Professional Documents
Culture Documents
HPLC este cea mai extins metod cromatografic utilizat pentru analiza analiilor
compui biologic activi, fiecare clas a acestora fiind testat separat. Spre deosebire de
tehnica LC-MS, nu ofer o certitudine 100% cu privire la identificarea analiilor.
Principiul cromatografiei lichide
Spre deosebire de cromatografia de gaze n care faza mobil joac doar rolul de
cru n transportul componenilor prin coloan, n cazul cromatografiei de lichide,
faza mobil particip alturi de faza staionar la procesul de separare prin interaciuni
selective mult mai complexe (Gocan, 2002).
Cromatografia lichid se subclasific dup tipul suportului, n cromatografie cu
faz normal (NP-HPLC) i invers (RP-HPLC).
Sistemele NP-HPLC utilizeaz o faz staionar polar (silicagel, alumin,
celuloz, Ca(OH)2, MgCO3 ), o faz mobil nepolar (eter de petrol, hexan puri sau n
amestec cu aceton 1-15%), separarea avnd la baz adsorbia diferit a componentelor
amestecului pe faza staionar. Se adreseaz probelor preponderent nepolare, ordinea de
eluie (caracterizat de timpul de retenie, tR, al probei pe coloan, exprimat n minute) a
componentelor amestecului fiind :
tR componente nepolare < tR componente polare
n sistemele RP-HPLC, faza staionar devine nepolar prin legare chimic de
octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca faz mobil se folosesc amestecuri de solveni
polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, ap), iar procesul de separare are la baz
repartiia componentelor amestecului ntre faza staionar i eluent. Este indicat n cazul
probelor preponderent polare, ordinea de eluie fiind:
tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997).
n prezent, peste 60% din totalul separrilor se realizeaz prin cromatografia cu
faz invers. Popularitatea acestei tehnici rezid n faptul c prezint o universalitate n
separarea unor compui nepolari, polari i ionici, incluznd un larg domeniu de mase
moleculare i faptul c optimizarea separrilor se realizeaz relativ uor (Gocan, 2002).
de lichide
Cromatografia
gazoas
Faza mobil
S1, NP-HPLC
Solveni preponderent
Si-C8,Si-C18,RP-
nepolari
Solveni preponderent
HPLC
Schimbtori de ioni2
polari
Soluii acizi-baze
Geluri3(CES)
Geluri i
Soluii tampon4
Soluii tampon4
Interaciuni hidrofobe
1. Adsorbie
Hidroxilapatit
Oel sau rini (GSC) Ar, He, N2 + H2
2. Repartiie
Uleiuri(GLC)
**
Cromatografia
Faza staionar
2.Repartiie LL (CR)
***
Ar, He, N2 + H2
* Efectuat pe hrtie (CH), strat subire (CSS), coloan deschis (CC) i coloan nchis (HPLC)
** Efectuat pe strat subire (CSS) sau pe coloan deschis (CC) i nchis de oel (HPLC)
*** Efectuat pe coloan deschis sau nchis de sticl la presiuni joase (LPLC- Low pressure
liquid chromatography)
1
Absorbanta/Absorbance (mAU)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
10
15
20
25
30
Primele dou sunt cel mai frecvent folosite. ntruct SFE necesit echipament specializat,
nu i-a gsit aplicaii foarte largi.
O importan deosebit prezint alegerea solventului utilizat n extracia analitului.
n acest sens, se va ine seama de proprietile termodinamice ale solventului i solvatului:
polaritate, interaciuni dipol-dipol, caliti donoare sau acceptoare de H+, precum i de
observaiile analistului din practica experimental. Alternana pH-ului are un efect
dramatic asupra solubilitii compuilor ionizabili. Se tie c compuii ionizai sunt mult
mai solubili in solveni polari (n special soluii apoase) dect compuii neionizai
(Fedeniuk i Shand, 1998).
Metodologia LLE const n amestecarea a dou faze nemiscibile (de obicei una
organic i una apoas), n urma creia analitul de interes este separat de ceilali
componeni ai matricei din prima faz i extras n cea de-a doua faz lichid. Procedeul se
repet de regul de 2-3 ori, pentru a asigura o extracie complet.
Comparativ cu LLE, extracia n faz solid SPE are unele avantaje: este mai
rapid, mai reproductibil, se obin extracte mai curate i necesit cantiti de solveni mai
reduse. Utilizarea cartuelor SPE implic patru pai: condiionarea umpluturii cartuului;
aplicarea probei prin care analiii de interes vor fi reinui selectiv pe cartu, n timp ce
restul compuilor vor fi ndeprtai; splarea cartuului cu solveni care s ndeprteze
compuii nedorii adsorbii la ncrcarea probei; eluarea compuilor reinui pe cartu,
utiliznd un solvent care va distruge interaciunile analit-pat adsorbant.
Exist patru mecanisme generale de extracie ntlnite n tehnica SPE:
- nepolar - gruprile funcionale utilizate sunt C18, C8, C2, fenil, ciclohexil i copolimerul
stiren-divinilbenzen
- polar - gruprile funcionale utilizate sunt: cianopropil, diol i aminopropil
- schimbtor de ioni - coloanele schimbtoare de ioni se mpart n coloane schimbtoare de
anioni i cationi. Gruprile schimbtoare de cationi pot fi puternic schimbtoare (derivaii
acidului sulfonic) sau slab schimbtoare (derivaii acidului carboxilic). Gruprile
schimbtoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbtoare (aminele cuaternare) sau
slab schimbtoare (aminele primare, secundare i teriare).
Pentru cromatografia de lichide au fost create dou tipuri de detectori care sunt astzi
folosii n mod curent:
proprieti chimice ori fizice. Din aceast categorie fac parte detectorii
spectrofotometrici de absorbie UV-Vis, de fluorescen, electrochimici i
spectrometrul de mas. Se pot atinge sensibiliti remarcabile, selectivitate bun i
permit eluia cu gradient.
detectori cu serie de fotodiode, care prezint facilitatea c ntreg domeniul spectral este
nregistrat continuu, la intervale de timp de microsecunde, iar datele stocate pot fi
folosite n diferite moduri i la date ulterioare, fr a fi necesar repetarea separrii.
Exist situaii n care amestecul de separat este complicat i timpul de retenie nu
este suficient pentru a caracteriza fiecare component. Unele substane organice au timpi de
retenie identici, fapt ce conduce la erori de interpretare datorit suprapunerii semnalelor.
Astfel, este universal recunoscut c cea mai bun metod de identificare i caracterizare a
fiecrui component separat prin cromatografie const n nregistrarea spectrului su de
mas. Spectrometrul de mas (MS) este detectorul care permite identificarea prin
compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare cu spectrele etalon din
biblioteca de spectre.
analizatorul de ioni
fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre n ioni pozitivi (alturi de alte
particule negative sau neutre). Analizatorul de ioni separ ionii provenii din camera de
ionizare n funcie de raportul dintre masa i sarcina acestora (m/z). Ionii cu aceeai
valoare m/z formeaz n colector un curent slab care este trimis spre amplificator i apoi
nregistrat (Oprean, 1974).
necunoscui,
determinarea
compoziiei
izotopice
moleculare,
cu band transportoare
cu pulverizare la temperatur (thermospray)
cu electropulverizare (electrospray)
cu pulverizarea efluentului ntr-un curent de gaz la cald combinat cu o ionizare
chimic la presiunea atmosferic (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea
atmosferic (APPI) (Gocan, 2002).
Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de mas
Spectrele de mas sunt spectre de linii, adic semnalul generat de ion apare
sub forma unei linii numite i pic. n figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din
spectrul de mas al unui compus organic.
. Acest spectru este srac n informaii, din acest motiv fiind nevoie de o a doua
studiate
ori
prin
sustragerea
unui
ion
(http://www.icmpp.ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD.doc).
n cazul interfeei care utilizeaz pulverizarea termic, tot eluentul este
introdus prin intermediul acesteia n masa spectrometrului. Prin pulverizarea
termic, ionizarea probei poate fi obinut fr a se recurge la folosirea unui
filament. Ionizarea thermospray se produce cnd un component ntr-o soluie salin
este vaporizat, producnd un jet supersonic de vapori ncrcai. Pe msur ce
solventul se evapor i raza picturii se micoreaz, suprafaa cmpului pe o
pictur crete pn are loc evaporarea final a unui ion. Spectrele de mas obinute
prin ionizare TSP sunt simple, producnd aduci protonai (M+1)+ prin procedeul cu
ion pozitiv i (M-1)- prin procedeul cu ion negativ. Temperatura joac un rol
analitice sau preparative n funcie de lungime i coloane capilare construite dintrun tub de oel moale sau Cu, Al, sticl, n care pereii interiori pot fi folosii ca atare,
ca faz staionar sau pot fi tapetai cu o faz staionar. Coloanele capilare sunt net
superioare celor cu umplutur, larga lor utilizare datorndu-se eficienei ridicate de
separare a acestora.
Numrul de talere teoretice este proporional cu lungimea coloanei, deci
pentru separri optime se folosesc coloane lungi. Diametrul interior al coloanelor
este de 2-500mm pentru coloanele clasice i <1mm pentru coloanele capilare.
Diametrul interior influeneaz viteza optim a gazului transportor, capacitatea de
lucru a coloanei i cantitatea maxim de material separat. Cu ct diametrul coloanei
este mai mic, separarea este mai performant. Umplutura coloanelor clasice depinde
de tipul cromatografiei, astfel n GSC se folosesc faze staionare active: crbune
activ, silicagel, alumin, site moleculare, zeolii, sticl poroas, silicat de Mg.
ntruct energiile de absorbie sunt mai mari dect energiile de disociere, analiza se
realizeaz la temperaturi mai mari dect n GLC. Faza staionar n GLC este
constituit dintr-un suport inactiv, poros (suprafaa specific de 1-10 m 2 /g)
impregnat 5-20% cu un lichid. Faza staionar astfel constituit este repartizat
uniform ca pelicul subire pe pereii coloanei, pentru a opune rezisten ct mai
mic amestecului de separat. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau
P, celita, pmntul de diatomee, produsele Brique C 22 , iar suporturile mai puin
poroase sunt: bile de sticl, pudra de teflon, grafit, polietilen microporoas.
nlimea unui taler teoretic este proporional cu diametrul particulelor. Este
important ca particulele s aib dimensiuni apropiate. Pentru a elimina proprietile
absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau
acoperirea suportului cu polivinilpirolidon (PVP), cu teflon sau argintare.
n alegerea fazei staionare trebuie s se in seama de tipul substanelor de
separat (polaritate, legturi de hidrogen, etc.), de interaciunile chimice posibile cu
faza staionar sau faza mobil, de capacitatea de adsorbie pe suport. S-a fcut o
scal de selectivitate a lichidelor staionare care ncepe cu squalenul (nepolar) i se
ncheie cu , - dioxipropionitril (cel mai polar). Suportul impregnat cu lichid este
nclzit ntr-un curent de gaz inert la o temperatur apropiat de cea de separare.
Umplerea coloanei se face sub vid, iar condiionarea ei const n nclzire sub
curent de gaz purttor la temperatur nalt pentru a ndeprta impuritile volatile.
Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale n care faza staionar
nu este fixat pe suport, fiind repartizat uniform pe pereii interiori ai coloanei.
Practic se realizeaz o pelicul foarte subire prin evaporarea fazei staionare
lichide. Diametrul interior este de 0.25-0.5mm, iar lungimea de 20-50m, realiznduse aproximativ 10000 talere teoretice.
Proba nu se introduce direct n coloan, ci printr-o camer de injectare a
crei form i volum influeneaz mult separarea. Aceast camer are o temperatur
mai mare dect coloana, permind evaporarea probei. Volumul probei trebuie s fie
ct mai mic. Cnd coloanele sunt suprancrcate, se reduce numrul de talere
teoretice, crete nlimea unui taler i picurile devin asimetrice i cu lime mare.
Injectarea probei poate fi fcut cu sau fr splitare. n cel de-al doilea caz, toat
cantitatea injectat intr n coloana cromatografic. Pentru compuii mai volatili
dect solventul este obligatoriu s se lucreze cu splitare: o parte din extractul de
injectat va intra n coloan, o parte va fi direcionat n exteriorul cromatografului.
n calculul concentraiilor componenilor determinai se va ine seama de raportul de
splitare, care are practic semnificaia unei diluii.
Analiza unei probe implic etapele de pregtire a probei, de separare a
componenilor i de evaluare calitativ i cantitativ a componenilor separai.
Analiza calitativ presupune identificarea fiecrui pic din cromatogram. Analiza
cantitativ se face prin integrarea picurilor i calculul ariilor acestora, exprimate ca
procent din totalul picurilor. Acest procent este proporional cu ponderea fiecrei
componente n amestec. Pentru a exprima n valori absolute cantitatea fiecrei
componente din amestec, trebuie determinat concentraia total a substanelor n
amestec i apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculeaz
concentraia fiecrei componente (Socaciu, 2000).
cromatografic, sub forma unor semnale electrice care pot fi nregistrate. Detectorul
trebuie s deosebeasc o proprietate oarecare a componentului de analizat fa de
gazul purttor. Exist detectori universali, sensibili la un numr mare de componeni
i specifici, sensibili numai la anumii componeni (la anumite grupri funcionale
sau legturi chimice).
Caracteristicile detectorului:
sensibilitate ct mai mare pentru a putea detecta chiar i urmele de componeni i
pentru a nu fi necesar ncrcarea coloanei cu cantiti mult prea mari de prob
vitez de rspuns ct mai mare
liniaritate: sensibilitatea detectorului s rmn constant ntr-un domeniu larg de
concentraii
limit de sensibilitate ( concentraia minim de substan n eluent pentru care se
obine un pic) ct mai joas
stabilitate: linia de fond i reproductibilitatea s fie ct mai puin afectate de
condiiile de lucru (temperatur, debit, presiune, etc) (Liteanu i col., 1981).
Cele mai importante tipuri de detectori sunt:
1. Detectorul de conductibilitate termic (DCT) a fost primul care a
aprut, fcnd parte din categoria detectorilor universali. Se mai numete i
catarometru, este nedestructiv, putnd fi utilizat i n cromatografia preparativ.
Principiul de funcionare se bazeaz pe diferena de conductibilitate termic dintre
component i eluent.
2. Detectorul cu flacr de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai
mult folosit n GC. Principiul de funcionare const n msurarea conductibilitii
electrice a unei flcri de hidrogen n prezena unui compus organic. La ieirea din
coloan, eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen i este aprins la captul
unei duze din oel inoxidabil. Crend un cmp electric ntre duz i un electrod
colector aezat deasupra flcrii, se stabilete un curent slab (10-14 A) ntre cei doi
electrozi prin flacr. Apariia n flacr a unui compus organic mrete intensitatea
probei, fasciculul de electroni ionizeaz gazul reactiv cu puine molecule ale probei
ionizate direct. Deoarece sursa este operat la presiune nalt comparativ cu sursa
EI, reaciile ion-molecule sunt favorizate, realizndu-se ionizarea probei. Aceste
reacii au loc cu energie mic n comparaie cu impactul direct cu electroni,
abundena ionului molecular fa de alte fragmente rezultate va fi mare i
mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu.
Majoritatea tehnicilor de ionizare chimic lucreaz cu ioni pozitivi, dar s-au
dezvoltat i cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai
mic. Comparativ cu ionizarea prin EI, ionizarea chimic prezint dezavantajul c
ofer rezultate mai puin reproductibile i nu este posibil alctuirea unei librrii de
spectre care s fie folosit n scopuri de identificare.
Separarea ionilor formai are loc n analizorul de mas, tipurile cele mai
uzuale fiind cele magnetice i cu cuadrupol descrise n capitolul 3.3.3.
Spectrele de mas pot fi nregistrate sub form de picuri cu maxime (forma
original a spectrului), dar n practic se utilizeaz reprezentarea fiecrui pic sub
forma unei linii. Celei mai nalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100,
iar restul sunt exprimate ca procente fa de aceasta, obinndu-se concentraia
diverselor fragmente ionice ca valori de abunden relativ (Gocan, 1998; Ciucanu,
1990; http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182.php).