You are on page 1of 6

Evaluation of Novel KAT II Inhibitors and Their Potential Application in the 

Treatment of Cognitive Deficits Associated With Schizophrenia and Similar 
Psychiatric Disorders  
Drew Schleicher 
Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland College of 
Medicine, Baltimore, MD, USA 

 
A. Rationale:  
In recent years, the tryptophan metabolite kynurenic acid (KYNA) has gained an 
increasing amount of attention due to its possible role in the pathophysiology of schizophrenia. 
Patients with with schizophrenia display elevated levels of kynurenic acid in the cerebrospinal 
fluid (Nilsson 2005) and in the postmortem prefrontal cortex (Schwarcz et al. 2001). Additionally, 
rat studies have shown that in increase in kynurenic acid in the brain causes cognitive deficits 
mimicking those seen in patients with schizophrenia (Nilsson 2005). Another study found that 
dietary exposure to kynurenine, the precursor of kynurenic acid, during the gestation period of 
rats led to neurochemical and cognitive deficits in adulthood (Pershing et al. 2014). This 
evidence strongly suggests that elevated kynurenic acid concentration is responsible for the 
cognitive deficits seen in those afflicted with schizophrenia and similar disorders. The enzyme 
responsible for converting kynurenine into kynurenic acid is kynurenine aminotransferase II 
(KAT II). There has been much interest in targeting KAT II and the effects of its inhibition. It was 
found that local inhibition of KAT II in rats leads to reduction of extracellular KYNA, and in 
increase in extracellular glutamate, dopamine, and acetylcholine levels in several brain regions. 
Researchers found that oral application of the inhibitor mimics the effects of of local inhibition, 
and found rats treated with the inhibitor displayed significantly decreased escape latency in the 
Morris water maze, indicating improved performance in spatial and contextual memory (Wu et 

al. 2014). The results of these studies indicate the promising possibility of KAT II inhibition as a 
mechanism of treating cognitive dysfunction in schizophrenia and other psychiatric disorders. 
My research will be focused on testing a large number of substances and determining their 
effectiveness of inhibiting KAT II. It is hoped that this research will aid the scientific community in 
the development of cognitive enhancing treatments for those suffering from schizophrenia and 
other psychiatric disorders.  
B. Hypothesis:  
The application of a KAT II inhibitor to in vitro tissue will result in a statistically significant 
reduction of kynurenic acid concentration.  
By comparing the levels of KYNA in control treatments to trial treatments, I will be able to 
determine if an agent’s inhibition of KAT II is significant, and will also be able to determine the 
relative effectiveness of all agents tested.  
C. Procedures:  
The primary experimental procedure used in my research will be the KAT II Assay.  
The basic premise of this procedure is to asses the level of KAT II activity by measuring the 
amount of kynurenic acid produced. The first step is create a cocktail containing 2.25 uM 
L­Kynurenine (precursor of KYNA), ​
Pyridoxal phosphate (P5P), and Pyruvate in equal 
proportions. ​
Radioactive kynurenine is then added to this cocktail at at a concentration of 
1:10,000. Before being added, the radioactivity of the kynurenine is measured and recorded. It 
should be around 50,000 disintegration per minute (DPM).  
The next step of the procedure is the preparation of tissue. Rat Brain and liver and 
mouse brain and liver are the tissues currently used, though if a compound proves promising it 
will be evaluated in human tissue. Tissue samples are produced from storage in a freezer (kept 
at ­80 degrees celsius). All samples were already in possession of the research institution, no 
animals are euthanized specifically for my project. Using a sterile work space and razor, a small 

sample of tissue (~100 mg) is acquired and weighed. All tissues are initially homogenized in 
water at a 1:10 ratio. Depending on the tissue, the homogenate may be diluted further. The final 
concentrations are as follows: Rat and mouse brain at a 1:10 ratio, rat liver at 1:300, and mouse 
liver at 1:100. Homogenates are stored on ice for the duration of the experiment, and the 
original tissue samples are returned to the freezer at this time.  
The next step is the preparation of the eppendorfs and trial assignment. Each tube 
receives 80 uL homogenate and 100 uL cocktail. Each tissue type receives 5 eppendorfs for 
each substance being tested. 2 of these are control actives, and receive 20 uL of deionized 
water. The other 3 eppendorfs serve as the experimental sample, and receive 20 uL of the 
experimental substance.  Each eppendorf is labeled with a number, and the numbers are 
recorded with their content into a journal. Each sample is now complete and the conversion 
kynurenine to kynurenic acid begins.  
The samples are placed in an incubator for 22 hours are 37 degrees celsius. At the end 
of this period,the samples are removed from the incubator and placed on ice. The reaction is 
stopped by adding 20 uL 1% ​
trichloroacetic acid and 1 mL 0.1 N  hydrochloric acid to each 
sample. The samples are then centrifuged at 14,000 RPM for ten minutes.  
While the samples are being centrifuged, the next process is set up. Thin glass assay 
tubes (approx. 1 cm in diameter and tapered at the bottom) are arranged in a rack above a 
waste collection tray. A small glass bead is dropped in each tube. 200 uL of Dowex, an ion 
exchange resin that serves as a filter. Due to its viscous nature, the dowex is trapped in the tube 
by the glass bead, while less viscous liquids can slowly trickle through and drain out the bottom. 
2 mL of water is added to each tube, one mL at a time, allowing the first mL to completely drain 
before adding the second. After the water has fully drained, the process is repeated with 2 mL 
0.1 N HCL. Once this is done, a mL of the sample supernatant is added to each tube. Each tube 

receives its sample from a single corresponding eppendorf. After this, 1 mL 0.1 N HCl is added 
to each tube, and upon its draining, 1 mL of water is added to each tube. Once the water 
finishes draining, the rack is moved so each tube is positioned above a corresponding 
scintillation vial. Each vial is filled with 10 mL scintillation fluid beforehand. Once in position, the 
tubes are once again flushed with 2 mL water, one at a time. This process should result in the 
collection of kynurenic acid in the scintillation vial. As the KYNA was produced by radioactive 
kynurenine, it is also radioactive, and the level of radiation in each vial indicates the amount of 
KYNA produced, and therefore the level of KAT II activity.  
 To ensure a blind experiment, I am not informed of the identity of the experimental 
substances until after data collection and analysis is complete. A list of approximately 200 
substances was produced my mentor, and I will test all of them in the tissues stated previously. 
If any of them appear promising, I will test them at lower concentrations, and then in human liver 
and brain tissue.  
Risk and Safety:  
As with any biochem lab, there exists certain dangers one must be aware of in order to take 
proper precautions. First and foremost is the risk of exposure to caustic and harmful chemicals 
that could cause chemical burns or eye damage. Emergency showers and eyewash stations are 
present in each room to flush the affected area. Latex gloves are worn at any time when 
handling lab materials, and eye protection is used when needed. The latex gloves also protect 
myself from exposure to tissue, which is a potentially hazardous and pathogen risk. Though the 
levels of radiation used at the lab are quite low, precautions are still took to ensure safety. All 
radioactive materials and samples exposed to radiation are stored of and disposed of in 
specially marked areas that are properly insulated. The wash stations are used to remove 

radioactive material from the body, and spare clothes are kept incase a lab members become 
contaminated.  
 
Data Analysis:  
Using the DPM, a series of calculations will be performed to acquire the concentration of KAT II 
and its level of activity in each experimental treatment. These will be compared to the baseline 
for each set, and a chi­square will be used to determine if the inhibition is statistically significant. 
The p­value will be set at p<.05. Each sample will also be evaluated to determine its relative 
effectiveness of KAT II inhibition. Each of the substances will be ranked, and their effectiveness 
will be compared graphically to themselves at varying concentrations and to the other 
experimental substances.  
Discussion  
It is hoped that my research will result in the discovery of several promising candidates for KAT 
II inhibition. By creating a ranked risk of effective compounds, I hope to provide others in my lab 
with a starting point for further studies. The most promising candidates could be tested in vivo in 
rats, measuring both their neurophysiology with microdialysis and observe their behavior. Tests 
could be performed on the rats to assess changes in their cognition, as has been previously 
done at my lab. The side effects of said compounds could also be assessed. The end goal of 
course, is to provide a foundation for the creation of drugs that combat the cognitive deficits 
seen in schizophrenics.  
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
Bibliography  
 
Nilsson, L. K. (2005). Glutamatergic Mechanisms In Schizophrenia: Role of Endogenous 
Kynurenic Acid. Stockholm: Karolinska Institutet.  
 
Pershing, M. L., Bortz, D. M., Pocivavsek, A., Fredericks, P. J., Jorgensen, C. V., Vunck, S. A., 
Leuner, B., Schwarcz, R., Bruno, J. P. (2014). Elevated levels of kynurenic acid during gestation 
produce neurochemical, morphological, and cognitive deficits in adulthood: Implications for 
schizophrenia. Neuropharmacology, 90, 33­41.  
 
Wu, H.­Q., Okuyama, M., Kajii, Y., Pocivavsek, A., Bruno, J. P., & Schwarcz, R. (2014). 
Targeting Kynurenine Aminotransferase II in Psychiatric Diseases: Promising Effects of an 
Orally Active Enzyme Inhibitor. ​
Schizophrenia Bulletin,​
40​

(Suppl 2), S152–S158. 
http://doi.org/10.1093/schbul/sbt157