l'eau potable ou des réservoirs d'eau naturels avec ces micro-organismes
indicateurs est une bonne indication de la mauvaise gestion des déchets. Plusieurs microorganismes indicateurs différents sont utilisés pour déterminer le niveau de contamination par
des matières fécales.
MICROORGANISMES INDICATEURS D’UNE CONTAMINATION FÉCALE
Coliformes totaux : des petits bacilles de la famille des Enterobacteriacae qui fermentent le
lactose à 37oC avec formation d’acide et de gaz en 48 heures. Elles incluent des bactéries
résidentes de l’intestin des mammifères et de l’environnement tel qu’Escherichia coli, Klebsiella
sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Serratia sp., Shigella sp., et Proteus sp.
Coliformes fécaux (Escherichia coli): seule bactérie coliforme qui n'est pas retrouvée
naturellement hors de l’environnement intestinal. Sa présence est donc une excellente indication
de contamination fécale. Mais, leurs viabilités réduites en dehors de son environnement naturel
font qu’un test négatif n’est pas nécessairement indicateur d’une absence de contamination
fécale.
Streptococci fécal : Inclus des espèces des Streptococcus et Enterococcus, parmi lesquels
plusieurs ont des origines entériques ou fécales. Ceux-ci ont l’avantage de survivre pour de plus
longues durées dans l’environnement. Par contre, il est difficile de les distinguer des habitants
naturels des sols et des cours d’eau.

78

Labo de Microbiologie-2012
ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES
Les trois tests de base pour détecter les coliformes bactériens de l'eau sont présumés confirmés,
et complétés. Les tests sont effectués de façon séquentielle sur chaque échantillon en cours
d'analyse. Ils détectent la présence de bactéries coliformes (indicateurs de contamination fécale)
qui sont des bacilles Gram négatifs non sporulant qui fermentent le lactose avec production
d'acide et de gaz qui est détectable après une période d'incubation de 48 heures à 37 º C.
TEST DE COLIFORME PRÉSOMPTIF
Détermination du nombre le plus probable de coliformes
But :
1. Évaluer la présence de coliformes dans un échantillon d’eau
2. Obtenir un indice quant au nombre possible d’organismes présents dans l’échantillon sous
analyse
Principe :
Le test présomptif est spécifique pour la détection des bactéries coliformes. Des aliquotes d’eau
mesurées à tester sont ajoutés à un bouillon de fermentation du lactose contenant une fiole
inversé de collecte de gaz (Tube Durham). Puisque ces bactéries sont capables d'utiliser le
lactose comme source de carbone (d'autres organismes entériques ne le sont pas), leur détection
est facilitée par l'utilisation de ce milieu. Des tubes de ce milieu au lactose sont inoculés avec des
aliquotes de 10 ml, 1 ml, et 0,1 ml de l'échantillon d'eau. La série se compose d'au moins trois
groupes, chacun composé de trois tubes du milieu spécifié. Les tubes de chaque groupe sont
ensuite inoculés avec le volume désigné de l'échantillon d'eau. Le développement de gaz dans
l'un des tubes est une présomption de la présence de bactéries coliformes dans l'échantillon. Le
test présomptif permet également au microbiologiste d’estimer le nombre d’organismes présents
au moyen du test du nombre le plus probable (NPP). Le NPP est estimé en déterminant le
nombre de tubes dans chaque groupe qui montrent de l'acide et du gaz suite à la période
d'incubation.
Bouillon Lauryl-trypotose. Ce milieu contient des peptones comme source de carbone et
d'azote ainsi que d'autres nutriments. En outre, ce milieu contient du lactose comme un glucide
fermentescible et du lauryl sulfate de sodium qui inhibe la croissance des organismes autres que
les coliformes. Une fiole inversée est incluse pour détecter l'accumulation de gaz. Un test positif,
l'accumulation de gaz après une période d'incubation de 48 heures à 37 ° C indique la présence
présumée de coliformes.

79

Labo de Microbiologie-2012
Matériaux
Échantillon d’eau
3 bouillons de lauryl sulfate lactose double force
6 bouillons lauryl sulfate lactose force simple
Méthode
1. Étiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate double force "10".
2. Étiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate force simples "0.1" et les trois autres "1".
3. Inoculer les trois tubes à double force avec 10 ml de l’eau à être testée.
4. Inoculer trois des tubes à force simple avec 1 ml de l’eau à être testée.
5. Inoculer trois des tubes à force simple avec 0.1 ml de l’eau à être testée.
6. Incuber tous vos tubes à 37oC.

Inoculums d’eau
0.1 ml

[1X]

[1X]

1.0 ml

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[1X]

Bouillons Lactose

80

[2X]

[2X]

[2X]

2 source de la contamination fécale (humaine vs animale). Matériaux Échantillon d’eau Plaque de Pétrifilm Méthodes 1. Il existe six espèces de streptocoques: S. Ce test représente une variable du compte viable sur des milieux sélectifs et différentiels. S. Les plaques de Pétrifilm sont de minces couches de milieu déshydraté qui possèdent plusieurs avantages comparativement aux géloses conventionnelles. Appliquer 1 ml de l’eau à être testée sur le Pétrifilm tel qu’illustré. gallinarum. 81 . équin. la facilité d'utilisation.Labo de Microbiologie-2012 ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE L’EAU POUR DES COLIFORMES L’essai de Pétrifilm. non sporulantes. S. avium. telles que la confirmation biochimique visuelle. En outre. faecalis. Ces bactéries sont des cocci Gram positifs. 2. 3. puis étendre l’échantillon par le roulement d’une pipette de 10 ml sur la surface. Source Rapport bovis et S.4 généralement plus élevé que pour les coliformes fécaux. Mouton 0.4 Contrairement aux coliformes. anaérobies Homme 4.4 entre leurs nombres (CF / SF) dans un échantillon d'eau est une indication de la Vache 0. Étiqueter et incuber à 37oC. qui fermente le glucose à 37 °C.6 Ils se trouvent principalement dans les excréments des animaux à sang chaud. le rapport Porc 0. ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES FECAUX Les excréments humains et des animaux contiennent un grand nombre de bactéries streptocoques qui peuvent être classées comme appartenant au groupe des streptocoques fécaux.4 facultatifs. S. faecium. Recouvrir de la couche de plastique. le plus petit espace qu'ils occupent et le fait qu'aucune préparation du milieu n'est requise. Canard 0. le nombre de streptocoques fécaux est Poulet 0. catalase négative. S.

Incuber tous vos tubes à 37oC. Étiqueter trois tubes de bouillons SF simple force "0. des aliquotes mesurés de l'eau à tester sont ajoutés à un milieu sélectif (bouillon SF).1 ml de l’eau à être testée. 10. La fermentation du glucose est indiquée par un changement de couleur dans le bouillon. Matériaux Échantillon d’eau 3 bouillons SF double force 6 bouillons SF simple force Méthode 7. Étiqueter trois tubes de bouillons SF double force "10". Comme pour le test présomptif pour les coliformes. 11. 12.0 ml [1X] [1X] [1X] 10 ml [1X] Bouillons SF 82 [2X] [2X] [2X] .Labo de Microbiologie-2012 TEST DES ENTÉROCOQUES Les entérocoques sont un sous-groupe des streptocoques fécaux qui incluent les quatre premières espèces de streptocoques fécaux énumérés ci-dessus. Inoculums d’eau 0. Des méthodes de culture analogues aux tests de coliformes ont été développées pour déterminer la présence et la concentration de ces bactéries dans des échantillons d'eau. Inoculer trois des tubes à simple force avec 0. La croissance de toutes les bactéries cocci Gram négatives et d'autres est inhibée dans ce milieu par l'azote de sodium.1" et les trois autres "1". Inoculer les trois tubes à double force avec 10 ml de l’eau à être testée. 8. Le pourpre de bromocrésol est l'indicateur. Inoculer trois des tubes à simple force avec 1 ml de l’eau à être testée.1 ml [1X] [1X] 1. 9.

y compris les bactéries intestinales. inhibe les bactéries autres que Salmonella. La forte concentration de chlorure de magnésium augmente la pression osmotique. Le faible pH du milieu augmente la sélectivité en inhibant la flore associée. Les espèces de ce genre sont de courts bacilles Gram-positif sporulants qui sont des anaérobies stricts. Une des espèces particulièrement problématiques est Pseudomonas aeruginosa. Ces bactéries contribuent à la détérioration des propriétés organoleptiques des aliments. telle qu’E. et un faible pH. Les infections alimentaires sont le résultat de l’ingestion suivie de la croissance de bactéries pathogènes. La sélectivité est due à la présence du vert de malachite.. Le test du nombre le plus probable (NPP) est particulièrement utile pour la détermination de faibles concentrations de la bactérie Salmonella. 83 . Les œufs. Salmonella sp. En général. et les conséquences pour les êtres humains après la consommation du produit final contaminé dépendent des conditions de transformation des aliments. La nourriture est la principale source de l'infection par Salmonella chez l'homme. Les genres principaux impliqués incluent des membres de la famille des Enterobacteriacae. SALMONELLOSE La salmonellose est l'une des plus importantes maladies d'origine alimentaire et provoque d'importantes charges médicales et économiques à travers le monde. Elles génèrent des odeurs et des arrière-goûts déplaisants. les salmonelles peuvent se multiplier à des niveaux nuisibles dus à des conditions d’entreposage inappropriées. La détection des contaminants alimentaires est faite tout comme avec l'eau. trois échantillons ou cinq répliquas sont préparés à partir de dilutions de facteur 10. Le rapport entre les résultats positifs et négatifs relativement à la concentration permet d’obtenir une valeur NPP/g. Les salmonelles peuvent entrer dans la chaîne alimentaire à tous les stades. tandis qu’une croissance significative est observée à 8 ° C. ovoproduits. Contrairement aux infections alimentaires. les intoxications sont le résultat de l’ingestion de toxines préformées qui peuvent s’accumuler dans les aliments entreposés de façon inadéquate ou pour des périodes prolongées permettant donc la croissance de microorganismes. Salmonella ne croit pas sur la viande de poulet à des températures inférieures à 6°C. Plus tard. et la volaille sont les sources les plus importantes de la salmonellose humaine. une source bien connue de contamination est l'environnement des abattoirs. telle que Listeria et quelques espèces sporulantes de genre Bacillus tel que Bacillus cereus. Les espèces prédominantes responsables appartiennent au genre Clostridium.. Les espèces de cette famille sont des petits bacilles Gram négatifs aérobies stricts. Les microorganismes provoquant l’autolyse appartiennent principalement à la famille des Pseudomonaceae.Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS (Groupe de 2) Les bactéries dans les aliments contribuent à la détérioration (autolyse) des aliments et aux maladies. coli. et Shigella sp. et quelques genres Gram positifs non sporulants de la famille des Listeriaceae. et en combinaison avec le vert de malachite. altèrent la texture et peuvent causer une décoloration. Dans ce cas-ci. Le bouillon de Rappaport-Vassiliadis Est un milieu sélectif utilisé pour l'enrichissement des espèces de Salmonella. Des tests qualitatifs et quantitatifs fondés sur l'utilisation de milieux sélectifs et différentiels sont faits. Les maladies alimentaires peuvent être regroupées en deux classes: Les infections alimentaires et les intoxications alimentaires. Par exemple. une pression osmotique élevée.

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Pilon de poulet frais avec la peau dans un sac « Ziploc » (Goupes pair) Pilon de poulet avec la peau entreposé au frigidaire pour 7 jours dans un sac « Ziploc » (Groupes impairs) 3 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis double force 6 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis simple force Méthode Préparation de l’échantillon 1.0 ml 0. Mélanger en berçant et en massant le poulet pour 5 minutes. 3. 2. Récolter et transférer autant de la solution de lavage à un tube Falcon stérile. NPP 1.1 ml [1X] [1X] [1X] [1X] [1X] [1X] 10 ml [2X] Bouillons de Rappaport-Vassiliadis 84 [2X] [2X] . Ajouter 2 ml d’eau par gramme de poulet dans le sac. Peser et enregistrer le poids de votre échantillon de poulet dans le sac. Inoculer les bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis avec la solution de lavage tel qu’illustré ci-dessous : Inoculums de la solution de lavage1. 4.

Préparer des dilutions en série de facteurs 10 (100-10-4) dans de la saline physiologique de la solution de lavage du poulet préparé précédemment. L'infection par ces bactéries conduit à la libération d'endotoxine (une substance toxique associée à la paroi cellulaire bactérienne) provoquant une inflammation des tissus et des gastro-entérites. tandis que les non-fermenteurs sont blancs. 2. Salmonella. Legionella. 3. coli. La détermination du nombre d’hétérotrophes aérobies Gram négatifs est habituellement effectuée sur des géloses MacConkey.1ml de chaque dilution sur des géloses MacConkey étiquetées de façon appropriée. Stenotrophomonas. Pseudomonas. et 10-5 de chacun des échantillons de bioremédiations entreposés. un milieu sélectif et différentiel qui contient du lactose et des protéines en tant que sources potentielles de carbone.1ml de chaque dilution de chacun des échantillons sur des géloses TSA étiquetées de façon appropriée. et bien d'autres. 3. 10-3. La plupart des pathogènes d'origine alimentaire appartiennent au groupe appelé Proteobacteria qui comprend plusieurs agents pathogènes potentiels tels qu’E. 85 . Incuber à 28oC. Préparer les dilutions 10-1. Incuber à 370C BIOREMÉDIATION (Partie 6a) Matériaux Échantillons de bioremédiation entreposés 12 Géloses Eau stérile Méthode 1.Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES Il ya de nombreux groupes de bactéries Gram négatives dont la plupart ne sont pas pathogènes. 2. Vos plaques devraient être étiquetées avec votre numéro de groupe et la date d’échantillonnage. Helicobacter. Étaler 0. Les bactéries qui fermentent le lactose sont de couleur rose. La propriété différentielle de ce milieu permet de discriminer la fermentation du lactose par l'addition d'un indicateur de pH. Moraxella. La sélectivité de ce milieu est due à l'inclusion du cristal violet qui inhibe la croissance des organismes Gram positifs et des levures. Matériaux Solution de lavage du poulet frais (Groupes pairs) Solution de lavage du poulet entreposé au réfrigérateur pour 7 jours (Groupes impairs) 75 ml saline physiologique stérile 5 tubes stériles 5 Géloses MacConkey Méthode 1. Étaler 0.

. 4. 86 . Indice NPP pour Différentes Combinaisons de Résultats dans les Essais Présomptifs: Nombre de tubes avec une réaction positive: 3 de 10 ml chacun 3 de 1 ml chacun 3 de 0.400 Source: Standard methods for the examination of water and waste water.1 ml chacun 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 1 1 2 2 0 2 2 1 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 Indice NPP par 100 ml <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1. Pour chacun des essais. 1971. Obtenir les données pour les quatre échantillons d’eaux distribuées dans la classe. déterminer le nombre de tubes sur trois (pour chaque jeu de 3) qui sont positifs pour l’organisme étant testé. Utiliser le tableau ci-dessous pour déterminer le NPP/100 ml pour chaque microorganisme.100 >2. American public health association. Récolter tous vos tubes pour les essais présomptifs. New York. 13th ed. Bouillon Lauryl sulfate: Présence de gaz (>10%) Bouillon SF : Production d’acide 3. 2.Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU ESSAIS QUALITATIFS DE L'EAU 1.

Labo de Microbiologie-2012 TEST DE COLIFORME CONFIRMÉ La présence d'un test présomptif positif suggère immédiatement que l'échantillon d'eau est non potable. 3. Les bactéries Gram positives sont inhibées sur ce milieu par le sulfate de lauryl et le désoxycholate. Une personne de chaque groupe devra se présenter au temps désigné afin d’obtenir les résultats. La confirmation de ces résultats est nécessaire. Déterminer le nombre/ml de coliformes (colonies rouges ou bleu avec gaz) ainsi que le nombre d’E. STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU EN ONTARIO Bactéries coliformes totales: Escherichia coli: Streptoccoci fécaux: Eaux potables 0/100ml 0/100ml 0/100ml 87 Eaux récréatives 100/100ml 100/100ml S. étant donné que les tests positifs présomptifs peuvent être le résultat d'organismes d'origine non-coliformes qui ne sont pas reconnus comme des indicateurs de pollution fécale. Les colonies des coliformes sont donc rouges avec un éclat métallique typique. Obtenir les données pour les quatre échantillons d’eaux distribuées dans la classe. Les fermenteurs du lactose produisent des aldéhydes qui réagissent avec le réactif de Schiff (fuchsine basique et le sulfite de sodium) pour donner des zones rouges autour des colonies. ESSAIS QUANTITATIFS (ESSAI DE PETRIFILM) 1.coli (colonies bleues avec gaz) 2. Le test a confirmé exige que des milieux sélectifs et différentiels tels que l'agar endo soient striés à partir d'un bouillon de lactose positif. . Faire des stries pour colonies simples à partir de tous les bouillons de lauryl sulfate positifs.O. Enregistrer le nombre de tubes confirmé à l’ordinateur au podium. Incuber à 37oC pour 24 heures. Méthode 1. 2.

Déterminer le nombre de bactéries qui fermentent le lactose/g de poulet. du citrate de sodium et du vert brillant inhibent les bactéries Gram positives et la majorité des bactéries coliformes. Obtenir les données pour tous les échantillons de poulet distribués dans la classe. 2. Utilisez le tableau à la page 87 afin de déterminer le NPP/g de poulet. ESSAI DE SALMONELLA CONFIRMÉ Comme pour le test de coliformes. une digestion enzymatique de la caséine. Faire des stries pour colonies simples à partir de tous les bouillons positifs de RappaportVassiliadis. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures. 4. et une digestion enzymatique de tissus animaux fournissent des sources d'azote. Déterminer le compte de bactéries Gram négatives/g de poulet. et les vitamines nécessaires à la croissance des organismes. BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES 1. 4. Une personne de chaque groupe devra passer aux temps précisés afin d’obtenir leurs résultats. Le sodium de thiosulfate et du de fer de citrate permettent la détection du sulfure d'hydrogène par la production de colonies avec un centre noir. Le lactose est le glucide présent dans l’agar de Salmonella et Shigella. de carbone. Des sels biliaires. 3. tout en permettant à Salmonella de croître. Obtenir tous vos bouillons de Rappaport-Vassiliadis. 2. De l’extrait de bœuf. Obtenir les données pour tous les échantillons de poulet répartis dans la classe. 3. Déterminer le nombre de bactéries qui ne fermentent pas le lactose/g de poulet. Enregistrer le nombre de tubes confirmés à l'ordinateur podium.Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS SALMONELLOSE: NPP DE SALMONELLA 1. Déterminer le nombre de tubes positifs sur trois (pour chaque jeu de 3) qui montrent de la croissance. 2. 1. la présence de Salmonella doit être confirmée sur un milieu sélectif comme l’agar de Salmonella et Shigella. Non-fermentor Fermentor STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU Coliformes : Escherichia : Salmonella 500 UFC/g 100 UFC/g Pas plus de 5 échantillons positifs parmi 51-échantillons 88 . 3.

si vous n’avez pas obtenu de croissance ou vous n’avez pas fait l’essai en question. Prendre en note si la colonie choisie fermente le lactose ou non. empruntez un échantillon d’un autre groupe 2. 89 . Incuber à 37oC. Faire des stries pour colonies simples sur une gélose TSA d’une colonie obtenue de la gélose MacConkey dont vous avez confirmé que c’est une bactérie Gram négative.Labo de Microbiologie-2012 COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS (Groupes de 2) Matériaux Une gélose TSA Méthode 1. 4. Faire des colorations de Gram et la prise de photos de chacun des échantillons suivants : Un des bouillons positifs de Lauryl-tryptose pour le NPP des coliformes dans l’eau Un des bouillons positifs de SF pour le NPP des Enterococci fécales dans l’eau Un des bouillons positifs de Rappaport-Vassiliadis pour le NPP de Salmonella Une des colonies sur les géloses MacConkey Notez. 3.

Devoir Soumettre une courte proposition de tests que vous utiliserez pour l’identification du genre bactérien isolé. 3. identifier le type de colonie prédominant et faire une coloration de Gram. 4. Faire des stries pour colonies simples du type prédominant de colonie et incuber à 28oC.Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 6b) Matériaux Comptes viables des échantillons de bioremédiations 1 Gélose TSA Méthode 1. Basez-vous sur les organigrammes disponibles sur la page web de ce cours. Celles-ci seront entreposées à 4oC après une période d’incubation de 48 heures. Faire des observations en ce qui a trait aux nombres de différentes morphologies coloniales et leurs nombres relatifs pour chaque temps d’échantillonnage. Obtenir une photo numérique. les tests requis et le nombre requis. Votre proposition ne doit pas dépasser une page. Seulement réquisitionner des tests qui ont été faits précédemment dans ce cours de laboratoire (incluant ceux de la semaine prochaine). Obtenir des comptes de colonies appropriés pour chacun des temps d’échantillonnage de l’essai de bioremédiation. 2. Indiquer dans la section des matériaux. 90 . À partir du dernier temps d’échantillonnage. Votre proposition doit inclure un organigramme clair qui démontre les résultats attendus et le procédé d’identification.

les Pseudomonaceae sont des bacilles Gram négatifs non-fermenteurs. mais variant énormément quant à leurs caractéristiques biochimiques Les Pseudomonaceae Contrairement aux Enterobacteriaceae. 2. Plusieurs font partie de la flore naturelle du tractus intestinal des humains et des animaux. gonorrhoeae (agent de la gonorrhée) et N.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO8 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES Jour 1 Les Enterobacteriaceae Les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae sont parmi les microorganismes le plus souvent retrouvés dans les spécimens cliniques. Ce sont des bâtonnets Gram négatifs Ce sont des anaérobies facultatifs Ils sont oxydase négative Ils fermentent tous le glucose. Les Nesseriaceae Cette famille inclut les genres Neisseria et Moraxella des organismes non motiles. Les membres de cette famille ont les quatre caractéristiques suivantes en communs: 1. 4. Les membres de cette famille sont tous oxydase-positifs — un test biochimique clé pour l’identification de cette famille. Ils peuvent causer des infections chez l’humain quand ils colonisent des individus immunodéprimés ou obtiennent accès à l’intérieur du corps suite à un traumatisme. 3. Les Enterobacteriaceae représentent une grande famille diverse qu’on appelle communément les bacilles Gram négatifs entériques fermenteurs. indiquant qu’ils sont des bâtonnets Gram négatifs qui fermentent les sucres. Le plus commun des bacilles Gram négatifs non-fermenteur qui cause des infections chez les humains est Pseudomonas aeruginosa. 91 . Les bacilles Gram négatifs non-fermenteurs sont des résidents naturels des sols et des eaux. Le genre Neisseria inclut plusieurs espèces saprophytiques qui se retrouvent dans la flore naturelle des membranes muqueuses des tractus respiratoires et génitaux. meningitidis (responsable de méningites). Gram négatifs diplocoques. Certains infectent le tractus intestinal. Deux espèces pathogènes sont: N.

Strier vos deux bactéries sur des pentes de citrate de Simmons et incuber à 37oC. 3. Prendre en note la coloration de Gram. la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire. Strier vos deux bactéries sur des pentes d'urées et incuber à 37°C.Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIQUE D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS (Groupes de 2) Dans l’exercice suivant. Faire le test d’oxydase sur les géloses de l’inconnu que vous avez isolé. Matériaux Bouillon de culture TSB d’une bactérie Gram négative oxydase négative connue Colonies simples sur gélose TSA d’un inconnu Gram négatif isolé la semaine précédente 2 géloses MacConkey 2 pentes de citrate de Simmons 2 pentes d’urée 2 pentes TSI 2 tubes profonds SIM 2 bouillons de décarboxylase dépourvus d’acides aminés 2 bouillons de décarboxylase avec ornithine 2 bouillons de décarboxylase avec lysine Une Bande API Méthodes Faire tous les tests suivants avec chacune de vos 2 bactéries Gram négatives COLORATION DE GRAM 1. 92 . URÉASE 1. Faire la prise de photos pour vos rapports. L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE 1. CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY 1. on vous demandera d’identifier un inconnu Gram négatif que vous avez isolé la semaine passée ainsi que de confirmer l’identité d’un inconnu Gram négatif qui vous sera fourni. Faire une coloration de Gram de chacune des bactéries. 2. Faire des stries pour colonies simples de vos deux bactéries sur des géloses MacConkey et incuber à 37oC. OXYDASE 1.

générant des produits alcalins. et des protéines. le lactose. générant un précipité noir. En sortant. le sucrose. le glucose est limitant (0. Puisque les Enterobacteriaceae peuvent tous métaboliser le glucose. Incuber à 37oC. Bout 93 . En plus de permettre la distinction entre la fermentation de différents sucres. L'utilisation de sucre par un mode de fermentation donne lieu à une réaction acide. Introduire la boucle d’inoculation Pente jusqu’au fond du milieu dans le bout. La hausse de pH résultante changera le milieu à une couleur neutre ou alcaline (orange ou rouge respectivement). Il contient quatre différentes sources de carbones potentielles. strier la surface de la pente. dont le glucose. son métabolisme rend le milieu initialement acide (jaune). une des autres sources de carbone devra être utilisée. les acides produits feront que le milieu demeurera acide (jaune). créant ainsi des conditions d’aérobies et d’anaérobies. tel que la méthionine et la cystéine. tandis que la portion interne est plutôt anaérobie. (Voir l’image) 2. suite à l’épuisement du glucose. Si le sucrose et le lactose ne peuvent pas être utilisés.Labo de Microbiologie-2012 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) Ce milieu de croissance est couramment utilisé pour l'identification préliminaire de membres de la famille des Enterobacteriacae. Parmi les trois sucres. tandis que l'oxydation de protéines génère une réaction alcaline. Par contre. le milieu de croissance TSI permet de déterminer si une bactérie peut dégrader des acides aminés qui possèdent un groupement sulfhydrile. Le milieu est pourvu sous forme de pente. 1. Pour une croissance continue. la source de carbone qui sera métabolisée sera donc les protéines. La surface de la pente est essentiellement aérobie. Inoculer la surface et le bout de pentes TSI avec vos deux bactéries. favorisant ainsi la fermentation.1%) tandis que le sucrose et le lactose sont en excès (1. La présence d'un indicateur de pH permet de distinguer entre l'utilisation des sucres et des protéines. si le sucrose et/ou le lactose peuvent être utilisés en anaérobies.0%). La dégradation de ces acides aminés génère du sulfure d'hydrogène qui réagit avec le sulfate ferreux.

qui change la couleur de l’indicateur du mauve au violet. Ces derniers causent une hausse du pH. l’ornithine ou la lysine. D’INDOLE ET LA MOTILITÉ PRODUCTION DE H2S Tout comme avec le milieu TSI. Ces conditions acides permettent de stimuler l’activité des décarboxylases. 2. La production d'indole peut être décelée par sa réaction avec le réactif dimethylaminobenaldehyde (réactif de Kovacs). 3. la dégradation d’acides amines à base de soufre peut être déterminée par la production d’un précipité noir. 2. 94 . Obtenir des tubes de milieu SIM solide. Cette caractéristique peut être observée par l'inoculation de milieux semi-solides. Incuber à 37oC. LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE Le milieu utilisé pour vérifier la présence de différentes décarboxylases d’acides aminés contient du glucose. Incuber à 37oC. 4. l'indole. L'acide pyruvique est utilisé comme source de carbone. 1. et l’acide aminé désiré. le milieu demeure acide (jaune). Utiliser une aiguille d’inoculation pour inoculer chacune de vos bactéries jusqu’au bas du tube le long d’une ligne droite. Recouvrir tous les bouillons d’huile minérale pour créer des conditions d’anaérobies. L’acide produit par la fermentation du glucose réduit le pH du milieu et change la couleur de l’indicateur de pH du mauve au jaune. Inoculer des bouillons de décarboxylase contenant de l’ornithine avec chacune de vos bactéries. 3. source de carbone fermentable. tandis que la décarboxylation de l’ornithine génère de la putrescine. tandis que les bactéries motiles démontrent une croissance qui s'étend au-delà de la région d'inoculation. et l'acide pyruvique. Inoculer des bouillons de décarboxylase contenant de la lysine avec chacune de vos bactéries.Labo de Microbiologie-2012 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE. Les bactéries non motiles croissent seulement dans la région qui est inoculée. La dégradation du tryptophane génère un sous-produit. 1. 5. La décarboxylation de la lysine génère de la cadavérine. tandis que l'indole est excrété dans le milieu en tant que déchet. Si l’organisme ne produit pas l’enzyme appropriée. Inoculer des bouillons du milieu de décarboxylase dépourvu d’acide amine avec chacune de vos bactéries. MOTILITÉ Certains microorganismes possèdent la capacité de se mouvoir à l'aide de flagelles. PRODUCTION D'INDOLE SUITE À LA DÉGRADATION DU TRYPTOPHANE Un autre acide aminé qui peut être utilisé comme source de carbone par certains microorganismes est le tryptophane.

Cette animation est disponible sur le site web de ce cours : suivre le lien pour API.Labo de Microbiologie-2012 API 20E SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE Cette bande test API-20E (de bioMerieux. 9. Placer la bande dans ce réservoir du bas. Puits ou cupule Ligne de remplissage pour la majorité des puits ou cupule 4. Inoculer la bande API 1. Remplir le bas de la chambre avec juste assez d’eau pour remplir les indentations. 7. Inc. Ceci devrait prévenir la formation de bulles dans les puits. [VP] et [GEL]. D’autres produisent des sous produits qui doivent être identifiés avec des réactifs. Incuber la bande dans sa chambre 6.) qui est utilisée pour identifier les bacilles Gram négatifs entériques possède 20 compartiments de test déshydraté séparés. 5. Toucher l’extrémité de la pipette sur le côté de la cupule permettant au fluide de pénétrer dans le puits par l’action capillaire tout en appliquant une pression légère sur le bulbe. Une suspension bactérienne est utilisée pour réhydrater chacun des puits. Certains des puits auront des changements de couleur résultants des différences de pH. 8. Placer la bande à 37o C. LDC. 95 . Placer le dessus de la chambre d’incubation sur le bas et étiquetée là. ODC. vous allez maintenant inoculer la suspension bactérienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur stérile. En tenant la bande à un léger angle avec le dessus de la table. Suite à l’inoculation. H2S et URE avec de l’huile minérale. remplir complètement la section de la cupule des microtubes ADH. Voir l’animation pour une description du procédé décrit ci-dessous. Chaque puits doit être rempli jusqu’au cou (voir diagramme). Préparer une dilution de 1/10 de la culture bactérienne dans de la saline physiologique. Méthode (Ce test est à être fait seulement avec la bactérie Gram négative connue qui vous a été fournie) 1. 3. Remplir le tube et la section de la cupule des tubes [CIT]. 2.

2. Faire des stries pour colonies simples pour une deuxième fois et incuber à 28oC. Faire une coloration de Gram sur votre isolation de colonies simples et obtenir une photo numérique.Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 7a) Matériaux Stries pour colonies simples d’OEM 1 gélose TSA Méthode 1. 96 .

97 Negatif Positif Negatif Positif .Labo de Microbiologie-2012 Jour 2 CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY Examiner la croissance sur votre gélose MacConkey afin de déterminer si vos bactéries fermentent le lactose. UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE Examiner vos pentes de citrate de Simmons afin de déterminer si vos bactéries peuvent utiliser le citrate en tant que source de carbone. Fermenter Non Fermenter URÉASE Examiner vos pentes d’urée afin de déterminer si vos bactéries peuvent utiliser l'urée en tant que source de carbone.

Labo de Microbiologie-2012 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) Faire l’analyse de vos pentes TSI afin d’obtenir les données suivantes : Quelle est la réaction de pente : acide. B. C = alcalin 98 . C. D. est-elle produite sous aérobie. B C D Bout et pente acide + accumulation de gaz Pente alcaline et bout acide Bout acide et pente alcaline + H2S en anaérobie Pente alcaline et bout neutre Observations typiques en milieu TSI de bactéries de la famille des Enterobacteriaceae Réactions TSI Bactérie Bout Pente H2 S Gaz Enterobacter A A + Escherichia A A + Klebsiella A A + Proteus mirabilis A C + + Proteus vulgaris A A/C + + Morganella A C + Serratia A C Shigella A A Salmonella A K + A= acide. alcaline ou neutre Est qu’il y a production de H2S o Si oui. alcaline ou neutre Quelle est la réaction bout : acide. anaérobie ou les deux Est-ce qu’il y a accumulation de gaz A A.

B C D Motile +H2S Motile + Indole Non-motile Aucune croissance Résultats typiques Microorganismes Escherichia Enterobacter Citrobacter Klebsiella Salmonella Shigella Prot. vulgaris Prot. mirabilis Morganella Serratia H2S + + + + - 99 Indole + +/+ + - Motilité +/+ + + + + + + . B. le réactif devient rouge A A. Si de l’indole a été produit. D’INDOLE ET LA MOTILITÉ Faire l’analyse de vos tubes profonds de milieu SIM afin d’obtenir les données suivantes : Vos bactéries sont-elles motiles Est qu’il y a production de H2S Le tryptophane est-il utilisé comme source de carbone o Est-ce qu’il y a production d’indole? Afin d’obtenir ce résultat.Labo de Microbiologie-2012 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE. C. ajoutez quelques gouttes du réactif de Kovacs. D.

Labo de Microbiologie-2012 LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE LDB : Milieu avec acide aminé (ornithine ou lysine) DCB : Milieu sans acide aminé 1. mais réaction acide sans acide aminé 3. Résultat négatif : Réaction alcaline avec et sans acide aminé 2. Résultat positif : Réaction alcaline avec acide aminé. Résultat négatif : Réaction acide avec ou sans acide aminé 100 .

) VP Na pyruvate production d’acétoine incolore rose/rouge(10 min.Labo de Microbiologie-2012 SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE API 20E Interprétation 1. TESTS SUBSTRAT REACTION TESTÉ RESULTATS - RESULTATS + ONPG ONPG bêta-galactosidase incolore jaune ADH arginine arginine dihydrolase jaune rouge/orange LDC lysine lysine décarboxylase jaune rouge/orange ODC ornithine ornithine décarboxylase jaune rouge/orange CIT citrate utilisation de citrate Vert pâle/ jaune bleu/bleu-vert H2S Na thiosulfate production d’H2S incolore/gris dépôt noir URE urée hydrolyse d’urée jaune rouge/orange TDA tryptophane déaminase jaune brun-rouge IND Tryptophane production d’indole jaune rouge (2 min.) GEL charbon gélatine gélatinase GLU glucose fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune MAN mannitol fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune INO inositol fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune SOR sorbitol fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune RHA rhamnose fermentation/oxydation bleu/bleu-vert jaune SAC sucrose fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune MEL melibiose fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune AMY amygdalin fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune ARA arabinose fermentation/oxydation bleu/bleu vert jaune OX oxydase oxydase violet Pas de diffusion du noir Noir diffus incolore/jaune 101 . sans l’ajout de réactifs. tel que dans le tableau. 3. Faire la lecture de tous les autres tests. Noter les résultats et comparer les réactions positives avec le tableau de différentiation. Ajouter les réactifs appropriés aux compartiments o 1 goutte de Kovac's au IND (faire la lecture dans les minutes qui suivent) o 1 goutte de 40% KOH et alpha-naphtol au VP (une réaction positive peut prendre jusqu'à 10 minutes) o 1 goutte de FeCl3 au TDA 2.

102 .Labo de Microbiologie-2012 GÉNÉRER LE NUMÉRO DE PROFIL En lisant la bande. Faire la somme de toutes les réactions positives dans chaque bloc de trois tests et inscrire la valeur dans la boîte du bas. Vous aurez besoin des résultats pour la réaction d’oxydase pour le dernier numéro (suit le panneau de fermentation des hydrates de carbone). Voir l’exemple ci-dessous : Enregistrer votre numéro de profil sur l’ordinateur au podium. Le formulaire a des lignes verticales plus foncées qui divisent les sept sections. inscrire + ou – sur le formulaire du rapport.

Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section. Vous devriez trouver de l’information sur leurs caractéristiques générales. Un organigramme serait une bonne idée pour cette section. Introduction: Cette section devrait traiter des raisons que l’isolation et l’identification d’organismes bactériens sont importantes. Après la période d’incubation. Résultats: Présenter les tests qui ont été faits. Inoculer 5ml de TSB et mettre le bouillon à l’endroit désigné pour une incubation à 28oC pour 48 heures. Présentez comment certains ou tous les résultats obtenus ont permis d’identifier l’organisme inconnu. Faire une coloration de Gram sur votre isolation pour colonies simples et obtenir une photo numérique. importance Clinique et traitement. impacte environnementales (s’il y en a) utilités. physiologie. les bouillons de culture seront entreposés à 4oC. Discussion: Dans cette section vous devez écrire (environ une page pour chaque organisme) une description détaillée de l’organisme identifié. 103 . ainsi que les techniques générales qui sont utilisées a cette fin (non seulement celle vue en labo). C. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit : A. quelles observations ont été faites et leurs interprétations respectives. BIOREMÉDIATION (Partie 7b) Matériaux Isolation pour colonies simples d’OEM 1 bouillon TSB (5ml) Méthode 1. Titre et les noms des auteurs B. D. E. Références: Lister toutes les références utilisées d’après le style recommandé par le « Journal of Bacteriology ». 2.Labo de Microbiologie-2012 RAPPORT SUR L’IDENTIFICATION D’INCONNUS BACTÉRIENS Chaque personne ou équipe de deux doit rédiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs résultats.

Techniquement. cette procédure est faite comme suit : premièrement. les bactéries strictement intracellulaires. La première composante dépend d’anticorps qui peuvent reconnaître de façon spécifique et lier l’agent qu’on désire déceler. l’antigène et l’anticorps auquel il est lié sont maintenant immobilisés sur le support solide. Elle inclut des méthodes indirectes fondées sur la recherche dans le sérum d’un patient d’anticorps spécifiques contre l’agent microbien. particulièrement les virus. Ce deuxième anticorps possède une enzyme qui lui est liée. Ces méthodes diagnostics sont essentielles pour le diagnostic d’infections par des microorganismes qui sont difficiles à identifier ou dont la croissance en laboratoire est difficile ou même impossible. Donc. Plusieurs méthodes immunologiques sont utilisées à cette fin. l’anticorps primaire. ELISA Cet essai représente un système à deux composantes. si l’anticorps primaire a été immobilisé par sa liaison à l’antigène. le deuxième anticorps et l’enzyme liée à celui-ci seront aussi immobilisés. tous deux. Le but est ensuite de déterminer s’il y a des anticorps spécifiques à l’antigène qui sont liés. et les bactéries intracellulaires facultatives. un parasite ou un champignon responsable de la pathologie. les protéines dans l’échantillon (le sérum du patient) qui inclut l’agent à être décelé sont fixées sur une matrice solide telle que le plastique. Le plus commun de ces tests et l’essai immunoabsorbant d’enzyme liée communément connu sous l’appellation d’ELISA. Si la matrice a des antigènes qui y sont liés. Dans l’exercice suivant. La deuxième composante dépend d’une enzyme conjuguée à un deuxième anticorps qui génèrera un produit coloré. quelques anticorps se lieront à l’antigène qui est lié à la matrice.Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 9 HÉMATOLOGIE/ SÉROLOGIE Jour 1 SÉROLOGIE MICROBIENNE (Groupes de 2) Une des méthodes de laboratoire utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses humaines est la sérologie microbienne. La détection de l’anticorps spécifique à l’antigène est faite à l’aide d’un anticorps secondaire (l’anticorps détecteur) qui reconnait de façon spécifique la région constante du premier anticorps. Un substrat incolore est ensuite ajouté qui peut être clivé par l’enzyme qui est lié à l’anticorps secondaire. Des anticorps qui peuvent spécifiquement reconnaître et lié l’agent d’intérêt sont ensuite ajoutés. Le produit du clivage enzymatique du substrat est coloré et peut donc être quantifié avec un spectrophotomètre. vous ferrez un ELISA direct afin de détecter la présence d’un agent infectieux (l’antigène). viral. la sérologie microbienne à pour but de déceler dans le sérum du patient une réaction antigène : où l’antigène est représenté par le microorganisme entier ou une partie de ce dernier et l’anticorps est représenté par des immunoglobulines spécifiques à l’agent microbien infectieux. La quantité de couleur qui est décelée est directement proportionnelle à la quantité d’enzyme qui a été immobilisée. Il existe aussi des méthodes directes qui utilisent des anticorps afin de détecter le microorganisme d’intérêt. 104 . qu’il soit bactérien. Brièvement. Donc. Il y a plusieurs variantes de l’ELISA.

Étape 3: Liaison de l’anticorps secondaire auquel une enzyme est liée.Labo de Microbiologie-2012 Étape 1: Liaison de l’antigène au support solide. Étape 4: Conversion du substrat incolore en un produit coloré. Étape 2: Liaison de l’anticorps primaire. 105 .

Utiliser la pissette de solution de lavage pour laver les puits. puis diviser l’échantillon de façon égale entre vous. Après avoir lavé les puits trois fois.2 ml Micropipette de 1 ml Méthode Propagation de l’agent infectieux 1. 8. 106 . 7. Une fois les lavages complétés.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Tube de fluides corporels inconnu Fluides corporels positifs Fluides corporels négatifs Pissette de solution de lavage (PBS) Anticorps primaire (IgG de mouton anti . Transférer 50 µL des fluides partagés dans chacun de trois puits d’une plaque d’ELISA. prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour cette troisième ronde. transférer la totalité du contenu du tube de vos fluides corporels inconnu (approx. Afin de complètement vider les puits. Laissez la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. Pour faire le partage.IgG de mouton Substrat pour peroxydase Plaque de 96 puits Micropipette de 0. chaque groupe partagera leurs fluides corporels avec ceux d’un autre groupe sur une autre table. Transférer 50 µL du témoin négatif dans chacun de trois différents puits d’une plaque d’ELISA. Prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour la première ronde. on vous demandera de répéter le processus en partageant avec un autre groupe. frapper la plaque contre le côté de l’évier. 2. 4.N. 3. Répéter l'étape de lavage deux fois de plus. on vous demandera de répéter le processus en partageant avec un autre groupe. 2. Après que tout le monde aura fini avec la deuxième ronde. Encore une fois. Notez le numéro du groupe avec qui vous partagez les fluides ainsi que la ronde du partage. 6. Bien mélanger à l'aide de la micropipette. prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour cette deuxième ronde. puis retirer le tampon de lavage tel qu’indiqué ci-dessus. 3. Après que tout le monde aura fini avec la première ronde. Encore une fois. il ne devrait plus y avoir de liquide dans la plaque. frapper fermement la plaque à l’envers sur des essuietout pour retirer tout fluide résiduel. ELISA 1. 5. Quand on vous indiquera de le faire. 500µL) dans le tube des fluides corporels inconnu du groupe avec lequel vous faites le partage. Transférer 50 µL du témoin positif dans chacun de trois différents puits d’une plaque d’ELISA. gonorrhea) Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (IgG de souris anti . Vider la plaque dans l’évier.

11.-à-d. Faire de même et inscrire un plus ou un moins suivi du numéro de la ronde de partage au coté des trois groupes avec qui vous avez partagé des fluides corporels. Incuber tous les tests (si nécessaire) à 28oC. 2.Labo de Microbiologie-2012 9. Les puis positifs (―infecté‖ et les témoins positifs) tourneront bleu. Dernière étape: Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL du substrat pour la peroxydase à chacun des puits. 13. Les puits négatifs (―non-infecté ‖ et les témoins négatifs) demeureront totalement clairs. et si votre résultat était négatif vous inscririez un symbole moins pour votre groupe et trois autres. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. Pour mon groupe (Groupe 2) Groupes avec qui les partages ont été faits Votre No de groupe Ronde 1 Ronde 2 Ronde 3 +2 +14 +7 +8 -8 -12 -5 -2 BIOREMÉDIATION (Partie 8a) Matériaux Isolation pour colonies simples de l’OEM Bouillon de culture de l’OEM Méthode 1. C. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL de la solution de l’anticorps secondaire. Faire les tests que vous avez proposés pour l’identification du genre de l’OEM’s. Observer les résultats. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. Vider la plaque et faire les lavages tel qu’indiqué aux étapes 6-7 ci-dessus. si votre résultat était positif vous devriez inscrire un plus au coté du numéro de votre groupe ainsi que ceux de trois autres groupes.. Récolte des résultats: À l’ordinateur au podium à l’avant. 10. Ex. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 10 minutes 14. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL de la solution de l’anticorps primaire à chacun des puits. Vider la plaque et faire les lavages tel qu’indiqué aux étapes 6-7 ci-dessus. 12. d’après vos résultats. 107 . inscrire votre numéro de groupe et indiquer un plus (+) ou un moins (-) à ses cotés.

Un nombre anormal de globules rouges représente soit une anémie (nombre sous la normale) ou une polycythémie (nombre plus élevé que la normale). 108 . après quoi le nombre de globules rouges/mm3 est déterminé.Labo de Microbiologie-2012 Jour 1 ou 2 L'HÉMATOLOGIE (Groupes de 2) L'hématologie est un des domaines cliniques qui se préoccupe de l'étude du sang et de ces composantes. Le sang est composé de deux parties : le plasma et les éléments formés. Le volume est donc de 0. Les éléments formés sont les cellules et les fragments cellulaires retrouvés dans le sang. Les cellules contenues dans chacun de trois des carrés étiquetés "R" sont comptées pour en calculer une moyenne. COMPTE DE GLOBULES ROUGES Afin de pouvoir déterminer le compte de globules rouges (GR). La cellule de comptage d'une lame d’hemacytomètre standard possède deux secteurs de comptage identiques burinés dans le verre. Ceux-ci incluent les érythrocytes (globules rouges ou GR). un échantillon du sang est dilué et ensuite appliqué à une cellule de comptage de volume connu d'une lame d'hémacytomètre.1 mm. Lorsque la lame d'hemacytomètre est recouverte d'une lamelle. qui sont constitués de neuf carrés aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm. La capacité du sang de transporter l'oxygène dépend sur la concentration de l'hémoglobine dans les GR ainsi que le nombre de GR dans le sang. qui transportent l'oxygène.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'échantillon à dénombrer est ajouté dans l'hemacytomètre. les leucocytes (globules blancs ou GB) et les plaquettes (fragments cellulaires qui aident à la coagulation). l'espace libre disponible est d’une profondeur de 0. voir la figure). Plus de 99 % des cellules sanguines sont des érythrocytes. les cellules sont visualisées au microscope et énumérées.

Par exemple si l'échantillon de sang a été dilué par un facteur de 1 000. vous devez ensuite multiplier par le facteur de dilution. 109 .Labo de Microbiologie-2012 B B R R R R B B Exemple de calcul Si l'on compte 10. l'on a une moyenne de 10 cellules par carré.2mm X 0. 14 et 6 cellules dans trois carrés indépendants.1mm) ou 10 cellules/0. votre réponse finale serait 2.004 mm3 ou 2500 cellules/mm3 Afin d'obtenir la concentration originale. Ce nombre équivaut à avoir 10 cellules/(0.5 X 106 cellules /mm3.2mm X 0.

5–5. 4.2*106/mm3 – femelles: 4–4. Dans de la saline physiologique. Le pourcentage de la colonne représentée par la fraction des globules rouges est ensuite déterminé.5*106/mm3 L'HÉMATOCRITE Tel que mentionné précédemment. Compter le nombre de GR observées dans chacun de trois carrés (R) indépendants et déterminer le nombre total de cellules dans la suspension originale. est peux varier entre 37 % à 48 %.Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Un échantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4 Saline physiologique de 0. Les cellules représentent la fraction la plus dense. L'hématocrite d'un adulte male est en moyenne 45 %. le sang est composé de deux parties : les éléments formés et le plasma. 3. L'hématocrite est habituellement déterminé suite à la centrifugation d'un tube capillaire remplie de sang. Le plasma constitue un peu plus de la moitié du sang d'un adulte. préparer trois dilutions en série de facteurs 10 du sang. 2. Cette fraction est 90% à 92 % d'eau avec divers soluté qui y sont dissouts.9% (m/v) Lame d'hémacytomètre Pipette pasteur Méthode 1. Ménisque Plasma Globules Blancs Globules Rouges 110 . Appliquer la dilution la plus élevée à la chambre de comptage de l’hémacytomètre. recommencer avec la dilution précédente. Une lecture plus faible indique possiblement une anémie. Le pourcentage d'érythrocytes qui se retrouve dans un volume donné de sang s'appelle l'hématocrite. Si le nombre de cellules est trop petit. Faire la moyenne de votre compte et de celui du groupe en face de vous. Étendues de concentrations normales – males: 4.

Matériaux Un échantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4 Tube capillaire Méthode 1. Remplir par capillarité le tube capillaire de sang. Dans ce cas-ci. Centrifuger dans la centrifuge pour les capillaires pour 15 minutes. En présence d'anémie hémolytique ou macrocytique le VCM peut être plus grand que 100 femtolitres. 5. Le type d'anémie le plus commun se dit normocytique. Calculer le VCM de votre échantillon de sang. Faire la moyenne de votre hématocrite et de celui du groupe en face de vous. La taille moyenne des globules rouges est exprimée en femtolitres (1 femtolitre = 10-15 litres). 4. 3. Mesurer à l'aide d'une règle la hauteur totale de la colonne de fluide ainsi que la hauteur de la colonne de GR.4 dans l'équation. Boucher une des extrémités du tube capillaire avec un peu d'argile. 6. Une déficience en fer cause communément une anémie microcytique. Ce type d'anémie est associé à l'alcoolisme et des déficiences d'acide folique. inscrire 0. le VCM est normal (entre 80-100 fl. dans quel cas le VCM est plus petit que 80 femtolitres. Faire la moyenne de votre VCM et de celui du groupe en face de vous. 2.Labo de Microbiologie-2012 VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) Les valeurs obtenues pour le compte de GR et l'hématocrite peuvent être utilisées pour la détermination du volume cellulaire moyen (VCM) qui est utile pour la discrimination de différents types d'anémies. L'Étendue normale est typiquement 80-100 fl.) mais le nombre de GR est faible. Déterminer l'hématocrite. Il est calculé en divisant le volume des cellules sédimentées (l'hématocrite) par le nombre de GB: VCM = Hématocrite No de GB NOTEZ: si l'hématocrite = 40%. 111 . Une telle anémie peut aussi être observée dans les cas de thalassémie ou suite aux menstruations chez la femme. pas 40.

la leucémie. Matériaux Lame préparée d'un frottis de sang humain Méthode 1. éosinophiles.Labo de Microbiologie-2012 LES LEUCOCYTES Les leucocytes ou GB (globules blancs). Faire le balayage de la lame préparé (voir ci-dessous) au plus faible grossissement (10x) et compter le nombre de différents types de leucocytes sur un total de 100 leucocytes compté. Calculer le pourcentage de chaque classe de GB en divisant le nombre de chaque type par le nombre total de GB compté. basophiles. 3. monocytes et lymphocytes. Il est rare qu'une augmentation dans le nombre d'une de ces classes de leucocytes cause une augmentation dans le nombre d'une autre classe de leucocytes. une inflammation. Chacun des leucocytes possède des caractéristiques spécifiques qui peuvent être observées suite à une coloration (voir le tableau sur la prochaine page). monocytose et basophilie. un traumatisme ou même le stress. Un nombre généralement élevé de globules blancs se dit une leucocytose. éosinophilie. neutrophilie. Ceci peut être le résultat d'infections bactériennes. Dépendamment du nombre de laquelle des classes de leucocytes sont observé différentes pathologies sont associées : lymphocytose. 2. sont sous-divisés en cinq catégories : les neutrophiles. Compte différentiel de globules blancs Type cellulaire No de chaque % de chaque Neutrophiles Éosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes Total: 112 . Ces cellules jouent un rôle vital dans les réponses immunitaires. Examiner la lame préparée d'un frottis de sang humain afin d'identifier les différentes catégories de leucocytes. qui représentent les cellules qui défendent le corps humain contre les infections.

Labo de Microbiologie-2012 Les leucocytes Nom Granulocytes: Neutrophiles Caractéristiques Fonction principale morphologiques Granules Deux lobes séparés par un Phagocytose des mince filament de bactéries chromatine Granulocytes: Éosinophiles Granules Noyau bilobé Destruction des vers parasites Granulocytes: Basophiles Granules très abondants qui habituellement cachent le noyau Libération de médiateurs chimiques (réaction inflammatoire) Lymphocytes B Lymphocytes T Monocytes Production d'anticorps (réponse humorale) Absence de granules Noyau occupe la majorité Attaque des cellules du cytoplasme infectées (réponse cellulaire) Pas de granules Noyau de forme irrégulière Phagocytose (les monocytes se transforment en macrophages dans les tissus) Vous êtes responsable de cette matière pour l’examen final! 113 .

114 . Inclure un commentaire. BIOREMÉDIATION (Partie 8b) Méthode 1. Obtenir vos résultats et vos observations pour les tests métaboliques faits pour pouvoir identifier l’OEM.Labo de Microbiologie-2012 Devoir: Hématologie Soumettre un tableau qui présente les données suivantes pour votre échantillon de sang. qui indique et explique toute condition médicale évidente s’il y en a une. Compte GR Hématocrite VCM Compte GB % Neutrophiles % Éosinophiles % Basophiles % Lymphocytes % Monocytes Assurez-vous d’indiquer les valeurs avec les unités appropriées.