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Universidade de So Paulo

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos


Graduao em Engenharia de Alimentos
Departamento de Cincia Bsicas

Relatrio da Aula Prtica 01 de ZAB0361 Bioqumica Fundamental

Determinao de Protena em amostra do Leite


(Mtodo de Lowry)

Nathlia Avelar dos Reis, 8600588

Prof. Dr. Marcelo de Cerqueira Csar

Pirassununga SP
Maio/2015

Sumrio
1.

Resumo ............................................................................................................................ 3

2.

Introduo ........................................................................................................................ 3

3.

Objetivo ............................................................................................................................ 5

4.

Metodologia ..................................................................................................................... 5

5.

Resultados e discusso................................................................................................. 6

6.

Concluso ........................................................................................................................ 8

7.

Apndice .......................................................................................................................... 8

8.

Referncias Bibliogrficas ............................................................................................. 9

1. Resumo
O mtodo de Lowry tem como o propsito a determinao de protenas
totais em uma soluo contendo o reagente Folin-Ciocalteau, que sofre
reduo quando reage com protenas de uma amostra gerando um complexo
de cor azul que pode ser medido num espectrofotmetro no comprimento de
onda de 660 nm. No experimento realizado, elaborou-se uma curva padro
com albumina a 0,4 mg/mL como soluo padro, onde obteve-se um fator de
calibrao mdio para calcular a concentrao de protenas nas amostras.
Utilizou-se leite integral e o leite desnatado para a quantificao proteica. A
concentrao de protenas foi de 21,44 mg/mL e 25,58 mg/mL, no leite integral
e desnatado respectivamente.

2. Introduo

2.1

Protena
As protenas so de fundamental importncia nos processos biolgicos

atuando como enzimas, hormnios, neurotransmissores, transportadores


atravs de membranas entre outros, pois so essenciais sob todos os aspectos
da estrutura e funo celular.
As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes nas clulas e
representam cerca de 50% do seu peso seco. So encontradas em todas as
partes das clulas, pois so fundamentais na estrutura e funes celulares,
alm disso, a maior parte da informao gentica expresso pelas protenas
(LEHNINGER, 1976). As protenas so polmeros de aminocidos, os
aminocidos so compostos que apresentam, na sua molcula, um grupo
amino(-NH2) e um grupo carboxila (-COOH). Os aminocidos tem uma frmula
bsica comum, na qual os grupos amino esto ligados ao carbono , ao qual se
liga um tomo de hidrognio e um grupo varivel chamado cadeia lateral ou
grupo R (MARZZOCO, 2011).
As protenas apresentam muitas funes biolgicas diversas. Elas so
de fundamental importncia nos processos biolgicos atuando como
3

catalisadores biolgicos (enzimas), hormnios, protenas de transporte,


estrutural

contrtil,

antgenos/anticorpo,

funo

nutricional,

neurotransmissores, transportadores atravs de membranas entre outros


(LEHNINGER, 1976).

2.2

Mtodo de Lowry
O mtodo de Lowry se baseia numa mistura de molibdato, tungstato e

cido fosfrico (reagente Folin Ciocalteau) que sofre uma reduo quando
reage com protenas, na presena do catalisador Cu+2 e produz um composto
em absoro mxima de 750 nm que apresenta colorao azul. Os
aminocidos cromgenos so tirosina e triptofano. O desenvolvimento da cor
do ensaio parece ser bastante estvel at 4 horas aps a adio do reagente
de Folin-Ciocalteau.

2.3

Espectofotometria
A espectrofotometria uma tcnica analtica baseado na absoro de

luz por molculas que passam do estado fundamental para o excitado, quando
a luz absorvida por um analito, a energia radiante do feixe de luz diminui,
sendo a absorbncia de luz diretamente proporcional a concentrao das
espcies absorventes de luz na amostra (SEVERO JUNIOR, 2007).
A espectrofotometria considerada um processo analtico sensvel,
rpido, cujos resultados so precisos. Quando um feixe de luz monocromtica
atravessa uma soluo que contm uma espcie absorvente, uma parte dessa
energia radiante absorvida e ento se estabelece uma relao entre a
absorbncia ou transmitncia com a concentrao do analito (ZAIA, 1998).
A medida de absoro de luz por um espectrofotmetro utilizada para
detectar e identificar molculas e para medir suas concentraes em soluo.
A frao da luz incidente absorvida por uma soluo em um comprimento de
onda est relacionada a espessura da camada envolvida na absoro de luz

(comprimento do caminho da luz) e a concentrao da espcie que absorve a


luz(ZAIA, 1998).

2.4

Leite
O leite, independentemente da espcie considerada, um alimento

natural quase completo, do ponto de vista nutricional, por conter protenas,


lipdeos, carboidratos, sais minerais e vitaminas.
As protenas correspondem a 3 - 4 % da composio do leite de vaca.
As principais protenas do leite so casena e -lactoglobulina, que no so
encontradas em outros tecidos ou fludos biolgicos.
Segundo a Associao Brasileira da Indstria de Leite Longa Vida, o
leite integral pode conter no mnimo 3 % de gordura, alm de ser considerado
uma excelente fonte de clcio e protenas. Para o leite semidesnatado, h uma
diminuio no teor de gordura (0,6 a 2,9 % de gordura), enquanto o leite
desnatado apresenta uma diminuio ainda maior no teor de gordura em
relao ao semidesnatado: no mximo 0,5 % de gordura. Porm todos mantm
o teor de clcio e protenas do leite, apesar da diminuio de gorduras.

3. Objetivo
Determinar a concentrao proteica em amostras de leite integral e
desnatado, a partir do mtodo de Lowry.

4. Metodologia
Identificaram-se 2 micro tubos, um como leite integral e outro como leite
desnatado. Diluram-se em gua destilada na proporo de 1:20 as respectivas
amostras de leite integral e desnatado em seus micro tubos correspondentes.
De tal forma, adicionaram-se 950 L de gua destilada a 50 L dos respectivos
tipos de leite, com pipeta automtica.
Para o preparo da curva padro, nomeou-se um tubo de ensaio com
tampa de rosca como branco e adicionou-se 500 L de gua destilada.
Identificaram-se com numerao de 1 ao 5, outros 5 tubo de ensaio com tampa
5

de rosca, adicionou-se 100 L de soluo padro de Albumina(0,4 mg/mL) e


400 L de gua destilada ao primeiro; 200 L de soluo padro de
Albumina(0,4 mg/mL) e 300 L de gua destilada ao seguinte; posteriormente
300 L de soluo padro de Albumina(0,4mg/mL) e 200 L de gua destilada;
400 L de soluo padro de Albumina(0,4 mg/mL) e 100 L de gua destilada
ao tubo 4 e por fim 500 L de soluo padro de Albumina(0,4mg/mL) ao tubo
com numerao 5. Medidas adicionadas a partir da pipeta automtica.
Identificaram-se triplicatas como leite integral diludo, e pipetaram-se 50
L da soluo de leite integral diludo e 450 L de gua destilada . O mesmo foi
feito para a soluo de leite desnatado diludo.
Colocaram-se 5 mL de mistura reativa em todos os tubos de ensaio com
tampa de rosca, levaram-se cada um ao agitador para tubos e, incubaram-se
os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente

pipetaram-se 500 L do reativo de Folin, agitaram-se novamente os tubos e


incubaram-se por 30 minutos a temperatura ambiente.
Enfim, fez-se a leitura das solues de todos os tubos de ensaio das
absorbncias em espectrofotmetro a 600 nm.

5. Resultados e discusso
Os valores padres da concentrao de protenas nas solues de
Albumina e os valores de absorbncias obtidos atravs da leitura no
espectrofotmetro apresentam-se na Tabela 1.

Tabela 1: Valores padres da concentrao de protena e suas


respectivas absorbncias.
Pontos Conc.

Prot. Absorbncias

(mg/mL)
Branco 0

0,08

0,085

0,16

0,111

0,24

0,148

0,32

0,176

0,40

0,241

O Tubo Branco, aps a leitura, empregou-se para minimizao dos erros


do espectrofotmetro causados pela absoro de luz pelo vidro e pela gua
para as prximas leituras realizadas, tubo o qual continha apenas gua
destilada.
Tendo em base os valores obtidos no padro construiu-se o grfico da
curva padro (Figura 1), que possui 96,48% de segurana para que os valores
de absorbncia empregados na equao da reta forneam valores exatos de
concentrao de protenas.

Curva Padro de Preotenas Lowry


0,3
y = 0,5411x + 0,0186
R = 0,9648

Absorbncia

0,25
0,2
0,15

0,1
0,05
0
0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Protena (mg/mL)

Figura 1. Dissipao linear das concentraes de protenas

A partir da equao da reta padro (Equao 1) obtida atravs do grfico


foi possvel encontrar a concentrao de protena no leite, substituindo o x pelo
valor da leitura das absorbncias. Os valores obtidos referentes s amostras
podem ser observados na Tabela 2, (clculos vide apndice):
y = 0,5411x + 0,0186 - Equao 1

Tebela 2. Dados experimentais para cada tipo de amostra


Amostras

Amostra

gua

Mdia das

Desvio

Conc.

destilada

Absorbncias

Padro

Prot.(mg/mL)

50 L

450 L

0,1637

0,0204

21,44

Desnatado 50 L

450 L

0,2020

0,0293

25,58

de Leite
Integral

Com base nos resultados obtidos atravs do experimento, pode-se


afirmar que o leite desnatado, possui maior a concentrao de protenas.

6. Concluso
Os resultados indicam que o leite desnatado possui uma concentrao
brevemente superior de protenas quando comparado ao leite integral, o que
era esperado, j que as quantidades de protenas no leite integral e desnatado
indicadas na literatura e nos rtulos dos produtos so similares.
7. Apndice
Clculos para determinar a concentrao de protena nas amostras de leite
y = 0,5411x + 0,0186 (Equao 1)

Leite Integral: y = (0,5411*0,1637 + 0,0186)*200

y = 21,44

Leite desnatado: y = (0,5411*0,2020 + 0,0186)*200 y= 25,58

8. Referncias Bibliogrficas

JEFFERY, G. H.; BASSETT, J.; MENDHAN, J.; DENNEY, R. C. Anlise


Qumica Quantitativa Vogel. 5 ed. Editora LTC: Rio de Janeiro, 1992.
LEHNINGER, A. L. Bioqumica. Ed. 2; v. 1; Editora Edgard Blucher: So
Paulo, 1976.
MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica bsica. Ed. 3; Editora
Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2011.
SEVERO JUNIOR, J. B. et al. Interferncia do pH, concentrao de BSA e de
tampo fosfato sobre a resposta na determinao de protena total pelo mtodo
do Biureto. Exacta, So Paulo, 2007.
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais
via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes.
Qumica Nova, 1998.