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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA

EDUCACION
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
BIOQUIMICA GENERAL
ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL
Correa,X.Hoyos,J.Peña,J.
Objetivo: Determinación cualitativa de la afectación de la actividad enzimática de la Amilasa
salival por diferentes factores como Temperatura, pH, especificidad e influencia de inhibidores
y activadores.
Resultados:
Se reportan los Resultados de la actividad enzimática en cada una de las pruebas.
Tabla N°1: Labilidad térmica de la enzima Amilasa utilizando como sustrato el Almidón.
Tubo N°

Condiciones experimentales

Incubación

Coloración con yodo

1
2

Enz. Calentada previamente

enzima nativa

10 min, 37°C
10 min, 37°C

++

3

enzima nativa

10 min, 0°C

-

Tabla N° 2: Influencia del pH en la actividad de una enzima:
Tubo N°

pH del medio

incubación

Coloración con yodo

1

5,0

10 min, 37°C

-

2

6,8

10 min, 37°C

++

3

8,0

10 min, 37°C

+

Tabla N°3 de especificidad de las Enzimas (Amilasa y sacarasa):
Tubo N°

sustrato

Enzima

1
2
3
4

Almidón
Almidón
Sacarosa
Sacarosa

Amilasa
Sacarasa
Amilasa
Sacarasa

Incubación

10
10
10
10

min,
min,
min,
min,

37°C
37°C
37°C
37°C

Coloración
con yodo

Reacción de
fehling

+

Tabla N° 4 Influencia de los activadores e inhibidores en la Amilasa:

+

para ser dispuestos en un baño termostatado a 37ºC aproximadamente. 37°C + 2 CuSO4 Almidón Amilasa 10 min. formando un compuesto de . seguidamente al tubo 1 y 2. cuya acción digestiva es ejercida sobre los almidones. [1]. 1. “El color que dan los polisacáridos con el Lugol (solución de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios vacíos en las hélices de la cadena de unidades de glucosa. Prueba de labilidad térmica. para el primer tubo se presentó una coloración azul oscura. para el tubo 3 se le agrego la solución de ptialina y se procedió a enfriar a 0ºC por 10 minutos y finalmente a cada tubo se le aplicó una gota de Lugol. de los cuales. de izquierda a derecha tubos 1. Esta prueba se llevó a cabo en 3 tubos de ensayo cada uno con la muestra de ptialina. La actividad enzimática está definida como la cantidad de producto formado o cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo. el tubo 1 fue sumergido en un baño de agua hirviendo por 2 minutos. Según los resultados de la tabla N°1 y de la fotografía N°1. hay que resaltar que el reactivo de Lugol es empleado para determinar la presencia del almidón en el sustrato sobre el cual actúa la enzima. esto por un periodo de 10 minutos. y el pH entre otros. y es afectada por una serie de factores entre ellos la temperatura. Labilidad térmica para la amilasa salival. La saliva está constituida entre otras cosas por una enzima llamada ptialina. 37°C - Análisis de resultados: Las enzimas son proteínas que aceleran la velocidad de las reacciones químicas en nuestro organismo. que es una alfa amilasa. se les añadió la solución de almidón. 2 y 3.Tubo N° sustrato Enzima Incubación Coloración con Yodo 1 NaCl Almidón Amilasa 10 min. Imagen N° 1.

41ºC. uniones C1 con C6. lo que quiere decir que la enzima no degradó el almidón por lo tanto está inactiva. Finalmente este ensayo no es una reacción química. Esta unión del I2 a la cadena es reversible. lo cual da positivo para la presencia de amilo pectina “componente del almidón de cadena ramificada. lo que hay es una formación de un compuesto el cual modifica las propiedades físicas de la molécula de almidón. que al enfriarse reaparece. ya que al ser hervida esta se desnaturaliza por lo cual no puede actuar sobre el almidón para hidrolizarlo. como se evidencia en la fotografía. formando cadenas ramificadas. esto prueba que la enzima estaba activa en condiciones normales. forma hélices mucho más cortas. dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. degrada la amilosa. al elevar la temperatura sin exceder su punto óptimo. En el tubo 2 la coloración fue amarilla muy clara. La α-amilasa rompe uniones C1-C4. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces α. En este caso la ptialina puede revertir su inactividad debido a que a temperaturas bajas se mantiene en estado nativo pero sin ejercer su función. mientras que la amilopectina tiene. “El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina. y por calentamiento desaparece el color. y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse. Para el tubo 3 se presenta una cloración rojiza.inclusión que altera las propiedades físicas del polisacárido. ambos polisacáridos de glucosa. se activa nuevamente 2.”[1] Podemos analizar que cuando el tubo con la enzima es calentado en un baño con agua hirviendo previamente esta pierde su actividad enzimática. tanto en la amilasa como en la amilopectina. además de estos últimos enlaces. preservándola en un rango de temperatura óptima para la acción de enzimas.C1-C4. ya que no se sometió el tubo a grandes variaciones de temperatura. se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I 2/IK ya no dará una coloración azul. Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas: . especialmente la absorción lumínica.[2] Por tal razón cuando la α-amilasa actúa. así esta ha perdido su estructura inicial y pierde sus propiedades como catalizador. que oscila entre 36 . El Lugol da con el almidón color azul y con el glucógeno color rojo caoba. obteniéndose un color entre naranja y amarillo [3].

0 mL de la muestra de saliva y 2 mL de solución de almidón. la coloración se debe a que el yodo entra a la estructura helicoidal del almidón. a todos los tubos se les añadió 1. es decir que los átomos de yodo se introducen entre las espirales provocando la fijación de yodo en las moléculas de almidón.8 se evidencia un cambio de color a transparente. especialmente en la parte proteica.Para esta prueba se tomaron tres tubos de ensayos a los que se les vertieron 2 mL de soluciones amortiguadoras a pH diferentes (tabla N° 2). siendo inactivada tanto en medio acido como alcalino [4]. lo que nos indica que a este pH. como regla. se tiene que el punto isoeléctrico de la enzima no corresponde con el pH al cual la enzima tiene su mayor actividad. Imagen N°2 Como podemos evidenciar en la fotografía N°2 vemos en el tubo N°1. La actividad enzimática guarda una estrecha relación con el estado iónico de la molécula. puesto que las cadenas poli peptídicas contienen los grupos carboxilos y aminos que se pueden ionizar. . Se pusieron a incubar (tabla N°2). y luego se les añadió 1 gota de reactivo de Lugol. se presenta una tonalidad azul intensa.4. [5] En el tubo N°2. a un pH de 6. la enzima presenta una actividad óptima. lo que nos indica que no hubo ninguna actividad de la enzima sobre el sustrato. La ptialina de la saliva actúa de manera óptima en un pH entre 6 y 7.

mientras que la amilopectina es de estructura ramificada. esto quiere decir que existe una reacción entre la ptialina (amilasa) y el almidón por ello no se observó presencia de coloración. 4 3 2 de las pruebas de 1 La prueba de Lugol se da como consecuencia de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción entre el almidón y el yodo presente en el reactivo de lugol. Ciertas enzimas muestran especificidad relativa.En el tubo N°3. vemos un cambio de coloración a amarillo claro.1. pero que si disminuyó mucho su actividad. Imagen 3. La amilasa hidroliza el almidón para formar maltosa y dextrina. que forma hélices en donde se juntan las moléculas de yodo formando un color azul oscuro. [7]. se esperaría que a pH mucho más altos. Resultados especificidad enzimática. Especificidad enzimática. y que esta dependencia se puede llegar a explicar por una alteración de la carga eléctrica neta de la proteína que hace que haya una repercusión en su solubilidad. y con ello el sitio catalítico [6]. quede completamente inactiva. Con este ensayo podemos ver como el pH tiene una gran influencia sobre la velocidad de la reacción entre la enzima y el sustrato. Los cambios de pH afectan profundamente el carácter iónico de los grupos funcionales de la enzima y por tanto alteran la conformación de la proteína. que forma hélices mucho más cortas y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse presentando un color intermedio entre anaranjado o amarillo. lo que nos indica que la enzima no está totalmente inactiva. con con enlaces α (1-4) (1-6). Observemos al tubo 1 que contiene solución de almidón y amilasa salival al que se le realizó la prueba de Lugol y no se obtuvo coloración alguna lo que quiere decir que la prueba dio negativa. Acción de la amilasa sobre el almidón. como es el caso de la amilasa. con enlaces α (1-4).(reacción N°3. ya que actúan sobre muchos compuestos que poseen un rasgo estructural común.También simplemente puede pasar que haya un efecto del pH sobre el sustrato. . ocasionando así un efecto sobre la reacción enzima+ sustrato 3.1) [8] Reacción 3. La amilosa y la amilopectina son componentes del almidón pero la amilosa es de estructura lineal.

Si el grupo carbonilo se encuentra combinado no puede presentar este poder reductor. siendo entonces la glucosa un azucar reductor y la fructuosa no lo es [9]. [6]En esta prueba cuando se obtiene una coloracion azul nos indica que da negativa. mas sin embargo la sacarasa tambien conocida como invertasa es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa. Se hace evidente que la enzima amilasa es especifica para la hidrolisis del almidon ya que utilizando otra enzima la prueba de lugol dio positiva. El poder reductor que pueden presentar los azúcares proviene de su grupo carbonilo. pues bien la sacarasa es una enzima que convierte la sacarosa (azúcar común) en glucosa y fructosa. Por ende en el tubo tres se observo que la prueba es negativa. sin embargo observemos que en el tubo 4 que contiene sacarosa y sacarasa dio positivo para la prueba de Fehling. . y positiva cuando la coloracion es naranaja o marron. que puede ser oxidado a grupo carboxilo con agentes oxidantes suaves. pues bien la amilasa no es una enzima que tenga algun efecto sobre la sacarosa. La reaccion de Fehling de usa para la determinacion de azucares reductoras. sin embargo la sacarosa no tiene poder reductor sobre el reactivo de Fehling. a la que se le realizo de igual forma la prueba de Lugol presento una coloracion azul oscura.Contrariamente en el Tubo 2. determinando con esto que la brueba dio positiva por la presencia de almidon en la solucion. que esta compuesto por almidon (sustrato) y sacarasa. [8] En el tubo 3 (solucion de sacarosa y amilasa) se adiciono reactivo de Fehling que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores. y no cumple la misma funcion que la ptialina.

En el tubo N°1 (tabla N°1.Reaccion 3. La ptialina requiere cloruro como cofactor inorgánico para que la catálisis ocurra de manera óptima [10]. evidenciando así una aceleración en la actividad catalítica de la reacción. figura N°4) al cual se le adicionó Cloruro de sodio podemos ver que la solución se tornó transparente. mostrando claramente una reacción rápida. Accion de la sacarasa (invertasa) sobre la sacarosa. Influencia de los activadores e inhibidores en la actividad enzimática de la amilasa: Figura N°4 Sabemos que la labor de los inhibidores sobre un enzima es disminuir la velocidad de reacción o la de detener completamente la actividad.2. .

. para el enzima sacarasa. la amilasa de ésta actúa sobre el almidón rompiendo sus cadenas dando lugar a polisacáridos más pequeños llamados dextrinas con los que el reactivo de Lugol da un color más claro y finalmente se rompen las dextrinas dando lugar a disacáridos de glucosa y glucosa con los que el reactivo de lugol no reacciona por lo que la solución va perdiendo color. mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos análogos. En el tubo N° 2 al que se le adicionó Sulfato de cobre. El sulfato de Cobre. se una a los grupos de las cadenas laterales originando la ruptura de los puentes de hidrogeno. Podrían dar positivos los isómeros de la sacarosa como maltosa y la isomaltosa ya que estos son sustratos análogos a la sacarosa por lo tanto también rompería en estas el enlace bglucosídico. se digiere el almidón y quedan las glucosas libres. el cual hace que el COO . se presentó un efecto inhibidor (Tabla N° 4) que provocó que la hidrolisis del almidón no se llevara a cabo.: transaminasas. Cuál es el sustrato específico de la sacarasa. Ej. por lo que se pierde totalmente la coloración.Al incubar con NaCl y amilasa lo que pasa es que se rompen los o sea. y por ello observamos (figura N°4) el color que es característico para reconocimiento del almidón. utilizado para la determinación de polisacáridos. dando un color violeta a negro. Así. Qué se espera con la tinción con el Lugol y cuál es el fundamento de la reacción general? El reactivo de lugol (solución de iodo). 3. NAD y NADP. Entonces el Lugol no se puede intercalar en el polisacárido y no habría detección del mismo. FMN. que tienen como coenzimas a los nucleótidos FAD. El enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos análogos. la sacarosa es su sustrato natural. Los más característicos son las deshidrogenasas. Cuál es la clasificación de las enzimas. tiene efecto sobre el almidón (polisacárido de la glucosa) .[11] Preguntas complementarias: 1.reductasas: catalizan óxido .reducciones de los sustratos encaminadas generalmente a obtener energía de los carburantes metabólicos. Transferasas: catalizan la transferencia de grupos funcionales de un sustrato a otro. pero al añadir la saliva. sobre cuales sustratos no específicos esta podría actuar y por qué? La enzima sacarasa es muy específica: rompe el enlace b-glucosídico de la sacarosa o de compuestos muy similares. que es azul oscuro.de la enzima. es una sal que desnaturaliza las enzimas por efecto del desprendimiento del ion cúprico. 2. teniendo en cuenta su papel o función? Oxido .

Se logró determinar que existen factores muy determinantes en la actividad enzimática en este caso específico la Amilasa Salival. Comisión de Enzimas. La energía necesaria para la síntesis del enlace la obtienen de la hidrólisis del ATP. en donde el (2) representa la clase (transferasas). el (7) la subclase (fosfotransferasas). Glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa): EC 2. para asegurar así el buen funcionamiento de cada una de las enzimas. ya que no se observaron resultados que demostraran lo contrario con el otro sustrato (sacarosa). etc) Isomerasas: catalizan reacciones de isomerización que producenreordenaciones dentro de la molécula o transferencia de radicales de una parte a otra de la molécula. tales como el pH. En que consiste la nomenclatura internacional para estas? De por lo menos dos ejemplos. amilasas) y de enlaces peptídicos (tripsina. y sin embargo también se evidencia la acción de la sacarasa en la sacarosa. la tercera la sub-subclase y la cuarta es propia de cada enzima. y la temperatura. y controladas. de enlaces glucosídicos (sacarasas. fosfatasas). Ejemplos: Creatin-fosfotransferasa. Se utiliza un código numérico. encabezado por las letras EC que significa. la acción enzimática se llevan a cabo bajo condiciones muy bien establecidas. Su número de clasificación es EC 2.2. seguida de cuatro números separados por puntos.Hidrolasas: catalizan reacciones de hidrólisis de enlaces éster (lipasas. . 4.7. ambas reacciones se encuentran acopladas. el (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitrógeno como aceptor) y la cuarta (2) designa a la creatínquinasa. abreviadamente. En términos generales. es la temperatura corporal (37°C).1.La primera cifra representa el nombre de la clase. pepsina.7. Ligasas o sintetasas: catalizan la síntesis de nuevas moléculas al formar enlaces entre dos o más moléculas o grupos funcionales.3. Existen compuestos que pueden actuar como activadores e inhibidores de las reacciones llevadas a cabo por las enzimas. Se logra determinar que la amilasa es una enzima específica para la hidrolisis de almidones.2 Conclusiones:     Se logró determinar que la actividad óptima de la ptialina presente en la saliva. por lo que las incubaciones se hicieron a dichas temperaturas. la segunda la subclase.

p df [11] http://es. 1984.academia. Ed Limusa. Prácticas de fisiología II.net/vegabner/almidn-35325388 (último acceso: 03 de 04 de 2016)  [4]Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica pág. pág 347.slideshare.»https://www. 29.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/vargas_as/antec_fund_cientif.com/trabajos-pdf900/actividadenzimaticaamilasa/actividad-enzimatica-amilasa.net/michael24k/practica-n1-11980137  .monografias.co/2011/04/especificidad-enzimatica.es/~mbam0000/paginas/LABORATORIOs/azucares. Instituto tecnológico de Santo Domingo.html [8].» http://www.México 2004. es.Bibliografia:  [1] «Academia. [7].  [5] Estrada. enzimaszagan.slideshare. 35.edu. almez.pdf (último acceso: 03 de 04 de 2016).» http://es. L. Peru. M.net/lizbethdamazogalvez/hidrlisis-del-almidn-por-la-amilasa-salival [9].  [3]« Manuel de practicas Universidad del Santa.pntic.mec.slideshare.htm [10]http://sisbib. pág.com.      [6] Pacheco.edu/6347596/Identificaci%C3%B3n_de_Car bohidratos_a_trav%C3%A9s_de_reactivos (último acceso: 03 de 04 de 2016)  [2] «Monografias.unmsm. Bioquímica médica.blogspot.