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VIROLOGA

DIAGNSTICO VIROLGICO.- MTODOS


INDIRECTOS O SEROLGICOS
DOCENTE: CARMEN MOSQUERA
STEPHANIE CAROLINA ROMERO RAMREZ
GRUPO 7

MTODOS INDIRECTOS O SEROLGICOS


Consiste en demostrar en el suero del paciente
la presencia de anticuerpos especficos
antivirales.

Dos mtodos: conversin serolgica y


presencia de IgM especfica.
Conversin serolgica.-aparicin
de Anticuerpos mas de 4 veces
en dos muestras pareadas

Deteccin de IgM especfica.diagnstico de infeccin reciente


en una sola muestra de suero

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Diagnstico serolgico
Uso de anticuerpos especficos anti-Igs
humanas conjugados con colorantes
fluorescentes (fluorescena u otros)
Detectar fcilmente en el suero del
paciente la presencia de anticuerpos
antivirales.

Permite detectar la presencia de


antgenos virales en el interior de
las clulas mediante tincin con
anticuerpos especficos conjugados
con un colorante fluorescente

Inmunofluorescencia indirecta
para deteccin de anticuerpos
Hacer reaccionar los anticuerpos presentes
en el suero con antgenos virales presentes
en clulas infectadas fijadas sobre
portaobjetos y revelar esa unin antgenoanticuerpo mediante un segundo
anticuerpo anti-Igs humanas, conjugado con
fluorocromo.

El fluorocromo mas usado es el


isotiocinato de florescena

INMUNOFLUORESCENCIA
La IFI suele ser mas sensible y mas
especfica que la directa debido a que
tiene un paso mas de amplificacin,
por lo que requiere 1-2 horas para su
realizacin

Requiere de solo un reactivo


marcado, la globulina gamma
antihumana de cabra conjugada
con fluorescena

Inmunofluorescencia indirecta para deteccin


de IgM
Se utiliza para el diagnstico
de infeccin reciente y para
diagnstico de infecciones
congnitas.
Pueden falsos resultados:

Factores reumatoideos(FR)
Altos ttulos de IgG
especfica

Los diferentes tipos de ELISA son:


Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)

Antgeno marcado:
o ELISA competitivo

Elisa de captura
ELISA Sndwich DAS
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de
anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar.
Adicin de la muestra problema (extracto
vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).
Adicin de anticuerpos especficos del
antgeno a detectar.
Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del
producto final coloreado.

ELISA Sndwich HADAS


Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar.
Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados
en el paso anterior.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA COMPETITIVO
Consta de las siguientes etapas:
o Fijacin al soporte insoluble de
anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar.
o Adicin en concentracin conocida de
una mezcla de antgenos del anticuerpo
utilizado en el paso anterior.
o Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora.
o Lectura visual o colorimtrica del
producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados.

WESTERN BLOT
Javier Agustn Lanez Mite
Grupo 7 Cuarto Semestre

Definicin
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente
utilizada en biologa celular y molecular, para la
separacin e identificacin de protenas.
En virologa sirve para investigar antgenos virales o sus
respectivos anticuerpos.

Capacidad de identificar
protenas especficas de
una mezcla compleja de
protenas extradas de las
clulas.

Similar a ELISA
WB menos sensible
WB ms especifico
Prueba confirmatoria de la presencia de Ac para HIV en suero de
pacientes con serologa positiva determinada por ELISA

cmo funciona?
Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel
en funcin de su peso molecular.
A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la
protena de inters.
El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la
protena y su cantidad relativa en la muestra.

Secuencia
Preparacin del tejido

Electroforesis en gel

Bloqueo

Transferencia

Deteccin

Anlisis

Preparacin de la muestra
Muestra:
Tejido
Cultivo celular
Extraccin de las protenas de muestras biolgicas mediante
disrupcin mecnica o qumica.

Mecnico

Qumico

Licuadora (para grandes


volmenes de muestra)

Detergentes

Homogenizador (para
muestras pequeas)

Tampones (favorecen la
lisis y solubilizan las
protenas)

Sonicacin.

Sales

ELECTROFORESIS
Para entender la tcnica del Western Blot es necesario comprender
que es una electroforesis y en que se basa.
Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un
campo elctrico a una solucin que contenga una mezcla de protenas,
stas migrarn a una velocidad que depender de su carga neta, forma
y peso molecular. Esta tcnica es conocida como electroforesis.
Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre en soportes
slidos, generalmente para separar una mezcla de protenas, el soporte
de eleccin son los geles de poliacrilamida.

Secuencia del Western blot Paso 1


Paso 1
Electroforesis de las muestras de protenas:
-Las protenas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta
mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S-El SDS aporta cargas negativas
-Las protenas corren hacia el nodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a
su peso molecular
Dodecilsulfato sodico

Muestra de protenas para cargar en


el gel

Fuente de poder

Protenas ya corriendo en el gel

Electroforesis en gel
En esta tcnica la mezcla de protenas se separa mediante una
electroforesis en gel, con base en:
o Peso molecular
o Estructura
o Hidrofobicidad

65mm altura Gel de


corrida

Cubeta de electroforesis

transferencia
Estos resultados son luego transferidos a una membrana adsorbente
produciendo una banda para cada protena.
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por
anticuerpos.
Membrana de nitrocelulosa o de PVDF.

Esta transferencia puede realizarse por:


Difusin
Por vaco
Por accin de un campo elctrico (electrotransferencia).

Buffer de transferencia

Se construye lo que se conoce como


sndwich, donde se apilan sucesivamente
una esponja plana, papel absorbente, el gel,
la membrana sinttica, ms papel y
finalmente otra esponja plana.

Secuencia del Western blot


Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las protenas separadas por tamao se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las protenas

Se detiene la corrida electroforetica

Se quitan las burbujas para asegurar


la correcta transferencia

Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar


el gel con las proteinas separadas por masa

Armado del cassette de transferencia

El gel con las protenas se coloca en el cassette de transferencia

Cassette listo para iniciar transferencia

VERIFICACIN
Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel
con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para
comprobar que en efecto una parte importante del material proteico
ha pasado a la membrana.

No se deberan observar protenas coloreadas en el Gel, lo que nos


dara a entender que todas las protenas se transfirieron.

bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas
de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que
han quedado libres tras la transferencia.
En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado
en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin
del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que
se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas:


Albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA)
Leche en polvo o casena
Diminuta fraccin de detergente (Tween 20 o Tritn X-100)
Se evita falsos positivos.

deteccin
Posteriormente la membrana se incuba con anticuerpos especficos
marcados para la protena de inters.
Comprueba la presencia en la membrana de una determinada
protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella
unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice
una reaccin colorimtrica. De esta forma, se hace patente la unin
con el antgeno, la protena, as como su localizacin.

Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos

Producto Insoluble

Anticuerpo
primario.

Anticuerpo
secundario

El anticuerpo reconoce especficamente la


protena desnaturalizada.

Reconoce de forma especfica una regin


concreta del anticuerpo primario.

Esta incubacin puede durar desde 30 minutos


a una noche entera.

Suelen estar marcados para ser detectables .

Las temperaturas elevadas temperaturas


favorecen las uniones ms especficas.

Varios de estos anticuerpos se unirn a cada


anticuerpo primario, amplificando la seal.

TIPOS
Se puede hablar de tipos de western blot segn el tipo de deteccin
de las protenas.
Directo:
El anticuerpo primario marcado se une al antgeno de la membrana y
reacciona con el sustrato originando una seal detectable. En el
mtodo directo de deteccin, el anticuerpo primario que se utiliza
para detectar el antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir
marcado con una enzima

MTODO DIRECTO

Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antgeno. Luego,
un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con
el sustrato. En el mtodo indirecto, se aade primero un anticuerpo
primario sin marcar contra el antgeno de la superficie de la
membrana; posteriormente se aade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo primario.

MTODO INDIRECTO

MTODOS DE DETECCIN
Radiactividad
Ms caro
Peligroso
Lento

Anticuerpo unido a una


enzima
Enzimas que catalicen la
transformacin de un sustrato soluble
en un producto insoluble.
Peroxidasa de rbano (HRP) o una
fosfatasa alcalina

Sistema
avidina/estreptavidina
Anticuerpo primario unido
covalentemente a molculas
de biotina.

Marcaje fluorescente
Unido a fluorocromos del infrarrojo
cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o
el rojo Nilo.

Deteccin de oro
Anticuerpos primarios con protena
A unida a partculas de oro.

anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la
deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters.

Es

muy importante ser consciente de que los datos producidos


con un western blot se considera generalmente para ser semicuantitativa.
Debido a que proporciona una comparacin relativa de los
niveles de protena, pero no una medida absoluta de la
cantidad.

Hay dos razones para esto; primero, hay variaciones en los tipos
de carga y de transferencia entre las muestras en carriles
separados que son diferentes en transferencias separadas.
En segundo lugar, la seal generada por la deteccin no es
lineal en todo el intervalo de concentracin de muestras.
Por lo tanto, puesto que la seal producida no es lineal, no
debe ser utilizado para modelar la concentracin.

aplicaciones
Investigacin
Biologa molecular.
Inmunologa.

Diagnstico
Prueba de VIH.
Enfermedad de las vacas locas.
Enfermedad de Lyme.

Et
a
p
a

TAMIZAJE SEROLOGICO
ELISA
Negativo

Positivo/Indeterminado
Repetidamente

Correr una nueva


muestra

Repetidamente
POSITIVO

(1)

Et
a
p
a

WESTERN BLOT
Negativo

Indeterminado
Correr una nueva muestra 30 a 60 das
despus

(2)
Repetir etapas 1 y 2

Positivo

WESTERN BLOT
(TEST CONFIRMATORIO)

TEST DE WESTERN BLOT


Objetivo- Detectar anticuerpos especficos contra el VIH1/2

Fundamento
Lisado viral de clulas infectadas, sometidos a
electroforsis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas
de nitrocelulosa

Criterios de interpretacin
POSITIVO
-

Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relacin al control ,


Una banda de envoltura y la p24
Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17 para HIV1
Protenas gp105 y gp36 para HIV2

3+ 1+ +/-

Control
gp120 gp41 p31 p24 p17

gp105 gp36

Criterios de interpretacin

INDETERMINADO
- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto son negativos en
relacin al control
3+ 1+ +/-

Control

Gp120

p24

NEGATIVO
Si todas las bandas presentan valoracin <+/ Ausencia de protenas
3+ 1+ +/-

Control

Inmunoperoxidasa
Detecta antgenos virales en muestras clnicas que contengan tejidos
y clulas.
En utilizar como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de
color un sustrato incoloro.
En la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, que permite la
identificacin de una protena (el antgeno), cuya presencia queremos
demostrar, mediante su unin a un anticuerpo especfico

ENZIMAS UTILIZADAS

Estos marcadores pueden unirse directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente


mediante otros anticuerpos o sustancias como biotina o protena A.

Proceso de la tcnica
Paso 1

Paso 2

Paso 3

El suero se pone en contacto con el sustrato antignico


Si hay Ac se unen al Ag (complejo Ag-Ac)

Se agrega un antigrama-globulina humana marcada con peroxidasa.


Si hay complejo esta se unir.

Hay una reaccin colorimtrica en presencia de un cromgeno y agua oxigenada.


Da un complejo insoluble y estable visible al microscopio ptico

ganglio linftico de rata

los puntos o clulas donde se localiza el antgeno


aparecen de color marrn

DOT BLOT
Dot Blot es una tcnica de biologa molecular para detectar
biomolculas.
En un dot blot las biomolculas para ser detectados no son separadas
por cromatografa. En cambio, una gota que contiene la molcula
para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto
es seguido por la deteccin por sondas de nucletidos (northern blot
y southern blot) o anticuerpos (para un western blot).
El procedimiento del Slot y Dot Blot son casi iguales pero en el
primero el filtro es a travs de pequeas ranuras.

Equipo de DOT BLOT

Armado:
1.

Tapa inferior

2.

Membrana selladora

3.

Membrana de Nitrocelulosa

4.

Tapa superior

5.

Ajuste de los tornillos

-Volumen Total PCR: 100 l


Preparacin de los productos a transferir:

Para sembrar un punto del dot blot:


Producto de PCR: 10 l
EDTA 100 mM

50 l

NaOH 2N

40 l

Agua

100 l

X8

Producto de PCR: 80 l
EDTA 100 mM

400 l

NaOH 2N

320 l

Agua

800 l

Teniendo en cuenta cuntos sondas vamos a probar y cuntas muestras se van a analizar,
hacer los clculos necesarios para TODOS los dot blots, multiplicando los volmenes
anteriores por el nmero de sondas + 1. En este ejemplo, se usaron 7 sondas
x 8.

1- Tomar tantos tubos eppendorf grandes como muestras.


7

2- Preparar las mezclas calculadas antes


membranas.

muestras listas para transferir a

Preparacin de la membrana:

Se utilizan membranas
de NITROCELULOSA
Cortar un rectngulo de 12 x 8 cm trabajando
siempre con guantes.

Hidratar 30 minutos con agua destilada y luego


equilibrar durante 5 minutos en buffer SSPE 20X,
pH 7,4.

Siembra de las Muestras- Dot Blot:


HYBRI-DOT MANIFOLD, BRL (Gibco)

+
membrana

Colocar la plancha inferior del aparato, conectar a la


bomba de vaco. Identificar un extremo de la membrana
con un corte.

Utilizando guantes, colocar la membrana sobre la


plancha inferior.

Colocar la plancha superior y ajustar perfectamente los tornillos en forma enfrentada. Encender la
bomba de vaco y verificar que sta elimina el lquido remanente del lavado de la membrana.
En cada punto de siembra colocar sucesivamente 200 ml de dilucin de cada producto de
amplificacin y 200 ml de SSPE 20X

7 8

Finalizada la siembra, y luego que la bomba elimin todo el lquido, colocar la membrana entre
dos papeles Whatman y sellarlos con una cinta. Secar durante una hora a 80 C en estufa (o por
cross linker)

Southern blot
permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una
mezcla compleja.

Pasos para un Southern blot


Extraccin del ADN

Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin.


Electroforesis en gel de agarosa.
Preparacin de un ensayo de southern.
Hibridacin con sonda radiactiva.

Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa


Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

Northern Blot
Tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de
una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un
ARN mensajero para un pptido dado en una muestra de ARN total).

Pasos de la tcnica
Extraccin del ARN.
Electroforesis en gel de agarosa.

Transferencia a membrana de nailon.


Estabilizacin con luz ultravioleta o calor.
Marcaje con sonda.

Lavado para quitar el exceso de sonda.


Analisis con sondas marcadas con isotopos radioactivos o
quimioluminiscencia.

Diferencias

Inmunodifusin

Se procede a colocar 5 micro litros


de suero control y del suero
problema en diferentes pocillos de
la placa de agarosa
El fin es tener las 3 placas de
agarosa con sueros control y
problema

-Es importante poner las concentraciones


especificas del suero control en la hoja de
datos
-Luego se procede a la incubacin de las
placas en una cmara hmeda a
temperatura ambiente

En este tiempo (3 das) las


Inmunoglobulinas van a difundirse por
la placa de agarosa, entrando en
contacto con sus correspondientes
antgenos
Esta interaccin forma anillos de
precipitacin visibles al ojo humano

La lectura de la muestra se hace con la


lupa, en la cual se mide el dimetro del
halo de precipitacin

-Se procede a colocar los dimetros de


cada halo en las tablas
-Se cambian los dimetros por
concentraciones usando la tabla de
referencia

-Se observa finalmente la concentracin


de alguna Inmunoglobulina aumentada
dependiendo del estado de infeccin del
paciente

PCR ( REACCION EN CADENA DE LA


POLIMERASA
Permite amplificar selectivamente secuencias
de ADN o ARN luego de la sntesis de ADN
complementario mediante transcripcin
reversa

Kary Mullis Ganador del premio nobel de quimica en


1993 por esta tecnica

Grandes cantidades de ADN de longitud y


secuencia definidas, a partir de pequeas
cantidades de un complejo templado

Con la amplificacion resulta mas facil identificar virus o


bacterias causantes de enfermedades

Muestra clnica

Fundamento de la PCR
Amplificacin enzimtica de un fragmento de
ADN flanqueado

2 oligonucleotidos cebadores ( primers ) que hibridan con las cadenas opuestas de la


secuencia nucleotida de inters (secuencia blanco )

Tres tipos de informacin


1.- Presencia de la secuencia blanco
2.- distancia entre los cebadores
3.- secuencia nucleotida entre los cebadores

Una vez obtenido el templado de ADN

Gen de interes
Cebadores
Nucleotidos
ADN polimerasa termoestable

Se lo deposita en el
termociclador

Ciclo de desnaturalizacin
( a 95 C )

Punto de partida para replicar el


ADN

Hibridacin o Anillamiento
Hibridacin de los cebadores a las
secuencias complementarias ( a 55 - 65 C )

Extension o elongacion
Extension nucleotidica de dichos cebadores
mediante la accion enzimatica de una ADN
polimerasa termoestable

Ciclo 2

Ciclo 3