You are on page 1of 10

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETIL ASETAT KULIT BUAH

MANGGIS (Garcinia mangostana L.) terhadap Streptococcus mutans

Siti Muslichah1), Dian Anggraini1), Joko Waluyo2)
1

Fakultas Farmasi Universitas Jember
2

FKIP Universitas Jember

ABSTRACT
Garcinia mangostana belong to the family Cluciaceae which is has used as
phitomedicine for the treatment of diarrhea, anti-inflammatory, antiallergy, antifungal, and
skin infection. The present study was aimed to investigate the antibacterial activity of etyl
acetat extract from mangosteen pericarp against Streptococus mutans. Antibacterial activity
was examined by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) using agar dilution
method. The inhibition values of extract against S. mutans were ranged from 10-400 ppm.
The result showed that the extract was effective against S. mutans. The MIC value was 12.5
ppm that was comparable to these of tetracycline, an antibactery used as control.
Keyword : mangosteen, antibacterial, agar dilution method
PENDAHULUAN
Sejak jaman dahulu masyarakat Indonesia sudah mengenal dan menggunakan
tumbuhan berkhasiat obat sebagai salah satu upaya penanggulangan masalah kesehatan yang
dihadapi. Hal ini telah dilakukan jauh sebelum pelayanan kesehatan formal dengan obatobatan modern menyentuh masyarakat. Pengetahuan tentang tumbuhan obat merupakan
warisan budaya bangsa secara turun temurun (Muhlisah, 2002). Pencarian obat baru dapat
dimulai dari isolasi dan identifikasi kandungan utama dari bahan alam. Kulit buah manggis
(G. mangostana L.) telah digunakan dalam obat tradisional untuk mengatasi gangguan
pernafasan (Wahyuono et. al., 1999). Selain itu, secara tradisional kulit buah manggis selain
sebagai obat diare juga digunakan sebagai obat sariawan dengan cara kulit buah ditambah air
dan direbus kemudian digunakan sebagai obat kumur (Sastroamidjoyo, 2001). Senyawa
golongan xanthone adalah metabolit sekunder yang terdapat dalam manggis yang dapat
diisolasi dari buah, kulit batang, daun, dan kulit buah manggis. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa xanthone memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, antialergi,
antibakteri, antifungi, antitumor, dan antivirus (Pedraza, et al., 2008; Suksamrarn, et al.,
2006).

sedangkan dari ekstrak etil asetat kulit buah manggis diperoleh isolate FB1.Penyakit infeksi merupakan penyakit yang banyak diderita masyarakat Indonesia sejak dulu. dan isolat FE2 diduga γ-mangostin. Berdasarkan hasil telaah kandungan kimia dan aktifitas antimikroba kulit buah manggis. mutans (Laboratorium Mikrobiologi Fak MIPA UNEJ).al. etil asetat NSAP (UPT BPPTK LIPI). media agar Mueller Hinton . BAHAN DAN METODE Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : kulit buah manggis dari daerah Jember. dan ludah manusia. 2005). FD2 7mangostin. albus. 1990). nasofaring. dalam ekstrak n-heksana kulit buah manggis didapatkan isolat FH1. bakteri S. pelarut etil asetat yang digunakan sebagai pelarut pengekstraksi lebih banyak mengambil kandungan kimia dari kulit buah manggis daripada menggunakan pelarut n-heksana pada penelitian pendahuluan. S. isolat FB1 13-mangostin. S.mutans juga merupakan kuman pathogen penting penyebab infeksi bernanah dengan sifat khasnya yaitu kecenderungan yang menyebar. mutans. Adanya sifat antiinflamasi dari mangostin yang merupakan kandungan aktif kulit buah manggis dan derivat xanthone diharapkan dapat digunakan sebagai bahan aktif obat kumur antiseptik yang dapat membunuh kuman S. Berdasarkan uraian tersebut. Karies atau penyakit gigi berlubang merupakan penyakit infeksi yang diderita oleh hampir 95% populasi dunia. dan Eschericia coli (Tambunan. Karies gigi terjadi karena adanya perusakan email gigi atau biasa disebut proses demineralisasi oleh kuman Streptococcus mutans yang ada pada plak.. mutans. Isolat FH1 adalah mangostin. Kandungan kimia kulit buah manggis telah diteliti aktifitasnya terhadap bakteri Staphilococcus aureus. S. Semua isolat tersebut aktif terhadap bakteri uji Shigella flexneri. juga dapat menyebabkan lesi non spuratif seperti demam rematik akut dan glomerulonefritis. Pada penelitian. Kadang-kadang menyebabkan endokarditis bakterialis dan pembentukan plak pada gigi yang mengarah kepada terjadinya karies gigi dan lain-lain (Gupte. penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat kulit buah manggis terhadap bakteri S. dan FE2. 2010). isolate FCA2 mangostin. mutans merupakan bakteri komensal pada mukosa mulut. Salmonella typhi. FCA2. tetrasiklin serbuk (PT Brataco). dan Micrococcus lutus (Priya et.

Setelah dikeluarkan dari autoklaf. 32 ppm. . stopwatch dan kamera digital. vortex. mikropipet (Ependorf). Penyiapan bakteri Suspensi S. kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf dengan suhu 121 oC selama 30 menit. Prosedur Penelitian Pembuatan ekstrak Serbuk kulit buah manggis sebanyak 1 kg ditambah etil asetat sebanyak 7. residu dipisahkan dengan corong Buchner. lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. mutans lalu dicampur dengan 3 mL aquades steril. alkohol. kapas steril. Ekstrak kental dikeringkan dengan tujuan menghilangkan pelarut agar tidak mengganggu proses pengujian. neraca analitik. Maserat dikumpulkan. Ekstrak etil asetat kulit buah manggis dibuat beberapa konsentrasi yaitu 10 ppm. 12. colony counter (Carolina). media TSA (DifcoTM). 200 ppm. dengan ditambah tween 80 2%. Tween 80 2%. mutans yang dipergunakan dibuat dengan cara mengambil 2 ose kuman dari kultur.(Merck). TSB (BactoTM). kertas saring.5 ppm. agar dituang sebanyak 20 mL kedalam cawan petri steril dengan cara aseptik. 50 ppm. selanjutnya diinkubasi disesuaikan dengan standar McFarland no 1 (3x108 CFU/mL). aqua destilata.5 L. lampu spiritus. kemudian ditambahkan aquadestilata 100 mL. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan dianginanginkan sampai ekstrak kental. yang dilakukan dengan mengambil 0.Serbuk diremaserasi dengan etil asetat sebanyak tiga kali selama 3 hari. 25 ppm. 100 ppm.2 mL suspense S. kemudian dimasukkan ke media 5 mL TSB. 16 ppm. 20 ppm. dicampur dan diaduk lalu dipanaskan sampai mendidih da larut. dan 400 ppm. alat-alat sterilisasi (Memmert). lalu diencerkan sampai diperoleh koloni kuman yang dapat tersebar untuk mempermudah proses penghitungan. cawan porselin. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : alat-alat gelas (Pyrex). Pembuatan media Muller Hinton Agar Muller Hinton ditimbang sebanyaj 2 g.

Jika berdistribusi normal maka dilanjutkan dengan uji statistik Analysis of Varians (ANOVA) satu arah dengan derajat kemaknaan 95% (p<0. Inkubasi dilakukan selama 24 jam dengan suhu 37o C. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak kulit buah manggis diketahui mempunyai aktivitas bakteri spektrum luas terhadap beberapa bakteri gram positif dan gram negatif. dimana konsentrasi ekstrak yang terkecil yang memberi hambatan ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimum (KHM) terhadap pertumbuhan S.1 mL untuk ditanam ke media Muller Hinton. plate dikeluarkan. Pengamatan dan pengumpulan data Setelah diinkubasi dalam incubator selama 24 jam dengan suhu 37o C. Analisis dilanjutkan dengan menggunakan analisis probit untuk mengetahui pada konsentrasi berapakah yang mampu menghambat pertumbuhan 50% koloni uji.9 mL lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi.Pengenceran dilakukan sampai sepuluh kali sehingga jumlah koloni terhitung dikalikan satu per enambelas dipangkatkan sepuluh. Analisis data Analisis data didahului dengan uji homogenitas variansi dengan uji Kolmogorov Smirnov. Inokulasi kuman ke dalam media agar dilakukan dengan cara mengambil ekstrak etil asetat kulit buah manggis masing-masing konsentrasi sebanyak 0. terutama yang dikaitkan dengan . Setelah itu campuran diambil sebanyak 0. mutans diambil sebanyak 0.1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi ekstrak. Diamati sifat dan jumlah koloni yang tumbuh dan dilakukan uji katalase untuk memastikan bahwa yang didapatkan adalah benar-benar koloni dari S. Penanaman S. diratakan sampai campuran ekstrak dan suspensi kuman rata pada permukaan media. mutans. mutans dilakukan per seri terdiri satu seri terdiri dari 3 replikasi pada tiap konsentrasi ekstrak yang berbeda.05) menggunakan SPSS. sedang kontrol negatif digunakan larutan Tween 80 2%. dikocok dengan vortex dan didiamkan selama 60 detik. Lalu suspensi S. Sebagai kontrol positif digunakan tetrasiklin dalam Tween 80 2%. kemudian dilakukan perhitungan dengan menggunakan colony counter. mutans.

12. Berdasarkan penelitian Phongpaichit dkk (2008).. 1983.5 ppm. 100 ppm. 16 ppm. mutans maka dilakukan uji pendahuluan terhadap konsentrasi terkecil yang digunakan dalam penelitian yaitu ekstrak 10 ppm untuk memastikan bahwa konsentrasi terkecil tersebut bukan merupakan KHM dari ekstrak terhadap S. dari beberapa derivate xanthone. α-mangostin diketahui mempunyai aktivitas antimikroba yang paling poten (Mahabusarakam et al.. Oleh karena itu. mutans yang dapat dihitung. 1983..infeksi kulit. 1996 ). dan jerawat (Iinuma et al. Dari hasil proses uji pendahuluan pada suspense inokulum ternyata inokulum yang diencerkan sesuai standar McFarland tersebut pertumbuhan koloninya pada media masih banyak sulit dihitung. ekstrak kulit buah manggis dibuat dengan metode maserasi menggunakan pelarut etil asetat. Iinuma et al. pengenceran inokulum dilakukan sebanyak 10 kali dengan perbandingan 1:16 (0. mutans. TB. 1986). Sundaran et al. sebab kandungan senyawa mangostin mudah larut dalam pelarut etil asetat.2 mL inokulum diencerkan dengan 3 mL aquades steril). Berdasarkan pengujian.. Kandungan kimia yang terdapat di dalamnya bertanggung jawab terhadap aktivitasnya sebagai anti mikroba. dan 400 ppm. 1996. 50 ppm. Untuk control positif digunakan tetrasiklin dengan konsentrasi 5 ppm dan control negatif adalah Tween 80 dengan konsentrasi 2%. 25 ppm. 200 ppm. . diare. Konsentrasi larutan uji yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri ekstrak kulit manggis yaitu 10 ppm.33%. KHM atau MIC (Minimum Inhibitor Concentration) bertujuan untuk mengetahui pada konsentrasi berapakah ekstrak mulai menunjukkan aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. 32 ppm.. Dalam penelitian terdahulu. Sebelum dilakukan pengujian aktivitas ekstrak etil asetat kulit buah manggis terhadap S. dilakukan pengenceran sampai diperoleh jumlah koloni S. 20 ppm. Sebelum dilakukan pengujian terhadap aktivitas antibakteri ekstrak maka dilakukan uji pendahuluan terhadap pengenceran suspensi inokulum. 20 ppm. Mahabusarakanm et al. Secara keseluruhan aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat kulit buah manggis dapat ditunjukkan pada tabel I. Ekstrak kental hasil penyarian didapatkan rendemen sebesar 6.

57-12. 2005).5 ppm 290 8 2.5 ppm. mangostana L. Pada penelitian ini juga menunjukkan adanya efek sinergis antara α-mangostin dengan antibiotic .5 ppm.2% 12 K(-) 298 0 0 K(+) : Kontrol positif tetrasiklin konsentrasi 5 ppm K(-) : Pelarut pengencer (10 mL aquadest+2% Tween 80) (-) : tidak ada hambatan terhadap pertumbuhan S. mangostana mampu menghambat Methicillin-Resistant Staphilococcus aureus (MRSA) dengan isolatnya α-mangostin pada konsentrasi 1. mutans dengan metode sumuran. mutans.Tabel I.6% 3 Ekstrak 100 ppm 195 103 34. mutans No Larutan Uji Koloni Terhitung Koloni Terhambat % Hambatan 1 Ekstrak 400 ppm 126 172 57.5% 7 Ekstrak 20 ppm 268 30 10.5 ppm. Untuk memastikan nilai KHM ini peneliti juga melakukan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat kulit buah manggis terhadap S. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat Kulit Buah Manggis (G.1% 6 Ekstrak 25 ppm 252 46 15.6% 11 K(+) 223 75 25. mutans yang diperoleh jumlahnya dikalikan dengan 1/16 10 x 107 CFU/mL Konsentrasi hambat minimal (KHM) ekstrak etil asetat kulit buah manggis terhadap S.8% 2 Ekstrak 200 ppm 165 133 44.1% 8 Ekstrak 16 ppm 281 17 5. Pada hasil pengamatan permukaan media dengan metode tersebut mulai tampak adanya zona bening pada daerah sumuran yang berisi ekstrak konsentrasi 12.5µg/mL (Sakagami et al.63% 10 Ekstrak 10 ppm 302 -4 -1.6% 4 Ekstrak 50 ppm 223 74 24..25 dan 6. mutans Catatan : Seluruh jumlah koloni S.25-12. juga ditunjukkan bahwa α-mangostin aktif teradap Vancomycin Resistant Enterococci (VRE) dan MRSA dengan nilai MIC 6. Selain itu.5 µg/mL.7% 9 Ekstrak 12.) terhadap Pertumbuhan S. mutans adalah 12. Jika dilihat dari hasil perhitungan persen hambatan ekstrak tersebut dapat dikatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang diujikan pada bakteri semakin meningkat pula persen hambatannya terhadap bakteri S. Ekstrak G. sehingga KHM dari penelitian aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah manggis adalah 12.9% 5 Ekstrak 32 ppm 238 60 20.

Neoformans (MIC 64-200µg/mL) dan Micosporum gypseum (MIC 2-64µg/mL). aureus ATCC29523. nigrolineta. dan Cryptococcus neoformans. Berdasarkan berbagai hasil penelitian diketahui tanaman manggis memiliki khasiat sebagai antimikroba baik sebagai antibakteri maupun antijamur. gypseum. al. albicans. dan flavonol ketiganya diketahui telah disintesis oleh tanaman dalam responnya terhadap infeksi mikroba sehingga tidaklah mengherankan jika secara in vitro efektif terhadap sejumlah mikroorganisme. Pada penelitian ini data yang diperoleh berupa persen hambatan ekstrak kulit buah manggis terhadap pertumbuhan S. Konsentrasi penghambatan dari ekstrak etil asetat G. albicans. flavonoid. 2005). Neoformans. serta dapat mmbentuk kompleks dengan dinding sel (Pudjarwoto et.. dulcis. Flavon. Cr. Ketidaktepatan jumlah koloni terhitung dalam penelitian dapat disebabkan karena penyiapan inokulum yang kurang tepat (Sanz et al. G. 1987). antijamur. C. 70 dari 377 isolat mempunyai aktivitas antimikroba terhadap S. Data yang didapatkan kemudian diolah . dan menunjukkan efek parsial sinergis dengan antibiotik ampisilin dan minoksiklin (Sakagami et al. Mangostin dan turunannya tergolong ke dalam senyawa xanthone yang merupakan pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan gerakan kromatografinya serupa dengan flavonoid (Harborne. aureus (MIC 32512µg/mL).. Pada penelitian Rungjindamai dkk (2004) di Thailand terhadap daun dan ranting beberapa tanaman genus Garcinia antara lain Garcinia atroviridis. mangostana. dan larvasida. Selain itu. Hal ini terlihat pada perbedaan jumlah koloni terhitung pada perlakuan ekstrak 10 ppm yang jumlahnya ternyata lebih banyak daripada kontrol negatif sehingga dalam perhitungan persen hambatannya menjadi negatif.gentamisin. G. mangostana secara berurutan 6-10%. C. G. scortechinii dapat diisolasi 377 isolat dan 19% mempunyai aktivitas sebagai antimikroba terhadap 7 mikroba pathogen dalam tubuh manusia. C. dan G. 1-2% dan 18% dengan nilai MIC untuk S. dan M. 1992). mutans. Dalam penelitian Phongphaichit dkk (2008) dilaporkan bahwa ekstrak etil asetat kulit buah manggis dapat mengambil 70 isolat (18.. Selain itu terdapat berbagai penelitian yang membuktikan bahwa ekstrak daun dan akar tanaman manggis juga mengandung mangostin yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri. Aktivitasnya kemungkinan disebabkan oleh kemampuannya untuk membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler dan terlarut. MRSA. 1990).albicans dan Cr. Kandungan utama daru kulit buah manggis adalah mangostin.6%) yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri pada beberapa mikroorganisme pathogen seperti S. Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengarui hasil dalam suatu penelitian. aureus.

menggunakan Analisis Varian Satu Arah (ANOVA) untuk mengetahui apakah data yang diperoleh berbeda secara signifikan atau tidak menggunakan LSD. Tabel III. Hasil Analisis Probit No Replikasi Nilai IC 50 1 Pertama 250.758. Hasil Analisis LSD Konst(ppm) 10 12.758 ppm. Artinya ekstrak etil asetat kulit buah manggis dapat menghambat pertumbuhan 50% bakteri S. . mutans pada konsentrasi 238. selanjutnya dilakukan analisis probit dan hasilnya seperti terlihat pada tabel III. Tabel II.5 TBS 16 BS TBS 20 BS BS TBS 25 BS BS BS BS 32 BS BS BS BS TBS 50 BS BS BS BS BS TBS 100 BS BS BS BS BS BS BS 200 BS BS BS BS BS BS BS BS 400 BS BS BS BS BS BS BS BS BS BS Keterangan: BS : Berbeda signifikan TBS: Tidak berbeda signifikan Setelah dilakukan analisis menggunakan Anova untuk mengetahui perbedaan secara signifikan pada berbagai konsentrasi.5 16 20 25 32 50 100 200 400 10 TBS BS BS BS BS BS BS BS BS TBS BS BS BS BS BS BS BS TBS BS BS BS BS BS BS BS BS BS BS BS BS TBS BS BS BS BS TBS BS BS BS BS BS BS BS BS 12.077 ppm Rata-rata 238.899 ppm 3 Ketiga 242. mutans (IC50). Hasil dari analisis LSD dapat dilihat pada tabel II. Hasil rata-rata IC50 ekstrak kulit buah manggis pada penelitian ini adalah 238.297 ppm 2 Kedua 223.758 ppm Analisis probit dilakukan untuk mengetahui konsentrasi hambatan ekstrak terhadap 50% pertumbuhan S.

Tosa.R. Nattawut. and Shimano. C. Phongpaichit S. Antimicrobial Activity of Pericarp Ekstrak of Garcinia mangostana Linn. F. and Phongpaichit.. Priya. 48: 861-5 Mahabusarakamn. 278-281 . KHM ekstrak etil asetat kulit buah manggis terhadap pertumbuhan S. P. Thailand.) mampu menghambat pertumbuhan S. International Journal of Pharma Sciences and Research.. and Jariya. Saraswathi P... P.W..5 µg/mL) 3.S. S.S. 2010.5 ppm (12. Wiriyachitra. Jainu. Antimicrobial Activities of Chemical Constituents from Garcinia mangostana Linn. Antibacterial Activity of Xanthones from Guttiferaeous Plants Againts MethicillinResistant Staphylococcus aureus.. 2002.... 1996. mutans adalah 12. diterjemahkam oleh Julius. Blackwell Synergy. Screening of Antibacterial Activity of Chemicals from Garcinia mangostana. 1983.. Kobayashi. N.. Jansakul.. Journal of Food and Toxicology.. J. Penerbit ITB. Asai. R. Cardenas... terbitan Kedua (diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang sudiro.. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan .. J. H.I.. E... Antimocrobial Activity in Cultures of Endophytic Fungi Isolated from Garcinia sp. and Jazmin.3:24-27 Phongpaichit. F. Medicinal Properties of Mangosteen (Garcinia mangostana L.C.K. J Sci Technol 5:33740 Muhlisah. Nilai IC50 ekstrak etil asetat kulit buah manggis adalah 238. mangostana L. C. M..P. 1987.. M. Binarupa Aksara... J Sci Soc Thailand 12: 239-42 Mahabusarakamn. Mohan.B. Orozco.. Mikrobiologi Dasar edisi III.KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. J Phamrm Pharmacol. M. Gopan.1(8).V. 2. Harborne.S. and Wiriyachitra.M. Vol.. S. Jakarta. 2006. 2008. Jakarta. mutans. W. R.. S. Ekstrak etil asetat kulit buah manggis (G.). Bandung Iinuma. 2010. Vatcharin. Penebar Swadaya Pedraza. R.. 1990. 1986.758 ppm DAFTAR PUSTAKA Gupte. Y.. Tanaman Obat Keluarga. Tanaka T.

.M.ac.. Quintessence Publishing C. and Suksamrarn. C. Antibacterial Activity of α-Mangostin Againts Vancomycin Resistant Enterococci (VRE) and Synergisme with Antibiotics. 48: 59-69 Tambunan. .3.M. and Kameswaran. Subramanian...M. N.itb. M. Guttiferae). S. Komutiban... H. dan Sakayaroz.Pudjarwoto. Molecular Idenfication and Diversity Endophytic Fungi from Garcinia sp.php?id=jbptitbfa-gdl-s2-1998-rismaris-111 Wahyuono. Cermin Dunia Kedokteran. Daya Antimikroba Obat Tradisional Diare terhadap Beberapa Jenis Bakteri Enteropatogen. Nur. A.G. 54: 301-305 Sundaram. M.R. 12:203-8 Sanz.id/login.G. R. Karakterisasi Senyawa Bioaktif Alpha Mangostin dari Kulit Buah Garcinia mangostana L. Majalah Farmasi Indonesia. dan Wayan.H. S. 1990.. Mangosteen Research. B. I.. dalam Newman and Korman. Inc.P.. . 1999. S. Sakagami. J.lib. 2005. Rukachaisirikulzand. Planta Med. http://fa. Telaah Kandungan Kimia dan aktivitas Antimikroba Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L. USA. Simanjuntak. Puji. 2006. N.. 2004.. N. Antibiotic/Antimikrobial use in Dental Practice. Departement of Microbiology and Departement of Chemistry Faculty of Science Songkhla University. No.. P. Cytotoxic prenylated xanthones from the young fruit of Garcinia mangostana. and Dharmaratne. Suksamrarn. no.Departemen Farmasi Ganesha Digital Library. K.A. Shankaranarayanan.. Lartpornmatulee. 1992. C.. Antimicrobial Activities of Garcinia mangostana. Chemical & Pharmaceutical Bulletin.. D. Newman.. L. Chicago. Chimnoi. A. 2005.. Rungjindamai.. Phongpaichit. O... Vol 10. Phytomedicine no. Iinuma..T. Jogjakarta .. S.. 76.. T. 1983. Gopalakrisshnan. Ratananukul.Y. Piyasena.