RO

RO

REGULAMENTUL (UE) NR. / AL COMISIEI

din XXX
de modificare a Regulamentului (CE) nr. 152/2009 n ceea ce privete metodele de
analiz pentru determinarea constituenilor de origine animal pentru controlul oficial
al furajelor

(Text cu relevan pentru SEE)

COMISIA EUROPEAN,
avnd n vedere Tratatul privind funcionarea Uniunii Europene,
avnd n vedere Regulamentul (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European i al Consiliului
din 29 aprilie 2004 privind controalele oficiale efectuate pentru a asigura verificarea
conformitii cu legislaia privind hrana pentru animale i produsele alimentare i cu normele
de sntate animal i de bunstare a animalelor1, n special articolul 11 alineatul (4),
ntruct:
(1)

Articolul 7 alineatul (1) din Regulamentul (CE) nr. 999/2001 al Parlamentului

European i al Consiliului din 22 mai 2001 de stabilire a unor reglementri pentru
prevenirea, controlul i eradicarea anumitor forme transmisibile de encefalopatie
spongiform2 prevede c se interzice utilizarea proteinelor animale n nutriia
rumegtoarelor. Aceast interdicie se extinde i asupra altor animale dect
rumegtoarele i se limiteaz, n ceea ce privete nutriia acestor animale cu produse
de origine animal, n conformitate cu anexa IV la regulamentul respectiv.

(2)

Articolul 11 alineatul (1) din Regulamentul (CE) nr. 1069/2009 al Parlamentului

European i al Consiliului din 21 octombrie 2009 de stabilire a unor norme sanitare
privind subprodusele de origine animal i produsele derivate care nu sunt destinate
consumului uman i de abrogare a Regulamentului (CE) nr. 1774/2002 3 interzice
hrnirea animalelor terestre dintr-o anumit specie, cu excepia animalelor pentru
blan, cu proteine animale prelucrate care provin din cadavre sau pri de cadavre ale
altor animale din aceeai specie, precum i hrnirea petilor de ferm cu proteine
animale prelucrate care provin din cadavre sau pri de cadavre ale altor peti de
cresctorie din aceeai specie.

(3)

Regulamentul (CE) nr. 152/2009 al Comisiei din 27 ianuarie 2009 de stabilire a

metodelor de eantionare i analiz pentru controlul oficial al furajelor 4 stabilete n
anexa VI metodele de analiz pentru determinarea constituenilor de origine animal

JO L 165, 30.4.2004, p. 1.
JO L 147, 31.5.2001, p. 1.
JO L 300, 14.11.2009, p. 1.
JO L 54, 26.2.2009, p. 1.

2
3
4

RO

RO

pentru controlul oficial al furajelor. Metoda microscopic, care este n prezent singura
metod validat pentru a detecta prezena proteinelor animale n furaje, este n msur
s fac distincie ntre prezena constituenilor derivai din animale terestre i prezena
constituenilor derivai din peti, dar nu este n msur s cuantifice cu un grad
suficient de precizie cantitatea de constitueni de origine animal prezent n furaje, i,
prin urmare, nu ar trebui s fie utilizat n acest scop.
(4)

O nou metod de detectare a constituenilor de origine animal bazat pe reacia n

lan a polimerazei (PCR) a fost validat de laboratorul de referin al UE pentru
detectarea proteinelor animale n hrana pentru animale. n urma unui studiu de punere
n aplicare organizat cu laboratoarele naionale de referin din statele membre, s-a
dovedit c noua metod este suficient de solid pentru a fi utilizat ca metod de
control oficial n Uniune. Aceast nou metod este n msur s detecteze prezena
constituenilor de origine animal n furaje, i, de asemenea, s identifice specia de
origine a acestor constitueni. Utilizarea acestei noi metode n combinaie cu sau
pentru a nlocui, dup caz, metoda microscopic ar fi foarte valoroas pentru controlul
punerii n aplicare corecte a interdiciilor referitoare la nutriie prevzute n
Regulamentele (CE) nr. 999/2001 i (CE) nr. 1069/2009.

(5)

Prin urmare, anexa VI la Regulamentul (CE) nr. 152/2009 ar trebui nlocuit n

consecin.

(6)

Msurile prevzute n prezentul regulament sunt conforme cu avizul Comitetului

permanent pentru lanul alimentar i sntatea animal i nu au ntmpinat nicio
opoziie din partea Parlamentului European sau a Consiliului,

ADOPT PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1
Anexa VI la Regulamentul (CE) nr. 152/2009 se nlocuiete cu textul din anexa la prezentul
regulament.
Articolul 2
Prezentul regulament intr n vigoare n a douzecea zi de la data publicrii n Jurnalul
Oficial al Uniunii Europene.

Prezentul regulament este obligatoriu n toate elementele sale i se aplic direct n toate statele
membre.
Adoptat la Bruxelles,

Pentru Comisie
Preedintele
Jos Manuel BARROSO

RO

RO

ANEX
ANEXA VI
METODE DE ANALIZ PENTRU DETERMINAREA CONSTITUENILOR DE
ORIGINE ANIMAL PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL FURAJELOR
1.

SCOPUL I DOMENIUL DE APLICARE

Determinarea constituenilor de origine animal n furaje se efectueaz prin
microscopie optic sau reacie n lan a polimerazei (PCR), n conformitate cu
dispoziiile stabilite n prezenta anex.
Aceste dou metode fac posibil detectarea prezenei constituenilor de origine
animal n materiile prime furajere i furajele combinate. Totui, ele nu fac posibil
calcularea cantitii acestor constitueni n materiile prime furajere i furajele
combinate. Ambele metode au o limit de detecie sub 0,1% (g/g).
Metoda PCR face posibil identificarea grupului taxonomic al constituenilor de
origine animal prezeni n materiile prime furajere i furajele combinate.
Aceste metode se aplic pentru controlul aplicrii interdiciilor prevzute la articolul
7 alineatul (1) i anexa IV la Regulamentul (CE) nr. 999/2001 i la articolul 11
alineatul (1) din Regulamentul (CE) nr. 1069/2009.
n funcie de tipul de furaj n curs de testare, aceste metode pot fi utilizate, n cadrul
unui singur protocol operaional, fie singure, fie combinate mpreun n conformitate
cu procedurile standard de operare (PSO) stabilite de laboratorul de referin al UE
pentru detectarea proteinelor animale n hrana pentru animale i publicate pe site-ul
internet al acestuia5.

2.

METODE

2.1.

Microscopie optic

2.1.1.

Principiu
Constituenii de origine animal care pot fi prezeni n materiile prime furajere i
furajele combinate trimise pentru a fi analizate se identific pe baza caracteristicilor
tipice, identificabile prin examinare microscopic, cum ar fi fibre musculare i alte
particule de carne, cartilagii, oase, coarne, pr, pr de porc, snge, pene, coji de ou,
oase i solzi de pete.

RO

http://eurl.craw.eu/

RO

2.1.2.

Reactivi i echipamente

2.1.2.1. Reactivi
2.1.2.1.1. Agent de concentrare
2.1.2.1.1.1. Tetracloretilen (greutate specific 1,62)
2.1.2.1.2. Agent de colorare
2.1.2.1.2.1. Soluie de rou de alizarin (se dilueaz 2,5 ml acid clorhidric 1M n 100
ml ap i se adaug 200 mg rou de alizarin n soluia obinut)
2.1.2.1.3. Mediu de montare
2.1.2.1.3.1. Leie (NaOH 2,5 % g/v sau KOH 2,5 % g/v)
2.1.2.1.3.2. Glicerol (nediluat, vscozitate: 1490 cP)
2.1.2.1.3.3. Norland Optical Adhesive 65 (vscozitate: 1 200 cP) sau o rin cu
proprieti echivalente pentru pregtirea lamelor permanente
2.1.2.1.4. Mediu de montare cu proprieti de colorare
2.1.2.1.4.1. Soluie Lugol (se dizolv 2 g iodur de potasiu n 100 ml ap i se
adaug 1 g de iod agitnd frecvent)
2.1.2.1.4.2. Reactiv cistin (2 g acetat de plumb, 10 g NaOH/100 ml ap)
2.1.2.1.4.3. Reactiv Fehling [preparat nainte de utilizare din pri egale (1/1) a dou
soluii stoc A i B. Soluia A: se dizolv 6,9 g sulfat de cupru (II) pentahidrat n
100 ml ap. Soluia B: se dizolv 34,6 g tartrat de sodiu i potasiu tetrahidrat i
12 g NaOH n 100 ml ap]
2.1.2.1.4.4. Tetrametilbenzidin/Peroxid de hidrogen. [se dizolv 1 g de 3,3,5,5tetrametilbenzidin (TMB) n 100 ml de acid acetic glacial i 150 ml ap.
nainte de utilizare, se amestec patru pri din aceast soluie TMB cu o parte
de peroxid de hidrogen 3%]
2.1.2.1.5. Ageni de limpezire
2.1.2.1.5.1. Etanol 96 % (puritate tehnic)
2.1.2.1.5.2. Aceton (puritate tehnic)
2.1.2.1.6. Agent de decolorare
2.1.2.1.6.1. Soluie comercial de hipoclorit de sodiu (9 - 14 % clor activ)

RO

RO

2.1.2.2. Echipamente
2.1.2.2.1. Balan analitic cu o precizie de 0,001 g
2.1.2.2.2. Echipament de mcinare: moar sau mojar
2.1.2.2.3. Site cu ochiuri ptrate de 0,25 mm i 1 mm lime
2.1.2.2.4. Plnie de separare conic din sticl cu un coninut de 250 ml cu robinet din teflon
sau din sticl lefuit la baza conului. Diametrul de deschidere al robinetului trebuie
s fie 4mm. De asemenea, se poate folosi un pahar de sedimentare cu fund conic,
cu condiia ca laboratorul s fi demonstrat c nivelurile de detecie sunt echivalente
cu cele obinute utiliznd plnia de separare conic din sticl.

Plnie de separare
2.1.2.2.5. Microscop stereoscopic care s acopere cel puin o gam de amplificare final de la
6,5 la 40 de ori
2.1.2.2.6. Microscop compus care acoper cel puin o gam de amplificare final de la 100 la
400 de ori, n cmp luminos cu lumin transmis. Se pot utiliza, n plus, lumina
polarizat i contrastul interferenial diferenial
2.1.2.2.7. Sticlrie de laborator standard
2.1.2.2.8. Echipamente pentru pregtirea lamelor: lame de microscop clasice, lame tubulare,
lame de acoperire (20x20 mm), pensete, spatul fin
2.1.3.

Eantionarea i pregtirea eantioanelor

2.1.3.1. Eantionare
Se utilizeaz un eantion reprezentativ, prelevat n conformitate cu dispoziiile
prevzute n anexa I.
2.1.3.2. Precauiile ce trebuie luate
Pentru a se evita contaminarea ncruciat n laborator, toate echipamentele
reutilizabile sunt curate cu grij nainte de utilizare. Piesele plniei de separare sunt

RO

RO

demontate nainte de curare. Piesele plniei de separare i sticlria sunt presplate

manual i apoi splate n maina de splat. Sitele sunt curate utiliznd o perie cu
peri sintetici aspri. Se recomand curarea final a sitelor cu aceton i aer
comprimat dup cernerea materiilor grase precum fina de pete.
2.1.3.3. Pregtirea eantioanelor, altele dect grsimi sau uleiuri
2.1.3.3.1. Uscarea eantioanelor: eantioanele cu un coninut de umiditate > 14 % se usuc
nainte de tratare.
2.1.3.3.2. Cernerea n prealabil a eantioanelor : se recomand s se cearn n prealabil la 1
mm furajele sub form de pelete i grunele i apoi s se pregteasc i s se
analizeze cele dou fraciuni rezultate ca eantioane distincte.
2.1.3.3.3. Subeantionarea i mcinarea: cel puin 50 g din eantion constituie subeantioane
pentru a fi analizate i ulterior mcinate.
2.1.3.3.4. Extragerea i prepararea sedimentului: o poriune de 10 g (cu o precizie de 0,01 g)
din subeantionul mcinat este transferat n plnia de separare sau n paharul de
sedimentare cu fund conic i se adaug 50 ml de tetracloretilen. Poriunea
transferat n plnie este limitat la 3 g n cazul finii de pete sau a altor produse de
origine animal pure, ingrediente minerale sau preamestecuri care genereaz
sedimente n proporie de peste 10%. Amestecul se scutur energic cel puin 30 de
secunde i se mai adaug cu atenie cel puin 50 ml de tetracloretilen n timp ce se
spal suprafaa interioar a plniei pentru a ndeprta orice urm de particule.
Amestecul rezultat se las s stea cel puin cinci minute nainte de a separa
sedimentul prin deschiderea robinetului.
Dac se utilizeaz un pahar de sedimentare cu fund conic, se agit energic amestecul
cel puin 15 secunde i particulele care rmn pe pereii paharului sunt splate cu
atenie de pe suprafaa interioar cu cel puin 10 ml de tetracloretilen curat.
Amestecul se las s stea 3 minute i apoi se agit din nou 15 secunde, iar particulele
care rmn pe pereii paharului sunt splate cu atenie de pe suprafaa interioar cu
cel puin 10 ml de tetracloretilen curat. Amestecul rezultat se las s stea cel puin
5 minute i apoi fraciunea lichid se nltur i se elimin prin decantare atent,
avnd grij s nu se piard nimic din sediment.
Sedimentul se usuc i apoi se cntrete (cu o precizie de 0,001 g). Dac peste 5%
din sediment const n particule > 0,50 mm, se cerne la 0,25 mm i se examineaz
cele dou fraciuni rezultate.

RO

RO

2.1.3.3.5. Extragerea i prepararea reziduului de flotaie: dup recuperarea sedimentului prin

metoda descris mai sus, ar trebui s rmn dou faze n plnia de separare: una
lichid constnd n tetracloretilen i una solid alctuit din material care plutete.
Aceast faz solid este reziduul de flotaie care se recupereaz turnnd toat
tetracloretilena din plnie prin deschiderea robinetului. Prin rsturnarea plniei de
separare, reziduul de flotaie este transferat ntr-o plac Petri mare i uscat la aer ntro hot de tiraj. Dac peste 5% din reziduul de flotaie const n particule > 0,50 mm,
se cerne la 0,25 mm i se examineaz cele dou fraciuni rezultate.
2.1.3.3.6. Pregtirea materiei prime: se pregtete o poriune de cel puin 5 g de subeantion
mcinat. Dac peste 5% din materie const n particule > 0,50 mm, se cerne la
0,25 mm i se examineaz cele dou fraciuni rezultate.
2.1.3.4. Pregtirea eantioanelor constnd n grsimi sau uleiuri
Pentru pregtirea eantioanelor constnd n grsimi sau uleiuri se aplic urmtorul
protocol:

dac grsimea este solid, se nclzete ntr-un cuptor pn cnd devine lichid;

cu ajutorul unei pipete, 40 ml de grsime sau ulei se transfer din partea

inferioar a eantionului ntr-un tub de centrifug;

se centrifugheaz timp de 10 minute la 4 000 r.p.m.;

dac grsimea este solid dup centrifugare, se nclzete ntr-un cuptor pn

cnd devine lichid;

se repet centrifugarea timp de 5 minute la 4 000 r.p.m.;

cu ajutorul unei linguri mici sau al unei spatule, jumtate din impuritile
decantate sunt transferate spre examinare ctre lame microscopice; se
recomand glicerolul ca mediu de montare;

impuritile rmase se utilizeaz pentru prepararea sedimentului astfel cum se

descrie la punctul 2.1.3.3.

2.1.3.5. Utilizarea agenilor de colorare

Pentru a facilita identificarea corect a constituenilor de origine animal, operatorul
poate utiliza ageni de colorare n timpul pregtirii eantioanelor, n conformitate cu
orientrile emise de laboratorul de referin al UE pentru detectarea proteinelor
animale n hrana pentru animale i publicate pe site-ul internet al acestuia.
n cazul n care se utilizeaz soluie de rou de alizarin pentru colorarea
sedimentelor, se aplic urmtorul protocol:

RO

sedimentul uscat se transfer ntr-o eprubet de sticl i se cltete de dou ori

cu aproximativ 5 ml de etanol (de fiecare dat se utilizeaz un agitator timp de
30 de secunde, solventul se las s se decanteze aproximativ 1 minut i 30 de
secunde i se elimin prin turnare);

RO

2.1.4.

sedimentul se decoloreaz adugndu-se cel puin 1 ml de soluie de hipoclorit

de sodiu. Se permite ca reacia s continue 10 minute. Tubul se umple cu ap,
sedimentul se las s se decanteze 2-3 minute, iar apa i particulele n
suspensie se elimin uor prin turnare;

sedimentul se mai cltete de dou ori cu aproximativ 10 ml de ap (se

utilizeaz un agitator timp de 30 de secunde, se las s se decanteze i se
elimin apa prin turnare de fiecare dat);

se adaug ntre 2 i 10 picturi de soluie de rou de alizarin, iar amestecul se

agit. Se permite desfurarea reaciei timp de 30 de secunde i sedimentul
colorat se cltete de dou ori cu aproximativ 5 ml de etanol, apoi o dat cu
aceton (de fiecare dat se utilizeaz un agitator timp de 30 de secunde,
solventul se las s se decanteze aproximativ 1 minut i se elimin prin
turnare);

sedimentul colorat se usuc.

Examinare microscopic

2.1.4.1. Pregtirea lamelor

Lamele microscopice se pregtesc din sediment i, n funcie de alegerea
operatorului, fie din reziduu de flotaie, fie din materie prim. n cazul n care s-a
utilizat cernerea n timpul pregtirii eantioanelor, se pregtesc cele dou fraciuni
rezultate (cea fin i cea grosier). Poriunile de testat din fraciuni ntinse pe lame
trebuie s fie reprezentative pentru ntreaga fraciune.
Se pregtete un numr suficient de lame pentru a se asigura c se poate efectua un
protocol complet de examinare, astfel cum se prevede la punctul 2.1.4.2.
Lamele microscopice se monteaz cu mediul de montare adecvat n conformitate cu
PSO stabilite de laboratorul de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale
n hrana pentru animale i publicate pe site-ul internet al acestuia. Lamele se acoper
cu lame de acoperire.
2.1.4.2. Protocoale de observare pentru detectarea particulelor animale n furajele combinate
i materiile prime furajere
Lamele microscopice pregtite se observ n conformitate cu protocoalele de
observare stabilite n diagrama 1 pentru furajele combinate i materiile prime furajere
altele dect fina de pete pur sau n diagrama 2 pentru fina de pete pur.
Observaiile microscopice se realizeaz utiliznd microscopul compus pe sediment
i, n funcie de alegerea operatorului, fie pe reziduul de flotaie, fie pe materia
prim. Microscopul stereoscopic poate fi utilizat n plus fa de microscopul compus
pentru fraciunile grosiere. Fiecare lam se examineaz n ntregime la diferite
amplificri.
Numrul minim de lame care trebuie observate n fiecare etap a protocolului de
observare trebuie s fie strict respectat, cu excepia cazului n care ntregul material

RO

RO

al fraciunii nu permite s se ajung la numrul prevzut de lame. Nu se observ mai

mult de 6 lame pentru fiecare determinare.
Pentru a facilita identificarea naturii i originii particulelor, operatorul poate utiliza
instrumente de sprijin cum ar fi sisteme de asistare n luarea deciziilor, biblioteci de
imagini i eantioane de referin.

Diagrama 1: protocol de observare pentru detectarea particulelor animale n

furajele combinate i materiile prime furajere altele dect fina de pete

RO

10

RO

Diagrama 2: protocol de observare pentru detectarea particulelor animale n fina de pete

2.1.4.3. Numrul determinrilor
Dac, n urma unei prime determinri efectuate n conformitate cu protocolul de
observare stabilit n diagrama 1 sau n diagrama 2, dup caz, nu se detecteaz nicio
particul animal de o anumit natur (de exemplu, animale terestre sau peti), nu
este necesar nicio determinare suplimentar, iar rezultatul analizei se raporteaz
utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.1.
Dac, n urma unei prime determinri efectuate n conformitate cu protocoalele de
observare stabilite n diagrama 1 sau n diagrama 2, dup caz, numrul total al
particulelor animale de o anumit natur (de exemplu, animale terestre sau peti)
detectate variaz de la 1 la 5, se efectueaz o a doua determinare pornind de la un
nou subeantion de 50 g. Dac, n urma acestei a doua determinri, numrul de
particule animale de aceast anumit natur detectate variaz de la 0 la 5, rezultatul
analizei se raporteaz utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.2, dac nu, se
efectueaz o a treia determinare pornind de la un nou subeantion de 50 g. Cu toate
acestea, n cazul n care, n urma primei i celei de-a doua determinri, suma
particulelor de o anumit natur detectate n cele dou determinri este mai mare de
15, nu este necesar nicio determinare suplimentar, iar rezultatul analizei se
raporteaz direct utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.3. Dac, n urma
celei de-a treia determinri, suma particulelor animale de o anumit natur detectate
pe parcursul celor trei determinri este mai mare de 15, rezultatul analizei se

RO

11

RO

raporteaz utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.3. Altfel, rezultatul

analizei se raporteaz utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.2.
Dac, n urma unei prime determinri efectuate n conformitate cu protocoalele de
observare stabilite n diagrama 1 sau n diagrama 2, dup caz, sunt detectate mai mult
de 5 particule animale de o anumit natur (de exemplu, animale terestre sau pe ti),
rezultatul analizei se raporteaz utiliznd terminologia stabilit la punctul 2.1.5.3.
2.1.5.

Exprimarea rezultatelor
Atunci cnd raporteaz rezultatele, laboratorul indic pe ce tip de material s-a
efectuat analiza (sediment, reziduu de flotaie sau materie prim) i cte determinri
s-au efectuat.
Raportul laboratorului conine cel puin informaii privind prezena constituenilor
derivai din animale terestre i din peti.
Diferitele situaii se raporteaz n modul urmtor:

2.1.5.1. Nicio particul animal de o anumit natur detectat:

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

nu a fost detectat nicio particul derivat din animale terestre,

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

nu a fost detectat nicio particul derivat din peti.

2.1.5.2. ntre 1 i 5 particule animale de o anumit natur detectate n medie:

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

nu au fost detectate mai mult de 5 particule derivate din animale terestre, n
medie, pentru fiecare determinare. Particulele au fost identificate ca [os,
cartilagiu, muchi, pr, coarne ]. Aceast prezen sczut, fiind sub limita
de detecie a metodei microscopice, nseamn c nu se poate exclude riscul
unui fals rezultat pozitiv.

Sau, dup caz,

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

nu au fost detectate mai mult de 5 particule derivate din peti, n medie, pentru
fiecare determinare. Particulele au fost identificate ca [oase de pete, solzi
de pete, cartilagiu, muchi, otolit, branhii]. Aceast prezen sczut, fiind
sub limita de detecie a metodei microscopice, nseamn c nu se poate exclude
riscul unui fals rezultat pozitiv.

n cazul cernerii n prealabil a eantioanelor, raportul laboratorului menioneaz

fraciunea n care (fraciune cernut, fraciune sub form de pelete sau grune) au
fost detectate particulele animale, ntruct detectarea particulelor animale numai n
fraciunea cernut poate fi semnul unei contaminri a mediului.

RO

12

RO

2.1.5.3. Mai mult de 5 particule animale de o anumit natur detectate n medie

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

au fost detectate mai mult de 5 particule derivate din animale terestre n medie
pentru fiecare determinare. Particulele au fost identificate ca [os, cartilagiu,
muchi, pr, coarne ].

Sau, dup caz,

n msura n care a fost perceptibil la microscopul optic, n eantionul prezentat

au fost detectate mai mult de 5 particule derivate din peti n medie pentru
fiecare determinare. Particulele au fost identificate ca [oase de pete, solzi
de pete, cartilagiu, muchi, otolit, branhii].

n cazul cernerii n prealabil a eantioanelor, raportul laboratorului menioneaz

fraciunea n care (fraciune cernut, fraciune sub form de pelete sau grune) au
fost detectate particulele animale, ntruct detectarea particulelor animale numai n
fraciunea cernut poate fi semnul unei contaminri a mediului.
2.2.

PCR

2.2.1.

Principiu
Fragmentele de acid dezoxiribonucleic (ADN) de origine animal care pot fi prezente
n materiile prime furajere i furajele combinate sunt detectate printr-o tehnic de
amplificare genetic prin PCR, care vizeaz secvene de ADN specifice speciei.
Metoda PCR necesit, n primul rnd, o etap de extragere a ADN-ului. Etapa de
amplificare se aplic ulterior extractului de ADN astfel obinut, n vederea detectrii
speciilor de animale vizate de test.

2.2.2.

Reactivi i echipamente

2.2.2.1. Reactivi
2.2.2.1.1. Reactivi pentru etapa de extragere a ADN-ului
Se utilizeaz numai reactivii aprobai de laboratorul de referin al UE pentru
detectarea proteinelor animale n hrana pentru animale i publicai pe site-ul internet
al acestuia.
2.2.2.1.2. Reactivi pentru etapa de amplificare genetic
2.2.2.1.2.1. Primeri i sonde
Se utilizeaz numai primerii i sondele cu secvene de oligonucleotide validate
de ctre laboratorul de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale n
hrana pentru animale6.

RO

Lista acestor primeri i sonde pentru fiecare specie de animale vizat de testare este disponibil pe siteul internet al laboratorului de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale n hrana pentru
animale.

13

RO

2.2.2.1.2.2. Amestecul principal

Se utilizeaz doar soluiile de amestec principal care nu conin reactivi
susceptibili s conduc la rezultate false datorit prezenei de ADN animal7.
2.2.2.1.2.3. Reactivi de decontaminare
2.2.2.1.2.3.1. Soluie de acid clorhidric (0,1N)
2.2.2.1.2.3.2. nlbitor (soluie de hipoclorit de sodiu la 0,15% din clor activ)
2.2.2.1.2.3.3. Reactivi necorozivi pentru decontaminarea dispozitivelor costisitoare
precum balanele analitice (de exemplu, DNA EraseTM al MP Biomedicals)
2.2.2.2. Echipamente
2.2.2.2.1. Balan analitic cu o precizie de 0,001 g
2.2.2.2.2. Echipament de mcinare
2.2.2.2.3. Thermocycler care permite PCR n timp real
2.2.2.2.4. Microcentrifug pentru tuburi de microcentrifugare
2.2.2.2.5. Set de micropipete care permit introducerea cu pipeta de la 1 l pn la 1 000 l
2.2.2.2.6. Material de plastic standard de biologie molecular: tuburi de microcentrifugare,
vrfuri de plastic filtrate pentru micropipete, plci adecvate pentru thermocycler.
2.2.2.2.7. Congelatoare pentru depozitarea eantioanelor i reactivilor
2.2.3.

Eantionarea i pregtirea eantioanelor

2.2.3.1. Eantionare
Se utilizeaz un eantion reprezentativ, prelevat n conformitate cu dispoziiile
prevzute n anexa I.
2.2.3.2. Pregtirea eantioanelor
Pregtirea eantioanelor de laborator nainte de extragerea ADN-ului respect
cerinele prevzute n anexa II. Cel puin 50 g din eantion constituie subeantioane
pentru a fi analizate i ulterior mcinate.
Pregtirea eantioanelor se efectueaz ntr-o ncpere diferit de cele dedicate
extragerii ADN-ului i reaciilor de amplificare genetic descrise n ISO 24276.
Se pregtesc dou poriuni de testat de cel puin 100 mg fiecare.

RO

Exemple de amestecuri principale care sunt funcionale sunt disponibile pe site-ul internet al
laboratorului de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale n hrana pentru animale.

14

RO

2.2.4.

Extragerea ADN-ului
Extragerea ADN-ului se efectueaz pe fiecare poriune de testat pregtit utiliznd
PSO stabilite de laboratorul de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale
n hrana pentru animale i publicate pe site-ul internet al acestuia.
Se pregtesc dou controale de extragere pentru fiecare serie de extrageri descrise n
ISO 24276.

2.2.5.

un control martor de extragere,

un control de extragere al ADN-ului pozitiv.

Amplificarea genetic
Amplificarea genetic se efectueaz utiliznd metodele validate pentru fiecare specie
care necesit identificare. Aceste metode sunt prevzute n PSO stabilite de
laboratorul de referin al UE pentru detectarea proteinelor animale n hrana pentru
animale i publicate pe site-ul internet al acestuia. Fiecare extract de ADN se
analizeaz n cel puin dou diluii diferite n scopul de a evalua inhibarea.
Se pregtesc dou controale de amplificare pentru fiecare specie int, astfel cum se
descrie n ISO 24276.

2.2.6.

se utilizeaz un control int al ADN-ului pozitiv pentru fiecare plac sau serie
de teste PCR,

se utilizeaz un control al reactivului de amplificare (denumit, de asemenea,

control fr etalon) pentru fiecare plac sau serie de teste PCR.

Interpretarea i exprimarea rezultatelor

Atunci cnd raporteaz rezultatele, laboratorul indic cel puin greutatea poriunilor
de testat utilizate, tehnica de extragere utilizat, numrul de determinri efectuate i
limita de detecie a metodei.
Rezultatele nu sunt interpretate i raportate n cazul n care controlul de extragere al
ADN-ului pozitiv i controalele int ale ADN-ului pozitiv nu ofer rezultate pozitive
pentru obiectivul care face obiectul testului, n timp ce controlul reactivului de
amplificare este negativ.
n cazul n care rezultatele celor dou poriuni de testat nu sunt consecvente, se
repet cel puin etapa de amplificare genetic. n cazul n care laboratorul
suspecteaz c extractele de ADN pot fi cauza inconsecvenei, se efectueaz o nou
extracie de ADN i o alt amplificare genetic nainte de interpretarea rezultatelor.
Exprimarea final a rezultatelor se bazeaz pe integrarea i interpretarea rezultatelor
celor dou poriuni de testat n conformitate cu PSO stabilite de laboratorul de
referin al UE pentru detectarea proteinelor animale n hrana pentru animale i
publicate pe site-ul internet al acestuia.

RO

15

RO

2.2.6.1. Rezultat negativ

Un rezultat negativ este raportat dup cum urmeaz:
Niciun ADN de la X nu a fost detectat n eantionul prezentat (X fiind specia de
animale sau grupul de specii de animale care sunt vizate de test).
2.2.6.2. Rezultat pozitiv
Un rezultat pozitiv este raportat dup cum urmeaz:
A fost detectat ADN de la X n eantionul prezentat (X fiind specia de animale sau
grupul de specii de animale care sunt vizate de test).

RO

16

RO