You are on page 1of 6

Mengenal Aflatoksin dan Metode Analisisnya pada Kakao

Oleh:
Bayu Refindra Fitriadi, S.Si
Calon PMHP Ahli Pertama
Kakao merupakan salah satu produk unggulan perkebunan Indonesia, bahkan
saat ini Indonesia menempati peringkat ke-3 dunia sebagai negara penghasil kakao
terbesar dunia. Namun tingginya produksi kakao ini tidak dibarengi dengan
meningkatnya kualitas produk kakao yang dihasilkan. Kualitas biji kakao yang diekspor
oleh Indonesia dikenal rendah. Di Amerika Serikat, biji kakao Indonesia selalu
mendapatkan penahanan (automatic detention) karena sering ditemukan jamur,
kotoran, serangga dan benda asing lainnya. Jamur yang sering ditemui pada biji kakao
yang proses penanganan dan pengolahan yang tidak tepat adalah jamur dari genera
Aspergillus, Mucorsp, Penicilium, dan Rhyzopus. Aspergillus.flavus dan A. parasiticus
dan A. niger merupakan jamur yang dapat menghasilkan mikotoksin pada biji kakao
kering. Walaupun belum ada penolakan produk kakao Indonesia terkait kandungan
mikotoksin seperti yang terjadi pada pala Indonesia beberapa waktu lalu, akan tetapi
apabila tidak diantisipasi dengan baik, bukan tidak mungkin pada masa yang akan
datang akan terjadi penolakan kakao produk Indonesia karena mengandung aflatoksin
yang melebihi batas.
Jamur penyebab aflatoksin dapat tumbuh dan berkembang pada hasil-hasil
perkebunan kakao sebelum panen, pada hasil panen kakao yang sedang disimpan
maupun produk kakao yang sedang atau telah diolah. Belum dikuasainya teknologi
penanganan pascapanen biji kakao kering atau pengolahan pascapanen yang kurang
tepat dan tidak layak seperti pemanenan, sortasi, pencucian, penjemuran dan
penyimpanan, menyebabkan mudahnya terjadi kontaminasi mikroorganisme yang tidak
diharapkan seperti jamur penghasil toksin. Jamur tersebut akan mencemari biji kakao
dan dapat menimbulkan perubahan-perubahan kimiawi di dalamnya, sehingga komoditi
ini tidak dapat dikonsumsi atau bahkan beracun. Selain pada biji kakao, jamur ini juga
dapat tumbuh pada jagung, kopra, kedelai, cantel, kopi, beras, gaplek, tembakau, jamu
dan lain-lain. Jamur mikotoksigenik yang tumbuh di produk kakao memungkinkan
adanya mikotoksin pada produk kakao. Kontaminasi mikotoksin pada biji kakao tidak

hanya berbahaya bagi kesehatan manusia namun juga dapat menimbulkan kerugian
ekonomi yang cukup besar dan berpengaruh terhadap perdagangan Internasional.
Aflatoksin adalah senyawa racun yang dihasilkan oleh metabolit sekunder jamur
Aspergillus flavus dan A. parasiticus. Selain itu, aflatoksin diproduksi juga oleh jamur
Aspergillus nomius, A.

pseudotamarii

dan A. ochraceoroseus.

A. flavus

dan A.

parasiticus tumbuh pada kisaran suhu yang panjang, berkisar dari 10–12oC sampai 42–
43oC dengan suhu optimum 32–33oC dan pH optimum 6. Jamur ini biasanya ditemukan
pada bahan pangan/pakan yang mengalami proses pelapukan. Pertumbuhan aflatoksin
dipacu oleh kondisi lingkungan dan iklim, seperti kelembapan, suhu, dan curah hujan
yang tinggi. Kondisi seperti itu biasanya ditemui di negara tropis seperti Indonesia.
Selain itu, faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kapang dan produksi aflatoksin
adalah (1) pengaruh aerasi, dimana proses fermentasi yang dilakukan pada wadah
yang tidak memiliki aerasi yang bagus (2) pengaruh atmosfir (gas udara) seperti CO2,
dan O2; (3) suhu, dimana suhu optimum untuk memproduksi toksin yaitu 25oC ; (4)
pengaruh kelembaban, dimana RH pada proses fermentasi lebih dari 80 %.
Aflatoksin merupakan salah satu nama sekelompok senyawa yang termasuk
mikotoksin dan paling toksik dibanding mikotoksin lainnya. Aflatoksin dikenal susunan
kimianya pada tahun 1964, yang mula-mula dibagi dalam dua golongan yatu aflatoksin
jenis B dan jenis G berdasarkan atas warna fluoresensi apabila dikenai sinar ultra violet;
masing-masing warna biru (blue) untuk aflatoksin jenis B dan warna kehijauan (green)
untuk jenis G. Pada saat itu baru diketahui empat jenis aflatoksin yaitu B1, B2, G1 dan
G2, yang masing-masing mempunyai struktur kimia serta daya racun yang berbeda, di
mana aflatoksin B1 adalah yang sangat beracun. Aflatoksin bersifat sangat tidak larut
dalam air, larut dalam aseton atau chloroform dan titik cairnya antara 237-289oC.
Aflatoksin memiliki sifat racun yang akut dan kronis.
Aflatoksin bersifat karsinogen dan banyak ditemukan pada produk pertanian.
Aflatoksin dapat menyebabkan kanker dan ginjal pada manusia bila dikonsumsi secara
berlebihan. Dalam dosis yang tinggi aflatoksin dapat menyebabkan efek akut. Aflatoksin
juga dapat terakumulasi di otak dan mempunyai efek buruk terhadap paru-paru,
miokarbium dan ginjal. Efek kronik dan sub akut aflatoksin pada manusia yaitu penyakit
hati seperti kanker hati, hepatitis kronik, penyakit kuning, dan sirosis hati. Aflatoksin

dapat pula mengakibatkan gangguan penyerapan makanan, gangguan pencernaan dan
metabolisme nutrien akibat mengkonsumsi pangan yang terkontaminasi aflatoksin pada
konsentrasi

rendah

secara

terus

menerus.

Aflatoksin

juga

berperan

dalam

menyebabkan penyakit seperti busung lapar. Selain itu juga dapat mengganggu sistem
kekebalan tubuh pada manusia dan hewan. Efek kronis racun aflatoksin merupakan
penyebab kanker yang potensial (potent carcinogen). Aflatoksin B1 adalah penyebab
kanker hati yang potensial (potent hepato carcinogen). Mengingat bahaya yang
ditimbulkannya, maka WHO, FAO dan UNICEF telah menetapkan batas kandungan
aflatoksin pada produk pertanian yang dikonsumsi, tidak lebih dari 30 ppb. Bahkan
Europan Commission menetapkan batas maksimal total aflatoksin lebih rendah yakni 4
ppb untuk produk serelia.
Metode analisis aflatoksin pada produk perkebunan dapat dilakukan dengan
menggunakan ELISA maupun dengan metode instrumen HPLC dengan detektor
fluorosence. Kedua metode tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan masingmasing.
Metode analisis ELISA atau enzyme linked immunosorbent assay dapat
digunakan untuk menentukan kadar aflatoksin pada produk perkebunan. Keuntungan
dari teknik analisis ini adalah sangat sensitif dan spesifik dengan menggunakan
antibodi. Selain itu, waktu analisisnya cepat, baik pada contoh tunggal maupun banyak.
Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang
teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat
antibody atau antigen yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan
menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan
pandangan mata atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA
plate reader.
Adapun untuk preparasi contoh, biji kakao yang kering dilarutkan pada larutan
metanol 70% dan didiamkan selama 30 menit sampai mengendap. Endapan disaring
dan filtrat contoh siap dianalisa menggunakan ELISA seperti metode di atas.
Analisis berlangsung dalam wadah microwell (mikroplat) dengan konsentrasi
antibodi yang dilapiskan pada mikroplat 0 mg/ml. Aflatoksin B1 yang terdapat pada
contoh yang diperiksa akan berkompetisi dengan antibodi yang berada dalam mikroplat.

Bahan atau pereaksi yang tidak berikatan akan terbuang setelah mengalami proses
pencucian. Dengan menambahkan substrat pada mikroplat akan terbentuk warna pada
ikatan antara antibodi dan enzim konjugat. Semakin biru warna yang dihasilkan,
semakin kecil aflatoksin B1 yang terdapat pada contoh yang dianalisis. Hasil analisis
ditentukan dengan membaca Optical Density (OD) pada ELISA plate reader. Kurva
kalibrasi, plot antara nilai OD dan konsentrasi standar aflatoksin B1 dibuat dan
digunakan untuk menghitung kadar aflatoksin B1 pada contoh.
Selain menggunakan metode ELISA, kadar aflatoksin pada kakao juga bisa
ditentukan, baik kuantitatif maupun kualitatifnya dengan metode HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Prinsip
kerja dari metode HPLC ini adalah perbedaan distribusi dari komponen-komponen
campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase bergerak dan dideteksi
menggunakan detektor fluorosense. Untuk penentuan secara kualitatif dari Aflatoxin
didasarkan pada waktu retensi atau volume retensi suatu senyawa yaitu dengan
membandingkan t atau V senyawa dalam contoh yang dianalisis dengan t atau V
Aflatoxin standar yang telah diketahui. Sedangkan untuk mengetahui secara kuantitatif
dari Aflatoxin yang terdapat dalam contoh didasarkan pada prinsip bahwa tinggi puncak
suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk
kromatogram tersebut. Keuntungan dari metode HPLC ini adalah analisis yang cepat,
resolusi yang diperoleh relatif tinggi, sensitivitas detektor yang baik, kolom sebagai fase
diam yang dapat digunakan kembali sehingga menguntungkan secara ekonomis, ideal
untuk zat bermolekul besar dan berionik seperti Aflatoxin dan mudah untuk recovery
contoh.
Teknik analisis Aflatoxin menggunakan metode HPLC menggunakan fase gerak
berupa campuran larutan Acetonitrile : Metanol : Aquabidest (1:3:6), dengan laju alir 1,0
mL / menit, dan volume injeksi sebesar 20 µL. Adapun detektor yang digunakan adalah
detektor fluorescence pada panjang gelombang

eksitasi 365 nm

dan panjang

gelombang emisi 450 nm. Fasa diam menggunakan kolom Rp-18 Lichrospher dengan
panjang

250 mm dan diameter 4.0

mm dengan ukuran partikel 5µm. Standar

campuran Aflatoksin dibuat dari standar induk aflatoksin yang diencerkan dengan
acetonitrile dan dihomogenkan. Deret standar aflatoksin 1 ppb ; 2 ppb ; 5 ppb ; 10 ppb ;

25 ppb ; 50 ppb ; dan 100 ppb di buat. Kemudian masing-masing deret standar yang
telah dibuat dimasukkan ke dalam vial amber, setelah dicampur larutan dikocok sampai
homogen. Ditimbang dengan teliti sebanyak 25 gram contoh dan ±5 gram serbuk NaCl
dimasukkan ke dalam blender, ditambahkan 125 mL metanol 70%, diblender dengan
kecepatan tinggi selama 2 menit. Larutan disaring dengan kertas saring. Dipipet 15 mL
filtrat kemudian diencerkan dengan 30 mL aquabidest, kocok sampai homogen. 15 mL
fitrat dilewatkan ke immunoaffinity column dengan kecepatan 1 tetes per detik,
dilewatkan 10 ml aquabidest ke immunoaffinity column dengan kecepatan 2 tetes per
detik. Setelah semua cairan turun, didorong dengan syringe hingga keluar udara dan
dibuang cairan yang ditampung, dilewatkan 1 ml methanol ke immunoaffinity column,
ditampung tetesan ke dalam vial amber. 1 mL standar atau sampel dalam metanol
dalam vial amber diuapkan dengan gas nitrogen sampai kering. Setelah kering
ditambahkan 100 µL TFA (tri fluoro acetic acid) dan divortex selama 30 detik, diinkubasi
pada suhu ruang selama 15 menit (lindungi dari cahaya), ditambahkan 900 µL
campuran acetonitril-aquabidest (1: 9), divortex selama 30 detik. Sampel diinjeksikan
ke sistem kromatografi. Kadar aflatoksin dalam sampel dihitung dan ditetapkan
menggunakan kurva kalibrasi (hubungan antara konsentrasi standar dan luas area)
dengan garis lurus.
Masing-masing metode baik ELISA maupun HPLC memberikan hasil yang
signifikan dalam menentukan kandungan Aflatoxin dalam kakao sehingga dapat
dijadikan referensi bagi analis dalam melakukan pengujian Aflatoxin dalam kakao.

Referensi:
Asrul, 2009, Populasi Jamur Mikotoksigenik dan Kandungan Aflatoksin pada Beberapa
Contoh Biji Kakao (Theobroma cacao L) Asal Sulawasi Tengah, J. Agroland 16
(3) : 258 - 267, September 2009
Muchtadi,
D.,
2010,
Tidak
Dapat
Hilang
Walau
Sudah
Diolah
Aflatoxin, Racun Penyebab Kanker, diakses pada 26 September 2013 di
http://web.ipb.ac.id/~tpg/de/pubde_fdsf_aflatoxin.php
Racmawati, Eka., Nasrianto, H., Mulyati, A.H., 2012, Kandungan Aflatoksin (B1, B2, G1
dan G2) pada Kacang Tanah (Arachis hypogaea L) yang Beredar di Pasar
Tradisional Daerah Jabotabek, diakses pada 26 September 2013 di http://ejournal.unpak.ac.id/detail.php?detail=mahasiswa &id=478

Syarief, R., 2012, Mikotoksin Bahan Pangan, diakses pada 26 September 2013 di
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja
&ved=0CCgQFjAA&url=http%3A%2F%2Fxa.yimg.com%2Fkq%2Fgroups%2F20
875559%2F965541030%2Fname%2FMikotoksin_seminar_Prof%255B1%255D.
_Rizal_s2_s3.ppt&ei=vRDUoqKK47GrAfLyYHQDA&usg=AFQjCNFT0KwB2SsXe
YWKM1gCYP1yMwny-Q&sig2=0XWA_g4PiG4X4A
fAVaqnw&bvm=bv.53217764,d.bmk
Wangge, E.S.A., Suprapta, D.N., dan Alit, G.N., Wirya, S., 2012, Isolasi dan Identifiaksi
Jamur Penghasil Mikotoksin pada Biji Kakao Kering yang Dihasilkan di Flores, J.
Agric. Sci. and Biotechnol. Vol. 1, No. 1, Juli 2012
Yusrini, H., 2005, Teknik Analisis Kandungan Aflatoksin B1 Secara ELISA pada pakan
ternak dan Bahan Dasarnya, Buletin Teknik Pertanian Vol. 10, Nomor 1, 2005