You are on page 1of 7

Interaciuni antigen-anticorp

Reaciile antigen-anticorp se aseamn, prin afinitate i specificitate, cu interaciunile enzim-substrat.


Exist, ns, i diferene ntre aceste tipuri de interaciuni i anume : anticorpii interacioneaz cu
liganzii lor n configuraii stabile i de energie joas, n timp ce enzimele se leag de formele nestabile i
de nalt energie ale substraturilor lor.
Interaciunile antigen-anticorp sunt guvernate de principiul complementaritii. Conform acestui
principiu, caracteristicile structurale ale unui anumit antigen sunt reflectate complementar n situsurile
anticorpilor prin legturi care asigur crearea unei reele tridimensionale n care moleculele antigenanticorp alterneaz.
Legarea antigenelor i anticorpilor implic puni de hidrogen, fore Van der Waals, interaciuni
hidrofobe i interaciuni ionice ntre grupele terminale amoniu i carboxilat din aminoacizi. Anticorpul
pe a crui suprafa exist mai multe situsuri de legare poate interaciona cu dou molecule antigenice.
Toate tipurile de interaciuni participante la formarea complecilor imunologici (tabelul II.9.) sunt de
circa 100-1000 ori mai slabe dect o legtur covalent, astfel nct pentru stabilizarea legturii unui
anticorp la o antigen sunt necesare foarte multe legturi necovalente.

Tabelul II.9. Legturi necovalente cu impact imunologic


Tipul
Fore electrostatice
Legturi de hidrogen

Legturi Van der Waals

Interaciuni hidrofobe

Originea
Reprezentarea schematic
Atracia dintre sarcini opuse
- NH3 OOC Distribuirea hidrogenului
>NH-----O=C<
ntre atomi electronegativi
- + (N, O)
Fluctuaiile n nori electronici
din jurul moleculelor
polarizeaz atomii nvecinai
Gruprile hidrofobe
interacioneaz nefavorabil cu
apa i au tendina s se
mpacheteze mpreun
pentru a exclude moleculele
de ap. De asemenea, atracia
implic i forele Van der
Waals.

n plus, aceste interaciuni sunt operaionale numai pe distane foarte mici (1 sau chiar mai puin),
ceea ce se traduce prin complementaritatea dintre un determinant antigenic (epitop) i un situs de legare
a unui anticorp (principiul cheie-broasc), care asigur apropierea celor dou specii reactante pn la
o distan care s depeasc intensitatea acestor interaciuni.

Centrul (situsul) de legare a anticorpilor (paratop) poate fi descris ca o despictur situat n


fragmentele F(ab) i Fc i alctuit din segmentele VH si VL- . n legarea antigenului, segmentul VH are
un grad mai mare de implicare. Structura unui situs de legare, format din peptide cu cu 10-15 resturi de
aminoacizi, este complementar antigenului, iar mrimea corespunztoare acestuia. Structura flexibil a
moleculei de anticorp Ig G permite acomodarea celor 2 ramuri ale formei moleculare Y la poziia
determinantului antigenic. Rotirea liber se face n jurul unui punct situat ntr-o regiune a lanului
polipeptidic care conine o secven de resturi prolinice.
n mod obinuit, moleculele mici i peptidele scurte se leag ntr-un situs situat ntre regiunile variabile
ale lanului greu i lanului uor prin interaciuni necovalente n care sunt implicai 1-2 aminoacizi din
anticorp i epitop. Mrimea unei antigene poate depi, n unele cazuri (proteine mari i organisme)
mrimea macromoleculei de anticorp. n aceste situaii de complementaritate a interaciunilor poate fi o
suprafa extinsp cu o arie de 500 1000 2 . n interiorul acestei arii, 15-20 aminoacizi dintr-un
anticorp pot intra n contact cu acelai numr de aminoacizi din determinantul antigenic.
ntre un antigen (Ag) sau o hapten (H) i anticorpul (Ac) se desfoar reacii reversibile, guvernate de
legea aciunii maselor i soldate cu formarea complexului antigen-anticorp (AgAc):
k1
Ag + Ac
reactani liberi

k2

AgAc
fraciunea legat

n orice moment, o parte din reactanii liberi se combin cu o constant de viteza kA, pentru formarea
complexului imunologic. n alceai timp, o fraciune din complex se disociaz, cu o constant de vitez
Kd , dnd antigen liber i anticorp liber. Reacia se desfoar pn la atingerea echilubrului, moment
care corespunde invariablitii cantitilor de antigen prezente n fraciunea liber i n cea legat.
Constanta de afinitate, K, care exprim cantitatea de antigen liber necesar pentru ocuparea a jumtate
dintre poziiile de legtur ale unui anticorp, permite estimarea intesitii imunointeraciunilor. Valorile
constantei de afinitate sunt cuprinse, n general, ntre 5x104 i 1023 moli/L, fiind date de reaciile:
K=

ka
kd

[ AgAc]
[ Ag ] [ Ac ]

,unde Ka reprezint constanta vitezei de formare a complexului imunologic, Kd este constanta vitezei de
disociere a complexului AgAc, iar [Ag], [Ac] si [AgAc] sunt concentraiile antigenului, anticorpului i
respectiv complexului lor n soluie.
Viteza de formare a complecilor antigen anticorp depinde de viteza de difuzie a celor dou molecule
n soluie. Viteza de disociere a unui imunocomplex este dependent de tria interaciunii
(complementaritate + legturi necovalente).
n acest context, afinitatea unui anticorp poate fi descris ca o proprietate termodinamic indicatoare a
probabilitii ca epitopul i anticorpul s fie asociai ntr-un complex. Afinitatea este msurat ntre un
determinant antigenic i situs de legare a unui anticorp. n condiiile n care n molecula unui anticorp

exist 2 sau mai multe centre de legare, interaciunile imunochimice pot fi exprimate i prin intermediul
aviditii , care i pune amprenta asupra afinitii. Alturi de aviditate, la afinitatea unui anticorp
contribuie i valena sa (exprimat prin numrul de situsuri antigenice), valena antigenei i modificrile
conformaionale care se produc n anticorp sau antigen n timpul formrii unei legturi. Astfel, un
antigen cu mai muli epitopi care se repet va interaciona mult mai puternic cu un anticorp dect cu
acelai antigen care nu posed epitopi repetabili. n plus, interaciunea dintre acelai antigen i un
anticorp IgM (valen mai mare) este mult mai intens dect cu o imunoglobulin IgG cu aceeai centri
de legare. Aviditatea nu este o proprietate termodinamic, ea fiind deosebit de util pentru o descriere
din punct de vedere funcional, n anumite condiii de testare. Datorit acestui fapt, se prefer
caracterizarea activitii i concentraiei unui anticorp dintr-o prob biologic prin intermediul titrului
su.
Exist i cazuri n care anticorpii indui de un antigen pot reaciona ncruciat cu o gen nenrudit.
Reactivitatea ncruciat a anticorpilor se manifest atunci cnd:

Dou antigene diferite au un epitop identic;


Anticorpii specifici pentru un epitop se leag i de epitop nenrudit, care posed proprieti
chimice i structurale identice.

Modul n care diversitatea molecular a anticorpilor, datorat organizrii la nivel genetic, este transpus
n specificitatea antigenelor la nivel molecular a fost intens studiat, att din punct de vedere structural,
ct i funcional. Cunoaterea aprofundat a relaiei dintre structur i funcie este indispensabil n
eforturile de adaptare raional a anticorpilor la necesiti specifice.

Studiile structurale vizeaz determinarea structurii tridimensionale a fragmentelor de anticorpi


i a complecilor imunologici. De asemenea, studiile structurale efectuate pe aceti compleci
pot oferi informaii asupra naturii interaciunii anticorp-antigen i asupra oricrei modificri
conformaionale care o nsoesc. Totui, pn n prezent, nu sunt complet elucidate mecanismele
din spatele afinitii i specificitii interaciunilor.
Studiile funcionale se concentreaz asupra cineticii i termodinamicii interaciunilor anticorp
antigen, n combinaie frecvent cu mutageneza. Astfel, unele date din literatura de specialitate
sugereaz c afinitatea este determinat de legturile de hidrogen, punile de sare i interaciunile
Van der Waals (parametrul termodinamic determinant este entalpia). Alte date atribuie rolul
principal aa-numitului efect hidrofob, adic pierderea ordinii structurale a moleculelor de ap
prezente pe suprafee, care sunt ngropate odat cu formarea legturilor. Aceast comportare
presupune c, din punct de vedere termodinamic, interaciunea anticorp antigen este
determinat de entropie. ntr-un alt context, se confirm modelul entalpie - entropie descris de
Novotny, care sugereaz c formarea complexului imunologic este determinat de entropie la
temperaturi sczute i de entalpie la la temperaturi mai ridicate, cnd efectele entropice joac un
rol cheie n interaciune, cea mai important caracteristic, n formarea complexului imunologic
este complementaritatea superficial, care se traduce printr-o potrivire perfect a suprafeelor
anticorpului i antigenei implicate. Aceast particularitate ar putea fi extrem de important n
eforturile de modulare a caracteristicilor legturilor de anticorp prin ingineria proteinelor.

Probabil, moleculele de anticorp manifest, ca i n cazul secvenei de aminoacizi, o mare variabilitate


n cinetica i termodinamica interaciunilor cu antigenele corespunztoare. De aceea este extrem de
dificil formularea unor reguli cu valabilitate general n legarea unui anticorp la o antigen.

II.4. Structuri biomimetice


Intervalul foarte scurt de stabilitate chimic, termic i fizic a enzimelor i anticorpilor le limiteaz
drastic perioada lor de conservare i, n final, aplicabilitatea lor comercial. Deosebit de important este
i faptul c prepararea lor din surse biologice este cronofag i necesit sacrificarea de animale. Pe de
alt parte, receptorii moleculari sintetici sunt mult mai stabili din punct de vedere termic i chimic i, n
principiu, pot fi preparai n cantiti mari. Totui, selectivitatea i afinitatea receptorilor moleculari
sintetici, obinui prin sinteze multifazice, sunt mult mai mici n comparaie cu cele corespunztoare
contrapartenerilor lor biologici.

II.4.1. Polimeri cu amprent molecular


n categoria receptorilor sintetici cu o poziie cheie este ocupat de polimerii cu amprent molecular
care prezint memorie steric i chimic pentru un anumit ablon. Ei manifest abilitate de
recunoatere molecular, mai stabil i mai uniform dect cea a compuilor biologici. Datorit
versatilitii, uurinei preparrii, robusteii fizice i proprietilor chimice, polimerii cu suprafa
moleculara ndeplinesc cu succes, de peste 30 de ani, rolul de elemente sensibile n biosenzori.
Schema general de obinere a polimerilor cu amprent molecular implic:
1) Interaciunea covalent sau necovalent a unei molecule oaspete (ablon), riguros selectat, cu
un monomer funcional, soldat cu formarea unui complex de prepolimerizare
2) Convertirea complexului de prepolimerizare (prin polimerizare) ntr-o matrice polimer, cu grad
nalt de reticulare. n urma acestui proces, se formeaz caviti rigide, care sunt complementare,
ca form i dimensiuni, cu ablonul.
3) Prin ndeprtarea ablonului din polimerul astfel format, se obine un material n care exist
cel puin un centru activ (care manifest abiliti de recunoatere molecular pentru molecula
gazd).

Polimerii astfel obinui prezint anumite caracteristici atractive, ntre care se remarc: abilitatea de a fi
preparai i utilizai n solveni organici, capacitatea de a-i pstra, pe perioade lungi de timp, potenialul
de recunoatere molecular prin conservare n stare uscat i stabilitatea termic pn la temperaturi de
125 C. n plus, dac polimerizarea se efectueaz n prezena unei molecule ablon corespunztoare,
ei pot fi uor adaptai la substraturi noi.

Polimerii cu amprent molecular sunt aplicabili ntr-o varietate de configuraii : polimeri compaci,
granule sferice (obinute prin polimerizarea prin precipitare, cu diametre sub 200 nm i excelente

proprieti de recunoatere pentru diferite molecule int) sau membrane. Un format corespunztor al
polimerilor cu amprent molecular trebuie s fie selectat nainte de aplicarea materialului imprimat.
n acest context, polimerii cu amprent molecular sunt considerai, n prezent, materiale accesibile,
complementare i/sau alternative la receptorii biologici

II.4.1.1 Metode de sintez a polimerilor cu amprent molecular

Sinteza polimerilor cu amprent molecular se realizeaz prin copolimerizarea unor momomeri


corespunztori, n prezena unui ligand ablon. ntre speciile reactante se manifest interaciuni
necovalente, covalente, reversibile i mediate de ionii metalici.
n imprimarea molecular sunt valorificate, n mod uzual, urmtoarele tipuri de interaciuni :

Legturi covalente
Interaciuni
Legturi de hidrogen
Interaciuni Van der Waals hidrofobe
Interaciuni de tip eteri coroan / ciclodexterine
Legturi metal ligand
Fore ionice

Efectul de imprimare molecular este maximalizat atunci cnd ablonul interacioneaz cu mai multe
centre de legare, iar interaciunile implicate au determinare direcional sau spaial

Imprimarea molecular prin legturi necovalente


Denumit i auto-asamblare, metoda necovalent are cea mai larg utilizare n imprimarea
molecular.
Anumii monomeri se amestec cu ablonul i cu agenii de reticulare, ntr-un solvent adecvat.
Prin interaciuni polare (legturi de hidrogen, legturi ionice, fore Van der Waals), n amestecul
de prepolimerizare se formeaz compleci ntre ablon i monomeri. Tria acestor interaciuni i
complecii rezultani au o importan primordial pentru efectul de amprentare n polimerul
rezultant.
Monomerii utilizai n imprimarea molecular necovalent sunt : acidul metacrilic, acidul 2vinilpiridil trifluorometacrilic, acidul 4-vinilpiridil trifluorometacrilic, acrilamida i
hidroximetacrilatul.
Cel mai utilizat agent de reticulare este etilenglicolul dimetilacrilatul. Divinilbenzenul i
trimetiloilpropanul sunt utilizai ntr-o msur mai mic. n scopul obinerii unor reele
polimerice rigide i foarte dense, agentul de reticulare se adaug ntr-un exces care poate ajunge
pn la 80 90 % din raportul molar al componenilor amestecului de prepolimerizare. Prin
aceasta se asigur pstrarea formei i a mrimii centrilor imprimai, care prezint toleran
pentru diferite medii i rezisten la contracie i umflare.

Solvenii cu utilizare tipic pentru acest tip de imprimare molecular sunt cloroformul,
acetonitrilul i dimetilsulfoxidul. Solventul ndeplinete dublu rol : mediu de polimerizare i
favorizarea crerii unei structuri poroase n polimerul rezultant.
Aplicarea polimerizrii cu imprimare molecular necovalent la raporturi molare diferite ntre
monomeri conduce la materiae capabile de legare selectiv a pesticidelor, a unor hormoni
steroizii vegetali sau a unor medicamente.

Imprimarea molecular prin legturi covalente


n scopul ncorporrii unei funcionaliti de polimerizare, molecula amprent este supus unei
modificri. Aceasta presupune ataarea amprentei de un monomer corespunztor, prin legturi covalente
labile. Monomerii cu utilizare frecvent sunt acidul 4-vinilfenilboronic i 4-vinilbenzilamina.
Polimerizarea decurge cu fixarea amprentei n interiorul reelei polimerice, ntr-un anumit aranujament
spaial. Pentru recuperarea polimerului, legturile labile se rup, elibernd centrii activi de legare.
Aceast tehnic are ca principal avantaj faptul c prin cunoaterea stoechiometriei reaciei dintre
amprent i monomerul funcional se asigur obinerea unei densiti nalte a centrilor activi bine
definii. Totui, specificitatea legturilor care trebuie s tolereze condiiile de polimerizare, este
rezultatul unor eforturi susinute. n plus, aceste legturi se desfac apoi uor, n scopul recuperrii
amprentei i al eliberrii centrului activ. Ca i n cazul variantei necovalente, relegarea se realizeaz prin
intermediul unor interaciuni covalente sau de alt tip.

Imprimarea semicovalent
Este o tehnic hibirid ingenioas care combin cele mai atractive caracteristici ale celorlalte
dou metode. Molecula amprent este legat de monomerul funcional printr-un distanier de
sacrificiu (de exemplu un ester carbonat). Polmerizarea este urmat de clivajul esterului, n
urma cruia se degaj dioxid de carbon i rezult un monomer capabil s formeze un centru
necovalent de recunoatere.
Se presupune c formarea complexului amprent monomer se produce prin intermediul
funcionalitilor selectate ale moleculelor corespunztoare.
De dat relativ recent, prin obinerea unor noi monomeri specifici pentru o amprent dat, s-au
deschis noi perspective n imprimarea molecular. Atingerea acestui deziderat presupune
modificarea monomerilor existeni sau prepararea unor entiti complet noi, n scopul realizrii
unei asociaii n mai multe puncte cu molecula amprent. Creterea triei i specificitii
caracteristic complecilor de acest tip ar trebui s se reflecte n afinitatea/aviditatea mai nalt a
polimerilor cu amprent molecular.
Dup formarea complecilor amprent-monomer, n amestecul de polimerizare se adaug un
azo-iniiator (de regul, azo N, N-bis-izobutironitrilul). Polimerizarea radicalic este iniiat
prn homoliz fotochimic prin radiaii ultraviolete (0 15 C). S-a constatat c polimerii cu
amprent molecular obinui prin fotopolimerizare la temperaturi joase (0 C) manifest
proprieti mbuntite de recunoatere molecular. S-au omis ipoteze conform crora
complecii amprent monomer sunt mai stabili la temperaturi mai joase, astfel nct n
polimerii rezultai imprimrile sunt mai omogene i mai bine definite.

Dupa polmerizare care dureaz ntre 10 i 24 de ore, polimerul este supus unei prelucrri
suplimentare care vizeaz contraextracia moleculei ablon. Succesul utilizrii polimerilor cu
amprent molecular depinde, n mare msur, de reuita acestei etape. n cazurile tipice,
extracia se efectueaz n amestecuri de solveni protici i acizi (de exemplu metanol cu acid
acetic 10 %). Aceste amestecuri suprim interaciunile formatoare de legturi i extrag, aproape
cantitativ, amprenta din miezul polimeric. Principalele proceduri experimentale utilizate sunt
extracia Soxhlet, splarea intensiv sau splarea alternativ acido-bazic. ndeprtarea
ablonului este esenial din dou puncte de vedere :
- cu ct este mai cantitativ, cu att mai mare numrul de centre active relevate n polimerii cu
amprent molecular
- amprenta remanent n polimerii cu amprent molecular poate sngera. ntr-un asemenea
caz, chiar i o cantitate minim de ablon (adugat manual n prob), poate influena
semnificativ rezultatele unei analize. O souie elegant a acestei probleme const n utilizarea, n
timpul polimerizrii, a unui ablon fictiv (analog al analitului). Scurgerea ablonului fictiv,
eventual aprut pe parcursul unei asemenea proceduri, nu interfer n analiz, ci se constituie
ntr-o etap de separare a 2 molecule analoage.
O variant preparativ o reprezint polimerizarea in situ a amestecurilor de imprimare
molecular, de exemplu n tuburi digestive sigilate, cnd se obin retele polimerice, rigide i nalt
reticulate, care prezint o structur macroporoas.
Prin metode alternative de polimerizare (n suspensie, n dispersie, n microgranule) se pot
obine particule sferice de mrime determinat.
O nou metod de sintez a polimerilor cu amprent molecular este metoda epitopului, care se
bazeaz pe utilizarea ca amprent a unui compus, a crui structur reprezint un fragment
constituitiv al unei molecule mai mari.
Polimerii cu amprent molecular pot fi obinui i sub forma unor membrane subiri i stabile
care pot fi utilizare direct n senzori. Membranele pe baz de polimeri cu amprent molecular
pot fi obinute prin tehnici cum ar fi :
- polimerizarea pe suprafaa unui filtru de sticl
- precipitarea prin inversie de faze
- evaporarea solventului
- generarea unor membrane de tip film pe cursoare de sticl
- depunere prin pulverizare i piroliza unor amestecuri de polifurfurilalcool/polietilenglicol pe
suporturi macroporoase.
Exist toate premizele ca imprimarea molecular s devin o cale neted ctre o producie
eficienta i simpl (direct) de senzori. Din punct de vedere virtual, poate fi imprimat orice
substan cu mas molecular mic. Recent, s-a realizat detectarea cu senzori pe baz de
polimeri cu amprent molecular a unor entiti mai mari de tipul proteinelor, bacteriilor i a
celulelor vii, fapt care a sporit considerabil aplicabilitatea i perspectivele imprimrii
moleculare.