You are on page 1of 31

Analiza namirnica

49

HROMATOGRAFSKE METODE

Princip hromatografije
Sve hromatografske metode se svode na raspodeljivanje smee komponenata
izmeu dve razliite fizike faze. Pod fizikom fazom podrazumevamo deo prostora
jasno omeen meufaznom granicom od ostalog prostora. Zamislimo da se u ai
nalaze voda i hloroform dve tenosti koje se ne meaju. Hloroform e, kao gui,
obrazovati sloj na dnu ae, a iznad njega e biti sloj vode. Izmeu dva sloja postoji
jasna meufazna granica. Dve faze na isti nain predstavljaju led i voda ili voda i
vazduh.
Ako, na primer, u au stavimo jednake zapremine vode i hloroforma i u nju
unesemo neku supstancu, ona e se izmeu ove dve faze raspodeliti shodno
rastvorljivosti u svakoj od njih. Tu pojavu opisuje Nernstov zakon raspodele:
Cvoda
=K
C hloroform

Ako sada paljivo pipetom odvojimo sloj vode i unesemo ga u drugu au u kojoj se
nalazi jednaka koliina istog hloroforma, supstanca e, sledei Nernstov zakon, iz
vodenog sloja delimino prei u njega dok se ponovo ne zadovolji odnos
koncentracija. Isto tako, ako u prvu au na postojei sloj hloroforma dodamo istu
koliinu iste vode, supstanca e iz hloroforma delimino prei u nju, opet dok se ne
zadovolji gornji odnos koncentracija.
Proirimo opisani eksperiment i zamislimo da preko kadice napunjene hloroformom
ravnomerno struji tok vode. Ako se na poetku neka supstanca koja se inae
rastvara i u vodi i u hloroformu, nalazila samo u hloroformu, lako se moe razumeti
da e zbog istovremene rastvorljivosti u ova dva rastvaraa, ona vremenom biti
potpuno odnesena vodom. Nastavimo u istom duhu i zamislimo da su se u
hloroformu na poetku nalazile dve supstance A i B, koje se obe rastvaraju i u vodi i
u hloroformu, ali se u vodi A rastvara mnogo bolje nego B. Moe se pogoditi da e pri
strujanju vode iznad hloroforma u kadici, komponenta A biti iz njega mnogo pre
isprana vodom nego komponenta B.
Ovaj jednostavan zamiljeni eksperiment ukazuje na dva kljuna aspekta
hromatografskih metoda:
- Svaki hromatografski sistem sadri dve faze jednu stacionarnu
(nepokretnu) i drugu mobilnu (pokretnu).
- Pri proticanju mobilne faze preko stacionarne, u hromatografskom sistemu
se due zadravaju supstance koje imaju vei afinitet prema stacionarnoj fazi.
Shodno ovome, kada s mobilnom fazom u hromatografski sistem istovremeno
unesemo vie komponenata u obliku smee (uzorak), one e iz njega izlaziti posle
razliitog vremena, u zavisnosti od svojih relativnih afiniteta prema stacionarnoj,
odnosno mobilnoj fazi. To je ilustrovano sledeim emama:

Analiza namirnica

50

Dve faze miruju jedna iznad druge.


Komponente A, B i C se razliito rastvaraju u
svakoj od njih.
Faza I i Faza II na prvoj slici se meusobno ne meaju. Supstance A, B i C se u
razliitom stepenu rastvaraju u dve faze, tako da njihovi koeficijenti raspodele izmeu
faza I i II [Ki=(Ci)I/(Ci)II] stoje u sledeem odnosu:
KA>KB>KC
Od tri komponente, u Fazi I je najrastvorljivija komponta A, a u Fazi II komponenta C.
Komponenta B se u obe faze rastvara priblino jednako.

Faza I (mobilna) tee u smeru strelice preko faze


II (stacionarne). Komponente A, B i C se pri tome
razdvajaju.
Na drugoj slici je Faza II nepomina (stacionarna), dok se Faza I (mobilna) kree
preko nje u smeru strelice. Moe se zamisliti da se komponente A, B i C kreu s
Fazom I (slikovito: kotrljaju) brzinom koja je proporcionalna njihovoj rastvorljivosti u
toj fazi. Najbre se kree komponenta A, a najsporije komponenta C ona je najvie
"zaglibljena" u nepominu Fazu II. Zbog toga komponente u smeru sleva udesno
putuju razliitim brzinama razdvajaju se, i na kraju stacionarne faze izlaze
pojedinano. Ovo je princip svih hromatografskih metoda razdvajanja, a razlike u
tehnikama postoje zbog razliitih sila kojima dve faze (stacionarna i mobilna)
"privlae" komponente.
Klasifikacija hromatografskih metoda
Shodno agregatnom stanju primenjenih faza, sve hromatografske tehnike se mogu
podeliti u etiri grupe. Tako imamo:

Analiza namirnica

51

1. vrsto-gasnu hromatografiju
2. vrsto-tenu hromatografiju
3. Gasno-tenu hromatografiju
4. Teno-tenu hromatografiju
Povod za neke drugaije klasifikacije mogu biti i sami mehanizmi na osnovu kojih se
komponente smee iz uzorka raspodeljuju izmeu dve faze u kontaktu:
- Adsorpcija. Pojam podrazumeva koncentrisanje supstanci na graninoj povrini
dveju faza. Najee je jedna faza vrsta, pa se pod adsorpcijom uobiajeno
podrazumeva koncentrisanje komponenata iz rastvora (tene faze) ili iz smee
gasova (gasne faze) na vrstoj povrini. Stoga se vrsto-tena i vrsto-gasna
hromatografija nazivaju i adsorpcionom hromatografijom. Pri adsorpciji postoji
konstantan odnos izmeu koncentracije supstance u gasnoj ili tenoj fazi i na povrini
adsorbenta, odreen adsorpcionom izotermom.
- Rastvorljivost. Raspodela komponenata uzorka izmeu dve tene faze se vri
prema njihovoj rastvorljivosti u tim fazama. Odnos koncentracija komponente u dve
faze odreen je Nernstovim zakonom raspodele. Fenomen se tie uglavnom tenotene hromatografije.
- Isparljivost. Raspodela komponenata izmeu tene i gasovite faze odreena je, s
jedne strane, rastvorljivou u tenoj fazi, a s druge, njihovom isparljivou.
Isparljivost komponenata zavisi od njihovog napona pare i aktivnosti. Pojava je
karakteristina za gasno-tenu hromatografiju.
- Jonska izmena. Izmeu jona u rastvoru i jonogenih grupa na povrini vrste faze
uspostavlja se jonska ravnotea prema zakonu o dejstvu masa. Fenomen se
iskoriava kod jonoizmenjivake hromatografije koja spada u klasu teno-vrstih
hromatografskih metoda.
- Gel-filtracija. Raspodela komponenata smee izmeu tene i vrste faze ne vri se
prema afinitetu, ve prema veliini molekula komponenata. vrsta faza predstavlja
granulisan porozan materijal ije pore imaju irinu blisku veliini molekula
komponenata. Veim molekulima pore e biti manje dostupne, a manji e u njih lako
ulaziti, pa e se shodno tome molekuli razliitih veliina zadravati razliito vreme u
sistemu. Pojava strogo ne spada u hromatografiju (nema raspodele izmeu dve
faze), ve se koristi efekat razliite veliine "mrtve zapremine" sistema za molekule
razliite veliine, zbog ega im se vremena zadravanja razlikuju. Ipak, gel-filtracija
se uvek razmatra uporedo s hromatografskim metodama jer se tehniki izvode na
slian nain.
Hromatografske metode mogu se realizovati na razliite tehnike naine i obratno
slina tehnika moe se koristiti za izvoenje razliitih hromatografskih metoda. Stoga
se u praksi esto vri klasifikacija prema tehnikama. Najpoznatije tehnike
hromatografije su:
1. Hromatografija na papiru (engl. PC - paper chromatography)
Raspodela obuhvata adsorpciju komponenata iz rastvora na povrini listova
celuloznog papira.

Analiza namirnica

52

2. Tankoslojna hromatografija (engl. TLC - thin layer chromatography)


vrsta faza je prakasti adsorbent, imobilizovan na ravnoj ploi od inertnog
materijala. Raspodela komponenata vri se adsorpcionim mehanizmom izmeu
rastvora i adsorbenta.
3. Hromatografija na stubu (engl. CC - column chromatography)
vrsti, prakasti adsorbent spakovan je u vertikalnu kolonu kroz koju se proputa
tena, mobilna faza. Na isti nain se izvode i jonoizmenjivaka, odnosno gelhromatografija.
4. Hromatografija na invertovanoj fazi (engl. IPC - inverted phase chromatography)
Izvedba je kao kod TLC i CC, osim to je na adsorbent nanesena tena stacionarna
faza, tako da se raspodela vri izmeu nje i mobilne faze. Naneta tena faza menja
(invertuje) polarnost adsorbenta.
5. Tena hromatografija (engl. LC - liquid chromatography)
Pojam ukljuuje sve teno-tene i teno-vrste hromatografske metode, koje se
izvode na koloni. Takoe i jonoizmenjivaku i gel-hromatografiju.
6. Tena hromatografija visoke moi razlaganja (engl. HPLC - high performance
liquid chromatography) ili tena hromatografija pod visokim pritiskom (engl. HPLC high pressure liquid chromatography).
Pojam obuhvata tehnike tene hromatografije u posebnom aparativnom izvoenju
koje omoguuje izuzetnu kontrolu procesa i razdvajanje komponenata.
7. Gasna ili gasno-tena hromatografija (engl. GC - gas chromatography ili GLC gas-liquid chromatography)
Kontaktiranje gasne i tene ili vrste faze ostvaruje se u specijalnim dugakim
kolonama, ispunjenim stacionarnom fazom u prakastom obliku, sa ili bez nanete
tene faze, u posebnim ureajima.
8. Kapilarna gasna hromatografija (engl. Capillary GC)
Stacionarna tena faza nije naneta na vrsti adsorbent, ve na unutarnji zid uske,
veoma duge kapilare, kroz koju protie gasna faza. Koristi se u ureajima za GLC.

Analiza namirnica

53

ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA

U ovaj odeljak spadaju tehnike hromatografije na papiru, tankom sloju i stubu


adsorbenta, pa ih je, zbog slinosti mehanizma separacije, pogodno razmatrati
zajedno.
Istorijski posmatrano, hromatografija je kao metoda separacije i uvedena ba kao
adsorpciona hromatografija. Davne 1903. g., ruski naunik M.S. Cvet uspeo je da
razdvoji smeu biljnih pigmenata na stubu adsorbenta spirajui ih rastvaraem, pri
emu su se pojedinani pigmenti raspodeljivali du stuba adsorbenta u obliku
obojenih prstenova. Takav preparat Cvet je nazvao "hromatogramom", a metodu
"hromatografijom" (pisanje bojom).
Za sve adsorpcione tehnike zajedniko je postojanje vrste stacionarne faze
adsorbenta, od ijih osobina zavisi mogunost i kvalitet razdvajanja komponenata.
Adsorpcione sile
Kod neutralnih atoma se centar pozitivnog i centar negativnog naelektrisanja
poklapaju, pa se atom u odnosu na okolinu ponaa kao nenaelektrisana estica. Kad
se atom, meutim, unese u elektrino polje, pomenuti centri naelektrisanja se
razdvajaju i atom se polarizuje postajui elektrini dipol. Pri tome, stvaranje i
orijentisanje dipola slabi spoljno elektrino polje to je atom polarizabilniji, slabljenje
je vee. Sposobnost veeg ili manjeg polarizovanja atoma (stvaranja dipola) u
spoljnom elektrinom polju iskazuje se dielektrinom konstantnom materijala.
Ulogu spoljnog elektrinog polja koje izaziva polarizaciju atoma esto vre susedni
atomi unutar hemijskih jedinjenja. Jedan od dva uesnika u tzv. kovalentnoj vezi
obino jae privlai zajedniki elektronski par, tako da je sama veza polarizovana
predstavlja elektrini dipol. U graninom sluaju veoma jake polarizacije veze,
elektronski par u potpunosti prelazi na jedan od dva atoma i kovalentna veza
degradira u jonsku. Molekul moe sadrati vie polarizovanih i nepolarizovanih veza
iji se elektrini dipoli (ako postoje) vektorski sabiraju. Ako je zbir razliit od nule, tada
i molekul u celini poseduje stalni elektrini dipol. Na primer, polarizovane su veze
HO i CCl jer atomi kiseonika, odnosno hlora, koji su elektronegativniji od
vodonika, odnosno ugljenika, jae privlae elektronski par. Sa slike 2 vidi se da e
molekul vode zbog toga imati stalan dipol, ali molekul ugljentetrahlorida nee.

Slika 2

Analiza namirnica

54

Na slian nain se razmatra polarnost i pojedinih funkcionalnih grupa od kojih su


izgraeni molekuli, to u velikoj meri moe da pomogne pri razmatranju mogunosti
razdvajanja pojedinih komponenata sloene smee. Na slici 3 prikazan je redosled
polarnosti nekih funkcionalnih grupa.
-OCH3 < -NO2 < -N(CH3)2 < -COCH3 < -NH2 < -OH < -CONH2 < -COOH
Slika 3. Polarnost funkcionalnih grupa raste s leva u desno
Treba naglasiti da su redosledi polarnosti funkcionalnih grupa koji se esto citiraju u
literaturi samo priblini jer i ostatak molekula moe imati znatnog uticaja na polarnost.
Tako, na primer, u homologom nizu alifatinih alkohola ili kiselina polarnost molekula
opada sa duinom ugljovodoninog lanca.
Zbog opte tenje sistema ka elektroneutralnosti, izmeu polarnih molekula deluju
relativno jake privlane sile molekuli se tako orijentiu da im se elektrini dipoli
ponitavaju. Tenosti s polarnim molekulima obino su u znatnoj meri asosovane
njihovi molekuli ine vee ili manje grupacije uzajamno orijentisanih dipola, pa su
take kljuanja takvih tenosti obino visoke.
Kada se polarni molekul nae u blizini nepolarnog, on svojim elektrinim dipolom
moe da u nepolarnom molekulu indukuje privremeni elektrini dipol. Zbog toga e se
izmeu njih javiti privlane sile koje su ipak znatno slabije od sila izmeu dva
molekula sa stalnim dipolima.
Slabe privlane sile e se javiti ak i izmeu dva bliska nepolarna molekula, usled
privremenog uspostavljanja dipola. Pojava se objanjava injenicom da elektroni pri
svom kruenju oko jezgra nisu u svakom trenutku simetrino rasporeeni, pa je
ukupna nepolarnost atoma samo statistiki prosek. Dakle, iako molekul nema stalan
dipol, poremeaji njegovog elektrinog polja mogu indukovati iste takve poremeaje
polja u susednom molekulu, tako da se uspostavlja slabo privlaenje izmeu dva
privremena dipola.
Kada se razmatraju sile, pomou kojih se molekuli neke supstance vezuju za
povrinu vrste stacionarne faze, svi pomenuti fenomeni su zastupljeni, pa ipak,
obino ne svi istovremeno.
Redosled jaine ovih sila je sledei:
- Vandervalsovske sile (Londonove disperzione sile). Njima se ostvaruje upravo
opisana interakcija izmeu nepolarnih molekula adsorbata i nepolarne povrine
adsorbenta. Energija veze je mala, pa se veze lako raskidaju. Takva, fizika
adsorpcija poeljna je u hromatografiji, jer se komponente lako razdvajaju, a
koncentracione zone su dobro definisane.
- Indukcione sile. Molekuli adsorbata su polarni i indukuju elektrine dipole u
molekulima povrine adsorbenta. Energija adsorpcije je via nego u prethodnom
sluaju.
- Vodonine veze. Kada se u molekulima adsorbenta i adsorbata nalaze grupe koje
mogu da izmenjuju proton, na primer, hidroksilne, karboksilne ili amino-grupe, tada

Analiza namirnica

55

se izmeu njih uspostavljaju vodonini mostovi koji pojaavaju efekat ostalih sila.
Znatan broj adsorbenata ima hidroksilne grupe na povrini, tako da je ovakva veza
esto zastupljena.
- Kovalentne veze. Ukoliko su molekuli i adsorbata i adsorbenta veoma polarni, to
znai da su sastavljeni od atoma ija je razlika u elektronegativnosti velika, moe
doi do obrazovanja prave kovalentne veze na povrini adsorbenta. Energija
adsorpcije je visoka i odgovara energiji uspostavljanja kovalentne hemijske veze. U
hromatografiji je ova pojava, osim u specifinim sluajevima, nepoeljna, jer se
supstance esto adsorbuju nepovratno. U blaim sluajevima, one se mogu eluirati sprati sa adsorbenta polarnim mobilnim fazama, pri emu se obrazuju veoma
razvuene, asimetrine koncentracione zone s dugim "repovima", nepogodne za
kvantitativan rad.
Adsorbenti
Budui da se kod adsorpcione hromatografije raspodela komponenata uzorka vri
izmeu mobilne faze i povrine adsorbenta, ova kontaktna povrina mora biti
dovoljno velika da bi sistem bio efikasan. Stoga se za adsorbente koriste porozan
vrsti materijali u obliku sitnih granula ili praha, ija specifina povrina obino
prevazilazi 50 m2/g, a ponekad i 1000 m2/g. Ovako velika povrina kontakta ostvaruje
se veoma razuenim sistemom pora unutar pojedinih estica adsorbenta. Da bi ona
bila dostupna mobilnoj fazi, prenik estica adsorbenta treba da je to manji i na ovo
reenje se ide u tehnici tankoslojne hromatografije. Meutim, kod hromatografije na
stubu estice ne smeju da budu previe sitne jer takav sloj prua visok otpor
proticanju mobilne faze. Tipine vrednosti veliine estica za stubnu hromatografiju
kreu se u intervalu od 50 do 200 m.
Adsorpcija komponenata smee se ne vri na celoj povrini adsorbenta, ve na
pojedinim njenim mestima - aktivnim centrima, ija priroda zavisi od para adsorbent adsorbat. Na primer, supstance sa slobodnom karboksilnom grupom vezivae se za
bazne centre. Stoga podatak o specifinoj povrini mora biti dopunjen i podatkom o
aktivnosti broju aktivnih centara po jedinici povrine. Tipine vrednosti aktivnosti
iznose od 4 do 6 centara po 1 nm2. U Tabeli 1 prikazano je nekoliko adsorbenata,
redosledom rastue aktivnosti.
Tabela 1. Redosled aktivnosti pojedinih
adsorbenata
Adsorbent

Priroda aktivnih
centara

Saharoza
Skrob
Dijatomit
Silicijumdioksid
Magnezijumsilikat
Aluminijumoksid
Magnezijumoksid
Aktivni ugalj
Jonoizmenjivake smole

neutralna
neutralna
neutralna
kisela
kisela
kisela i bazna
bazna
neutralna i kisela
kisela i bazna

Analiza namirnica

56

Aktivnost adsorbenta moe se uglavnom regulisati koliinom vode, koju on sadri.


Pokaimo ovo na primeru silikagela tipinog adsorbenta.
Povrina silikagela koji je vazduno osuen (amorfnog silicijumdioksida), prekrivena
je fiziki adsorbovanom vodom. Pri postepenom zagrevanju do 150-2000 C deo te
vode se udaljava, ostavljajui za sobom hidroksilne grupe kao kisele centre (slika 4).

Slika 4
Hidroksilne grupe su polarne, a istovremeno su i donori protona, tako da se na
povrini prvenstveno adsorbuju polarna i bazna jedinjenja.
Tokom daljeg zagrevanju silikagela u temperaturnom intervalu od 200 do 4000 C, sve
vie susednih hidroksilnih grupa meusobno reaguju (slika 5) obrazujui siloksanske
grupe, zbog ega povrina gubi aktivnost.

Slika 5
Razmiljanje ove vrste moe se primeniti na veinu adsorbenata, koji imaju
mogunost ostvarivanja vodoninih veza.
Pri izboru adsorbenta za odreeni sistem, neophodno je voditi rauna o prirodi
aktivnih centara. Naime, adsobenti s veoma jakim kiselim ili baznim centrima mogu
hemijski reagovati s komponentama smee ili ispoljiti prema njima katalitiko dejstvo,
to dovodi do hidrolize, izomerizacije, kondenzacije i drugih neeljenih prateih
reakcija u sistemu. Takvo dejstvo adsorbenta se takoe moe regulisati koliinom
prisutne vode ili i drugih supstanci koje prvenstveno blokiraju najaktivnije centre.
Osobina adsorbenta koja u praksi ima najvei znaaj jeste njegova selektivnost pri
adsorbovanju razliitih jedinjenja jer je to i osnov za hromatografsko razdvajanje. Pri
tome, danas jo uvek ne postoji jedinstveno teorijsko znanje na osnovu koga bi se u
svakom pojedinanom sluaju, prema hemijskoj strukturi jedinjenja mogao odabrati
optimalan adsorbent, ali postoji izuzetno obiman eksperimentalni materijal koji
praktino omoguava svaki izbor.
Osnovno pravilo u izboru adsorbenta proizilazi iz razmatranja prirode
meumolekulskih sila koje uestvuju u adsorpciji: polarne supstance e se dobro
razdvajati na polarnim adsorbentima, a nepolarne na nepolarnim. Ako neku
supstancu mnogo jae privlai mobilna faza nego adsorbent, ona se uopte nee

Analiza namirnica

57

adsorbovati. U obrnutom sluaju, ona e se za adsorbent vezati hemijski. Za


postizanje hromatografskog razdvajanja nije dobro ni jedno ni drugo potrebno je
pronai neku sredinu izmeu ova dva granina sluaja.
Tako, na primer, za smee polarnih jedinjenja: alkohola, estara itd., koristiemo
polarni adsorbent: silikagel ili alumijumoksid, a za razdvajanje nepolarnih alifatinih
ugljovodonika, aktivni ugalj. Pri tome treba imati u vidu mogunost nepovratne
hemisorpcije jakih kiselina na baznim adsorbentima i obratno, jakih baza na kiselim
adsorbentima. Stoga emo smeu kiselina razdvajati na kiselom adsorbentu
silikagelu, a smeu baza na onom koji poseduje bazne centre, moda na
aluminijumoksidu. Treba naglasiti da su polarni adsorbenti primenljivi i za razdvajanje
jedinjenja s dvostrukim i trostrukim vezama, budui da se -veza lako polarizuje.
Za specifine potrebe povrina adsorbenta se moe modifikovati razliitim dodacima.
Na primer, nezasieni ugljovodonici se mogu razdvojiti od odgovarajuih zasienih
uglovodonika eluiranjem sa silikagela, impregniranog srebro-nitratom. Srebro-nitrat
gradi komplekse s dvostrukom i trostrukom vezom nezasienih jedinjenja i na taj
nain poveava njihovo vreme zadravanja u sistemu. U Tabeli 2 navedeno je
nekoliko takvih modifikatora.
Tabela 2. Neki naini modifikovanja adsorbenata
Modifikator
0,1-0,5 n kiselina ili baza
srebro-nitrat
borna kiselina, natrijum-borat
pikrinska kiselina
natrijum-bisulfit
bakar-sulfat

Jedinjenja koja se selektivno adsorbuju


jedinjenja, osetljiva na promenu pH
olefini i acetileni
polihidroksilna jedinjenja
policiklini aromatski ugljovodonici
aldehidi
amini

Osim pobrojanih osobina, komercijalni adsorbenti za primenu u adsorpcionoj


hromatografiji moraju posedovati standardizovana svojstva da bi se rezultati
pojedinih eksperimenata i laboratorija mogli porediti. S obzirom na vie osetljivih,
nedovoljno poznatih osobina adsorbenta koje u proizvodnji treba nepogreivo
reprodukovati, to nije lako izvesti, ali u dananje vreme, mnoge poznate svetske
firme bave se ovim problemom, tako da analitiar uglavnom moe raunati na
gotove, standardne adsorbente.
Pregled vanijih adsorbenata
Silikagel
Adsorbenti opte formule SiO2.xH2O nazivaju se: silikagel, silicijumdioksid,
silicijumova kiselina, kizelgur. Silikagel nastaje taloenjem iz rastvora alkalnih silikata
ili hidrolizom silicijumovih jedinjenja. Dobija se u obliku gela koji suenjem daje
amorfan, porozan, delimino hidratisan materijal. Promenom uslova obrazovanja gela
(na primer, promenom pH pri taloenju), dobijaju se estice razliite strukture,
specifine povrine od 200 do 800 m2/g, i prenika pora od 10-25 nm.

Analiza namirnica

58

Zbog mogunosti regulacije aktivnosti preko sadraja vode i lake dostupnosti,


silikagel je veoma zastupljen u hromatografskoj praksi. Polarnost, kiselost (pH
povrine 3-5) i prisustvo hidroksilnih grupa na povrini omoguuju mu iroku primenu
za razdvajanje nezasienih, aromatinih i uopte, polarnih jedinjenja. Zbog prisustva
kiselih centara, bazne supstance se na njemu snano adsorbuju, ponekad
nepovratno. Budui da je polarnog karaktera, pokazuje slabu adsorpciju i selektivnost
prema nepolarnim supstancama. S njega se one prve eluiraju.
Posebnu klasu silicijumdioksidnih adsorbenata ini dijatomit ili infuzorijska zemlja
mineral, nastao od fosilnih skeleta jednoelijskih praivotinja infuzorija, dijatomea.
Adsorpciona sposobnost dijatomita je niska i on se uglavnom ne koristi kao
adsorbent, ve kao pomono filtraciono sredstvo. Ponekada se koristi kao nosa
stacionarne tene faze u teno-tenoj ili gasno-tenoj hromatografiji.
Aluminijumoksid
Ovaj adsorbent se pored silikagela najee koristi u adsorpcionoj hromatografiji. I
on je polarne prirode, a red eluiranja supstanci s njega isti je kao kod silikagela.
Aktivira se zagrevanjem do 4000 C. Tipina specifina povrina mu je 100-200 m2/g,
a tipina veliina pora 3 nm.
U odnosu na silikagel, aluminijumoksid pokazuje i vane razlike:
- Jedinjenja sa nezasienim vezama na aluminijumoksidu se adsorbuju neto
jae, pa se i bolje razdvajaju. Stoga je ovo preporueni adsorbent za aromatine
ugljovodonike.
- Zbog prisustva kiselih, ali i jako baznih centara, jake kiseline se na njemu ne
mogu razdvajati jer se hemisorbuju. Slabe kiseline se mogu razdvajati, naroito ako
je mobilna faza bazna.
Primena aktiviranog aluminijumoksida za mnoge svrhe je iskljuena, zbog
katalitikog podsticanja razliitih neeljenih reakcija.
Osim silikagela i aluminijumoksida, kao adsorbenti se koriste i: magnezijumsilikat
(najpoznatiji komercijalni preparat je Florisil), kod koga se broj kiselih centara na
povrini lako moe regulisati dodatkom vode, zatim bazni i polarni magnezijumoksid,
slabi adsorbenti eeri, skrob i celuloza, nepolarni adsorbenti aktivni ugljevi,
kisele i bazne jonoizmenjivake smole.
Mobilna faza
Pri razmatranju selektivnosti adsorbenata ne treba zaboraviti ni prirodu mobilne faze
jer ona je drugi uesnik u meufaznoj separaciji i treba da zadovolji neke osnovne
kriterijume. Ona treba da dobro rastvara sve komponente uzorka, da se sama
minimalno adsorbuje na stacionarnoj fazi i ne sme da reaguje hemijski ni sa
stacionarnom fazom, ni s komponentama uzorka. Pored toga, pogodno je da ima
nizak viskozitet pod primenjenim uslovima kako bi uz to manji otpor prolazila kroz
sloj adsorbenta, ime se vreme analize znaajno skrauje.
Uslov rastvorljivosti komponenata uzorka treba razmatrati u smislu starog
alhemijskog pravila "slino se u slinom rastvara". Kako treba razumeti "slinost"?
Ako se pri meanju dve komponente ostvaruju veze sline jaine ili ak jae
meumolekulske veze od veza koje su vladale unutar svake od dve iste

59

Analiza namirnica

komponente, one e se meusobno dobro rastvarati. Primer je sistem voda


(polarna)etanol (polaran). Ako bi se, s druge strane, pri meanju dve komponente
izmeu njihovih molekula ostvarivale slabije veze, nego u istim komponentama,
tada bi do takvog meanja moglo doi tek uz dovoenje dodatne energije.
Komponente se spontano ne meaju, na primer: pentan (nepolaran)voda (polarna).
Konano, dva nepolarna jedinjenja: pentan i ugljentetrahlorid, lako se meaju jer se
obrazuju relativno slabe nove veze na raun raskidanja takoe relativno slabih veza.
Odavde sledi jednostavno pravilo: dobro se meusobno rastvaraju smee polarnih
supstanci i smee nepolarnih supstanci. Smee polarnih i nepolarnih supstanci se
meusobno samo ogranieno rastvaraju.
U hromatografiji se esto primenjuje eluiranje (spiranje) uzorka s kolone uzastopnim
nizom rastvaraa sve vee desorpcione moi (sve vee polarnosti), pri emu se
jedna po jedna komponenta desorbuje, redosledom rastue jaine adsorpcije. U vezi
s tim, veoma je ilustrativan tzv. eluotropni niz rastvaraa (Tabela 3), niz u kome su
rastvarai ureeni po opadajuoj sposobnosti desorpcije komponenata s polarnog
adsorbenta. Ovo je priblino i redosled kojim se smanjuje polarnost rastvaraa, o
emu svedoi i gotovo identino opadanje njihove dielektrine konstante, kao i
podatak o rastvorljivosti u vodi. Za nepolarne adsorbente, eluotropni niz je obrnut.
Tabela 3. Elutropni niz rastvaraa
Rastvara

Dielektrina
konstanta

Rastvorljivost u
vodi (g/100 g)

Voda
Metanol
Etanol
n-Propanol
Aceton
Dihloretan
Etilacetat
Amilacetat
Dietiletar
Dioksan
Hloroform
Metilenhlorid
Benzol
Toluol
Trihloretilen
Ugljentetrahlorid
Cikloheksan
Petroletar

81,0
31,2
25,8
22,8
21,5
10,4
6,1
4,4
5,2
2,3
2,3
3,4
2,2
2,0
1,9

0,7-0,9
8,5
slabo rastvoran
7,5

0,82
2
0,082
0,05
0,1
0,097
nerastvoran
nerastvoran

Pri izboru mobilne faze, njena polarnost se podeava prema polarnosti i adsorbenta i
adsorbujuih supstanci. Da bi se komponente uzorka uopte nale u mobilnoj fazi,
ona mora da ih rastvara, a da bi se s njom kroz sistem i kretale, njena polarnost mora
biti konkurentna polarnosti adsorbenta. Na primer, smea organskih kiselina nee se

Analiza namirnica

60

uopte eluirati sa silikagela nepolarnim heksanom. S druge strane, veoma polarna


mobilna faza - dietiletar, eluirae sve komponente praktino istom brzinom neselektivno. Potrebno je, dakle, nai takvu smeu heksana i dietiletra da polarnost
mobilne faze priblino odgovara polarnosti silikagela. Polarnost mobilne faze se, ba
kao u ovom primeru, regulie meanjem rastvaraa razliite polarnosti, pri emu broj
komponenata moe biti i 4-5. Pri tome, meutim, treba paziti da ne doe do
raslojavanja unutar mobilne faze.

Analiza namirnica

61

HROMATOGRAFIJA NA STUBU (KOLONI)

Tradicionalne tehnike
Kolona (slika 1) predstavlja vertikalnu staklenu ili plastinu cev koja na donjem kraju
moe da ima slavinu. Pri dnu je disk od poroznog stakla ili ep od staklene vune, ija
je svrha da nosi sloj adsorbenta. Kolona moe imati dvostruki zid kroz koji protie
voda odreene konstantne temperature.

Slika 1 Kolona za klasinu


stubnu hromatografiju
Kolona se puni odreenom koliinom stacionarne faze, na nju se nanosi uzorak i
tada kontrolisanim protokom dodaje mobilna faza koja se niz stub adsorbenta kree
pod dejstvom gravitacije. Efluent iz kolone se prikuplja u posebne sudove.
Kolona za stubnu hromatografiju obino je prenika 2-70 mm, a duine 15-150 cm.
Poto mobilna faza kroz kolonu tee pod dejstvom gravitacije, razdvajanje traje dugo,
to je i glavna mana ovakvog tipa hromatografije na stubu. S druge strane,
skraivanje stuba ubrzava proces, ali sniava kvalitet separacije komponente iz
kolone izlaze nedovoljno razdvojene.
Moderne tehnike (HPLC - hromatografija visoke moi razlaganja)
Sistem HPLC u naelu se sastoji od pumpe visokog pritiska (i do 350 bara), koja
obezbeuje stabilan, visok protok mobilne faze, zatim kolone, injektora ili ventila za
unos uzorka u kolonu i detektora (slika 2) sa ureajem za registrovanje rezultata.

Analiza namirnica

62

Slika 2 ematski prikaz HPLC sistema


Dodatnu opremu moe initi filter za rastvara, stabilizator pulsacija pumpe, monitor
pritiska, alarm previsokog pritiska, predkolona za zatitu analitike kolone od
zagaenja neistim uzorcima i kolektor frakcija. Da bi se skratilo vreme zadravanja
uzorka, odnosno njegovih komponenata u sistemu i time predupredilo difuziono
irenje koncentracionih zona, ceo ureaj je izveden od uskih, kapilarnih vodova, tako
da je mrtva zapremina sistema svedena na minimum. Ureaj je automatizovan, a
temperatura, sastav mobilne faze, njen protok i drugi parametri strogo se kontroliu.
Efluent iz kolone se analizira kontinuirano. esto ureaju pripada sopstveni raunar
za programiranje procesa i obradu podataka.
Aparatura za izvoenje HPLC je skupa, ali omoguuje veoma preciznu kontrolu
radnih uslova.
Zbog upotrebe visokog pritiska i shodno tome viih protoka mobilne faze, mogu se
koristiti odnosi duine i prenika kolone od 100:1 do 1000:1, pri emu je prenik
obino 2-3 mm, uz duine od 50-100 cm. Ovde se, takoe, moe koristiti adsorbent
znatno manje veliine estica: 5-15 m, u odnosu na raspon od 50-250 m kod
klasinih tehnika. Stoga je efikasnost razdvajanja ovakvih sistema veoma visoka.
Detekcija komponenata
Kod klasinih tehnika, eluent se sakuplja u porcijama u kojima se naknadno
analiziraju pojedine komponente specifinim ili nespecifinim metodama.
Kod HPLC se koncentracija komponenata prati kontinualno u struji mobilne faze, uz
korienje mnogih poznatih instrumentalnih, kao i nekih specifinih metoda.
1. Detektor indeksa refrakcije
Ovo je diferencijalni detektor, jer prati razliku indeksa refrakcije mobilne faze pre
ulaska i posle izlaska is kolone. Spada u univerzalne detektore. Osetljivost mu je oko
10 g komponente po ml efluenta.
2. UV-apsorpcioni detektori
Ovi detektori mogu raditi pri razliitim talasnim duinama, ali se najvie koristi talasna
duina od 254 nm, koju emituje ivina lampa niskog pritiska. Detektor je selektivan, tj.

Analiza namirnica

63

ogranien na detekciju onih supstanci koje apsorbuju ili fluoresciraju u ovoj oblasti
spektra. Moe se detektovati do 1 ng supstance.
Oba opisana detektora znaajna su za praenje neobojenih supstanci.
3. Kolorimetrijski detektori
Prati se apsorpcija vidljivog zraenja, bilo u originalnim, bilo u derivatiziranim
komponentama uzorka. U drugom sluaju, u struju efluenta se kontinualno dozira
reagens za obrazovanje boje, pri emu se mora dopustiti da supstance tokom
odreenog vremena izreaguju, to produava vreme analize i doprinosi irenju
koncentracionih zona.
4. Konduktometrijski detektor
Funkcionie na principu praenja elektrine provodljivosti efluenta. Primenjuje se,
uglavnom, kod mobilnih faza, koje sadre vodu. Granica detekcije je oko 10 g.
5. Plameno-jonizacioni detektor s pokretnom icom
Kroz efluent na izlazu iz kolone stalno se provlai beskonana ica koja se zatim sui
od rastvaraa i unosi u plameno-jonizacioni detektor, gde sagorevaju komponente
koje su na njoj zaostale. (Plameno-jonizacioni detektor e biti detaljnije opisan kod
gasne hromatografije). Osetljivost mu je 1 - 4 g/ml, uz kvantitativan, linearan
odgovor.
6. Detektor radioaktivnosti
Metoda se primenjuje u sluajevima razdvajanja prirodnih ili vetakih radioaktivnih
supstanci.
Primer klasinog razdvajanja
Prema originalnom lanku: Johnston, J.J., Ghanbari, H.A., Wheeler, W.B.,
Kirk, J.R. 1983. Characterization of Shrimp Lipids. J. Food Sci., 48, 33.
Razdvajanje lipida na klase neutralnih, gliko- i fosfolipida
20 g Silikagela 60 (70-230 mea) suspenduje se u hloroformu i
izrui u staklenu kolonu (1,5 x 20 cm). Na gornji sloj pakovanog
silikagela postavi se sloj od 1 cm anhidrovanog natrijumsulfata.
Na kolonu se nanosi do 1 g lipida, kao rastvor u 1 ml
hloroforma. Lipidi se eluiraju sukcesivno sa po 400 ml
hloroforma (neutralni lipidi), acetona (glikolipidi) i metanola
(fosfolipidi). Svaka od tri eluirane frakcije upari se pod snienim
pritiskom, pri 300 C, do zapremine od oko 10 ml, zatim prebaci
u tariranu posudu i ostatak rastvaraa otpari u struji suvog
azota, pri 350 C. Konano se frakcije osue do konstantne
mase u eksikatoru nad CaSO4.

64

Analiza namirnica

Napomena: Neutralnim lipidima bi pre odgovarao naziv "umereno polarni lipidi", za


razliku od veoma polarnih gliko- i fosfolipida, koji sadre polarne eere i fosfatne
grupe. U neutralne lipide spadaju: ugljovodonici, holesterol i holesterilestri, mono-, dii trigliceridi i slobodne masne kiseline.
Razdvajanje frakcije neutralnih lipida na pojedine klase
Oko 300 mg neutralnih lipida, rastvorenih u 1 ml heksana,
nanosi se na kolonu (1,5 x 30 cm), pakovanu sa 25 g Florisila
(100-200 mea), pre upotrebe aktiviranog pri 2600 C, tokom 8
sati i tada hidratisanog sa 7% vode (w/w). Neutralni lipidi se
frakcioniu eluiranjem rastvaraima, uzastopno rastue
polarnosti (Tabela 1), pri emu se prikupljaju frakcije po 7 ml.
Lipidni sadraj svake frakcije odreuje se gravimetrijski, po
uparavanju rastvaraa i suenju. istoa i identitet svake
frakcije proveravaju se tankoslojnom hromatografijom, uz
standarde.
Tabela 1 (uz Primer)
Frakcija

Zapremina
eluenta (ml)

Ugljovodonici
Holesterilestri
Trigliceridi
Holesterol
Digliceridi
Monogliceridi
Slobodne masne kiseline

60
80
120
100
100
100
150

Eluent
heksan
5% etra u heksanu
15% etra u heksanu
25% etra u heksanu
50% etra u heksanu
2% metanola u etru
4% siretne kiseline u etru

Razdvajanje frakcije fosfolipida na pojedine klase


Kolona (2 x 40 cm) spakuje se hloroformskom suspenzijom
Silikagela 60 (70-230 mea), aktiviranog i hidratisanog sa 7%
vode. Kolona se prvo ispere sa 200 ml metanola, a potom sa
200 ml hloroforma. Na vrh kolone uspe se sloj od 1 cm
anhidrovanog natrijumsulfata, a potom unese uzorak od oko
500 mg fosfolipida u 1 ml hloroforma. Eluiranje se vri sa: 400
ml 15% metanola u hloroformu (v/v), pri emu se skupljaju
frakcije po 15 ml u tarirane posude, a zatim, jedno za drugim,
sa 400 ml 35% metanola u hloroformu i 400 ml metanola. Ove
dve frakcije od po 400 ml upare se na oko 10 ml metanola i
kvantitativno prenesu u tarirane posude. Po uparavanju i
suenju, sadraj lipida se odreuje gravimetrijski. Identitet se
potvruje tankoslojnom hromatografijom, uz standarde.
Opisanom procedurom, autori su u lipidima kampa nali sledee fosfolipide:
sfingomijelin, fosfatidilserin, fosfatidilholin i fosfatidiletanolamin.

Analiza namirnica

65

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC)

Jedna od adsorpcionih hromatografskih tehnika hromatografija na listovima


celuloznog papira je zahvaljujui svojoj jednostavnosti nala veoma iroku primenu u
istraivakom radu, pa ipak, upotreba iskljuivo celuloze kao stacionarne faze
neizbeno je ograniila mogunosti ove metode. Stoga su injeni mnogi pokuaji da
se ovo prevazie. Sadanji sistem hromatografije na tankom sloju postavio je
Kirchner sa saradnicima 1951. godine, a metoda je postala popularna tek poto je
Stahl objavio obimnu knjigu iz ove oblasti (1962.) u kojoj je opisao komercijalni ureaj
za nanoenje tankog sloja i odgovarajue adsorbente.
Najee se adsorbent u suspenziji na pogodan nain razvlai po povrini ploe od
stakla ili drugog materijala i suspenzija sui dajui sloj tipine debljine 0,25 mm.
Takva ploa se dalje koristi kao i list papira tehnika rada je veoma slina.
Tehnika razdvajanja na tankom sloju
Hromatografija na tankom sloju adsorbenta se izvodi tako to se blizu ivice ploe na
koju je nanesen adsorbent specijalnom kapilarom nanese rastvor uzorka u vidu kapi
ili linije koju ini vie kapi, rastvara otpari na vazduhu, a zatim taj kraj ploe
vertikalno uroni svojom ivicom u mobilnu fazu. Mobilna faza se kapilarnim silama
penje uz sloj adsorbenta, na svom putu nailazi na mrlje uzorka, delimino iz njih
rastvara komponente i nosi ih razliitim brzinama sa sobom. Kada front mobilne faze
dostigne dovoljnu visinu, ploa se vadi i sui, a potom se zone pojedinih
komponenata uporeuju.

Izgled razvijene ploe s tankim slojem adsorbenta na koju su naneti


nepoznati uzorak i poznati standard
Ve je naglaeno da je vreme zadravanja karakteristika svake komponente uzorka
u datom hromatografskom sistemu. Kod hromatografije na tankom sloju nije pogodno
meriti vreme izlaska komponenata iz sistema jer se to pri uobiajenim uslovima rada

Analiza namirnica

66

ne dogaa, ve se tokom odreenog trajanja eksperimenta registruje relativno


zaostajanje komponenata za frontom mobilne faze, pri emu se rastojanja obino
mere od linije nanoenja uzorka do centra koncentracionih zona (mrlja)
komponenata. Karakteristino zaostajanje komponente naziva se Rf-vrednost
komponente (gornja slika):
Rf =

put komponente
a
100 = 100
put mobilne faze
b

Na taj nain, Rf-vrednost je veliina, obrnuto proporcionalna vremenu zadravanja


komponente u sistemu.
Kod hromatografije na tankom sloju uslovi pojedinanog eksperimenta teko se
mogu ponoviti, tako da poreenje Rf-vrednosti nije pouzdano. Stoga se u uzorak
unosi unutranji standard (x), i sve Rf-vrednosti porede s njim:
Rx =

put komponente
a
100 = 100
put standarda
c

Ovakav postupak kompenzuje nehomogenost tankog sloja adsorbenta, temperaturne


fluktuacije i mnoge neregularnosti drugih uslova eksperimenta.
Kada je re o reproduktivnosti Rf i Rx-vrednosti, treba odmah rei da ove
karakteristike nisu dovoljne za sigurnu identifikaciju supstanci zbog mnogih
eksperimentalnih faktora koje ne moemo kontrolisati.
Koncentracione zone komponenata u idealnom sluaju predstavljaju krunu ili ovalnu
mrlju koja postepeno uveava dimenzije (difuzno irenje) tokom putovanja s
mobilnom fazom. U mnogim sluajevima oblik zona je deformisan javljaju se mrlje s
jednim ili dva repa, preklapanje mrlja dve komponente ili jedinstvena supstanca daje
dve ili vie mrlja. Uzroci ovakvih anomalija nisu u potpunosti poznati, no
hromatografski sistem se moe iskoristiti i u ovakvim sluajevima, ukoliko omoguuje
reproduktivnu separaciju komponenata.
Stacionarna faza
Adsorbenti korieni za stacionarnu fazu odgovaraju materijalima koji se
upotrebljavaju kod hromatografije na koloni, osim to su estice znatno manjih
dimenzija. Adsorbenti obino sadre i vezivo da bi se pojaala adhezija izmeu sloja i
ploe, a kod nekih se dodaje i inertni fluorescentni indikator (na primer, cink-silikat)
koji pomae pri detekciji koncentracionih zona pod ultraljubiastom svetlou. Takva
posebna obrada adsorbenta posebno se i oznaava, pri emu su oznake gotovo
standardizovane. U Tabeli 1 dati su neki primeri za silikagel, moda najee
korieni adsorbent u hromatografiji na tankom sloju.
Prisustvo dodataka moe da izmeni osobine adsorbenta ili da onemogui primenu
nekih mobilnih faza, odnosno sredstava za vizuelizaciju koncentracionih zona.

Analiza namirnica

67

Tabela 1. Oznake komercijalnih silikagelova za TLC


Silkagel H

bez dodataka

Silikagel G

uz dodatak gipsa kao veziva

Silikagel S

uz dodatak skroba kao veziva

Silikagel F-254

uz dodatak fluorescentnog indikatora za


podruje talasne duine od 254 nm

Silikgel GF-254+366

uz dodatak gipsa kao veziva i


fluorescentnog indikatora za podruje
254 i 366 nm

Silikagel PF

za preparativnu hromatografiju, uz
dodatak fluorescentnog indikatora

Tanki sloj se moe modifikovati na razliite naine u cilju zadovoljenja specifinih


potreba. Na primer, za sloj se moe upotrebiti adsorbent sastavljen od vie
komponenata ili se na istoj ploi mogu obrazovati dva susedna sloja od razliitih
adsorbenata. Sloj se moe impregnirati puferima, agensima za precipitaciju (na
primer, sulfidom za razdvajanje metalnih jona), agensima za kompleksiranje (na
primer, boratima za eere), agensima za helatiziranje (za neorganske jone), srebronitratom (za nezasiena jedinjenja), hidrofobnim materijalima (za postizanje inverzije
faza) itd.
Priprema sloja adsorbenta

Slika 1 Komercijalni ureaj za nanoenje tankog sloja


Za nanoenje sloja postoji niz komercijalnih aparata, od kojih je jedan prikazan na
Slici 1. On se sastoji od plastine podloge, na koju se reaju staklene ploe
(20x20 cm ili 20x10 cm), i aplikatora s podesivim razrezom, koji se puni suspenzijom
adsorbenta, postavlja na kraj niza ploa, i prevlai preko njega, pri emu iza sebe
ostavlja tanak, ravnomeran sloj suspenzije. Razrez se moe podeavati u intervalu
od 0-2000 m (0-2 mm). Rezervoar aplikatora moe se podeliti na dva dela i u njih
usuti suspenzije dva razliita adsorbenta za obrazovanje dva razliita susedna sloja
na ploama.
Suspenzija adsorbenta pravi se u odreenoj koliini vode, organskog rastvaraa ili
smee vode i organskog rastvaraa, pri emu se treba strogo pridravati uputstva
proizvoaa. Obino se primenjuje suspendovanje tokom 30-60 sekundi u
elektrinom mikseru. Ako adsorbent sadri vezivo, mora se odmah po
suspendovanju naneti na ploe da se ne bi stegao i postao neupotrebljiv. Brzina

Analiza namirnica

68

vezivanja gipsa, estog vezivnog materijala, moe se smanjiti ako se umesto iste
vode za suspenziju upotrebi smea vode i metanola.
Prevuene ploe se ostave da se osue na vazduhu, a zatim se aktiviraju prema
uputstvu, odnosno potrebi, najee (SiO2, Al2O3) pri 100-1200 C. Slojevi celuloze,
jonoizmenjivakih smola, poliamida samo se sue na vazduhu, a gel Sephadexa
koristi se odmah po nanoenju, dok je jo u nabubrelom stanju.
Ako je potrebno, ploe se impregniraju tako to se prskaju ili potapaju u rastvor
impregnacionog sredstva ili se jednostavno urone donjim krajem u rastvor i pusti da
se on kapilarnim silama upije do vrha ploe, posle ega se sue i kondicioniraju.
Na tritu ima vie proizvoaa koji isporuuju gotove ploe za tankoslojnu
hromatografiju, kako na staklu, tako i na fleksibilnoj aluminijumskoj foliji ili filmu.
Garantovanog su sastava i uniformnosti, a fleksibilne ploe imaju prednost to se
mogu sei.
Tehnika tankoslojne hromatografije
Nanoenje uzorka
Nanosi se 0,1-1% rastvor u koliini od 1-25 l. Zone uzorka na poetnoj liniji treba da
su prenika od 1-3 mm, meusobno udaljene 1-2 cm, na 1,5-2 cm od ivice ploe. Za
analitiki rad, uzorak se nanosi u koliini od 1 g do 1 ng.
Postoje komercijalni ureaji za automatsko, reproduktivno nanoenje.
Izbor sistema: mobilna faza/adsorbent
U Tabeli 2 dat je prikaz nekih esto korienih sistema za razliite klase jedinjenja.
Tabela 2. Neki esto korieni sistemi za tankoslojnu hromatografiju
razliitih klasa jedinjenja
1. 2,4-dinitrofenilhidrazoni aldehida ili ketona
a. Heksan/etilacetat (4:1 ili 3:2) - silikagel
b. Benzen ili hloroform ili etar ili benzen/heksan (1:1) - aluminijumoksid
c. Smee petroletra/benzena s malo piridina - cinkkarbonat
2. Amini
a. Etanol(95%)/amonijak(25%) (4:1) - silikagel
b. Aceton/heptan (1:1) - aluminijumoksid
c. Aceton/voda (99:1) - kizelgur G
3. Karboksilne kiseline
a. Bezen/metanol/siretna kiselina (45:8:8) - silikagel
b. Metanol ili etanol ili etar - poliamid

Analiza namirnica

69

Tabela 2. Neki esto korieni sistemi za tankoslojnu hromatografiju


razliitih klasa jedinjenja (nastavak)
4. Sulfonamidi
a. Hloroform/etanol/heptan (1:1:1) - silikagel G
5. Insekticidi
a. Cikloheksan/heksan (1:1) ili ugljentetrahlorid/etilacetat (8:2) - silikagel G
b. Heksan - aluminijumoksid
c. Heptan, zasien siretnom kiselinom - silikagel S
d. Hloroform - silikagel G, impregniran oksalnom kiselinom
6. Lipidi
a. Petroletar/dietiletar/siretna kiselina (90:10:1) do (70:20:4) - silikagel G
b. Petroletar/dietiletar (95:5) - aluminijumoksid
c. Hloroform/metanol/voda (80:25:3) - silicijumova kiselina
7. Glikolipidi
a. Propanol/amonijak(12%) (4:1) - silikagel G
8. Fosfolipidi
a. Hloroform/metanol/voda (60:35:8 ili 65:25:4) - silikagel
9. Aminokiseline
a. Butanol/siretna kiselina/voda (3 ili 4:1;1) - silikagel
10. Steroidi i steroli
a. Benzen ili benzen/etilacetat (9:1 ili 2:1) - silikagel G
b. Siretna kiselina/voda (92:8 ili 90:10) - kizelgur G, impregniran
undekanom
11. Vitamini
a. Metanol, ugljentetrahlorid, ksilol, hloroform ili petroletar - aluminijumoksid
b. Metanol, propanol ili hloroform - silikagel G
c. Aceton/parafin (zasieno vodom) (9:1) - silikagel, impregniran parafinom
12. eeri
a. Benzen/siretna kiselina/metanol (1:1:3) - silikagel, impregniran bornom
kiselinom

Detekcija i identifikacija komponenata


Hromatogram se po suenju obrauje reagensima za bojenje koji su poznati iz
hromatografije na papiru, pri emu je na tankom sloju silikagela mogue upotrebiti i
brojne korodivne, destruktivne supstance. U nastavku je opisano nekoliko
univerzalnih metoda.

70

Analiza namirnica

1. Jodna para. Ploa se unosi u komoru na ijem dnu se nalazi nekoliko kristala joda
ili se prska rastvorom joda u ugljentetrahloridu. Veina organskih supstanci pojavljuje
se u vidu utih mrlja, pri emu se nezasiena jedinjenja boje intenzivnije. Ukoliko se
eli da se komponente ouvaju za dalju analizu ili eluiraju s ploe, izlaganje jodnoj
pari treba da traje kratko, esto samo desetak sekundi. Adsorbovani jod se s ploe
moe ukloniti strujom vazduha. Ovaj reagens, naravno, nije mogue primeniti na
adsorbentima kod kojih je vezivo skrob.
2. Prskanje vodom. Ploa se prska vodom dok ne postane transparentna i posmatra
u proputenoj svetlosti. Koncentracione zone organskih jedinjenja pojavljuju se kao
neprovidne ("masne") bele mrlje. Reagens je oigledno nedestruktivan.
3. pH-indikatori. Pri prskanju rastvorom
komponente boje se odgovarajuom bojom.

indikatora,

kisele,

odnosno

bazne

4. Smee sumporne kiseline. Ovo je opti reagens za nespecifinu lokalizaciju zona


svih organskih jedinjenja. Postoji niz ovakvih smea s vodom ili i drugim oksidacionim
reagensima (hromsumporna kiselina), kojima se ploa prska i zagreva tokom
odreenog vremena pri odreenoj temperaturi. Komponente se pojavljuju u obliku
tamnih ugljenisanih mrlja, pri emu esto tokom zagrevanja odreena jedinjenja
menjaju boju na specifian nain koji se moe iskoristiti za njihovu prilinu
identifikaciju. Reagens se ne moe primeniti na ploe sa skrobom.
5. Metod vrue ice. Komponente se mogu ugljenisati i tako to se iznad ploe, na
kratkom odstojanju (1 mm), prevlai elektrootporna usijana ica (cekas ili nihrom).
Metoda je neprimenljiva za ploe vezane skrobom.
6. UV-svetlost. Jedinjenja koja ne fluoresciraju pojavlju se kao tamne mrlje na svetloj
pozadini, ako je u sloj dodat fluorescentni indikator. Obratno, na sloju bez indikatora,
vidljive su svetle mrlje fluorescirajuih jedinjenja na tamnoj pozadini. Metoda je
nedestruktivna. Za specifinu, bliu identifikaciju jedinjenja, mogu se koristiti sve
metode iz oblasti hromatografije na papiru.
Kvantitativna analiza
Za kvantitativno odreivanje mrlja direktno na sloju se koriste fotodenzitometri
ureaji koji na osnovu intenziteta reflektovane svetlosti izraunavaju koliinu
materijala u mrlji.
Kod hromatografije na tankom sloju iroko se koristi metoda skidanja mrlja i njihovog
daljeg analiziranja drugim metodama. Podruje sloja pod mrljom izgrebe se iglom i uz
pomo vakuuma usisa neposredno u minijaturnu kolonu, odakle se eluira polarnim
rastvaraem. Ovde mogu nastati tekoe kod spektrofotometrijske analize jer se pri
spiranju ne moe izbei prelaz najfinijih estica adsorbenta u eluat, naroito ako se
eluiranje vri vrlo polarnim rastvaraima. Sitne estice rasipaju svetlost i sniavaju
tanost odreivanja.

Analiza namirnica

71

GASNA (GASNO-TENA) HROMATOGRAFIJA (GC, GLC)

Kod ove metode mobilna faza je gasna, dok stacionarna faza moe biti vrsta (gasna
hromatografija - GC) ili tena, naneta na vrst nosa, odnosno unutarnji zid kapilarne
kolone (gasno-tena hromatografija - GLC). Ovaj drugi sluaj je mnogo vaniji i ei
u praksi.
Kod gasno-tene hromatografije, mobilna faza je uvek neselektivna, tj. predstavlja
inertnu, pokretnu atmosferu, u koju komponente uzorka prelaze iskljuivo zbog
sopstvene isparljivosti. S druge strane, afinitet komponenata ka stacionarnoj fazi se
ne ostvaruje uvek mehanizmom rastvorljivosti, ve esto znaajnu ulogu igra i
adsorpcija na povrini, kako tenog sloja, tako i na povrini nosaa stacionarne faze.
Ovde je znaajan faktor i temperatura koja izuzetno utie na rezoluciju komponenata.
Aparatura
Na slici 2 je ematski prikazan sistem za gasno-tenu hromatografiju.

Slika 2 ema sistema za gasno-tenu hromatografiju


Nosei gas (mobilna faza) mora odgovarati primenjenom detektoru, biti inertan, ist,
suv i jeftin. Tipian protok noseeg gasa u analitikom radu kree se izmeu 25 i 125
ml/min.
Uzorak se u gasnu struju unosi kroz injektor, putem mikroprica ili specijalnih ventila
za uzorkovanje. Tipina koliina rastvora ubrizganog uzorka u analitikom radu iznosi
od 0,1 do 50 l, a ako su u pitanju gasoviti uzorci, onda izmeu 0,1 i 50 ml. Injektor
mora biti zagrejan do temperature dovoljne za potpuno isparavanje uzorka.
Kolone su obino od stakla, nerajueg elika ili bakra prave, savijene ili u obliku
navoja. Ispunjene su prakastim nosaem, impregniranim stacionarnom fazom.
Pakovanje adsorbenta je sabijeno izmeu dva epa od staklene vune na krajevima
kolone. Prenik analitikih kolona kree se od 2 do 6 mm, a duina od 2 do 30 m.
Ako je kolona kapilarna, dakle bez adsorbenta, tada joj se prenik moe kretati od
0,25 do 0,75 mm, a duina od 30 do 300 m. Budui da je temperatura eksperimenta
znaajna karakteristika, kolone se smetaju u poseban termostat.

Analiza namirnica

72

Detektor ima ulogu da otkrije prisustvo i odredi koncentraciju komponente u izlaznoj


struji noseeg gasa. Dobar detektor treba da ima visoku osetljivost, da daje linearan
odgovor u irokom rasponu koncentracija i da njegov rad ne podlee varijacijama
protoka i temperature. Detektor se termostatira barem na temperaturu kolone da u
njemu ne bi dolo do kondenzovanja komponenata uzorka.
Signal iz detektora se preko odgovarajueg pojaivaa alje pisau i belei u funkciji
vremena.
Komponente koje izlaze iz kolone mogu se skupljati u hlaene kapilarne cevi ili u
odgovarajue posude.
Stacionarna faza
Kod gasno-tene hromatografije vrsta faza ima preteno ulogu nosaa tene
stacionarne faze i stoga treba da je inertna, fiziki postojana i dovoljne specifine
povrine. Za nosae se koriste razni oblici deaktiviranog silicijumdioksida (dijatomit,
kizelgur) ija se povrina dodatno obrauje da bi postala inertnija. Najefikasnije je da
se povrina silanizira (slika 3), pri emu se blokiraju zaostale hidroksilne grupe. Kod
kapilarnih staklenih kolona unutarnji zid se takoe podvrgava istoj obradi.

Slika 3 Postupak blokiranja hidroksilnih grupa na povrini silikagela


Kolona ima najveu efikasnost kada je veliina estica nosaa u uskom rasponu,
naprimer 60-80 mea (0,25-0,18 mm), 80-100 mea (0,18-0,15 mm), ili 100-125
mea (0,15-0,13 mm).
Tena stacionarna faza u radnim uslovima treba da ima nizak viskozitet i da pokazuje
visoku selektivnost rastvaranja razliitih komponenata uzorka. Ona ne sme da
reaguje sa vrstim nosaem (osim ako se na taj nain imobilizuje na njemu), niti da
isparava u znaajnijoj meri. Zbog toga se za svaku stacionarnu fazu preporuuju
donja i gornja temperaturna granica primene. Tena stacionarna faza se nanosi na
vrsti nosa u koliini od 2-20%, pri emu manja koliina omoguava bre
razdvajanje, pri nioj temperaturi, ali istovremeno smanjuje kapacitet kolone.
Tene stacionarne faze mogu se klasifikovati prema polarnosti. Najpolarnije tenosti
vezuju komponente uzorka jakim vodoninim vezama, dok kod onih najmanje
polarnih izmeu molekula stacionarne faze i molekula komponenata deluju samo
slabe vandervalsovske sile. Izbor stacionarne faze vri se tako da njena polarnost
priblino odgovara polarnosti komponenata (prema navedenom alhemijskom pravilu:

73

Analiza namirnica

"slino se u slinom rastvara"). U Tabeli 3 su navedene neke tipine stacionarne faze


prema redosledu rastue polarnosti uporedo s maksimalnim temperaturama njihove
primene.
Tabela 3. Neke stacionarne faze za GLC, u nizu rastue polarnosti
Stacionarna faza

Maksimalna
temperatura
korienja (0 C)

Squalan (C30H62, razgranat)


Apiezon-L mast (A.E.I., England)
Didecilftalat
Di-(2-etilheksil)sebacinat
Metilsilikonsko ulje, niskog viskoziteta (DC-200,
Dow Corning)
Fenilsilikonsko ulje (DC-550, Dow Corning)
Metilsilikonska guma (SE-30, General Electric)
Polietilenglikol (Carbowax 1540, Union Carbide)
Polialkilenglikol (Ucon Oil LB-550-X, Union Carbide)
Polialkilenglikol (Ucon Oil 50-HB-2000, Union
Carbide)
Polifeniletar (OS-138)
Poliestar butandiolsukcinat "BDS"
Poliestar dietilenglikolsukcinat "DEGS"

150
250-300
165-170
150
200
180-220
300-350
150
180-200
180-200
200-225
200-205
205-210

Nosei gas
Nosei gas, osim to treba da je inertan, treba da ima i to veu molekulsku masu jer
se na taj nain smanjuje difuzioni koeficijent komponenata uzorka u njemu i shodno
tome, difuziono irenje koncentracionih zona. Zbog toga se obino za nosei gas
koristi azot (M=28) ili argon (M=40). Za specifine svrhe, npr. pri upotrebi
termokonduktometrijskog detektora (o kome e kasnije biti rei), koriste se, s druge
strane, gasovi najnie mogue molekulske mase: vodonik i helijum, upravo zato to
im se koeficijent termike provodljivosti veoma razlikuje od svih drugih supstanci, pa
se prisustvo komponenata u njima moe lako pratiti. Osim toga, pomenuti gasovi su
niske gustine, to omoguuje primenu visokih protoka i ostvarivanje kraeg vremena
razdvajanja.
Temperatura kolone
Budui da se kod gasno-tene hromatografije raspodela komponenata izmeu
noseeg gasa i stacionarne faze vri na osnovu razlika izmeu njihove isparljivosti i
rastvorljivosti, radna temperatura sistema ima izuzetan znaaj. Povienje
temperature izaziva poveanje isparljivosti i smanjenje rastvorljivosti komponenata,
zbog ega se komponente krae zadravaju u koloni, koncentracione zone su jasnije

Analiza namirnica

74

izraene, ali je razdvajanje komponenata loije. S druge strane, sa snienjem


temperature raste rastvorljivost komponenata, to omoguuje njihovu potpuniju
interakciju s polarnom stacionarnom fazom i vodi boljoj rezoluciji, ali i produenom
vremenu analize. Vie temperature po pravilu poboljavaju razdvajanje komponenata
prema isparljivosti, a nie prema polarnosti.
Na osnovu prethodnog razmatranja proizlazi da za svako konkretno razdvajanje
postoji neka kompromisna temperatura, s tim to treba voditi rauna i o maksimalnoj
temperaturi korienja stacionarne faze, kao i o riziku da komponente uzorka pri
viim temperaturama reaguju s njom ili nezavisno od nje, pretrpe strukturne i
hemijske promene.
Kod gasno-tene hromatografije uestvuje i pojava koja se ne sree kod drugih vrsta
hromatografije: razdvajanje se postie ne samo prema afinitetu, ve i prema
isparljivosti. Tako e, na primer, homologi niz alifatinih ugljovodonika (dakle
jedinjenja jednake polarnosti) izlaziti iz kolone redosledom rastuih molekulskih
masa, to se slae s redosledom njihove opadajue isparljivosti. Pri tome e se pri
izotermskom radu zapaziti sukcesivno opadanje visine i irenje koncentracionih zona
s vremenom zadravanja pojedinih komponenata, to se u potpunosti moe
kompenzovati primenom programiranog rasta temperature kolone tokom analize.
Slian princip temperaturnog programiranja kolone moe se primeniti na smeu
komponenata kod kojih se (zbog njihove veoma razliite polarnosti) retenciona
vremena veoma razlikuju.
Detektori
1. Termokonduktometrijski detektor (katarometar)

Slika 4 ema termokonduktometrijsklog detektora


Ovaj detektor radi na principu elektrino zagrevane ice oko koje struji nosei gas.
Kada su jaina struje i protok konstantni, izmeu ice i gasa uspostavlja se termika
ravnotea: proizvedena toplota jednaka je toploti koju odvodi nosei gas i
temperatura ice zadrava konstantnu vrednost koja, izmeu ostalog, zavisi i od
termike provodljivosti gasa. Ako se zbog pristustva strane komponente promeni
termika provodljivost noseeg gasa, uspostavie se novo ravnoteno stanje i
drugaija temperatura ice.

Analiza namirnica

75

U svojoj praktinoj realizaciji katarometar (slika 4) predstavlja masivni metalni blok s


dve protone elije u kojima su smetena dva identina metalna filamenta ili dva
identina termistora poluprovodnika otpornika s visokim termikim koeficijentom
elektrinog otpora. Ti elementi ine dve grane Wheatstoneovog mosta ureaja,
pomou koga se mogu uporeivati njihove elektrine otpornosti.
Kroz jednu od elija (referentnu) nosei gas protie pre ulaska u kolonu, a kroz drugu
(radnu) po izlasku iz nje. Poetna identinost uslova u obe elije znai i elektrinu
ravnoteu filamenata detektor ne daje signal. Kada se, pak, u efluentu iz kolone
nae komponenta, termika provodljivost noseeg gasa se menja, to izaziva
promenu temperature elektrootpornog elementa u radnoj eliji i poremeaj elektrine
ravnotee izmeu filamenata, koju detektor registruje.
Konduktometrijski detektor je univerzalnog tipa. Poto je za njegovu osetljivost
veoma znaajno da se termika provodljivost noseeg gasa to vie razlikuje od
termike provodljivosti komponenata, nosei gas je obino vodonik ili helijum. On
spada u nedestruktivne detektore, to znai da se posle izlaska iz njega komponente
mogu sakupljati i dalje analizirati drugim metodama. Odgovor katarometra
proporcionalan je koncentraciji komponente u noseem gasu tako da se za dobijanje
podatka o apsolutnoj masenoj koliini komponente mora tano poznavati veliina
protoka noseeg gasa.
2. Plameno-jonizacioni detektor (engl. flame ionization detector, FID)
Ovaj detektor (slika 5) sastoji se u naelu od dve elektrode, izmeu kojih gori
kiseonino-vodonini plamen. Izmeu elektroda prikljuenih na jednosmerni napon
(150-300 V) protie slaba elektrina struja zbog prisustva male koliine jona u
plamenu. U gorivu smeu stalno se uvodi nosei gas iz kolone. Kada u plamen s
noseim gasom dospe neko organsko jedinjenje, ono naglo sagoreva u viku
kiseonika, pri emu se stvori veliki broj jona i struja izmeu elektroda naglo poraste.
Odgovor detektora proporcionalan je broju neoksidisanih ugljenikovih atoma, to
znai da se detektor moe primeniti za detektovanje gotovo svih organskih jedinjenja,
pri emu je za kvantitativan rad potrebna kalibracija uz standarde. Neorganski
gasovi, voda, ugljendisulfid i ugljenoksisulfid ne izazivaju odgovor detektora, tako da
je ugljendisulfid pogodan rastvara za unoenje uzorka u kolonu.

Slika 5 ema plameno-jonizacionog detektora

Analiza namirnica

76

Za razliku od katarometra, odgovor ovog detektora nije proporcionalan koncentraciji,


ve apsolutnoj masenoj koliini komponente i stoga ne zavisi od protoka noseeg
gasa. Detektor je veoma rairen u praksi. Budui da je destruktivan, ako se eli
hvatanje komponenata iza kolone, mora se primeniti cepanje toka noseeg gasa
(obino u odnosu 1:10). Manji deo ide u detektor, a vei u kolektor frakcija.
3. Alkalni plameno-jonizacioni detektor (engl. alkali flame ionization detector, AFID)
FID se moe podesiti da bude osetljiv gotovo iskljuivo za organofosforna i u neto
manjoj meri za azotna jedinjenja u submikrogramskim koliinama tako to se uz sam
plamen smesti mali blok kalijumhlorida, cezijumbromida ili rubidijumsulfata. Za razliku
od situacije kod plameno-jonizacionog detektora (viak kiseonika), vodoninokiseonini plamen se odrava redukcionim (viak vodonika), tako da znaajnu ulogu
u stvaranju signala ima piroliza organskih jedinjenja. Mehanizam rada AFID jo nije u
potpunosti rasvetljen. Detektor je destruktivnog tipa i primenjuje se najvie za analizu
organofosfornih pesticida.
4. Detektor elektronskog zahvata (engl., electron capture, EC)

Slika 6 Detektor elektronskog zahvata


Ovaj detektor (slika 6) sadri izvor -zraenja na unutarnjem zidu kuita kroz koje
se proputa nosei gas iz kolone. Zraenje jonizuje molekule komponenata, zbog
ega se izmeu pozitivne elektrode i negativno naelektrisanog kuita detektora
javlja elektrina struja. Izvor -zraenja je obino titanijumska folija na kojoj je
adsorbovan radioaktivni tricijum 3H2 ili folija radioaktivnog izotopa 63Ni. Oba izvora su
isti -izraivai, to pri radu omoguuje laku zatitu od radioaktivnosti.
Kao nosei gas za ovaj detektor koristi se azot ili argon sa 10% metana. Osetljivost
detektora na organske molekule zavisi od njihovog efektivnog preseka za jonizaciju,
pa se stoga on uglavnom koristi za detekciju halogenih jedinjenja, naroito pesticida.
Ovo je detektor nedestruktivnog tipa.
Neke uporedne osobine opisanih detektora, prikazane su u Tabeli 5.

77

Analiza namirnica

Tabela 5. Uporedne osobine GLC detektora


Detektor

Katarometar
FID
AFID (fosfor)
AFID (azot)
EC-tricijum
(hlor)
EC-nikl (hlor)

Osetljivost
(g/s)

Interval
linearnog
odgovora

Granica
detekcije (g)

6 x 10-10
9 x 10-13
4 x 10-14
7 x 10-12

104
107
103
103

3 x 10-6
2 x 10-11
2 x 10-12
2 x 10-10

2 x 10-14

5 x 102

10-13

5 x 10-14

50

4 x 10-12

Kvalitativna analiza
Kao kod drugih hromatografskih metoda, vreme zadravanja komponente
(retenciono vreme) pod datim uslovima predstavlja njenu karakteristiku. Kod gasnotene hromatografije pogodno je da se koristi korigovano vreme zadravanja koje se
meri od trenutka izlaska iz kolone vazduha koji je unet sa uzorkom. esto se iz
praktinih razloga vreme zadravanja meri od trenutka izlaska iz kolone rastvaraa u
kome je bio rastvoren uzorak.
U kvalitativnoj analizi veliku pomo moe da prui injenica da kod lanova
homologog niza postoji linearna zavisnost logaritma retencionog vremena od broja
ugljenikovih atoma, pri emu je nagib ove zavisnosti razliit za razliite homologe
nizove. Zakonitost se jo bolje moe iskoristiti ako se takve linearne zavisnosti
uporede na kolonama razliite polarnosti.
Dodatne informacije mogu se dobiti ako se efluent iz kolone proputa kroz dva
razliita detektora, paralelno ili sukcesivno. U drugom sluaju, prvi detektor mora biti
nedestruktivan. Na primer, kod para: FID i EC utvruje se koje komponente su
halogena jedinjenja.
Identifikaciji moe pomoi ako se alikvoti uzoraka pre hromatografskog razdvajanja
obrade na razliite naine: oksidiu, hidrogenuju i sl. Na primer, hromatogram smee
jedinjenja razliitog stepena nezasienosti znaajno se moe razjasniti ako se uzorak
prethodno hidrogenuje i dvostruke i trostruke veze zasite.
I na kraju, neisparljive supstance mogu se pirolizovatii pod kontrolisanim uslovima,
produkti pirolize podvri GLC i dobijeni hromatogram (pirogram) uporediti kao "otisak
prsta" s pirogramima poznatih supstanci obraenih na identian nain.
Svi pobrojani naini identifikacije samo su priblini, ak i kada se analiza radi uz
standarde, jer iako svakom jedinjenju pod datim uslovima odgovara karakteristino
retenciono vreme, za dva jedinjenja ono moe biti jednako. Stoga je za pozitivnu
identifikaciju komponenata neophodno njihovo naknadno analiziranje pouzdanim
klasinim ili instrumentalnim metodama. U tom cilju se gasni hromatograf esto
povezuje s kolorimetrom, spektrofotometrom ili masenim spektrometrom.

Analiza namirnica

78

Kvantitativna analiza
Izuzimajui tehnike kod kojih se pojedine komponente sakupljaju po izlasku iz kolone
i neposredno mere, kvantitativno odreivanje kod gasno-tene hromatografije svodi
se na merenje povrina koncentracionih zona (pikova) na hromatogramu, to
podrazumeva linearan odgovor detektora u irokom rasponu koncentracija.
Pri tome, unutar nekog homologog niza, i uz FID, najee je mogue dobiti relativno
uee komponenata u smei kao relativno uee povrina odgovarajuih pikova u
zbirnoj povrini:
AX
%X =
AX
Kada odgovor detektora nije priblino jednak za sve komponente, gornji izraz se
koriguje:
FX AX
%X =
FX AX
gde je Fx - faktor proporcionalnosti izmeu povrine pika i mase svake komponente.
Ovaj faktor se dobija odreivanjem standardne krive za svaku komponentu.
Dakle, za tanu analizu neophodno je korienje standarda, najbolje direktno dodatih
u uzorak (unutranji standard), jer se tako eliminiu varijacije izmeu ponovljenih
hromatografskih razdvajanja.
Sama povrina pikova komponenata moe se izmeriti:
- planimetrisanjem;
- triangulacijom - aproksimiranjem zvonastog oblika zona trouglom, i merenjem
njegove visine i osnove;
- isecanjem pikova s hromatograma i njihovim merenjem na analitikoj vagi, to
podrazumeva dovoljnu homogenost papira;
- pomou automatskog mehanikog integratora povrine;
- pomou digitalnog (raunarskog) integratora povrine;
pri emu se, istim redosledom, smanjuje greka merenja, poev od nekoliko %, pa
do 0,5%.
Primena GLC
Iako su tehnike hromatografije na papiru, tankom sloju i koloni veoma popularne, ipak
se moe rei da je najvei doprinos analitici uopte, a naroito analitici biolokog
materijala, dala gasno-tena hromatografija, zbog svoje visoke moi razdvajanja,
fleksibilnosti radnih uslova i irokog podruja primene. Na podruju namirnica, neke
njene uobiajene primene nalaze se u sledeim oblastima.
1) Utvrivanje sastava pojedinih prehrambenih komponenata ili proizvoda.
2) Utvrivanje falsifikata, odnosno identifikovanje porekla namirnica.

Analiza namirnica

79

3) Istraivanje komponenata mirisa i ukusa instrumentalno objektiviziranje


organoleptikih svojstava radi praenja promena pri preradi i skladitenju.
4) Kontrola aditiva (prezervativa, antioksidanasa, emulgatora, stabilizatora)
kako u proizvodnji, tako i u primeni.
5) Kontrola kvaliteta zaina.
6) Kontrola toksinih supstanci u hrani (ugljovodonici iz ambalae, rastvarai,
ostaci pesticida, hormona, antibiotika, hemoterapeutika, nitrozamini,
policiklini aromati, polihlorovani bifenili itd.).
Iako iz samog principa gasno-tene hromatografije proizilazi da se njoj mogu
podvrgavati iskljuivo isparljive supstance, tehnika pripreme uzoraka u toj meri je
napredovala da gotovo ne postoji podruje gde se ona ne bi mogla primeniti.
Pomenuta priprema uzorka uglavnom obuhvata derivatizaciju prevoenje
neisparljivih, esto termolabilnih jedinjenja u njihove isparljivije, termostabilne
derivate, pogodne za analizu uz GLC.
Osnovni uzrok male isparljivosti i termike labilnosti mnogih organskih jedinjenja jesu
njihove veoma polarne funkcionalne grupe. One se esto intermolekulski povezuju
meusobno jakim vodoninim vezama, ije raskidanje zahteva dodatnu energiju za
isparavanje takvih jedinjenja. Istovremeno, veoma polarne funkcionalne grupe
(hidroksilna, karboksilna, amino grupa i sline grupe) veoma su reaktivne tako da
povienje temperature lako dovodi do destrukcije molekula, kroz reakcije s drugim
polarnim grupama.
Derivatizacijom se pomenute veoma polarne grupe blokiraju, u stvari prevode u
manje polarne grupe. U literaturi je opisan niz proverenih postupaka i reagenasa za
blokiranje pojedinih, specifinih funkcionalnih grupa, od kojih su najpoznatiji:
- Alkilovanje hidroksilnih grupa, ime se alkoholi ili karboksilne kiseline
prevode u manje polarne etre ili estre.
- Sililovanje -OH, -SH i =NH grupa, tj., zamena aktivnog vodonika u njima,
neaktivnom trimetilsilil (TMS) grupom: -Si(CH3)3.
- Trifluoracetilovanje, za blokiranje uglavnom amino-grupe.
- Halogenesterifikovanje kiselina, alkohola, amina, u cilju uvoenja halogena u
jedinjenja, za osetljivu analizu uz pomo EC-detektora.
- Dinitrofenilovanje amina, u cilju analize uz EC-detektor.
- Obrazovanje 2,4-dinitrofenilhidrazona karbonilnih jedinjenja.
Postupci derivatizacije omoguuju da se uz GLC analiziraju i takva osetljiva
jedinjenja, kao to su steroidi, antibiotici, vitamini, eeri, i sl.