You are on page 1of 142

SZENT ISTVN EGYETEM

MINTAELKSZTSI MDSZEREK KIDOLGOZSA


S REFERENCIAANYAGOK ELLLTSA
MDOSULATANALITIKAI CLOKRA

DERNOVICS MIHLY
doktori rtekezse

Kszlt a Szent Istvn Egyetem


Alkalmazott Kmia Tanszkn

Budapest, 2003

Dernovics Mihly

A doktori iskola
megnevezse:

lelmiszertudomnyi Doktori Iskola

tudomnyga:

lelmiszertudomnyok

vezetje:

Dr. Fekete Andrs


Egyetemi tanr, az MTA doktora
SZIE, Budai Campus, lelmiszertudomnyi Kar,
Fizika-Automatika Tanszk

Tmavezet:

Dr. Fodor Pter


Tanszkvezet egyetemi tanr, az MTA doktora
SZIE, Budai Campus, lelmiszertudomnyi Kar,
Alkalmazott Kmia Tanszk

A doktori iskola- s a tmavezet jvhagy alrsa:


A jellt a Szent Istvn Egyetem Doktori Szablyzatban elrt valamennyi felttelnek eleget tett,
a mhelyvita sorn elhangzott szrevteleket s javaslatokat az rtekezs tdolgozsakor
figyelembe vette, ezrt az rtekezs nyilvnos vitra bocsthat.

...........................................................
Az iskolavezet jvhagysa

...........................................................
A tmavezet jvhagysa

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

TARTALOMJEGYZK
TARTALOMJEGYZK .................................................................................................................3
RVIDTSEK ..............................................................................................................................6
1. BEVEZETS ..............................................................................................................................7
1.1. A mdosulatanalitika ltrejttnek okai s fejldse a kezdetektl napjainkig....................7
1.2. Clkitzseim........................................................................................................................9
1.3. Nevezktani s fogalmazstechnikai megjegyzsek.............................................................9
2. IRODALMI TTEKINTS .....................................................................................................11
2.1. A szeln s az arzn mdosulatanalitikai trtnelme..........................................................11
2.1.1. A szelnkutats s a mdosulatanalitika sszekapcsoldsa .......................................11
2.1.2. Kt dolog, mely elvlaszthatatlan egymstl: az arzn s a mdosulatanalitika .........17
2.2. Mintaelksztsi eljrsok: Hagyomnyos mdszerek Teljes feltrs...........................21
2.2.1. Teljes feltrs sszes szelntartalom meghatrozs cljbl .......................................22
2.2.1.1. ltalnos ismertetjegyek ......................................................................................22
2.2.1.2. A jellegzetes mintacsoportok kezelse...................................................................23
2.2.2. Teljes feltrs sszes arzntartalom meghatrozs cljbl.........................................24
2.2.2.1. ltalnos ismertetjegyek ......................................................................................24
2.2.2.2. A jellegzetes mintacsoportok kezelse...................................................................25
2.3. Mintaelksztsi eljrsok: Mdosulatanalitikai mdszerek ............................................26
2.3.1. Mdosulatanalitikai mintaelksztsi eljrsok szelnre ............................................27
2.3.1.1. ltalnos ismertetjegyek ......................................................................................27
2.3.1.2. Pufferelt s nem pufferelt (vizes) kzeggel vgzett extrakcik..........................27
2.3.1.3. Szerves oldszeres extrakci..................................................................................29
2.3.1.4. Az n. biolgiai pH-tartomnynl kisebb kmhatson vgzett extrakcik s
kezelsek .............................................................................................................................30
2.3.1.4.1. Tmny (1 mol l-1 koncentrcinl tmnyebb) oldatok felhasznlsa.......30
2.3.1.4.2. Hg (1 mol l-1 koncentrcinl hgabb) oldatok felhasznlsa .....................31
2.3.1.5. Enzimes hidrolzis fehrjebont s nem fehrjebont enzimek..........................32
2.3.1.5.1. Az enzimes mintaelkszts ltalnos jellemzi ............................................33
2.3.1.5.2. Enzimes hidrolzis fehrjebont enzimek alkalmazsa az emberi szervezet
emsztsi folyamatainak modellezsre ..........................................................................33
2.3.1.5.3. Enzimes hidrolzis fehrjebont enzimek alkalmazsa egylpses
mintaelksztsi mdszerekhez ......................................................................................35
2.3.1.5.4. Enzimes hidrolzis egyb, nem fehrjebont enzimek alkalmazsa .............38
2.3.1.6. Ktelyek az enzimes mintaelkszts kapcsn j mdszerek keresse .............40
2.3.1.7. Mintaelkszts a szeln fehrjeszint mdosulatanalitikai vizsglataihoz .....41
2.3.1.8. Zrsz a szeln mdosulatanalitikai vizsglataihoz...............................................42
2.3.2. Mdosulatanalitikai mintaelksztsi eljrsok arznre .............................................43
2.3.2.1. ltalnos ismertetjegyek ......................................................................................43
2.3.2.2. Mintaelkszts nem ignyl esetek: folykony mintk az arzn
mdosulatanalitikban.........................................................................................................44
2.3.2.3. A metanol-vz oldszer-pros s a szerves oldszerek szerepe szilrd mintk
elksztse sorn................................................................................................................45
2.3.2.4. Enzimes mdszerek felhasznlsi terlete az arzn mdosulatanalitikban..........49
2.3.2.5. Pufferelt kzegek s hg savak/lgok alkalmazsa: szekvencilis mintaelkszts
a mveletileg meghatrozott arzn mdosulatanalitikban ................................................50
2.3.2.6. Tmny savak s bzisok szerepe az arzn mdosulatanalitikai
mintaelksztsben ............................................................................................................52
2.4. Az analitikai mrsek minsgbiztostsi folyamatnak elengedhetetlen kellkeinek, a
referenciaanyagoknak bemutatsa: tpusok, ellltsi md s felhasznls.............................53
2.4.1. Trtnelmi elzmnyek ................................................................................................53
2.4.2. A referenciaanyagok fbb tpusai s ellltsuk ltalnos folyamata.........................54
3

Dernovics Mihly

2.4.3. A mdosulatanalitikai mrsek minsgbiztostsnak jellegzetessgei a rendelkezsre ll referenciaanyagok tkrben ........................................................................................ 57


3. ANYAG S MDSZER .......................................................................................................... 61
3.1. sszes As- s Se-tartalom meghatrozsa sorn alkalmazott mdszerek, vegyszerek s
berendezsek ismertetse........................................................................................................... 61
3.2. A mdosulatanalitikai mintaelksztsek sorn felhasznlt vegyszerek, standardok s
ltalnosan alkalmazott berendezsek ismertetse .................................................................... 61
3.3. Statisztikai eljrsok ........................................................................................................... 62
4. EREDMNYEK ....................................................................................................................... 63
4.1. Az enzimes mintaelkszts kritikai vizsglata az arzn mdosulatanalitika terletn.... 63
4.1.1. Arznnel dstott zldalga As-mdosulatanalitikai elksztse s vizsglata............ 64
4.1.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse .. 64
4.1.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa 64
4.1.1.3. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok
bemutatsa az eredmnyek rtkelse.............................................................................. 65
4.1.2. Referenciaanyag clzattal ksztett sima lepnyhal (Pleuronoctes platessa) Asmdosulatanalitikai elksztse az enzimes mdszerek hasznlhatsgnak tkrben ....... 67
4.1.2.1. Tapasztalati elzmnyek tengeri kagylmintkon vgzett ksrletek alapjn ....... 67
4.1.2.2. A halminta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse 68
4.1.2.3. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa 68
4.1.2.4. Az enzimes mintaelkszts fbb paramtereinek jrulkos optimlsa ............. 69
4.1.2.5. A halminta mdosulatanalitikai elemzse s a mintaelkszts optimlsa sorn
kapott eredmnyek rtkelse ............................................................................................. 70
4.1.3. A vizsglt arzntartalm mintk enzimes mintaelksztsnek kritikai vizsglata
sorn elrt j tudomnyos eredmnyek .................................................................................. 72
4.2. Szelnnel dstott lesztmintk mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa. 72
4.2.1. A Se-21 jel, szelnnel dstott leszt mdosulatanalitikai mintaelksztsnek
kidolgozsa............................................................................................................................. 73
4.2.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse .. 73
4.2.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa 74
4.2.1.3. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok
bemutatsa az eredmnyek rtkelse.............................................................................. 75
4.2.1.4. A mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse ....... 77
4.2.2. LRM cljbl ksztett Se-dstott leszt mdosulatanalitikai vizsglata ................. 79
4.2.2.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse .. 79
4.2.2.2. A felhasznlt vegyszerek s az alkalmazott mintaelkszts bemutatsa ............ 80
4.2.2.3. A kt Streptomyces griseus fehrjebont enzimkeverkkel elrt kinyersi
hatsfokok s a mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse 81
4.2.3. A szelnnel dstott lesztmintk vizsglata sorn elrt j tudomnyos eredmnyek82
4.3. Szelnnel dstott gomba mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa ............ 83
4.3.1. A szelnsval kiegsztett komposzton termesztett, Se-dstott gomba
mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa ......................................................... 84
4.3.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse .. 84
4.3.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa 85
4.3.1.3. Adalkols a mintaelkszts minsgbiztostsnak cljbl ............................ 86
4.3.1.4. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok
bemutatsa az eredmnyek rtkelse.............................................................................. 86
4.3.1.5. A mdosulatanalitikai vizsglatok s az adalkols eredmnyeinek ismertetse s
rtkelse............................................................................................................................. 87
4.3.1.6. j tudomnyos eredmnyek a szelnsval kiegsztett komposzton termesztett,
Se-dstott gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan ................................. 91
4

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.3.2. A szelnnel dstott lesztksztmnnyel kiegsztett komposzton termesztett, Sedstott gomba mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa ................................93
4.3.2.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse...93
4.3.2.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa.93
4.3.2.3. A sejtfalbontsi lps optimalizlst clul tz ksrletek rtkelse ..................96
4.3.2.4. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok
bemutatsa az eredmnyek rtkelse..............................................................................98
4.3.2.5. A mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse........99
4.3.2.6. j tudomnyos eredmnyek a Se-tartalm lesztvel kiegsztett komposzton
termesztett, Se-dstott gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan............101
4.3.3. A szelnnel dstott gombamintkkal vgzett mdosulatanalitikai vizsglatainak
lezrsa s utsz..................................................................................................................102
4.4. Az els LRM kidolgozsa a szeln mdosulatanalitika trtnetben...............................102
4.4.1. Felhasznlt anyagok s vegyszerek ............................................................................105
4.4.2. A brazil di zsrtalantsa ...........................................................................................105
4.4.3. A brazil di mdosulatanalitikai mintaelksztse sorn vgrehajtott mveletek
bemutatsa ............................................................................................................................106
4.4.4. A brazil dibl kszl, Se-mdosulatanalitikai LRM kialaktsa sorn alkalmazott
mveleti lpsek ismertetse ................................................................................................107
4.4.4.1. A referenciaanyag ellltsa a nyersanyag feldolgozstl a trolsi ksrletek
kialaktsig.......................................................................................................................107
4.4.4.2. A homogenitsvizsglat menete...........................................................................107
4.4.5. A minta zsrtalantsra irnyul ksrletek kirtkelse ...........................................108
4.4.6. A szelnmrleg alakulsa a referenciaanyag ksztse sorn .....................................109
4.4.7. A brazil di Se-mdosulatanalitikai mrseinek kirtkelse....................................110
4.4.8. A homogenitsvizsglat eredmnyeinek bemutatsa s rtkelse ............................111
4.4.9. A stabilitsvizsglat eredmnyeinek bemutatsa s rtkelse ..................................113
4.4.10. A brazil di alap, Se-mdosulatanalitikai referenciaanyag ksztse sorn elrt j
tudomnyos eredmnyek ......................................................................................................115
4.4.11. A brazil dival vgzett ksrletek lezrsa s utsz ...............................................116
5. J TUDOMNYOS EREDMNYEK ..................................................................................117
SSZEFOGLALS....................................................................................................................119
SUMMARY ................................................................................................................................120
1. MELLKLET (IRODALOMJEGYZK)...............................................................................121
2. MELLKLET (SZELNMDOSULATOK)........................................................................131
3. MELLKLET (ARZNMDOSULATOK) .........................................................................133
4. MELLKLET (SZELN-MINTAELKSZTS) ..............................................................134
5. MELLKLET (ARZN-MINTAELKSZTS)................................................................136
6. MELLKLET (RM-ELLLTS)......................................................................................138
7. MELLKLET (RSM-TBLZAT).......................................................................................139
8. MELLKLET (FOLYAMATBRA) ....................................................................................140
9. MELLKLET (HOMOGENITSVIZSGLAT)..................................................................141
KSZNETNYILVNTS.....................................................................................................142

Dernovics Mihly

RVIDTSEK
Rvidts................................. Eredeti (brit) angol sszettel ......................................................Magyar megfelel
2-D IEF.............................. 2-Dimensional Isoelectric Focusing ................. 2 dimenzis izoelektromos fkuszls
AAS .....................................Atomic Absorption Spectrometry .............................. atomabszorpcis spektrometria
AFS.................................... Atomic Fluorescence Spectrometry ........................... atomfluoreszcens spektrometria
ASE........................................Accelerated Solvent Extraction................................. gyorstott oldszeres extrakci
BCR ................................. Bureau Communautaire de Rfrence
CRM (SRM) ...................Certified (Standard) Reference Material............................................. hiteles anyagminta
CV .............................................. Coefficient of Variation ..................................................................relatv szrs
C(Z)E................................... Capillary (Zone) Electrophoresis ............................... kapillris (zna) elektroforzis
ESI ............................................... Electrospray Ionisation ..........................................elektroporlasztsos ionizci
ETV .........................................Electrothermal Vaporisation ....................................elektrotermikus elprologtats
HG ..................................................Hydride Generation...................................................................hidridfejleszts
HHPN .............................. Hydraulic High Pressure Nebulization .................... nagy hidralikus nyoms porlaszt
HPLC........................... High Performance Liquid Chromatography .....nagyhatkonysg folyadkkromatogrfia
ICP........................................... Inductively Coupled Plasma ...........................................induktv csatols plazma
INAA ............................ Instrumental Neutron Activation Analysis ................mszeres neutronaktivcis analzis
IUPAC ...................International Union of Pure and Applied Chemistry
JRC ............................................... Joint Research Centre
LA.......................................................Laser Ablation............................................................ lzeres elprologtats
LD.........................................................Lethal Dose............................................................................ hallos dzis
(L)RM...................................(Laboratory) Reference Material..........(laboratriumi) anyagminta, referenciaanyag
MAE ..................................... Microwave Assisted Extraction......................mikrohullmmal tmogatott extrakci
MALDI ....................... Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation .lzeres mtrixdeszorpcin alapul ionizci
MS .................................................. Mass Spectrometry ........................................................... tmegspektrometria
NMR ....................................... Nuclear Magnetic Resonance .......................................... mgneses magrezonancia
OES........................................Optical Emission Spectrometry............................... optikai emisszis spektrometria
PAGE.................................Polyacrylamide Gel Electrophoresis.............................poliakrilamid glelektroforzis
PLE .........................................Pressurised Liquid Extraction .............................. nagynyoms folyadk extrakci
PMSF.................................. Phenylmethanesulphonyl Fluoride ................................... fenil-metil-szulfonil fluorid
PTFE............................................Polytetrafluoroethylene.........................................................politetrafluor-etiln
RP ......................................................Reversed Phase ...................................................................... fordtott fzis
RSD ......................................... Relative Standard Deviation ...............................................................relatv szrs
RSM...........................................Response Surface Method................................................. Fellet-vlasz mdszer
SEC.......................................Size Exclusion Chromatography................................. mretkizrsos kromatogrfia
SEP(T) ....................... Sequential Extraction Procedure (Technique) ...szekvencilis extrakcis eljrs (mdszer)
SDS............................................Sodium Dodecyl Sulphate........................................................ Na-dodecil-szulft
TCA ............................................... Trichloroacetic acid.................................................................... triklr-ecetsav
TFA.................................................Trifluoroacetic acid...................................................................trifluor-ecetsav
TMAH .................................Tetramethylammoniumhydroxide...............................tetrametil-ammnium hidroxid
TOF.....................................................Time of Flight ............................................................................ replsi id
TRIS-HCl ...................... Tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl ..................Tris(hidroximetil)aminometn-HCl
UV ........................................................ Ultra-violet ..............................................................ultraviola (tartomny)

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

1. BEVEZETS
1.1. A MDOSULATANALITIKA LTREJTTNEK OKAI S FEJLDSE A KEZDETEKTL NAPJAINKIG
Minamata-bl, 1956 mjusa. Ngy gyri munks agykrosodsbl fakad panaszokkal
krte felvtelt a helyi Kunamoto Egyetemi Krhzba, ahol az orvosok tancstalanul lltak a
tnetek eltt. Mivel a helyi lakosok egyre nvekv szmban jelentkeztek hasonl krkppel,
eleinte fertz betegsgre gyanakodtak, melynek a Minamata-betegsg megnevezst adtk.
Hrom s fl vnek kellett eltelnie, mire a valdi ok felsznre kerlt: egy kzeli, acetaldehidet s
vinil-kloridot gyrt cg metil-higanyt is tartalmaz szennyvizt tisztts nlkl engedte az
blbe tbb mint 40 ven keresztl. A sekly tengervzbe kerlt, kzel 150 tonna metil-higany
feldsult a tpllklncban, s mivel az annak vgn ll, a helyiek f tpllkt ad halak
krosodsa nem volt szrevehet, a halszatbl szrmaz lelmiszerek sem keltettek gyant az
emberekben. A metil-higany a szervetlen higannyal ellenttben sokkal nehezebben rl ki az
emberi szervezetbl, gy az utbbihoz kpest jval kisebb mennyisgben is vgzetesnek
bizonyult: a vr-agy gton (s a mhlepnyen) tlpve a felnttekben agykrosodst, a
magzatokban, a csecsemkben s a gyermekekben fejldsi rendellenessgeket s agyvrzst
vltott ki sok szz ember hallt okozva. A halszatot csak 1965-ben lltottk le; s br az
zemnek megtiltottk, hogy a metil-higany tartalm szennyvizt az blbe engedje, szervetlen
higannyal tovbbra is szennyezte a trsget arra ugyanis a tilts nem vonatkozott, egszen
1968-ig. Akkor ugyanis mg nem tudtk, hogy a biometilcis (=biolgiai szervezetek ltal
vgrehajtott metilezsi) folyamatok rvn a szervetlen higany jelents rszbl is metil-higany
kpzdtt [GRAEME 1998].
A higany esetben mutatkozott meg elszr, hogy ugyanazon elem eltr oxidcis llapot
vagy eltr ligandummal rendelkez formi akr vgletekig klnbz mdon viselkednek az
l szervezetben. Egyidben a higannyal, a krm lettani kutatsainak eredmnyei taln mg
nagyobb szenzcit keltettek a tudomnyos berkekben, hiszen a 6 vegyrtk formjnak
kiemelkeden rkkelt jellege miatt toxikusnak tartott elem 3 vegyrtk llapotrl 1959-ben
dertettk ki, hogy fontos szerepet jtszhat a glkzanyagcsere szablyozsban [SCHWARZ
1959]. A sort az arzn folytatta: 1977-ben EDMONDS s FRANCESCONI kutatprosnak
sikerlt egy rkflbl izollni az arzeno-betaint, az els olyan szerves arznvegyletet, melynek
bizonytottan nincs toxikus hatsa, s amely feloldotta a tengeri eredet lelmiszerek
arzntartalma s ennek ellenre veszlytelen fogyasztsuk kztt feszl ellentmondst. Csupn
6 vet kellett vrni az jabb ez esetben negatv pldra: az elemi llapotban s szervetlen
siban veszlytelennek szmt n hajfestkhez kevert tributil-szrmazka a clszervezetek
kz nem tartoz llnyeknl (pl. osztriga) genotoxikusnak bizonyult [WALDOCK 1983].
Vgl, de nem utolssorban a szelnt s a vasat kell megemltennk, amelyek az eddig
ismertetett, koncentrcitl rszben fggetlen, toxikus-ltfontossg /krm(VI) vs. krm(III)/,
toxikus-valsznleg nem toxikus /ltalban az arzn vs. arzeno-betain; szerves n-szrmazk
vs. szervetlen n/ ill. kiemelten toxikus-kevsb toxikus /metil-higany vs. szervetlen higany/
minsgi megkzeltseket j elemmel tvztk: a koncentrcitl kiemeltebben fgg,
7

Dernovics Mihly

biolgiailag jobban elrhet s/vagy biolgiailag jobban hasznosul s/vagy jrulkosan


j/rossz hatst mutat/nem mutat tulajdonsgok megllaptsval.
Az elz pldk egyrtelmen jeleztk, hogy egy adott elem sszes koncentrcijnak
megismerse mr nem nyjt elegend informcit a vizsglt mintrl, lett lgyen sz akr
lelmiszerrl, talajmintrl vagy ntzvzrl brmirl, amelyben a krdses elemnek egy
vagy tbb, valamilyen szempontbl kritikus kmiai-fizikai-lettani jellemzvel rendelkez
formja fordulhat el. Kialakult egy j, tbb tudomnygat rint szakterlet, mely az analitikaikrnyezeti-lelmiszer-klinikai kmia, a biokmia s az lettan hatrmezsgyjn helyezkedik el: a
mdosulatanalitika (speciation analysis). A sok kzs terlet s a rszbeni tfedsek miatt egy
ideig ugyanakkor nem volt egszen vilgos az j, kln tudomnyg ltnek jogosultsga, s
helyzetnek tisztzshoz szksges nevezktani defincik is hinyoztak mg. Vgl a IUPAC
2000-ben vgre kzztette a pontos megnevezseket, amelyeket konkrt pldkkal ltott el a
lehet legpontosabb rtelmezs vgett [TEMPLETON 2000]. A defincik szerint egy elem
kmiai mdosulata (chemical species) az elem egy adott formja, amelyet izotpsszettele,
vagy elektron- / oxidcis llapota, s/vagy komplex vagy molekulris szerkezete hatroz meg;
a mdosulatanalitika pedig azon analitikai tevkenysgek sszessge, melyek egy adott
mintban lv, egy vagy tbb egyedi kmiai mdosulat minsgi s/vagy mennyisgi
meghatrozsra irnyulnak. Meghatrozsra kerlt a korbban kellen meg nem klnbztetett
mveleti mdosulatanalitika is, melyet a frakcionls kifejezssel lttak el vglegesen: a
frakcionls az a mvelet, melynek sorn egy adott mintban lv, meghatrozand komponenst
vagy komponensek csoportjt fizikai (pl. mret, oldhatsg) vagy kmiai (pl. ktsek,
reakcikpessg) jellemzk alapjn osztlyokba sorolunk. A kt szakterlet gy egyrtelmen
sztvlt, br mint pldul az arzn mdosulatanalitikai ismertetsnl ltni fogjuk gyakorlati
okokbl nhol egytt alkalmazzuk ket.
A kezdetben egymstl elszigetelten fejld, elemenknt trgyalt mdosulatanalitika mra
egysges egssz vlt s fontossgt mi sem igazolja jobban annl a tnynl, hogy az Eurpai
Kzssg 1998-ban kln tematikus hlzatot hozott ltre Speciation 21 nvvel a legkivlbb
21 nyugat-eurpai labor rszvtelvel [CORNELIS 2000]. A hlzat abbl a clbl jtt ltre,
hogy szakmai tancsokkal segtse az lelmiszer-tudomnyi, krnyezetvdelmi s
(munka)egszsggyi terleten mkd, dntshoz szerveket a legjabb ismereteknek
megfelel szablyozsok s hatrrtkek megllaptsnl. A korbban emltett, Hg-Cr-As-SnSe-Fe elemek mell idkzben felzrkztak a platinafmek (Pd, Pt), a nikkel s az lom is,
tovbb bvtve a mdosulatanalitika clterlett.
A mdosulatanalitika felbecslhetetlen rtk j ismeretanyaggal jrult hozz ahhoz, hogy
munkakrlmnyeink, lelmiszereink, gygyszereink biztonsgosabbak legyenek, hogy
krnyezetnk vdelmt korszerbb tudomnyos httrrel biztosthassuk s megrthessnk
szmos olyan biokmiai folyamatot, melyek szervezetnk mkdsben kros vagy pp
ellenkezleg, hasznos lettani hatst vlthatnak ki. A kvetkezkben ezen kutatsok kt
jellegzetes szerepljnek, a szelnnek s az arznnek mdosulatanalitikai mintaelksztsi
eljrsainak ismertetsre kerl sor, valdi mintk elemzsnek tkrben kztk egy olyan
8

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

mintnl is, amely remlhetleg az els, termszetes eredet Se-mdosulatanalitikai


referenciaanyagknt fog elterjedni.
1.2. CLKITZSEIM
A Se- s As-mdosulatanalitika olyannyira fiatal tudomnygnak szmt, hogy egyszerre
tbb, kiforratlansgbl ered Achilles-sarokkal jellemezhet; doktorandusztrsaimmal egytt
mindhrmunknak jutott egy-egy: IPOLYI [2003] (mdosulatanalitikai minsgbiztosts) s
STEFNKA [2003a] (mdosulatanalitikai mintabeviteli technikk) mellett n a szinte minden
mrsi folyamatot megelz mintaelkszts terletn kutatva vittem vgbe a PhD munkmhoz
illeszked vizsglataimat.
1999-ben, doktoranduszi tevkenysgem kezdetn mr a mdosulatanalitikai
mintaelkszts berkein bell vilgoss vlt, hogy mely alfejezetekben lesz rdemes
elmerlni, s a kezdeti kutatsok az idkzben csatlakoz mdosulatanalitikai feladatokkal
egytt csiszoldtak ssze a kvetkez hrom krdskrbe, melyek tszttk ngy ves
munkmat, s ebben az rtekezsben teljesedtek ki:
milyen mdon lehet fejleszteni a Se- s As-mdosulatanalitikai mintaelksztst az
enzimes mdszerek kiterjesztsvel, ill. br-e ltalnos ltjogosultsggal az enzimek
hasznlata ezen a terleten?
lehet-e ltalnos, knnyen kvethet s viszonylag egyszer receptet nyjtani a
szerves eredet, Se- s As-tartalm mintk mdosulatanalitikai mintaelksztshez?
el lehet-e lltani termszetes vagy mestersges eredet mdosulatanalitikai
referenciaanyagot a rendelkezsre ll felszereltsggel?
1.3. NEVEZKTANI S FOGALMAZSTECHNIKAI MEGJEGYZSEK
Mieltt sor kerlne az rtekezs rdemi rszre, clszer kitrni a nevezktan krdsre. A
fejld tudomnyterletek ltalnos problmja, hogy a szaknyelv csak lassan tud tszrdni a
nemzeti szakmai szkincsbe, s meglehetsen hossz tmeneti idszak szksges a fogalmak
letisztzdshoz. Nincs ez mskpp a mdosulatanalitika esetben sem. Mr maga a
mdosulat sz is sokszor kpezi vita trgyt, mivel az eredeti angol kifejezsbl szrmaz
speciesz is meglehetsen elterjedtnek szmt. A nevezktani feladatok megoldsval
foglalkoz bizottsgok hivatalos llspontjnak hinyban egyni dntsek szolglnak alapul
ahhoz, hogy ki, melyik kifejezscsaldot rszesti elnyben. Szemly szerint, ebben a konkrt
pldban a mdosulat-csald mellett trtem lndzst, szmos okbl kifolylag: egyrszt a
speciesz sz mr korbban elfoglalta helyt a termszettudomnyok rendszertani szegmensben,
a klnbz llnyek s vrusok azonostsnl, msrszt a mdosulat sz magyar kifejezsnek
szmt, honostsi erszak nlkl.
Azonban nem minden esetben nylik erre md. Az angol spiking s a to spike sg mg
nem rendelkezik magyar megfelelvel. Ebbl kifolylag elszr clszer megmagyarzni ket:
1. spiking: az a tevkenysg, amely sorn a vizsgland minta ismert mennyisghez,
mg a mintaelkszts eltt, a mennyisgi s/vagy minsgi elemzs trgyt kpez
9

Dernovics Mihly

mdosulatokat standard vegyletek formjban, ismert mennyisgben hozzadjuk.


Amennyiben az adott mdosulatbl standard vegylet nem ll rendelkezsre, akkor a
spiking sorn a mdosulat brmely ms, a mrrendszer kalibrlsra hasznlt
formjt kell hasznlni. A spiking sorn adagolt mdosulatok nem felttlenl
fordulnak el eredetileg is a mintban. A mvelet sorn trekedni kell arra, hogy a
hozzadott mdosulatok lehetleg azonos eloszlssal, azonos ktsi viszonyok kz
kerljenek a mintban eredetileg is elfordul mdosulatokkal. A hozzads sorn
biztostani kell az adagolt mdosulat(ok) (a) homogn eloszlst a mintn bell, gy a
mvelet tbbnyire a minta s a standard vegyletek feloldsval, az egyenslyi llapot
elrsig keverssel/rzssal trtn homogenizlsval, majd az alkalmazott oldszer
eltvoltsval jr egytt; (b) talakuls nlkli kezelst, teht pl. az oxidci
elkerlst; gy a folyamatot clszer inert gzok (Ar, N2) jelenltben vgezni. A
spiking nem felttlenl biztostja olykor egybknt lehetetlen is lenne az eredeti s
a hozzadagolt mdosulatok mintaelkszts / mrs sorn tanstand azonos
viselkedst; szerepe gyakran arra korltozdik, hogy megfigyelhetv /
tanulmnyozhatv tegye a mintaelksztsi mdszerek mdosulatokra gyakorolt
hatst a mintamtrixban. Mintaelksztst nem ignyl, folykony vagy lgnem
halmazllapot mintk esetn a spiking megegyezik a standard addcival.
2. to spike sg: a spiking mvelete sorn a minthoz adagolni a kivlasztott, elemzend
mdosulat(ok) standard vegyleteit.
Szmos kifejezshonostsi ksrlet is lezajlott az utbbi idben, amelyek pl. a szilrd
mints addci hasznlatt rszestettk elnyben. Ez utbbi azonban eredenden tves, mivel a
spiking nem felttlenl jelenti szilrd minta megltt. A msik, tanszknk ltal javasolt sz az
adalkols; ezzel a formval elkerlhetv vlik a (standard) addcival trtn, akr vtlen
sszekevers, s maga a sz is valdi magyar kifejezs. Br nem tkletes, hiszen az adalk
tbbnyire olyan vegyletet / anyagot jelent, amely nem fordul el abban a dologban, amelyhez
keverjk, mg a spiking sorn ltalban a mintban is megtallhat mdosulatokat adagolunk;
mindenesetre a dlt betvel szedett szavak tfedse elegend teret nyjt ahhoz, hogy a szt ne
vessk el. rtekezsemben doktorandusztrsaimhoz hasonlan az adalkols kifejezst
fogom hasznlni.
Vgl az igk egyes s tbbes szmrl kell beszlnem. A mintaelkszts jellegzetesen
olyan tevkenysg, amely nmagban nem ltezhet: mg pl. az elvlasztstechnikai fejlesztseket
akr valdi minta nlkl, csupn standard vegyletekkel is el lehet vgezni, addig a
mintaelksztst mindig valamilyen mdosulatanalitikai vagy n. hagyomnyos (lsd ksbb)
mrs kveti. Doktoranduszi munkm sorn a mrseket szinte minden esetben msok
vgeztk, gy az egyes szm els szemly folytonos alkalmazsa tisztessgtelen eljrs lenne.
Ebbl kifolylag az egyes szm els szemly, a szenved szerkezet, az ltalnos alany s a
tbbes szm els szemly felvltva, de kvetkezetesen fordul el rtekezsemben remlem
olyan mdon, hogy kell mrtkben rezhetv tegyem a legutbbi mgtt rejtz konzulensem,
doktorandusztrsaim, kollgim, dikjaim s segtim ptolhatatlan munkjt.
10

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2. IRODALMI TTEKINTS
2.1. A SZELN S AZ ARZN MDOSULATANALITIKAI TRTNELME
2.1.1. A szelnkutats s a mdosulatanalitika sszekapcsoldsa
Csupn a tudsokat oly gyakran segt szerencss vletlennek ksznhet, hogy a 70-es
vek vgn ugyan mr ltfontossgnak tartott, de a f kutatsi irnyvonalaktl tvol es,
lettani s analitikai szelnvizsglatok jra lendletet vehessenek s a mai napig az len
maradjanak. Kna Keshan nev tartomnyban felttte a fejt egy furcsa betegsg, mely
szvizomgyenglshez s hallhoz vezetett a tartomny lakosai kztt. A helysznre rkez
tudsok sok egyb vizsglat elvgzse mellett a helyiek tpllkt is elemzs al vettk, s gy
talltk, hogy a betegsg ltal sjtott terleten lk tpllka az tlagosnl jval kevesebb szelnt
tartalmaz. A ltez legegyszerbb s legolcsbb szelnvegylettel, ntrium-szelenittel
egsztettk ki a lakosok trendjt, s a rejtlyes betegsg visszavonult [CHEN 1980]. Csak
vtizedekkel ksbb derlt ki, hogy a lakosok panaszait nem kzvetlenl a szelnhiny vltotta
ki, hanem egy klnleges krokoz, a Coxsackie-vrus fertzse; ez a vrustrzs azok kz
tartozik, melyek sejten belli reprodukcijt a szeln szelektven gtolja [LEVANDER 1997]. A
vrus megjelense s Keshan tartomny szelnben szegny termfldjei egyttesen jrultak
hozz ahhoz, hogy az eset fordulpontot jelenthessen a tudomnytrtnet s a szelnkutats
szmra.
Mra a szeln egyike lett a leginkbb tanulmnyozott mikroelemeknek. 1957-ben
SCHWARZ s FOLTZ kzlemnye volt az els, mely a mjmkds terletn ltfontossgnak
kiltotta ki ezt az elemet, azta pedig szmos lettani folyamatban bizonytottk szerept.
Alkotja a 21. aminosavnak, a szelenociszteinnek (SeCys), mely valban nem valamely meglv
aminosav utlagos mdostsval jn ltre, hanem rszben sajt kdonnal s tRNS-sel is br
[STADTMAN 1996]. A SeCys szablyozottan pl be egy sor enzimbe, amelyek katalitikus
folyamataihoz ez az aminosav elengedhetetlen: cserje pl. a kntartalm ciszteinnel tbb
nagysgrendnyi aktivitscskkenshez vezet. Az emberi jodotironin-dejodinz a jd
anyagcserjben, a glutation-peroxidzok egsz csaldja s a tioredoxin-reduktz a sejtek
oxidatv stressz elleni vdelmben rendelkezik rkellenes hatssal [SCHRAUZER 2000]. Ezeken
kvl sikerlt kimutatni SeCys-t tartalmaz, teht vlheten funkcionlis, de mg nem tisztzott
feladattal rendelkez szelntartalm fehrjket (az eddigiekben bemutatottakkal egytt sszesen
tbb mint 30 flt) pl. a mitokondriumokban, a prosztatban s a herkben is [BEHNE 1998]; ez
utbbi kt elfordulsi hely sszecseng azon megfigyelssel, miszerint a nem kielgt
szelnbevitel ronthatja a frfiak nemzkpessgt [REILLY 1998]. Kzvetlen vagy kzvetett
mdon, de a szelnhiny tbbtucatnyi betegsg kialakulsban vagy krkpnek
slyosbodsban jtszhat szerepet, mint pldul a felnttkori cukorbetegsg, szrkehlyog,
ciszts fibrzis, agyrkatasztrfa vagy vastagbl-feklyeseds [NAVARRO-ALARCN 2000].
Azonban tveds lenne azt vlni, hogy a korbbi, a szelnt toxikus tulajdonsggal felruhz
ksrletek tvedsen alapultak volna. A szeln a legszkebb toleranciatartomnnyal jellemezhet
mikroelem: az ajnlott napi bevitel (kb. 70-100 mg f-1 nap-1) 3-4-szerest meghalad fogyaszts
11

Dernovics Mihly

esetn elszr gyengbb, majd ksbb rendkvl erteljes mrgezsi tnetek jelennek meg.
Krnikus mrgezsi jegyek kzt a br-, szaruhrtya- s krmelvltozs, hajhulls, gyomor- s
blmkds zavara, fogazat romlsa, fradtsg s szdls emlthet meg; akut mrgezs esetn
a szervezetbe kerlt szeln mennyisgtl fggen, 5-10 mg testslykg-1-tl kezdden nhny
rn bell bell a hall [OLSON 1986].
A szeln a kvetkez alapvet kmiai tulajdonsgokkal rendelkezik: rendszma 34, relatv
atomtmege 78,96 g. Hat stabilis izotpja ismert, a leggyakoribb a 80Se-izotp. Tbbfle
oxidcis szmmal fordul el, melyek rendre: -II, 0, +IV s +VI, de vegyletei a +IV-es
oxidcis llapotban a legstabilabbak. A szeln megtallhat a talajban, a vizekben s a
levegben is; talajokban 0,1-0,2 g g-1 szelnkoncentrci a gyakori, mg a levegben, vrosi
krnyezetben 0,1-10 ng m-3 tallhat ltalban. A felszni vizekben 0,06-400 g l-1
mennyisgben mutattk ki, br olddsnak mrtkt a vz pH-ja nagyban befolysolja: kisebb
pH esetn a Se koncentrcija megn. A szelnterhels forrsai kztt emlthet a vulkni
tevkenysg, valamint az ipar, kzlekeds, tzels s a mezgazdasg.
A szeln lettani tulajdonsgait nem lehet anlkl bemutatni, hogy ne emelnnk ki: a 6.
fcsoport tagjaknt a knnel analg mdon viselkedik s gyakorlatilag minden kntartalm
molekulnak ltezik szelnt hordoz, analg vegylete. A tmeghats alapjn a kn s a szeln
egymssal versengve szerepelhet szmos biokmiai reakciban, a szulft helybe szelent lphet
s fordtva. gy nem meglep, hogy a 2. Mellklet tblzata ltal bemutatott
szelnmdosulatokban szinte a teljes knanyagcsere analg molekulris eszkztrt
felfedezhetjk, a szervetlen szelenttl kezdve a szelenocisztationinig. Az emlsk szervezete
kt folyamat esetn rendelkezik szelnre specifikus, szablyozott anyagcserettal: egyrszt a
SeCys s az intermedier szerepet jtsz szelenofoszft szintzisnl, msrszt a szeln
kivlasztsnl, amely finoman hangolt egyenslyi folyamatokkal jellemezhet [KOBAYASHI
2002]. Ez utbbi valsznleg egyenes gi kvetkezmnye a szervezet rendkvl kis
szelnraktroz kpessgnek, mivel a szelenoprotein P nev, 10 SeCys-t hordoz fehrje az
egyetlen, amely ha kis mrtkben is, de szelnt szlltani s trolni kpes [SUZUKI 1999].
Mihelyst a bejut szeln mennyisge meghaladja a maximlisan szksges
(100-200 mg f-1 nap-1) rtket, a tlzott bevitel mrtknek fggvnyben ms s ms tpus,
ms s ms szablyozs rvn kialaktott szelntartalm molekula segt kirteni a felesleget
(1. s 2. bra), elszr a vizelet, majd prologtats/verejtkezs rvn.
A 2. brval kapcsolatban rdemes nhny dolgot kiemelni. Egyrszt vilgosan tetten rhet
a szeln felhasznlsnak/beplsnek szablyozsi mdja: mg az egyrtelmen funkcionlis
molekulk kztt is fennll egy fontossgi sorrend, mely nmelyikket gy a reprodukcihoz
szksges, mg pontosan nem ismert szelenoproteineket is elnyben rszesti a csupn
ltalnosan ltfontossg Se-enzimekhez kpest. Msrszt ezen vegyletek feltltse utn
meglehetsen szk tartomnyra korltozdik a mg egszsgesnek tekinthet szelnbevitel, s
mr azon bell is funkci nlkli SeMet bepls zajlik le. Ez utbbi megtlse nem
egyrtelm: a SeMet-t tartalmaz fehrjk trszerkezete kiss eltr a genetikailag kdoltan
metionint hordoz tpusoktl, teht elvileg az eredeti fehrjefunkci nem felttlenl j irnyba
12

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

trtn vltozsa kvetkezhet be. Ugyanakkor jelents szelntrol-kapacits hjn a szervezet


ebben a formban, kzvetett mdon, a fehrjk krforgsi folyamatain keresztl kpess vlhat
kis mennyisg, szelenoprotein P-tl fggetlen szeln raktrozsra (1. s 2. bra).
SeMet

Met pool

Nem funkcionlis
Se-fehrjk

Se-homocisztein

Se-cisztationin
SZABLYOZOTT
ANYAGCSERE
SeO42-

SeCys

SeO32-

H2Se

vizelet

MSeAcG

Funkcionlis Se-fehrjk

Se-foszft
SerSeCystRNS

lehelet

(CH3)2Se

vizelet

(CH3)3Se+

SeCysSeCystRNS

1. bra. Az emberi szervezet Se-anyagcsere folyamatai [OBISKI 2000 s KOBAYASHI 2002 alapjn].

Bepl/
kivlasztd
fbb szelnmdosulat

Jellemz
anyagcserefolyamatok

Anyagcsere
jellege
Szelnbevitel,
g nap-1 f-1

SeCys
Ltfontossg
Se-fehrjk szintzise
(jodotironindejodinz,
mitokondrilis s
reprodukcis
szervek-szvetek Sefehrji,
szelenoprotein-P)

SeMet

Egyb
funkcionlis
Se-fehrjk
szintzise
(glutationperoxidz
csald)

Nem
funkcionlis Sefehrjk
szintzise

MSeAcG

Szelntartalm
molekulk szintzise s
rtse
a vizeleten keresztl

BEPLS/ FELHALMOZS

0-70

TMSe+

70-450
optimum: 100-200 kztt

DMSe

Szelntartalm molekula
szintzise s
rtse a
verejtken s
lgzsen
keresztl

KIRTS
>450

2. bra. Az emberi szervezet ltal szintetizlt fbb szelnmdosulatok s szerepk a Se-anyagcserben


[STADTMAN 1996, REILLY 1998, BEHNE 1998 s KOBAYASHI 2002 alapjn].
13

Dernovics Mihly

les hatrvonalakrl, rgztett beviteli mennyisgekrl a klnbz szelnanyagcsereszakaszok esetben nem lehet beszlni: az optimlis tartomny fels rgijban mr megindul a
szeln kivlasztsa a vizeleten keresztl, elszr a szervezetet legkevsb terhel szelenocukrok,
majd a kiss mrgezbb, de knnyebben szintetizlhat TMSe+ formjban. A fokhagymaszag
DMSe lehelettel s verejtkkel trtn eltvoltsa mr slyos, akut mrgezsre utal.
Lassan elrkeznk ahhoz a ponthoz, ahol rthetv s indokoltt vlik a szeln
mdosulatanalitika ltjogosultsga. Itt sz sincs az arzn esetn ksbb bemutatsra kerl,
rendkvli mdon klnbz LD50 rtkkel jellemzett mdosulatok ltal elidzett
bizonytalansgrl, miszerint egy adott (sszes) As-tartalm minta mdosulateloszlsa toxikus
vagy egyltaln nem mrgez mdosulatokat takar-e. Az l szervezetekben kimutatott, nem
illkony szelnmdosulatok egybknt nagyon kicsi, 3-4 mg krli LD50 rtkei kztti
eltrs kisebb kt nagysgrendnl, s a leggyakrabban vizsglt Se(IV), Se(VI), SeMet s SeCys
esetn az tlagos eltrs mrtke kisebb 20%-nl [OLSON 1986]. A valdi klnbsg a
mdosulatok biolgiai hozzfrhetsgben, hasznosulsban, felhalmozdsban, s a
szervezetben kivltott esetleges oxidatv terhelsben lt testet. Ha a tulajdonsgok ezen krt a
mr ismertetett, meglehetsen szk Se-tolerancia (s egyben a szksges szelnbeviteli
mennyisg) tkrben tekintjk, egyrtelmen krvonalazdni ltszanak azok az alkalmazsi
terletek, melyeken a szeln mdosulatanalitika teret nyert ill. amelyekre kiterjesztse vrhat:
(a) A szeln szelnhinyos tpllkozs esetn minden mdosulata hasznos s adott
esetben letment, mivel ltfontossg enzimek alkotrsze. Az ppen kielgt szintet elr
elltottsgtl kezdve azonban jelents klnbsg bontakozik ki az egyes mdosulatok kztt,
melyek a szeln jrulkos jtkony hatsait cskkenthetik ill. teljesen meg is szntethetik. A
legfbb eltrst a szeln rkellenes hatsval kapcsolatban mutattk ki a kutatsok. Jelenlegi
ismereteink alapjn gy tnik, hogy a Se-metilszelenocisztein s a g-glutamil-Semetilszelenocisztein szignifiknsan hatkonyabb rkellenes vegyletnek bizonyultak brmely
ms szelnmdosulathoz kpest, in vivo vizsglatok esetben is [WHANGER 2000, BLOCK
2001]. Az egyik leggyakrabban vizsglt szelnmdosulat, a SeMet szelnptlsra alkalmas
ugyan, de ez az aminosav a metionin tjt analg kvetve elszr az aminosavpoolba, majd ezen
keresztl a fehrjk krforgsi folyamataiba jut; egyrszt teht szveti szelndsuls jhet ltre,
melynek megtlse mai ismereteink alapjn a nemkvnatos kategriba tartozik, msrszt
jrulkos rkellenes hats nem rvnyesl [BESSER 1993, KOTREBAI 1999a]. Szervetlen
Se(IV) st tartalmaz ksztmnyek esetn szveti felhalmozds nem alakul ki, azonban ennek
a szelnmdosulatnak a felvtelnl reaktv oxigngykt tartalmaz molekulk keletkezhetnek,
amely a szelenitet a tbbi mdosulathoz kpest toxikusabb teszi [KOBAYASHI 2001]. A
szelent bevitele nem vlt ki a msik szervetlen mdosulathoz hasonl negatv hatsokat,
azonban biolgiai felvehetsge csupn 25%-os a Se(IV)-hez kpest, s egy rsze vltozatlan
formban azonnal kirl a vizeleten keresztl [GMEZ 1998, KOBAYASHI 2001]. Mindezek
utn vilgoss vlhat, hogy ismereteink alapjn kpesek vagyunk tllpni a korbban
kielgtnek vlt, a tpllk sszes szelntartalom-meghatrozsn valamint a csupn vlt vagy
valdi hatrrtkeken alapul gondolkodsmdunkon s minsgi ugrst hajthatunk vgre a
14

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

valban optimlis szelnbeviteli elvek kialaktsa fel. Termszetesen mindehhez


elengedhetetlen a gyakran fogyasztott, jelents szelntartalm lelmiszereinkben tallhat
szelnmdosulatok azonostsa s az lettani kutatsok tovbbi bvtse, mdosulatanalitikai
ismereteink felhasznlsval.
(b) A standard szelnvegyletekkel vgzett ksrleteknek ksznheten tbb-kevsb
tisztban vagyunk azzal, hogy a klnbz mdosulatok felszvdsuk utn milyen szerepet
tltenek be a szervezet szelnhztartsban s egyb folyamataiban. Ha azonban az adott
szelnmdosulat nem magban, hanem valdi lelmiszer/tpllkkiegszt mtrixban jut be a
szervezetbe, az emberi emszts gyakorlatilag fekete dobozknt takarja el ellnk, mi is zajlik le
az sszessgben tbb mint szz klnbz, emsztsben szerepet jtsz enzim s egyb
segdvegylet (epesavak, ssav, stb.) kzremkdsvel, az emsztrendszer egymst kvet,
trben s idben elvlasztott szakaszaiban. Meghatrozhatjuk s megismerhetjk a bemeneti
paramtereket, teht az elfogyasztand lelmiszer mdosulatanalitikai sszetevit feltve,
hogy sikerl nagy kinyersi s azonostsi hatsfok mintaelksztsi mdszert fejlesztennk;
vizsglhatjuk a kimeneti paramtereket a fleg vizelettel eltvoz szeln mennyisgt s
mdosulatait, a vrszrum, a vrsvrsejtek szelntartalmnak vltozst s megmrhetjk a
legfbb, szelnhasznosuls mennyisgi meghatrozsra szolgl rtket, a glutation-peroxidz
aktivitst. A teljes kp azonban annyira sszetett, hogy a mai napig nem tudjuk megmagyarzni
a mrsi eredmnyek ltal szolgltatott valsznleg csak ltszlagos ellentmondsokat.
Minden bizonnyal a vizsglatban rszt vev ksrleti alanyok szervezetnek egyedi
tulajdonsgai, a teljes mrtkben sosem azonos ksrleti krlmnyek s az ppen
tanulmnyozott vagy egyttesen fogyasztott lelmiszerek egyb komponensei (pl. aszkorbinsav,
mint a szervetlen szelnmdosulatokat elemi teht nem felszvd formv redukl
vegylet) llnak az eltrsek htterben [FAIRWEATHER-TAIT 1999]. tlagosnl nagyobb
szelntartalmuknak ksznheten a tengeri halakat pldul idelis szelnptl lelmiszernek
vlnnk, s erre utal HAGMAR et al. [1998] lettorszgi tpllkozs-lettani vizsglata ha nem
igazoln ennek pontosan az ellenkezjt is ksrletek egsz sora [THORNGREN 1987,
MELTZER 1993, HUANG 1995]. Szelnnel dstott csiperkegomba in vivo patknyksrletben
nagyobb rkellenes hatst biztostott a szelnt nem tartalmaz gomba fogyasztshoz kpest
[SPOLAR 1999], ugyanakkor a gombk szelntartalmnak biolgiai hozzfrhetsge nagyon
kicsinek addott CHANSLER et al. [1986] vizsglatai alapjn. A felsorolt ksrletek sorn nem,
vagy csak korltozott mrtkben vgeztk el az elzetes mdosulatanalitikai elemzseket,
rvilgtva arra a hinyra, amely a valdi, htkznapi lelmiszerek mdosulatanalitikai
elemzsnl tapasztalhat. Napjaink egyik legfbb szeln mdosulatanalitikai kihvsa ezeknek
a komplex mtrixszal jellemezhet mintknak a mintaelksztse s mrse.
(c) A szeln ltfontossg mikroelem volta csak az 1970-es vek vgre szrdtt le az tlag
fogyaszt szintjre, amikor szmos orszg kztk az Egyeslt Kirlysg, j-Zland s
Finnorszg vezetse szembeslt a tnnyel: a lakossg tlagos szelnbevitele jval elmarad az
optimlisnak tekintett szak-amerikai szinttl s mindez slyos egszsggyi kockzatot rejt
magban [REILLY 1998]. A vlaszreakci orszgonknt ms s ms formt lttt: mg
15

Dernovics Mihly

Finnorszgban s j-Zland szelnhinyos vidkein bevezettk a szelntartalm mtrgyk


hasznlatt, addig az Egyeslt Kirlysgban sajtkzlemnyek tjn biztattk a lakossgot
tpllkkiegsztk s a kzismerten nagy szelntartalm brazil di fogyasztsra. Rszben
ennek ksznheten a szelnnel dstott leszttablettk, fokhagymakivonatok s funkcionlis
lelmiszerek, mint pl. a szelnes szupertojs [SURAI 2001] soha nem ltott mrtkben
rasztotta el a boltok pultjait. Ezen ksztmnyek egy rsze gy hirdette s hirdeti a mai napig
magt, miszerint szerves ktsben lv szelnt tartalmaznak, a szeleno-aminosavak
szervetlen szelnmdosulatokhoz viszonytott, nagyobb biolgiai elrhetsgre utalva. Szmos
tanulmny bizonytotta idkzben, hogy a gyrtk kzl j pran sajnos csupn szervetlen Sesk bekeversvel oldottk meg a feltntetett szelntartalom biztostst. Nem csupn a
fogyaszt megtvesztsrl van sz: nem vilgos ugyanis, hogy a szervetlen Se-sk lettanilag
kedvezbb vagy kedveztlenebb hatsak-e a kttt szerves mdosulatokhoz kpest. A tmval
foglalkoz kzlemnyek szerint patknyok esetben a szelnnel dstott leszt fehrjben kttt
SeMet tartalma jval kevsb terheli a szervezetet s sokkal nagyobb hatsfokkal szvdik fel a
szervetlen Se-skhoz vagy magnak a tisztn adagolt SeMet-hoz kpest [YOSHIDA 1999], mg
sertsek esetn rszben ellenttes eredmnyre jutottak a ksrletek sorn [MAHAN 1997].
Fontos kiemelni, hogy az elz vizsglatokat emlskn vgeztk, ugyanis a SeMet halak s
madarak esetben egyrtelmen toxikusabb a szervetlen Se-skhoz kpest [FAN 2002].
Mindenesetre, amg nem rendelkeznk elegend informcival az esetleges kros ill.
kedveztlen hatsokrl, legalbb a termk ltal valban hordozott mdosulatok sszettelt
lenne rdemes tisztzni s feltntetni a fogyaszt tnyszer tjkoztatsa vgett ehhez pedig
felttlenl szksg van szeln mdosulatanalitikai vizsglatokra.
(d) A szeleno-aminosavak termszetesen mind D-, mind pedig L-enantiomer formban is
megtallhatak. Kmiai szintzis esetn racm vegylet jn ltre, a kt forma 50-50%-os
megoszlsval; biolgiai mintk esetn pedig szinte kizrlag L-szeleno-aminosavakat mutattak
ki. A szinte sz alkalmazsa mgtt az a megfigyels ll, hogy 100C krli hmrskleten az
lelmiszer-fehrjkben racemizci indulhat meg, gy pldul a szelnnel dstott leszt
porlasztva szrtsa sorn elvileg D-szeleno-aminosavak kpzdsre nylik md [MAN 1987].
PREZ MNDEZ et al. [2000] kutatsai igazoltk, hogy mindez nem csupn elvi lehetsg: az
ltaluk vizsglt lesztminta SeMet-tartalmnak 18%-a bizonyult D-trllsnak. A gygyszati
ksztmnyek egy rsze kmiai szintzissel ellltott vegyleteket, teht pldul racm SeMet-t
tartalmaz [MONTES-BAYN 2001]. Ugyanakkor a tpllkozstudomny jelenlegi llsa szerint
nem rendelkeznk elg informcival arrl, hogy a D-szeleno-aminosavak milyen szerepet
tlthetnek be az emberi tpllkozsban. Annyi mr bizonyos, hogy tiszta formban az L-SeCys2
szignifiknsan toxikusabb D-enantiomer prjnl [MCADAM 1987]. Nagyon valszn, hogy a
D-(szeleno-)aminosavakkal kapcsolatos ismereteink bvlse az eddigieknl is szlesebb krben
vonja majd maga utn a szeln mdosulatanalitika enantiomerekkel foglalkoz gnak
kibvlst.

16

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.1.2. Kt dolog, mely elvlaszthatatlan egymstl: az arzn s a mdosulatanalitika


Taln az egyetlen elem, amelynek neve nem csupn elvlaszthatatlanul sszeforrott a
mrgezs fogalmval, hanem szinte szinonimjv is vlt. Fehr arznknt ismert arzn-trioxid
vegylete ztelen s szagtalan megjelense miatt a kzpkor s az jkor brgyilkosainak kedvelt
eszkzv vlt. Albertus Magnus, a termszeti s termszetfeletti tudomnnyal egyarnt
elktelezett domonkosrendi szerzetes 1250 krl fedezte fel s klntette el elszr elemi
llapotban, ugyanakkor mr Hippokratsz mvei kztt is fellelhet a ksbb arzn-szulfidknt
azonostott vegyletet tartalmaz, feklyek elleni kencs lersa [MANDAL 2002]. me a
kettssg, amely sokig feloldhatatlanul vezte az arzn megtlst: gygyszerek s gyorsan l
mrgek is tartalmazhatjk, gygythat s rthat egyszerre. Az ipari forradalmat kveten ismt
mindkt oldalra jutottak pldk. A rendkvl toxikus, bellegezve akut mrgezshez vezet
arzinszrmazkok megismerse elmleti htterl szolglt az I. vilghbor sorn bevetett harci
gzok (pl. a hrhedt Lewisite /2-klorovinil-dikloroarzin/) kialaktshoz. Msrszrl az Erlich
ltal szintetizlt, szintn As-tartalm Salvarsan egszen a penicillin 1943-as megjelensig a
szifilisz legfbb gygyszernek szmtott, s egyes protozoon-betegsgek (trypanosomizis)
kezelsnl a mai napig alkalmazzk a Melarsoprol ksztmnyt [GRAEME 1998].
Az arzn a kvetkez alapvet kmiai tulajdonsgokkal rendelkezik: rendszma 33,
atomtmege: 74,922; elektronhj-szerkezete 3d10 4s2 4p3, oxidcis llapota -III, 0, +III, +V
lehet, Pauling-fle elektronegativitsa: 2,0. A termszetben elfordul arzn a stabil 75-s
arznizotpbl ll, a radioaktv 72-, 74- s 76-os arznizotpokat az orvosi diagnosztikban
hasznljk. Annak ellenre, hogy az arzn sszes mennyisge a fldkregben s a tengervzben
igen csekly (5,5*10-4 m/m % s 1*10-4 m/m %), mgis meglehetsen elterjedt: a 41. elem a
gyakorisgi sorrendben. Krlbell 200 svnya ismert; kimutathat tenger- s desvizekben
(g kg-1 nagysgrendben), talajban 0,05-50 g g-1 mennyisgben (feltve, hogy nem zajlott le
mestersges szennyezs), s rtegvizekben is; valamint llati s nvnyi szvetekben: a legtbb
szrazfldi llny ltalban 1 mg testslykg-1-nl kevesebb arznt tartalmaz, mg a tengeri
szervezetekben 1-100 g g-1 kztti rtkben tallhat meg. Ez utbbi rtk klnsen
szembetn, fknt ha figyelembe vesszk, hogy a tengerekkel, tengeri halszati kultrval
rendelkez orszgokban vente s szemlyenknt akr 50-60 kg hal s egyb tengeri eredet tel
is fogyasztsra kerlhet.
Az arzn l szervezetekben megismert viselkedse rszben annak tulajdonthat, hogy a
peridusos rendszer 5. fcsoportjnak tagja; ebbl kifolylag a nitrogn s a foszfor
vegyletekkel analg, As-tartalm molekulkban (pl. As-betain s As-kolin) gyakran fordul el,
s bizonyos vegyleteinl ebbl fakad toxicitsa is. Konkrtan az arzent a foszftionnal
versenyez, gy annak helybe lpve megszaktja az oxidatv foszforilcit s gtolja az ATP
szintzist. A msik gyakori szervetlen forma, az As(III) mrgezsi hatsmechanizmusa eltr
biokmiai httrrel jellemezhet: szelektven ktdik a szulfhidril-csoportot aktv helyen
tartalmaz enzimekhez, amelyeket inaktivl, s lelasstja ill. lelltja mind a sejtlgzst, mind
pedig a sznhidrt-anyagcsert.
17

Dernovics Mihly

Az arzn bnlajstroma korntsem r vget az emltett kt szervetlen As-szrmazk nagy


mennyisg adagolsnl fellp, akr percek alatt hallhoz vezet krkpben. A kis
mennyisg, pldul ivvzzel nap mint nap elfogyasztott nhny 100 g As hossz tvon
gyakorlatilag a teljes szervezetet krosthatja: lgzsi- s keringsi rendszer elemeit (td,
lgcs, lghlyagocskk, szvizom, rfalak stb.) sorvasztja; gyomor- s brbntalmakat vlt ki,
belertve a hrhedt, feklyesedssel jr feketelb-betegsget; krostja a mjat, a vest; a
vrkpet s az idegrendszeri paramtereket (koncentrlkpessg, reflexek) rontja; fejldsi s
reprodukcis zavarhoz vezet; az immunolgiai rendszer leplst vltja ki; mutagn,
karcinogn, genotoxikus, teratogn; felnttkori cukorbetegsg okozja lehet s vgl: tbb mint
200 emberi enzimet rszben vagy teljesen inaktivl [MANDAL 2002]. Ha szervetlen arzn kerl
a szervezetbe, akkor beindul az eltvoltst szolgl, detoxikcis folyamat, mely rszben az
arzn sorozatos metilezsben s vizelettel trtn kirtsben, rszben pedig keratinhoz (haj,
krm) trtn irreverzibilis ktsben lthet testet.
Nhnyszor 10 mg fehr arzn gyors hallt okoz. Ha ezt a tnyt annak az adatnak a tkrben
nzzk, hogy a tengeri eredet halak, rkok, kagylk sszes arzntartalma akr egyetlen ttermi
fogsnl meghaladhatja akr a 10-20 mg-os mennyisget is, termszetszerleg addik a krds:
mi szabja meg, hogy ugyanazon As-tartalom mikor jelent lelmiszer-biztonsgi kockzati
tnyezt s hallos fenyegetst ill. mikor tekinthet veszlytelennek. A megolds a korbban
mr sejtetett, hol szrmazk, hol pedig formk megnevezssel illetett, valjban a klnbz
arznmdosulatokban rejlik, melyek leggyakoribb pldit a 3. Mellklet tblzata ismerteti.
A tblzatban felsorolt tbb tucat vegylet azokat a mdosulatokat fedi le, melyeket
biolgiai rendszerekben azonostottak ill. mellktermkknt szabadulhatnak fel ipari folyamatok
sorn. Jellemz elfordulsi hely alatt azon mintatpus rtend, melybl leggyakrabban
mutattk ki az adott mdosulatot termszetesen nem kizrlagos esetekrl van sz, hiszen pl. a
tengeri llnyekben oly gyakori AsB szrazfldi gombkban is elfordul [KUEHNELT 1997].
A gygyszerknt vagy egyb cllal (rovarlszer, faanyag-tartst vegylet, hzillatoknak
roborlszer) szintetizlt vegyletek nem kerltek emltsre, mivel felhasznlsuk s gy
elfordulsuk clzott, teht ismert s korltozott mrtk. Az ltalban patknyksrletek
alapjn meghatrozott LD50 rtkek alapjn hrom csoportot lehet kialaktani, amelyek egyben
vlaszt is adhatnak az lelmiszer-biztonsgi krdsekre:
(a) Kiemelten toxikus mdosulatok az arzinek, a szervetlen As(III) - As(V), s a hrom
vegyrtk metilezett szrmazkok tartoznak ide. Az arzinek problmja munkaegszsggyi
krds, kell felgyelettel s vintzkedssel a mrgezs veszlyt le lehet cskkenteni. A
szervetlen mdosulatok sajnos jellegzetes sszetevi lehetnek mind a talaj- s ivvizeknek, mind
pedig a talajoknak, ebbl fakadan mennyisgi meghatrozsuk olykor ltfontossg feladat. A
hrom vegyrtk, metilezett szrmazkokat csak 2000-ben mutattk ki elszr emberi
vizeletben [LE 2000], s jelenltk ill. rendkvli toxicitsuk (in vitro mrsek szerint akr
386-szor mrgezbbek az As(III)-nl [MASS 2001]) fenekestl forgatta fel azt a korbban
elfogadott magyarzatot, miszerint az arzn detoxikcis folyamata sorn a metilezs a
szervetlen mdosulathoz kpest kevsb toxikus intermediereket s vgtermkeket eredmnyez.
18

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

Ezen j ismeretek mg inkbb arra a kvetkeztetsre vezetnek, hogy a szervetlen Asmdosulatok emberi szervezetbe trtn bevitelt a lehet legkisebb mrtkre kell cskkenteni.
(b) tmeneti tartomnyt kpviselnek az t vegyrtk metilezett szrmazkok s a ngy
metilcsoportot hordoz TETRA. Ugyan az MMA(V) s DMA(V) LD50 rtke jval nagyobb az
els csoport mdosulatainl, m a hrom vegyrtk metilezett szrmazkok felfedezse sorn
szerepk jra rtkelsre kerlt: mivel az emberi szervezetben hrom vegyrtkv
redukldhatnak, kzvetve vlthatnak ki mrgezsi tnetegyttest.
(c) AsB, AsC, arzenocukrok. Az els kt mdosulat, melyek egytt jelents, olykor 100%t adjk a tengeri llatok As-tartalmnak, gyakorlatilag nem tekinthet mrgeznek. Amita
felfedeztk [EDMONDS 1977], szinte minden tengeri llatban kimutattk mr az AsB-t, s
aprlkos vizsglatok egsz sorval igazoltk, hogy az emberi szervezet semmilyen mdon sem
dolgozza fel [LARSEN 1993], gy kzvetlen (pl. nyers hal) fogyasztsa egszsggyi
kockzatot nem jelent. Az AsB-bl tlhevtssel, tl nagy hmrskleten (>180C) vgzett sts
sorn kialakul TETRA jelenlte azonban nagyobb veszllyel jr, gy a fogyasztk figyelmt
mindenkppen rdemes felhvni az egybknt semmilyen szempontbl sem ajnlott helytelen
stsi szoksok elkerlsre [HANAOKA 2001]. Az alacsonyabb rend nvnyi szervezetekben
tallt arzenocukrok toxicitsrl meglehetsen keveset tudunk; vlhetleg az AsB-hez hasonlan
nagy LD50 jellemzi ket.
A mdosulatok megismerse utn az elmlt vekben valsznleg hossz tvon is
vglegesnek tekinthet irnyvonalak alakultak ki az arzn mdosulatanalitika terletn, melyek
mind a mintkat, mind pedig az alkalmazhat mintaelksztsi mdszereket keretbe foglaljk:
1. Tengeri eredet lelmiszereket nagymrtkben fogyaszt orszgokban merlt fl a
krds, hogy a klnbz tengeri llatokban (puhatestek, rkok, halak) az arzn milyen
formban van jelen, ill. ezen elfordulsi formk hordoznak-e valamilyen veszlyforrst
lelmiszer-biztonsgi szempontbl. Ma mr ismert, hogy az ilyen lelmiszerek arzntartalma
fknt a nem, vagy csak kevss toxikus AsB formjban tallhat meg; azonban a tengervzbl
felvett szervetlen arzn detoxiklsi folyamata idignyes mechanizmus, gy az esetlegesen
nagyobb tengeri terletet r hirtelen arznkoncentrci-emelkeds amely lehet mestersges
(szennyezs) vagy geolgiai (vulkni tevkenysg lnklse) okokra visszavezethet
megnvelheti az AsB-nl toxikusabb intermedierek koncentrcijt.
2. Iv-, ntz- s talajvizek esetben geolgiai oka van a szervetlen arznmdosulatok
elfordulsnak (mivel szerves arzntpusokkal nem kerl kapcsolatba a vztrol kzet, gy a
vz szinte csak As(III)-t vagy As(V)-t tartalmazhat). Ebben az esetben teht a
mdosulatanalitikai vizsglatokat nem abbl a szempontbl kell elvgezni, hogy az adott vz
mennyire mrgez vagy sem, hiszen lelmiszer-biztonsgi szempontbl elegend informcit
szolgltat ilyenkor az sszes As-tartalom megllaptsa. F cl a szervetlen arznmdosulatok
egymshoz viszonytott arnynak meghatrozsa, ugyanis az As(III) s As(V)
koncentrcijnak ismeretre szksg lehet a vztiszttsi technolgia megvlasztsban (e kt
szervetlen arznvegylet kzl ugyanis az As(V) j hatsfokkal eltvolthat a vzbl
19

Dernovics Mihly

membrnszrs segtsgvel). Az ntzvz arzntartalma klnsen a tvol-keleti


rizsltetvnyek veszlyeztetettsgt befolysolja.
3. A talajok biolgiailag hozzfrhet arzntartalma termesztett nvnyeinkbe ltalban
szervetlen teht kiemelkeden toxikus mdosulatknt plhet be; ebbl kifolylag mind
maguknak a talajoknak, mind pedig a feljavtsukra sznt iszapnak s ledkeknek is clszer
elvgezni a hozzfrhet/sszes arznarny s a mdosulatok eloszlsnak megllaptst.
4. Valsznleg mindinkbb lnkl figyelem ksri majd az arzn detoxikcival
kapcsolatos tmakrt, amely maga utn vonja a testfolyadkok (vr, vizelet) tovbbi
mdosulatanalitikai elemzsnek szksgessgt.
5. Az lelmiszerek elksztse sorn a mdosulatokat rt behatsok (hkezels, oxidatv
krlmnyek, folykony-szilrd extrakcis folyamatok gyenge savakkal /ecetsav, citromsav/ s
lipofil vegyletekkel /olajok, zsrok/ ksztett ntetek, szszok s pclk hasznlatnl stb.)
miatti talakulsok s megoszlsok vizsglata fnyt derthet egyrszt a ma mg feltratlan, pl. az
arzenocukrokkal kapcsolatos bomlsi folyamatokra, msrszt az esetleg toxikusabb mdosulatok
migrcijra az lelmiszerben s krnyezetben.
A felsorolt t tmakrt illeten haznk fknt az els kettben rintett. Magyarorszg egyike
azon kevs eurpai orszgoknak, ahol valdi gondknt jelentkezik az Alfld As-tartalm
ivvizeinek jelenlte s kezelse [VERES 1991, VARSNYI 1991, BRZSNYI 1992,
SMEDLEY 2002], gy a mdosulatanalitikai vizsglatok minden bizonnyal az eddiginl
szlesebb krben vlnak ismertt s kerlnek gyakorlati felhasznlsra. A 100%-ban importbl
szrmaz, tengeri eredet lelmiszereink forgalomba hozatali engedlyeztetsnl pedig el
kellett hagyni az egszen 2003. mrcius 12-ig rvnyes, sszes As-tartalom meghatrozsn
alapul vizsglati elrsokat s hatrrtkeket, mivel ezek elavultnak bizonyultak az egyre
szlesebb krben elfogadott vlt As-mdosulatanalitikai ismeretek tkrben; vrhatan a
kzeljvben mdosulatanalitikai mdszer hasznlatt rja majd el az illetkes minisztrium
[EGSZSGGYI 2003].
Vgl szt kell mg ejteni a magyar mdosulatanalitikai nevezktannal kapcsolatos
krdskrrl is. A teljes mdosulatanalitikai tmakr elemektl fggetlenl viszonylag j
tudomnyterletnek szmt, nem is beszlve a csupn nhny ve felfedezett mdosulatokrl.
Jellemz, hogy mg az angol elnevezsek sem egyeznek meg minden esetben (tipikus pldul
szolgljanak erre hrom, viszonylag j sszefoglal kzlemny nevezktani ellentmondsai:
[GONG 2001, 2002] s MCSHEEHY [2003a]), gy a magyarra trtn tltets rszben ttr
feladatnak szmt. Legfbb gond a metilezett arznmdosulatok klnbz vegyrtk forminl
addott. Ezekben az esetekben az angolban arsonous, arsinous, arsinic, arsonic s
arsenic tagok egyarnt elfordulnak, sajnos olykor ugyanazon vegyletre is. A 3. Mellklet
tblzatban a GONG-fle nevezktan mellett tettem le voksomat, gy kln taggal (arzinsav
s arzonsav) lttam el a dimetil- ill. monometil-szrmazkokat, s -es, -os kpzk jelzik a
hrom vegyrtk mdosulatokat.

20

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.2. MINTAELKSZTSI ELJRSOK: HAGYOMNYOS MDSZEREK TELJES FELTRS


A teljes feltrs clja a minta szervesanyag-tartalmnak tkletes elroncsolsa anlkl, hogy
figyelmet szentelnnk az elem eredeti formjnak megrzsre. Ez a folyamat egytt jrhat a
minta eredeti mdosulatanalitikai tulajdonsgainak elvesztsvel, de ebben az esetben mindez
nem jelent htrnyt. A teljes feltrs ugyanis alapveten a mdosulatanalitikai mrsek kerett
adja meg, s hasznlatt kt f ok jellemzi: (1) egyrszt a minta sszes As- s/vagy Setartalmnak ismeretben lehetsgnk lesz dnteni arrl, hogy rdemes-e egyltaln
mdosulatanalitikai vizsglatokat is vgrehajtanunk (figyelembe vve pl. arzn esetben az adott
orszg lelmiszer-biztonsggal kapcsolatos szablyozst) ill. (2) amennyiben szksges a
mdosulatanalitikai megkzelts, gy a teljes feltrssal meghatrozott sszes As s/vagy Se
mennyisg a mrsek anyagmrlegnek sszelltshoz nyjt alapvet informcit.
A teljes feltrs vgrehajtsa sorn olyan mdszerhez kell folyamodnunk, amely lehetleg
az sszes mdosulatot szerveseket s szervetleneket egyarnt azonos llapotba hozza.
Termszetesen a folyamatot gy kell megvlasztanunk s vezetnnk, hogy a vgre kialakul
mdosulat leginkbb megfeleljen a feltrst kvet mrstechnika kvnalmainak. Ez a felttel a
Se s az As esetn klns hangslyt kap mgpedig okkal. A gyakorlatban ugyanis a
feltrssal egytt jr hmrsklet-emelst s erteljes oxidatv krnyezetet illeten mind a Se,
mind pedig az As rendkvl eltr stabilits mdosulatokkal rendelkezik, amelyek igen gyakran
egyms mellett is elfordulnak az adott mintban. gy azonban elfordulhat, hogy a nem kell
figyelemmel vezetett feltrs nem eredmnyez homogn mdosulateloszlst. A
mrrendszereket ltalban arra a felttelezsre ptve hasznljuk, hogy a mintban a
feltrssal/mintaelksztssel egyfle mdosulat alakul ki, s annak analitikai tisztasg
standardknt is elrhet formjval kalibrljuk a mrmszert. Ha azonban a vizsglt elemre
nzve inhomogn elegy kerl mrsre, a kalibrcis grbe alapjn szmolt rtkek nem
felttlenl tkrzik majd a valdi koncentrcikat. Mindez kiemelt jelentsg problmt
jelenthet a mai napig szles krben elterjedtnek szmt, a kt elem hidridkpzsi kpessgre
pt HG-AAS vagy HG-AFS technikk esetben, ugyanis a Se s As mdosulatok csak egy
rsze kpes hidridet fejleszteni, radsul klnbz hatsfokkal. Az ebbl fakad
hibalehetsgek s azok kikszblsi mdjai a kt elemnl kln-kln kerlnek bemutatsra.
Napjainkra mr elmondhatjuk, hogy a teljes feltrs terletn a klnbz oxi- s
halogenidsavakkal vgzett, megnvelt hmrskleten s nyomson lejtszd nedves
roncsolsok egyeduralkodv vltak termszetesen mindig az adott minthoz s az
alkalmazand analitikai mrrendszerhez illesztve. Br az emltett nagy hmrskletet olyan,
hagyomnyosnak mondhat mdszerekkel is el lehet rni, mint pl. a laboratriumi nyomstart
ednyzet, a mikrohullm berendezsek trnyerst nem lehet vitatni. Ez utbbiak esetn nem
csupn a mintaelksztsi id cskkentse, hanem nagyfok automatizltsguk s az akr
mintahelyenknt szablyozhat, dokumentlhat s rekonstrulhat paramtereik (nyoms,
hmrsklet, reflux) igazoljk elterjedsket mrtkt. Legalbb ugyanilyen mdon kezd
egyeduralkodv vlni a nedves roncsols terletn a teflonednyek (PTFE) felhasznlsa: sav-,
lg- s hllsguk, knny tisztthatsguk s gyakorlatilag brmilyen formban trtn
21

Dernovics Mihly

gyrtsuk nmagukrt beszlnek. Kivtelt csupn a klnleges, n. blokkroncsolkban


alkalmazott kvarcednyek jelentik, amelyek azonban nem teszik lehetv folysavas feltrsok
vgrehajtst.
A nedves roncsolst kveten a mintt a vrhat Se/As koncentrci fggvnyben
gyakran hidridfejlesztst kveten AAS, ICP-OES vagy ICP-MS kszlkkel elemzik. Kln
figyelmet rdemelnek azok az esetek, amikor a minta sszes Se/As tartalmnak
meghatrozshoz nincs szksg mintaelksztsre. Ilyen lehetsg llhat el a.
roncsolsmentes mrsi technikk (pl. INAA) illetve a kzvetlen szilrd mints (solid
sampling) mdszerek hasznlata esetn. Az elbbi eljrsnl a rendszerint vzmentestett s
portott mintt 40-60 rs neutronbesugrzsnak teszik ki, amelyet nhny napos hts s a
vizsglt radionuklidok gamma-spektrometris mrse kvet [DE BRTTER 1995]. Az utbbiak
szilrd minta bemrsvel-elprologtatsval (pl. egyes grafitkemencs ill. LA megoldsok)
kzvetlen kapcsolatot teremtenek a mrrendszerrel (AAS vagy ICP-MS). Br mindkt mdszer,
az INAA s a kzvetlen szilrd mints mintavtel is ktsgtelen elnykkel jr, az elbbit nagy
kltsgignye, az utbbit pedig a minta inhomogenitsbl fakad, tlagosnl gyengbb
ismtelhetsgi paramterei gtoljk a szlesebb kr elterjedsben.
A folykony mintk tmenetet kpeznek a mintaelksztst nem ignyl s az
elksztend mintatpusok kztt. A talajvizeket ltalban csupn gyenge savanytsnak ill.
0,45 m-es membrnon keresztl trtn szrsnek teszik ki [RAESSLER 2000]. A
vizeletmintk kezelse lehet hasonlan egyszer, szrs hgtssal kiegsztve [LINDEMANN
2000], vagy kicsit sszetettebb (dsts cljbl liofilizls, amelyet kisebb trfogatban trtn
olds kvet: CAO [2001]) ill. enyhbb (hidrogn-peroxid + UV-besugrzs: LINTSCHINGER
[1998]) vagy erteljesebb nedves roncsols (HNO3-H2SO4: SAB [2001]).
Mieltt sorra kerlne a teljes feltrst clz eljrsok konkrt, elemekre s mintatpusokra
lebontott ismertetse, nem szabad emlts nlkl hagyni kt alapvet felttelt: a vizsgland
minta homogenitst s reprezentatv jellegt. Hibaval ugyanis a brmely tkletessggel
elvgzett roncsols, ha az elkszts sorn nem szentelnk figyelmet az elz paramtereknek.
Mg a szigor kvetelmnyeket kielgt CRM-ek esetn is megadsra kerl, milyen mdon
szksges az anyagot homogenizlni ill. mekkora a legkisebb, mg reprezentatv tmeg. Ezen
okokbl kifolylag a (szilrd) mintt a lehetsgekhez kpest elzetes szemcsemretcskkentsnek (aprts-darls) s mret szerinti osztlyozsnak (szitls) clszer kitenni
mindezek elmaradsa ksbb rosszabb ismtelhetsgben / reproduklhatsgban testeslhet
meg.
2.2.1. Teljes feltrs sszes szelntartalom meghatrozs cljbl
2.2.1.1. ltalnos ismertetjegyek
A szeln esetben a teljes feltrs mveletnek fejldse egytt haladt a klnbz Semdosulatok megismersvel, felismerve azok eltr rzkenysgt a klnfle hmrskleti s
vegyi behatsokra. ltalnossgban a kvetkez jellegzetessgeket clszer kiemelni:
22

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

1) Brmilyen feltrst is alkalmazunk, kizrlag a zrt rendszerek brnak ltjogosultsggal,


mivel a szeln-halogenidek illkonyak, gy HCl vagy HF hasznlata csak ilyen rendszerben teszi
lehetv a vesztesgmentes mintaelksztst [DULIVO 1997].
2) A kell figyelemmel vgzett nedves roncsols a mintban eredetileg jelen lv sszes
szelnmdosulatot Se(VI) formba alaktja. Mivel a szeln +6 oxidcis llapotban nem kpez
hidridet, a feltrst kveten redukcis lpst kell beiktatni a hidridkpz Se(IV) ltrehozshoz.
Mindehhez leggyakrabban ssavas klium-bromid vagy klium-bromt reagenst hasznlnak
[VILAN 1998].
2.2.1.2. A jellegzetes mintacsoportok kezelse
Talaj- s ledkmintk esetben a teljes feltrshoz elengedhetetlen a HF alkalmazsa. A
mintaelkszts ltalban 2 f lpsben zajlik: a teflonednybe kimrt anyaghoz elszr
savkeverket adnak a szervesanyag-tartalom roncsolsa cljbl (leggyakrabban HNO3-H2SO4HClO4 ill. kirlyvz) amelyet a sziliktok oldsa rdekben HF adagolssal fejeznek be [ITOH
1988, ELWAER 1995, MARTENS 1997]. A feleslegben marad folysavat brsavval ktik meg.
Szerves eredet (nvnyi, llati, lelmiszer, stb.) mintknl szinte kivtel nlkl egyetlen
mveleti lps elegend a mr kzvetlenl elemezhet llapot elrshez ez az egyetlen lps
pedig a saltromsavval, saltromsav-perklrsav eleggyel ill. az elzek hidrogn-peroxiddal
trtn kombinlsval vgrehajtott nedves roncsols. A mikrohullm berendezssel vagy
blokkroncsolval, tisztn HNO3 adagolsval, teflonednyben vgzett kezels kpes mr olyan
komplex mintkat is feltrni, mint pl. szeln-fitoremedicis clbl teleptett mustrnvny
[MONTES-BAYN 2002a], tengeri prhal [MAHER 1997], kk-zld alga [CASES 2002],
tejsavbaktrium-ksztmny [MICHALKE 2001] s szelnnel dstott lesztbl kszlt
tpllkkiegszt [BHYMER 2000]. Bizonyos fknt nagy lipidtartalm mintknl
perklrsavval egytt vlik teljess a feltrs; gy pldul szja [WANG 1996], nem zsrtalantott
brazil di [CHANG 1995] s tengeri rk [GMEZ-ARIZA 2002] esetben hasznltk ezt a
savkeverket. A hidrogn-peroxid adagolsa egyfajta oxidatv sokk rvn ugyancsak a
tkletes roncsolst segti el; alkalmazsa nem mintafgg, s a szakirodalom alapjn nem lehet
egyrtelm okot tallni hasznlatra ill. mellzsre. Ebbl fakad, hogy rszben a fent emltett
mintkrl is tallhatunk olyan kzlemnyeket, ahol a roncsolst HNO3-H2O2 prossal vgeztk
(leszt s leszt-tpllkkiegszt: ZHENG [2000], UDEN [1998]). Termszetesen
tallkozhatunk tbb, fggetlen csoport ltal is mindig HNO3-H2O2-vel eleggyel feltrt
mintatpussal is: ilyenek pl. a kalapos gombk, ahol valsznleg a nehezen roncsolhat kitines
sejtfal ignyli a hidrogn-peroxid hasznlatt [VETTER 1990, 1993; KUEHNELT 1997; RCZ
2000a,b]. UDEN et al. [1998] egy egsz sor mintnl (hagymaflk, llati trgya, nvnyi s
llati eredet CRM-ek, lucerna, stb.) ptettek a mikrohullmmal trstott HNO3-H2O2
hasznlatra sszes Se-tartalom meghatrozsa cljbl, s kielgt eredmnyekre jutottak
mindegyik mintatpus ill. CRM esetn. ltalnos szablyknt azt lehetne kijelenteni, hogy
amennyiben a H2O2 adagolsval megnvelt roncsolsi trfogat s ezen keresztl a mintaoldat
hgulsa mg nem rontja le a mrs pontossgt s megbzhatsgt, gy a hidrogn-peroxid
23

Dernovics Mihly

hasznlata tbb mint clravezet. Mindenesetre annyi bizonyos, hogy mg nagytisztasg


saltromsavhoz viszonylag knny hozzjutni (leggyakrabban az analitikai tisztasg sav
desztilllsval), addig sszevethet mrtkben szennyezdsmentes H2O2 jval
nehezebben/kltsgesebb ton llthat el vagy szerezhet be.
Egyetlen olyan szelnmdosulatot emlt a szakirodalom, amelynek roncsolshoz,
szervetlen mdosulatt alaktshoz a felsorolt savkombincik nem elegendek: ez pedig a
vizeletbl kimutathat TMSe+ [SAB 2001]. Ennl a vegyletnl kizrlag saltromsav-knsav
keverk segtsgvel vlhat teljess a mintaelkszts olyan mdon, hogy a TMSe+-t elszr
szelentt, majd ksbb redukcival szelenitt alaktjk.
Szerves eredet mintk esetn ritkn ugyan, de tallkozhatunk a TMAH hasznlatra pt
feltrssal is. 25 m/m %-os, rendkvl lgos kmhats oldatval vgzett hidrolzis oldatba visz
minden szerves mintaalkot komponenst, s az esetleg kttt llapotban lv fmionokat is
felszabadtja. Br ltezik olyan tanulmny, amely szerint ez a kezels nem vlt ki
mdosulattalakulst [DE LA CALLE-GUNTIAS 1997], azonban ez a feltevs ksbb
tbbszr megdlt, mr 2,5 m/m % koncentrci esetn is [CASIOT 1999; BHYMER 2000;
MARTN 2001] s jelenleg csak mint a savas feltrs alternatvjaknt jtszik szerepet [CASES
2002]. A lgos pH-rtk a TMAH-hoz kpest jval gyengbb bzis, az NH3-oldat alkalmazsa
esetn is mr 4 m/m %-os koncentrcinl bizonytottan a szelnmdosulatok talakulst
eredmnyezi [EMTEBORG 1998], gy szeln mdosulatanalitikban a biolgiai pH-tartomny
feletti kmhats kzegek nem jtszanak szerepet.
2.2.2. Teljes feltrs sszes arzntartalom meghatrozs cljbl
2.2.2.1. ltalnos ismertetjegyek
A mintban tallhat sszes arzn meghatrozsa sok kzs tulajdonsgot mutat a szelnnel,
amelynek rszben kmiai (ugyancsak hidridkpz s viszonylag nagy ionizcis
energiaszksglet jellemzi ebbl kifolylag viszonylag nehezen gerjeszthet), msrszt
gyakorlati okai vannak (hasonl eljrsok alkalmazhatak mindkt elemre, akr egyidej
mintaelksztsi clzattal). Ebbl kifolylag az ltalnos jellegzetessgek rszben egyezek:
1) A zrt rendszer feltr berendezsek hasznlata elnysebb a nyitottakhoz kpest, mivel
egyes tengeri eredet ill. talajmintk illkony arznmdosulatokat (pl. arzineket; TURPEINEN
[2002]) tartalmazhatnak, gy a vesztesgmentes feltrs kialaktsa kln figyelmet rdemel.
2) Minl tbbszrsebben metilezett, minl tbb arzn-szn kovalens ktst tartalmaz az
adott arznmdosulat, annl ellenllbb az oxidatv savas feltrsnak. Emellett a klnbz
fokban metilezett szrmazkok eltr mrtkben kpeznek hidridet. Ebbl az kvetkezik, hogy
amennyiben (a) a teljes feltrs nem vezet egy adott arznmdosulat (pl. As(V)) homogn
elegyhez, (b) az arzn csak rszben alakul t hidridkpz mdosulatt s (c) a mrrendszer
elzetes kromatogrfis elvlaszts nlkl, hidridkpzsen alapul detektlst vgez, tves
eredmnyt kaphatunk az arzntartalmat illeten.

24

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

Mivel az elbb bemutatott problmakr jellegzetesen mintafgg jelensg, a kvetkezkben


mintacsoportok szerint ismertetem az sszes As meghatrozsnl alkalmazott mintaelksztsi
mdszereket.
2.2.2.2. A jellegzetes mintacsoportok kezelse
ledkmintknl a szelnhez hasonlan az arzn esetben sem lehet folysavas kezels
nlkl sszes arznkinyerst elrni, mg talajok esetben a nagyobb szervesanyag- s a kisebb
szilikttartalom miatt olykor elegend a kirlyvizes olds is. Akr ipari tevkenysg, akr
termszetes eredet okozza a talajokban az As jelenltt, ltalban csak szervetlen siban,
arzenitknt vagy arzentknt tallhat meg, gy a bevezetben emltett tbbszrsen metilezett
mdosulatokkal adalkolt mintktl eltekintve nem tallkozunk. Ugyangy talajvizek
esetben e kt vegyleten kvl nem szokott ms arznmdosulat elfordulni ebbl fakadan
klnleges elksztsre az esetleges lebeg szennyezdsek eltvoltst clz
membrnszrsen kvl nincsen szksg [RAESSLER 2000].
Szerves eredet mintk esetben azonban jval sszetettebb a kp. Amennyiben a feltrt
mintt nem hidridfejlesztst alkalmaz mdszerrel elemzik (pl. hagyomnyos porlasztsos
mintabevitel ICP-OES vagy MS kszlkbe), gy nincs szksg az As-mdosulatok tkletes,
szervetlen arzentig vezetett roncsolsra, s megelgszenek a szeln esetben is gyakran
kielgt HNO3-H2O2 keverk teflonednyben (bombban) trtn alkalmazsval.
Optimalizlt mikrohullm kezels esetn a saltromsav magban is elegendnek szokott
bizonyulni [BRANCH 1994], de az tlagnl nagyobb zsrtartalm mintk miatt a H2O2
hasznlata mindenkppen ajnlott [MATUSIEWITZ 1989, YBEZ 1991, EL MOLL 1996].
Kzlemnyek, elemzett CRM-ek s valdi mintk egsz sora igazolja, hogy ez a megkzelts
nem okoz szignifikns mrsi hibt, hiba klnbzhetnek egymstl a kalibrlsra sznt,
rendszerint As(V) s a roncsolt mintban fellelhet arznmdosulatok. Konkrt pldaknt:
bbitelek [PARDO-MARTNEZ 2001], zldalga [GOESSLER 1997], erdei s termesztett
gombk [VETTER 1990], klnbz rizsfajtk [DILIO 2002], kagyl- s emberi hajmintk
[BERMEJO-BARRERA 1999] ill. tengeri halak [MAICHIN 2000] esetben az elemzsek az
egytt vizsglt CRM-ekkel kielgt As-mrseket eredmnyeztek.
Hidridfejlesztshez kapcsolt mrsi sszelltsoknl fokozottabb figyelmet kell szentelni a
minta jellegnek. A taln leggyakrabban tanulmnyozott tengeri eredet mintk (halak, a tenger
gymlcsei, az ezekbl kszlt lelmiszerek) ugyanis tbbnyire AsB-t tartalmaznak, amely
egyrszt nem hidridkpz, msrszt egyike az oxidatv savas kezelseknek leginkbb ellenll
As-mdosulatoknak. LEJKOVEC et al. [2001] ksrleteik alapjn arra a vlemnyre jutottak,
hogy az AsB 100%-os roncsolst csak saltromsav, knsav s hidrogn-peroxid egyttes
adagolsval lehet elrni, mivel magban a 65 m/m %-os saltromsav 200C fokon csupn kb.
50%-ban volt kpes ezt a metilezett arznmdosulatot arzentt oxidlni. rdemes megjegyezni,
hogy a knsav oxidlkpessge ugyan gyengbb a saltromsavnl, azonban forrspontja
nagyobb, gy hozz tud jrulni az AsB konverzijhoz idelisnak tartott 300C fok elrshez.
Ugyanezen nagy hmrsklet elrshez lteznek alternatv megoldsok is: az n. fkuszlt
25

Dernovics Mihly

mikrohullmmal mkd roncsolk akr knsav hasznlata nlkl, saltromsavas kzegben is


kpesek biztostani a kvnt konverzis hatsfokot, ttrst jelentve az arzntartalm tengeri
mintk mintaelksztsnek terletn.
Az ETV-AAS mrrendszerhez trtn mintaelkszts br nem ignyli az
arznvegyletek hidridkpz mdosulatokk trtn bontst hatresetnek tekinthet az elbb
bemutatott kt csoport, a hidridkpzsre pt ill. azt mellz kztt. Ennek az az oka, hogy a
klnbz arznmdosulatok ms s ms hmrskleten prolognak el az ETV felftsi
szakasza kzben, s ezltal az arzn egy rsze mg a mrsi szakasz eltt elillanhat a
mrcellbl, vesztesget okozva az arznmrlegben. A pontos mrs vgrehajtshoz gy kt
lehetsg marad: vagy a hidridkpzsen alapul mrsekhez sznt (erteljesen oxidatv)
mintaelksztst hajtjuk vgre, vagy pedig n. mdost vegyletekkel (Pd- s Mg-sk) vesszk
elejt az id eltti As-elillansnak [DEAKER 1999].
2.3. MINTAELKSZTSI ELJRSOK: MDOSULATANALITIKAI MDSZEREK
A teljes feltrssal ellenttben a mdosulatanalitikai mintaelkszts kifejezetten azt a clt
szolglja, hogy a mintban tallhat As- s Se-mdosulatok talakuls nlkl kerlhessenek
meghatrozsra. Azonban nem ez az egyetlen klnbsg a kt megkzelts kztt: a teljes
feltrssal ellenttben lteznek mdosulatanalitikai feladatok, amelyek nem tzik ki clul az
sszes mdosulat kinyerst, gy azok egy rsze biztosan feltratlan marad. Msrszt sajnos
meglehetsen gyakori az olyan mintatpus, amelybl nem nyerhet ki az sszes mdosulat, hiba
lenne clunk a 100%-os extrakcis hatsfok.
A mdosulatanalitikai mintaelkszts azutn indult fejldsnek, amikor ismertt vlt, hogy
ugyanazon elem klnbz mdosulatai eltr mdon viselkednek ill. eltr tulajdonsgokkal
brnak. Arzn esetben 1973-ig [BRAMAN 1973], mg szelnnl egszen a 60-as vekig kell
visszanylnunk az els mdosulatanalitikai mrsek megismershez [tbbek kzt MARTIN
1966]. Ezt kveten minden egyes j, gyakorlatban hasznlhatnak bizonyul mintaelksztsi
eljrs nyomot hagyott a soron kvetkez, elemzend minta megkzeltsben, ugyanis az
egyszer mr alkalmasnak tallt, mdosulatvltozst nem okoz mdszert egyfajta tartalkknt,
referenciaknt hasznltk az jabb mdszerek mellett. Ez az egymsra pls tkletesen
kimutathat mind az As, mind a Se esetben, s ltalban a korbban mg nem vizsglt mintk
prhuzamosan alkalmazott, eltr mintaelksztsben nyilvnul meg. Ebbl kifolylag nehz
lenne a mdosulatanalitikai mintaelksztsi mdszereket jellegzetes mintatpusok szerint
csoportostani, mivel ugyanazon mintt eltr, de azonos kinyersi hatsfokot biztost
mdszerekkel is fel lehet trni. Msrszt, mint korbban emltsre kerlt, nem felttlenl cl a
minl nagyobb kinyers, gy nem lehet idelis mdszert javasolni az adott mintatpusra br a
leggyakoribb mintk s a hozzjuk kapcsold feladatok mra mr kijelltek egynhny minta
+ ajnlott elksztsi mdszer prost, amelyekre a kvetkezekben bemutatsra kerl,
legnagyobb gyakorlati jelentsggel rendelkez mdszerek szolgltatnak pldkat.

26

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.3.1. Mdosulatanalitikai mintaelksztsi eljrsok szelnre


2.3.1.1. ltalnos ismertetjegyek
Az alkalmazhat mdszereket alapveten hrom tnyez szorthatja korltok kz. Egyrszt
figyelemmel kell lenni a szervetlen szelnmdosulatok ltalnos rzkenysgre, gy pldul
nagyobb hmrskleten (> 70C) a Se(IV) mdosulat Se(VI)-t oxidldhat [ZHANG 1997], ill.
a pH szmottev vltozsa az elbbi kt szelnvegylet kzt fennll redox egyenslyt tolhatja
el egyik vagy msik irnyba [SHARMASARKAR 1998]. Msrszt a szeln lettani szerepnek
tovbbi tisztzst srget ignyek s a proteomics (fehrjetudomnyok) trnyersnek
ksznheten
egyre
tbb
kutatcsoport
foglalkozik
a
szeln
fehrjeszint
mdosulatanalitikjval, amelyben termszetesen csak korltozott mrtkben lehet fordulni az
olyannyira elterjedt teljes fehrjehidrolzis eszkztrhoz. Harmadrszt mg nem ismerjk
elgg a szelntartalm aminosavak s jonnan felfedezett szrmazkaik tulajdonsgait, gy az
vatos, inkbb kisebb kinyersi hatsfokot nyjt, de mdosulatvltozst biztosan nem okoz
mdszerek eltrbe helyezse mindenkppen indokolt. Mindezek figyelembevtelvel mg
mindig meglehetsen b vlasztk ll rendelkezsnkre a vlaszthat eljrsokat illeten.
2.3.1.2. Pufferelt s nem pufferelt (vizes) kzeggel vgzett extrakcik
A leginkbb gyengd-nek tekintett mintaelksztsi eljrsokkal llunk szemben. Az
alkalmazott pH-rtkekre pufferelt kzeg esetn az n. biolgiai puffer-tartomny (pH=5-9)
jellemz, a kezels 1-2 rs kevertetsben-rzatsban testesl meg, mg a kezelsi hmrskletek
a szobahmrsklet s 80-90C kztt mozognak, az utbbinl termszetesen csak vlheten
fleg szerves mdosulatot hordoz mintk esetben. Ezzel a mdszerrel a nem kttt formban
lv szervetlen szelnsk tbbsgt, a szabad aminosavakat s szrmazkaikat illetve semleges
krli pH esetn a fehrjk 20-30%-t lehet kinyerni a mintbl. Mivel a vrhat extrakcis
hatsfok inkbb fgg a minttl, mintsem a vlasztott extrahl oldattl, clszer mintacsoportok
szerint bemutatni a konkrt alkalmazsi pldkat.
Talaj- s ledkmintk esetben a csupn desztilllt vzzel vgzett extrakci rendkvl kis
rszt szabadtja fel a szelnnek: MARTENS s SUAREZ [1997] 1,0 s 7,0% kztti rtket
kapott. A minttl fggen olykor mg az extrahl vzben ioncserl clzattal oldott KCl
adagolsa sem nveli a hatsfokot: ZHANG s MOORE [1997] mg az elz csoport
eredmnyeihez kpest is kisebb, 1,4-1,8%-os hatsfokot knyvelhetett gy el. Lnyegesen
nagyobb kinyerst tesz lehetv a tbbrtk aniont, jellemzen foszftot hordoz oldatok
alkalmazsa: az elbbi szerzpros 72-100%-ra emelte meg a kinyert szeln mennyisgt
0,1 mol l-1, pH=7,0 klium-foszft puffer segtsgvel. A foszftpuffer ott nem rt el 100%
krli kihozatalt, ahol jelents volt a talajminta Se(0) s Se(-II) mdosulattartalma; ezen
esetekben 0,1 mol l-1 K2S2O8 oldat utlagos szekvencilis hasznlata oxidl hatsa rvn
tette teljess a kinyerst. Fontos megjegyezni, hogy a talajok s ledkek kizrlag szervetlen
szelnvegyleteket hordoznak mrhet koncentrciban, s ezeknek jellemzen Se(IV) s
Se(VI) a kt legfbb sszetevjk.
27

Dernovics Mihly

Nvnyi eredet mintknl a vizes olds mind minsgileg, mind mennyisgileg teljes
mrtkben eltr szelnkinyerst eredmnyezhet mg azonos fajon bell is. Ennek az az oka,
hogy amennyiben a talaj szelntartalma kiugr, gy bizonyos tpus nvnyek (pl. napraforg)
kiemelked mrtkben veszik fel ezt az elemet (akr 900 g g-1 rtkig), de a feldstott
szervetlen szelnskat anyagcserjk nem hasznostja, s bellk ez a szelnmennyisg 100%ban kinyerhet egyszer vizes oldssal [LINTSCHINGER 2000]. Ahogy azonban kevesebb
szelnt hordoz talajrl szrmaz napraforgt vizsglunk, a metabolizlt Se arnya emelkedik, s
ezzel egytt cskken a knnyen kioldhat Se mennyisge. A hagymaflk eltr mdon
viselkednek: a fokhagyma egy bizonyos szelnelltottsgig a 85-90C fokos vzzel szinte 100%ban kioldhat, kiemelkeden rkellenes hats -glutamil-Se-metilszelenociszteint lltja el
[MCSHEEHY 2000, IP 2000], mg a tpoldatban/talajban rendelkezsre ll nagyobb szelnkoncentrci esetn megjelenik a Se-metilszelenocisztein s a fehrjkbe ptett gy vzzel nem
extrahlhat SeMet is, cskkentve a vizes olds hatsfokt [KOTREBAI 2000]. Ms hagymaflk (Allium tricoccum, WHANGER [2000]; vrshagyma, KOTREBAI [2000]) valamivel
nagyobb arnyban szintetizljk a fehrjbe ptett SeMet-t az elbb emltett, kzvetlenl
vzoldhat mdosulatokhoz kpest, gy a vizes kinyers hatsfoka ltalban 90% al cskken.
Az n. szeln-fitoremedicis nvnyek (Brassica ssp.) a hagymaflkhez kpest eltr Seanyagcseretjaik kvetkeztben ms eredmnyt adnak vizes ill. pufferelt kzeg extrakci
esetn: ZHANG s FRANKERBERGER [2001] ill. KOTREBAI et al. [2000] vzzel 60,472,6%-os kinyerst rtek el, fleg Se(VI), szabad szeleno-aminosavak s szrmazkaik
kimutatsa mellett; MONTES-BAYN et al. [2002a] TRIS-HCl puffer segtsgvel (pH=8,0)
46,5%-os hatsfokot tudtak felmutatni, de a kinyert mdosulatok jelents rszt nem sikerlt
azonostania.
A gyakorlati szempontbl taln legfontosabb szelntartalm mintt, a szelnnel dstott
lesztt is vizsgltk mr vizes ill. pufferelt kzeg (30 mmol l-1 TRIS-HCl, pH=7,0) kezelst
kveten. A vizsglatok sorn a kutatcsoportok a kvetkez, szinte tkletesen azonos
eredmnyre jutottak: a vizes extrakci (50-90C, 1-2 ra) s a pufferes kezels is (37C, 1 ra)
egyarnt kb. 10%-os kinyersi hatsfokot eredmnyezett, f komponensknt pedig Se-adenozilszelenohomocisztein mellett nmi szabad SeMet-t ill. a fermentci sorn felvett, de nem
metabolizlt szervetlen Se(IV)-t mutattak ki [CASIOT 1999; KOTREBAI 1999a s 2000; IP
2000; MCSHEEHY 2001a].
A vizes-pufferes extrakcit felhasznlhatjk mg egyrszt a vzoldhat Se-tartalm
peptidek-polipeptidek kioldsra az adott mintamtrixbl, amelyet legtbbszr a kinyert
molekulk SEC vagy SDS-PAGE elvlasztsa kvet: csiperkegombnl [VAN ELTEREN
1998], tengeri halaknl [NNING 2000] s szjnl [WANG 1996] ezzel a megkzeltssel
jellemeztk a minta Se-tartalm fehrjit, azok mrett s mintn belli eloszlst vizsglva.
Msrszt ez az extrakcis eljrs lehetsget adhat arra, hogy egyfajta elkezelsknt
eltvoltsuk a mintbl azokat a knnyen extrahlhat fmionokat, amelyek pl. enziminhibcin
keresztl akadlyoznk vagy meggtolnk a tervezett mdosulatanalitikai mintaelkszts
vgrehajtst [ABOU-SHAKRA 1997].
28

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

rdemes pr szt szlni a vizes-pufferes kezelsek sorn felhasznlt jrulkos vegyszerekrl


is. Enzimaktivitst gtl (katalz) s baktericid tulajdonsga miatt a NaN3, redukl s
antioxidns szerepe miatt a -merkaptoetanol, fehrjedenaturl hatsnak ksznheten a SDS,
szelektv protez inhibitor jellege miatt pedig a PMSF gyakori sszetevje az extrahl
oldatoknak.
2.3.1.3. Szerves oldszeres extrakci
Napjainkig mg nem azonostottak egyetlen hidrofb karakter Se-mdosulatot sem. Ennek
ellenre fleg a korbban mg nem tanulmnyozott mintk esetben tallkozni lehet olyan
irodalmi utalsokkal, amelyek kloroform-metanol 1:2 vagy 2:1 arny elegyvel vgrehajtott
extrakcit emltenek. WANG et al. szjabab [1996], ALSING PEDERSEN s LARSEN [1997]
s EMTEBORG [1998] fehr lhere CRM, MAHER et al. [1997] pedig szvkagyl s prhal
mintk esetben hasznltk az emltett keverket. Ezek kzl kizrlag a kagyl bizonyos
alkotibl (kopolty) sikerlt szmottev, az sszes Se-tartalom 30%-t kitev
szelnmennyisget kinyerni, a tbbi esetben 0,2-19% krl maradt az extrakcis hatsfok. Mivel
a kagylminta esetn ennek a frakcinak nem zajlott le mdosulatanalitikai vizsglata, nem
tudjuk, hogy valban lipofil Se-mdosulatok meglte, mintaelksztsi hiba, ill. esetleg a mr
korbban azonostott szeleno-aminosavak s szrmazkaik lipoproteinekbe val plse vltottae ki az egybknt szokatlanul nagy, lipidoldkony Se-frakci megjelenst. Mindenesetre az
irodalomban azta sem szerepel kifejezetten zsroldkony Se-mdosulatra utal nyom [LARSEN
2002], mi tbb, a szerves oldszeres kezels hatstalan volta miatt eltrbe helyezdtek az
egyb, pl. enzimes mintaelksztsre pt mdszerek [ALSING PEDERSEN 1997]. Ebbl
kifolylag a vzzel egyltaln nem, vagy alig elegyed oldszereket rendszerint a minta
lipidtartalmnak eltvoltsra hasznljk fel a szeln mdosulatanalitikai mintaelksztse
sorn; gy pldul KANNAMKUMARATH et al. [2002] kloroform-metanol eleggyel
zsrtalantottak brazil di rlemnyt, GMEZ-ARIZA et al. [2002] pedig diklr-metnnal vontk
ki kagylmintkbl a kromatogrfis elvlasztst zavar lipid vegyleteket.
Kln rdemes foglalkozni a vzzel jl elegyed metanollal s etanollal, amelyeket szmos,
egymstl eltr clzat, br hasonl mkdsi elven alapul mintaelksztsi lps sorn
vonhatnak be a szeln mdosulatanalitika fegyvertrba. A kzs alapelv arra a jelensgre pt,
hogy 40 V/V % krli alkoholkoncentrcit meghalad elegyben a fehrjk tbbsge
csapadkknt kivlik, s gy azok az oldattl centrifuglssal ill. mikroszrssel eltvolthatak.
Ezltal lehetv vlik a zavar, elemzsre nem sznt fehrjk pl. mintaelksztsnl
alkalmazott fehrjebont enzimek s nem hidrolizlt mintafehrjk levlasztsa
[VONDERHEIDE 2002], ill. ezzel ellenttes cllal, a szelnt tartalmaz teht vizsgland
fehrjk egy vagy tbblpses frakcionlt oldszeres csapadkkpzse [WANG 1996].
40 V/V %-nl kisebb koncentrcinl az etanolt ill. metanolt ltalban 0,1 mol l-1 HCl oldattal
elegytik; ezeknek az extrahl elegyeknek a hasznlata kis extrakcis hatsfokkal (10-14%) jr
egytt s a felhasznlsuk a vzoldhat mdosulatok pl. szabad Se-aminosavak kinyersben
merl ki [UDEN 1998, LE 1998, CASIOT 1999]. Br nhny csoport prblkozott azzal, hogy
29

Dernovics Mihly

kzvetlenl az arzn mdosulatanalitikban oly gyakori (lsd 5. Mellklet tblzata) 1:1


vagy 9:1 metanol-vz eleggyel hajtsa vgre valdi minta (fehr lhere CRM: ALBERTI [1995],
EMTEBORG [1998]; ezstsirly tojsa: JAKUBOWSKI [2001]) szelnmdosulatainak
extrakcijt, az elrt hatsfok jval kisebbnek bizonyult 50%-nl mg akkor is, amikor ssav
adagolsval prbltk nvelni a mvelettel kinyerhet szeln mennyisgt.
2.3.1.4. Az n. biolgiai pH-tartomnynl kisebb kmhatson vgzett extrakcik s kezelsek
2.3.1.4.1. Tmny (1 mol l-1 koncentrcinl tmnyebb) oldatok felhasznlsa
Taln a Se-mdosulatanalitika egyetlen ms terletn sem lehet ennl ellentmondsosabb
szakaszra bukkanni. A krds a kvetkez: tmny savak s lgok alkalmazhatak-e
mdosulatanalitikai mintaelksztsre? Mint ahogyan a 2.2.1. szakaszok rmutattak, a
saltromsav, a knsav, ill. a perklrsav biztosan nem; azonban a ssav megtlse mr korntsem
ilyen egyrtelm. Az anaerob krlmnyek kztt, 24 ra alatt, 110-120C hmrskleten
6 mol l-1 ssavval vgrehajtott fehrjehidrolzisre pl aminosav-analiztorok szmtottak szinte
az els automatizlt szerves kmiai mszernek s felhasznlsuk a mai napig tretlen. Miutn a
60-as vekben egyre nyilvnvalbb vltak a szeln bizonyos aminosavakba trtn plsnek
bizonytkai, ezt az akkor mr szles krben elterjedt mdszert is alkalmaztk s alkalmazzk a
mai napig is szelntartalm fehrjk hidrolzisre s aminosavaik vizsglatra. A hangsly a
fehrjkre helyezdik, mivel az eljrsnak gtat szabhat bizonyos szelnmdosulatok, klnsen
a szervetlen Se(IV)-Se(VI) egyensly instabilitsa, gy a ssavas hidrolzis nem teszi lehetv a
szervetlen mdosulatok llapotnak megrzst. gy amennyiben nem valsul meg a minta
fehrjetartalmnak elklntett vizsglata, a minta szelnmdosulatainak egy bizonyos hnyada
csupn sszes szervetlen Se-frakci-knt lesz jellemezhet. Ettl a htrnytl eltekintve a
ssavas hidrolzis egyik legfbb elnyeknt kell megemlteni, hogy a mikrohullm technika
bevezetse lecskkentette a 24 rs idignyt kevesebb, mint fl rra [CAVALLI 1995].
Az elmlt vekben szmos plda ltott napvilgot a hagyomnyos ill. tovbbfejlesztett
(mikrohullmmal vgrehajtott) ssavas hidrolzis felhasznlsrl biolgiai mintk szeln
mdosulatanalitikai vizsglatra. Szelnnel dstott tejsavbaktrium [CALOMME 1995b] s alga
[FAN 1998], delfinmj [CAVALLI 1995], szvkagyl s prhal [MAHER 1997], ill. ksrleti
llatok szervei [BEHNE 1998] esetben a mdszerrel 90% feletti kinyersi hatsfokot rtek el s
a szerzk szerint sikerlt megvni a szeleno-aminosavakat az emelt hmrsklet ltal elidzett
esetleges bomlstl s/vagy talakulstl. Mindezek ellenre a ssavas hidrolzis egyedli
dvzt volta tbb mint megkrdjelezhet. Nem vilgos, hogy a szerzk jelents csoportja
mirt nem fektet hangslyt a fenol alkalmazsra, amely elvileg alapvet fontossg az oxidci
elkerlse szempontjbl, klnsen az arra rzkeny SeCys esetben. Msok szerint sem a
fenol adagolsa, sem pedig a lnyegesen rvidebb ideig tart mikrohullm kezels nem kpes
biztostani a szeleno-aminosavak psgt [HUBER 1967, MACKEY 1982, SOCHASKI 2001,
KROLL 1998]. Mindezekbl az kvetkezik, hogy amg nincs kereskedelmi forgalomban szeln
mdosulatanalitikai clokra sznt CRM, amellyel minden ktsget kizrlag bizonytani lehetne
egyik vagy msik fl igazt, addig ktelyek ksrik majd a ssavas hidrolzis ezen a terleten
30

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

val felhasznlsnak jogosultsgt. Msrszt azokban az esetekben, ahol a fehrjket mg


rszben sem vlasztjk el a mtrixtl (pl. izmok elklntse a tbbi szervtl halmintnl,
MAHER [1997]), csak a nagy mennyisgben szervetlen szelnmdosulatokat hordoz (s gy a
ssavas kezels miatt mdosulatvltozst szenved) mintknl rhet el az elvrt (80-90%
feletti) extrakcis hatsfok (pl. szelnes tpllkkiegsztk: BHYMER [2000]).
2.3.1.4.2. Hg (1 mol l-1 koncentrcinl hgabb) oldatok felhasznlsa
Ezen csoport legjellegzetesebb tagja a triklr-ecetsav (TCA), amely rendszerint jghideg, 112 m/m %-os oldatban kerl felhasznlsra. Alkalmazsnak legfbb clja, hogy a pH s a
fehrjk hidratcis potenciljnak cskkentse rvn a nagy molekulatmeg fehrjket
csapadkknt levlassza az oldatbl, s gy azok eltvoltsa utn lehetv teszi a kis
molekulatmeg vzoldkony szelnmdosulatok (szervetlen sk, metilezett szrmazkok,
szabad aminosavak stb.) vizsglatt. Ebbl kvetkezik, hogy a TCA-s kezels egyfajta alternatv
lehetsget nyjt a szelntartalm komponensek molekulatmeg szerinti, kzelt jellemzsre,
ha sem ultraszrsi, sem pedig mretkizrson alapul mdszerek nem llnak rendelkezsre.
Ugyanakkor a sztvlasztst illeten a kis s nagy molekulatmeg kztti hatrvonal nem
egyrtelm, mivel mind a fehrjk mrete, mind pedig hidrofb karakterk meghatrozza
oldhatsgukat a TCA oldatban. ltalnos elvknt az mondhat el, hogy a fehrjk kzl a ht
aminosavnl rvidebbek mg biztosan nem csapdnak ki [NNING 1999]. A TCA alkalmazsi
terlete meglehetsen szles: Chlorella zldalga [FAN 1998, LARSEN 2001], tke- s lepnyhal
[NNING 1999], brazil di [VONDERHEIDE 2002], tejsavbaktrium [CALOMME 1995a] s
szjabab [WANG 1996] szerepel a kzlemnyekben. rdemes tovbb megemlteni, hogy a
TCA illkonysga lehetsget ad a mintbl liofilezssel trtn eltvoltsra, amely
tulajdonsg klnsen elnys a kis szelntartalm mintk ill. mintafrakcik kezelsnl.
Br a molekulatmegre nzve ugyan mg ilyen mrtkben sem nyjt informcit, ennek
ellenre ugyancsak hasznlatban van az ltalban 0,4 mol l-1 koncentrcij perklrsav s a
0,1-1 mol l-1 ssav a kis molekulatmeg szelnmdosulatok kinyerse cljbl. Mivel az utbbi
fleg mikrohullm berendezsben vgzett extrakci esetn mr 0,5 mol l-1 koncentrciban
is kpes megvltoztatni a Se(IV)-Se(VI) arnyt a mintban, gy a szervetlen Se-mdosulatokrl
tbbnyire csak sszes szervetlen adat gyjthet [MONTES-BAYN 2002a]. Ezek utn
felmerlhet a krds, mirt clszer egyltaln hg savakkal vgezni extrakcit, pldul egyszer
vizes kezels helyett. A vlasz abban rejlik, hogy a szabad vagy gyengn kttt aminosavakat s
szrmazkaikat a gyenge savak szignifiknsan nagyobb mrtkben szabadtjk fel a mintbl,
mind a biolgia pH-tartomnyra pufferelt oldatokhoz, mind pedig a hagyomnyos vizes
extrakcihoz kpest. Ezt a tnyt klnbz mintkon vgzett sszehasonlt kezelsek sora
igazolja, pl. szjafehrje [YASUMOTO 1988] szelnnel dstott leszt [CASIOT 1999],
szelnakkumull fitoremedicis nvnyek [MONTES-BAYN 2002b], tejsavbaktrium
[MICHALKE 2002], fehr lhere [EMTEBORG 1998], s brazil di [VONDERHEIDE 2002]
vizsglatnl.
31

Dernovics Mihly

Egyetlen irodalmi hivatkozs ismertet olyan vizsglati eredmnyeket, amelyeknl a hg


ssavoldattal vgzett extrakci kisebb extrakcis hatsfokot eredmnyezett a vizes extrakcihoz
kpest. LINTSCHINGER et al. [2000] bza- s lucernacsrkat neveltek szelntartalm
folyadkkultrs mdszerrel. Azt tapasztaltk, hogy a csramintkbl 0,1 mol l-1 koncentrcij
NaOH oldattal lehetett a legnagyobb mennyisg szelnt kinyerni, br az extrahlt mdosulatok
egy rszt nem sikerlt azonostani az eredeti komponensek degradcija vagy ismeretlen
szelnmdosulatok jelenlte miatt. A 0,1 mol l-1 koncentrcij ssavoldattal az sszes kinyert
szeln mennyisgt tekintve mg a vizes kezelshez kpest is kisebb hatsfok extrakcit
lehetett csupn elrni. Mindkt jelensg szokatlannak szmt, s rvilgt arra a tnyre, hogy
szeln mdosulatanalitikai mintaelksztsnl nem ltezik egyetemes megkzelts, ugyanis
minden mintatpusra egyedi elbrlst kell vagy clszer alkalmazni.
2.3.1.5. Enzimes hidrolzis fehrjebont s nem fehrjebont enzimek
A szelntartalm fehrjk vizsglatnak terletn hossz vtizedeken keresztl
egyeduralkodnak szmt, 6 mol l-1 ssavas hidrolzisen alapul mdszer megtlse a 80-as
vek elejn tbb tnyez egyttes fellpse miatt kedveztlen irnyba vltozott meg. Egyrszt
problmk merltek fel magval a ssavas hidrolzissel kapcsolatban, ugyanis
megkrdjelezdtt a szeleno-aminosavak psgnek megrzse az anaerob krnyezet s a fenol
jelenlte ellenre [HUBER 1967, MACKEY 1982]. Msrszt megjelent egy j igny, a szeln
biolgiai hozzfrhetsgnek megllaptsa klnbz lelmiszerekben, hiszen az tkezssel
ill. tpllkkiegsztkkel bejuttatott szelnmennyisget mg csak sszes szeln-knt tudtk
trstani az addigra mr jl ismert, szk szelntolerancia-tartomnyhoz. Mivel az emberi
emsztst nem lehetett csupn ssavas hidrolzissel modellezni, a korbbiaktl eltr mdszerre
volt szksg. Ez az j megkzelts vezetett el lassanknt a szeln mdosulatanalitika
kiterjesztshez az lettani-biokmiai terletrl a tpllkozstudomny s lelmiszer-kmia
berkeibe s ezen irnyvonal hvta letre az enzimes mintaelksztst, mely az els, szjababbal
foglalkoz kzlemny ta [YASUMOTO 1983], ltalnosan teret nyerve vlt szinte
egyeduralkodv.
Az elmlt 20 v hrom szakaszra oszthat mind a felhasznlt enzimeket, mind a konkrt
clkitzseket tekintve. A 90-es vek kzepig a biolgiai hozzfrhetsg megismerse mellett
trtek lndzst a kutatk s ebbl kifolylag az emberi emsztst prbltk modellezni, ltalban
tbblpses enzimes kezelsekkel, csak a fehrjebont vagy az sszes, emberi
emsztrendszerben szerepet jtsz enzimcsoportokra helyezve a hangslyt. A vizsglatoknl
nem szntak elsdleges szerepet a maximlis elmleti kinyersi hatsfok elrsnek, clul a
felvehet-e a szeln az adott lelmiszerbl, s ha igen, milyen mrtkben tpus krdsek
megvlaszolst tztk ki. Ezen tpus problmafelvets a mai napig tetten rhet, s br
jelentsge egy idben lecskkent, jbli eltrbe kerlsnek lehetnk szemtani az elmlt 1-2
vben.
1995-ben jelent meg az a mondhatni ttrnek szmt kzlemny, amely a 2. szakasz
eljvetelt vltotta ki. GILON et al. [1995] az azta tbb mint flszz alkalommal idzett
32

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

munkjukban vezettk be az egylpses enzimes mintaelksztst a szeln mdosulatanalitika


tmakrben, felknlva egy viszonylag egyszer, s ami a msik legfbb jdonsgot jelentette
nagy kinyersi hatsfokot megclz mdszert. Rszben nekik, rszben pedig a cikkk utn
piacra kerl j mszereknek ksznhet, hogy egsz garmadjt ismertk meg a klnbz
szerves szelnmdosulatoknak az 1995-tl kb. 2002-ig tart kutatsi idszakban. Ezt kveten
lttak napvilgot a 3. genercis szeln mdosulatanalitikai kzlemnyek, amelyek egy szinttel
feljebb, az aminosavaktl s szrmazkaiktl a szelntartalm fehrjk s egyb
makromolekulk szintjre helyezve a mdosulatanalitikt, ismt ms enzimeket vetnek be az j
cl, a szelntartalm fehrjk szekvencijnak megllaptshoz.
Mindhrom szakaszban, mindezen ksrletekkel prhuzamosan az adott mintk vizsglata
sorn felmerl, sajtsgos mintaelksztsi problmk megoldsra a fehrjebont enzimek
mellett fel-feltntek a ms osztlyokba tartoz enzimek is. Az utbbiak termszetesen csak
kzvetve, a fehrjebont enzimek feladatt segtve jrulnak hozz a mintaelksztshez, pldul
a hidrolizland fehrjkhez trtn hozzfrs javtsn keresztl. Ugyanakkor a jelenleg fut
kutatsi terleteket figyelve nem kizrt, hogy a kzeljvben fszereplkk is ellphetnek egyegy j, nem fehrjeeredet szelnmdosulat kapcsn.
2.3.1.5.1. Az enzimes mintaelkszts ltalnos jellemzi
Az emberi emszts modellezsn s a biolgiai hozzfrhetsg-felvehetsg becslsn
kvl az enzimes mintaelksztsek mindazon tulajdonsgokkal jellemezhetek, amelyekkel a
mdosulatanalitikai szempontok alapjn kvnt kmletes, de mgis hatkony mdszernek
rendelkeznie kell. Alkalmazsuk nem jr nagy hmrsklet-emelssel: rendszerint 30-50C
fokon, teht jval a hatrrtknek kikiltott 70C alatt zajlik le. A gyomormkdst modellez
ksrleti rendszerektl eltekintve nem ignyelnek szlssgesen savas vagy lgos kmhatst,
mivel pH-optimumuk leggyakrabban az n. biolgiai tartomnyban tallhat. Hasznlatukhoz
nincs szksg klnleges mszerekre, ltalban a termosztlhat rzgp jelenti az egyetlen,
nem felttlenl minden laboratriumban elrhet berendezst. A mikrohullmmal trstott,
6 mol l-1 ssavas hidrolzisen alapul mdszerhez kpest azonban htrnyknt emlthet az
olykor nagy idigny (egszen 36-64 rig), nmelyik enzim viszonylagos drgasga, ill. a minta
szemcsemretnek eloszlsra val rzkenysg, amely nem kellen portott-homogenizlt minta
vizsglata esetn kis kinyersi hatsfokban s nagy mrsi bizonytalansgban lthet testet. A
nem ltalnosan jellemz alkalmazsi elnyk s htrnyok az adott enzimeknl kln-kln
kerlnek bemutatsra.
2.3.1.5.2. Enzimes hidrolzis fehrjebont enzimek alkalmazsa az emberi szervezet emsztsi
folyamatainak modellezsre
A fehrjebont enzimek mindazon esetekben sikeresen jrulhatnak hozz a
szelnmdosulatok mintbl trtn kinyershez, amelyekben a minta biolgiai eredet,
felttelezheten jelents mrtkben tartalmaz fehrjket s ezek a fehrjk kzvetlenl
hozzfrhetek az enzimek szmra. A felsorolt s az elz szakaszban emltett ltalnos
33

Dernovics Mihly

felttelek egyttes teljeslse a kulcs a sikeres mintaelksztshez; ekkor ugyanis a megfelel


hmrsklet, pH s kevertets belltsa utn az enzim tpustl fggen a minta fehrjit
aminosavakra vagy kisebb-nagyobb peptidekre hidrolizlja. A legfontosabb feladat a clnak
megfelel enzim kivlasztsa.
Az emberi szervezet a teljes rtk fehrjket 95-98%-ban aminosavakig kpes lebontani.
Ebbl indultak ki YASUMOTO s trsai [1983, 1988], amikor elsknt a vilgon enzimes
mintaelksztst terveztek meg szelntartalm szjafehrje-izoltum vizsglatra. Tbblpses
mintakezelsket 1 m/m %-os pepszinoldatban indtottk, a gyomorra jellemz pH=1 s
hmrsklet (37C) belltsval. Ezt kveten a mintt a fehrjebont aktivitssal is rendelkez
enzimkeverkkel, a hasnylmirigyben termeld pankreatinnal (1 m/m %, pH=7,5), majd vgl
pronzzal (1 m/m %, pH=7,5) kezeltk. A felsorolt enzimek kzl a pepszin s a pankreatin
fknt peptidekre, mg a pronz (nem szubsztrtspecifikus, endo- s exopeptidzokat is
tartalmaz, fonalas baktrium ltal ellltott enzimkeverk) aminosavakig bontotta a
szjafehrjt. A mintaelkszts folyamata 63 rt vett ignybe. A kezelseket dializl csben
hajtottk vgre, gy vgig nyomon kvethettk a hidrolzis sorn felszabadul kis
molekulatmeg, szelntartalm kztes- s vgtermkek mennyisgt. A ksrletek alapjn
egyrtelmv vlt, hogy a szjafehrje szelntartalma fleg SeMet formjban tallhat meg.
CREWS et al. [1996] ftt tonhalat vetettek al in vitro emsztrendszeri bontsnak.
Kezelsk kt lpsbl llt: elszr pepszines kzegben (1 m/m %, pH=2,0; + 0,15 mol l-1
NaCl), majd pankreatint is tartalmaz oldat hozzadsval (1,5 m/m %, pH=6,9; + 0,15 mol l-1
NaCl, 0,5 m/m % amilz s 0,15 m/m % epes), sszesen 8 rs idtartammal modelleztk az
emberi szervezet mkdst. A viszonylag rvid kezels s a kifejezetten aminosavakig bont
enzim hinya miatt az elksztst kveten csak szervetlen Se(IV)-et sikerlt azonostani a
mintaelegybl, szeleno-aminosavakat nem.
THOMAS et al. [2001] slt hs, szak-amerikai (teht szelnt valsznleg kimutathat
mennyisgben tartalmaz) pirts s klnbz gyrtktl szrmaz szelntartalm
tpllkkiegsztk vizsglatt vgeztk el az elz kt csoport mdszereinek vegytsvel:
dializl csben, ktlpses in vitro emsztrendszeri modellezssel becsltk fel az
lelmiszermintk szelntartalmnak biolgiai hozzfrhetsgt. Ez utbbi mrszmaknt a
dializl csbl eltvoz szeln mennyisgt vettk alapul, s nem trekedtek tkletes
hidrolzisre. Eredmnyeik alapjn a slt s a pirts 40-50%-ban, mg a tpllkkiegsztk 70100%-ban tartalmaznak hozzfrhet szelnt, amely az elbbiek esetben fknt SeMet, mg az
utbbiaknl SeMet s Se(VI) formjban volt jelen.
MARTN et al. [2001] szelnnel dstott lesztt mestersges gyomornedvvel (1 m/m %
pepszin, pH=1,8; 0,9 m/m % NaCl) prbltak lebontani, egyetlen 4 rs lpsben. Mint vrhat
volt, kizrlag a pepszin nem volt kpes teljes hidrolzist vgrehajtani, gy az sszes
szelnmennyisg csupn 11%-t tudtk azonostani SeMet s Se(IV) formjban.
Az elzekben ismertetett eredmnyek mindegyike ugyanazon rtkelssel jellemezhet:
teljes hidrolzishez felttlenl szksg van a nem specifikus enzimek hasznlatra, mivel csak
gy biztosthat kell mrtkben a szelnmdosulatok kinyerse s azonostsa.
34

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.3.1.5.3. Enzimes hidrolzis fehrjebont enzimek alkalmazsa egylpses mintaelksztsi


mdszerekhez
Olykor tbb napos mintaelkszts, kztes beavatkozsi lpsek (pl. dializl folyadk s
pufferek cserje, j enzimek hozzadsa, akr tbbszri liofilezs kzbeiktatsa) sokasga,
sterilits hinyban az idben elnyl kezels sorn esetlegesen fellp mikrobiolgiai
tevkenysg ltal okozott mdosulattalakuls lehetsge mindezen tnyezk miatt csak
valban indokolt esetben clszer az emberi emsztst modellez, rendszerint dializlssal
egybekttt mdszerekhez folyamodni. Msrszt az lelmiszer-fehrjkrl nincs okunk
felttelezni, hogy lebontsuk csak rszlegesen trtnne meg az emberi szervezetben: ltalban az
elfogyasztott fehrjk mindssze 2-5%-a kerli el az emsztst [GANONG 1990], s kifejezetten
az emsztenzimek hozzfrst lehetetlenn tev trszerkezettel csak szlssges esetekben (pl.
a scrapie, a kergemarhakr s embereknl a Kreutzfeld-Jacobs szindrma kialakulsrt felels
prionfehrjk lelmiszerbe val kerlsnl) tallkozhatunk. Amennyiben teht sikerlne
egyetlen lpsben, az emberi szervezetben akr el sem fordul enzimmel vagy enzimekkel
lebontani a mintafehrjket, gy egyszerre hrom clt is elrhetnnk: (a) valsabb kpet
kaphatnnk a minta szelntartalmnak biolgiai hozzfrhetsgrl, (b) a szinte teljes bonts
kiemelked kinyersi s azonostsi hatsfokot tenne lehetv ill. (c) rvidebb tehetnnk a
mintaelkszts folyamatt.
Termszetesen ez csupn az elmlet. A gyakorlatban az lelmiszerek nem csak fehrjbl
llnak, sszetett, vz-lipidek-sznhidrtok-lelmi rostok-fehrjk-svnyi anyagok- s egyb
mtrixot alkotnak, amelyek lebontsra a szervezet klnbz enzimek szzait veti be teht az
in vitro kimutatott, esetlegesen kicsiny szelnkinyersi hatsfok nem felttlenl jelenti a
hozzfrhetsg hinyt. A szeln mdosulatanalitika portott alapminti (leszt, hagymaflk,
lisztek) lelmiszer vagy tpllkkiegszt voltuk ellenre komplexitsukban mg gyakran
tvol llnak a valdi lelmiszermintktl, de ugyanakkor lehetv teszik egyrszt az egyszerbb
mintaelksztsi megkzeltst, msrszt az lelmiszer-alapanyagok vizsglatra ptve a ksz
lelmiszernek a fogyasztk szelnnel val elltsban betlttt szerepnek felmrst.
Az elmondottak alapjn rthet, hogy a GILON et al. [1995] ltal bevezetett, egylpses
enzimes mintaelkszts mirt vlhatott alapmdszerr a szeln mdosulatanalitikban.
Eljrsuk lnyege a kvetkez: a kellen homogenizlt s portott minthoz a Streptomyces
griseus fonalas baktrium ltal kivlasztott pronz E (vagy a gyrttl fggen aktinz E
vagy XIV-es tpus protez /EC 3.4.24.4 s 3.4.24.31/ nven ismert) enzimet keverik nagy
feleslegben, az enzim pH- s hmrskleti optimumnak belltsa (pH=7,4-8,8; 37-40C)
mellett. A nagy felesleg azt jelenti, hogy 100 mg mintra 10 mg enzim jut; ez az arny valban
risi mind az enzim eredeti gyakorlati felhasznlsa, a DNS-RNS kivonatok
fehrjementestsnl felhasznlt koncentrcik [DAVEY 1981], mind pedig az l
szervezetekben tapasztalhat, akr 1:10000 enzim:szubsztrt (ml)arnyhoz kpest. Az ok
nyilvnval: in vitro (teht nem optimlis) krnyezetben kell elrni a lehet legtkletesebb
fehrjehidrolzist, emsztsi szempontbl elksztetlen, olykor szrts s egyb mveletek
miatt koagulldott-irreverzibilisen kicsapdott mintafehrjken. A pronz enzim azonban a
35

Dernovics Mihly

rendelkezsre ll 20-24 ra alatt a minttl fggen valban elrheti a kzel 100%-os


hidrolzist (4. Mellklet tblzata). Mindennek htterben az ll, hogy nem egyetlen, hanem a
gyrttl fggen akr 10, eltr aktivits (endo- s exo-, protez + peptidz, valamint N- s Cterminlis fell is hast) fehrjebont enzimrl van sz [YAMSKOV 1986]; ezek eredje egy
nem szubsztrtspecifikus, nagy aktivits keverkben (crude enzim) lt testet, amely nhny
klnleges szerkezet fehrjtl (pl. keratin: BERMEJO-BARRERA [1999]) eltekintve valban
szinte minden tpus fehrjt hidrolizlni kpes. Nmely gyrt (Sigma-Aldrich) a S. griseus
ltal kivlasztott extracellulris enzimkeverkbl a legfbb komponenst, egy szerin protezt
izollva, kalcium-acett ksrvegylettel forgalmazza, kb. 4-5 U mg-1 szilrd ksztmny
aktivitssal. Ms cgek (pl. Merck) meghagyjk az sszes, fehrjebont aktivitssal rendelkez
enzimet, s hrom nagysgrenddel nagyobb sszestett aktivitst rnek gy el (4000 U mg-1).
Mindezek ellenre nmileg meglep mdon a kzlemnyek 95%-t a kisebb aktivits
Sigma ksztmny hasznlata jellemzi, amelyet a tblzatban a Sigma-Aldrich katalgus
nevezktana szerint feltntetett protez XIV tlslya tmaszt al.
A pronz hasznlatn alapul egylpses mintaelkszts robbansszeren terjedt el az
emltett kzlemny utn, amelyhez nagymrtkben jrult hozz az a szerencss egybeess is,
hogy 1997-1998 krl szmos nyugat-eurpai s egyeslt llamokbeli laboratrium indtott el
szelndstsi ksrleteket hagymaflk s leszt felhasznlsval. Ennek htterben az 1996ban lezrult, 10 vig vezetett CLARK-tanulmny sikere llt, mely szerint a szelnnel dstott
leszt fogyasztsa szignifiknsan cskkentette bizonyos rktpusok (pl. a prosztata- s tdrk)
elfordulst [CLARK 1996, SCHRAUZER 2000]. Az elksztett, kilogrammos nagysgrendben
rendelkezsre ll, kiemelked szelntartalm mintkat sztkldtk a tmval foglalkoz 4-5
kutatlaboratriumnak, ahol az ezt kveten felfut feltrsi-azonostsi ksrletek eredmnyei
1999 s 2001 kztt tbbtucatnyi (ignyes) kzlemnyben ltttek testet (4. Mellklet tblzata).
E tblzat adataival kapcsolatban rdemes felhvni a figyelmet nhny rdekessgre ill.
magyarzatra szorul jelensgre. Egyrszt szembetn a szelnnel dstott, teht trendi
szereppel (mg) csupn alig jellemezhet mintatpusok, s legfkppen az leszt trnyerse. Ez
teljes mrtkben rthet: knnyen elllthat tesztmintrl van sz, szmtalan kisebb-nagyobb
cg gyrtja s kszt belle tablettzott tpllkozskiegsztt, s a mr emltett CLARKtanulmny [1996] is ennek fogyasztsra ptett. Elemzse egyszerre szolgl ltalnos (pl.
mdszerfejlesztsi) mdosulatanalitikai clokat s a bizonytottan rkmegelz tulajdonsg
htternek kidertst. Tovbbi jellegzetessg az 1999-2000 krl hirtelen felfut, egyre tbb
mdosulatot azonost kzlemnyek szma, amely a szeln mdosulatanalitika eddigi
legsikeresebb korszakt jelezte, lvn ekkorra rett egysges egssz a mintaelkszts, az
elvlasztstechnika (fleg a RP-HPLC) s a szelektv detektlshoz szksges mszerezettsg
(ICP-MS, ESI-MS). Ugyanakkor e hrom kzl az els kett mg jcskn br hinyossgokkal,
hiszen a mai napig tallkozni lehet kis kinyersi hatsfokkal jellemzett mintkkal. A tblzat
utols oszlopa kln figyelmet rdemel: a felsorolt s azonostott mdosulatok kb.
hromnegyede csak kis szm kutatcsoport rszre rhet el, ebbl kifolylag nem zrhat ki,
hogy a gyakran nem kielgt azonostsi arny htterben a kereskedelmi forgalomba mg nem
36

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

bocstott, standard vegyletek hinya ll. Msrszrl a csupn egyetlen elvlasztsi eljrst
hasznl mdszerek alkalmazsa sorn szinte lehetetlen kizrni a klnbz, akr ismeretlen
szelnmdosulatok egyttes elcijbl fakad, tves azonostst s mennyisgi meghatrozst;
gy nem vletlen, hogy pl. a szelnnel dstott leszt elemzst bemutat kzlemnyek
meglehetsen hasonl (tbbnyire 80% feletti) azonostsi hatsfok-tartomnyt jeleznek akkor
is, ha 3, s akkor is, ha 8 mdosulat adja ki ezt az rtket.
A pronz mkdsre nzve optimlis pH-rtket ltalban a 6-9-es pH-tartomnyokban jl
hasznlhat szervetlen vagy szerves pufferekkel lltjk be (4. Mellklet tblzata). Ugyanakkor
tallkozni lehet olyan kzlemnyekkel is, ahol vlheten a mintaelksztst kvet
mrstechnika kvnalmainak megfelelen nem nvelik meg a mintaoldat iontartalmt a
pufferekkel bevitt skkal, s csupn ioncserlt vizes kzeget (pH~5,5-6) hasznlnak. Szemlyes
tapasztalatom szerint a nagy fehrjetartalm mintk pronzos bontsa sorn a puffereletlen kzeg
pH-ja nhny ra alatt akr 2-3 egysggel is cskkenhet, amely a mintaoldatot kivonja az enzim
optimlis pH-tartomnybl, s gy cskken kinyersi hatsfokhoz vezethet. Ebbl fakadan a 4.
Mellklet tblzatban puffereletlen desztilllt vizes kzeggel vgrehajtott ksrletekre utal
referencik esetben feltntetett, olykor az tlagnl kisebb extrakcis hatsfokok mgtt ez a
jelensg is llhat.
Idkzben a pronz mellett egyb fehrjebont enzim(keverk)ek is feltntek a szeln
mdosulatanalitikai mintaelkszts porondjn. Kzs jellemvonsuk, hogy nem
szubsztrtspecifikusak, s legtbbjk korbbi (s jelenlegi) felhasznlsi terlete a molekulris
biolgiban DNS-RNS kivonatok fehrjementestse ill. klnbz szennyez (=kros
aktivits) vagy feladatukat elvgzett enzimek hidrolzissel trtn inaktivlsa. A baktrium
eredet szubtilizin (ms nven VIII-as tpus protez; forrs: Bacillus licheniformis; EC
3.4.21.14), a penszek ltal termelt proteinz K (forrs: Tritirachium album; EC 3.4.21.64), s
egy Novo enzimkeverk, a Flavourzyme (forrs: Aspergillus oryzae) klnbz mrtkben
bizonyult alkalmasnak a mintk szelntartalmnak kinyersre, s az azonostott vegyletek
arnya is eltrnek addott. Fontos kiemelni, hogy ez utbbi mrszm (az n. Column
Recovery) nagyban fgg a rendelkezsre ll mrrendszertl s standard vegyletektl, gy a
kutatcsoportok ltal kzlt rtkekben val eltrs nem felttlenl utal a mintaelkszts
sikeres/sikertelen voltra. Ugyangy, maga a kinyersi hatsfok megllaptsa sem tesz mindig
lehetv sszehasonltst, mivel a mintaelkszts tartalmazhat olyan, nem ltalnosan
alkalmazott lpseket (pl. centrifuglst kvet ultraszrs, TCA csapadkkpzs), amelyek akr
10-20%-kal cskkenthetik az emltett rtket.
A felsorolt enzimeket tbben is sszehasonltottk abbl a clbl, hogy ki lehessen alaktani
egy ltalnosan alkalmazhat eljrsi rendet. MORENO et al. [2001] kagyl- s
osztrigamintkon prbltak ki szubtilizin s pronz enzimeket. A csoport ltal prhuzamosan
hasznlt pufferek egyike (foszftpuffer) a Sigma-Aldrich ltal gyrtott pronz ksztmnyben
tallhat Ca2+-skkal csapadkot kpzett, gy ksrleteiket kizrlag szubtilizinnel folytattk.
Mivel az sszehasonltst nem vezettk vgig teht nem prbltk meg a pronzt ms, pldul
TRIS-pufferrel alkalmazni, vagy pldul Merck ksztmnyre vltani , nem lehetett vgs
37

Dernovics Mihly

kvetkeztetst levonni a kt enzim hasznlhatsgrl. GMEZ-ARIZA et al. [2002] adalkolt


kagylmintkat kezeltek VIII-es tpus protez s pronz enzimekkel; eredmnyeik szerint egyik
sem volt tkletesen alkalmas a ngy tanulmnyozott s minthoz adalkolt szelnmdosulat
(SeCys2, SeMet, Se(IV), Se(VI)) kinyersre, amelynek az alkalmazott clean-up technika s az
enzimekhez gyrilag kevert ksrvegyletek sszefrhetetlensge volt a legfbb oka.
MONTES-BAYN et al. [2002] proteinz K s pronz sszevetst vgeztk el indiai mustr
szeln-fitoremedicis nvnymintkon; a kinyersi hatsfok s az azonostott mdosulatok
terletn a proteinz K valamivel jobbnak bizonyult a pronz enzimhez kpest. Ugyanakkor
ebben a ksrletben puffereletlen kzegben zajlott le az enzimes kezels, amelyet a
vgeredmnyek kirtkelsnl nem vettek figyelembe.
2.3.1.5.4. Enzimes hidrolzis egyb, nem fehrjebont enzimek alkalmazsa
A mintk lett lgyen sz lelmiszerrl, fitoremedicis vagy konyhakerti nvnyrl nem
csak fehrjbl llnak: teljesen nyilvnval tny. Trstsuk ehhez azt a megfigyelst, hogy a
fehrjebont enzimekkel vgzett enzimes mintaelksztsek nem mindig vezetnek kiemelked
(a frakcik sszes szelntartalmnak megllaptsn alapul) szelnkinyersi eredmnyekhez. A
szakirodalomban fellelhet, legkevsb sikeres, XIV-es tpus protez hasznlatn alapul
mdosulatanalitikai mintaelkszts szelnnel dstott tejsavbaktrium minta vizsglathoz
fzdik, amelybl MICHALKE et al. [2002] mindssze kb. 8%-os kinyersi s 27%-os
azonostsi arnyt tudtak felmutatni. A httrben kt ok bjhat meg: egyrszt ltezhetnek idig
mg nem azonostott, nem fehrjkhez ktd szelnmdosulatok, amelyeket a korbban
felsorolt enzimek nem kpesek polimereikbl vagy bizonyos sejtalkotkrl leszaktani, msrszt
elkpzelhet, hogy a valban fehrjkben fellelhet szelnmdosulatokhoz nem tudnak az
alkalmazott enzimek hozzfrni, mivel valamely mintakomponens ennek gtat szab. Rendszerint
kt olyan sszetev kerl reflektorfnybe, amely felels lehet a kinyersi hatsfok
cskkensrt: nvnyi, baktrium s gomba eredet mintknl a sejtfal, amely a ksbb mintul
szolgl alapanyag (pl. frissen szedett kalapos gomba) aprtsi-szrtsi-rlsi s egyb
kezelstl fggen tbb-kevsb pen maradhat, ill. nvnyi s llati eredet mintknl a
lipidtartalom. gy nem sokkal a korbban emltett, 2. genercis mintaelksztseket elindt
kzlemny [GILON 1995] utn napvilgot lttak a sejtfal- s lipidbont enzimek hasznlatra
pt mintaelksztsi mdszerek.
Elsknt 1999-ben szelnnel dstott leszt vizsglatnl kerlt sor a mr jl bevlt pronz
mellett egy lesztgomba eredet lipidbont enzim (VII-es tpus lipz, EC 3.1.1.3; forrs:
Candida rugosa) alkalmazsra [CASIOT 1999], mghozz egyszerre, ugyanazon pufferelt
oldatban. Elvileg a mintban lv lipidek bontsra kt okbl lehet szksg: egyrszt a
kromatogrfis oszlopra juttatott mintaelegyben a lipidek jelenlte terhelheti leginkbb a
rendszert, msrszt a minta tartalmazhat lipoproteineket, melyek fehrjebont enzimmel trtn
hidrolzishez azokat elszr hozzfrhetv kell tenni. A GILON et al. [1995] kzlemnyhez
kpest legalbb ugyanolyan mrtkben idzett munka azonban meglehetsen sok krdst hagyott
lezratlanul, mivel nem vgeztk el pontosabban nem emltettk a kt enzim ltal (egymstl
38

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

fggetlenl) elrhet kinyersi hatsfokot, gy nem derlt ki, hogy valban szksges volt-e
egyltaln a lipidbont enzim bevetse. Radsul a kt enzim ugyanabban az oldatban trtn
hasznlata felveti annak a lehetsgt, hogy a nem szubsztrtspecifikus fehrjebont enzim a
msik enzimet szubsztrtknt kezelve annak aktivitst cskkenti. Br mdszerkkel mg
lehetett ksbbi kzlemnyekben is tallkozni [CASES 2002], az 1999 utn, szelnnel dstott
leszt vizsglatrl publiklt tbb tucat cikk mr nem emlti a lipz hasznlatt. Teht
lesztnl nem azonban a nla nyilvnvalan nagyobb mennyisgben lipidet tartalmaz tengeri
eredet lelmiszereknl igen. GMEZ-ARIZA et al. [2002] kagyl- s rkmintk esetben csak
lipzzal kombinlt fehrjebont enzimes kezelssel tudtak kielgt kinyersi hatsfokot elrni.
A CASIOT-kzlemny [1999] vezette be a lipzhoz kpest jval megalapozottabb mdon
s kzzelfoghatbb eredmnyre jutva a sejtfalbont enzimeket is a szeln mdosulatanalitika
terletre. Drizelzt, egy kalapos gombaflbl (Basidiomycetes ssp.) kivont crude
enzimkeverket hasznltak fel abbl a clbl, hogy az eredenden nvnyi s gomba
protoplasztok ksztsre alkalmazott, tbbek kzt laminarinz, xilanz, pektinz, amilz,
protez s cellulz aktivitssal rendelkez ksztmnnyel az esetleg sejtfalhoz kttt
szelntartalm komponenseket vagy mdosulatokat felszabadtsk. A szerzk alapossgra
jellemz, hogy PMSF adagolsval biztostottk a drizelzbl ill. esetleg magbl az lesztbl
szrmaz fehrjebont enzimek gtlst, megbzhat alapot szolgltatva a klnbz enzimek
ltal elrhet kinyersi hatsfokok sszehasonltshoz. A sejtfalbont enzim segtsgvel
szignifiknsan nagyobb mennyisg szelnt szabadtottak fel az lesztbl az ioncserlt vizes ill.
pufferelt kzeggel vgzett extrakcikhoz kpest, gy indirekt mdon bizonytottk a szeln
jelenltt nem csupn fehrjkhez kapcsold molekulkban is. A rendelkezsre ll
mrstechnika azonban mg nem tette lehetv szmukra a sejtfalbontsbl szrmaz frakci
tovbbi vizsglatt, azonostatlanul hagyva a minta szelntartalmnak kb. 15%-t kitev
komponenseket. WROBEL et al. [2002] baktrium (Arthrobacter luteus) eredet, ugyancsak
PMSF adagolsval kiegsztett lizl enzimkeverkkel trtk fel a mintul szolgl, szelnnel
dstott lesztt, hogy fehrjehidrolzis nlkl tanulmnyozhassk a szelnanyagcsere kztes
vegyleteit. MICHALKE et al. [2002] szelnnel dstott tejsavbaktrium mintaelksztsnl a
sejtfal szerkezetnek megfelelen lizozim enzimet trstottak pronz enzim hasznlatval. A
kezelsek sorn a kt enzimmel kln-kln s egytt is vgrehajtottk az extrakcis
mveleteket, amelyek az sszes szelnre vettve kiemelked (85-105%), mg azonostott
szelnmdosulatokra nzve rendkvl kicsi (8-12%) hatsfokra vezettek. Az elbbiben a pronz,
az utbbiban a lizozim alkalmazsa sorn nyertk ki / azonostottk a legnagyobb mennyisg
szelnt; a kt enzim egyttes alkalmazsa nem jelentett egyrtelm elnyt. Mindezen
eredmnyek mgtt a nem tkletes hidrolzis, a tlzottan kis szm, kereskedelmi forgalomban
elrhet szelnmdosulat-standard ill. valsznleg az elzetesen nem kezelt (pl. szrts, rls
elmaradsa) minta enzimekkel szembeni rszleges ellenllsa mutathat ki.
LARSEN et al. [2001, 2003] elegns s egyszer eljrs segtsgvel hidaltk t azt a
problmt, amely az ugyanazon elegyben alkalmazott enzimek kapcsn merlt fel. Szelnnel
dstott leszt vizsglatnl szekvencilis enzimes mintaelksztst lltottak ssze, amelyben
39

Dernovics Mihly

els lpsknt a Novo dn cg ltal gyrtott Novozym 234 (-glkozidz) sejtfalbont enzimet
adtk a minthoz, amelyet 3 ra utn az ugyancsak Novo Flavourzyme 1000L szles
szubsztrtspektrummal rendelkez fehrjebont enzimkeverk hozzadsa kvetett. Br a
szerzk nem kzltk az egyenknti kezelssel elrt extrakcis hatsfok mrtkt, az enzimek
alkalmazsnak egymsra ptsvel elsk kzt tettk lehetv a kt bontsi fzis akr klnkln vgrehajthat optimalizlst.
Az emberi emsztst modellez (1. genercis) ksrletek tlnyom rsze is ugyan ms
clkitzsbl kiindulva, nem az elbbi gondolatmeneteket kvetve, de a vgs mdszert tekintve
hasonl vgkifejletre jutott: a pepszin mellett egyb, nem fehrjebont enzimek is bevezetsre
kerltek. A valamennyire letszer modell fellltshoz ugyanis figyelembe kellett venni, hogy
az elfogyasztott lelmiszerre enzimcsaldok egsz sora tmad, amelyek nem felttlenl a
szelntartalm komponenseket veszik clba, de a komplex lelmiszermtrix lebontsval
hozzfrhetv tehetik azokat. rdekes kihvs mindez a mrstechnika szemszgbl is, hiszen
minl tbb monomer, vzoldhat molekula, ion stb. szabadul fel s kerl a vizsgland
szelnmdosulatokkal egy oldatba, a felvitt mintaelegy annl jobban terheli meg a
kromatogrfis oszlopot vagy egyb, elvlasztsi feladatokat ellt berendezst s nveli meg a
detektls sorn tapasztalhat interferencia mrtkt. Leggyakrabban a kemnyt-, lipid- s
fehrjebont aktivitssal is rendelkez, hasnylmirigy-kivonatbl ksztett pankreatin szerepel a
kzlemnyekben az sszetett enzimes kezels tagjaknt: szjamintnl [YASUMOTO 1983,
1988], slt hsnl s szak-amerikai pirtsnl [THOMAS 2001], s ftt tonhalnl [CREWS
1996] ltalban semlegeshez kzeli pH-rtken kerlt felhasznlsra, sokszor epesavakkal egytt
(a lipidfzis emulgelsa cljbl). Az utoljra emltett tonhalminta esetben a pankreatinhoz
hasonl pH-optimummal rendelkez s a szervezetben is a msik enzimkeverkkel egyidben
aktv hasnylmirigy a-amilzt is adagoltak a kutatk az emsztst vgz enzimelegyhez. A
korbban emltett problma, az enzimek egyttes alkalmazsbl fakad esetleges
aktivitscskkents az emsztst modellez ksrleteknl nem jelent gondot, mivel mindez az
emberi szervezetben is elfordul s a kinyersi hatsfok maximalizlsa ezeknl a ksrleteknl
nem kpezi a vizsglat cljt.
2.3.1.6. Ktelyek az enzimes mintaelkszts kapcsn j mdszerek keresse
A maguk el lehetsg szerint teljes kinyerst s azonostst clul tz kutatcsoportok
1995 utn egymst kveten, kzlemnyek tucatjaiban tettk le voksukat a pronz vagy ms,
nem specifikus fehrjebont enzim(keverk)ek felhasznlsa mellett, olykor 100% kzeli
kinyersi hatsfokokat s szelnmdosulat-azonostsi rtkeket bemutatva. Ennek ellenre tbb
jel is utalt arra, hogy legalbbis bizonyos mintk esetben a nem kielgt azonostsi hatsfokok
htterben nem a hinyz szelnstandardok, vagy az enzimek fehrjkhez trtn
hozzfrsnek gtlsa, hanem egyrtelmen a tkletlen enzimes fehrjehidrolzis ll.
MONTES-BAJN et al. [2001] szelnes lesztbl ksztett tpllkkiegszt elemzsnl a
proteinz K-val trtn bontst utlagosan aminopeptidz-M segtsgvel tettk teljess.
MORENO et al. [2001] osztrigk vizsglatnl knytelenek voltak a nagy feleslegben adagolt
40

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

szubtilizin enzimmel ktszer egyms utn kezelni ugyanazt a mintt, hogy kielgt extrakcis s
azonostsi hatsfokot rjenek el. Az utbbi esetben viszonylag nagy pufferkapacits
(0,1 mol l-1 TRIS-HCl, pH=7,5) oldatban, llati eredet (=sejtfalat nem tartalmaz) mintval
zajlott le a reakci, teht az esetleg tlagnl nagyobb lipidtartalomtl eltekintve semmi sem
gtolta a fehrjehidrolzist. VONDERHEIDE et al. [2002] zsrtalantott brazil di proteinz Kval trtn bontsnl a kevsb komplex mintamtrix ellenre sem tudtak a 83%-ot kitev
kinyersi hatsfok mellett 11%-nl nagyobb mennyisg szelnmdosulatot azonostani. A
felsorolt kzlemnyek szerzi ksrleteik sorn arra utal jeleket talltak, hogy az alkalmazott
enzimek a mintafehrjket nem hidrolizltk teljes egszben aminosavakig. Mindez rszben
rthet, ismerve a kt emltett enzim (a proteinz K s a szubtilizin) hastsi tulajdonsgait,
melyek nem felttlenl biztostjk a szerzk ltal elvrt hidrolzisfokot. Ugyanakkor a GILON et
al. [1995] kzlemnyben felvezetett pronz hasznlatakor sem mindig sikerlt 90-100%-ban
kinyerni a szelnmdosulatokat a mintbl (lsd 4. Mellklet tblzata), gy valban felmerlt az
igny egy j, nem az enzimes kezels (s nem a 6 mol l-1 ssavas hidrolzis) alapjain nyugv
fehrjehidrolzis mdszerre.
Vgl WROBEL et al. [2003] ismertettek egy olyan megoldst, melynek lnyege a
metnszulfonsav 4 mol l-1 koncentrcij, az oxidci elkerlse vgett -merkaptoetanollal
kiegsztett oldatnak hasznlata. Szelnnel dstott lesztmintn s zsrtalantott brazil din
vgzett ksrleteik szerint a legfeljebb 16 rs, melegtett s refluxszal visszavezetett
metnszulfonsavas elegy szignifiknsan nagyobb mennyisg SeMet-t szabadtott fel a
mintkbl, mint a prhuzamosan vgzett, elszr proteinz K, majd XIV-es tpus protezzal
vgzett szekvencilis enzimes kezels. Ugyanakkor arra is fny derlt, hogy a mdszer a
hmrsklet emelse s az erteljesen redukl kzeg miatt alkalmatlan a szervetlen
szelnmdosulatok (s minden bizonnyal a SeCys) llapotnak megrzsre, s a SeMet egy
rsze, kb. 2%-a biztosan krosodik a folyamat kzben. Mindezekbl az kvetkezik, hogy ezen j
mdszer csak rszmegoldst knlt az esetlegesen fennll problmkra, s tovbbi fejlesztsek
szksgesek ahhoz, hogy valdi alternatvt knljon a ma szles krben elfogadott s hasznlt
enzimes mdszerek helyett.
2.3.1.7. Mintaelkszts a szeln fehrjeszint mdosulatanalitikai vizsglataihoz
Az eddigiekben megszokottnak s ltalnosnak belltott, szeln mdosulatanalitikai
mintaelksztsi lpsekben volt kt kzs pont: egyrszt szilrd mintbl indultunk ki,
msrszt egszen az alkot monomerekig vagy szabadon ll vegyletekig, aminosavakig,
szrmazkaikig vagy szervetlen skig hatoltunk le a molekulris szervezds-biokmia szintjein.
Mindez nem felttlenl szksges, mi tbb: vannak esetek, amelyekben egyltaln nem clszer
hiszen eggyel magasabb szervezdsi szinten, pldul a fehrjk kztt ott tallhatak a
funkcival rendelkez szeln-enzimek s a nem funkcionlis (vletlenszer) szelnbeplsen
tesett fehrjk; az elbbiek kivtel nlkl SeCys-ben, az utbbiak SeMet-knt hordoznak
szelnt. Ezen molekulk megismershez, jellemzshez hozztartozik p llapotban, hidrolzis
nlkli vizsglatuk is. Csak magban a humn lettani kutatsok s a velk prhuzamos
41

Dernovics Mihly

llatksrletek is egsz sort szolgltatjk azon mintknak, melyek szelntartalm, s


ismeretlen szereppel rendelkez fehrjket tartalmaznak. Ezekben az esetekben a fehrjk
hidrolzise csak rszt kpezheti az tfog vizsglatoknak; az p fehrjk molekulatmegmeghatrozson (SDS-PAGE, 2D-IEF, SEC, MALDI-TOFMS) s szerkezetvizsglaton (NMR,
ESI-MS/MS) jutnak keresztl abbl a clbl, hogy mkdsk s az l szervezetben betlttt
funkcijukat megismerhessk [BEHNE 1998, OBISKI 2000, CHEN 2002]. Fontos tisztzni,
hogy mindenflekppen hatrterletre rtnk, hiszen lelmiszeripari szempontbl lnyegtelen,
milyen funkcival rendelkezik az adott, telknt elfogyasztott fehrje, ugyanakkor a bioanalitika
s lelmiszer-kmia berkeiben kifejlesztett mdosulatanalitikai mintaelkszts rtkes
hozzjrulsknt nyilvnulhat meg a szeln lettani vizsglatnak kapcsn.
Az elbb lert elemzsek belpszintjt azon fehrjevizsglatok kpezik, ahol lehetsg
szerint egyetlen lpsben, kzelt molekulatmeg meghatrozs utn kerl sor a szelntartalom
megllaptsra, s nincs md (vagy rtelme) a mintt szolgltat rendszert befolysolni az
esetlegesen megvltozott krlmnyek ltal okozott vltozsok kimutatsnak cljbl vagyis
a mintbl kell visszafel kvetkeztetni a kiindulsi rendszerek klnbzsgre s azok okaira.
Jellegzetes plda erre az anyatej vizsglata, ahol a szelntartalm fehrjket s kisebb
molekulkat SEC-HPLC vagy C(Z)E ill. IEF ltal trtn elvlasztst kveten a kzvetlenl
vagy pl. ETV berendezsen keresztl csatolt ICP-MS detektlja, azok szelntartalma alapjn
[MICHALKE 1997, 1998]. Ezeknl a mintknl az elkszts tbbnyire csupn centrifuglssal
trtn zsreltvoltsban merl ki.
2.3.1.8. Zrsz a szeln mdosulatanalitikai vizsglataihoz
A mintaelksztsi mdszerek ismertetse utn rdemes pr szval utalni a szeln
mdosulatanalitika fejldsnek azon rdekes jelensgre, hogy az azonostott mdosulatokat
illeten alig nhny v mr elegendnek bizonyult a korbbi mrsek eredmnyeinek akr teljes
kr fellvizsglathoz s megkrdjelezshez. Mint ahogy a 4. Mellklet tblzatnak
eredmnyei jelzik, a leginkbb tanulmnyozott mintbl, a szelnnel dstott lesztbl tbb
kutatcsoport is kimutatta a SeCys2 jelenltt ugyanakkor egy 1999-ben elkszlt tanulmny
szerint az lesztgenom nem tartalmazza az ezen aminosav szintzishez szksges szakaszokat
[KRYUKOV 1999]. Erre a tnyre elszr LARSEN et al. [2003] hvtk fel a mdosulatanalitikai
kutatsokkal foglalkoz szakemberek figyelmt, utalva arra, hogy a korbbi valsznleg tves
azonostsok htterben a SeCys2 ltalban visszatartssal nem rendelkez, kromatogrfis
futtats holttrfogatban ms, akr ismeretlen komponensekkel egytt eluld viselkedse
llhat. Ez az esemny sszhangot mutat azokkal a megfigyelsekkel, hogy a mdosulatanalitikai
vizsglatok detektlsi feladatra a csupn elemszelektv mszerek olykor mr nem nyjtanak
biztos megoldst, s eltrbe kerl a molekulaszint azonostsra alkalmas kszlkek
hasznlata ott, ahol az anyagi httr vagy a nemzetkzi kapcsolatrendszer mindezt lehetv
teszi [MCSHEEHY 2003b].

42

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.3.2. Mdosulatanalitikai mintaelksztsi eljrsok arznre


2.3.2.1. ltalnos ismertetjegyek
Instabil oxidcis llapot hrom sz, amely taln legjobban jellemzi az arzn
mdosulatanalitikai mintaelkszts ltalnos problmjt. Radsul ezen jelensg a napjainkig
megismert, kb. 25 As-mdosulat kzl sajnos pont a leginkbb mrgezk krben tapasztalhat:
a szervetlen As(III) As(V), a metilezett MMA(III) MMA(V) ill. DMA(III) DMA(V)
ktirny egyenslyi talakuls fleg az utbbi szrmazkok krben gyors s ami taln a
legfontosabb teszi az egsz krdskrt toxicitsban rendkvli mrtkben klnbz
mdosulatok kztt jtszdik le. Mg az As(III) s As(V) kztti tmenet gyakorlatilag az arzn
mdosulatanalitika hajnaltl ismert, s a tanulmnyozsa rvn szerzett tapasztalatok segtenek
tbbek kzt ivvizeink As-mentestsben (pl. az As(V) mdosulat nanoszrssel vagy fordtott
ozmzissal trtn eltvoltsn keresztl; BRANDHUBER s AMY [1998], URASE [1998],
NING [2002]), addig a metilezett mdosulatok instabilitsa s egyltaln: a jval mrgezbb
hrom vegyrtk MMA(III) s DMA(III) jelenlte az emberi szervezetben s vizeletben
vadonatj megfigyels [LE 2000, GONG 2002]. A hromrtk metilezett szrmazkok
oxidcijval (egyben teht vegyrtkvltozssal is) jr reakcii az ltalnos mintaelksztsi
krlmnyek kztt nhny ra alatt vgbemehetnek, gy amennyiben jelenltkre szmtani
lehet, klnleges figyelemre van szksg [GONG 2001].
Eltekintve az utbbi hrom vben felfut, a humn arznanyagcserhez kapcsold
vizsglatoktl s mintktl (vrszrum, vizelet, stb.), a legtbb arzn mdosulatanalitikai mrs
hrom mintacsoportra sszpontosul: ntz-, iv- s szennyvizekre, talaj-, iszap- s
ledkvizsglatokra ill. tengeri eredet mintkra s az azokbl kszlt lelmiszerekre. A hrom
clterlet kzl az els kett kzs tulajdonsga, hogy gyakorlatilag csak a kt szervetlen
arznszrmazkot (As(III) s (V)) hordozzk, gy mintaelksztsk sorn az egyik legfbb
kihvsnak a kt szrmazk kztti redox tmenet gtlsa szmt. Ugyanakkor a talaj- iszap- s
ledkvizsglatok mintaelksztse kln gg fejldtt, mivel e kt mdosulat egyttes
kinyerse meglehetsen bonyolult, tbblpcss extrakcis mdszereket, n. SEP(T) /sequential
extraction procedures(techniques)/ eljrsokat tesz szksgess. A harmadik g klnleges
szerepet tlt be az arzn mdosulatanalitikban: az ehhez a csoporthoz tartoz mintkban
fedeztk s fedezik fel napjainkban is az j arznmdosulatok 95%-t, s ennek a csoportnak
tulajdonthat, hogy az arzn mdosulatanalitika a higany utn taln a legnagyobb
sajtnyilvnossgot kap mdosulatanalitikai terletnek szmt. Mindennek oka przaian
egyszer: kizrlag a mdosulatanalitika kpes feloldani a ltszlagos ellentmondst a tengeri
lelmiszerek olykor kiemelked arzntartalma s az ennek ellenre hinyz mrgezsi
problmk kztt. Az elmondottakbl fakadan a mintaelksztsek s a hozzjuk kapcsold
vizsglatok a legutols mintacsoportnl kt f irnyvonal mentn zajlanak: olykor elegend a
mintbl kinyerni s meghatrozni csupn a mrgez(bb) szervetlen arznszrmazkokat (akr
indirekt mdon, hidridfejlesztsi kpessg vizsglatn keresztl), amely megkzelts viszonylag
kis kinyersi hatsfokkal jrhat egytt; mskor cl a lehetsg szerint teljes mrtk azonosts.
43

Dernovics Mihly

Termszetesen a kt megkzelts mind mdszereiben, mind mintikban t- meg tszvi


egymst, gy elklntsk az elmlt vek kzlemnyeiben mr kevss rvnyesl.
2.3.2.2. Mintaelkszts nem ignyl esetek: folykony mintk az arzn mdosulatanalitikban
A folykony mintkat a szilrd mintkhoz kpest nem szksges elkszteni mr
amennyiben a mintaelkszts fogalma alatt a meghatrozand komponens mrhet llapotba
trtn hozatalt rtjk, amely rendszerint oldatba vitel formjban testesl meg. Ugyanakkor
nhny alapvet mveletet mindenkppen el kell vgezni a mintval, amelyek kztt a
legltalnosabbnak a 0,45 mm szr segtsgvel trtn tiszttsi (s elvileg sterilizlsi) lpst
vehetjk, ugyanis az esetlegesen jelen lv szilrd szemcsk, csapadkok ill. sejtek
lerakdsukkal eltmhetik mind a kromatogrfis oszlopot, mind pedig a porlasztrendszereket.
Ugyanakkor felttlenl emltst kell tennnk a minta trolsrl is, hiszen a minta stabilitshoz
nagymrtkben hozzjrul szrst nem felttlenl kveti azonnal a mrs folyamata. A
korbban emltett, redox egyenslyban lv szervetlen s metilezett As-mdosulatok stabilitst
alapveten 4 tnyez, a hmrsklet, a mdosulatok koncentrcija, a pH s a mintamtrix
hatrozza meg. ltalnos szablyknt az mondhat el, hogy 20 mg ml-1-nl nagyobb
koncentrciban, htben (egyben teht a fnytl is vdve), fagyaszts nlkl (0 s 4C fok
kztt), ioncserlt vzben oldva a mdosulatok standardjai ill. a szrt talaj-, iv- s
szennyvizekben tallhat mdosulatok kielgt mrtk stabilitssal brnak tbb hten keresztl
[JKAI 1998, LINDEMANN 2000]. Egyedli kivtelnek az oxidcira rendkvli rzkeny
DMA(III) szmt, amely az elzekben lert trolsi krlmnyek kztt sem stabilabb 2-3
napnl hosszabb ideig, s DMA(V) mdosulatt alakul [GONG 2001]. Vizeletmintk esetn a
hrom vegyrtk DMA s MMA mg htben trolva sem stabilabb egyetlen napnl, mi tbb, a
DMA(III) rk alatt 100%-ban t vegyrtkv oxidldik. Amennyiben teht a vizeletbl e kt
mdosulat meghatrozsa a cl, gy a mrseket lehetsg szerint in situ kell elvgezni; egyb
mdosulatoknl az akr nhny hetes, htszekrnyben val trols sem okoz szignifikns
vltozst. A tartstszerek hasznlatt clszer elkerlni, mivel nem javtjk rdemben a
mdosulatok stabilitst, mg az oxidci ellen adagolt vegyletek (pl. aszkorbinsav)
hozzjrulhatnak az t vegyrtk mdosulatok redukcijhoz, megvltoztatva az eredeti
egyenslyt s ismeretlen, a standardokhoz kpest eltr retencis idej komponensek
kialakulshoz vezethetnek [LARSEN 1993, EDWARDS 1998, HALL 1999].
rdemes kiemelni, hogy az oldatok fagyasztsa rontja mind a vizeletmintk, mind pedig a
valdi mintkbl szrmaz extraktumok As-mdosulatainak kinyersi rtkeit, gy trolsra nem
clszer 0C foknl kisebb hmrskletet vlasztani [FELDMANN 1999].
Kiemelked vastartalommal rendelkez talaj- s ivvizek mrsnl a mintt felttlenl
savanytani rdemes abbl a clbl, hogy meg lehessen elzni a vas-oxi-hidroxidok s az arzn
egyttes kivlst. Az oldat kmhatst ltalban ssavval, pH=1-2 lltjk be; a minta tlzott
savanytsa azonban kerlend az As(III)-As(V) egyensly rzkenysge miatt [FELDMANN
1999, RAESSLER 2000].
44

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

Legvgl szlni kell a kifejezetten a mrrendszer ltal ignyelt mintaelksztsi


lpsekrl. Amennyiben vizeletmintkat kzvetlenl, kromatogrfis elvlaszts nlkl, ICP-MS
berendezs segtsgvel elemezzk, gy elkerlhetetlen a minta legalbb 1:5 arny hgtsa,
mivel a vizelet kb. 1 m/m %-os NaCl tartalma az tlagos felbonts MS kszlkek esetn szinte
lehetetlenn teszi az egy izotpos 75As mrst a 75-s tmegszmon jelentkez ArCl+
tbbatomos interferencia miatt [LINTSCHINGER 1998]. Egyb, pl. ICP-OES vagy AAS
berendezsek hasznlatnl ez a problma nem lp fel [BECKER-ROSS 2000]. A vizeletmintk
hgtsa az ArCl+ zavars mrsklse mellett kzvetett mdon, a mtrixban lv oxidl
vegyletek koncentrcijnak cskkentse rvn az As(III) mdosulat stabilitshoz is
hozzjrul [LARSEN 1993].
2.3.2.3. A metanol-vz oldszer-pros s a szerves oldszerek szerepe szilrd mintk elksztse
sorn
Ahogy a tudomny mai llsa szerint a szeln mdosulatanalitikai mintaelksztse szinte
elkpzelhetetlen enzimes mdszerek nlkl, gy az arzn mdosulatanalitika sem emlthet meg
a metanol s vz klnbz arny elegyvel vgzett extrakcik nlkl. Az els, kifejezetten
arzn mdosulatanalitikai mintaelkszts cljbl alkalmazott metanolos kezels 1988-ban
trtnt bemutatsa ta [BEAUCHEMIN 1988] gyakorlatilag nem ltezik olyan szerves eredet,
arzntartalm minta, amelynek mintaelksztse sorn ne vgeztk volna el legalbb
sszehasonltsi cllal ezt az extrakcis mveletet. A kezels htterben azon ismeretnk
hzdik meg, hogy az l szervezetben az arzn detoxikci gyakorlatilag teljes folyamata
fehrjkhez kapcsoltan zajlik le: fehrjk szlltjk, enzimek metilezik s transzportfehrjk
segtsgvel zajlik le a vizeleten keresztli kivlaszts is [STBLO 2002]. A fehrjk
trszerkezett irreverzibilisen megvltoztat metanolos kezels felszabadtja s oldatba viszi a
detoxiklsi folyamat klnbz szintjein idz arznmdosulatokat, gy azok a mintbl
kinyerhetv vlnak.
Elmletileg. A gyakorlat azonban azt mutatja, hogy a kinyersi hatsfokot mind a minta
jellege, mind pedig a benne fellelhet mdosulatok kpesek befolysolni. Ennek htterben fleg
egy sszetteli paramter, a minta zsrtartalma ll, sszefggsben a hidrofb
molekulaszakaszokkal rendelkez As-mdosulatokkal. A kinyersi hatsfok nvelsnek
rdekben teht clszer lehet a metanol-vz kettssel vgzett extrakcit a minta zsrtartalmnak
eltvoltst-elklntst clz szerves oldszeres kezelssel sszekapcsolni. Mindez azrt is
fontos, mert a metanolos extrahl oldszerelegy emulzit kpezhet a minta zsrtartalmval,
amely rendkvli mrtkben megneheztheti a mintaelkszts folytatst, s szignifikns
rtkben cskkentheti az elrhet kinyersi hatsfok rtkt [YBEZ 1995]. Emiatt a kezels
legtbbszr gy zajlik le, hogy a mintt elszr kloroform-metanol meghatrozott arny
elegyvel extrahljk rzgpben vagy ultrahangos kszlkkel, majd centrifugls segtsgvel
kileptik a szuszpenzibl a mintaszemcsket s a fellszt metanol-vz hozzadsa utn
vlaszttlcsrben osztjk meg. Az elklnts utn szerves fzisban marad arzn mennyisgt
az oldszer elprologtatsa utn rendszerint hagyomnyos roncsolssal, sszes arznknt teht
45

Dernovics Mihly

mdosulatanalitikai vizsglatok nlkl adjk meg; az utbbi elemzsek trgyt a metanol-vz


fzis arzntartalma kpezi, rendszerint a metanol vkuumbeprlssal trtn eltvoltst
kveten [lsd 5. Mellklet tblzata].
Amennyiben a minta sszettele jelents mennyisg lipidtartalom hjn nem indokolja
szerves oldszerek alkalmazst, gy a mvelet gyakorlatilag egyms utn tbbszr legfeljebb
tszr megismtelt, metanol-vz eleggyel elvgzett extrakcira s centrifuglsra korltozdik.
Ezt kveten az sszetartoz fellszkat egyestik s a fent lert elv alapjn jrnak el vele. A
metanol-vz arnyt illeten nem ltezik ltalnos recept, ugyanis figyelembe kell venni az
elemzend minta vztartalmt is. Tisztn metanolt csak akkor rdemes alkalmazni, amennyiben a
minta friss s kezeletlen, teht sem hagyomnyos, sem pedig fagyasztva szrtson nem ment
keresztl ekkor ugyanis a minttl fggen akr 80-90%-ban jelen lv vz hgtja ki
megfelel mrtkben a metanolt [MCSHEEHY 2000, SZPUNAR 2000]. 100%-ban metanollal
vgzett extrakcira csak a viszonylag korai kzlemnyek sorban tallni pldkat [YBEZ
1995, VELEZ 1995, SHIOMI 1995]; mindez arra utal, hogy a hidratlt fehrjktl knnyebb
elvlasztani s kinyerni az arznmdosulatokat. ltalban az 1:1 V/V krli (40:60, 50:50,
60:40) metanol-vz arny bizonyul a legjobb vlasztsnak, ugyanakkor nem ritka az olyan
kzlemny, ahol az 1:9 elegytst talltk a legjobbnak [JKAI 1998] ill. olyan eset is
elfordul, hogy egyltaln nem tapasztaltak eltrst a klnbz arny oldszerelegyeknl, a
teljes, 0-100 V/V % kztti metanol tartomnyt figyelve [MCSHEEHY 2001b]. Ehhez hasonl
kvetkeztetsre jutottak LAGARDE et al. [1999], akik kzlemnykben a BCR-CRM 627
arzn mdosulatanalitikai tonhal CRM hitelestsi krelemzse sorn tapasztalt rdekessgek
kztt emltettk meg a metanollal s metanol nlkl vgzett mintaelksztsek azonos
kinyersi hatsfokt. Taln a legszokatlanabb s legkevsb a metanol hasznlatval elrhet
kinyersi hatsfokkal kapcsolatos indokot a HELGESEN s LARSEN szolgltattk [1998]:
arzntartalm talajon termelt rpk vizsglatnl az extrahl oldszerelegyben csupn
antibakterilis cllal hasznltak 10 V/V % metanolt.
Az 5. Mellklet tblzata a klnbz (tengeri, szrazfldi, lelmiszer stb.) mintk
tekintetben nyjt ttekintst az alkalmazott oldszerarnyokrl s az elrt extrakcis
hatsfokrtkekrl. Kizrlag olyan kzlemnyek kerltek bemutatsra, melyeknek szerzi a
legfbb alkot (pl. AsB) vagy lehetsg szerint az sszes extrahlt mdosulat mennyisgi
meghatrozsra trekedtek. Mindez sajnos nem minden esetben jrt egytt sszes Asmrleg fellltsval, illetve a kzlt rtkek alapjn nhol meglehetsen sszetett feladatnak
bizonyult a kinyersi vagy azonostsi arny kiszmolsa: a szerzk nha mg a minta sszes
As-mennyisgt sem kzltk egyrtelm mdon. A felhasznlt (esetenknt leghatkonyabb)
oldszer V/V arny oszlopban feltntetett rtkek rtelmezsnl figyelembe kell venni, hogy
az adatok a minthoz adott oldszerek arnyt jelzik, nem pedig a minta vztartalmval korriglt
rtket, gy az rtkek a kzvetlen sszehasonltshoz nem minden esetben szolgltatnak alapot.
A kzlemnyek jelents rszben a metanol-vz oldszeres extrakci mellett ms fajta (pl.
enzimes) mintaelkszts is helyet kapott; ezekben az esetekben a feltntetett tblzati rtkek
csak az elbbi mdszer segtsgvel elrt hatsfok-rtkeket tartalmazza. Amennyiben nem a
46

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

metanol-vz mdszer bizonyult a leginkbb hatkony kezelsnek, gy az azonostott


mdosulatok sora a vgs mdszer felhasznlsval kimutatott tpusokat tkrzi.
Mindenkppen magyarzatra szorul a tblzat Azonostsi arny, a kinyert As %-ban
oszlopa. A mdosulatanalitikai kzlemnyekre sajnos jellemz, hogy a szerzk gyakran
elmulasztjk megadni az n. Column Recovery rtket, amely az azonostott s mennyisgileg
meghatrozott mdosulatok arnyt mutatja a minta sszes vagy extrakcival kinyert
arzntartalmhoz kpest. Ennek ismeretben elvileg egyszeren eldnthet, hogy az adott
mdszer a mintaelksztstl kezdve a kalibrciig, detektlsig stb. milyen mrtkben s
milyen minsgben volt kpes a vizsglt minta mdosulatainak azonostsra. A gyakorlat
azonban kiss bonyolultabb kpet fest ezen rtk megadsrl. Egyrszt a klnbz
mdosulatokat a rendelkezsre ll standard vegyletek eltr tisztasga, koncentrcijuk
pontossga, a mintaelkszts ltal csatolt szrstnyez, a kromatogrfis elvlaszts sorn
kialakult cscstisztasguk ms s ms bizonytalansgi rtkkel esik latba a vgs mennyisgi
meghatrozs sorn, nem is beszlve bizonytalansguk fggsrl, amelyet az adott mintban
kimutathat koncentrcijuk rendkvli mrtkben befolysol. Talajok, ledkek s magasabb
rend nvnyi mintk esetben, amelyek szinte kizrlag szervetlen As-mdosulatokat
hordoznak, a 100% krl bejegyzs valdi eredmnyt takarhat. llatoknl s alacsonyabb
rend nvnyeknl azonban a mai napig hzilag knytelen a kutat szintetizlni vagy ismert
mintbl izollni s tiszttani az As-mdosulatok szmos kpviseljt feltve, hogy egyltaln
tudomst szerzett valamilyen ton-mdon arrl, hogy mely klnlegesebb mdosulat vrhat az
ltala vizsglt mintban. A rgta ismert, s standardjaikat tekintve remnytelenl elrhetetlen
arzenocukrok mellett tipikus llatorvosi lnak szmt a macskacpa izomszvetbl ksztett,
DORM-1 CRM-et 1996-ban felvlt DORM-2 esete. Ez a CRM 1999-ig hls, 100% krli
azonostsi arny mintnak szmtott [ACKLEY 1999], majd 2000-ben FRANCESCONI et al.
[2000] kimutattk, hogy egy korbban ismeretlen AsB szrmazk alkotja a minta
arzntartalmnak jelents rszt. Ettl kezdve az AsB-2-nek vagy TMAP-nek nevezett
mdosulatot DORM-2-bl s az idkzben ugyancsak AsB-2-t hordoz CRM-knt azonostott
TORT-2-bl preparatv kromatogrfis mdszerekkel nyertk ki [MCSHEEHY 2001b, KIRBY
2002], s a 100% krl rtk valsgg vlhatott. Termszetesen ezen eredmnyek is
rendelkeznek tfutsi idvel, teht a mr bejratott elvlasztsi mdszereket csak lassan
vltjk fel a mr AsB-2-t is minsgileg meghatrozhatv tv eljrsok: pldul PARDOMARTNEZ et al. [2001] kzlemnyben a DORM-2 mint 100%-ban AsB-t hordoz CRM-knt
kerl minsgbiztostsi alkalmazsra. Ugyanakkor ms mintafajtknl, gy algknl, hnroknl
az arzenocukrok annyi j vlfaja vlik ismertt napjainkban is, hogy a DORM-2 s az AsB-2
esete valsznleg mg vekig analg, azonostsi siker nlkli pldnak szmt majd ezen
mintk krben, krdsess tve a 100%-os mdosulatazonostst.
Az 5. Mellklet tblzata jl tkrzi, hogy a metanollal vgzett oldszeres extrakci a
mintk jelents rsznl kielgt kinyersi hatsfokhoz vezet. Ugyanakkor ez a mdszer kt,
napjainkban egyre fontosabbnak nyilvntott terleten rszben elmaradottnak, fejlesztsre
vrnak szmt; e kt terlet a vezrelhetsg-automatizlhatsg ill. a rvid idigny kezels
47

Dernovics Mihly

kialaktsa. A hagyomnyos metanolos kezelst rzgp segtsgvel hajtjuk vgre, majd ezt
kvet centrifuglssal s manulis fziselvlasztssal fejezdik be a mintaelkszts, s
minttl fggen akr 10-12 rt is ignybe vehet. Az elmlt vekben kt olyan technolgia
bevezetsre is sor kerlt, amelyeknek az elz mdszer helybe kellett volna lpnie: az n. ASE
(Accelerated Solvent Extraction, gyorstott oldszeres extrakci; ritkbban PLE, Pressurized
Liquid Extraction, nagynyoms folyadk extrakci) s a MAE (Microwave Assisted Extraction,
mikrohullmmal tmogatott extrakci).
Az ASE 1999-ben bukkant fel az arzn mdosulatanalitika terletn [MCKIERNAN 1999].
A mdszer lnyege abban rejlik, hogy az ltalban 3-11 ml trfogat extrahl ednyben
elhelyezett mintt a kivlasztott oldszereleggyel nagy nyomson (3-21 MPa) s hmrskleten
(150-200C) extrahljk [GALLAGHER 2001]. Az ASE kszlk a kezels sszes jellemzjt
(idtartam, hmrsklet, nyoms, oldszercsere) automatikusan szablyozza s lltja be,
kiemelked reproduklhatsgot biztostva. Mindezek ellenre az ASE technolgia mgsem (ill.
taln inkbb mg nem) tudott elterjedni, ugyanis extrakcis hatsfokban nem kpes
tlszrnyalni ellenlbast, a hagyomnyos metanolos extrakcit [MCKIERNAN 1999], ill. ha
mgis sikerlne, akkor rendszerint metanol nlkl, 100%-ban ioncserlt vizet alkalmazva, amely
viszont a duzzadsra hajlamos mintk esetben a kszlk eldugulst vltja ki [GALLAGHER
2001, HEITKEMPER 2001]. Radsul az ASE kielgt kinyersi hatsfokot tbbnyire csak
100C-nl nagyobb hmrskletnl tud elrni, ahol viszont egyrtelm As(III)-As(V) talakuls
kvetkezik be [SCHMIDT 2000]. A msik automatizlt technolgia, a MAE sem bizonytotta
tt ervel, hogy kpes lenne a hagyomnyos oldszeres extrakci szerept tvenni a
mintaelkszts terletn: HELGESEN s LARSEN [1998] ill. LARSEN et al. [1998b] csak
meglehetsen krlmnyes eljrssal, a mikrohullm energia tlzott elnyeldse ellen vd,
ltaluk ballasztvznek nevezett s mintnknt tbbszr cserre szorul vzkpennyel tudtk
elrni, hogy a csupn 75 W teljestmnnyel zemel mikrohullm kszlk ne hevtse tl a
mintt; ebbl fakadan a kezels idignye sszevethet mrtkv vlt a kivltand
hagyomnyos eljrssal. Ezen a technikai jelleg problmn ACKLEY et al. [1999] csak
mintatarthelyenknt szablyozott hmrsklet s nyoms, igen kltsges berendezs
segtsgvel tudtak tlpni, s egy tengeri hal CRM-bl 100% krli extrakcit elrni. KIRBY s
MAHER [2002] RSM statisztikai eljrssal kt CRM-en optimalizltk a mikrohullm
berendezs segtsgvel, 1:1 V/V arny metanol-vz eleggyel vgrehajtott arznextrakci
krlmnyeit, melyet ezek utn tz msik CRM mintaelksztsre alkalmaztak vltoz
sikerrel: a mintk egy rszbl csak 66-76%-os kinyerst rtek el.
sszefoglalskppen elmondhatjuk, hogy a rzgpben vagy ultrahangos kszlkben
metanol-vz oldszereleggyel vgzett szilrd-folyadk extrakci minden htrnya ellenre
stabilan rzi vezet helyt az arzn mdosulatanalitikban, s a modernebb eljrsok kizrlag
az automatizltsg terletn tudjk megszortani. Ugyanakkor vilgoss vlt az a tny is, hogy a
minta jellege s eredete dnt mrtkben, kinyersi hatsfokra vettve akr 20-30%-ban is kpes
befolysolni az akr vgletekig optimalizlt mintaelksztsi folyamat vgeredmnyt.
48

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2.3.2.4. Enzimes mdszerek felhasznlsi terlete az arzn mdosulatanalitikban


A szeln s az arzn mdosulatanalitikai enzimes kezelsek kztt alapvet klnbsg
fedezhet fel. Amg a szelntartalm mintknl az enzimes eljrs kzvetlenl a
szelnmdosulat kinyerst clozza meg, pldul a kovalens (peptid)kts szeleno-aminosavak
fehrjkbl trtn le- ill. kihastsval, addig az arzntartalm mintk esetben ez a behats
kzvetett: a kezels a minta mtrixt, a fbb alkot komponenseket bontja le, hogy fizikailag
hozzfrhetv tegye az arznmdosulatokat. Ebbl fakadan nincs szksg sem a nem
specifikus (szles szubsztrtspektrum), sem pedig a nagy tisztasg, nagy aktivits (egyttal
kltsges) enzimek hasznlatra. Mivel az arznmdosulatok nem monomerekknt tallhatk
meg az l szervezet valamely alkotjban, a nem tkletes enzimes hidrolzis nem rejti
magban a szelnmdosulatoknl megismert, klnfle oligomerek kialakulsa miatt fellp
azonostsi hibk lehetsgeit.
Az arzn mdosulatanalitika terletn az enzimes kezelsek csupn a 90-es vek elejn
jelentek meg. BRANCH et al. [1994] ht klnbz tengeri hal mintaelksztst vgeztk el a
hagyomnyosnak mondhat kloroform-metanol-vz extrakcival s ezzel prhuzamosan nagy
fehrjetartalm mintrl lvn sz tripszines bontssal. Eredmnyeik nem tkrztk
egyrtelmen a tripszin alkalmazsnak elnyeit, mivel a halak fajtjtl fggen jobb vagy
rosszabb kinyersi hatsfokot sikerlt elrni a szerves oldszeres extrakcihoz kpest, s az
enzimes eljrs idignye az utbbi tbbszrsnek addott. LAMBLE s HILL [1996] az elz
csoporttl tvett tripszines bontssal 87% feletti extrakcis hatsfokig jutott kt tengeri eredet
CRM vizsglatnl, s mind az sszes arzn mrleg, mind pedig a mdosulatanalitikai rtkek
egyezst mutattak a hiteles ill. korbban kzlt adatokkal. A kt kzlemny feltehetleg azrt
jutott eltr eredmnyre, mert az els esetben valdi mintk, mg LAMBLE s HILL
munkjban csupn CRM vizsglatra kerlt sor, teht az utbbi mintk minden bizonnyal
knnyebben feltrhat anyagot jelentettek a mintaelkszts szmra. PARDO-MARTNEZ et
al. [2001] ugyancsak a BRANCH-alapkzlemnyre ptve hekk-, nyelvhal- s rdghaltartalm bbitelek As-mdosulatanalitikai mintaelksztst vgeztk el tripszin s pankreatin
enzimek segtsgvel. Vizsglataik sorn a tripszin tkletesen alkalmasnak bizonyult a
meglehetsen komplex mtrix mintk feltrsra s a mrseik szerint szinte kizrlag
AsB-bl ll As-mdosulatok kinyersre, mg a pankreatin a mdosulatok talakulst vltotta
ki, gy hasznlatt elvetettk.
A fehrje mellett a kemnyt szmt olyan, nagy mennyisgben jelen lv, enzimesen
knnyen lebonthat mtrixalkotnak, melyet arzn mdosulatanalitikai mintaelkszts
folyamatban enzimes ton prbltak meg eltvoltani ill. megbontani. HEITKEMPER et al.
[2001] rizsfajtkon vgeztek arzn mdosulatanalitikai vizsglatokat, mely sorn 4 klnbz
mintaelksztsi eljrst hasonltottak ssze, kztk -amilzzal vgzett feltrst is. Ez a
technika a metanolos extrakci elfutraknt alkalmazva a msodik legjobb kinyersi hatsfokot
(59%) biztostotta a TFA-val vgrehajtott extrakci mgtt, szignifiknsan megelzve a tisztn
metanollal vgzett kezelseket. Ugyanakkor tbb mint fl napos idignye miatt nem folytattk
vele a ksrleteket, gy nem lehet megllaptani, hogy az enzim alkalmazsa vajon csak
49

Dernovics Mihly

mennyisgileg vagy minsgileg is teljesebb kpet adott-e volna a minta arzntartalmrl.


CARUSO et al. [2001] fagyasztva szrtott, arzntartalm almamintk vizsglatnl viszont
egyrtelmen az -amilz ltal biztostott, legnagyobb elrt kinyersi hatsfokrl szmolhattak
be: az enzim hasznlatval szignifiknsan, 10-20%-kal szrnyaltk tl a hagyomnyosnak
mondhat metanolos-vizes extrakcik eredmnyeit mg gy is, hogy a 6 rs kezelst nem
rzgpen, hanem ultrahangos frdben hajtottk vgre, amely nem kifejezetten ltalnos eljrs
az ilyen jelleg behatsokra meglehetsen rzkeny enzimek tekintetben. Mindenesetre
rdemes megjegyezni, hogy az elz kt mintnl vagy eredenden, vagy liofilezs tjn a
kemnyt lpett el f mtrixkomponenss, gy annak bontsa sorn a kutatk teljes joggal
vrhattk a kinyersi hatsfok javulst. Ugyanakkor sem a rizs-, sem pedig az almaminta
esetben nem kpezett az -amilz kezels nll elksztsi lpst, mivel az enzimes
kemnyt hidrolzis csupn elksztette az utna kvetkez metanolos kioldst vagyis mg
inkbb bizonytottnak ltszik azon rtelmezs, miszerint az -amilz enzimes kezelsek
csupn az arznkomponensek hozzfrhetsgnek javtsa cljbl kerlnek alkalmazsra, s
felhasznlsuk a f mintaelkszts elfutrnak szerepre korltozdik.
2.3.2.5. Pufferelt kzegek s hg savak/lgok alkalmazsa: szekvencilis mintaelkszts a
mveletileg meghatrozott arzn mdosulatanalitikban
Br a szekvencilis kifejezs elvileg minden olyan mintaelksztsi folyamatra
alkalmazhat, amely egyms kvet lpsekbl, pl. szerves oldszerrel vgrehajtott
zsrtalantsbl s az utna alkalmazott, metanol-vz szilrd-folyadk extrakcibl ll, azonban a
kifejezssel leginkbb sszekapcsold fogalom, a SEP (Sequential Extraction Procedure,
szekvencilis extrakcis mveletsor) jellegzetesen a talajok, ledkek sajtja. Az olykor tbb
napot ignybe vev, egyms utn ms s ms extrakcis kzegekkel dolgoz mveletsor
alkalmazsa azon a felismersen alapul, hogy a talajok/ledkek eltr szerkezetkbl,
sszettelkbl s eredetkbl fakadan klnbz mdon s erssggel ktik meg a
fmionokat. Ebbl az kvetkezik, hogy pl. nvnytermesztsi terletrl szrmaz talajmintk
teljes kirlyvzzel s folysavval vgzett feltrsa sorn kinyert, esetleg kiemelked toxikus
fmion-mennyisg nem felttlenl jelent veszlyt a termnyekre s azon keresztl a fogyasztra,
mivel biolgiai hozzfrhetsge tbbek kzt az adott elemtl s mdosulattl, a termesztett
nvnytl, az aktulis idszakban hullott csapadk kmhatstl fggen akr elhanyagolhat
mrtk is lehet.
A biolgiailag hozzfrhet arzn ugyanakkor az tlagosnl nagyobb figyelmet ignyel,
mivel mind a termesztett nvnyekbe, mind pedig a gyomnvnytrsulsokba fknt a
szervetlen s toxikus arznmdosulatok, az As(III) s As(V) formjban pl be [HELGESEN
1998, MATTUSCH 2000] radsul e kett kzl az emberre mg toxikusabb As(III) a
gyakoribb beplsi forma, mivel a nvnyek szmra viszont a talajbl a foszftanyagcsere s
felvtel tjn versengssel bejut As(V) a mrgezbb, gy azt redukcival, detoxikci cljbl
arzenitt alaktjk [MATTUSCH 2000, ZHANG 2002]. Kiemelt fontossg teht, hogy a
termesztsre sznt talajok ill. a talaj feljavtst clz szennyvziszapok s tavakbl, folykbl
50

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

kikotort ledkek hozzfrhet As-tartalmt a lehet legpontosabban megllaptsuk. Ezen


feladathoz, minden mintra rvnyes, kizrlagosan kvetend szekvencilis extrakcis
mveletsor nem ltezik. Klnbz iskolk, szabvnygyi testletek, ideiglenesen mkd
hivatalok (pl. a BCR) ajnlsai alapjn vlaszthatja a kutat vagy az ellenrz lloms az adott
mintra leginkbb illeszked eljrst. A kvetkezkben kizrlag olyan pldk bemutatsra
kerl sor, ahol az elemzs rszben vagy teljes egszben az arznre irnyult.
A magyarorszgi veszprmi iskola 1997-ben fejlesztette ki a fleg ledkek vizsglatra
sznt, 4 lpses leaching (kioldsi) folyamatot [BDOG 1997], amely a kvetkez frakcikat
nyeri ki a lpsek sorn: (a) a krnyezettel dinamikus egyenslyban lv s karbonthoz kttt
/0,11 mol l-1 ecetsavas extrakcival/; (b) Fe- s Mn-oxidokhoz kttt /extrakci 0,1 mol l-1
hidroxil-ammnium hidrokloriddal/; (c) szerves anyaghoz s szulfidokhoz kttt /8,8 mol l-1
H2O2 alkalmazsa/; (d) savban oldhat /cc. HNO3 s HClO4 adagolsa/. Ezt a lerst kvette
POLYK s HLAVAY [1999], amikor a balatoni ledkbl 15 helyen trtn mintavtellel a
tavat terhel tbbek kzt toxikus (As, Cd) elemek bekerlsvel kapcsolatos elemzsket
hajtottk vgre. A teljes mveletsor kb. 60 rt vett ignybe. A frakcik arzntartalmt nem az
eddigiekben ismertetett oxidcis llapot, hanem n. mveletileg meghatrozott
mdosulatanalitika (frakcionls) szerint tudjuk rtelmezni. Mindez azt jelenti, hogy az adott
kezels ltal kinyert sszes As-mennyisget tekintjk egyfajta As-frakcinak.
WENZEL et al. [2001] kifejezetten a talaj As-tartalmnak frakcionlst clz, 5 lpses
SEP-et mutattak be, amelyet 20, rszben iparilag szennyezett talajminta vizsglatnl hasznltak
fel. Az ltalnos mdszerektl rszben eltr megkzeltst az arzn oxianion jellege indokolja.
A mveletsor sszessgben kb. 30 rt ignyel s a kvetkez terminolgiai alapokon pl fel:
(a) nem specifikusan adszorbeldott As /0,05 mol l-1 (NH4)2SO4/; (b) specifikusan
adszorbeldott As /0,05 mol l-1 NH4H2PO4/; (c) amorf s nem tkletes kristlyszerkezet Fes Al-oxihidroxidok /0,2 mol l-1 NH4-oxalt puffer, pH=3,25/; (d) tkletes kristlyszerkezettel
jellemezhet Fe- s Al-oxihidroxidok /0,2 mol l-1 NH4-oxalt puffer, aszkorbinsavval, pH=3,25/;
(e) maradk frakci / teljes roncsols HNO3+H2O2 segtsgvel/.
Ahogy e kt mdszer lersbl vilgoss vlhat, a mveleti mdosulatanalitika
mintaelksztse idignyes folyamat s az elemek oxidcis llapotnak megrzse nem
szerepel clkitzsei kztt. Nvnylettani vizsglatokhoz, az arzn talajbl trtn felvteli
mechanizmusnak megismershez azonban szksg van a talajban lv, fknt szervetlen Asmdosulatok /As(III), As (V)/ mennyisgnek s arnynak megllaptsra. Tapasztalati tny,
hogy e kt mdosulat mr viszonylag rvid id (rk) alatt is egymsba tud alakulni az adott
mveleti lps sorn, gy hossz, olykor 30-60 rs mintaelksztsre nem lehet pteni.
THOMAS et al. [1997] ttr kzlemnykben az elsk kzt ismertettek egy gyors mdszert,
amelynek segtsgvel ki tudtk vltani a hossz mintaelksztst. LRM-ekbl s CRM-ekbl
egyetlen, mindssze 20 perces lpsben, kis teljestmny mikrohullm kezelssel (40W),
1 mol l-1 koncentrcij foszforsavval 81-100%-os extrakcis hatsfokot rtek el, s
adalkolssal vgzett ellenrz mrseik szerint a mintaelkszts alatt nem trtnt szignifikns
mrtk As(III)-As(V) konverzi. VERGARA GALLARDO et al. [2001] az elz mdszer
51

Dernovics Mihly

tvtelvel valdi mintk fel fordultak, s a Tvol-Keletrl szrmaz ledkmintkbl 72-98%ban tudtk kinyerni s azonostani a fknt szervetlen As-mdosulatokat kivtelt csupn a
talajmintk kpeztek, amelyek esetben szoksosnl gyengbb (60% krli) hatsfokot mrtek.
MONTPERRUS et al. [2002] ugyanezen jelensggel talltk maguk szemkzt: foszforsavas
kezelsnl a talajmintkbl elgtelen kinyersi hatsfokot rtek el. Ebbl fakadan egyb
extrahlszereket vettek grcs al, s igyekezetk sikeresnek bizonyult: a WENZEL et al.
[2001] kzlemnyben megismert, eredetileg egy SEP rszt kpez, 0,2 mol l-1 NH4-oxalt
pufferrel 18% al cskkentettk a mintban marad, elemzsre nem kerl As arnyt.
Az utbbi hrom kzlemny ltalnosan igaznak bizonyul, szinte teljesen azonos
sszegzssel zrta sorait, melynek lnyegt kt pontban lehet sszefoglalni: (1) a talaj- s
ledkmintk egsz sora kivtel nlkl csak As(III) s As(V), teht toxikus arznmdosulatokat
hordoz mennyisgileg meghatrozhat mrtkben; (2) a mintkban az As(III)/As(V) arny annl
kisebb, minl hosszabb ideig volt kitve az adott talaj vagy ledk aerob krnyezeti
paramtereknek termszetes krnyezetben ill. a mintavteli mveletsor alatt.
2.3.2.6. Tmny savak s bzisok szerepe az arzn mdosulatanalitikai mintaelksztsben
A tengeri eredet lelmiszerek, CRM-ek s egyb mintk arzn mdosulatanalitikai
mrseinl meglehetsen gyakran fordul el, hogy a kinyersi hatsfok, ha kevssel is, de
elmarad a 100%-tl, brmilyen mdszert is alkalmazzon a kutat, lett lgyen sz akr metanolvz elegyes extrakcirl (lsd 5. Mellklet tblzata) vagy enzimes kezelsrl. 1997-ben fedezte
fel STBLO s THOMAS [1997], hogy az As(III) mdosulat szelektven ktdhet a
mintafehrjk szabad SH (tiol) csoportjaihoz, S-As kovalens ktst kialaktva. Amennyiben a
mintakezels s -elkszts nem elg drasztikus a fehrjk denaturlst illeten, gy ezek a
ktsek pen maradva ezt a mdosulatot az extrakcis maradkban tarthatjk. Mivel a szervetlen
As mennyisge a mintkban ltalban csupn nhny szzalkra rghat [BROOKE 1981], gy az
As(III) hinya lehet, hogy fel sem tnik az sszes arznmrlegben a tbbi mintaelksztsi lps
bizonytalansgbl ered szrs miatt. MUOZ et al. [1999a,b] a problmra elegns thidal
megoldssal lltak el: kifejlesztettek egy, a szervetlen As-mdosulatokra nzve szelektv
extrakcis technolgit, amely sorn a minta szksg szerint vzzel trtn visszanedvestst
kveten cc. ssavval teljes elfolystst hajtanak vgre, majd kloroform-metanol eleggyel
kirzzk [MUOZ 1999a], vagy mikrohullm kszlkkel vgzett desztillcival egyttesen,
mint szervetlen frakcit nyerik ki az As(III)-As(V) mdosulatokat [MUOZ 1999b].
Amennyiben ezt a mveletet a hagyomnyos metanol-vz extrakcival egsztik ki, gy teljes
arzn mdosulatanalitikai kpet kaphatnak a mintrl, mivel ez utbbi mdszer a legfbb,
tengeri eredet mintban tlnyomrszt elfordul AsB mdosulatot bizonytottan
mennyisgileg oldja ki. Ezt a gondolatmenetet kvetve kzel msfl tucat CRM, kagyl, rk s
hal vizsglatt vgeztk el; eredmnyeik amellett, hogy az adalkolssal igazoltan 100% krli
As(III) extrakcit rtek el j mdszerrel s j oldalrl igazoltk az emberre nem mrgez AsB
legalbb 85-90%-os jelenltt ezekben a mintacsoportokban.
52

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

A ssav mellett mg a leggyakrabban ionprkpzknt hasznlt trifluor-ecetsav alap


extrakcit emlti a szakirodalom, mint savas kzeg, arzn mdosulatanalitikai mintaelksztst
[HEITKEMPER 2001]: a szerzk kereskedelmi forgalomban kaphat rizsmintk
arznmdosulatainak meghatrozsra 2 mol l-1 koncentrcij TFA oldatot alkalmaztak,
mellyel 84-97%-os kinyersi hatsfokot mutattak fel. Ugyanakkor a szervetlen mdosulatok
kzti arny a minta As(V) tartalmnak rszbeni redukcija miatt megvltozott, gy e kt
mdosulat (MUOZ et al. [1999a,b] eljrsaihoz hasonlan) egyttesen, mint szervetlen frakci
szerepelhet a mdosulatanalitikai anyagmrlegben.
Sok szakember szerint ez nem is felttlenl jelent problmt. Hatrozzuk meg a szervetlen
mdosulatok sszegt, mivel oly nagy toxikolgiai klnbsg gy sincs az As(III) s As(V)
kztt, s a figyelmet tartalkoljuk az alig ismert sszettel s toxicits arznmdosulatok
irnyba, amelyek tbbnyire a szokatlanul rossz kinyersi hatsfokkal jellemzett mintkban
fordulnak el. Ez a gondolatmenet vezette PARKS et al. [2003] csoportjt, amikor a korbban
msok ltal [ACKLEY 1999] kromatogrfis cscseltoldst kivlt tulajdonsga miatt elvetett
ersen lgos vegylettel, TMAH-val kifejezetten ilyen tengeri mintkat vettek clba.
Hromlpses, elszr TMAH-t, majd az azt kzmbst ecetsavat, vgl 80C hkezelst
alkalmaz mdszerkkel a gyakran dominns AsB koncentrcit jval meghalad mrtk
arzenocukor mennyisgre bukkantak a vizsglt kagylkban. Br extrakcis hatsfokuk olykor
csak 50% krl mozgott, az ltalban nehezen kinyerhet mdosulatokra, az arzenocukrokra
[GALLAGHER 2001] bevethet mveletsoruk tkletes s knnyen kivitelezhet, a
hagyomnyos mdszereket kiegszt eljrsknt tallhatja meg helyt az arzn
mdosulatanalitika fegyvertrban.
2.4. AZ ANALITIKAI MRSEK MINSGBIZTOSTSI FOLYAMATNAK ELENGEDHETETLEN KELLKEINEK, A REFERENCIAANYAGOKNAK BEMUTATSA: TPUSOK, ELLLTSI MD S FELHASZNLS

2.4.1. Trtnelmi elzmnyek


Az analitikai mrsek s mszerezettsg fejldse egytt jrt azzal a felismerssel, hogy az
elsdleges mdszerek kivtelvel szinte minden eljrs s mrstechnika a valdi minta ltal
okozott, jelents mtrixhatssal terhelt: a meghatrozand komponens vagy tulajdonsg mrst
a ksr komponensek, makro- s mikrosszetevk, ill. a minta fiziko-kmiai tulajdonsgai
olykor rendkvl nehzz tehetik, pldul a mszerek kalibrlsra alkalmazott standard
vegyletek meghatrozshoz kpest. Lassan rezhetv vlt az az r, amely a klnbz
laboratriumok ltal szolgltatott eredmnyek kzs nevezjnek hinya vltott ki: br a
kalibrlsok szintjn a mrsek mg visszavezethetek voltak a nemzetkzi standardokhoz, a
konkrt alkalmazsok terletn semmi sem garantlta az eredmnyek sszehasonlthatsgt,
minsgi vizsglatt. Az utbbi szempontbl klnsen kritikus volt a helyzet, hiszen nem llt
rendelkezsre olyan anyag, amely segtsgvel az egyre sszetettebb vl mintaelksztsimrsi eljrsok mdszeres hibjt s rvid ill. hossz tv stabilitst meg lehetett volna
llaptani.
53

Dernovics Mihly

Vgl 1920-ban, Dniban megtrt a jg: KNUDSEN [1925] tengervzbl 2130 veg, ltala
norml vz-nek nevezett, mai szemmel az LRM-ek (lsd ksbb) snek tekinthet,
nemzetkzileg is sikeres referenciaanyagot ksztett, melyet az oceanogrfiai laboratriumok
kvnalmai szerinti kiszerelsben hozott forgalomba. Az igny valdisgt mi sem jelzi annl
jobban, hogy 5 v alatt a kszlet kzel -e fogyott el s jutott el Dl-Afriktl egszen Japnig.
Ezt kveten nhny analitikai terleten, gy pl. az aclipari minsgellenrzsben hamar
megjelentek az els szilrd, hitelestsi clt szolgl RM-ek; ugyanakkor az els, szles krben
ismertt vlt, biolgiai eredet hiteles anyagmintra mg kzel fl vszzadot kellett vrni:
BOWEN [1966] 1965-ben kelkposztalevelekbl lltotta el abbl a clbl, hogy nvnyi
mintk nyomelemvizsglataihoz minsgbiztostsi httrrel szolgljon. Pldjn felbuzdulva
vgre nagy lptkben megindult az n. krnyezeti referenciaanyagok (talaj, ledk, lelmiszer,
tp, mikroba-, nvnyi-, llati-, emberi szvet eredet) gyrtsa is, amelynek fontossgt
felismerve az Eurpai Kzssg 1972-ben letre hvta a rszben referenciaanyagok ellltsra
szakosodott JRC-t (Joint Research Centre).
2.4.2. A referenciaanyagok fbb tpusai s ellltsuk ltalnos folyamata
A referenciaanyagok alapveten kt f csoportba sorolhatak [ISO/IEC 1992]:
1., RM (gyakran LRM): referenciaanyag, laboratriumi (vagy hzilagos, nem tanstott)
anyagminta; olyan anyag vagy vegylet, amelynek egy vagy tbb tulajdonsga kielgten
megllaptsra kerlt azzal a cllal, hogy azt egy kszlk kalibrcijra, egy mrsi mdszer
rtkelsre vagy anyagok meghatrozsra lehessen felhasznlni.
Az LRM legfbb szerepe az, hogy referenciapontknt szolgljon a laboratriumi mrsek
minsgbiztostsnak terletn, pldul kontrollkrtys rendszer alapjt kpezve. Mivel az
LRM mtrixa idelis esetben kzel ll a vizsgland minta mtrixhoz, mdszerfejlesztsi cllal,
legtbbszr mintaelksztsi mveletsorok optimlsnl, a kinyersi hatsfokok
megllaptsn keresztl fontos szerepet jtszhat.
2., CRM (Egyeslt llamokban SRM): hiteles (vagy bizonylatolt, tanstott) anyagminta;
olyan referenciaanyag, amelynek egy vagy tbb tulajdonsgt egy mszakilag rvnyes eljrs
segtsgvel hatroztk meg, s amely mell kzvetlenl vagy kvethet mdon egy hitelest
bizottsg ltal kiadott tanstvnyt vagy egyb dokumentumot mellkelnek. A CRM hitelestett
rtkein tl azok bizonytalansgt is kzlik, meghatrozott megbzhatsgi szint mellett.
Ez utbbi tpusukkal, a CRM-ekkel lehet biztostani a kmiai mrsek alapvet
visszavezethetsgt s bizonytani a mrsi eredmnyek helyessgt. A CRM hasznlata
kpess teszi a laboratriumot arra, hogy mszereket kalibrljon, gy alkalmazsukra lehetsg
szerint trekedni kell. A megfelelen kivlasztott CRM kiemelt szerepet tlt be a
mdszervalidls terletn is, klnsen akkor, amikor mtrixhatssal kell szmolni.
A hangsly az utbbi esetben a megfelelen kivlasztott szakaszra helyezdik, ugyanis
nem minden mdszert lehet egyazon hiteles anyagmintval validlni. Elvileg minden lnyegesen
klnbz mintamtrixhoz, s a meghatrozand komponens (vagy tulajdonsg) lnyegesen
eltr koncentrcitartomnyhoz (mrtkhez) ms s ms referenciaanyagot clszer hasznlni
54

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

[ABOU-SHAKRA 1997]. Ez a gyakorlatban szmos okbl is kivitelezhetetlen. A rendelkezsre


ll, klnfle CRM-ek szma nemzetkzi szinten jelenleg az 1-2 ezer fajta krl jrhat, melyek
ltszma csak lassan n a kifogy vagy visszavont kszletek ill. az egyre szigorod elrsok (s
a technika fejldsvel egytt jr nagyobb mszerezettsgi-minsgbiztostsi kvetelmnyek)
miatt egyre hosszabb ideig kszl j CRM-ek bevezetsbl kifolylag. A 6. Mellklet brja
szemlletesen mutatja, hogy legalbb 3-4 v telik el a hiteles anyagminta gyrtsnak els
fzistl a piacra kerlsig. Fontos kiemelni, hogy a CRM-ek s LRM-ek kzti rklnbsg nem
minsgi eltrsbl fakad: a legfbb eltrs a stabilits vizsglati idtartamban s a hitelestsi
folyamat megltben keresend. Az LRM-ek gyakorlati lettartama 1-2, mg a CRM-ek 10 vre
tehet, gy termszetesen az utbbiakat hosszabb ideig kell tesztelni. Msrszt az LRM-ek nem
hitelestsi clra kszlnek, gy nincs szksg a CRM-gyrts legkltsgesebb szakasznak, a
gyakran nemzetkzi sszefogssal vgrehajtott hitelestsi folyamatnak vghezvitelre.
Eltekintve teht a hiteleststl, a referenciaanyagok ksztse azonos tem s kvnalmak
szerint zajlik (6. Mellklet brja):
1., Ignyek felmrse, tervezs: br valban tzezer szmra lehetne RM-jellteket lltani, a
legnagyobb cgek sem kpesek vente 3-4 hiteles anyagmintnl tbbet piacra dobni; az eurpai
cscsintzmny, a Bureau Communautaire de Rfrence (BCR) 1974 s 1999 kztt
mindssze 79 CRM-et/LRM-et s 145 krelemzsre alkalmas anyagot jegyzett [MUNTAU
2001]. Csak a nemzetkzi szinten, ltalnossgban fontosnak tartott terletekhez kszl CRM;
ebbl kifolylag ennek a kevs anyagnak a lehet legalkalmasabbnak kell lennie, s aprlkos
tervezs szksges a gyrts minden munkafzishoz.
2., Nyersanyag begyjtse: fontos kiemelni, hogy a nemzetkzi ignyek kielgtsre
kszl RM-ek esetben a kiindulsi anyag tmege akr 2-3 tonna is lehet. Kt ok ll a
hatalmasnak tn mennyisg mgtt: egyrszt a kszts sorn hatatlanul lemorzsoldik az
anyag egy rsze, akr 90%-os vesztesget eredmnyezve; msrszt az alapanyagnak mr
indulsnl a lehet leghomognebbnek kell lennie, gy a nagy indulsi tmeg rszben
ellenslyozhatja az anyagon belli esetleges egyenetlen komponens / tulajdonsg megoszlsokat.
3., Vzeltvolts: Alapvet fontossg lps szilrd halmazllapot RM-ek gyrtsnl.
Tbb clt is szolgl: a vzaktivits cskkentsn keresztl hozzjrul a mikrobiolgiai
stabilitshoz, cskkenti a nyersanyag tmegt, koncentrltabb teszi a komponenseket, a vizes
kzegben knnyen lejtszd reakcikat (pl. oxidci) gtolja ill. lasstja, s megknnyti /
lehetv teszi a soron kvetkez, szemcsemret-cskkentst clz mveleti lpseket.
Ugyanakkor a minta jellegt ltalban irreverzibilisen vltoztatja meg, gy az RM viselkedse
fleg a mintaelkszts sorn csak rszben tkrzi az eredeti anyag tulajdonsgait.
4., Szemcsemret-cskkents, szitls: Egyrtelmen az inhomogenits cskkentst
szolgl mveletsor. Mr az alapanyag is gyakran tartalmaz kisebb-nagyobb
konglomertumokat, sszetapadt szemcsket, melyek a ftmeghez kpest teljesen eltr
sszettel, zrvnyszer rszekbl is szrmazhatnak. Ha korbbrl nem, a vzeltvolts sorn
biztosan kpzdnek csomk s rgk, melyek mrete jval meghaladhatja a kiindulsi tlagos
szemcsemretet is. Az rls-darls sorn gyelni kell arra, hogy az RM-et lehetleg ne rje
55

Dernovics Mihly

szennyezds a berendezsekbl s az esetleges segdanyagokbl. A szitls sorn elrend


szemcsemret fgg a minta jellegtl: biolgiai eredet esetn fleg az tlagosnl nagyobb
lipidtartalomnl nagy nehzsggel jrhat a 90 m-es tartomny elrse, gy a 125 m-es
szitatnyron tes frakcit mr elegenden kis mretnek fogadja el a szakirodalom. Szervetlen
s / vagy knnyen porthat alapanyagoknl (kzet, ledk, tejpor) kisebb, 63 m-es tartomny
elrse a cl. Ugyanakkor gyelni kell arra, hogy biolgiai eredet referenciaanyagok esetn ne
kerljn tlslyba az 50 m-nl kisebb frakci, mert az ebbe a tartomnyba es szemcsk
elektrosztatikusan feltltdve egyrszt nehzz tehetik a bemrst, msrszt esetleges
higroszkpos viselkedsk sszetapadst s szegregcit idzhet el. Fontos megemlteni, hogy
a szitls rszben kivlthat az RM n. minimlis bemrend tmegrtknek megllaptsval;
ekkor a gyrt a csatolt bizonylatban kzli, hogy mekkora az a tmeg, amelynek elemzse esetn
a hiteles rtkeknek 95%-os megbzhatsgi szinten teljeslnik kell.
5., Homogenizls s ellenrzse: A referenciaanyag clparamternek megbzhatsgt
nvel eljrs. Az anyag tmegtl fggen, rendszerint forgdobos berendezssel vgzik, s
meghatrozott idkznknt mintavtellel s elemzssel hatrozzk meg az aktulis
homogenitsi rtket. A folyamat akr egy htig is eltarthat. Kritikus mveletrl van sz, mivel a
nem kielgt mrtkben homogn eloszls gyakorlatilag hasznlhatatlann teheti az eredetileg
tkletes alapanyagbl kszl RM-et.
6., Elzetes analitikai vizsglat: rszben a homogenitsvizsglat rszeknt azt hivatott
eldnteni, hogy a clparamter aktulis rtke a vgrehajtott mveleti lpsek utn az eredetileg
kitztt tartomnyban tallhat-e, ill. a gyrtsi folyamatot abba kell-e hagyni a tartomnytl
val tlzott tvolsg miatt.
7., Trolsi egysgek, azonostsi jelek kialaktsa: clszersg s gyakorlati megfontolsok
ltal vezrelt gyrtsi lpsek. Az egy egysgen belli RM tmeget ltalban gy lltjk be,
hogy 40-50 alkalomnl tbbszr ne kelljen kinyitni a trol ednyzetet, ms szval: ennyi id
alatt fogyjon el az egysg RM tartalma.
8., -besugrzs: a leggyakrabban hasznlt 60Co gy 25 kGy dzisa sterilizlja s
stabilizlja a mintt, annak szmottev felmelegedse nlkl; megbzhat s gyors eljrs,
azonban rdemes besugrzsi kontrollt is kszenltben tartani, mivel ez a nagy dzis biolgiai
mintk esetben bizonyos paramterekben mrhet br a referenciaanyag hasznlata
szempontjbl nem felttlenl kros vltozst okozhat.
9., Kijellt rtkek megllaptsa: lehetsg szerint tapasztalt laboratrium ltal, elsdleges
mdszerrel vgzett eljrs keretben kerl sor azoknak a referenciartkeknek a
meghatrozsra, melyek a stabilitsvizsglat s CRM-ek esetn a hitelestsi folyamat
viszonytsi alapjt kpezik.
10., Trolsi stabilitsi vizsglatok: LRM-eknl rendszerint 6-18, CRM-eknl 24-36
hnap, klnbz hmrskleteken (-18C s +40C kztt) vgrehajtott trols segtsgvel
megfelel bizonyossgot lehet szerezni a clparamter(ek) id fggvnyben mutatott
vltozsrl, rtknek alakulsrl. A vizsglatnak az anyag szlltsval egytt jr
56

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

behatsokat is modellezni kell, pl. kzvetlen napfnynek trtn rvid idej kitettsg ill. az
ajnlott trolsi hmrsklet fl val emelkeds krlmnyeinek kialaktsn keresztl.
11., Hiteles rtk megllaptsa, kirtkels, dnts: A CRM-ek ksztse sorn egyszerbb
eljrsi rend esetn ugyanazon laboratrium vgzi el, klnbz fggetlen mdszerek
alkalmazsval az adott paramter meghatrozst; nemzeti vagy nemzetkzi egyttmkds
esetn a fggetlen laboratriumok rszben vagy egszben rgztett mdszerrel hatrozzk meg a
hiteles rtket, melyet ezt kveten rtkel bizottsg sszehvsval fogadnak el vagy
mdostanak. A teljes gyakorlati mveletsor legdrgbb rszfolyamatrl van sz; egymagban
akr 80%-ban jrulhat hozz az sszes kltsgekhez. Ez okozza, hogy (L)RM-bl jval tbb
kszl a CRM-ekhez kpest; klszablyknt azt mondhatjuk, hogy csupn minden 20., stabil s
homogn referenciaanyagbl kszl hiteles anyagminta (6. Mellklet brja).
Egy CRM piacra kerlse akr 4-5 vet, vagy akr mg hosszabb idt is ignybe vehet; gy
rthetv vlik az ltalban 50-80 Euro / egysg krli rfekvs, amely azonban nem szmt
kiemelkeden drga eszkznek ahhoz kpest, hogy szerencss megfelels esetben a CRM mind
a mrs helyessgnek megllaptsban, mind pedig a mdszerfejlesztsben s -validlsban is
ptolhatatlan szerepet jtszhat.
2.4.3. A mdosulatanalitikai mrsek minsgbiztostsnak jellegzetessgei a rendelkezsre ll referenciaanyagok tkrben
A mdosulatanalitikai mrsek br tbb mint fl vszzada jelen vannak az analitikai
mrsek egyik vlfajaknt mg egyetlen szabvnygyi testlet ltal sem kerltek
szabvnyostsra. Ebbl kvetkezik, hogy a vizsgllaboratriumoknak kivtel nlkl validlni
kell a klnbz mdosulatanalitikai mdszereket, mint minden ms, szabvnyban vagy
gygyszerknyvben nem rgztett ill. szakmai szervezetek/hatsgok ltal (mg) nem elfogadott
mdszert [MSZ 2001, NAR 2002]. A validls sorn meg kell hatrozni az alkalmazand
analitikai rendszer s mdszer alkalmassgt, mely folyamatnak rszt kpezi tbbek kzt az
analitikai mdszer(ek) teljestmnyjellemzinek pldul a pontossgnak s a mrsi
bizonytalansgnak megllaptsa, valamint igazolni kell az elvgzett mrsek
visszavezethetsgt. ltalnossgban, nem mdosulatanalitikai mrsek esetn az utbbi
jellemzk megllaptsnl fontos szerephez jutnak a CRM-ek (hiteles /ms nven bizonylatolt
vagy tanstott/ anyagmintk). Amennyiben a laboratrium rendelkezik az ltala vizsglt
minthoz hasonl jelleg s a meghatrozand komponenst kzeltleg azonos koncentrciban
tartalmaz CRM-mel, gy viszonylag egyszeren meghatrozhatja az ltala hasznlt mdszer
pontossgt (teht az eltrst a valdi s a mrt rtk kztt), a mdszer teljes bizonytalansgt
(amely magban foglalja az sszes lpst, kezdve a mintaelksztsi folyamatoktl egszen a
vgs detektlsig) s biztosthatja a mrs visszavezethetsgt a nemzeti vagy nemzetkzi
standardokhoz.
A CRM hinya nem teszi lehetetlenn a mrs validlst, azonban meglehetsen bonyolult
mveleti gra knyszertheti a laboratriumot. Ebben az esetben ugyanis a kvetkez eljrsok
kzl vlaszthat [EURACHEM 2000, MSZ 2001, NAR 2002]:
57

Dernovics Mihly

1., A mrberendezst visszavezethet, ismert sszettel, pontosan meghatrozott


koncentrcij (+bizonytalansg) standard vegylettel kalibrlja s emellett a mdszer
megelz lpseinek (pl. extrakcis mveletek) visszavezethetsgt egyb mdszerekkel, pl.
adalkolssal igazolja.
2., n. elsdleges mdszerrel is elvgzi a mrst, s az eredmnyeket sszehasonltja az
ltala alkalmazott mdszerrel amennyiben elsdleges mdszer egyltaln rendelkezsre ll s
alkalmazhat az adott mrsi feladathoz.
3., A laboratrium a vlasztott mdszer segtsgvel mrst hajt vgre egy olyan mintn,
amely rszben (adalkols ill. standard addci rvn) vagy teljesen a mrend vegyletet tisztn
tartalmaz referenciaanyagbl ll amennyiben az elrhet.
4., A laboratrium olyan mdszerrel vgzi el a mrst, amelynek az sszes meghatrozhat
mveleti paramtere pontosan megllaptsra kerlt s e paramterek mindegyike
visszavezethet.
Sajnos a mdosulatanalitika bizonyos gai klnskppen pedig a szeln s arzn
mdosulatanalitika tbb szempontbl is htrnyt szenved. Egyrszt a napjainkig megismert
mdosulatok jelents rsze, kb. 80%-a nem tallhat meg a vegyszergyrtk knlatban; gy
pldul arzn esetben a teljes arzenocukor-sorozat, az AsB-2, az AsC s a TETRA csak
kutatlaboratriumokbl ill. egyni mdszerekkel, pl. CRM-ekbl trtn izollssal szerezhet
be [KIRBY 2002], mg a szelnnl pldul olyan fontos ppen a legerteljesebb rkellenes
hatssal rendelkez mdosulatok hinyoznak, mint a Se-allil-szelenocisztein s a -glutamilSe-metilszelenocisztein (2003. mjusi llapot). Msrszt risi hiny tapasztalhat a
mdosulatanalitikai CRM-ek terletn is. Arzn esetben valdi (mtrix) CRM-bl mindssze
egyetlen, a BCR-CRM 627 rendelhet, s az is csupn sszes As, AsB s DMA(V)
mdosulatokra hitelestett; szeln mdosulatanalitikai CRM pedig ez idig egyszeren nem
kszlt.
A kialakult helyzet megrtshez sszefggseiben kell vizsglni az elmleti s gyakorlati
htteret. Az arznnel kapcsolatos lettani s mdosulatanalitikai kutatsok s az egyre ersd,
lelmiszer-biztonsggal kapcsolatos lakossgi nyoms a 80-as vek vgre tette nyilvnvalv,
hogy mindenkppen lpni kell az els CRM kialaktsa fel. Ekkor alig egy tucat eurpai
laboratrium rendelkezett egyltaln valamifle As-mdosulatanalitikai tapasztalattal, s mg a
mainl is kevsb jutottak hozz As-standard vegyletekhez. Vgl az Eurpai Kzssg
tagllamaiban tevkenyked laboratriumok harmonizcis trekvseit keretbe foglal, 1973ban ltrehozott BCR kezbe vette az irnytst, s egy korbban kialaktott, lpsrl-lpsre
trtn mdszertani megkzeltssel indtotta el a CRM 627 kialaktst [LAGARDE 1999,
MUNTAU 2001]. A folyamat 8 vig tartott; a kvetkez, remlhetleg hamarosan piacra kerl,
tbbelemes mdosulatanalitikai hiteles anyagminta, a CRM 710 sem sokkal kevesebb id alatt
kszl(t) el. Szeln esetben eddig egyetlen prblkozst jegyez a szakirodalom: a BCR
szervetlen Se(IV) s Se(VI) vegyletekkel mestersges vzmintt lltott el, azonban a kt
mdosulat stabilitsa nem bizonyult megfelelnek s a CRM sosem kszlt el
[QUEVAUVILLER 1998]. Mindezekbl ltszik, hogy a CRM-mel val elltottsg mg hossz
58

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

ideig problematikus rszt kpezi majd a mdosulatanalitikai vizsglatoknak. Hiba vrhat


ugyanis a CRM-ek szmnak lass bvlse, minden mtrixot, minden mdosulatot s minden
koncentrcitartomnyt valsznleg sohasem fednek majd le teljesen.
A laboratriumoknak ms minsgbiztostsi lehetsgek utn kell nznik, amelyekkel a
lehetsgekhez kpest t tudjk hidalni a hinyossgokat [LARSEN 1998a, MICHALKE 1999]:
az sszes Se- vagy As-anyagmrleg megllaptsa alapvet s elengedhetetlen rszt kell,
hogy kpezze a mdosulatanalitikai vizsglatoknak, hiszen csak gy tarthat kzben az olykor
mveletileg tbb rszre osztott mintbl szmolhat kinyersi hatsfok;
a mdosulatanalitikai folyamat minden lpst lehetsg szerint egyenknt vizsglat al kell
vonni, hogy meg lehessen ismerni az egyes folyamatok sorn fellp vesztesgeket, mveleti
hatsfokokat, szennyezsi forrsokat, bizonytalansgi tnyezk mrtkt s okait, s vgl, de
nem utolssorban meg kell bizonyosodni afell, hogy mdosulattalakuls egyltaln ne, vagy
pedig dokumentlt (jl ismert, minsgileg s mennyisgileg /egyedi hatsfokok szempontjbl/
kzben tartott) krlmnyek kztt trtnhessen meg;
a mintaelkszts s az esetleges hosszabb idej trols megvltoztathatja a mdosulatok
hozzfrhetsgt ill. magukat a mdosulatokat is; ezt ellenrizend, clszer standard
vegyletekkel vgrehajtani a teljes vizsglati folyamatot a mintaelksztstl kezdve a trolsi
lpseken t a vgs, pl. hgtssal vagy pH-lltssal jr mveletekig ugyanakkor figyelembe
kell venni, hogy a standard vegyletek nem felttlenl viselkednek ugyangy, mint a valdi
mintbl extrahlt komponensek;
standard addci s bels standard hasznlatval clszer figyelemmel ksrni a vegyletek
valdi minta mrsnl gyakran tapasztalt retencis id vltozst s a rendszer
felbontkpessgnek alakulst mind GC, mind LC elvlasztsok esetn klnsen akkor, ha
nem ll rendelkezsre molekulris szint azonostst lehetv tev berendezs, pl. ESI-MS vagy
MALDI-TOFMS;
krelemzsekben val rszvtellel, ill. az azokbl megmarad rendszerint RM minsg
mintk s hzi kszts LRM-ek hasznlatval felvett kontrollkrtyk tjn a laboratrium
meggyzdhet szemlyzetnek felkszltsgrl, mdszereinek alkalmassgrl s mrseinekeredmnyeinek minsgrl;
ugyanazon minta klnbz mdszerekkel s/vagy klnbz laboratriumokban trtn
vizsglata hozzjrulhat a tapasztalatlansgbl fakad vagy az alkalmazott, gyakran rendkvl
sszetett mintaelksztsi / mrstechnikai mveletekben rejl mdszeres hibk feldertshez;
jellegzetes pldaknt a kromatogrfis rendszerek nem kielgt felbontkpessgbl add
cscstisztasgi gondok azonostsa szolglhat. Az arzn tekintetben pl. a DORM-2 CRM-et
kutatcsoportok tucatjai elemeztk mr s szmos kzlemny ltott napvilgot a klnbz
mdszerrel elrt kinyersi hatsfokok, azonostott mdosulatok s mveleti paramterek
vizsglatairl.
Kln rdemes beszlni az adalkols lehetsgrl. Elvileg a folyadk-szilrd extrakcis
mveletek esetn a minthoz ismert mennyisgben adalkolt standard vegyletek visszanyerse
kpet adhat a valdi mintbl trtn extrakcis mveletek hatsfokrl. Valjban azonban ez
59

Dernovics Mihly

csupn elmleti lehetsg: a gyakorlat azt mutatja, hogy rendkvl nehz ugyanolyan jelleg,
erssg s stabilits ktseket ltrehozni a minta s a hozzadott standard kztt, mint
amelyek akr vtizedek alatt jttek ltre a minta s a benne eredetileg megtallhat mdosulat
kztt. A helyzetet tovbb bonyoltja, hogy gyakran mg a legfbb, leginkbb vizsglt
mdosulatokrl (pl. AsB) sem tudjuk mg, milyen s hny ktsi mechanizmus rvn ill. milyen
eloszlsban raktrozza pl. az adott tengeri llny ha egyltaln elfordul benne [ACKLEY
1999]. A szeleno-aminosavak esetben pedig badarsg lenne azt felttelezni, hogy a vizes
oldatban minthoz adalkolt mdosulatok ugyangy viselkednek majd a mintaelkszts alatt,
mint a fehrjkben kovalensen kttt trsaik. Az adalkols minden ezzel ellenttes vrakozs
ellenre csupn egyetlen clra alkalmas: esetleg segthet eldnteni, zajlik-e valamilyen mrtk
mdosulattalakuls a mintaelkszts rszt kpez folyamatok sorn.
Fontos kiemelni, hogy a CRM meglte sem oldja meg egy csapsra az sszes felmerl
problmt. Gyakori feladatknt addik pldul a kinyersi hatsfok becslse, amelyre elvileg a
CRM vizsglata sorn kapott rtkek vonatkozhatnak. Azonban a CRM jellegbl addan
mindig homognebb, kisebb vztartalm, s kisebb szemcsemret, mint a valdi minta, gy
annl ltalban knnyebben, nha viszont nehezebben kezelhet [QUEVAUVILLER 1996].
A jvt illeten megllapthat, hogy mg legalbb 20 vig okoz majd gondot a megfelel
CRM hinya [QUEVAUVILLER 1999]. Rszben ennek ksznhet, hogy egyre jobban
terjednek a minsgbiztostsi clok bizonyos terletein jl hasznlhat LRM-ek, akr tbb
laboratrium sszefogsval, akr egyetlen laboratrium ltal ksztve [GOESSLER 1997], ill.
megjelent az a tendencia is, hogy a nagy mennyisgben elrhet, sszes As- vagy Se-tartalomra
hitelestett CRM-eket utlagos vagy jrulkos hitelestssel prbljk alkalmass tenni
mdosulatanalitikai clokra [LARSEN 1997, WOLF 2001, ZHENG 2003]. Ez utbbi eljrsnak
az a jelensg szabhat gtat, hogy az sszes As- vagy Se-tartalomra vonatkoz homogenits nem
jelent egyben homogn mdosulateloszlst is, klnsen, ha az adott mintban tbb, jelents
mennyisgben jelen lv, eltr oldhatsgi jellemzkkel rendelkez mdosulat tallhat meg.
Az As- s Se-mdosulatanalitikai mrsek minsgbiztostsi jellemzit sszefoglalva
elmondhatjuk, hogy a CRM-ek s standardok terletn bemutatott hinyossgok jelentsen
szktik a mdosulatanalitikai vizsglatok sorn elrhet minsgi s mennyisgi
meghatrozsok lehetsgeit s nem elhanyagolhat mrtkben jrulnak hozz a mrsek teljes
bizonytalansgnak nvekedshez.

60

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

3. ANYAG S MDSZER
Ebben a fejezetben azokat a mdszereket, vegyszereket s standardokat ismertetem,
melyeket fbb vltoztatsok nlkl, minden kutatsi terletemen egyarnt alkalmaztam. Az
esetenknti eltrseket az Eredmnyek megfelel alfejezetei tartalmazzk, az adott minthoz
kapcsold kiegsztsekkel egytt. Mivel rtekezsem kzpontjban a mintaelkszts llt,
fontos kiemelnem, hogy a mdosulatanalitikai (HPLC-) mrsek bemutatst s azok
mdszerfejlesztsi lpseit tbbek kztt IPOLYI [2001a,b] kzlemnyei s STEFNKA
[2003a] PhD rtekezse tartalmazza.
3.1. SSZES AS-

SE-TARTALOM

MEGHATROZSA SORN ALKALMAZOTT MDSZEREK,

VEGYSZEREK S BERENDEZSEK ISMERTETSE

Minden mintnl a savas roncsolson alapul feltrst hasznltuk. Ennek sorn a mintbl
szrazanyagra szmtva legfeljebb 0,5 grammot mrtnk be analitikai mrleg (0,1 mg)
pontossggal az elzetesen tisztra mosott s ioncserlt vzzel kibltett, menetes fedvel
zrhat, laboratriumunkban ksztett teflon bombkba. A kvnt vgtrfogattl fggen elszr
2-3 ml cc. saltromsavat, majd 1-3 ra mlva 2-3 ml 30 m/m %-os H2O2-oldatot (mindkett
Merck gyrtmny; Darmstadt, Nmetorszg) pipettztunk a mintra. Ezekkel prhuzamosan
mintt nem tartalmaz vakot s bizonyos esetekben CRM bemrsvel kontroll mintt is
ksztettnk. A bombkat lefedtk s legalbb 8-10 rn keresztl llni hagytuk, hogy az
oxidci sorn keletkez gzok jelents rsze eltvozhasson. Ezutn a teflonbombkat bezrtuk
s laboratriumi nyomstart ednyben 25 percig 110C hmrskleten tartottuk ket. Kihls
utn a bombk tartalmt maradk nlkl, ioncserlt vzzel 5,0 vagy 10,0 ml-es mrlombikba
mostuk t s jelre tltttk ket. A ksz mintk As- s Se-tartalmt ICP-OES kszlk
segtsgvel (ICAP-61 vagy IRIS; Thermo Jarrel Ash Corp., Franklin, MA, USA) hatroztuk
meg. A kszlkek kimutatsi hatra mindkt elemre 40 g l-1-nak addik; a mrs sorn 1000
mg l-1-es As s Se trzsoldatok (Merck) hgtsval, kls kalibrci segtsgvel trtnt a
mennyisgi meghatrozs. Bizonyos esetekben a roncsolmnyokat a jelre tlts utn reds
szrpapron (Macherey-Nagel 619 G1/4; Dren, Nmetorszg) t kellett szrni, hogy a lebeg,
rendszerint nagy cellulztartalm mintbl megmarad komponensek eltvoltsval
megakadlyozzuk az ICP-porlaszt kapillrisnak eltmdst. Ilyenkor termszetesen a vak
mintkat is ugyanennek a kezelsnek tettk ki.
Ioncserlt vzknt minden esetben Elgacan Ultra-Pure patronnal (Elga Ltd., High Wycombe
Bucks, Anglia) R >10 MW ellenllsig tiszttott vizet hasznltunk.
3.2. A

MDOSULATANALITIKAI MINTAELKSZTSEK SORN FELHASZNLT VEGYSZEREK,

STANDARDOK S LTALNOSAN ALKALMAZOTT BERENDEZSEK ISMERTETSE

Vizsglataink sorn analitikai tisztasg vegyszerekkel dolgoztunk. A klnbz pufferek


ksztshez alkalmazott TRIS, K2HPO4 s KH2PO4 skat, citromsavat, a pH-lltsra szolgl
NaOH-t s ssavat a Reanal cgtl (Budapest) szereztk be. A rszben mintaelksztsi,
61

Dernovics Mihly

rszben kromatogrfiai clokra hasznlt, HPLC-tisztasg metanol s etanol Carlo Erba (Miln,
Olaszorszg) gyrtmny volt. Az enzimek kzl a sejtfalbont drizelzt (Basidiomycetes ssp.;
0,81 U mg-1 ksztmny) s tripszint (serts hasnylmirigybl; 1645 U mg-1 ksztmny) a Fluka
(Buchs, Svjc), a pepszint (sertsgyomorbl; 452 U mg-1 ksztmny), a VII-es tpus lipzt
(Candida rugosa; 875 U mg-1 ksztmny), a XIV-es tpus protezt (Streptomyces griseus;
4,8 U mg-1 ksztmny) s a lysing enzimet (Trichoderma harzianum; aktivits-megjells
nlkl) a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), mg a pronzt (Streptomyces griseus; 1140011417 U mg-1 ksztmny) a Merck cg szlltotta. A protez inhibitorok kzl a PMSF-et a
Fluka, mg a folykony inhibitor koktlt a Sigma-Aldrich cgtl szereztk be. Az emulgelsi ill.
zsrtalantsi clra szolgl Na-taurokoltot s ciklohexnt a Reanaltl, mg a gumiarbikumot a
Sigma-Aldrich cgtl rendeltk. Az NH4HCO3 puffer ksztshez Riedel-de Han (Seelze,
Nmetorszg) termket hasznltunk. Az alkalmazott enzimek, pufferek s egyb reagensek Asill. Se-tartalma az ICP-OES kszlk kimutatsi hatra alattinak (bemrsre szmtva:
< 0,4 g g-1 ksztmny) addott.
A D,L-szelenometionint (SeMet), D,L-szelenoetionint (SeEt), D,L-szelenocisztint (SeCys2)
s ntrium-szelentot (Se(VI)) a Sigma-Aldrich cg szlltotta, 97-99%-os tisztasgban. Se(IV)
mdosulatknt a Merck ltal forgalmazott, szelnre nzve 1000 mg l-1 koncentrcij SeO2trzsoldatot hasznltuk.
A centrifuglsi feladatokat a Hettich Zentrifugen cg (Tuttlingen, Nmetorszg) Micro
22R jel, hthet s cserlhet rotorral felszerelt centrifugjval hajtottuk vgre. A HPLC
mrsekre sznt oldatokat cserlhet membrnlappal elltott, 0,45 m prustmrj, cellulznitrt fecskendszrvel (Whatman; Maidstone, Anglia) tiszttottuk meg a lebeg,
centrifuglssal nem eltvolthat komponensektl. Bizonyos mintknl Ultrafree-4 tpusjel,
10 kDa vgsi rtk ultraszrmembrnnal elltott centrifugacs-szrket (Millipore; Bedford,
MA, USA) hasznltuk az oldatok szrst kvet tovbbi, mret szerinti frakcionlsra.
3.3. STATISZTIKAI ELJRSOK
A ksrletek kirtkelse sorn rszben a Microsoft Excel 97 tblzatkezel program
(Microsoft Corporation; Redmond, WA, USA) statisztikai fggvnyeit (varianciaanalzis, 2mints t-prba nem azonos szrsngyzeteknl /Welch-prba/), rszben pedig az STATISTICA
5.0 statisztikai programcsomagjnak (StatSoft Inc.; Tulsa, OK, USA) bizonyos alkalmazsait
(RSM /fellet-vlasz mdszer/) hasznltam fel. Minden esetben 95%-os megbzhatsgi szintet
vettem figyelembe.

62

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4. EREDMNYEK
4.1. AZ

ENZIMES MINTAELKSZTS KRITIKAI VIZSGLATA AZ ARZN MDOSULATANALITIKA

TERLETN

Mint ahogy a 2.3.2.4. szm irodalmi fejezetben bemutatsra kerlt, az enzimes


mintaelkszts csupn a 90-es vek kzepn jelent meg az arzn mdosulatanalitika terletn,
s alkalmazhatsgnak megtlse meglehetsen nehz, mivel viszonylag kis szm ksrletrl
szmol be a szakirodalom. A meglv eredmnyek alapjn gy tnik, hogy a nvnyi eredet
mintk (rizs, alma) mtrixnak bontsnl, s gy az arznmdosulatok kinyersnek
elsegtsnl a kemnytbont enzimek hasznos szerepet tlthetnek be, mg llati eredet
mintknl egyrtelm elnyrl nem lehet beszlni. Annyi bizonyos, hogy az els Asmdosulatanalitikai CRM, a BCR-627 hitelest nemzetkzi krelemzsnl az egyik rsztvev
tripszines bontssal megfelel, a hiteles rtkek megllaptsnl is figyelembe vett
eredmnyeket rt el az ltalban metanolos extrakci hasznlathoz fordul, tbbi
laboratriummal egytt [LAGARDE 1999]. Ennl a pldnl maradva gy gondolnnk, hogy a
tripszines mdszer vlasztst nem felttlenl a mdszer egyb eljrsokhoz kpest megismert,
nagyobb kinyersi hatsfokban vagy megbzhatbb eredmnyekben tkrzd elnye, hanem
esetleg egyb indokok, mint pl. a rendelkezsre ll mrrendszer s ms adottsgok /
hinyossgok indokoltk; ilyen lehet pldul a szerves oldszer eltvoltsnak nehzsge vagy
rossz tapasztalatok az emulzikpzsre hajlamos, nagy zsrtartalm tengeri mintknl.
Kzvetett mdon ugyanakkor gyakran elkerl egy olyan mintacsoport, melynek esetben
az enzimes mintaelkszts taln fontosabb, alapvet szerepet tlthetne be: a tengeri eredet,
alacsonyabb rend nvnyekrl, algkrl-hnrokrl-moszatflkrl van sz. Ezen mintk az
utbbi vekben az As-mdosulatanalitika taln legkedveltebb cltrgyai voltak, mivel (a)
egyrszt a reformtpllkozs s a tvol-keleti tkezsi szoksok megismerse rvn egyre tbb
lelmiszer kszl velk/bellk Nyugat-Eurpban is, (b) sszes arzntartalmuk elrimeghaladhatja a 100 g g-1 rtket, amely komoly lelmiszer-biztonsgi agglyokat vet fl ill.
(c) azonostott As-mdosulataik jelents rszt a tudomnyterlet napjaink taln leginkbb
tanulmnyozott vegyletcsoportja, az arzenocukrok alkotjk. Ezen tpus mintknl a metanolvz eleggyel vgzett extrakci szinte egyeduralkodnak szmt annak ellenre, hogy nem ritka a
csupn 26% krli kinyersi hatsfok [GALLAGHER 2001]. Hasonlan kis hatsfokot
tapasztaltak KOTREBAI et al. [1999b] zldalga Se-mdosulatanalitikai vizsglatnl is, a
legtbb ms jelleg mintnl kielgt eredmnyre vezet pronz enzimes extrakci ellenre.
Ez a megfigyels vezetett arra, hogy az ebbe a csoportba tartoz mintk mdosulatanalitikai
vizsglathoz a mintra legjellemzbb mtrixkomponens, a sejtfal bontsra hasznlhat
enzimes kezelst dolgozzak ki. Ez a korbban ilyen clra mg nem alkalmazott eljrs kijellheti
azt a terletet, ahol az arzn mdosulatanalitika valban ignybe veheti az enzimes
mintaelkszts eszkztrt.
Mindemellett clszernek tnt objektv, statisztikai mdszerekkel megvizsglni s igazolni,
hogy vajon a szmos alkalommal is idzett, tripszin hasznlatra pl mintaelkszts valban
csak esetleges mdszertani okok miatt kerlt-e felhasznlsra tengeri (hal)mintk esetn,
63

Dernovics Mihly

avagy valdi extrakcinvel tnyezknt kell vele szmolni s ajnlani a szerves oldszerrel
vgrehajtott extrakcis technikk helyett. A vizsglat szksgessge annak a megfigyelsnek az
okn merlt fel, amelyre hitelestsi clbl elemzett kagylminta sorn jutottunk; vgl a
kvetkeztetsek ltalnossgt egy msik nemzetkzi krelemzs sorn kapott LRM-jellt
halmintn prbltam ki.
Ez a kt ksrletsorozat alkalmasnak tnt az enzimes mintaelksztsnek az Asmdosulatanalitika kiterjesztett, nem csupn kemnytalap mtrixokkal jellemzett terletn
elfogadott ltjogosultsgnak eldntsre s esetleges j alkalmazsi pldk bemutatsra.
4.1.1. Arznnel dstott zldalga As-mdosulatanalitikai elksztse s vizsglata
4.1.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse
A BIOMA-6 jellssel elltott, As-mdosulatanalitikai referenciaanyag clzattal ellltott
mintt a Cseh Kztrsasgbl, a prgai ANALYTIKA spol. s.r.o. cgtl kaptuk. A minden
bizonnyal Chlorella fajhoz tartoz algbl arzntartalm tpkzegben vgzett fermentci
segtsgvel lltottk el azt a biomasszt, amelybl centrifuglssal s fagyasztva szrtssal
alaktottk ki a vgs, por alak ksztmnyt. Ennek a sttzld szn algapornak 31,0 g g-1-ot
(RSD: 3,2%) tett ki az sszes As-tartalma, amely nagysgrendileg egyezik a tengeri eredet,
alacsonyabb rend nvnyekben kimutatott mennyisggel. A mintaelksztsi eljrsok
tervezsnl figyelembe vettem az As-mdosulatanalitikban ltalnosan javasolt, metanol-vz
oldszerelegy hasznlatra pt mdszereket is, s ezeket egsztettem ki enzimes eljrsokkal.
A HPLC-HG-AFS kromatogrfis elvlaszts jellemzit IPOLYI et al. [2001a] kzlemnye
tartalmazza.
4.1.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa
Az arznnel dstott algaminta mdosulatanalitikai elksztse sorn metanol-vz
klnbz arny elegyeivel, valamint drizelz s pronz enzimekkel hajtottam vgre
kezelseket, melyek jellemzit a 3.2. fejezet hordozza, a pufferek ksztshez hasznlt TRIS,
K2HPO4, KH2PO4 skkal egytt. A mintaelksztseket 15 ml-es fiolkban vgeztem,
amelyekbe egyenknt 160-170 mg As-dstott algaport mrtem ki, majd a kvetkezekben (AD) ismertetett extrakcik kerltek sorra, 200 perc-1 fordulatszm rzgp segtsgvel. Az
egyenknt 3 prhuzamossal vgrehajtott mintaelkszt lpsek utn centrifuglssal (3700 g,
15 perc, 20C) vlasztottam szt az oldhatatlan rszt az extrahlt komponensektl; a D betvel
jellt mdszer esetn a ltrejv ledket hasznltam fel a soron kvetkez lpshez.
A., 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl, szobahmrskleten;
B., 3,6 ml, 1:9 V/V arny metanol:vz elegy, 1 rn keresztl, szobahmrskleten;
C., 3,6 ml, 1:1 V/V arny metanol:vz elegy, 1 rn keresztl, szobahmrskleten;
D., 1. lps: 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl, szobahmrskleten; 2. lps:
3,6 ml, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben (pH=7,0) pufferben oldott 1 m/v %-os drizelz oldat,

64

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4 rn keresztl, 37C hmrskleten; 3. lps: 3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4)
oldott 0,5 m/v %-os pronz oldat, 21 rn keresztl, 37C hmrskleten.
A mveletek befejezse utn a centrifuglssal ltrejv fellszkat 0,45 m
prustmrj fecskendszrn keresztl juttattam 5,0 ml-es mrlombikokba s ioncserlt
vzzel tltttem jelre. Az gy kapott oldatok kerltek HPLC (As-mdosulatanalitikai)
vizsglatokra. Az ledket s a hozzjuk tartoz membrnszrlapokat savas roncsolssal (3.1.
fejezet) trtam fel a maradk arzntartalom megllaptsa vgett.
4.1.1.3. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok bemutatsa
az eredmnyek rtkelse
Mint ahogyan az irodalmi szakaszban bemutattam, az arzn mdosulatanalitikai
mintaelkszts egyik f mdszernek a metanol-vz oldszereleggyel trtn kezels szmt
(2.3.2.3. szakasz). Ugyanakkor ezen eljrs a szles tartomnyban (0-100%) vgbevihet
oldszer-elegytsi lehetsg ellenre nem nyjt minden mintra tkletesen alkalmazhat
megoldst, hiszen nem szmt ritkasgnak a mg 50%-os kinyersi hatsfokot sem elr
extrakcis eredmny (5. Mellklet tblzata). Kifejezetten mdosulatanalitikai referenciaanyag
cljbl ksztett, mestersges As-tartalm tpkzegben fermentlt algamintval GOESSLER et
al. [1997] vgeztek mdosulatanalitikai mrseket, melynek elksztse sorn a 4:6 V/V arny
metanol:vz oldszereleggyel 100% krli extrakcit rtek el. Az ltaluk vizsglt alga azonban
valsznleg eltr fermentcis eljrssal kszlhetett, mivel tbb mint kt nagysgrenddel
nagyobb, s 99%-ban As(V)-bl ll arzntartalom jellemezte amelyrl pedig ismert, hogy
kinyerse ltalban nem tkzik akadlyokba a msik szervetlen As-mdosulathoz, az As(III)hoz kpest (lsd 2.3.2.6. fejezet).
Ennl az algamintnl az A, B s C mintaelksztsi eljrsok kpeztk a klnbz
arny metanol-vz eleggyel vgzett kezelseket, s sorban 77%, 78% s 80% kinyersi
hatsfokra vezettek az sszes kinyert As-tartalmat illeten. A hrom mdszer vgeredmnyei
kztt a pronknt elvgzett statisztikai vizsglat (Welch-prba) nem trt fel szignifikns
klnbsget. Ezt kveten az ledkben maradt, kb. 20%-ot kitev As kinyersre az elz
mdszerektl teljesen eltr mechanizmus, enzimes mintaelksztst hasznltam fel, mely kt,
egymst kvet lpsbl llt: elszr sejtfalbont enzimmel (drizelz) kezeltem a maradkot,
majd fehrjebontsi szakasz kvetkezett, pronz enzimmel. A drizelz a nvnyi alap
protoplasztkpzs gyakran hasznlt enzimkeverke, s vrhat volt, hogy alkalmazsval
szmottev nvekedst lehetne elrni a kinyersi hatsfok terletn. A fehrjebontsi szakasz
szksgessgnek elmleti htterl pedig az szolglt, hogy az algaflk fehrjetartalma a
vzelvonst kveten, szrazanyagra vettve jval 10 m/m % fl kerlhet [PIORRECK 1984],
ezltal mtrixalkot szerepk jelentss vlhat, akadlyozva pl. az As(III)-mdosulat kinyerst.
Az gy hromlpcsss alakult, D jel kezels els lpsnek a metanol nlkli, kizrlag
ioncserlt vzzel vgrehajtott extrakcit vlasztottam, mivel gy elkerlhetv vlt a
centrifuglssal esetleg nem teljesen eltvoltott metanol ltal kivltott enzimaktivits-cskkens,
msrszt a statisztikai elemzs nem igazolta a metanol hasznlatnak fontossgt.
65

Dernovics Mihly

Az algaminta mr mdosulatanalitikai informcival is kiegsztett, hromlpses


mintaelkszts segtsgvel kapott mrsi eredmnyeit az 1. tblzat hordozza. A 31,0 g g-1
sszes As-tartalm algbl a hromlpses extrakci utn fennmarad ledkben az ICP-OES
kimutatsi hatra alatti arzn maradt (K.H.= 40 g l-1 oldatban, amely a bemrs s sszes Astartalom alapjn abszolt rtkben 1,2 g g-1-ot jelent), teht a kinyersi hatsfok biztosan
meghaladta a 96%-ot. A HPLC-HG-AFS rendszer segtsgvel azonostott As-mdosulatok
(arzn egyenrtkben szmtva) 27,3 g g-1-ot tettek ki, teht az sszes mennyisgre vettve az
azonostsi arny 88%-nak addik. A kt rtk kztti klnbsg valsznleg a nem
hidridkpz pl. arzenocukor jelleg As-mdosulatok jelenltbl fakad, melyek a
szakirodalom alapjn minden alacsonyabb rend nvnyi szervezetbl kimutathatak s
azonosthatak amennyiben a szksges standardok s mszerek, teht molekulaszint
azonostsra alkalmas MS, pl. ESI-MS rendelkezsre llnak.
1. Tblzat. Az arznnel dstott algaminta hromlpses mintaelksztse rvn kinyert As-mdosulatok
megoszlsnak s az elrt kinyersi hatsfoknak bemutatsa. K.H. = kimutatsi hatr

HPLC-HG-AFS eredmnyek,
g As g-1 minta

Mrrendszer
Mintaelkszts /
azonostott
mdosulatok
As(III)
MMA(V)
DMA(V)
As(V)

Vizes
extrakci

Sejtfalbonts

Fehrjebonts

sszestve

5,38
9,45
0,82
8,48

0,49
0,41
0,49
0,65

0,33
<K.H.
0,82
<K.H.

6,20
9,86
2,13
9,13

sszestve

24,13

2,04

1,15

27,32

Az azonostott Asmdosulatok
megoszlsa az sszes
As-tartalom %-ban

78

88

ICP-OES eredmnyek,
g As g-1 minta
Nem
kinyerhet
As-tartalom

Minta
sszes
As-tartalma

Kinyersi
hatsfok

<1,2

31,0

>96%

Az 1. tblzat adatai alapjn egyrtelm, hogy az ioncserlt vzzel vgzett extrakcinak


tulajdonthat a mintbl felszabadtott As-mdosulatok dnt tbbsge, 78%-a. A
sejtfalbontssal mg tovbbi 7% nyerhet ki, s valsznleg gy vlik teljess az MMA(V) s
As(V) extrakcija is, hiszen a tovbbi kezelsek sorn nem szabadultak fel kimutathat
mrtkben. A DMA(V) s As(III) tekintetben a 3., fehrjebontsi lps mg mrhet
mennyisgben vitt oldatba e kt mdosulatbl; ugyanakkor nem igazoldott be az As(III)
kapcsn felmerlt ktely, miszerint fehrjebonts nlkl jelents kinyersi vesztesg kvetkezne
be, hiszen a pronz ltal felszabadtott 0,33 g g-1 mennyisg csak mintegy 5%-t tette ki a teljes,
6,20 g g-1-nak. A DMA(V) ennl a mintnl megismert, fehrjebontst is ignyl extrakcis
viselkedsre nem tallni pldt a szakirodalomban: a 3. lps nlkl 0,82 g g-1-mal (38%-kal)
kevesebbet mutattunk volna ki ebbl a mdosulatbl. Ezidig csupn egyetlen forrst talltam,
mely a DMA(V) olykor nem tkletes extrakcijra utal: csirkemell izomszvetbl metanolos
kezels nlkl, kizrlag ioncserlt vzzel nem lehetett tkletes kinyerst elrni [SEAS 2002].
Nem kizrt, hogy az enzimes kezelssel ltrejv fehrjebonts s a metanol ltal okozott

66

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

fehrjedenaturls ennl a mintnl hasonl eredmnyekre vezetne az ugyanarra a


mtrixalkotra kifejtett hats rvn, azonban ehhez tovbbi vizsglatokra lenne szksg.
Mindezekkel egytt a fehrjebontsnak tulajdonthat 3%-os extrakcinvekeds statisztikai
vizsglatok alapjn mr nem szmt szignifiknsnak az els kt lps eredmnyeihez kpest.
Ezzel ellenttben a sejtfalbonts ltal eredmnyezett 7% tbblet szignifiknsnak bizonyult, teht
ez a lps valban hasznos s szksges volt nem csupn az sszes As-kinyers, hanem az
egyenknti mdosulatok szemszgbl is, hiszen mindegyik extrakcijhoz hozz tudott jrulni.
4.1.2. Referenciaanyag clzattal ksztett sima lepnyhal (Pleuronoctes platessa) Asmdosulatanalitikai elksztse az enzimes mdszerek hasznlhatsgnak tkrben
4.1.2.1. Tapasztalati elzmnyek tengeri kagylmintkon vgzett ksrletek alapjn
A 2.3.2.4. alfejezetben ismertettem az As-mdosulatanalitika enzimes mintaelksztsnek
elmleti httert, kiemelve azt a jellegzetessget, amely a legfbb klnbsget okozza a szelnill. arzntartalm mintk kezelse kztt: mg szeln esetben a felhasznlt enzimek kzvetlenl
bizonyos Se-mdosulatokra (pl. a szeleno-aminosavakra) hatnak, addig a msik elemnl ez a
hats csak kzvetett, mivel az enzimek a mintamtrix bontsn keresztl jrulnak hozz az Asmdosulatok felszabadulshoz. Ebbl kvetkezik, hogy mg szelnnl az enzimes
mintaelkszts a ktelezen vlasztand mdszerek egyike, addig arznnl inkbb csak
kiegszt jelleg, nem felttlenl alkalmazand eljrsrl van sz.
Az elz alfejezetben sikerlt bizonytani, hogy legalbbis alacsonyabb rend nvnyi
szervezetek kezelsnl a sejtfalbonts szignifikns mrtkben javtott az extrakcis
hatsfokon. llati eredet mintknl termszetesen ilyen enzimre nincs szksg, s a
fehrjebont kezels szerepelhet a jrulkos mintaelksztsek kztt. 1998 s 2002 kztt
tanszknk folyamatosan szerepet vllalt az els, akr tbb elem egyttes mdosulatanalitikai
mrsnek hitelestsre sznt CRM-jellt, a T34, T36, T37 s T38 jelek alatt fut
osztrigaksztmny nemzetkzi krelemzsben (Mulspot project), a 9. szm laboratrium
megjells alatt [MULSPOT 1998, MCSHEEHY 2003a]. A tbbves munka folyamn a lehet
legegyszerbb mintaelksztsre val trekvs s sztnzs miatt ill. a rendelkezsre ll
mrrendszer kvnalmaihoz igazodva egylpses, emelt hmrskleten (70-80C) vgrehajtott,
ioncserlt vzzel trtn extrakci hasznlata mellett dntttnk. Ez a mindssze egyetlen rs
eljrs 86-90%-os As-kinyersi hatsfok elrst tette lehetv, amely mint ksbb, a
hitelestsi sszejvetelek sorn bizonyossgot nyert a metanol hasznlatra pt
mdszerekkel teljesen egyez s nemzetkzi szinten helytll eredmnyre vezetett. Tripszin
vagy egyb enzim alkalmazsra a rszt vev tz laboratrium mintaelksztsi eljrsai kztt
nem akadt plda. Korbban, az els As-mdosulatanalitikai hiteles anyagminta, a CRM-627
ellltsnl szerepelt egy enzimes mdszer (4.1. fejezet ill. LAGARDE [1999]), mely abban az
esetben megfelel s felhasznlhat mintaelksztsnek addott. A krds teht adott: jr-e
egyrtelm elnnyel, br-e klnsebb okkal az enzimes technika felhasznlsa a tengeri
llatokbl szrmaz mintatpus mdosulatanalitikai mintaelksztsnl. A vlasz megadsra a
kvetkez nemzetkzi krelemzsben val szerepvllals sorn kerlt sor.
67

Dernovics Mihly

4.1.2.2. A halminta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse


A SEAS Project keretben [SEAS 2002] sima lepnyhalbl kszlt, Asmdosulatanalitikai minta elksztst s elemzst hajtottuk vgre. A minta LRM-jelltknt,
teht referenciaanyag minsgben rkezett hozznk: por alak, 125 m-nl kisebb
szemcsemret, fagyasztva szrtssal vztelentett, kell mrtkben stabil s homogn
ksztmnyen hajtottuk vgre a vizsglatokat. Az utbbi kt mrssorozat, teht a stabilits- s
homogenitsvizsglat teljestse sorn a mrseket vgz laboratrium (mely azonos a
BRANCH [1994] kzlemny httrintzmnyvel) minden esetben enzimes mintaelksztst
hajtott vgre, melynek paramtereit a krelemzsben szerepet vllal laboratriumok rszre is
hozzfrhetv tettk. A korbbi Mulspot mintkhoz kpest itt teht adott volt egy
mintaelksztsi mdszer, mely ennl a halmintnl ktsget kizran alkalmasnak bizonyult az
As-mdosulatanalitikai clokra; ebbl kifolylag nem volt clszer a krelemzsi clzat
mrseinket eltr eljrssal kezelni. Ugyanakkor a rendelkezsre ll minta mennyisge
lehetv tette, hogy mdszeres, elre tervezett megkzelts rvn megllapthassuk, szksgese enzimet felhasznlni a lepnyhal As-mdosulatanalitikai mintaelksztse sorn.
A vizsglatok HPLC-UV-HG-AFS elvlasztstechnikai oldalt SZAB [2003]
diplomadolgozata tartalmazza; rtekezsemben csak a mintaelkszts optimlsra vonatkoz
szakaszokra helyezem a hangslyt.
4.1.2.3. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa
A vizsglatok sorn felhasznlt NH4HCO3, HNO3, H2O2 s tripszin jellemzit a 3.2.
fejezetben mutattam be. A krelemzsi feladatokhoz a SEAS program keretben ismertetett
paramtersereget hasznltam fel, mely a kvetkez mdon alaktotta ki a mintaelkszts
menett: 0,5 g mintt 15 ml-es fiolban 6,5 ml, 0,1 mol l-1 koncentrcij NH4HCO3 pufferben
(pH=8,0) oldottam fel; ezt a folyamatot ultrahangos berendezs segtsgvel gyorstottam. Ezt
kveten az elzvel azonos puffer 1 ml-vel 75 mg tripszin enzimet juttattam az elegyhez, s
sszekevers utn termosztlt rzfrdben 37C hmrskleten, 14 rn t 200 perc-1
fordulatszmon rzattam. A 3 prhuzamossal vgrehajtott enzimes kezels utn centrifuglssal
(4100 g, 25 perc, 20C) vlasztottam szt az oldhatatlan rszt az extrahlt komponensektl, majd
a ltrejv ledket vortex berendezs segtsgvel mg ktszer, egyenknt 1-1 ml pufferoldattal
bltettem t, s jra elvgeztem a korbban ismertetett centrifuglsi lpseket. A mveletek
befejezse utn a centrifuglssal kapott, sszetartoz fellszkat 0,45 m prustmrj
fecskendszrn keresztl juttattam 10,0 ml-es mrlombikokba, amelyeket ioncserlt vzzel
tltttem jelre. Az gy kapott oldatok kerltek a HPLC (As-mdosulatanalitikai) s prhuzamos
ICP-OES (sszes As-tartalom) vizsglatokra.
Az ledkeket s a hozzjuk tartoz membrnszrlapokat savas roncsolssal (3.1. fejezet)
trtam fel a maradk arzntartalom megllaptsa vgett, s a halminta sszes As-tartalmt
ugyanilyen eljrssal hatroztam meg.
68

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.1.2.4. Az enzimes mintaelkszts fbb paramtereinek jrulkos optimlsa


Az elzekben ismertetett enzimes mdszer kt olyan paramterrel rendelkezik, melyek
mdostsa jelents mrtkben befolysolhatja a kinyersi hatsfok alakulst: a minta / enzim
arny vltoztatsrl s a kezels idtartamrl van sz. Elvileg a kezelsi hmrsklet s a
rzsi fordulatszm is bemeneti vltozknt kezelhet, azonban ezek kevsb szmtanak
rugalmas tnyeznek. Az elzt ugyanis a tripszin optimlis hmrskletnek ismeretben
(37C) adott, ismert tnyeznek vehetjk; kisebb hfokon a folyamat egyrtelmen lassul az
enzim alkalmazstl fgg s attl fggetlen extrakcis folyamatok lassulsa miatt, amely
maga utn vonja a hosszabb elksztsben rejtz, mikrobiolgiai tevkenysg miatt kialakul
mdosulattalakuls veszlyt. A hmrsklet emelse cskkentheti a mikrobiolgiai behats
lehetsgt, de felvetheti a szervetlen As-mdosulatok redox tmenete ltal kivltott As(III)As(V) talakulsi folyamat problmjt. A keversi fordulatszm tekintetben a rendelkezsre
ll berendezsben a 160 perc-1 mr lassnak szmt s lepedshez vezethet, mg a 220 perc-1 a
fiolk oldalra trtn mintakirakdst eredmnyez.
Kt vltoz maradt teht, melyek egymstl a jelen esetben nem felttlenl fggetlenek. Az
enzimek in vitro krlmnyek kztt, az in vivo aktivitsuk s inaktivldsi idtartamuk
tekintetben kedveztlenebb jellemvonsokkal brhatnak, amely az id fggvnyben cskken
aktivitsban lt testet. Adott hmrskleten az inaktivldsi grbe ismert lehet s meg lehet
hatrozni, mennyi id mlva esik le mr nem jelents szintre az adott enzim aktivitsa.
Ugyanakkor ennl a mintaelksztsnl maga a kevertetsi folyamat enzimek hasznlata
nlkl is biztosan hozzjrul az As-mdosulatok kinyershez. Ezltal a kezels idtartama
sorn llandan vltoz krlmnyek jnnek ltre: az enzimes reakci indtsnl a mintamtrix
mg p, amelyre a kevertets mg csak kisebb hatst tud kifejteni, viszont az enzim teljes
aktivitsval mkdhet. A kezels sorn az enzim aktivitsa valsznleg cskken, de a mr
rszben bontott mtrixbl a kevertets knnyebben szabadtja fel az As-mdosulatokat. gy
egyrtelm, hogy a kezelsi idtartam minden bizonnyal fontos s egyttal optimlhat
bemeneti vltoznak tekinthet. A msik vltoz termszetesen a minta / enzim arny (m/m %ban kifejezve); ezt az rtket nvelni rdemes, hogy cskkentsk a mintaelkszts kltsgeit s
a rendszerhez juttatott, rszben mtrixknt jelentkez enzim mennyisgt. Termszetesen kevesebb enzim lassabban trja fel a mintt, gy hatssal lesz az optimlis kezelsi idtartamra is.
Amennyiben nem lehet egyrtelmen kizrni kt vltoz fggetlensgt a fgg vltoz
(jelen esetben a kinyersi hatsfok) tekintetben, gy nem is clszer egymstl fggetlen
optimlsi folyamatot vezetni. A statisztika fegyvertrnak egyik, erre az esetre kivlan
alkalmazhat eljrsa a fellet-vlasz mdszer (RSM): a kt bemeneti, fggetlen vltoz (x1 =
kezelsi idtartam; x2 = enzimkoncentrci) tervezett lpsekben vgrehajtott mdostsval s a
fgg vltoz (y = kinyersi hatsfok) rtkeinek mrsvel lehetsg nylik arra, hogy pl. a
legkisebb ngyzetek elvt kvetve polinom fggvnnyel kzeltsk az y(x1,x2) sszefggst.
Amennyiben a fggvny megoldsait x1-x2 tengely koordintarendszerben brzoljuk, az
optimlis bemeneti paramterekre utal y-rtkek azonos felleten helyezkednek majd el; innen
ered a fellet-vlasz elnevezs. Amg klnbz mrrendszerek paramtereinek
69

Dernovics Mihly

optimlsnl az RSM s ms, tbbvltozs statisztikai mdszerek hasznlata egyrtelmen


elterjedtnek tekinthet, addig a mdosulatanalitikai mintaelkszts terletn alig tallunk r
pldt; ismereteim szerint KIRBY s MAHER [2002] arzn-, ill. MASSUMI et al. [2002] krmmdosulatanalitikai alkalmazsai szmtanak ritka kivtelnek.
A (kinyersi hatsfok) vs. (kezelsi idtartam; minta/enzim arny) sszefggs
megllaptshoz szksges bemeneti vltozk vizsglt rtkeit s az alkalmazsuk segtsgvel
elrt kinyersi hatsfokokat a 7. Mellklet tblzata hordozza.
4.1.2.5. A halminta mdosulatanalitikai elemzse s a mintaelkszts optimlsa sorn kapott
eredmnyek rtkelse
A lepnyhal As-tartalmnak megoszlst s sszes ill. mdosulatokra vonatkoz rtkeit a 2.
tblzat ismerteti. A halmintt szolgltat laboratrium ltal hasznlt enzimes mdszerrel
99,5%-os kinyersi hatsfokot lehetett elrni, amely gyakorlatilag teljes extrakcit jelent.
Egyetlen mdosulatot, az AsB-t lehetett mennyisgileg s minsgileg is meghatrozni, mely az
extrahlt As-tartalom 84,4%-t tette ki. A kinyert s azonostott rtk klnbsge egyrszt olyan
mdosulatok jelenltbl fakadhat, melyek az alkalmazott UV-besugrzs utn sem kpeznek
hidridet, gy mintegy elvesznek az AFS detektor szmra, msrszt a mdosulatanalitikai
mrsek bizonytalansga sokszorosa az ICP-OES meghatrozsoknak, teht nem zrhat ki a
tnylegesen nagyobb azonostsi arny meglte. Ugyanakkor fontos kiemelni, hogy az ltalunk
szolgltatott, tblzatban bemutatott mrsi eredmnyek a SEAS nemzetkzi krelemzsben
megegyeztek a prhuzamosan dolgoz klfldi laboratriumok eredmnyeivel, teht a teljes
mrsre vonatkozan (belertve a mintaelksztst is) nem ll fenn mdszeres hiba jelenlte s
a rendszer valdi mintk mrsre alkalmasnak tekinthet. Egy ilyen, tnylegesen gyakorlati
lelmiszerminta (mlyfagyasztott tengeri rk) As-mdosulatanalitikai mintaelksztst s
mrst SZAB [2003] diplomadolgozata rszletezi.
2. Tblzat. ASEAS jel halmintbl savas roncsolssal ill. enzimes mintaelkszts segtsgvel kinyert
sszes As- s AsB-tartalom.

Mrrendszer / As-megoszls
sszes As, g g-1 RSD
Enzimes extrakcival kinyert As, g g-1 RSD
AsB-tartalom, g As g-1 RSD
Kinyersi hatsfok az sszes As-tartalom %-ban
Azonostsi hatsfok a kinyert As-tartalom %-ban

ICP-OES
43,7 1,1
43,5 2,1

99,5
84,4

HPLC-UV-HG-AFS

36,7 7,8

Az eredeti mintaelksztsi mdszer alkalmazsnak szksgessgt ill. az adott


paramtereknek az elmleti optimlis rtktl val tvolsgt az elz alfejezetben lertak
alapjn, statisztikai elveken nyugv megkzeltssel vizsgltuk meg. A STATISTICA statisztikai
programcsomag segtsgvel a 7. Mellkletben szerepl adatok alapjn kzeltett polinom
fggvny megoldsai a 3. bra lthatak; sajnos a program magyar nyelv vltozata nem volt
hozzfrhet, gy a feliratok angol nyelvek s magyarzatukat az brafelirat tartalmazza.
70

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

3. bra. A 7. Mellkletben bemutatott fggetlen vltoz prostsok ltal eredmnyezett As-kinyersi


hatsfok rtkek alapjn, a legkisebb ngyzetek elvt kvetve (Distance Weighted Least Squares) illesztett
polinom fggvny megoldsait bemutat 3 dimenzis kp (3 D Surface Plot). VAR1=extrakci idtartama
rban; VAR2=tripszin koncentrci m/m %-ban; VAR3=As-kinyersi hatsfok, %-ban. A fehr pontok a
mellkletben ismertetett prostsokhoz tartoz mrsi eredmnyeket mutatjk. A zld terletek kisebb, mg
a vrses rszek a nagyobb kinyersi hatsfokra utalnak; above jelentse: felett.

Az bra alapjn elssorban az tnik szembe, hogy a kt vltoz kzl az extrakcis id


(VAR1) jval fontosabb tnyez az enzimkoncentrcinl. Br a fggetlen vltoz prostsok
nem fedik le teljesen az sszes lehetsges varicit, egyrtelmen kiderl, hogy amennyiben a
rzats legalbb 5-6 rt tesz ki, gy enzim hasznlatra egyltaln nincs szksg a nagy (90%ot meghalad) extrakcis hatsfok elrshez. Rvidebb extrakcis id esetben pedig mg a
10 m/m %-ot meghalad enzim adagolsval sem lehet 85-87%-os hatsfok fl kerlni.
sszefoglalskppen azt lehet kijelenteni, hogy az NH4HCO3 puffer s nagy valsznsg
szerint mr az ioncserlt vz is az alkalmazott hmrskleten enzim hasznlata nlkl,
viszonylag rvid id (5-6 ra) alatt is mennyisgileg azonos kinyersre vezetett az eredetileg
hasznlt tripszines mintaelksztssel. Ezltal egyszerbb, kisebb kltsgigny s a
mintamtrixot enzimfehrjkkel tovbb nem terhel mintaelksztsi mdszert lehet vlasztani.
Termszetesen ezen optimlsi folyamat eredmnye nem vihet t teljes mrtkben ms
tengeri eredet (hal, rk, kagyl) minta mrsre; br eddig nem tallkoztunk sem olyan
kzlemnnyel, mely az ilyen jelleg mintk enzimes mintaelkszts egyrtelm elnyeire utalt
volna, s mint ahogy az osztrigaminta esetn is bizonyoss vlt laboratriumunk sem igazolta
a tripszin hasznlatnak szksgessgt. Nagyon valszn, hogy a tengeri (s llati eredet)
mintk zsrtartalma sokkal fontosabb s dntbb jelleg paramterknt kell, hogy szerepeljen
71

Dernovics Mihly

egy ismeretlen minta As-mdosulatanalitikai mintaelksztsnek tervezsnl, mint a


fehrjebont enzimes kezels felhasznlsnak krdse.
4.1.3. A vizsglt arzntartalm mintk enzimes mintaelksztsnek kritikai vizsglata
sorn elrt j tudomnyos eredmnyek
Arznnel dstott algaminta vizsglatval igazoltam, hogy sejtfalbont (drizelz) enzimes
kezelssel szignifikns mrtkben nvelni lehet mind az sszes arzn, mind pedig az Asmdosulatok kinyerst.
Tbbvltozs statisztikai mdszer (RSM) segtsgvel igazoltam, hogy termszetes (nem
dstott) As-tartalm halminta mdosulatanalitikai mintaelksztse sorn fehrjebont
enzimmel (tripszinnel) vgzett kezelssel nem lehetett szignifiknsan nagyobb As-kinyersi
hatsfokot elrni az enzimet nem alkalmaz mdszerek hasznlathoz kpest.
4.2. SZELNNEL

DSTOTT LESZTMINTK MDOSULATANALITIKAI MINTAELKSZTSNEK

KIDOLGOZSA

A szeln mdosulatanalitika ktsgtelenl leggyakrabban vizsglt mintja a Se-dstott


pkleszt (Saccharomyces cerevisiae; ld. 2.3.1.5.3. alfejezet). Klnsen a CLARK-fle
tanulmny [1996] kzlse ta jelentek meg egyre nagyobb szmban az ezzel a viszonylag
knnyen elllthat, tlnyomrszt SeMet-t tartalmaz s elvileg a legtbb, szelnptlsi cllal
forgalomba hozott trendi kiegszt alapjul szolgl, egysejt llnnyel foglalkoz cikkek.
Mivel a Se-mdosulatanalitika a mai napig nem rendelkezik egyetlen referenciaanyaggal sem, a
szelnes leszt alkalmasnak tnt arra is, hogy ezt az rt betltve nemzetkzi krelemzsek
alapjt kpezze, s gy jruljon hozz a tudomnyterlet fejldshez. Ugyanakkor hamar
vilgoss vlt, hogy az lesztk fajtl s fermentcis paramterektl fggen eltr sszettel
biomasszt kpeznek, amely megnyilvnulhat egyrszt a SeMet s a tbbi, kisebb mennyisgben
elfordul, kztes Se-anyagcsere vegylet (pl. Se-adenozil-szrmazkok) klnbz mennyisgi
arnyaiban, msrszt az leszt fehrjken kvli sejtalkotinak, pldul a lipidek s a sejtfal
sszettelnek / relatv mennyisgnek vltozsban. Hasonl mdon, a fermentci sorn
felhasznlhat szervetlen szelnmdosulatok (Se(VI), Se(IV)) tpusa, valamint az adagols s
gy a fermentci vezetsnek (rtpllsos /fed-batch/ vagy folytonos) jellege is
nagymrtkben befolysolhatja mind az elrhet dsts mrtkt, mind pedig a bepls fokt.
Az utbbi jellemvons klnsen fontos, hiszen rosszul vezetett fermentci esetn jelents
mennyisg szervetlen szelns maradhat az lesztksztmnyben, amely az gy egyszerre jelen
lv, klnbz Se-mdosulatok eltr biolgiai hozzfrhetsgn, felvehetsgn s
hasznosulsn keresztl nehzz teszi a felhasznlsi md s a napi fogyaszthat mennyisg
megadst. Mr az els vdett szabadalom is, melyet Se-dstott leszt ellltsra nyjtottak
be [NAGODAWITHANA 1985], kiemelten foglalkozott a szervetlen szeln jelenltnek
kzvetett mdon, mdosulatanalitikai mrsek nlkl (metilnkk-redukcis teszt rvn) trtn
kizrsval, amelyet msok is tvettek [DEMIRCI 1999a,b].
72

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

Az sszettelben tapasztalt eltrsek azt eredmnyeztk, hogy egy ideig egymsnak rszben
ellentmond kzlemnyek jelentek meg a pkleszt ltal hordozott Se-mdosulatokrl s az
egybknt hasonl mintaelksztsi eljrsok ltal elrhet kinyersi hatsfok rtkeirl. Majd
1999-ben a Se-mdosulatanalitikai vizsglatokkal foglalkoz laboratriumok szmra, gy
tanszknknek is, elrhetv vlt a Se-21 jel lesztminta, mely kimondottan a
mintaelksztsi mdszerek s mdosulatanalitikai mrrendszerek sszevetst clozta meg.
Ennek a mintnak a segtsgvel tbb eljrst dolgoztam ki s hasonltottam ssze, s ezltal
kialaktottam egy ltalnos, a Se-mdosulatanalitikai mintk elksztsre hasznlhat
megkzeltst, egyfajta metodikt, melyet ms szelnes lesztkn s a ksbbiekben
bemutatsra kerl kalapos gomba ill. brazil di mintknl is felhasznltam.
Ez az alfejezet a szelnnel dstott lesztkn vgzett, mdosulatanalitikai mintaelkszts
fejlesztst clz ksrleteimet mutatja be. A HPLC-mrrendszerek kialaktst, fejlesztsi
lpseit s mkdtetsi krlmnyeit a HPLC-HHPN-AFS sszellts esetben IPOLYI et al.
kzlemnye [2001a] s ZUBOR [2000] diplomadolgozata ismerteti, mg a HPLC-UV-HG-AFS
csatolt rendszert IPOLYI et al. kzlemnye [2001b] s CSABAI [2003] diplomadolgozata
tartalmazza.
4.2.1. A Se-21 jel, szelnnel dstott leszt mdosulatanalitikai mintaelksztsnek
kidolgozsa
4.2.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse
A Se-21 jel lesztminta ellltsrl nem rendelkeztnk adatokkal; elzetesen csupn a
ksztmny krlbelli sszes Se-tartalma (1-2 mg g-1 nagysgrendben) s LRM szint
elkezelse volt ismert ez utbbi minsts szerint homogenitsa s stabilitsa alkalmass tette
nemzetkzi krelemzseken val vizsglatokra. A mintaelksztssel kapcsolatban elrsok
nem szktettk mozgsteremet; ebbl kifolylag olyan eljrsok alkalmazst tztem ki clul,
melyek segtsgvel a lehet legtbb informcit lehetett kinyerni a mdosulatanalitikai
vizsglatok sorn. gy mindenkppen clszernek tnt a kvetkez mdszerek alkalmazsa: (i)
az ioncserlt vzzel trtn extrakci, mivel vrhatan az ezzel a lpssel extrahlt szervetlen Semdosulat rulkodhat majd a fermentcis folyamatban felhasznlt dst vegyletrl; (ii)
sejtfalbont enzimmel vgrehajtott kezels, amely egyrszt felszabadthatja a sejtfalhoz ktd,
Se-tartalm komponenseket, s segtheti a fehrjebont enzimek hozzfrst az intracellulris
fehrjkhez, msrszt a kinyersi hatsfokban megmutatkoz hasznossga/felesleges volta az
leszt biomassza fermentcit kvet kezelsi eljrsaira, pontosabban azok erteljes/gyengd
behatsaira utal jelknt rtelmezhet; (iii) fehrjebont enzimmel vgzett kezels, amely
elengedhetetlen a szerves eredet, Se-tartalm mintk vizsglatnl a felttelezheten fehrjkbe
(is) plt ill. fehrjealkot Se-mdosulatok miatt; (iv) lipidbont enzim alkalmazsa, amely az
extrakcit s az azt kvet elvlasztstechnikai lpst teheti eredmnyesebb s knnyebb az
esetleg zavar mrtkben jelen lv, mtrixalkot lipidek bontsa ltal. A kezelseket mind
egyenknt, mind pedig ahol az egymsra ptssel szinergens hats kialakulsra lehetett
szmtani szekvencilis kialaktssal is vgrehajtottam. Termszetesen nem fordultam olyan
73

Dernovics Mihly

mdszerek egyedi hasznlathoz, melyek szksgessgt sem szakmailag, sem pedig irodalmi
adatokkal nem lehetett altmasztani gy pl. csak lipidbont vagy csak sejtfalbont enzimre
pt extrakcira nem kerlt sor.
4.2.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa
Az enzimes mintaelkszts sorn drizelz, lipz s pronz enzimekkel hajtottam vgre
kezelseket, melyek jellemzit a 3.2. fejezet tartalmazza, a pufferek ksztshez hasznlt
K2HPO4 s KH2PO4 skkal egytt. A mintaelksztseket 15 ml-es fiolkban vgeztem,
amelyekbe egyenknt 170-180 mg Se-dstott lesztport mrtem ki, majd a kvetkezekben (AD) ismertetett extrakcik kerltek sorra, 180 perc-1 fordulatszm, termosztlt rzgp
segtsgvel. Az egyenknt 3 prhuzamossal vgrehajtott mintaelkszt lpsek utn
centrifuglssal (3700 g, 20 perc, 20C) vlasztottam szt az oldhatatlan rszt az extrahlt
komponensektl; tbblpses mdszer esetn a centrifuglssal ltrejv ledket hasznltam fel
a soron kvetkez lpshez. A B, C s D eljrsokat az emltett, teljes mveletre
vonatkoz prhuzamos mrseken kvl mg annyi kiegszt prhuzamossal vgeztem el, hogy
meg lehessen hatrozni a lpsenknti kinyersi hatsfok rtkeit: ezekben az esetekben ugyanis
az adott mintaelksztsi mveletet kveten a centrifuglssal levlasztott ledk a soron
kvetkez extrakcis lps helyett savas roncsolsra kerlt, teht tovbbi (pl. enzimes)
kezelsre mr nem nylt lehetsg.
A., 3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4) oldott 20 mg pronz enzimmel
vgrehajtott kezels, 21 rn keresztl, 37C hmrskleten;
B., 1. lps: 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl, 60C hmrskleten; 2. lps:
3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4) oldott 20 mg pronzt tartalmaz oldat, 21 rn
keresztl, 37C hmrskleten;
C., 1. lps: 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl, 60C hmrskleten; 2. lps:
3,0 ml, 0,1 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4) oldott 10 mg lipzt tartalmaz oldat, 37C
hmrskleten, 1 rn keresztl, amelyet 0,6 ml pufferben oldva 20 mg pronz hozzadsa
kvet, tovbbi 20 rs kezelssel, tartva a 37C fokos hmrskletet;
D., 1. lps: 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl, 60C hmrskleten; 2. lps:
3,6 ml ioncserlt vzzel ksztett (pH=5,7) 1 m/v %-os drizelz oldat, 4 rn keresztl, 37C
hmrskleten; 3. lps: 3,0 ml, 0,1 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4) oldott 10 mg lipzt
tartalmaz oldat, 37C hmrskleten, 1 rn keresztl, amelyet 0,6 ml pufferben oldva 20 mg
pronz hozzadsa kvet, tovbbi 20 rs kezelssel, tartva a 37C fokos hmrskletet.
A mveletek befejezse utn a centrifuglssal kapott fellszkat 0,45 m prustmrj
fecskendszrn keresztl juttattam 5,0 ml-es mrlombikokba, amelyeket vgl ioncserlt
vzzel tltttem jelre. Az gy kapott oldatok a mintaelksztstl fggen kerltek HPLC (Semdosulatanalitikai) s/vagy prhuzamos ICP-OES (sszes Se-tartalom) vizsglatokra. Az
ledket s a hozzjuk tartoz membrnszrlapokat savas roncsolssal (3.1. fejezet) trtam fel a
maradk szelntartalom megllaptsa vgett; a kezeletlen leszt sszes Se-tartalmt ugyanilyen
eljrssal hatroztam meg.
74

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.2.1.3. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok bemutatsa


az eredmnyek rtkelse
A ngy mintaelksztsi eljrs (A-D) nem csupn vgrehajtsukat illeten klnbztt
egymstl: azokat az eltr megkzeltsi mdokat is tkrzik, ahogyan a csak rszben ismert,
szerves eredet, Se-mdosulatanalitikai vizsglatra sznt mintkhoz fordulni rdemes. Kzs
bennk az, hogy enzimes fehrjehidrolzisre ptek alkalmazsuk sorn; ugyanakkor a ksr
enzimek s tbblpses eljrsok felhasznlsa olyan tbbletinformcit biztosthat, amellyel a
mdosulatanalitikai eredmnyeken tlmutat ismeretanyagra is szert lehet tenni, gyakran akr
nem sokkal id- vagy kltsgignyesebb mdszerek rn. Egyrtelmen az egylpses, szles
szubsztrtspektrum fehrjebont enzim alkalmazsra pt eljrs (A) szmt a
legegyszerbbnek; azonban figyelembe kell venni, hogy amennyiben az ezzel a mdszerrel
vgrehajtott mintaelkszts utn szervetlen Se-mdosulatok jelenltt tudjuk kimutatni, gy
nincs lehetsg annak eldntsre, hogy ez a Se-frakci eredetileg is jelen volt-e a mintban,
vagy pedig a mintaelkszts sorn jttek ltre ms Se-mdosulatbl trtn talakulssal.
Ennek eldntsnek cljbl fordultam az ioncserlt vzzel trtn extrakcihoz a tbbi hrom
mdszer els lpseknt beillesztve, 60C fokon, amely mg bizonyosan nem vlt ki
mdosulattalakulst, de nagy valsznsggel oldatba tudja vinni a rendszerint knnyen
extrahlhat szervetlen Se-mdosulatokat feltve, hogy jelen vannak a mintban (ld. 2.3.1.2.
fejezet). A B mdszer teht a vizes extrakci s az A mdszer egyms mg ptsvel jtt
ltre. A C eljrs klnll jellegt a prhuzamos enzimes lipid hidrolzis alkalmazsa jelenti,
amely az esetleg nagyobb mrtkben jelen lv s homogn oldat kialakulst nehezt lipid
vegyletek bontsval jrulhat hozz az extrakcis hatsfok nvelshez. Mivel ebben az
esetben a fehrjebont enzim valsznleg a lipzt is szubsztrtknt kezeli, 1 rn keresztl csak
a lipz mkdst tettem lehetv, s csupn ezt kveten adagoltam az egybknt nagy
feleslegben felhasznlt pronz enzimet. Gyakorlati tapasztalatok alapjn a lipidbontssal egytt
jr pH-cskkens ellenslyozsra a 0,05 mol l-1 foszftpuffer koncentrcijt 0,1 mol l-1-re
emeltem. A D mdszer abban klnbztt az sszes tbbitl, hogy sejtfalbontsi lpssel
egsztette ki a szelntartalm leszt kezelst; ettl a msodik lpstl azt lehetett vrni, hogy
az lesztsejtfal alkotinak bontsn keresztl teheti knnyebb a harmadik lpsben kvetkez
fehrjebonts menett.
A kezeletlen eredeti lesztminta savas roncsols utn ICP-OES technikval meghatrozott
sszes Se-tartalma 1352 g g-1-ot tett ki (RSD: 1,1%); ezt az rtket vettem alapul akkor, amikor
a 3. tblzatban bemutattam a ngy mintaelksztsi eljrssal elrhet kinyersi hatsfok
relatv rtkeit, melyeket a centrifuglsi lpsek utn ltrejv ledkek (ugyancsak) savas
roncsolsa rvn lehetett meghatrozni.

75

Dernovics Mihly

3. Tblzat. A Se-21 lesztmintn alkalmazott mintaelksztsi mdszerek segtsgvel elrt relatv


kinyersi hatsfok rtkei, az leszt sszes Se-tartalmnak (1352 g g-1) szzalkban.

Mintaelksztsi
mdszer jele
A
B
C
D

Vizes
extrakci

12,4%
11,7%
11,9%

Egyes mintaelksztsi szakaszok


sszestve
Egyttes lipid- s
Sejtfalbonts
Fehrjebonts
fehrjebonts
88,6%
88,6%

77,7%
90,1%

79,1%
90,8%

8,1%
70,1%
90,1%

Mint vrhat volt, nem lehetett szignifikns klnbsget kimutatni azon mintaelksztsi
eljrsok els lpseinek extrakcis rtkeiben, melyek ugyanazon (ioncserlt vzzel
vgrehajtott) kezelst tartalmaztk (ld. msodik oszlop). Ugyanakkor a tblzat utols
oszlopban feltntetsre kerlt, sszestett hatsfokok kztt sem tapasztaltam mrhet eltrst:
sem a pronknt elvgzett Welch-prbk, sem pedig az egytnyezs varianciaanalzis nem tallt
szignifikns klnbsget a ngy mdszer kztt. A C s D eljrsokban a lipidbont enzim
prhuzamos alkalmazsa nem vezetett nagyobb kinyersi hatsfokhoz a csupn pronzt
tartalmaz extrahl elegyekhez kpest. A sejtfalbont enzim mkdse kln, fggetlen
lpsknt illesztve a D mveleti sorba , br mrhet szelnfelszabadulssal jrt egytt,
sszessgben nem tekinthet elengedhetetlen szereplnek a mintaelkszts folyamatban.
Ezen eredmnyek alapjn tbb kvetkeztetst is le lehet szrni: (a) a mind a ngy
mdszerben felhasznlt pronzos kezels dnt fontossgnak bizonyult, hiszen a ksr
kezelsek meglttl fggetlenl is, a kombinlt kezelsekkel statisztikailag azonos (90% krli)
kinyersi hatsfok elrst tette lehetv; (b) a sejtfalbont enzim az sszes Se-tartalomra
vettve statisztikailag szksgtelen alkalmazsa arra utalhat, hogy a Se-21 leszt ellltsa
sorn sem a fermentci vezetse, sem pedig az azt kvet valsznleg porlasztva szrtssal
vgrehajtott vztartalom-cskkents nem a sejtek psgnek megrzse jegyben zajlott, az
lesztsejtek nagymrtkben krosodhattak, gy a fehrjehidrolzis az intracellulris sejtalkotkat
is elrhette; (c) a minta lipidtartalma nem szmottev, nem akadlyozza az enzimes
mintaelkszts folyamatt, gy lipidbont enzim hasznlatra az sszes Se-tartalomra vettett
kinyersi hatsfok szempontjbl nincs szksg.
A msodikknt emltett (b) kvetkeztets sszhangot mutat azokkal az eredmnyekkel,
melyekre ZUBOR [2000] a laboratriumunkban ellltott [PRUNK 2000], szelnnel dstott
friss pkleszt mdosulatanalitikai vizsglata sorn jutott: az esetben mg a kombinlt
enzimes mintaelkszts rvn sem sikerlt 64% fl emelni a mintbl kinyerhet szeln
mennyisgt, teht a sejtfal psge valsznleg fontos sszetevnek tekinthet az extrakcis
mveletek hatsfoknak alakulsban.
Br az sszes Se-tartalomra vonatkoztatott extrakcis hatsfokokat tekintve nem
tapasztaltam szignifikns klnbsget, a mdosulatanalitikai vizsglatokra clszer volt azt a
mintaelksztsi mdszert vlasztani, amely a legtbb jrulkos informcival szolglhat mind
a mintrl, mind pedig magrl a mintaelksztsi mveletek egyenknti hatsrl. Ebbl
kifolylag a D jel mdszert vlasztottam, s mindhrom kezelsi szakaszt kveten a
76

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

centrifugls segtsgvel elvlasztott s mikroszrssel tovbb tiszttott, extrahlt


komponenseket tartalmaz oldatot HPLC-HHPN-AFS mrrendszer segtsgvel elemeztk a
Se-mdosulatok minsgi s mennyisgi meghatrozsa vgett.
4.2.1.4. A mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse
A D jel, hromlpses mintaelksztsi mdszerrel elrt mdosulatanalitikai s
hatsfokokra ill. megoszlsokra vonatkoz eredmnyeket a 4. tblzat s a 4. bra tartalmazza.
Az sszestett kinyersi hatsfok kiss meghaladta a 90%-ot, s a 4. tblzat legals sorban
feltntetett megoszlsi adatok szerint hasonl kpet mutatott a korbbi, mg mdosulatanalitikai
mrsek nlkli ksrlet eredmnyvel. Hrom Se-mdosulatot, a kt szeleno-aminosavat
(SeCys2 s SeMet) s a szervetlen Se(VI)-ot mutattunk ki az egyes mintaelksztsi lpsek
sorn kapott mintaoldatokbl; e hrom vegylet eloszlsa jellegzetes kpet ad a D mdszer
egyes lpseinek mintra kifejtett hatsairl s termszetesen magrl a mintrl is.
4. Tblzat. Se-21 szelnnel dstott lesztminta hromlpses enzimes mintaelkszts rvn kinyert Semdosulatainak megoszlsnak s az elrt kinyersi hatsfoknak bemutatsa. K.H. = kimutatsi hatr

HPLC-HHPN-AFS eredmnyek,
g Se g-1 minta

Mrrendszer
Mintaelkszts /
azonostott
mdosulatok
SeCys2
SeMet
Se(VI)

sszestve

ICP-OES eredmnyek,
g Se g-1 minta

Vizes
extrakci

Sejtfalbonts

Fehrje-s
lipidbonts

sszestve
(zrjelben %os rtkknt)

Nem
kinyerhet
Se-tartalom

Minta
sszes
Se-tartalma

Kinyersi
hatsfok

54
<K.H.
<K.H.
54

51
80
21
152

92
749
82
923

197 (17)
829 (74)
103 (9)
1129 (100)

131

1352

90,3%

Extrakcis lpsenknt kinyert szeln megoszlsa


Az azonostott Semdosulatok
megoszlsa az sszes
Se-tartalom %-ban
Lpsenknt
felszabadtott Se
megoszlsa az sszes
Se-tartalom %-ban

4%

11%

68%

83%

11,5%

8,0%

70,8%

90,3%

Az els, csupn ioncserlt vzzel vgrehajtott extrakci sorn szervetlen Se-mdosulatot


nem azonostottunk a fellszban, amely ekkor mg arra engedett kvetkeztetni, hogy az
leszt fermentcis folyamata sorn minden bizonnyal nem kvettek el technikai hibt s a
dstshoz hasznlt szelns teljes mrtkben felvtelre s az anyagcsere-folyamatokon keresztl
beptsre kerlt. A retencis id alapjn vgrehajtott mdosulatazonosts SeCys2 jelenltt
igazolta ebben a frakciban; nagyon valszn, hogy ez a komponens a szelnnel dstott leszt
legnagyobb mennyisgben szintetizlt Se-mdosulatnak, a SeMet-nak oxidlt formja, a
szeleno-oxo-metionin (SeOMet; ld. 2.3.1.8. szakirodalmi alfejezet). Ha ez a feltevs igaz, akkor
rszben a klnbz Se-mdosulatok eltr meredeksg kalibrcis egyenesei miatt
magyarzatul szolglhat a tblzat utols kt sornak ioncserlt vzzel vgrehajtott kezelsre
vonatkoz, megoszlsi arnyokban tapasztalt eltrsnek: lehetsges, hogy a SeCys2-knt
77

Dernovics Mihly

azonostott s mennyisgileg meghatrozott komponens valjban SeOMet s ez a mdosulat


adja a kinyert 11,5%-nyi szeln jelents rszt. Termszetesen ms, ugyanezen retencis id
krnykn eluld mdosulat jelenlte is okozhatta az elbb emltett klnbsget.

Extrakcival kinyert Se-mdosulatok


-1
mennyisge, mg Se kg minta

1400
1200

Teljes Se

1000

Se(VI)

800

SeMet

600

SeCys2

400
200
0
Vizes extr.,
HPLC

Sejtfalbonts,
HPLC

Fehrje- s
lipidbonts,
HPLC

sszestve,
HPLC

Teljes Se-tart.,
ICP-OES

4. bra. Se-21 szelnnel dstott lesztminta hromlpses enzimes mintaelkszts rvn kinyert
Se-mdosulatainak megoszlsnak bemutatsa.

A sejtfalbontsi lps sorn tovbbi kt mdosulat, a SeMet s a Se(VI) jelent meg az


extraktumban, 8%-kal jrulva hozz a frakci sszes Se-tartalmt tekintve az sszestett
kinyersi hatsfokhoz. A tny, hogy SeMet fordul el a sejtfalbont enzimkeverkkel vgzett
feltrsnak ksznheten, arra utal, hogy a drizelz szmottev fehrjebont aktivitssal is
rendelkezik ez a lehetsg ill. aktivits a gyrt cg (Fluka) katalgusban is emltsre kerlt.
Ebbl az kvetkezik, hogy amennyiben szt szeretnnk vlasztani a klnbz kezelsek sorn
elfordul enzimaktivitsokat, s a fehrjebontst a tisztn fehrjebontsi clzattal adagolt enzim
alkalmazsi lpsnl szeretnnk teljess tenni, gy clszer szelektven gtolni a keverk ilyen
irny aktivitst. A Se(VI) megjelense nem vrt fejlemnynek tekinthet: a szelnes lesztt
gyrt cgek tbbnyire a kisebb kltsggel beszerezhet Na-szelenit (Se(IV)) st hasznljk fel a
Se(VI) vegyletek helyett, s gy rosszul vezetett fermentci vagy hamists (=fermentci
lelltst kveten Se(IV)-tartalm soldat leszt biomasszhoz trtn keverse) esetn ennek
a mdosulatnak a kimutatsa szolgl ltalban figyelmeztet jelknt, enzimes extrakci nlkli,
pl. ioncserlt vzzel vagy pufferrel vgrehajtott extrakci tjn [BHYMER 2000]. Radsul a
Se(VI) szerepel a harmadik extrakcis lps, a fehrjebonts sorn nyert fellszban is, s
Se(IV) jelenlte egyik alkalommal sem ksri. Mivel az leszt az anyagcserjbe bekerl
szelentokat szelenitt reduklja a szulft-szulfit anyagcserhez hasonlan [ONO 1996;
DEMIRCI 1999a,b], a Se(VI) valsznleg az leszt ltal fel nem vett, ennl a mintnl
dstsra hasznlt szelentbl szrmazhat. gy tnik, hogy ez a mdosulat a Se(IV)-nl
ersebben ktdik a mintamtrixhoz, s felszabadtshoz a mtrix (itt enzimes ton trtn)
78

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

bontsa s/vagy az alkalmazott foszftpuffer ioncserl hatsa (foszftokszelentok) is


szksgesnek bizonyult. Fontos rgzteni, hogy az itt alkalmazott mintaelksztsi lpsek
bizonytottan nem alaktjk t a kinyerhet Se-mdosulatokat [ZUBOR 2000], teht pl. a Se(VI)
nem egy esetleges, mintaelkszts kzben vgbemen Se(IV) oxidci eredmnye.
Az els lps megoszlsi paramterekben tapasztalt eltrseihez kpest a msodik lpsnl
kinyert sszes Se-tartalommal (8%) kapcsolatban javul tendencia figyelhet meg az azonostott
Se-mdosulatokhoz (11%) trtn viszonyts tern: az itt is SeCys2-knt kezelt mdosulat
arnya cskkent a kt msik, nagyobb biztonsggal azonostott mdosulatokhoz (SeMet s
Se(VI)) kpest, gy a kt, szzalkban kifejezett rtk kzeledett egymshoz. Ugyangy a
harmadik, pronzzal vgzett fehrjehidrolzisnl a kt megoszlsi paramter szinte teljesen
megegyezik (68% s 70,8%), amely arra utal, hogy arnyaiban mg tovbb ntt a biztos
mdosulatok mennyisge. A pronzos kezels rvn a fehrjk bontsval nagy mennyisgben
szabadult fel SeMet, s az elbb emltett okokbl kifolylag a kezels tovbbi Se(VI)
kiolddshoz is vezetett.
sszessgben az lesztmintbl kinyert s azonostott Se-mdosulatok kzl a SeMet
dominns jellege nyilvnvalv vlt, s kisebb mennyisgben mg szervetlen mdosulat
(Se(VI)) is meghatrozsra kerlt, a bizonytalan azonosts SeCys2-nel egytt. Ugyanakkor
rdemes megemlteni, hogy a korbban jelzett (2.3.1.8. alfejezet), az utbbi mdosulat
lesztben gyantott hinyra utal cikk ta mg mindig jelennek meg olyan kzlemnyek,
melyek tovbbra is SeCys2 azonostsrl szmolnak be lesztmintk vizsglatnl [ZHENG
2003]; ebbl kvetkezik, hogy ezen a terleten is tovbbi vizsglatokra van szksg. A pronzos
extrakci utols (harmadik) kezelsi lpsben mutatott sikeres volta kzvetett bizonytkul
szolgl arra, hogy a megelz lpsek sorn alkalmazott eljrsok ellenre az leszt fehrji
tovbbra is centrifuglssal lepthetek maradtak, teht rendelkezsre lltak a soron kvetkez
mintaelksztsi lpsek szmra. A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy az leszt esetben
amennyiben nem felttlenl szksges nem kell ragaszkodni az egylpses mintaelksztsi
eljrsokhoz, s szekvencilis mdszerek fejlesztsvel valban lehetsg nylhat jrulkos
ismeretek szerzsre; ennl a mintnl minderre j pldaknt szolglhat a sejtfalbont
enzimkeverk hatsnak (SeMet extrakci) s Se(VI) viselkedsnek (Se(IV)-hez kpest
megfigyelt, valsznleg ersebb mtrix-ktds) megfigyelse.
4.2.2. LRM cljbl ksztett Se-dstott leszt mdosulatanalitikai vizsglata
4.2.2.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse
A 4.1.2.2. fejezetben emltsre kerlt a SEAS program, melynek keretben As- s Semdosulatanalitikai clokhoz ksztett LRM-jellt mintk elemzst hajtottuk vgre [SEAS
2002]. A termszetes As-tartalm sima lepnyhal mellett Se-dstott leszt vizsglatval is
foglalkoztunk. Ez utbbi minta nem eseti gyrtmnyknt, hanem tbb v ta fut termelsbl
szrmaz ksztmnyknt kerlt a jelltek kz: a Pharma Nord dn gygyszeripari s
biotechnolgiai cg Bioselenium nven forgalomba hozott, szelnptl lelmi kiegsztjnek
alapjt kpezi a hagyomnyos pkleszt fermentcijnak mdostsval ellltott,
79

Dernovics Mihly

szelntartalm biomassza. A valdi zemi mretben (100 m3-es fermentorban), teljes mrtkben
szablyozott paramterek mellett, pontosan meghatrozott, a sznforrs kivtelvel kizrlag
szervetlen alapanyagokkal (kztk Na-szelenittel) gyrtott leszt rtheten knnyen teljestette
az olyan alapvet, LRM-ekkel szemben tmasztott kvetelmnyeket, mint pl. a homogenits. A
mdosulatanalitikai clokra sznt ksztmny csupn abban klnbztt a gyrtsorrl lekerlt
termkektl, hogy a szelnnel dstott, pasztrizlt s porlasztva szrtott lesztbl kzvetlenl,
a tablettagyrtshoz szksges kiegszt mveletek nlkl kpeztek csomagolsi egysget, kb.
20 grammos kiszerelseket hozva ltre a kzeltleg 96 m/m % szrazanyag-tartalm
biomasszbl.
Feladatom a lepnyhal esethez hasonlan abbl llt, hogy kidolgozzam a minta
mdosulatanalitikai mintaelksztst, gy tve lehetv az leszt ltal hordozott Semdosulatok minsgi s mennyisgi meghatrozst. A mintaelksztsi mdszer korbbi
tapasztalatokon (Se-21) alapul kivlasztst nagyban segtette a gyrt cg azon az
ltalnos ellltsi mdszer bemutatsa mellett tudomsunkra hozott vizsglati eredmnye,
hogy a dstsi clbl adagolt szervetlen szelnst (Se(IV)) nem tudtk kimutatni a
rendelkezsre bocstott lesztmintbl. Ebbl nyilvnvalv vlt, hogy nincs szksg kln
elvgzett ioncserlt vizes (vagy pufferelt kzeg) extrakcira, mivel ez a lps vrhatan nem
vezetett volna rdemi Se-kinyershez. Msrszt a knnyen vgrehajthat, viszonylag egyszer
eljrsra val trekvs s a Se-21-nl leszrt kvetkeztetsek maguk utn vontk, hogy a
termszetesen enzimes fehrjebontsra pt mintaelksztsi eljrsban nem kerlt sor sem
sejtfalbont, sem pedig lipidbont enzimek alkalmazsra; egylpses, pronzzal vgrehajtott
kezelst vlasztottam.
Ahogy a halmintnl is, gy a szelnes leszt pontosabban: annak egy korbbi gyrtsi
ciklusbl szrmaz mintja is tesett egy elzetes mdosulatanalitikai vizsglaton, amelyet a
gyrt cgtl fggetlen laboratrium vgzett el, s a kapott mrsi eredmnyekhez is
hozzjuthattunk [SEAS 2002]. Ezekbl arra derlt fny, hogy a mintaelkszts sorn a
leginkbb kritikus pontnak a SeOMet kpzdse szmt, amelyet tbbek kztt a sejtfalbont
kezels elkerlsvel lehet elkerlni gy teht egy kvetkez rv is az egylpses fehrjebont
mdszer mellett szlt. Vizsglataik sorn a szban forg laboratrium a Sigma cg ltal gyrtott
XIV-es tpus protezt hasznlta. Mivel ez az enzim nagysgrendekkel kisebb aktivits a Merck
cg pronz (ms megnevezsben ugyancsak XIV-es tpus protez) ksztmnyvel szemben, j
alkalom addott arra is, hogy a nemzetkzi krelemzsben rejl elnyket kihasznlva mindkt
enzimmel elvgezzem a feltrst, gy prblva megvlaszolni a kt gyrtmny
hasznossga/alkalmazhatsga kzt fennll krdseket.
4.2.2.2. A felhasznlt vegyszerek s az alkalmazott mintaelkszts bemutatsa
Az enzimes mintaelkszts sorn XIV-es tpus protez (Sigma) s pronz (Merck)
enzimekkel hajtottam vgre kezelseket, melyek jellemzit a 3.2. fejezet tartalmazza, a pufferek
ksztshez hasznlt K2HPO4 s KH2PO4 skkal egytt. A mintaelkszts menett a
kvetkezkppen alaktottam ki: 0,15 g mintt 15 ml-es fiolban 6,5 ml, 0,04 mol l-1
80

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

koncentrcij foszftpufferben (pH=7,4) oldottam fel; ezt a folyamatot ultrahangos berendezs


segtsgvel gyorstottam. Ezt kveten az elzvel azonos puffer 1 ml-vel 15 mg pronz vagy
XIV-es tpus protez enzimet juttattam az elegyhez, s sszekevers utn termosztlt
rzfrdben 37C hmrskleten, 24 rn t 180 perc-1 fordulatszmon rzattam. A 6-6
prhuzamossal vgrehajtott enzimes kezelsek utn centrifuglssal (4100 g, 25 perc, 20C)
vlasztottam szt az oldhatatlan rszt az extrahlt komponensektl, majd a ltrejv ledket
vortex berendezs segtsgvel mg ktszer, egyenknt 1-1 ml pufferoldattal bltettem t, s
jra elvgeztem a korbban ismertetett centrifuglsi lpseket. A mveletek befejezse utn a
centrifuglssal kapott, sszetartoz fellszkat 0,45 m prustmrj fecskendszrn
keresztl juttattam 10,0 ml-es mrlombikokba, amelyeket ioncserlt vzzel tltttem jelre. Az
gy kapott oldatok kerltek a HPLC (Se-mdosulatanalitikai) s prhuzamos ICP-OES (sszes
Se-tartalom) vizsglatokra.
Az ledket s a hozzjuk tartoz membrnszrlapokat savas roncsolssal (3.1. fejezet)
trtam fel a maradk szelntartalom megllaptsa vgett, s az leszt sszes Se-tartalmt
ugyanilyen eljrssal hatroztam meg.
4.2.2.3. A kt Streptomyces griseus fehrjebont enzimkeverkkel elrt kinyersi hatsfokok s a
mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse
A mdosulatanalitikai szakirodalomban vlhetleg a GILON et al. kzlemny [1995]
hatsra a Sigma cg ltal forgalmazott XIV-es protez dominns jellege
megkrdjelezhetetlen, annak ellenre, hogy a Merck-fle ksztmny mind a fajlagos aktivits /
kltsg arnyt tekintve, mind pedig a ksranyagok terletn (lsd Ca2+-csapadk
kialakulsnak veszlye, 2.3.1.5.3. fejezet) kedvezbb mutatkkal br. Ezen httr szolglt alapul
ahhoz, hogy kihasznlva a nemzetkzi krelemzs ltal biztostott ellenrzsi lehetsget a
SEAS lesztminta mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan elvgezzem a kt enzim
sszehasonltst is.
Az 5. tblzat tartalmazza mind az sszes Se-tartalom meghatrozs, mind pedig az enzimes
mintaelkszts eredmnyeit. Br az 1374 g g-1-ot kitev szeln mennyisgnek kzel azonos,
83-85%-t szabadtotta fel a kt enzim, a statisztikai elemzssel azt lehetett megllaptani, hogy a
Merck-fle ksztmny hasznlata szignifiknsan nagyobb kinyersi hatsfokot eredmnyezett.
Ugyanakkor a kt rtk kzelsge azt is jelzi, hogy a fajlagos aktivitsban fennll, tbb mint
hrom nagysgrendnyi klnbsg (4,8 ill. 11470 U mg-1 ksztmny) alig jelentkezik a
gyakorlati felhasznls sorn; ennek htterben az llhat, hogy ez a Se-dstott lesztpor nem
tartozik a komplex, nehezen feltrhat mintk kz, hiszen mind szemcsemrett, mind
homogenitst, mind pedig a ksr mtrixkomponenseket illeten nem teszi nehzz a
mintaelkszts oroszlnrszt vgrehajt enzimes fehrjehidrolzis folyamatt. Erre utalt a
korbbi, Se-21 minta vizsglata is, jelezve, hogy sem a lipidek, sem a sejtfaleredet
makromolekulk prhuzamos vagy elzetes bontsa nem szksges a megfelel extrakcis
hatsfok elrshez. A pronz ltal biztostott 85,9%-os kinyers lesztmintk esetben
megfelelnek szmt (lsd 4. Mellklet tblzatt).
81

Dernovics Mihly

5. Tblzat. A SEAS Se-dstott lesztminta savas roncsolsa s a klnbz enzimes mdosulatanalitikai


vizsglatai sorn kinyert sszes Se- ill. SeMet-tartalma.

Mrrendszer /
Mintaelkszts

Savas
roncsols

sszes Setartalom
XIV-es tpus
protez (Sigma)

Enzimes
extrakci Pronz (Merck)
SeMet-tartalom

ICP-OES eredmnyek
Kinyert szeln
g Se g-1 minta
RSD

Kinyersi
hatsfok
% RSD

1374 0,7

---

1062 5,4

83,2 1,2

1198 3,0

85,9 1,2

HPLC-UV-HG-AFS
eredmnyek
g Se g-1 minta

Azonostsi arny
a kinyert szeln
mennyisgnek
fggvnyben, %

934 4,3

78,0

A mdosulatanalitikai vizsglatokhoz a Merck enzimet hasznltam fel. A HPLC-UV-HGAFS csatolt rendszer segtsgvel hrom Se-mdosulatot, SeMet-t, SeCys2-t s Se(IV)-et
minsgileg tudtunk azonostani. Az utbbi kt mdosulat kzl a szelenocisztin jelenltt meg
kellett krdjeleznnk a korbban mr emltett, SeOMet lehetsges kialakulsbl fakad
bizonytalansg miatt, mg a Se(IV) mrsek kis megbzhatsga nem tette lehetv ez utbbi
mdosulat mennyisgi meghatrozst, melyet vgl csak a SeMet-ra vgeztnk el. Az enzimes
mintaelkszts sorn kinyert szeln 78%-t alkotta ez az aminosav, amely az sszes Setartalomra vettve 68%-ot jelent. Br a 4. Mellklet tblzatnak adataihoz kpest ez az rtk
inkbb csak elfogadhatnak szmtana, figyelembe kell venni, hogy a 100%-hoz kzeli
azonostsi rtkre utal kzlemnyek j rsze mg akkor ltott napvilgot, amikor egyrszt a
SeCys2 lesztre vonatkoztatott hinyrl mg nem rendelkeztnk ismeretekkel, msrszt egy
sor, azta mr lesztben is azonostott br standard vegyletknt forgalomba mg nem hozott
Se-mdosulat vizsglatra mg nem kerlhetett sor. Az ltalunk meghatrozott 68%-os SeMettartalom tkletes sszhangban van mind a SEAS nemzetkzi krelemzsben rszt vev klfldi
intzetek ugyanezen a mintn vgzett mrseivel [SEAS 2003], mind pedig egyes vezet eurpai
laboratriumok jabban kzlt, azonos forrsbl (Pharma Nord) szrmaz mintkra vonatkoz
eredmnyeivel [LARSEN 2003].
4.2.3. A szelnnel dstott lesztmintk vizsglata sorn elrt j tudomnyos eredmnyek
Megllaptottam, hogy az zemi fermentcival ellltott, tbbek kztt szrtssal
stabilizlt s a szemcsemretet tekintve az ltalnos LRM kvetelmnyeknek megfelel Sedstott leszt nem szubsztrtspecifikus fehrjebont enzimmel vgrehajtott mdosulatanalitikai
mintaelksztsnl a sejtfal- ill. lipidbont enzimek hasznlata szignifiknsan nem nvelte a
Se-kinyersi hatsfokot.
Se-dstott lesztn vgzett, egylpses enzimes mdosulatanalitikai mintaelkszts
segtsgvel sszehasonltottam a szakirodalomban legtbbszr jegyzett fehrjebont
enzimkeverket (XIV-es tpus protez; Sigma) az ugyanazon fonalas baktrium ltal ellltott,
eltr tulajdonsgokkal br pronz enzimmel (Merck). Az elvgzett statisztikai elemzs alapjn
82

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

megllaptottam, hogy a kt enzimmel elrhet kinyersi hatsfok szignifikns mrtkben


klnbzik: a Merck-fle enzim hasznlatval nagyobb mennyisg szeln extrahlhat.
4.3. SZELNNEL

DSTOTT GOMBA MDOSULATANALITIKAI MINTAELKSZTSNEK KIDOLGO-

ZSA

Az ehet gombk tpllkozs-lettani szemszgbl meglehetsen ellentmondsos, vagy


legalbbis nem egyrtelm megtls al esnek. Egyrszt kiemelked lelmi fehrje-, svnyi
anyag s nyomelemtartalommal brnak, amelyhez csak kis mennyisg sznhidrt trsul, gy
elvileg megfelelnek a modern tpllkozs ltal tmasztott kvetelmnyeknek. Ugyanakkor a
leggyakrabban fogyasztott gombk, gy az Agaricus nemzettsg is a krnyezetben (erdei talaj
ill. komposzt) megtallhat fmionokat akr 100-szoros dstsi faktorral veszi fel [RCZ
2000b], s gy a szennyezett terletekrl szedett gomba toxikus fmtartalma lelmiszer-biztonsgi
agglyokat vet fel. Az 1986-os csernobili katasztrfa kvetkezmnyeknt a lgkrbe, majd
kimosdssal talajba kerlt, radioaktv 137Cs izotp olyan mrtkben jelent meg a kelet-eurpai
gombaexportban, hogy az EU kln jogszabllyal rendelkezett az ellenrzs mdjrl s a
sugrzsi hatrrtkekrl [RCZ 2000a]. A helyzet sszetettsgt jelzi, hogy a nyugat-eurpai
eredet sem felttlenl garantlja a kis toxikus fmtartalmat, hiszen tbb orszgban (ld.
Nmetorszg) nincs elrs a komposzt minstsre, emiatt az azon termesztett gomba
vlheten nem radioaktv, de mrgez fmionokat ugyancsak tartalmazhat.
Ha eltekintnk a fmtartalomtl, egyetlen tpllkozs-lettani krds marad nyitva: a gomba
sszetevinek, beltartalmi rtkeinek biolgiai hozzfrhetsge. Az emberi szervezet csak
tttelesen, a blflra bizonyos baktriumai ltal kpes emszteni a rszben kitinbl s
(hemi)cellulzbl ll gombasejtfalat, gy eleve gtolt a tbbi komponens, pl. a fehrjk
emsztse. Rszben ez a jelensg llhat azon megfigyels mgtt is, hogy a szeln gombbl
szvdik fel legkevsb (< 5% mrtkben), hiszen ha felttelezzk a szeln fehrjkben val
ktttsgt a fehrjkhez trtn hozzfrs gtlsa kzvetve akadlyozhatja a szelnfelvtelt
is [CHANSLER 1986]. Azonban ahogy a szeln s a mdosulatanalitika kapcsolatt bemutat
2.1.1. alfejezetben mr jeleztem a szelnnel dstott gomba patknyksrletekben
tumorszupresszv hatst mutatott, amelynek mrtke sszevethet volt a prhuzamos vizsglatok
sorn szervetlen szelns (Se(IV)) ltal elrt hatshoz [SPOLAR 1999].
Az utbbi eredmnyek rvilgtanak arra a problmra, amely a szeln mdosulatanalitika
gyakorlati felhasznlsban lt(tt) testet: hinyos ismeretekkel rendelkeznk szmos lelmiszer
gy pl. a gombk szelnmdosulatairl. A korbban emltett, a gombk cziumfelvtelvel
kapcsolatos vizsglatok szerencsre hozzjrultak ahhoz, hogy meginduljanak az ltalnos, tbb
elemre is kiterjed akkumulcis vizsglatok, s sor kerlt a szelnre is. VAN ELTEREN et al.
[1998] radioaktv szeln- s cziumsk segtsgvel tanulmnyoztk e kt elem felszvdst
csiperkegombban (Agaricus bisporus), s pufferelt kzeg extrakcival elksztett
mretkizrsos kromatogrfiai eljrssal igazoltk, hogy a szeln felvtelt annak
metabolizmusa, teht molekulkba trtn beplse kveti. A tnkbl 4, mg a kalapbl 5,
klnbz molekulatmeg, szelntartalm sejtalkott mutattak ki, s felhvtk a figyelmet a
83

Dernovics Mihly

tovbbi mdosulatanalitikai vizsglatok fontossgra. Haznkban VETTER [1990, 1993] s


RCZ et al. [2000a,b] mikolgiai-analitikai kutatsai rdemelnek figyelmet: mg VETTER a
vadon term gombafajtk mikroelem-tartalmt kztk a szelnt is hatrozta meg s
hasonltotta ssze, addig RCZ et al. kifejezetten a komposztalap termesztssel kszlt
csiperke toxikus fmion- s szelnfelvteli mechanizmust tanulmnyozzk. Ez utbbi csoportot
nem is titkoltan az a cl vezrli, hogy funkcionlis lelmiszerknt szmtsba jv termket
lltson el; mivel mind a magyarorszgi csiperkegomba termeszts (a vilg termesztsnek 1%a), mind pedig a fogyaszts a rgiban kiemelkednek szmt, vals eslye lehet egy szelnnel
dstott gomba piaci bevezetsnek. Mindehhez csak a mestersges, szelnnel kiegsztett
komposzton termesztett csiperke lehet alkalmas, mivel az Agaricaceae csald vadon term
egyedei a szelnben szegny magyarorszgi erdtalajokon csupn 4,6-7,6 g g-1 szrazanyag
mennyisgben tartalmazzk ezt a mikroelemet [VETTER 1990, 1993].
Kutatcsoportunk ebben a helyzetben vette fel velk a kapcsolatot, s mintkat krtnk a
ksrleti stdiumban lv termesztsbl. Kt fajta csiperkegombt vizsgltunk: az els tpus
termesztsnl a szelnnel trtn dsts cljbl a komposztba szervetlen szelnst (Se(IV))
kevertek, mg a msik esetben szelnnel dstott lesztport. Feladatunk ttr jellegnek
szmtott: Se-mdosulatanalitikai mintaelkszts s mrstechnika kidolgozsa szelnnel
dstott csiperkegomba vizsglathoz; szakirodalmi elzmnyeket nem talltunk, gy teljesen az
alapoktl kellett indulni.
rtekezsemben a hangslyt a mintaelksztsi eljrsokra s a hozzjuk kapcsold,
adalkolssal vgrehajtott minsgbiztostsi mdszerre helyeztem; a mrs- s
elvlasztstechnika kialaktst s fejlesztst STEFNKA et al. kzlemnye [2001] s PhD
rtekezse [2003a] tartalmazza.
4.3.1. A szelnsval kiegsztett komposzton termesztett,
mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa

Se-dstott

gomba

4.3.1.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse


Kt fajta, szelnnel dstott ill. hagyomnyos komposzton termesztett (kontroll) gombt
hasznltuk fel ksrleteink sorn; a szelntartalm mintval hajtottuk vgre a mdosulatanalitikai
mrseket, mg a kontroll gombaminta a mintaelksztsi lpsek s a kromatogrfis
vizsglatok minsgbiztostsnl jtszott szerepet. A gombamintk nem frissen, hanem
elkezels utn rkeztek, amely a kvetkez lpsekbl llt: (a) a frissen szretelt gombkat
kalapra s tnkre vlasztottk szt, tovbbi kezelsre s vizsglatra csak az elbbiek kerltek; (b)
a kalapokat 105C fokon slyllandsgig szrtottk, majd kalapcsos malomban megrltk s
szitasor segtsgvel szemcsemret szerint frakcionltk; (c) a 90 m-nl kisebb frakcit kaptuk
meg s hasznlhattuk fel vizsglatainkhoz, melynek az sszes szelntartalma a dstott mintnl
110,2 g g-1-nak, mg a kontrollnl 4,3 g g-1-nak addott. A vizsglatok folyamn a biolgiai
hozzfrhetsg szerinti megkzelts alapjn jrtam el, gy kiindulsi-sszehasonltsi clzattal
az erre az elvre jellemz (ld. 2.3.1.5.2. fejezet), gyakran alkalmazott pepszines kezels kpezte
az egyik mintaelksztsi mdszert. Termszetesen figyelembe vettem a terlet fejldsi irnyt
84

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

is, gy mind a szekvencilis enzimes eljrsokra, mind pedig az egylpses mdszerekre is


ptettem.
4.3.1.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa
Az enzimes mintaelkszts sorn pepszin, tripszin s pronz enzimekkel hajtottam vgre
kezelseket, melyek jellemzit a 3.2. fejezet tartalmazza, a pufferek ksztshez hasznlt TRIS,
K2HPO4, KH2PO4 skkal, valamint a ssavval s NaOH-val egytt. A mintaelksztseket
15 ml-es fiolkban vgeztem, amelyekbe egyenknt 200 mg Se-dstott gombaport mrtem ki,
majd a kvetkezekben (A-E) ismertetett extrakcik kerltek sorra, 200 perc-1 fordulatszm
termosztlt rzgp segtsgvel. Az egyenknt 3 prhuzamossal vgrehajtott mintaelkszt
lpsek utn centrifuglssal (3700 g, 15 perc, 20C) vlasztottam szt az oldhatatlan rszt az
extrahlt komponensektl; tbblpses mdszer esetn a ltrejv ledket hasznltam fel a
soron kvetkez lpshez. Az extrakcis eljrsok (A-E) folyamatbrba rendezett,
egyszerstett lerst a 8. Mellklet tartalmazza.
A., 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 1 rn keresztl;
B., 3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,4) oldott 16 mg pronz enzimes kezels,
20 rn keresztl;
C., 1. lps: 3,6 ml, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl puffer (pH=2,1) 3 rn keresztl; 2. lps: az
elz lpsben hasznlttal egyez tpus pufferben oldott 45 mg pepszin enzimes kezels,
20 rn keresztl;
D., 1. lps: 3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferrel (pH=7,6), 3 rn keresztl; 2. lps: az
elz lpsben hasznlttal egyez tpus pufferben oldott 45 mg tripszin enzimes kezels,
20 rn keresztl;
E., 1. lps: 3,6 ml ioncserlt vz (pH=5,7), 3 rn keresztl; 2. lps: 3,6 ml, 0,05 mol l-1
TRIS-HCl pufferben (pH=2,1) pufferben oldott 45 mg pepszin enzimes kezels, 20 rn
keresztl; 3. lps: 3,6 ml, 0,05 mol l-1 foszftpufferben (pH=7,6) oldott 45 mg tripszin enzimes
kezels, 20 rn keresztl.
A mveletek befejezse utn a centrifuglssal kapott fellszkat 0,45 m prustmrj
fecskendszrn keresztl juttattam 5,0 ml-es mrlombikokba, majd a pH-t 5,5-re lltottam
1 mol l-1 NaOH ill. HCl oldatokkal; a mrlombikokat vgl ioncserlt vzzel tltttem jelre. Az
gy kapott oldatok kerltek a HPLC (Se-mdosulatanalitikai) s prhuzamos ICP-OES (sszes
Se-tartalom) vizsglatokra. Az ledket s a hozzjuk tartoz membrnszrlapokat savas
roncsolssal (3.1. fejezet) trtam fel a maradk szelntartalom megllaptsa vgett.

85

Dernovics Mihly

4.3.1.3. Adalkols a mintaelkszts minsgbiztostsnak cljbl


Az adalkols mvelett a Mulspot nemzetkzi krelemzs [MULSPOT 1998]
ajnlsainak mdostsval hajtottam vgre. 1 g Se-dstott gombaport mrtem ki 50 ml-es
csiszolt dugs Erlenmeyer-lombikba, majd 3 ml ioncserlt vzzel elnedvestettem, s 30 percig,
25C hmrskleten, 180 perc-1 fordulatszmon rzattam. Ezt kveten a kevertetett minthoz
cseppenknt, sszesen 3 ml adalkol folyadkot juttattam, amelyben a vizsglt ngy Semdosulat (Se(VI), Se(IV), SeCys2 s SeEt) szelnre szmtva 75-75 g mennyisgben volt
jelen, ioncserlt vzben oldva. A lombikot lezrtam, s mg 20 rig folytattam a rzatst a
vrhat egyensly elrsig. A kezelst mindkt (Se-dstott s kontroll) gombra elvgeztem.
A mvelet vgn a mintkat kmletes szrtsnak tettem ki: a csiszolt dugkat gzmos
felttekre cserltem, s 100 ml perc-1 Ar-ram segtsgvel, 50C hmrskleten, a
fordulatszmot vltozatlanul hagyva 30 rs folyamattal tvoltottam el az elnedvests s az
adalkols sorn hozzjuttatott vzmennyisget. Ezutn a beszradt mintt eltvoltottam a
lombikokbl, folykony nitrognben lefagyasztottam, porceln drzsmozsrban porr rltem s
szitasorral mret szerint frakcionltam. Tovbbi ksrletekhez a 125 m alatti tartomnyt
hasznltam fel. A gombamintk nedvessgtartalmt az adalkols folyamata eltt s utn is
meghatroztam, hogy korrekcis faktort kpezhessek a mdosulatanalitikai ill. sszes Setartalom mennyisgi meghatrozshoz.
4.3.1.4. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok bemutatsa
az eredmnyek rtkelse
Az alkalmazott mintaelksztsi mdszerek hrom olyan irnyvonalat lelnek fel, melyekre
clszer pteni ismeretlen minta mdosulatanalitikai elemzsnl ill. amelyek a korbban
emltett (2.3.1.5. alfejezet), klnbz generciba tartoz megkzeltseket jellemzik: a
leginkbb kmletes, pufferelt kzeggel (s ioncserlt vzzel) elvgzett extrakcit, a biolgiai
hozzfrhetsg megllaptst clz pepszines kezelst s az egylpses, nem
szubsztrtspecifikus fehrjebont enzimes hidrolzist. Mindezek kiegsztsre kerltek a
tripszines kezelssel is, amely hozzjrult a msodikknt emltett irnyvonal bvtshez, mind
magban, mind pedig szekvencilis eljrs keretben. Ez utbbi korbban mg nem kerlt
emltsre a szakirodalomban; az emberi emsztsben is egyms utn kvetkez kt enzim, a
pepszin s a tripszin kapcsolt hasznlata a mi munknkban kpezte elszr rszt Semdosulatanalitikai mintaelksztsnek.
A 6. tblzat tartalmazza az t mdszerrel elrhet kinyersi hatsfokok rtkeit. Az A ill.
a C, D s E els lpsei jelentik a pufferelt kzeggel ill. ioncserlt vzzel, mg enzimes
hidrolzis nlkli kezelseket. A sorban 36-34-40-37%-nak add kinyersi rtkek a
szakirodalmi utalsok alapjn viszonylag nagy szervetlen Se-mdosulatarnyra utalnak,
amelynek legfbb oka az lehet, hogy a felvett szelnt a gomba nem teljes mrtkben vonta be
anyagcsere-folyamataiba. Mindez azt is jelenti, hogy a B jel, teht a pronz enzim
hasznlatn alapul elkszts ltal felmutatott 64%-os extrakcis hatsfok mgtt minden
bizonnyal nem fehrjehidrolzis jtszotta a f szerepet; br a pronz nagyobb mennyisg szelnt
86

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

szabadtott fel, mint egymagban a pepszin (55%) vagy a tripszin (60%), az elrt hatsfok tvol
ll attl, amelyet pl. Se-dstott lesztmintnl tapasztalhatunk. A teljes kinyersi hatsfokot
tekintve a 3 lpses, ioncserlt vzzel + pepszines bontssal + legvgl tripszines kezelssel zrt
mdszerrel sikerlt elrni a legnagyobb rtket, 75%-ot.
6. Tblzat. Se-dstott gombamintn vgrehajtott mintaelksztsi mdszerek sszehasonltsa az
extrakcis mdszerek ltal felszabadtott s ICP-OES segtsgvel meghatrozott sszes szelntartalom
alapjn. K.H.= kimutatsi hatr = 0,25 mg Se ml-1 oldat.

Mintaelksztsi
mdszer
A
B
C - 1. lps
C - 2. lps
C - Teljes folyamat
D - 1. lps
D - 2. lps
D - Teljes folyamat
E - 1. lps
E - 2. lps
E - 3. lps
E - Teljes folyamat

Kinyert
Membrnszrn
ledk
Kinyert
RSD
RSD
RSD
Se-tartalom
maradt Se-tartalom
Se-tartalma
Se-tartalom
36%
64%
34%
21%
55%
40%
20%
60%
37%
24%
14%
75%

7%
1%
4%
8%
6%
10%
7%
2%
7%
11%
4%
3%

< K.H.

1%
< K.H.
< K.H.

2%
-

< K.H.
< K.H.

1%
< K.H.
< K.H.

65%
35%

1%
2%

101%
100%

47%

3%

102%

37%

1%

97%

26%

1%

102%

1%
-

Ha figyelembe vesszk a szakirodalmi adatok alapjn ismert, gombkra vonatkoztatott, 5%


krli szeln biolgiai hozzfrhetsget [CHANSLER 1986], akkor kijelenthetjk, hogy nagy
valsznsggel tlzott mrtkben ltalnostott eredmnyrl lehet sz: ennl a termesztett
gombamintnl mr a legrvidebb, mindssze ioncserlt vizet alkalmaz kezels is jval ennl
nagyobb rtket jelzett, nem is beszlve a hagyomnyos elvek alapjn elvgzett, biolgiai
hozzfrhetsget megllapt, tbblpses mdszerekrl. Termszetesen a mestersges Sedstssal egytt jr, eddigi eredmnyek alapjn valsznstheten tkletlen Se-metabolizmus
s a minta szrtsban + rlsben megnyilvnul elkezelse nagymrtkben hozzjrulhatott az
5% tlszrnyalsban; azonban figyelembe kell venni, hogy az lelmiszeripar nem csak frissen,
hanem szrtott gombaporknt is felhasznlja ezt az alapanyagot, teht az esetleg Se-dstott
gombbl kszlt por, mint funkcionlis lelmiszer-kiegszt minden bizonnyal nagyobb
mennyisg szeln felvtelt teszi majd lehetv.
Termszetesen az elbbi megllaptsokat mdosulatanalitikai mrsekkel kell
altmasztani, gy a leghatkonyabbnak bizonyult, hromlpses mintaelksztst kvetve
vgrehajtottuk a kinyerhet Se-mdosulatok minsgi s mennyisgi meghatrozst is.
4.3.1.5. A mdosulatanalitikai vizsglatok s az adalkols eredmnyeinek ismertetse s
rtkelse
A 7. tblzatban tallhatjuk meg a HPLC-HHPN-AFS rendszer segtsgvel azonostott s
mennyisgileg meghatrozott Se-mdosulatok bemutatst, amely rszben nem vrt
eredmnyekre vezetett. Szelnnel dstott biolgiai mintk esetben a SeMet mindig a
87

Dernovics Mihly

legnagyobb mennyisgben kimutatott szelnmdosulatnak szmtott, nhny, SeMet szintzisre


bizonytottan kptelen baktrium kivtelvel [MLLER 1997]. Mi tbb, ltalban mr a
pufferelt kzeggel vgzett extrakcik is felszabadtottk a SeMet egy rszt, mintegy
megellegezve a fehrjebont enzimmel vgzett, valban SeMet-tlslyt igazol mrseket
[KOTREBAI 1999a,b]. Ennl a gombamintnl azonban a korbban emltett, tkletlen Sebeplsre utal, az sszes extrahlt szeln mintegy 2/3-t kitev Se(IV) mellett csak SeCys2-t
(ill. esetleg vele egytt eluld, ltalunk nem azonosthat komponenst) mutattunk ki, SeMet-t
mg nyomokban sem. Mindez arra utal, hogy a csiperkegombk Se-anyagcserje bizonyosan
eltr az eddig megismert mdozatoktl, s nem felttlenl kveti analg mdon a knanyagcsere
tjait. A teljes hatsfokot tekintve 75%-os kinyerst hoz mintaelkszts leghatsosabb
lpsnek az els bizonyult, mivel mind a HPLC, mind pedig a prhuzamos ICP-OES mrsek
alapjn az extrahlt szeln kzel felt juttatta oldatba, melynek 45%-t a szervetlen, valsznleg
a komposztbl talakts nlkl dstott Se(IV) tette ki. A kt, szekvencilis fehrjebont lps
szerepnek fontossga is bizonytst nyert, mivel a Se(IV) extrakcijnak teljess tteln tl a
kinyert szeln 29%-t kitev SeCys2-t szabadtottak fel, amely az sszes SeCys2 tbb mint -t
jelenti.
Az egyes mintaelksztsi lpsek sorn kapott oldatokbl HPLC mrsekkel
mennyisgileg is azonostott ill. ICP-OES rvn megllaptott sszes Se-tartalom kb. 10%-os
eltrst mutat az utbbi javra. E jelensg mgtt szmos jelensg llhat. Az oldatok
tartalmazhatnak olyan Se-mdosulatokat vagy hidrolizlatlan molekulkat, melyek ersen
ktdtek az (eltt)oszlophoz s elcijuk ksleltetett vagy akr lehetetlen, pl. irreverzibilis
ktds miatt; msrszrl nem lehet kizrni az egyttes elci jelensgt, fleg a holttrfogat
kzelben eluld SeCys2 esetben, amely a HPLC mrsek bizonytalansgt nveli meg. Ezen
okok miatt a kinyersi hatsfokot nem a HPLC eredmnyek, hanem az ICP mrsek ltal
szolgltatott eredmnyek alapjn szmoltuk ki.
7. Tblzat. A 110,2 g g-1 szelntartalm Se-dstott gomba E jel, hromlpses mdszerrel vgrehajtott
mintaelksztse sorn felszabadul sszes Se s Se-mdosulatok mennyisge. K.H.= kimutatsi hatr =
0,25 mg Se ml-1 oldat. (a)=az sszestett prhuzamos ICP-OES eredmnyek s a minta sszes Se-tartalmnak
hnyadosa alapjn.

Mintaelksztsi
lps

Mdosulatanalitikai mrs
HPLC-HHPN-AFS rendszerrel;
mg Se g-1 (zrjelben %-os rtkknt)

1. lps
2. lps
3. lps
sszesen

SeCys2
6,3 (9)
6,7 (9)
14,7 (20)
27,7 (38)

Se(IV)
33,9 (45)
12,5 (17)
<K.H.
46,4 (62)

sszesen
40,2 (54)
19,2 (26)
14,7 (20)
74,1 (100)

ICP-OES mrsek
Prhuzamos
mrsek; mg Se g-1

sszes Se
mg Se g-1

Kinyersi
hatsfoka

42,5
25,5
15,0
83,0

110,2

75%

Kln figyelmet rdemel a 25%-ban ledkben marad szelnfrakci. Korbban mg nem


tanulmnyozott mintatpusrl lvn sz, gy alapveten kt tnyez indokolhatja a nem tkletes
extrakcit. Nem kizrt, hogy eddig ismeretlen, pldul sejtfalhoz kapcsold Se-mdosulat
maradt feltratlanul, hiszen a fehrjebonts valsznleg nem hidrolizlta ezen sejtalkott.
88

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

Ugyanakkor lehetsges, hogy a rszben mr kinyert mdosulatok alkotjk a fennmarad rszt is,
s csupn hosszabb vagy erteljesebb extrakcira lett volna szksg kinyerskhz. Az elbbi
lehetsget nehezebb igazolni vagy elvetni, mivel ha sikerlne is pl. sejtfalbont enzimmel
kinyerni az emltett jelleg komponenseket, az ltalunk is tanulmnyozott, a ksrletek idejn
kereskedelmi forgalomban elrhet Se-mdosulatokon (Se(IV), Se(VI), SeMet, SeEt, SeCys2)
kvl nem llt rendelkezsnkre egyb standard, gy br a HHPN-AFS kapcsols nem zrja ki
pl. a nem hidridkpz mdosulatok detektlst semmi sem garantln, hogy nem trtnik
egyttes elci ill. nem tudtuk volna sem minsgileg, sem pedig mennyisgileg azonostani az
ismeretlen mdosulatot.
Ami a msodik lehetsget teht az azonosthat mdosulatok nem tkletes extrakcijt
illeti, az adalkols mvelete lehetsget ad, hogy kpet kaphassunk a vlekeds valdisgrl.
Nagyon fontos kiemelni s kihangslyozni, hogy klnsen Se-mdosulatanalitika esetn az
adalkols tvol ll attl, hogy bizonyt erejnek tekinthessk, s brmilyen, a kinyerst illeten
kielgtnek mutatkoz eredmnyt azonnal tvezethessnk a valdi, nem adalkolt minta
elksztsnek rtkelsre. A szeln mdosulatanalitikban az adalkols egyetlen
kvetkeztetst enged meg levonni: amennyiben a mvelet sorn hozzadott mdosulatokat nem
tudjuk visszanyerni, gy nagy valsznsggel a valdi minta extrakcija sem lesz tkletes,
teht clszer ms eljrson alapul mintaelkszts utn nzni. Fordtott esetben (kielgt
mrtkben visszanyert mdosulatoknl) csak azt lehet kijelenteni, hogy amennyiben a valdi
minta mdosulatai az adalkols sorn ltrejv mdosulat-mintamtrix egyenslyi viszonyhoz
hasonl mdon tallhatk a mintban, akkor lehet, hogy ugyangy fognak viselkedni. A
mintbl eredetileg kimutatott Se(IV) s SeCys2 mellett egy-egy, jellegkben hozzjuk hasonl
mdosulattal (Se(VI) s SeEt) is adalkoltuk a mintt, hogy eldnthessk, fennll-e ltalnostsi
lehetsg kln a szervetlen s a szerves Se-mdosulatokra.
Az adalkols mvelett a korbbiakban lertaknak megfelelen mind a Se-dstott, mind
pedig a kontroll gombamintra is elvgeztem s ezt kveten a hromlpses mintaelkszts
segtsgvel trtam fel ket; az eredmnyeket a 8. tblzat hordozza. A Se-dstott gombnl az
els extrakcis lps az sszes kinyert szelnmennyisg 72%-t vitte oldatba, mely
termszetesen tartalmazta az adalkols folyamata sorn hozzjuttatott s az eredetileg is jelen
lv mdosulatok egy rszt is. A msodik lps tovbbi 19%-ot, mg az utols a maradk 9%
extrakcijt eredmnyezte. Az sszestett extrakcis hatsfok (az ICP-OES adataira
tmaszkodva) 91%-nak addik, amely azt jelzi, hogy a hozzjuttatott mdosulatok 97%-a
visszanyersre kerlt. Ehhez azt kell feltteleznnk, hogy az eredeti mdosulatok a korbbi,
adalkols nlkli mintaelkszts sorn tanstott viselkedsket kvetik lsd a nem
adalkolt oszlop eredmnyeit, amelybl kiindulva a 372,6 g g-1-bl 83,0 szrmazhat az eredeti
mdosulatokbl, mg 372,6-83,0=289,6 g g-1 pedig az adalkolsbl, amely 97%-a az adalkolt
300 g g-1-nak. Ezen felttelezs nem minden alap nlkli, hiszen a Se(IV) szinte a korbbihoz
teljesen hasonl megoszlssal extrahldik a mintbl; ugyanakkor a SeCys2 kiolddsahidrolzise ms mintzatot mutat: azt vrnnk, hogy az ioncserlt vzben oldott s adalkolt rsze
azonnal eltvozik az els lps sorn, de nem gy trtnt. Valsznleg ez az oxidcira
89

Dernovics Mihly

meglehetsen rzkeny mdosulat nem egysges mdon ktdtt a mintaszemcskhez, s


kiolddsa emiatt toldott a ksbbi, fehrjehidrolzissel egytt jr mintaelksztsi szakaszra.
A mintban eredetileg nem tallhat mdosulatokat sem jellemzi egysges extrakcis
viselkeds: mg a Se(VI) szinte alig ktdtt meg s mr az ioncserlt vz is 90%-ban (64,7 a
69,9 g g-1-bl) kioldotta, addig a SeEt 2/3 1/3-os megoszlssal (43,3 s 27,7 g g-1
rszletekben) tvozott az adalkolt gombaporbl.
A Se-mdosulatok anyagmrlege kt csoportra, az eredetileg is jelen lv ill. a csak
adalkols sorn bekerlt tpusra osztotta a vizsglt vegyleteket. Figyelembe vve a
mdosulatonknti, szelnre szmtott 75 g-os adalkolst, a SeEt s Se(VI) kb. 91-93%-ban
kerltek visszanyersre, mg a ketts forrssal rendelkez SeCys2 s Se(IV) 113-124%-ban
olddtak ki, amely rtkek a 75 g-os adalkolsbl s a korbbi, nem adalkolt mintnl
tapasztalt kinyersi rtkek figyelembevtelvel alakulnak ki. Az utbbi jelensg nem felttlenl
utal kalibrlsi vagy egyb mrsi hibra; figyelembe kell venni, hogy az adalkols klnsen
a 20 rs rzs ioncserlt vzben hozzfrhetbb tehette ezen mdosulatokat az adalkolson
t nem esett minthoz kpest, s ez a klnbsg lthet testet az eredeti minta adataibl szmtott
nagyobb, 100% feletti kinyersben.
A kontroll gombamintval vgzett adalkols jellegben hasonl eredmnyre vezetett (8.
tblzat). Az els kt mintaelksztsi lps sorn a kt szervetlen mdosulat s a SeEt
gyakorlatilag teljes mrtkben extrahldott a mintbl, mg a SeCys2 kinyerse csak a harmadik
lpssel fejezdtt be gy, hogy a hozzadott mdosulat mennyisgnek kzel 85%-a a kt
fehrjebont lps hatsra (33,6 s 32,6 g g-1 a 78,3 g g-1-bl) szabadult fel.
Mindez annak a tkrben szmt rdekes, tovbbi vizsglatokat ignyl adatnak, hogy az
enzimek valsznleg a mtrix bontsn keresztl jrultak hozz a teljes kinyershez hasonl
jelensggel lehet tallkozni az arzn mdosulatanalitikai mintaelksztsek enzimes
mdszereinl is (2.3.2.4. fejezet). A 96%-os sszestett kinyersi hatsfok kielgtnek
mondhat; ugyanakkor nem zrhat ki annak a lehetsge, hogy a hinyz 4% fleg a gomba
eredeti szelntartalmt jelenti, amely viszont a szeln gombkbl kimutatott kis biolgiai
hozzfrhetsgre utalhat vissza.
sszessgben az adalkols mvelete azt igazolta, hogy a hromlpses mintaelksztsi
mdszer megfelel mrtkben tette lehetv a mestersgesen minthoz adalkolt Semdosulatok extrakcijt, ill. a gombamintban eredetileg megtallhat szervetlen szelnsk
(Se(VI), Se(IV)) valsznleg teljesen kinyersre kerltek, gy a Se(IV) mennyisge (46,4 g g-1
minta) minden bizonnyal valdi rtket takar. A SeCys2-re vonatkoz eredmny megbzhatsga
krdses, mivel nem zrhat ki az egyttes elci lehetsge, s az adalkols csak az esetleg
szabad (=nem fehrjben kttt) aminosav viselkedst modellezi. Mivel a gombapor tbb olyan
kezelsen (pl. szrts) is tesett, amely irreverzibilis fehrjecsapadk-levlst okozhatott, nem
lehet megllaptani, hogy mg a nem szubsztrtspecifikus fehrjebont enzim ltal sem kinyert
szelnfrakci fehrjkben vagy ms fajta sejtalkotban rgzlt.

90

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.3.1.6. j tudomnyos eredmnyek a szelnsval kiegsztett komposzton termesztett, Sedstott gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan
Elsknt alaktottam ki egy olyan szekvencilis enzimes mdosulatanalitikai
mintaelksztsi eljrst, amelynek segtsgvel a szelnsval kiegsztett komposzton
termesztett gomba szelntartalma 75%-ban kinyerhetv vlt.
Adalkolssal s az azt kvet szekvencilis enzimes mdosulatanalitikai
mintaelksztssel igazoltam, hogy a Se-mdosulatok egy rsze nem az elmletileg vrhat
mdon (jelen esetben vizes extrakcival) nyerhet vissza a mintbl: a fehrjemtrix bontsa
szksges az adalkolt mennyisg oldatba vitelhez. Adalkolsi eljrs segtsgvel kzvetett
mdon bizonytottam, hogy a mdosulatanalitikai mrsek sorn azonostott Se-mdosulatok
kzl legalbb az egyik, a Se(IV) mennyisgi meghatrozsa valdi rtkre vezetett.

91

Minta
jellege

Se-dstott gomba

92

33,6

32,6

78,3

2. lps

3. lps

sszesen

<K.H.
79,0

<K.H.
78,9

75,3

66,8

12,1

1. lps
3,7

46,4

---

27,7

Nem adalkolt

12,1

151,7

sszesen

68,0

32,0

3. lps

116,5

24,8

2. lps
<K.H.

115,5

43,3

<K.H.

59,6
36,2

Adalkolt
24,7

1. lps

Se(IV)

SeEt

Adalkolt

Kontroll gomba
79,4

<K.H.

6,9

72,5

---

69,9

<K.H.

5,2

64,7

Se(VI)

HPLC-HHPN-AFS rendszerrel; mg Se g-1

ksztsi lps

SeCys2

Mdosulatanalitikai mrs

Mintael-

315,6

32,6

56,3

226,7

74,1

406,0

32,0

90,9

283,1

sszesen

292,2 (100)

16,1 (5)

58,0 (20)

218,1 (75)

83,0

372,6 (100)

32,1 (9)

70,9 (19)

269,6 (72)

Prhuzamos ICP-OES
mrsek; mg Se g-1 (zrjelben %-os rtkben)

304,3 a

410,2 a

sszes Se
mg Se g-1

ICP-OES mrsek

96%

91%

Kinyersi
hatsfok

Dernovics Mihly

8. Tblzat. Az adalkolt Se-dstott s adalkolt kontroll gombamintk E jel, hromlpses mdszerrel


vgrehajtott mintaelksztse sorn felszabadul sszes Se s Se-mdosulatok mennyisge. K.H.= kimutatsi
hatr=0,25 mg Se ml-1 oldat.(a)=az adalkols sorn hozzadott Se-mdosulatok (4 mdosulat, egyenknt
75 g Se g-1 minta) s az eredeti Se-tartalom (110,2 g g-1 /Se-dstott/ ill. 4,3 g g-1 /kontroll/) sszege.

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.3.2. A szelnnel dstott lesztksztmnnyel kiegsztett komposzton termesztett, Sedstott gomba mdosulatanalitikai mintaelksztsnek kidolgozsa
4.3.2.1. A minta bemutatsa s a vlasztott mintaelksztsi megkzelts ismertetse
Az elzekben bemutatott, szelnsval kiegsztett komposzton termesztett Se-dstott
gomba sok fontos tanulsggal jrt mind a mintaelksztst, mind a mdosulatanalitikai
mrstechnikt illeten. A mtrix ltal kivltott, a kirtkelst nehezt strukturlt httr
megszntetse cljbl a HHPN-AFS csatolst HG-AFS vltotta fel [IPOLYI 2001a,b;
STEFNKA 2003a,b] ill. a biolgiai hozzfrhetsg megllaptsa utn eltrbe helyezdtt a
lehet legnagyobb kinyersi hatsfok elrsre trekv mintaelksztsi megkzelts.
Tapasztalatainkat a kvetkez minta, a szelns helyett Se-dstott lesztvel kiegsztett
komposzton termelt csiperkegomba vizsglatban sszegeztk. Ez a minta az elzhz hasonl
elkezels utn rkezett hozznk, s kiss nagyobb, 160 g g-1 sszes szelntartalom jellemezte.
A kinyersi hatsfok nvelse cljbl kt klnbz sejtfalbont enzimkeverk is hasznlatra
kerlt, hogy meg lehessen llaptani, valban a sejtfal gtolja-e az extrakci folyamatt ill. ki
tudunk-e mutatni kifejezetten a sejtfallal kapcsolatos, ahhoz ktd Se-mdosulatot. Clul
tztem ki a szekvencilis s az egylpses extrakcis mveletek sszehasonltst, a korbbi
ksrletek sorn legnagyobb kinyersi hatsfokot elrt mdszerek erre a mintra trtn
alkalmazst, valamint ksrletet tettem arra, hogy lehetsg szerint a legnagyobb mrtkben
elklnthessem egymstl a klnbz kezelseket, nem csupn centrifugls rvn, hanem
biokmiai protez inhibitor vegyletekre pt mdszerekkel is.
4.3.2.2. A felhasznlt vegyszerek s alkalmazott mintaelksztsi eljrsok bemutatsa
Az enzimes mintaelkszts sorn drizelz, lysing enzim, pepszin, tripszin s pronz
enzimekkel hajtottam vgre kezelseket, melyek jellemzit a 3.2. fejezet tartalmazza, a pufferek
ksztshez hasznlt TRIS, K2HPO4, KH2PO4 skkal, a kt protez inhibitorral (protez
inhibitor koktl s PMSF) valamint a citromsavval, ssavval s NaOH-val egytt. A
mintaelksztseket 15 ml-es fiolkban vgeztem, amelyekbe egyenknt kb. 150 mg Se-dstott
gombaport mrtem ki, majd a 9. tblzatban ismertetett extrakcik (A-I) kerltek sorra,
200 perc-1 fordulatszm, termosztlt rzgp segtsgvel. Az oldatok vgtrfogatt 3,6 ml-re
lltottam be. Az egyenknt legalbb 3 prhuzamossal vgrehajtott mintaelkszt lpsek utn
centrifuglssal (4100 g, 25 perc, 15C; 1. szm centrifugls) vlasztottam szt az oldhatatlan
rszt az extrahlt komponensektl. Ezt kveten a fellszkat fecskendszr (0,45 m)
segtsgvel tiszttottam, s a szrleteket 10 kDa vgsi rtk centrifugacs-szrbe ntttem.
4100 g terhelsnl 25C hmrskleten kb. 50 perces centrifuglsra volt szksg ahhoz, hogy az
oldatok trfogata kb. 250 l-re cskkenjen, teht 93-95%-ban tszrdjn a membrnon. Ekkorra
a minta 10 kDa feletti rszt is tartalmaz frakci olyan tmnny vlik, hogy a tovbbi
centrifugls mr nem hoz lthat eredmnyt. Ezutn a szrletet (<10 kDa) ioncserlt vzzel
5,0 ml-es mrlombikban jelre tltttem; ezt az oldatot HPLC-vel vgzett mdosulatanalitikai
meghatrozsra ill. prhuzamos ICP-OES (sszes Se-tartalom) mrsekre is felhasznltuk. A
93

Dernovics Mihly

10 kDa-nl nagyobb molekulkat tartalmaz oldatfrakcit pipettval eltvoltottam a


fecskendszr membrnrekeszbl, ioncserlt vzzel 5,0 ml-es mrlombikban jelre tltttem
s ICP-OES mrssel sszes Se-tartalom meghatrozst vgeztnk. A teljes folyamatot olyan
prhuzamos elksztsekkel is elvgeztem, amelyek esetben a 0,45 m-es mikroszrst nem
kvette ultraszrs; ilyenkor az 5,0 ml-re feltlttt oldatot csak ICP-OES mrseknl hasznltuk
fel.
Az egymst kvet mintaelksztsi lpsek ltal kinyert szeln (s szelnmdosulatok)
lehet legjobb elklntse rdekben az 1. szm centrifuglst kveten ltrejv ledket
mg ktszer, egyenknt 2,0 ml, az adott lps sorn alkalmazott pufferben (vagy ioncserlt
vzben) szuszpendltam, s centrifuglssal fellszra + ledkre vlasztottam (2. s 3.
centrifuglsi lps). Az gy kapott, sszesen 4 ml fellszval az elz bekezdsben ismertetett
eljrsokat hajtottam vgre (mikroszrs, ultraszrs, jelre tlts), mg a 3. centrifugls utn
kialakul ledk kpezte trgyt szekvencilis extrakci esetn a kvetkez
mintaelksztsi lpsnek.
A mintaelksztsi mveletsorok vgn az utoljra marad ledket a hozz tartoz
membrnszrlapokkal egytt savas roncsolssal trtam fel (3.1. fejezet), az sszes maradk Setartalom ICP-OES segtsgvel trtn meghatrozsa cljbl.

94

Ioncserlt vzzel vgzett extrakci

Lpsek

1.
lps

2. lps

95

Fehrjebonts 15 mg pronz adagolsval,


0,05 mol l-1 foszftpufferben

Fehrjebonts 30 mg tripszin adagolsval,


0,05 mol l-1 foszftpufferben

Sejtfalbonts az optimlis mennyisg (30 mg) lysing


enzim adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben,
10 mmol l-1 PMSF jelenltben
Sejtfalbonts az optimlis mennyisg (30 mg) drizelz
enzim adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben,
1 V/V % protez inhibitor koktl jelenltben
Sejtfalbonts az optimlis mennyisg (30 mg) lysing
enzim adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben,
1 V/V % protez inhibitor koktl jelenltben
Fehrjebonts 30 mg pepszin adagolsval,
0,03 mol l-1 Na-citrt pufferben

Sejtfalbonts klnbz mennyisg drizelz enzim


adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben
Sejtfalbonts klnbz mennyisg lysing enzim
adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben
Sejtfalbonts az optimlis mennyisg (30 mg) drizelz
enzim adagolsval, 0,05 mol l-1 TRIS-HCl pufferben,
10 mmol l-1 PMSF jelenltben

Mintaelksztsi eljrsok

24

Idtartam
(ra)

7,4

2,1

5,5

5,7

pH

37

30

55

Hmrsklet
(C)

Mintaelkszts jele

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

9. Tblzat. A Se-dstott lesztvel kiegsztett komposzton termesztett szelntartalm gomba


mdosulatanalitikai vizsglata sorn alkalmazott egy- s tbblpses mintaelksztsek (A-I) bemutatsa. A
pipa szimblum jelzi az adott mintaelksztsi eljrsba bevont lpseket.

3. lps

Dernovics Mihly

4.3.2.3. A sejtfalbontsi lps optimalizlst clul tz ksrletek rtkelse


A sejtfalbontsra alkalmas enzimek Se-mdosulatanalitikai felhasznlsa egszen 1999-ig
nylik vissza, amikor CASIOT et al. [1999] tbbek kzt drizelzt vetettek be Se-dstott leszt
Se-mdosulatainak kinyersre. A magban alkalmazott enzim(keverk) csupn 27%-os
extrakcit eredmnyezett; br a szerzk ksrletet tettek a szekvencilis elrendezs ltrehozsra
ioncserlt vz-drizelz-SDS sszelltssal, mdszerk nem jrt szmottev eredmnnyel.
Tapasztalataikat hasznostva a vizsglat trgyt kpez csiperkemintnl a szekvencilis
extrakcit gy terveztem meg, hogy a sejtfalbont lpst fehrjebont lps kvesse, s gy
kiaknzhatak legyenek a sejtfalbonts sorn felszabadul ill. hozzfrhetv vl, fehrjkben
kttt Se-mdosulatok is. A drizelz mellett a protoplasztkpzs szakirodalma alapjn taln
leggyakrabban hasznlt sejtfalbont crude keverket, a lysing enzimet illesztettem be a
mintaelksztsi lpsekbe, hogy az alapveten eltr karakterrel s eredettel rendelkez
ksztmnyek kztt fennll klnbsgeket ezen az jnak mondhat alkalmazsi terleten
feltrkpezhessem.
Mindehhez alapveten kt dolog vizsglatra volt szksg. Egyrszt meg kellett hatrozni a
felhasznlt sejtfalbont enzim optimlis mennyisgt; ehhez lland rtken tartottam a
megelz (ioncserlt vzzel vgrehajtott) extrakcit s a sorban harmadikknt kvetkez, pronz
hasznlatn alapul fehrjebonts paramtereit. gy a vgs kinyersi hatsfok rtkekben
mutatkoz eltrsek a minta esetleges inhomogenitstl eltekintve a kzbls lps
alkalmassgt tkrzik. Msrszt figyelembe kellett vennem, hogy mindkt keverk rendelkezik
fehrjebont aktivitssal is, teht a sejtfalbont mintaelksztsi szakaszrl csupn a kinyersi
hatsfok alapjn kapott kp hamis lehet, ha nem klntem el egymstl a klnbz
enzimaktivitsoknak ksznheten felszabadul szelnmennyisget. (Erre a jelensgre utalnak a
4.2.1.4. fejezetben bemutatott, Se-dstott lesztvel vgzett ksrleteim is.) Ebbl a clbl kt
protez inhibitort, a fleg szerin protezokat gtl PMSF-et s az ltalnos, folyadk kiszerels,
leszt- s gombakivonatokhoz (s ezltal a megfelel enzimekhez is) sszelltott inhibitor
koktlt hasznltam fel. Elvileg ezen vegyletek adagolsa j szolglatot tehet akkor is, ha
magbl a mintbl szrmaz fehrjebont enzimeket kell gtolni; a mi esetnkben azonban a
105C fokon slyllandsgig vezetett szrts minden bizonnyal irreverzibilisen inaktivlta a
csiperke sajt enzimeit.
A 9. tblzat jellseire tmaszkodva a D s E jel mrssorozat tartalmazza a
sejtfalbont enzim optimlis mennyisgnek meghatrozst clz vizsglatokat, elszr mg
inhibitor adagols nlkl. A 6 klnbz koncentrci alkalmazsval elrt, lpsenknt
sszegzett kinyersi hatsfok rtkeket az 5. bra ismerteti. Kontrollknt az brn 0 felirattal
jelzett mrsek szolgltak, ahol sejtfalbont enzimmel nem, csupn a pufferrel kezeltem a
mintkat, a tbbi, enzimet is tartalmaz mintval azonos ideig. Az eredmnyek kirtkelshez
Welch-prbt hasznltam fel, mely a kvetkez megllaptsokra vezetett:
1., A sejtfalbont enzimmel kezelt mintkbl mindkt (drizelz s lysing) enzim s
mindegyik (10-50 mg kezelsi egysg-1) koncentrciban szignifiknsan nagyobb (teljes)
kinyersi hatsfokot lehetett elrni, mint a csak pufferrel extrahlt prhuzamosokbl.
96

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2., Egyik sejtfalbont enzim esetben sem tapasztaltam szignifikns klnbsget a


klnbz koncentrcik (10-50 mg kezelsi egysg-1) ltal eredmnyezett teljes kinyersi
hatsfokok kztt.
3., A kt sejtfalbont enzim teljes kinyersi hatsfokra vettett eredmnyessge kztt nincs
szignifikns klnbsg, egyik alkalmazott koncentrciban sem.
100
90

Kinyersi hatsfok, %

80
70
60
50
40
30
20
10
0

DR 0

DR 10

DR 20

DR 30

DR 40

DR 50

LY 0

LY 10

LY 20

LY 30

LY 40

LY 50

Extr. ics. vzzel

40,7

42,2

41,2

43,1

42,3

42,2

44,9

43,5

44,6

43,5

43,9

44,5

Sejtfalbonts

45,8

62,6

61,2

61,5

59,8

57,6

49,8

57,5

59,1

59,4

57,4

57,9

Fehrjebonts

81,2

87,8

87,5

88,3

87,5

86,1

82,0

89,3

89,0

89,3

88,1

87,3

5. bra. A hromlpses, sejtfalbont enzim hasznlatra is pt D s E jel mintaelksztsi


eljrsok sejtfalbont (msodik) lpsnek optimlsa az elrhet, sszes Se-tartalomra vonatkoztatott
kinyersi hatsfok tekintetben, amelynek szmtshoz a 160 g g-1 kiindulsi rtket vettem figyelembe.
A DR jelzs a drizelz, a LY a lysing enzim hasznlatra, mg a 0-50 rtkek az adott enzimbl
felhasznlt mg mennyisgre utalnak; a 0 jelzi a kontroll mrseket, ahol enzim nlkl, csak pufferrel
trtnt extrakci a mintaelkszts msodik lpsben. A hibasvok az adott lpsig sszestett kinyersi
hatsfokok rtkeihez tartoz 1 szrst mutatjk.

Mindezekbl egyrtelmv vlt, hogy sejtfalbontsra pt lps hasznos s fontos eleme a


szekvencilis mintaelksztsi eljrsnak. Br szignifikns klnbsget nem talltam a 1050 mg koncentrcitartomnyban, tovbbi ksrleteinkhez a 30 mg-os mennyisget vlasztottam,
mivel ennek hasznlata sorn tapasztaltam mindkt enzimnl a legnagyobb sszestett kinyersi
hatsfokot s a sejtfalbontsi lpseknl mrt legkisebb szrsrtkeket. Ugyanakkor tovbbra is
vizsglatra szorult mg az a krds, hogy a felhasznlt crude ksztmnyek (ismeretlen
mrtk) fehrjebont aktivitsa lnyeges szerepet jtszik-e a kinyersi hatsfok nvelsben.
Ezt eldntend, a 9. tblzatban F-G-H-I betkkel jelzett mrsi sorozatot hajtottam
vgre, melyekben az optimlis mennyisg sejtfalbont enzimek hasznlatt protez inhibitorok
jelenltvel trstottam; ez utbbiak koncentrcijt a szakirodalmi ill. a vegyszerkatalgusokban
fellelhet ajnlsok alapjn hatroztam meg.

97

Dernovics Mihly

10. Tblzat. A sejtfalbontsi lps kzben lezajl fehrjebonts gtlsnak hatsa a mintbl kinyerhet
szeln mennyisgre, a kinyersi hatsfok %-os rtknek fggvnyben. A kontroll azokra a prhuzamos
mrsekre vonatkozik, amelyekben inhibitor vegylet hasznlatra nem kerlt sor. A kinyersi hatsfok
rtkeinek megadshoz a gombaminta 160 g g-1 sszes Se-tartalmt vettem figyelembe.

Mintaelksztsi
lpsek

Sejtfalbonts drizelzzal
inhibitor
kontroll PMSF-fel
koktllal

Sejtfalbonts lysing enzimmel


inhibitor
kontroll
PMSF-fel
koktllal

Extrakci
ioncserlt vzzel
Sejtfalbonts

43,2

43,8

42,9

44,8

44,8

43,1

63,1

60,4

59,7

59,2

58,7

55,9

Proteolzis

88,4

88,1

87,4

89,2

88,2

89,2

Eredmnyeimet melyek kirtkelshez ugyancsak a Welch-prbhoz fordultam a 10.


tblzat hordozza. A msodik, teht a sejtfalbontsnak teret ad lpseknl kizrlag az inhibitor
koktl alkalmazsa cskkentette szignifikns mrtkben az addig sszestett kinyersi
hatsfokot; azonban ez a cskkens nem llandsult s a vgs extrakcis rtkek
kiegyenltdtek a harmadik, fehrjebontssal jr lps sorn. Mindez azt jelenti, hogy br
valban lejtszdott fehrjebonts a sejtfalbont enzimek mkdse kzben, ez az aktivits teljes
mrtkben ptolhat volt az elkszts utols lpsben alkalmazott pronz enzimmel. Ennek
ellenre a sejtfalbontsi lps elengedhetetlen rszt kpezte a mintaelksztsnek, mivel mg
az inhibitor koktllal gtolt fehrjebontssal is szignifiknsan nagyobb kinyerst lehetett elrni,
mint sejtfalbont enzimek nlkl.
4.3.2.4. A klnbz mintaelksztsi mdszerek s az elrt extrakcis hatsfokok bemutatsa
az eredmnyek rtkelse
A sejtfalbont enzim optimlis mennyisgnek megllaptsa utn a klnbz
mintaelksztsi mdszerek ltal biztostott extrakcis hatsfokok vizsglata s sszehasonltsa
kerlt sorra: a sejtfalbontssal is kiegsztett hromlpses mdszer mellett az ltalnosan
elterjedt, egylpses eljrsokat (ioncserlt vzzel vgzett vagy pronz hasznlatn alapul) ill.
az elz alfejezetekben tanulmnyozott gombaminta esetn legnagyobb kinyersi hatsfokot
eredmnyez, pepszint s tripszint felhasznl eljrst is vgrehajtottam. Az A-B-C-DE betkkel jellt mintaelksztsi mdszerek ltal elrt, sszestett extrakcis rtkeket a 11.
tblzat tartalmazza, az elmletileg vrt viszonyok s sorrend gyakorlati megvalsulst
tkrzve: a fehrjebontssal jr kezelsek a vizes extrakcihoz kpest kzel ktszer annyi
szelnt szabadtottak fel a mintbl. A statisztikai vizsglatok alapjn a sejtfalbontst is
tartalmaz D s E eljrsok az sszes tbbi kezelsnl nagyobb kinyersre vezettek, hasonl
(88-89%-os) sszestssel, maguk kzt nem szignifikns klnbsggel; az ugyancsak
tbblpses, kt fehrjebontsi mvelettel jellemzett C eljrs az egylpses fehrjebontshoz
(pronz) kpest kicsivel nagyobb kinyerst rt el. Ugyanakkor a szzalkos rtkekrl mg nem
lehetett tudni, hogy az ltaluk kpviselt, kinyert szelnmennyisg mekkora hnyadt lehet majd
mdosulatanalitikai mrsekkel azonostani s mennyisgileg meghatrozni; gyakorlati
98

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

szempontbl ugyanis az a mintaelksztsi eljrst tekinthetjk hasznosabbnak, amely abszolt


rtkben tbb mdosulat mrshez jrul hozz.
11. Tblzat. Nhny jellegzetes mintaelksztsi eljrssal (ultraszrs nlkl) elrt, sszestett Se-kinyersi
hatsfok rtkek bemutatsa. (a) A kinyersi hatsfok rtkeinek megadshoz a gombaminta 160 g g-1
sszes Se-tartalmt vettem figyelembe.

Mintaelksztsi Kinyersi
lpsek szma hatsfok, % a
A Extrakci ioncserlt vzzel
1
42
B Proteolzis pronzzal
1
78
C Proteolzis pepszinnel s tripszinnel
3
83
D 3-lpses kezels drizelzzal (30 mg)
3
88
E 3-lpses kezels lysing enzimmel (30 mg)
3
89
Mintaelksztsi mveletek

RSD, %
(n=5)
1,6
2,6
2,7
2,0
2,9

4.3.2.5. A mdosulatanalitikai vizsglatok eredmnyeinek ismertetse s rtkelse


A mintaelksztsi mdszerek eddigi, teljes kinyersi hatsfokok sszehasonltsval
kapott megfelelsgi ill. alkalmassgi sorrendje a 12. tblzatban bemutatott mdosulatanalitikai
(bal oldalon) s a hozzjuk lpsenknt csatlakoz sszes Se-tartalom (jobb oldalon) mrsi
eredmnyekkel vlt teljess. A HPLC-HG-AFS vizsglatok fggetlen ICP-OES
meghatrozsokkal trtn kiegsztsre azrt volt szksg, mert a mdosulatanalitikai
mrsekkel meghatrozott szeln sszestett mennyisge sosem egyezett a mintbl kinyert
mennyisggel, szmos okbl kifolylag: (a) HPLC mrsre csak ultraszrsen tesett mintaoldat
kerlt, amely termszetesen a szretlen oldathoz kpest kevesebb szelnt tartalmazott ezt
ersti meg a tblzat jobb oldaln a 10 kDa alatti s feletti frakcik szelntartalmnak
bemutatsa is; (b) a rendelkezsre ll standardok s maga a mrrendszer sajnos kzel sem
tudott 100%-os mdosulatanalitikai azonostsi arnyt biztostani: ezen rtk a mintaelksztsi
lpstl fggen 1 s 41% kztt mozgott. Ez utbbi viszonylag kis arnyt az is okozhatta, hogy
nem zrhat ki a mintaelksztsek sorn kinyert, de hidridet nem kpz mdosulatok jelenlte
sem, melyeket csak ms elven mkd, a mintamtrix ltal lehetleg kevss befolysolt
detektlsi technikval, pl. csatolt ICP-MS vagy mivel a koncentrci elvileg lehetv teszi
ICP-OES segtsgvel lehetett volna kimutatni a HPLC elvlaszts sorn. Fontos kiemelni, hogy
e kt utbbi mdszer nem csak a monomer vagy eredetileg is klnll Se-mdosulatokat
detektln, hanem a rszben hidrolizlatlan, pl. oligopeptid jelleg molekulkat is. Ennl a
csiperkemintnl ez a jelensg a csak rszben hidrolizlt Se-tartalm vegyletek jelenlte is
biztosan hozzjrulhatott a viszonylag kis azonostsi arnyok kialakulshoz.
Ellenrzsi clbl az elz gombamintnl alkalmazott HHPN-AFS detektlsi rendszert is
sszelltottuk, hogy megbizonyosodjunk afell, esetleg nem a kzvetlen hidridkpzsre
kptelen Se(VI) mdosulat kpezi-e a nem azonostott szelnfrakci jelents rszt. Mint
kiderlt, Se(VI) egyetlen mintaoldatban sem volt jelen kimutathat mennyisgben.
Az azonostott mdosulatokat illeten kiemelt figyelmet rdemel a SeMet jelenlte. Elz
gombamintnk vizsglata sorn ugyanis ezt az egybknt nagyon gyakori Se-mdosulatot nem,
csak Se(IV)-et s valsznleg SeCys2-t mutattunk ki, mg ennl a csiperknl (melyet Sedstott lesztvel kiegsztett komposzton termesztettek) szinte mindegyik mintaelksztsi
99

Dernovics Mihly

lps egytt jrt SeMet- (s jval kisebb mennyisgben Se(IV)) extrakcival is. Mivel egyrszt
nem llt rendelkezsnkre minta a komposzthoz adagolt lesztbl, msrszt a szelnes leszt
legfbb Se-mdosulata a SeMet, nem lehetett eldnteni, hogy a kinyert SeMet sszes
mennyisge az lesztbl szrmazott-e vagy legalbb rszben a gomba szintetizlta mindehhez
radioaktvan jellt Se-izotpos vizsglatokra lenne szksg.
A kinyersi hatsfokok alapjn a kt, sejtfalbontsi lpst is tartalmaz mdszert
tekinthetnnk a leghatkonyabb mdszereknek azonban az azonostsi arnyokat figyelve mind
relatv, mind abszolt rtkben az egylpses, pronz hasznlatra pt eljrs ll az len. Br a
pronzos kezels az sszes Se-extrakci alapjn csak az utols eltti helyet foglalta el, a 10 kDa
alatti mrettartomnyban az els helyen vgzett, s eltekintve a tripszines kezels (C-3.)
sszestve viszonylag kis extrakcis eredmnytl ennl a kezelsnl volt a legnagyobb a
10 kDa alatti / 10 kDa feletti tartomny arnya is, amely erteljes hidrolitikus folyamatok
lejtszdsra utal. A pepszin-tripszin ketts alkalmazsa (C kezels) ugyan a teljes kinyers
s az azonostsi arny terletn kiss lemaradt a sejtfalbontsos D s E mdszerek
eredmnyeitl, m a 10 kDa mrettartomny arnyt tekintve mindkettt megelzte. Ez az
sszetett helyezs fleg a pepszin tevkenysgnek ksznhet, mivel a tripszin csak a kinyert
szeln mennyisgt nvelte meg, s alig jrult hozz azonosthat-mennyisgileg
meghatrozhat mdosulattal a kezels hatkonysghoz.
12. Tblzat. A szelnes lesztvel kiegsztett komposzton termesztett, Se-dstott gomba (160 g g-1 sszes
Se) mdosulatanalitikai vizsglata t klnbz mintaelksztsi eljrs vgrehajtsa utn. A tblzat 1 g
mintra vettve, mint g Se ismerteti a kinyert sszes Se- s Se-mdosulatok mennyisgt. A D s E
mdszerek msodik, sejtfalbontsi lpsben a korbban optimlis rtkknt elfogadott 30 mg mennyisg
enzim kerlt felhasznlsra. K.H.=kimutatsi hatr. (a) A szzalkos azonostsi arny szmtsnl a HPLC
oszlopra juttatott, 10 kDa alatti mrettartomnybl szrmaz szeln mennyisgt vettem alapul.

HPLC-HG-AFS

ICP-OES

ultraszrssel

Mveletek
SeCys2 SeMet

Se(IV)

sszestett

ultraszrssel
Azonostsi
<10 kDa >10 kDa
arny, %a
15
49,5
19,2

sszestett

ultraszrs
nlkl

68,7

68,8

<K.H.

5,7

1,5

7,2

<K.H.

37,8

5,1

42,9

41

104,0

12,9

117

125

C 1.lps
C 2.lps
C 3.lps
sszestett

<K.H.
<K.H.
<K.H.
<K.H.

5,3
9,1
<K.H.
14,4

1,3
<K.H.
0,2
1,5

6,6
9,1
0,2
15,9

16
24
1
16

41,3
37,5
18,6
97,4

17,8
16,1
2,1
36,0

59,1
53,6
20,7
133

61,0
55,8
20,8
138

D 1.lps
D 2.lps
D 3.lps
sszestett

<K.H.
<K.H.
<K.H.
<K.H.

5,4
1,8
5,4
12,6

1,7
0,4
0,4
2,5

7,1
2,2
5,8
15,1

15
19
30
19

47,3
11,6
19,3
78,2

19,3
13,3
27,2
59,8

66,6
24,9
46,5
138

67,8
26,4
46,6
141

E 1.lps
E 2.lps
E 3.lps
sszestett

<K.H.
<K.H.
2,6
2,6

5,3
2,9
6,9
15,1

1,4
0,2
<K.H.
1,6

6,7
3,1
9,5
19,3

14
15
33
20

46,2
21,2
29,3
96,7

18,0
6,7
17,1
41,8

64,2
27,9
46,4
139

65,1
28,9
48,4
142

100

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

gy elrkeztnk a ksrletsorozat legfontosabb eredmnyhez is: a sejtfalbontst is kpvisel


eljrsok annak ellenre bizonyultak kevsb hatkonynak az azonostsi arny tekintetben az
egylpses pronzos technikhoz kpest, hogy utols, harmadik lpsknt gyakorlatilag
magukban tvztk azt. Ezen jelensg mgtt tbb ok hzdhat meg. Egyrszt a tbblpses
mdszerek sorn minden lps egytt jrt centrifuglsi lpsekkel, melyek eltvolthattk a
reakcitrbl a ksbbi enzimes reakcik lehetsges szubsztrtjainak egy rszt is egybknt
ezzel szinte teljesen ellenttes folyamatot figyelhettnk meg a Se-dstott lesztgomba
esetben, ahol a centrifuglsi lpsek sorn a szeln jval kisebb mrtkben tvozott el
azonostatlan mennyisgknt. Msrszt az eltvoltott komponensek tlnyomrszt fehrjk
lehettek, hiszen ellenkez esetben a D s E utols lpseiben sorra kerl pronzos
bontssal sokkal hatkonyabb hidrolzist kellett volna elrni, mely jval nagyobb 10 kDa alatti /
10 kDa feletti arnyban testeslt volna meg. Ez a magyarzat valsznnek tnik akkor
azonban mindez kzvetett bizonytkul szolglhat arra nzve is, hogy gombaporbl a szelnnek
sokkal nagyobb biolgiai hozzfrhetsget kell mutatnia, ha ms nem, akkor a knnyen
kioldd/extrahlhat gombafehrjken keresztl.
A sejtfalbont enzimes kezelsek mindezek ellenre nem tekinthetek eredmnytelennek,
klnsen ami a lysing enzim hasznlatt illeti: amikor ezt az enzimet hasznltam a
szekvencilis mintaelkszts sorn, a fehrjebontsi lps j, ms mintaelksztsi lpsekkel
fel nem trhat Se-mdosulat megjelenst eredmnyezte (12. tblzat, E-3.), amelyet
retencis ideje alapjn SeCys2-knt azonostottunk (br a holttrfogat kzelsge miatt ms
komponensek egyttes elcijt nem lehet kizrni). Mindezekhez kpest a drizelz minden
sszehasonltsi paramter tekintetben gyengbbnek bizonyult, s fleg a 10 kDa alatti / 10 kDa
feletti arnyt tekintve maradt alul.
4.3.2.6. j tudomnyos eredmnyek a Se-tartalm lesztvel kiegsztett komposzton
termesztett, Se-dstott gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan
Megllaptottam, hogy a tbblpses, sejtfalbont enzimes kezelst is tartalmaz
mintaelksztsi mdszerrel szignifiknsan nagyobb kinyersi hatsfokot lehet elrni a csupn
fehrjebont enzimre pt vagy pufferelt kzeg extrakcikhoz kpest, mg abban az esetben is,
amikor a sejtfalbont enzimkeverk fehrjebont aktivitst szelektven gtoltam. Kt klnbz
inhibitor vegylet alkalmazsval, statisztikai kirtkels segtsgvel igazoltam, a sejtfalbonts
sorn valban lejtszdott fehrjebonts; mindez azt jelenti, hogy a fehrjebonts gtlsval
megklnbztethetv tettem a sejtfalbonts szelnkinyersre gyakorolt hatst.
A lysing enzim hasznlatval ms mdszerekkel nem kinyerhet Se-mdosulatot tettem
hozzfrhetv a fehrjebont kezels szmra. Ez a mdosulat a HPLC-vizsglatok
segtsgvel (retencis id alapjn) vgrehajtott azonosts sorn SeCys2-nek bizonyult.

101

Dernovics Mihly

4.3.3. A szelnnel dstott gombamintkkal vgzett mdosulatanalitikai vizsglatainak


lezrsa s utsz
Szelnnel dstott gombkkal vgzett ksrleteinkbl kt kzlemny is szletett
[STEFNKA 2001, DERNOVICS 2002]. A szekvencilis, sejtfalbontst is tartalmaz enzimes
mintaelksztsi mdszer kifejlesztsvel idben egytt haladtunk LARSEN et al.
kutatcsoportjval, akik nem sokkal elttnk kzltk lesztn s zldalgn vgrehajtott
ksrleteik eredmnyeit [LARSEN 2001]. A szelnnel dstott gomba az eddigi vizsglatok
kritikai rtkelse s tovbbfejlesztse utn valsznleg alkalmas lehet funkcionlis lelmiszer
ksztsnek cljra, fleg szrtott (por) alakban, pl. instant ksztmnyek kiegsztse rvn,
gy garantlva a szeln kielgt mrtk biolgiai hozzfrhetsgt.
4.4. AZ ELS LRM KIDOLGOZSA A SZELN MDOSULATANALITIKA TRTNETBEN
Az lelmiszerekben kimutathat arznmdosulatok LD50 rtkei kztt fennll, akr hrom
nagysgrendnyi klnbsg megtmadhatatlan indokknt hzdott meg a majdnem 10 ves
sszefogs eredmnyt megtestest, CRM-627 (s 626) arzn mdosulatanalitikai hiteles
anyagmintk elksztsben. Ugyanakkor a szeln esetben az elem ltfontossg volta s az
egyes gyakran elfordul mdosulatok egymshoz kzelebbi toxicitsa miatt rnyaltabb s a
kevsb clratr magatarts volt megfigyelhet mind a hiteles anyagmintkat elllt
intzeteknl, mind pedig a szakmai kzlemnyekben. Sem a clmdosulat, sem a
clkoncentrci, sem az alkalmas minta kivlasztsa nem szmtott egyszer feladatnak. Els
megkzeltsben a BCR a lehet legegyszerbben jrt el: a kt szervetlen Se-mdosulattal
addcis eljrs keretben mestersges ivvzmintt lltott el, kt klnbz (sszes Setartalmat tekintve 14 s 80 g l-1) koncentrciban [QUEVAUVILLER 1998]. Az eurpai
ivvizek tlagos szelntartalma ng l-1 nagysgrend vagy mg kisebb [DULIVO 1997],
fogyasztsuk teht nem vlt ki lelmiszer-biztonsgi aggodalmat; ebbl lthat, hogy a vlaszts
oka nem gyakorlati szksglet, hanem kezdeti tapogatdzs s a meglehetsen instabil
(knnyen egymsba alakul) mdosulatok vizsglata volt. A tervezett hiteles anyagminta vgl a
gyakorlati felhasznls cljaira alkalmatlannak bizonyult, mivel a trolednyzet els nyitst
kveten valsznleg a beoldd oxign hatsra szignifikns mdosulatvltozs llt be.
A mestersges minta utn a figyelem a termszetes szelntartalommal rendelkez, valban
gyakorlati mintk fel fordult. Tbbelemes (As, Hg, Se) mdosulatanalitikai hiteles anyagminta
ellltsnak cljbl a BCR osztrigamintt ksztett, melyet 1,2 g g-1 krli Se-koncentrci
jellemzett. A Mulspot terv keretben, nemzetkzi krelemzs segtsgvel vgrehajtott
hitelestsi folyamat a szelnre nzve kudarcot vallott, mivel ilyen kis koncentrcit a minta
kiemelked vas- s zsrtartalma miatt a laborok jelents hnyada sajnos mg sszes Setartalomra sem tudott pontosan meghatrozni, nem is beszlve a mdosulatanalitikai mrsekrl
[MULSPOT 1998]. Msrszrl jogosan merlhetett fel a ktely, szksges-e egyltaln ebben a
koncentrcitartomnyban szeln mdosulatanalitikai mrseket vgezni, hiszen figyelembe
vve az eredeti minta szrazanyag-tartalmt s a szeln tengeri eredet lelmiszerekbl mutatott,
korbban mr emltett kis biolgiai hozzfrhetsgt a szelnt illeten ismt nem a valdi
102

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

szksglet ltal sugallt mintrl volt sz: 50%-os (a valdi rtket tbbszrsen meghalad)
szelnfelszvds esetn is csak a legalbb napi 5-6 kg osztriga fogyasztsa jelentene
egszsggyi kockzatot.
Nem tudni, milyen okbl kifolylag, de a taln leginkbb kzenfekv, a htkznapokban
valban gyakorlati jelentsggel rendelkez, olcsn, nagy mennyisgben, szablyozhat
szelntartalommal elllthat, a szakirodalmat tekintve rendkvl szles krben tanulmnyozott
s feltrkpezett, szelnnel dstott lesztbl sem kszlt hiteles anyagminta mg sszes
szelntartalomra sem. Igny lenne r, hiszen a kzlemnyek alapjn legalbb 3-4 tucat, kisebbnagyobb cg gyrt por vagy tablettzott formj, kifejezetten szelnptlsi cllal forgalomba
hozott lesztksztmnyt haznkban is legkevesebb 3 (ebbl 2 magyar) cg gyrtmnyait
tallhatjuk meg a gygyszertrak s a gygyhats termkeket forgalmaz boltok polcain. Mint
ahogy BHYMER s CARUSO [2000] megllaptottk, risi klnbsg tapasztalhat a szeln
mdosulatanalitikai eloszlst illeten a szinte 100% SeMet s a szinte 100% Se(IV) tartalm,
nmagukat a szelnt szerves ktsben hordoz tulajdonsggal jellemzett klnbz mrkk
kztt hatrrtkek, ajnlott mdosulatarnyok azonban mg sehol sem kerltek
meghatrozsra.
Pedig mindenkppen nagy szksg van mdosulatanalitikai referenciaanyagra, ugyanis a
legegyszerbb, mintaelksztst gyakorlatilag alig ignyl vzmintktl s a fehrjeszint
mdosulatanalitikai elemzsektl eltekintve jelenleg megoldatlan a szeln mdosulatanalitikai
mrsek legtbb szakasznak minsgbiztostsa. Mr egy LRM meglte is nagymrtkben
javtana a helyzeten, hiszen br CRM hinyban a mrs pontossgt csak krlmnyesen lehet
megllaptani, de az LRM lehetv tenn a mrs ismtelhetsgnek, reproduklhatsgnak s
a mintaelksztsi folyamatot jellemz kinyersi hatsfoknak meghatrozst, valamint
kontrollkrtys mdszerrel felgyelhetv, ellenrizhetv tenn a teljes vizsglati folyamatot. A
referenciaanyag szelnkoncentrcijnak el kell rni azt a tartomnyt, amelyben a szeln
mdosulatanalitika lelmiszer-biztonsgi szempontbl indokoltt vlik. A korbban emltett
okokbl kifolylag az adalkols alkalmatlan LRM ksztsi clokra, gy a mestersges
szelndsts vagy valamely knnyen hozzfrhet, eredenden nagy szelntartalm minta
hasznlata tnik clravezetnek. Szemlyes tapasztalataim alapjn az egysejtek (leszt,
tejsavbaktrium) dstsa kis (=laboratriumi) lptkben a trzsszelekcis s inhomogenitsi
problmk miatt nehezen kvethet utat kpvisel; a csiperkegomba ugyan knnyen elllthat
nagy tmegben, de az ltala szintetizlt Se-mdosulatoknak jelenleg csupn kb. 40%-t tudjuk
azonostani (ld. 4.3. alfejezetek) ez a tny pedig egyrtelm gtat jelent a csiperkegomba alap
mdosulatanalitikai RM ellltsnl.
A msik csoportot meglehetsen szk kr kpviseli. Az llati szervezet nem kpes szelnt
nagy mennyisgben trolni; szrazanyagra szmtva 1 g g-1 krli rtkben csupn az tlagnl
nagyobb mennyisg szelnt tartalmaz tpon nevelt hzillatok belssge (mj, vese)
tartalmazza, ill. a tengeri halak, rkok izma s ikrja rheti el ritka megnyilvnulsknt a
4-5 g g-1 szelnkoncentrcit [REILLY 1998]. Nvnyek esetben tbbek kzt nhny szakAmerikban honos, fitoremedicis clra is hasznlt gyomfle, a vadmustr (Brassica juncea) s
103

Dernovics Mihly

a nehz szag baktvis (Astragalus praelongus) kpes dstani a talaj szelntartalmt akr
nhny szz g g-1 rtkig [UDEN 1998]. Szmunkra ezek a nvnyek tbb okbl kifolylag
sem alkalmasak LRM ksztsre: (a) csak korltozottan lehet ket beszerezni (Eurzsiban nem
honosak); (b) sem lelmiszerben, sem llati tpokban nem hasznljk fel ket, gy vizsglatuk
lelmiszer-biztonsgi szempontbl nem indokolt; vgl (c) a bennk kimutatott
szelnmdosulatok azonostsa standardok hinyban kizrlag ESI-MS segtsgvel
trtnhet.
Ltezik azonban egy nvny, a brazil di (Bertholletia excelsa), melynek csonthjas termse
minden szempontbl megfelel alanynak ltszott szeln mdosulatanalitikai referenciaanyag
kialaktsra. A haznkban ltalban hjatlantva, paradi megnevezssel polcokra kerl termk
hazja Brazlia, ahol kt, egymstl a talaj szelntartalmban rendkvli mdon eltr,
eserdvel bortott rgiban terem. A kzp-brazliai rgibl szrmaz, hjastul s kisebb
kiszerelsekben (0,25-0,75 kg) csomagolt di szelntartalma az 500 g g-1 rtket is
meghaladhatja, mg a szelnben szegnyebb talajjal jellemezhet, nyugat-brazil terlet termse
mlesztve, hjjal vagy hj nlkl jut el a fogyaszthoz, tlagosan 3, de legfeljebb is csak
30 g Se g-1 koncentrcival [SECOR 1989, CHANG 1995]. A leginkbb desszertknt
felhasznlt brazil di azta npszer Nyugat-Eurpban, amita a 70-es vek vgn a brit
kormny kln felhvta a lakossg figyelmt arra, hogy az szak-amerikai bzaimport eurpai
bzval trtn kivltsa miatt lecskken, lelmiszer-eredet szelnbevitel brazil di
fogyasztsval is helyrellthat [REILLY 1998]. E terms napjainkban szinte minden
jelentsebb nyugat-eurpai bolt polcain megtallhat, a hagyomnyos dihoz kpest jval
alacsonyabb rfekvssel; haznkban a rendszervltst kveten jelent meg s mg viszonylag
drga, luxus lelmiszerknt kaphat, 150-250 g-os tasakokban. A brazil di tovbbi
jellegzetessgei kzl fontos megemlteni, hogy 70 m/m % krli zsrtartalommal rendelkezik,
s szrazanyag-tartalma meghaladja a 99 m/m %-ot.
Annak ellenre, hogy a vilg jelenleg ismert legnagyobb termszetes szelntartalm
lelmiszerrl van sz, meglehetsen ksn kezdtk el tpllkozs-lettani s
mdosulatanalitikai vizsglatt. CHANSLER et al. [1986] eredmnyei azt mutattk, hogy a
brazil di szelntartalmnak tbb mint 95%-a biolgiailag hozzfrhet formban van jelen; ez
az rtk az eddig ismert legnagyobb a nem llati eredet lelmiszerek kztt. Ez a tny,
kiegsztve azokkal az ismeretekkel, hogy a brazil di fehrjefrakcija kiemelked
metionintartalommal rendelkezik (19 n/n %) a nvnyi lelmiszer-fehrjkhez kpest [TU 1998],
s hogy a brazil dival etetett patknyok testszveteiben a SeMet-t tartalmaz tpot fogyaszt
trsaikhoz hasonl mrtk szelndsulst figyeltek meg [IP 1994], arra utal, hogy ebben a
mintban nagy valsznsg szerint SeMet lehet a f szelnmdosulat teht minden
szempontbl idelis vlasztsnak tnik a szeln mdosulatanalitikai referenciaanyag cljra:
vrhatan (a) nagy Se-koncentrci, (b) minsgileg s mennyisgileg meghatrozhat Semdosulat(ok) s (c) valdi lelmiszer-biztonsgi krds jellemzi, hiszen akr nhny szem di
elfogyasztsa a Se-mdosulattl fggen mr tlzott Se-bevitelhez vezethet. Ezek alapjn
hatroztuk el, hogy egyrszt vgrehajtjuk a brazil di mdosulatanalitikai vizsglatt, msrszt
104

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

amennyiben a mrsek sikerrel zrulnak LRM ellltst ksreljk meg, a hozz tartoz
sszetteli, homogenitsi s stabilitsi mrsekkel egytt.
4.4.1. Felhasznlt anyagok s vegyszerek
A ksrletekhez felhasznlt kt, egyenknt 500 grammos, sszesen kb. 80 db hjas brazil
dit tartalmaz csomag egy rmai bevsrlkzpontbl szrmazott. Az egyik csomag tartalmt a
mintaelksztsi s elzetes mdosulatanalitikai elemzsekhez hasznltuk fel, mg a msik
csomagot teljes egszben a referenciaanyag elksztsre fordtottuk.
A zsrtalantsi mdszer kialaktsa sorn felhasznlt gumiarbikum, lipz enzim, Nataurokolt, ciklohexn s a foszftpuffer ksztshez alkalmazott K2HPO4 s KH2PO4 sk
jellemzit a 3.1. fejezetben ismertettem, a mintaelkszts egyb lpseinl alkalmazott pronz
(nem szubsztrtspecifikus fehrjebont enzimkeverk), cc. HNO3 ill. a 30 m/m % H2O2 oldattal
egytt. Az sszes szelntartalom meghatrozsnak analitikai minsgbiztostshoz TORT-2
(lbasfej hepatopankreszbl kszlt) CRM-et hasznltunk, melyet a National Research
Council of Canada (Halifax, Kanada) llt el s forgalmaz.
A kromatogrfis anioncserl ill. ionprkpzssel vgrehajtott fordtott fzis HPLC
elvlaszts s a hidridfejleszts segtsgvel, atomfluoreszcens detektlssal trtn minsgi s
mennyisgi Se-mdosulat meghatrozs rszletes lerst, gy az ott alkalmazott standardok s
vegyszerek bemutatst is STEFNKA et al. kzlemnye [2003b] s STEFNKA PhD
rtekezse [2003a] tartalmazza.
4.4.2. A brazil di zsrtalantsa
A di enzimes zsrtalantst MTRAI [1997] ltal lert mdszer talaktsval vgeztem. A
kls s bels hjtl megtiszttott dit konyhai kvdarl segtsgvel krmes llagv
rltem, majd 0,50 g-nyi mennyisget 20 ml-es fzpohrba mrtem, amelyhez emulgelsi
clbl 1 ml, 20 mg ml-1 Na-taurokolt-oldatot, 5 ml 100 mg ml-1 gumiarbikum-oldatot, ill.
5 ml, 0,25 mol l-1 (pH=8,0) foszftpuffert adagoltam. Ezt kveten az elegyet mgneses kever
segtsgvel homogenizltam, hmrsklett kls ft folyadkkzeg segtsgvel 37-38C-ra
melegtettem, majd 1 ml foszftpufferben oldott, 30 mg ml-1 koncentrcij lipz enzim
hozzadsval elindtottam a zsrbontsi reakcit. Az oldat kmhatst elzetesen kalibrlt pHmr segtsgvel folyamatosan nyomon kvettem. A reakci elrehaladtval az elegy
kmhatsa semleges, majd savas tartomnyba csszott t, ekkor 0,05 mol l-1 NaOH-oldat
automata pipettval trtn adagolsval a kmhatst tbblpsben visszalltottam az enzim
pH-optimumhoz kzeli 7,5-s rtkre. Kb. 1000 l NaOH adagolsa utn a kmhats
cskkense lelassult s tovbbi lg adagolsra nem volt szksg. Ekkor a 20 ml-es fzpoharat
tartalmval egytt a kever eltvoltsa utn rzasztallal elltott termoszttba helyeztem t,
parafilmmel lefedtem s 37C fokon mg 12 rn keresztl, 160 perc-1 fordulatszmon
kevertettem. A teljes zsrbontsi reakci kb. 26 rt tett ki. Ezt kveten az elegyet maradk
nlkl 15 ml-es centrifugacsbe mostam t s 5C hmrskleten, 25 percig, 4100 g terhels
105

Dernovics Mihly

mellett centrifuglssal 3 frakcira (lipidrteg, pufferoldat, ditrmelk) osztottam, melyeknek


savas roncsols segtsgvel hatroztam meg az sszes szelntartalmukat.
A di szerves oldszerrel trtn zsrtalantshoz a megtiszttott termseket konyhai
reszelvel 2-3 mm-es forgcsokk aprtottam, amelyeket 10,00 grammonknt
extrahlhvelyekbe mrtem ki. Soxhlet-berendezs segtsgvel, 1:10 direszelk:ciklohexn
tmegarny belltsa utn 10 tbukson keresztl zsrtalantottam a mintt. A kb. 3 rs
folyamat vgn az extrahlhvelyeket kirtettem, az eltvoltott diforgcsokat slyllandsg
elrsig szobahmrskleten tartottam a rajtuk maradt ciklohexn eltvoltsa cljbl, majd
visszamrtem a mintkat a tmegcskkens meghatrozsa vgett. Az extrahlt zsrt tartalmaz
ciklohexnt ioncserlt vzzel vlaszttlcsrben rztam ki; a vizes s interfzist elvlasztottam,
s addig ismteltem a vizes kirzst, amg a szerves fzis zavarodsa meg nem sznt. Az
egymst kvet folyadk-folyadk extrakcikbl szrmaz vizes s interfzisokat egyestettem,
infralmpa al helyezett PTFE ednyekben 1-2 ml-es trfogatra proltam s savas roncsolssal
meghatroztam sszes szelntartalmukat. Az extrahlt ciklohexnbl vkuumbeprlssal
nyertem vissza a tiszta oldszert, a beprlsi maradkot pedig az elbb lertakhoz hasonlan
savas roncsolsnak vetettem al.
4.4.3. A brazil di mdosulatanalitikai mintaelksztse sorn vgrehajtott mveletek
bemutatsa
A szerves oldszerrel zsrtalantott direszelket porceln drzsmozsr segtsgvel finom
porr rltem, majd 125 m-es szitatnyron tszitltam; az enzimes mdosulatanalitikai
mintaelkszts cljaira az thull frakcit hasznltam fel. Ebbl a lisztszer mintbl 150 mgot polietiln fiolba mrtem ki, 3 ml 0,06 mol l-1 (pH=7,4) foszftpuffert adtam hozz s a mintt
rzogatssal-kevergetssel feloldottam; ezutn 0,6 ml pufferben oldott 15 mg pronz enzimet
mrtem az oldathoz. A fiolt lezrtam, s 37C fokon, 24 rn keresztl, 180 perc-1
fordulatszmon kevertettem. A kezels vgn a fiola tartalmt maradk nlkl centrifugacsbe
mostam t, s 15C hmrskleten, 25 percig, 4100 g terhels mellett centrifuglssal
kileptettem a minta oldhatatlan rszeit. A fellszt elvlasztottam, 0,45 m-es
fecskendszrn keresztl 5,0 ml-es mrlombikba juttattam, majd a lombikot ugyancsak a
szrn keresztl ioncserlt vzzel jelre tltttem. Ezt az oldatot hasznltuk fel mind a HPLC-vel
vgzett mdosulatanalitikai mrsekhez, mind pedig a prhuzamosan fut, ICP-OES
segtsgvel trtn sszes Se-meghatrozshoz.
A centrifuglssal kapott ledket a hozz tartoz 0,45 m-es szrvel egytt savas
roncsolssal (3.1. fejezet) trtam fel s meghatroztuk az sszes Se-tartalmat a kinyersi hatsfok
rtkeinek (ms megfogalmazsban a szelnmrleg) megllaptshoz; ez utbbi teljess
ttelhez a kiindulsi dipor sszes szelntartalmt is meg kellett mrni. Az sszes Semeghatrozs minsgbiztostst TORT-2 CRM prhuzamos elemzsvel (150-200 mg
bemrssel) oldottuk meg.

106

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

4.4.4. A brazil dibl kszl, Se-mdosulatanalitikai LRM kialaktsa sorn alkalmazott


mveleti lpsek ismertetse
4.4.4.1. A referenciaanyag ellltsa a nyersanyag feldolgozstl a trolsi ksrletek
kialaktsig
A referenciaanyag ksztshez 500 g brazil dit hasznltunk fel. A termseket feltrtk, a
hibs darabokat s a kls hjat eltvoltottuk, majd a termsekrl lekapartuk a bels barna hjat
is. A vlogatst kveten 210 g tiszta dihoz jutottunk, melyet aprra reszeltnk s a 4.4.2.
pontban lertak szerint Soxhlet-extrakci segtsgvel ciklohexnnal zsrtalantottuk. A
zsrmentes direszelk tmege 61,0 g-nak addott, amely 71 m/m %-os tmegcskkenst jelent.
A di egy kis rszbl sszes Se-meghatrozst vgeztnk el; a maradk tovbbi kezelst (a
125 m-es mrettartomny elrshez szksges finomra rlst, szitlst s homogenizlst) a
minta viszonylag nagy mennyisge miatt felkrsnkre az Orszgos Mezgazdasgi
Minsggyi Intzet (OMMI) laboratriuma vgezte el. Ezt kveten a diport 1,5 grammos
kiszerelsekben azonost jelekkel elltott, polietiln fiolkba osztottuk szt, amelyek egy
rszbl homogenitsvizsglatot vgeztnk el (4.4.4.2. pont). Mivel ez utbbi sikerrel zrult,
teht a minta homogenitsa megfelelnek bizonyult, a fiolkat lezrtuk s egy (az n.
besugrzsi kontroll) kivtelvel a Kzponti lelmiszertudomnyi Kutatintzet (KKI)
Mikrobiolgia Osztlyn 60Co gy segtsgvel 25 kGy -besugrzsnak tettk ki; ugyanitt
zajlott le a vzaktivits (aw; kszlk: Novasina; Novasina A.G., Zrich, Svjc) ill. a sugrkezels
eredmnyessgt vizsgl baktrium, pensz s leszt sszcsraszm meghatrozs is. A
mikrobiolgiai vizsglatok utn az immr steril diport a 6. brn bemutatott eloszts szerint 3
klnbz (-18C, +4C s +24C) hmrsklet helyen troltuk s a jellt idkznknt a
hagyomnyos ill. izokrn stabilitsvizsglati elv [LAMBERTY 1998] szerint vgeztk el a
mdosulatanalitikai vizsglatokat. A besugrzsi kontroll elemzsre 1 hnapos trolst
kveten kerlt sor.
4.4.4.2. A homogenitsvizsglat menete
A szeln s a SeMet n. trolsi egysgen belli homogenitst kt, a tltst kveten
vletlenszeren kivlasztott fiolbl vgzett vizsglatokkal hatroztuk meg; az egyik fiola az
sszes szeln, mg a msik a SeMet eloszlsnak ellenrzsre szolglt. Fiolnknt 9-9
prhuzamos mrst hajtottunk vgre, melyek sorn a mintaelksztst 150 mg dipor
bemrsvel vgeztk el. Az n. trolsi egysgek kztti homogenits megllaptshoz 9 db
fiolbl egyenknt 300 mg mintt vettnk, melybl 150 mg-t az sszes szeln, mg 150 mg-ot a
SeMet mdosulatanalitikai meghatrozsra hasznltunk fel. A mintavtel eltt a fiolkat nhny
percig kzzel sszerztuk, hogy az esetleg sszetapadt szemcsket sztvlasszuk egymstl s
gy biztostsuk a homogn mintavtel lehetsgt.

107

Dernovics Mihly

Trolsi
elrendezs s
hmrsklet

+4C

a1

a
Hagyomnyos

-18C

Jel

g
60
Co

b
b
b
c
c

+24C
thelyezs
-18C-rl
+24C-ra
-18C

Izokrn

d
d
d
e

Trols idtartama (hnap)


s a mrs idpontja (n)
1
2
3
n
n
n
n
n
n
n
n
n
-18C

+24C

-18C
-18C

+24C

n
n
n

6. bra. A brazil dibl referenciaanyag clzattal ltrehozott ksztmny stabilitsvizsglatnak trolsi


elrendezse s mrsi temterve. A pipa szimblum a -besugrzson tesett anyagot mutatja. A n jelzs
a mdosulatanalitikai mintaelkszts s mrsek vgrehajtsnak idpontjt jellik. A Jel fejlc
oszlopban tallhat azonost betk fels indexei a trolsi idtartam hosszra utalnak.

4.4.5. A minta zsrtalantsra irnyul ksrletek kirtkelse


A brazil di szelntartalmnak megoszlst illeten ismeretlen sszettel s jellegzetesen
nagy (70 m/m % krli) zsrtartalma elvileg magban hordozta annak a lehetsgt, hogy esetleg
lipofil karakter vegyletek is hordoznak szelnt ugyanakkor a szmunkra rendelkezsre ll
HPLC rendszerekkel kivitelezhetetlen lett volna egy ekkora zsrtartalm minta kzvetlen
elemzse. gy els megkzeltsben clszernek tnt a gyengd mintaelksztsi mdszerek
kztt szmon tartott enzimes kezelssel megbontani a minta egysgt, hogy kpet kaphassak a
szeln mintaalkotkon belli eloszlsrl; br a szeln ltalban a minta fehrjetartalmhoz
kapcsoldik, errl a brazil di esetben is bizonysgot kellett szerezni. Ehhez termszetesen
egyrszt emulgelszerekre (gumiarbikumra s Na-taurokoltra) volt szksg a minta vizes
oldatba trtn vitelhez, msrszt a zsrbontssal egytt jr pH-cskkens fkezsre s
ellenslyozsra pufferoldatot kellett adagolni. Elzetes mrseim alapjn a kb. 350 mg zsrt
tartalmaz, 500 mg diminta lipz enzimmel val kezelsnl mg a 0,25 mol l-1 (pH=8,0)
foszftpuffer sem bizonyult elegend kapacitsnak a pH legalbb semleges (teht a felhasznlt
enzim optimuma krli) rtken tartshoz. Ebbl kifolylag a reakci indtst kveten hg
NaOH-oldat adagolsval lltottam vissza a kmhatst egszen addig, amg a foszftpuffer s a
vlheten az enzim ltal felszabadtott zsrsavak Na-si ltal biztostott pufferhats stabilizlta az
elegy pH-jt. A 24 rs kezelst kvet, 5C fokon vgzett centrifugls hrom, egymstl
tisztn elklnl fzist eredmnyezett: vastag hfehr zsrrteget kiss diffz (interfzis jelleg)
108

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

als hatrfellettel a cs tetejn, egy kztes szntelen pufferes-vizes fzist s az oldhatatlan


ditrmelket. A rtegek sszes szelntartalma volt hivatott eldnteni, hogy a mdszer alkalmase a zsrtartalom eltvoltsra ill. hogy valjban hol helyezkedik el a szelnt tartalmaz
difrakci.
A savas roncsols a kvetkez eredmnyre vezetett: (a) a trmelk szelntartalma kimutatsi
hatr alattinak addott, (b) a pufferes-vizes fzis s a zsrrteg kb. fele-fele arnyban hordozott
szelnt. Mindez azt jelentette, hogy felems helyzet alakult ki: br a lipz enzimes kezels a
minta sszes szelntartalmt oldatba vitte, annak fele tovbbra is mdosulatanalitikai elemzsre
nem bocsthat frakciban helyezkedett el. Tovbbra is nyitva maradt a krds: vajon a szeln
jelents rsze valban lipofil vegyletek formjban tallhat-e meg a mintban, vagy esetleg a
feltrs nem bizonyult tkletesnek s a zsros mintamtrix nem bomlott meg teljesen, magba
zrva pl. a minta fehrjetartalmnak egy rszt.
Fontos megjegyezni, hogy a ksrletet kontroll mintval is elvgeztem, amely enzimet nem,
csupn emulgelszereket s puffert tartalmazott; ennek centrifuglsakor kt rteg, a
ditrmelk s egy zavaros, fehr, tejszer emulzi alakult ki, teht a zsrrteg enzimes kezels
nlkl nem klnlt el a vizes fzistl.
A zsrtalants msik mdjul a korbban szeln mdosulatanalitikai szakirodalomban mg
nem jegyzett mdszert, a Soxhlet-extrakcival vgzett, vzzel nem elegyed szerves oldszeres
(teht alkoholokat nem alkalmaz) kezelst vlasztottam. Ez az eljrs nem jr szmottev
hmrsklet-emelssel, mivel a mintval a mr lecsapdott, 50C fok krli hmrsklet
oldszer rintkezik, teht a szervetlen Se-mdosulatok kzti redox tmenet veszlye mg nem ll
fenn. Szerves oldszerknt ciklohexnt vlasztottam, mivel ez a klrt nem tartalmaz
vegylet vlhetleg inert kzegknt viselkedik s a lipofil vegyletek kioldsn kvl nem lp
ms reakciba a minta alkotival.
A ksrlet teljes mrtkben bevltotta a hozz fztt remnyeket. Mint ahogy a
ksbbiekben bemutatsra kerl szelnmrleg adatai igazoljk, a ciklohexn gyakorlatilag a
szelntartalom cskkentse nlkl zsrmentestette a dimintt, s a kezels azzal a jrulkos
elnnyel is jrt, hogy a kialakul direszelket a tovbbiakban knnyen, sszetapads veszlye
nlkl lehetett rlni s szitlni. Mindez azt is igazolta, hogy a brazil di szmottev
mennyisgben nem tartalmaz lipofil Se-mdosulatokat.
A brazil dival folytatott, minden tovbbi vizsglatot ciklohexnnal zsrtalantott formban
hajtottunk vgre.
4.4.6. A szelnmrleg alakulsa a referenciaanyag ksztse sorn
Az elzetes ksrletek sorn nyilvnvalv vlt, hogy a nem zsrtalantott di savas
roncsolsa a kiemelked, 70 m/m % krli lipidtartalom, annak valsznleg egyenetlen
eloszlsa s az egyes dik kzti eltrsek miatt csak kis megbzhatsggal teszi lehetv az
sszes szelntartalom megllaptst. Ebbl kifolylag a tisztts s vlogats utn rendelkezsre
ll 210 g dibl nem vgeztnk el sszes Se-meghatrozst, hanem vgrehajtottuk a reszelst s
a zsrtalantst, majd a ltrejv 2 frakcinak (zsrmentes dipor + szerves oldszerrel
109

Dernovics Mihly

eltvoltott lipid s lipofil dialkotk) kln-kln hatroztuk meg savas roncsolssal a Setartalmt, amely a dipornl 81,3 g Se g-1 (RSD: 5,9%, n=5), mg a Soxhlet-extrakcival
kialakul lipidfrakcinl sszesen 9,9 g Se rtknek addott. Mindez azt jelenti, hogy a 61,0 g
zsrtalantott di hozzvetlegesen 4960 g szelnt tartalmaz, s a szerves oldszeres kezels az
sszes szelntartalom kb. 0,2%-t tvoltotta el. Mivel a dipor ezt kveten mg tesett a
szemcsemret-cskkentst clz tovbbi aprtson s szitlson, clszernek tnt mg egyszer
meghatrozni az sszes szelntartalmat, hiszen a szemcsemret-eloszls vltozsa minden
bizonnyal befolysolja a teljes mrsi bizonytalansgnak a minta inhomogenitsbl fakad
sszetevjt. Ezen felttelezs igaznak bizonyult: a vgl stabilitsvizsglatokhoz is kijellt
rtk 82,9 g Se g-1-nak addott (RSD: 4,7%, n=5). Br kt mints t-prba szerint a kt
tlagrtk kztt szignifikns eltrs nincs, azonban az utbbi rtk hasznlata clszer, mivel a
kisebb szemcsemret dipor kpezte az sszes ksbbi vizsglat trgyt.
Az sszes szelntartalom meghatrozsnak minsgbiztostsra TORT-2 CRM
prhuzamos elemzse szolglt. A mrt rtkek (5,85 1,09 g Se g-1, n=3) eltrse a hiteles
rtktl (5,63 0,67 g Se g-1) nem volt szignifikns, gy az sszes Se-tartalom eredmnyek
elfogadhatnak s megfelelnek tekinthetek.
4.4.7. A brazil di Se-mdosulatanalitikai mrseinek kirtkelse
A diminta mdosulatanalitikai mrsei kt csoportba oszthatk. A vizsglatok els
szakaszban a mintaelkszts s a HPLC mrs paramtereinek optimalizlsnl minsgi
azonostst hajtottunk vgre, hogy megllapthassuk, mely Se-mdosulatokat lehet a
ksbbiekben megbzhatan, mennyisgi kirtkelssel is meghatrozni. Ezen szakasz lezrsa
utn a mr kifejezetten referenciaanyag clzattal kezelt, -besugrzssal sterilizlt dibl a
mdosulatanalitikai mrsek clja a kivlasztott mdosulat mennyisgi meghatrozst foglalta
magba.
Mivel ESI-MS vagy MALDI-TOFMS hinyban a mintban tallhat Se-mdosulatokat
kizrlag a meglv standard vegyletekkel mutatott egyttes elcival (mskppen fogalmazva:
azonos retencis id alapjn) tudjuk azonostani, gy mindenkppen clszernek tnt legalbb
kt, egymstl alapjaiban klnbz kromatogrfis elvlasztsi rendszert alkalmazni. Ez a
megkzelts ha nem is zrja ki, de nagymrtkben lecskkenti a klnbz mdosulatok
azonos retencis id miatti tves azonostsnak lehetsgt. A diminta anioncserl oszlop
segtsgvel vgrehajtott ill. a fordtott fzis oszlopon ionprkpz vegylet alkalmazsval
kialaktott HPLC-elvlasztsa segtsgvel kt mdosulatot, SeCys2-t s SeMet-t lehetett
kimutatni; e kettbl mennyisgileg csak az utbbit tudtuk mennyisgileg is meghatrozni, mivel
a SeCys2 a holttrfogat kzelben eluldott mindkt kromatogrfis rendszer esetben,
amelynek kzelsge nem teszi lehetv az egyrtelm azonostst. Ebbl kvetkezik, hogy a
ksbbiekben csak a SeMet mdosulat meghatrozsra trekedtnk.
A referenciaanyagnak sznt mintarszlet esetben a SeMet mennyisgi elemzst mindkt
kromatogrfiai rendszer segtsgvel vgrehajtottuk. Az anioncserl oszlop hasznlatn alapul
elvlaszts szerint a minta szelnre szmtva 79,9 g g-1 (RSD: 6,2%), mg a fordtott fzis
110

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

oszlopon, ionprkpzvel trstott elvlaszts alapjn 80,4 g g-1 (RSD: 18,9%) SeMet-t
tartalmaz. A stabilitsvizsglatok szmra kijellt rtknek az elbbi, nyilvnvalan
robosztusabb s megbzhatbb mdszer ltal szolgltatott adatot fogadtuk el, amely egyben azt is
jelenti, hogy mrseink szerint a minta szelntartalmnak tbb mint 96%-t alkotja ez a szelenoaminosav. rdemes megemlteni, hogy a legjabb irodalmi adatok alapjn [LARSEN 2003] az
ltalunk SeCys2-nek vlt, a holttrfogat utn eluld mdosulat esetleg a SeMet oxidlt
formja, a szeleno-oxo-metionin (SeOMet) is lehet, amely a mintaelkszts sorn jhet ltre a
fehrjkbl felszabadtott SeMet-bl; gy elvileg nem zrhat ki, hogy a brazil di sszes Setartalma az utbbi mdosulat formjban van jelen.
A mdosulatanalitikai mrsek rtkelst felttlenl szksges kiegszteni az alkalmazott
mintaelkszts sorn tapasztalt kinyersi hatsfok ismertetsvel, hiszen egy esetleg kis
hatsfok vagy kis megbzhatsg feltrs magban rejtheti annak a veszlyt, hogy pl. a
klnbz idpontokban vgrehajtott mintaelksztsek ms, korbban nem tapasztalt
mdosulatot eredmnyeznek ill. ugyanazon mdosulat kisebb vagy nagyobb mennyisgben val
azonostsa tves stabilitsi paramterek megllaptsra vezethet. A diminta azonban ilyen
veszlyt nem rejtett magban: az enzimes mintaelkszts 98%-os tlagos kinyersi hatsfokot
rt el 94,7-105,2%-os tartomny mellett, amely a minta kiemelkeden j s knny
feltrhatsgra utal. Termszetesen ehhez nagymrtkben hozzjrult a szerves oldszeres
kezels, hiszen az apolris ciklohexn a zsrtartalom eltvoltsn tl a lipidmembrnok
feloldsval is megknnytette az enzimek hozzfrst a di fehrjetartalmhoz.
4.4.8. A homogenitsvizsglat eredmnyeinek bemutatsa s rtkelse
A homogenits ellenrzse alapvet feladat a referenciaanyagnak sznt minta minstsnl,
mivel az inhomogn anyag megnvelt mintabemrs esetn ugyan mg lehetv teheti a
pontos mrseket, de mindez mr csak kis megbzhatsggal trsulhat. Mindemellett a
mdosulatanalitikai referenciaanyag homogenitst a vizsglt elemre s a kivlasztott
mdosulatra kln-kln ellenrizni szksges, hiszen a klnbz, esetleg elemzsre nem
kerl, eltr eloszls mdosulatok az sszes elemtartalom kizrlagos homogenitsvizsglata
esetn elfedhetik az egyes mdosulatok klnbz eloszlst.
A brazil di esetben teht mind az sszes Se, mind pedig a SeMet vizsglatra szksg
volt; az elbbit savas roncsolssal, mg a szeleno-aminosavat anioncserl oszlop segtsgvel
vgzett mdosulatanalitikai elemzssel hatroztuk meg, a 6. brn ismertetett temterv szerint. A
9. Mellklet 1. tblzata tartalmazza a trolsi egysgen belli (B) s kztti (K)
homogenitsvizsglat eredmnyeit mindkt meghatrozand komponensre. A kirtkelst
statisztikai mdszerrel lehet vgrehajtani: amennyiben a vonatkoz szrsngyzetek, CVB s
CVK 1 bizonytalansgi rtkkel (UCV; definci szerint UCV CV/2n, ahol n = ismtlsek
szma) bvtett rtktartomnyai tfedik egymst, gy a homogenits kielgtnek tekinthet
[KRAMER 2003]. Ezen szably szerint a brazil di referenciaanyag megfelel homogenitst
mutat, br rdemes megjegyezni, hogy az sszes Se rtkeket tekintve az tfeds meglehetsen
szk; ebbl kvetkezen egy esetleges kvetkez gyrtsi folyamat sorn clszer lesz a
111

Dernovics Mihly

szemcsemretet egy tovbbi szitlsi fokozattal 90 m al cskkenteni, ill. a 150 mg-os bemrst
a nvnyi eredet referenciaanyagoknl javasolt elv szerint 250 mg-ra emelni [KORHAMMER
2000].
CRM-ek esetben a gyrtk egy rsze a hitelestsi paramtereken tl megadja a minimlis
bemrend mintamennyisget is, azt a tmeget, amelynek elemzse esetn a bizonylatolt rtkek
az adott megbzhatsgi (leggyakrabban 95%-os) szinten mg teljeslnek. Ehhez olyan
mrrendszerrel kell elvgezni a CRM mrst, amely egyrszt lehetv teszi nagyon kis
(< 1 mg) mintamennyisgek mintaelkszts nlkli elemzst, msrszt a magban a mrsi
folyamatban rejl bizonytalansg elg kicsi ahhoz, hogy a mrs teljes bizonytalansgt fleg a
minta inhomogenitsbl fakad tnyez hatrozza meg [PAUWELS 1993]. Erre a clra a
kzvetlen szilrd mints AAS vagy INAA mdszerek felelnek meg azonban mindkt eljrs
csupn az sszes elemtartalom meghatrozsra alkalmas, mdosulatanalitikai mrsekre nem. A
2003 mjusig ismertetett mdosulatanalitikai szakirodalom nem is emlt 100 mg-nl kisebb
bemrseket, mivel a ma ismert mrsi sszelltsok kizrlag oldatba vitellel (s az azzal
minden esetben egytt jr hguls miatt ignyelt, legalbb nhny szz mg mintbl) kpesek
mennyisgileg is meghatrozni a vizsglt mdosulatokat. gy mdosulatanalitikai
referenciaanyagoknl csak tttelesen, az sszes elemtartalom alapjn lehet kvetkeztetst
levonni a minimlis bemrend mennyisgrl s mindezt kizrlag akkor, ha egyetlen
mdosulat kpezi az adott minta teljes mdosulatspektrumt, hiszen az sszes elemtartalomra
megllaptott homogenits szrmazhat a mdosulatokra nzve loklisan inhomogn eloszlsbl
is. Mrsi eredmnyeink alapjn nem zrhat ki, hogy a brazil di Se-tartalma csak SeMet-bl
ll, gy elvileg megllapthat lenne a minimlisan bemrend mintamennyisg azonban az
emltett, szilrd mints mdszerek nem lltak rendelkezsnkre.
A homogenitsvizsglat adatait rdemes mg egy tovbbi elemzsnek is alvetni, amely
sorn a trolsi egysgek kztti (in)homogenitsi rtk vizsglata nyjthat rtkes tbbletinformcit. A 9. Mellklet 1. tblzatban feltntetett, 9 trolsi egysgbl szrmaz tlagok
szrsngyzete (uc(K)) 2 rszbl, a trolsi egysgek kztti inhomogenits (sK) s a mrsi
eljrs szrs-ngyzete (smrs) ltal okozott bizonytalansgi tnyezkbl ll ssze; az utbbi
pedig az analitikai (mskppen: a mdszerben rejl vltozkonysg ltal okozott)
szrsngyzetet s a trolsi egysgen belli inhomogenitst foglalja magba [PAUWELS 2000,
VAN DER VEEN 2001]:
s2mrs=( s2mdszer / n)+ s2B
ahol n az egy trolsi egysgbl elvgzett mrsek szma a trolsi egysgek kztti
inhomogenits megllaptsnl, sB pedig a trolsi egysgen belli inhomogenits.
Mivel a trolsi egysgen belli inhomogenits nem kpezi rszt a referenciaanyagok
sszestett bizonytalansgnak, s2B=0 rtknek vehetjk akkor, ha a homogenitsvizsglat sorn
mind a trolsi egysgek kztti, mind pedig a trolsi egysgen belli elemzseket azonos
mintabemrssel hajtottuk vgre, hiszen gy a referenciaanyag bels inhomogenitsa azonos
mrtkben jrul hozz mindkt rtk mrsi bizonytalansghoz. A di vizsglatnl minden
esetben ugyanazt a mdszert, ugyanakkora mintabemrssel alkalmaztuk akkor, amikor 9
112

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

fiolbl egy mrssel uc(K)-t becsltk, ill. amikor egy fiolbl 9 prhuzamos mrst hajtottunk
vgre; gy n=1 s sK rtkt a kvetkezkppen kzelthetjk [PAUWELS 1998]:
s2K = u2c(K) s2mrs= u2c(K) s2mdszer
A trolsi egysgek kztti mrsek szrsbl uc(K)-t, mg az egy trolsi egysgen
belliekbl smdszer-t szmolhatjuk ki; gy az sszes szelntartalomnl az sK tlagra vettve 3,40%nak, SeMet esetben pedig 3,34%-nak addik (ld. 9. Mellklet 2. tblzata). Ezekbl tbb,
rszben egymsra pl kvetkeztetst vonhatunk le:
1., Mivel a kt vizsglt sszetteli paramtert, teht a diminta sszes szelntartalmt s a
SeMet mennyisgt eltr mdszeres/vletlen hibkkal terhelt, egymstl szinte fggetlen
mrsi eljrsok (ICP-OES s AC-HPLC-UV-HG-AFS) segtsgvel llaptottuk meg, a kzel
azonos inhomogenitsi rtkek szerint a kt meghatrozand komponens inhomogenitsa azonos
mrtkben jrul hozz a referenciaanyag teljes bizonytalansghoz. Ms megfogalmazsban ezt
azt jelenti, hogy a kt komponens azonos eloszls a referenciaanyagban.
2., Az sszes Se-tartalom s a SeMet hasonl eloszlsa br csak szksges, de nem
elgsges mdon kzvetetten hozzjrul ahhoz, hogy a minta mdosulatanalitikai mrseinl
kt fggetlen elvlasztsi mdszerrel biztostott, SeMet-ra vonatkoz kromatogrfis
cscstisztasgot igazolni lssuk, hiszen az esetleg jelentsen eltr inhomogenitsi rtkek
mgtt egy vagy tbb, a SeMet-nal egyttesen eluld Se-mdosulat jelenlte is llhatott volna.
Nagy biztonsggal azt jelenthetjk ki, hogy a SeMet mdosulatanalitikai kalibrcis
egyenesnek meredeksgtl jelentsen eltr meredeksg kalibrcis egyenessel rendelkez,
SeMet-nal egytt eluld Se-mdosulat nem volt jelen az enzimes mintaelksztssel kapott
mintaoldatokban. Az utbbi esetben ugyanis az sszes Se-tartalom inhomogenitshoz (vagy
mskpp fogalmazva: a nagy megbzhatsg sszes Se-tartalom rtkekhez) kpest
valsznleg jval nagyobb SeMet-inhomogenitst (mskppen: mindkt kromatogrfis
rendszer esetn kis megbzhatsg SeMet-rtkeket) rgzthettnk volna.
3., A mdosulatanalitikai mrsek teljes bizonytalansghoz a mdszer ltal okozott szrs
(5,20%) nagyobb mrtkben jrul hozz, mint a minta inhomogenitsa, mg az sszes
szelntartalom esetn fordtott a helyzet. Ebbl kvetkezik, hogy br a korbban emltett tovbbi
szemcsemret-cskkents valsznleg javtan a mrsek megbzhatsgt, elsdlegesen magt
a HPLC mrstechnikt rdemes megvizsglni a mdszerben rejl, minttl fggetlen szrs
mrsklse cljbl.
4.4.9. A stabilitsvizsglat eredmnyeinek bemutatsa s rtkelse
A mdosulatanalitikai referenciaanyag stabilitsa nyilvnvalan magasabb szint minsgi
kvetelmnyeket tmaszt (a kszts sorn) s sugall is (a felhasznls kzben) a csupn
sszes elemtartalomra megadott-hitelestett referenciaanyagokhoz kpest, hiszen az utbbi
anyagban trols kzben kialakul esetleges mdosulatvltozs csak ritkn (rendszerint illkony
mdosulatok ltrejttekor) jrhat egytt a vizsglt s gy kimutathat paramter, pl. sszes
elemtartalom cskkensvel. Hasonl elvek alapjn a tbb mdosulatot egyenknt is jelents
mennyisgben hordoz referenciaanyag stabilitst nem clszer csak a mdosulatok egy rszre
113

Dernovics Mihly

vizsglni, hiszen az egyik, ppen tanulmnyozott mdosulat llandnak vlt rtke szrmazhat
egy nem vizsglt mdosulat talakulsbl is gyakori pldaknt a Se(VI) - Se(IV) kzti redox
egyenslyt lehet emlteni illetve az n. mtermk jelensg is fellphet, amely a detektor nem
kielgt mrtk szelektivitsa miatt kvetkezhet be.
A brazil di esetben az egyetlen valban mennyisgileg meghatrozhat mdosulat, a
SeMet egyrtelm tlslya miatt nem merlt fel az utbb felvetett lehetsg, amelyet a
rendelkezsre ll, eltr elvlasztsi elveket hasznl kromatogrfis mdszerek mg inkbb
valszntlenn tettek. Ugyanakkor a HPLC mrsek sajnlatos jellegzetessgei kz tartozik,
hogy az oszlopok s reagensek viszonylag srn mennek keresztl elhasznldsbleltmdsbl ill. j szlltsi ttelek felhasznlsbl add cserken s finom sszetteli
vltozsokon. Az olykor vgletekig optimalizlt elvlasztsi krlmnyek ilyenkor jbli
sszehangolson esnek t, amely folyamat a korbbi krlmnyek nem teljesen azonos
egytteshez vezethet. Ebbl fakadan a stabilitsi vizsglatok sorn clszer olyan vizsglati
elvet kialaktani, amely figyelembe tudja venni ezen vltozsokat is, s kpes elklnteni
egymstl a mrrendszer eltrsbl s a tnyleges mdosulattalakulsbl szrmaz, esetleg
instabilitsi rtkben testet lt folyamatokat. A mi esetnkben a kt f stabilitsvizsglati elv, a
hagyomnyos (hnaprl hnapra elemz) s az izokrn (egy idpontban elemz) tvzse
garantlta a helyes rtkek megllaptst (7. bra): mindkt elv alapjn meghatroztuk a sorra
kerl fiolk SeMet-tartalmt, s a mrt rtkeket az brn vzszintes vonallal jellt, az
anioncserl oszlopon vgzett mrssorozat elfogadott tlagval egytt tntettk fel.
Az rtkels sorn tbbfle statisztikai eljrs egyttes felhasznlsra van szksg,
amelyeket biolgiai mintkrl lvn sz 95%-os megbzhatsgi szint mellett rdemes
elvgezni. Grafikai kirtkelst alkalmazva az tlagrtkek 1 szrssal kiegsztett
tartomnynak legalbb rintenie kell az elfogadott rtket br ez minden tlag esetn
rvnyesl, lthat, hogy nem egy esetben (fknt a szobahmrskleten trolt mintknl) a
mrs viszonylag nagy szrsa teszi lehetv a megfelelsget. Az eredmnyek egytnyezs
varianciaanalzise nem mutat szignifikns eltrst az tlagok kztt. A pronknt elvgzett t- s
Welch-prbk szerint azonban a szobahmrskleten trolt mintk tlagai klnbznek a tbbi
tlag jelents rsztl, mg a mlyhtben (-18C) s a hagyomnyos htben (+4C) trolt
mintk sem egymstl, sem sajt csoportjukon bell, sem pedig az izokrn elv alapjn troltmrt trsaiktl sem mutatnak szignifikns eltrst. Mindez azt jelenti, hogy a hrom hnapi
trols sorn a vgig +24C fokon lv mintkban a SeMet stabilitsa megkrdjelezhet, br
bizonyos kirtkelsi szablyok alapjn mg nem lpi tl az instabilitsi hatrrtket;
ugyanakkor az sszes tbbi minta kielgt stabilitssal rendelkezik.
A referenciaanyagok trolednyzete a valdi gyakorlati felhasznls sorn szmos, akr
tbb tucat nyitsi-zrsi folyamaton esik t, mivel a rendszerint 15-20 grammos ednyenknti
tmegbl mintatpustl fggen 200-500 mg anyag kerl kimrsre. Minden egyes nyitsnl a
referenciaanyag rintkezik a kls levegvel, amelybl oxignt s nedvessget vehet fel.
Amennyiben a ksztmny vzaktivitsa tl kicsi (aw < 0,15), gy egyrszt autooxidci indulhat
meg, msrszt a kinyitst kvet gyors vzfelvtel s a higroszkpos anyagokra jellemz
114

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

SeMet-koncentrci, g Se g-1 minta rtkben

sszetapads jelensge kvetkezhet be [LINSINGER 2001]. Az tlagos szemcsemretnvekeds magban mg nem tesz felttlenl krt a referenciaanyag minsgben, azonban az
esetleg 0,4-0,5 krli szintre emelked vzaktivits mr teret biztosthat bizonyos enzimes s
nem enzimes degradcis folyamatoknak ill. ha aw > 0,42, akkor szlssges esetben mr
xerofil baktriumok szaporodhatnak el, aw=0,61-nl pedig penszek jelenhetnek meg. Mindez azt
jelenti, hogy a stabilitsi mrseken tl melyek fiolnknt olykor mg tz nyitsi-zrsi
egyttes mveletet sem ignyelnek a minta vzaktivitsnak mrse (belltsa) lnyeges rszt
kpezi a referenciaanyag stabilitsnak s gyakorlati felhasznlhatsgnak megllaptsnl.
A brazil dibl ksztett referenciaanyag 23C hmrskleten megllaptott vzaktivitsa
aw=0,36-nak addott, amely a fenti adatok tkrben idelisnak tekinthet, gy a korbban
ismertetett stabilitsvizsglatok eredmnyein tl egy tovbbi, fontos gyakorlati paramter
megfelel rtke is igazolja a ksztmny hasznlhatsgt.

90
85
80
75

b1 b2 b3

70

a1

d1 d2 d3

a2 a3

e1

65

c1

c2

c3

60

7. bra. A brazil dibl ksztett, Se-mdosulatanalitikai referenciaanyag-jellt ksztmny


stabilitsvizsglatnak eredmnye. Az brn az anioncserl kromatogrfis rendszerrel meghatrozott
SeMet-koncentrci (mint g Se g-1) kerlt feltntetsre. A jell betk magyarzata (a 6. brval
sszhangban): (a) 18C, (b) +4C, (c) +24C, (d) izokrn vizsglatok, (e) besugrzsi kontroll minta; a betk
fels indexei a trolsi idtartam hosszra (1-2-3 hnap) utalnak. A hibajell svok
1 szrsra utalnak. A vzszintes vonalak a SeMet kijellt kzprtkre (79,9 g g-1, mint Se) utalnak.

4.4.10. A brazil di alap, Se-mdosulatanalitikai referenciaanyag ksztse sorn elrt j


tudomnyos eredmnyek
Megllaptottam, hogy a kiemelked (71 m/m %-os) zsrtartalm brazil dit szerves
oldszerrel vgrehajtott, folyadk-szilrd extrakci segtsgvel zsrtalantani lehet gy, hogy a
minta szelntartalma szmottev mrtkben nem cskken.
Elksztettem a Se-mdosulatanalitika els laboratriumi referenciaanyagt, amelyhez a
zsrtalantott brazil di ksztmny megfelel alapul szolglt, mivel (a) minsgi s mennyisgi
115

Dernovics Mihly

meghatrozsra egyarnt alkalmas mrtkben tartalmaz SeMet-t, amely napjaink egyik


leginkbb tanulmnyozott szelnmdosulata, teht a referenciaanyag ksztse vals ignyre
pl; (b) knnyen, kell finomsgra rlhet s jl homogenizlhat, amelyet az sszes Se s
SeMet homogenitsvizsglata igazol; (c) a SeMet-tartalom kielgt mrtkben stabil maradt
mind a -besugrzs, mind pedig a klnbz hmrsklet trols sorn; (d) a Semdosulatanalitikban legtbbszr alkalmazott, egylpses enzimes kezelssel az elksztett
referenciaanyag kzel 100%-os hatsfokkal trhat fel, nagy megbzhatsg mintaelksztst
tve lehetv.
4.4.11. A brazil dival vgzett ksrletek lezrsa s utsz
A bemutatott eredmnyek alapjn a brazil dibl kszlt referenciaanyag alkalmasnak
bizonyult arra, hogy nagyobb lptkben, meghosszabbtott trolsi-stabilitsi vizsglatok utn
SeMet mdosulatanalitikai LRM, vagy akr CRM kszlhessen belle. A di korbbrl ismert
biokmiai s tpllkozs-lettani tulajdonsgai htterben sejtett nagy SeMet-tartalom a
kzvetlenl, HPLC segtsgvel vgzett mdosulatazonostst kzvetett bizonytkokkal egszti
ki, gy a tves azonosts lehetsge gyakorlatilag kizrt.
A brazil dibl ksztett referenciaanyag amellett, hogy a szakirodalom alapjn valsznleg a vilg els szeln-mdosulatanalitikai LRM-je mg szmos jrulkos elnnyel is br:
1., A benne minsgileg s mennyisgileg meghatrozott Se-mdosulat standard vegylete
brki szmra knnyen elrhet a vegyszergyrtk knlatban, s azonostsa a hagyomnyos
kromatogrfiai elvek hasznlatval, viszonylag olcs mszerezettsggel megoldhat; nincs teht
szksg ESI-MS vagy MALDI-TOFMS kszlkekre.
2., Br haznkban a brazil di csonthjas llapotban mg nem kaphat, valsznleg
hamarosan megjelenik ilyen formban is a boltok polcain. Mindez azrt lnyeges, mert a
klnbz eredet dik keversvel a kialakul referenciaanyag sszes Se- s SeMet-tartalma
bizonyos korltok kzt, de szabadon bellthat lesz, az 1-2 g g-1 rtktl a 100-120 g g-1
gyakorlati fels hatrig. Ezltal ez lehet az els olyan, nem mestersges krlmnyek kztt
ellltott, mdosulatanalitikai referenciaanyag, melynek egyszeren, az alapanyagok
keversvel, akr hrom nagysgrenden keresztl elre lehet szablyozni a vizsgland
mdosulat kvnt koncentrcijt gy, hogy kzben a mtrix sszettele vltozatlan marad.
rdemes nhny szt ejteni munknk nemzetkzi helyzetrl s visszhangjrl is. A 2001
teln indult ksrletek nhny hnap eltrssel ugyan, de egymstl fggetlenl, szinte fej-fej
mellett haladtak Caruso professzor (Cincinnati, USA) csoportjnak munkjval. A rszben eltr
mintaelksztsi elvekbl fakad eredmnyek s a teljesen ms kategrij mszerezettsg
miatt az amerikai csoport a hangslyt az ESI-MS azonostsra s a kinyersi-azonostsi hatsfok
nvelsre helyezte, s kzlemnyeikben is ezeket a terleteket emeltk ki
[KANNAMKUMARATH 2002, VONDERHEIDE 2002, WROBEL 2003]. A mi esetnkben a
referenciaanyag kialaktsa szerepelt az els helyen, s munkkat a 2003. vi European Winter
Conference on Plasma Spectrochemistry konferenciadjas posztere [BOD 2003a] s kt
kzlemny [STEFNKA 2003b, BOD 2003b] dicsri.
116

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

5. J TUDOMNYOS EREDMNYEK
PhD rtekezsem j tudomnyos eredmnyeit ngy f csoportba sorolom, melyek egyttal a
ngy vizsglt tmakr sszefoglalsaknt is rtelmezhetek.
1., Az arzntartalm alga- s halmintk enzimes mintaelksztsnek kritikai vizsglata sorn
elrt j tudomnyos eredmnyek
Arznnel dstott algaminta vizsglatval igazoltam, hogy sejtfalbont (drizelz) enzimes
kezelssel szignifikns mrtkben nvelni lehet mind az sszes arzn, mind pedig az Asmdosulatok kinyerst.
Tbbvltozs statisztikai mdszer (RSM) segtsgvel igazoltam, hogy termszetes (nem
dstott) As-tartalm halminta mdosulatanalitikai mintaelksztse sorn fehrjebont
enzimmel (tripszinnel) vgzett kezelssel nem lehetett szignifiknsan nagyobb As-kinyersi
hatsfokot elrni az enzimet nem alkalmaz mdszerek hasznlathoz kpest.
2., A szelnnel dstott lesztmintk vizsglata sorn elrt j tudomnyos eredmnyek
Megllaptottam, hogy az zemi fermentcival ellltott, tbbek kztt szrtssal
stabilizlt s a szemcsemretet tekintve az ltalnos LRM kvetelmnyeknek megfelel Sedstott leszt nem szubsztrtspecifikus fehrjebont enzimmel vgrehajtott mdosulatanalitikai
mintaelksztsnl a sejtfal- ill. lipidbont enzimek hasznlata szignifiknsan nem nvelte a
Se-kinyersi hatsfokot.
Se-dstott lesztn vgzett, egylpses enzimes mdosulatanalitikai mintaelkszts
segtsgvel sszehasonltottam a szakirodalomban legtbbszr jegyzett fehrjebont
enzimkeverket (XIV-es tpus protez; Sigma) az ugyanazon fonalas baktrium ltal ellltott,
eltr tulajdonsgokkal br pronz enzimmel (Merck). Az elvgzett statisztikai elemzs alapjn
megllaptottam, hogy a kt enzimmel elrhet kinyersi hatsfok szignifikns mrtkben
klnbzik: a Merck-fle enzim hasznlatval nagyobb mennyisg szeln extrahlhat.
3/a., j tudomnyos eredmnyek a szelnsval kiegsztett komposzton termesztett, Se-dstott
gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan
Elsknt alaktottam ki egy olyan szekvencilis enzimes mdosulatanalitikai
mintaelksztsi eljrst, amelynek segtsgvel a szelnsval kiegsztett komposzton
termesztett gomba szelntartalma 75%-ban kinyerhetv vlt.
Adalkolssal s az azt kvet szekvencilis enzimes mdosulatanalitikai
mintaelksztssel igazoltam, hogy a Se-mdosulatok egy rsze nem az elmletileg vrhat
mdon (jelen esetben vizes extrakcival) nyerhet vissza a mintbl: a fehrjemtrix bontsa
szksges az adalkolt mennyisg oldatba vitelhez. Adalkolsi eljrs segtsgvel kzvetett
mdon bizonytottam, hogy a mdosulatanalitikai mrsek sorn azonostott Se-mdosulatok
kzl legalbb az egyik, a Se(IV) mennyisgi meghatrozsa valdi rtkre vezetett.
117

Dernovics Mihly

3/b., j tudomnyos eredmnyek a Se-tartalm lesztvel kiegsztett komposzton termesztett,


Se-dstott gomba mdosulatanalitikai vizsglathoz kapcsoldan
Megllaptottam, hogy a tbblpses, sejtfalbont enzimes kezelst is tartalmaz
mintaelksztsi mdszerrel szignifiknsan nagyobb kinyersi hatsfokot lehet elrni a csupn
fehrjebont enzimre pt vagy pufferelt kzeg extrakcikhoz kpest, mg abban az esetben is,
amikor a sejtfalbont enzimkeverk fehrjebont aktivitst szelektven gtoltam. Kt klnbz
inhibitor vegylet alkalmazsval, statisztikai kirtkels segtsgvel igazoltam, a sejtfalbonts
sorn valban lejtszdott fehrjebonts; mindez azt jelenti, hogy a fehrjebonts gtlsval
megklnbztethetv tettem a sejtfalbonts szelnkinyersre gyakorolt hatst.
A lysing enzim hasznlatval ms mdszerekkel nem kinyerhet Se-mdosulatot tettem
hozzfrhetv a fehrjebont kezels szmra. Ez a mdosulat a HPLC-vizsglatok
segtsgvel (retencis id alapjn) vgrehajtott azonosts sorn SeCys2-nek bizonyult.
4., A brazil di alap, Se-mdosulatanalitikai referenciaanyag ksztse sorn elrt j
tudomnyos eredmnyek
Megllaptottam, hogy a kiemelked (71 m/m %-os) zsrtartalm brazil dit szerves
oldszerrel vgrehajtott, folyadk-szilrd extrakci segtsgvel zsrtalantani lehet gy, hogy a
minta szelntartalma szmottev mrtkben nem cskken.
Elksztettem a Se-mdosulatanalitika els laboratriumi referenciaanyagt, amelyhez a
zsrtalantott brazil di ksztmny megfelel alapul szolglt, mivel (a) minsgi s mennyisgi
meghatrozsra egyarnt alkalmas mrtkben tartalmaz SeMet-t, amely napjaink egyik
leginkbb tanulmnyozott szelnmdosulata, teht a referenciaanyag ksztse vals ignyre
pl; (b) knnyen, kell finomsgra rlhet s jl homogenizlhat, amelyet az sszes Se s
SeMet homogenitsvizsglata igazol; (c) a SeMet-tartalom kielgt mrtkben stabil maradt
mind a -besugrzs, mind pedig a klnbz hmrsklet trols sorn; (d) a Semdosulatanalitikban legtbbszr alkalmazott, egylpses enzimes kezelssel az elksztett
referenciaanyag kzel 100%-os hatsfokkal trhat fel, nagy megbzhatsg mintaelksztst
tve lehetv.

118

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

SSZEFOGLALS
Clkitzseimben megfogalmazott tevkenysgi terletem alapveten kt vizsglati
irnyvonalban lttt testet: egyrszt a Se- s As-mdosulatanalitika enzimes
mintaelksztsnek kiterjeszthetsgt, fejleszthetsgt helyeztem a kzppontba, valdi
mintkkal trtn ksrletek rvn; msrszt megvizsgltam annak a lehetsgt, hogy a
rendelkezsre ll laboratriumi krlmnyek kztt ltrehozhat-e Se-mdosulatanalitikai
referenciaanyag (LRM).
Az els tmakr szmos, klnbz tpus mestersgesen ill. termszetes mdon
szelnnel vagy arznnel dstott minta elemzsn vezetett keresztl. Alga s tengeri hal (arzn)
ill. leszt s csiperkegomba (szeln) vizsglata sorn enzimes mintaelksztsi mdszerek
alkalmassgt vetettem ssze, s egyedi ill. szekvencilis eljrsokat dolgoztam ki, hogy rszben
statisztikai, msrszt mdosulatanalitikai mrsek alapjain nyugv kirtkels segtsgvel
eldnthessem, jr-e valamilyen elnnyel ezen eljrsok hasznlata az adott terleten elterjedtnek
szmt alapmdszerekhez kpest. Eredmnyeim azt mutattk, hogy nvnyi eredet mintk
esetn az As-mdosulatanalitikai mintaelkszts kialaktsa sorn rdemes figyelembe venni a
sejtfalbont enzimek hasznlatt, mivel szignifikns mrtkben javthatjk a kinyersi
hatsfokot. Ezzel ellenttben az arzntartalm tengeri halminta elemzse annak a tnynek a
megllaptshoz vezetett, hogy az enzimes mintaelkszts alkalmazsa nem jr elnnyel a
jval egyszerbb, csupn pufferes kzeget ignyl hagyomnyos mdszerhez kpest.
A szelntartalm mintk vizsglata sorn tapasztaltak tgabb teret nyjtanak az enzimes
mintaelkszts szmra. Az ltalam kidolgozott szekvencilis eljrs, mely sejtfalbont s /
vagy fehrjebont enzimek egymst kvet hasznlatra pt, bizonyos mintatpusoknl a
mintaelkszts kinyersi hatsfokt nvelte meg, mg ms esetekben a hagyomnyos
(egylpses enzimes) mdszerekhez kpest j mdosulatanalitikai informcikhoz vezetett.
A clkitzs krdseire a kvetkezkppen lehet felelni: (a) az enzimes mintaelkszts az
As-mdosulatanalitikban korltozott mrtkben, csupn bizonyos /br nem elhanyagolhat/
mintacsoportok esetben mutat fel egyrtelm elnyket; (b) Se-mdosulatanalitika terletn
azonban letkpes s fejlesztsre rdemes mdszernek tekinthet egy ilyen fejlesztsi
irnyvonalat jelent az ltalam kidolgozott, tbbfle enzim szekvencilis alkalmazsra pt
eljrs is; (c) br egyre tbb minta + mintaelkszts sszerendelst tudunk kialaktani eddigi
ismereteink alapjn, Se-mdosulatanalitikban a korbban mg nem vizsglt mintk
elemzshez mg mindig clszer ltalnos, szleskr mintaelksztsi megkzeltst
alkalmazni a hagyomnyos eljrsok helyett ugyanakkor As-mdosulatanalitika esetn ezzel
ellenttben, az egyszer s elterjedtebb (nem enzimes) mintaelksztsi mdszerek hasznlatra
rdemes hangslyt fektetni.
A clkitzs msodik tmakrnek krdsre jval egyrtelmbb vlasz adhat: igen az
ltalnos laboratriumi felszereltsggel el lehet lltani mdosulatanalitikai referenciaanyagot.
Termszetes szelntartalm (brazil di) alapanyagbl az ltalnos LRM elrsoknak megfelel,
stabil, knnyen kezelhet s elemezhet referenciaanyagot lltottam el, amely az ltalnos
minsgbiztostsi clokon tl alapul szolglhat egy ksbbi CRM kialaktshoz is.
119

Dernovics Mihly

SUMMARY
My scientific activity carried out in the frame of PhD formation was focused on two
directions: on one hand, I studied the extensibility and development of enzymatic sample
preparation in the fields of As- and Se-speciation by analysing real samples; on the other hand, I
evaluated the possibility of preparing LRMs under usual laboratory circumstances for Sespeciation analyses.
The first subject led through the analysis of several artificial or natural Se- and Asenriched samples of different origin. I compared and developed single and sequential
enzymatic sample preparation methods through the study of algae and marine fish samples (for
As) & yeast and agaric samples (for Se) on the basis of statistical and speciation evaluation in
order to assess if any of these methods possess significant advantages over the usually applied
basic techniques. According to the results of the study, when designing the speciation sample
preparation of samples of plant origin it is worth taking into consideration the use of cell wall
degrading enzymes capable to significantly increase extraction efficiency. In contradistinction to
plant samples, the analysis of marine fish arrived at a conclusion that there was no point in
replacing simple (usually buffered only) methods with the application of enzymatic ones.
My experiences on the field of selenised samples reveal greater possibilities for the use of
enzymatic sample preparation. I developed a sequential method addressing the succeeding use of
cell wall degrading and/or proteolytic enzymes, which proved to be capable either to increase
extraction efficiency or to provide additional speciation information over usual (one-step)
methods, depending on the given samples to analyse.
The questions of the relevant parts of my scientific targets presented at the beginning of this
thesis can be answered as follows: (a) the enzymatic sample preparation applied in the field of
As-speciation shows obvious advantages only in the case of special, however not neglectable,
group of samples; (b) the enzymatic sample preparation applied in the field of Se-speciation
proved to be a really viable technique worth developing, hopefully according to the method I set
up by sequentially applying several different enzymes; (c) however more and more combination
of adequate sample & sample preparation twins can be set up according to our knowledge, Sespeciation still requires an open-minded and large sample preparation approach instead of
applying usual techniques, especially when facing samples never analysed before; on the other
hand, it seems there is no universal need to change the well-established sample preparation
techniques of As-speciation for enzymatic methods possibly except for plant samples.
It is much easier to answer the question set in the second part of the introduction: yes, it is
usual labware is just enough to produce LRMs for speciation analytical purposes. Natural Seenriched raw material (from Brazil nuts) can serve as a base for the production of a reference
material easy to handle and to analyse along with fulfilling the common requirements of RMs.
This candidate LRM may become a future CRM and may be integrated into the regular quality
control routine procedures of Se-speciation analyses.

120

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

1. MELLKLET (IRODALOMJEGYZK)
ABOU-SHAKRA F. R., RAYMAN M. P., WARD N. I., HOTTON V., BASTIAN G. (1997): Enzymatic digestion
for the determination of trace elements in blood serum by inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of
Analytical Atomic Spectrometry, 12, 429433. p.
ACKLEY K. L., BHYMER C., SUTTON K. L., CARUSO J. A. (1999): Speciation of arsenic in fish tissue using
microwave-assisted extraction followed by HPLC-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 845
850. p.
ALBERTI J., RUBIO R., RAURET G. (1995): Extraction method for arsenic speciation in marine organisms.
Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 351 (4-5) 420425. p.
ALSING PEDERSEN G., LARSEN E. H. (1997): Speciation of four selenium compounds using high performance
liquid chromatography with on-line detection by inductively coupled plasma mass spectrometry or flame atomic
absorption spectrometry. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 358, 591598. p.
BEAUCHEMIN D., BEDNAS M. E., BERMAN S. S., MCLAREN J. W., SIU K. W. M., STURGEON R. E.
(1988): Identification and quantitation of arsenic species in a dogfish muscle reference material for trace-elements.
Analytical Chemistry, 60 (20) 22092212. p.
BECKER-ROSS H., FLOREK S., HEITMANN U. (2000): Observation, identification and correction of structured
molecular background by means of continuum source AAS-determination of selenium and arsenic in human urine.
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15, 137141. p.
BEHNE D., HAMMEL C., PFEIFER H., RTHLEIN D., GESSNER H., KYRIAKOPOULOS A. (1998):
Speciation of selenium in the mammalian organism. The Analyst, 123, 871873. p.
BERMEJO-BARRERA P., FERNNDEZ-NOCELO S., MOREDA-PIEIRO A., BERMEJO-BARRERA A.
(1999): Usefulness of enzymatic hydrolysis procedures based on the use of pronase E as sample pre-treatment for
multi-element determination in biological materials. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 18931900. p.
BESSER J. M., CANFIELD T. J., LA POINT T. W. (1993): Bioaccumulation of organic and inorganic selenium in
a laboratory food chain. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 5772. p.
BHYMER C., CARUSO J. A. (2000): Evaluation of yeast-based selenium food supplements using highperformance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of Analytical
Atomic Spectrometry, 15, 15311539. p.
BIRD S. M., UDEN P. C., TYSON J. F., BLOCK E., DENOYER E. (1997): Speciation of selenoamino acids and
organoselenium compounds in selenium-enriched yeast using high-performance liquid chromatographyinductively
coupled plasma mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 785788. p.
BLOCK E., BIRRINGER M., JIANG W., NAKAHODO T., THOMPSON H. J., TOSCANO P. J., UZAR H.,
ZHANG X., ZHU Z. (2001): Allium chemistry: synthesis, natural occurrence, biological activity, and chemistry of
Se-alk(en)ylselenocysteines and their g-glutamyl derivatives and oxidation products. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 49, 458470. p.
BOD E. T., DERNOVICS M., STEFNKA Z., FODOR P. (2003a): Preparation of a laboratory reference material
(LRM) for selenium speciation. Konferenciadjas poszterelads a 2003. vi European Winter Conference on
Plasma Spectrochemistry konferencin, Garmisch-Partenkirchen, Nmetorszg, 2003.01.1217.
BOD E. T., STEFNKA Z., IPOLYI I., SRS C., DERNOVICS M., FODOR P. (2003b): Preparation,
homogeneity and stability studies of a candidate LRM for Se speciation. Analytical and Bioanalytical Chemistry, (in
press)
BDOG I., POLYK K., HLAVAY J. (1997): Determination of heavy metals in lake and river sediments by
selective leaching. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 66, 7994. p.
BOWEN H. J. M. (1966): A standard biological material for elementary analysis. 17. p. In: SHALLIS P. W.
(Szerk.): Proceedings of the SAC Conference, Nottingham 1965. Cambridge: Heffers.
BRZSNYI M., BERECZKY A., RUDNAI P., CSANDY M., HORVTH A. (1992): Epidemiologic studies on
human-subjects exposed to arsenic in drinking-water in southeast Hungary. Archives of Toxicology, 66 (1) 7778. p.
BRAMAN R. S., FOREBACK C. C. (1973): Methylated forms of arsenic in the environment. Science, 182 (118)
12471249. p.
BRANCH S., EBDON L., ONEILL P. (1994): Determination of arsenic species in fish by directly coupled highperformance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic
Spectrometry, 9, 3337. p.
BRANDHUBER P., AMY G. (1998): Alternative methods for membrane filtration of arsenic from drinking water.
Desalination, 117, 110. p.
BROOKE P. J., EVANS W. H. (1981): Determination of total inorganic arsenic in fish, shellfish and fish products.
The Analyst, 106 (1262) 514520. p.
CALOMME M. R., VAN DEN BRANDEN K., VANDEN BERGHE D. A. (1995a): Selenium and Lactobacillus
species. Journal of Applied Bacteriology, 79, 331340. p.
CALOMME M., HU J., VAN DEN BRANDEN K., VANDEN BERGHE D. A. (1995b): Seleno-lactobacillus an
organic selenium source. Biological Trace Element Research, 47, 379383. p.

121

Dernovics Mihly

CAO T. H., COONEY R. A., WOZNICHAK M. M., MAY S. W., BROWNER R. F. (2001): Speciation and
identification of organoselenium metabolites in human urine using inductively coupled plasma mass spectrometry
and tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry, 73, 28982902. p.
CARUSO J. A., HEITKEMPER D. T., BHYMER C. (2001): An evaluation of extraction techniques for arsenic
species from freeze-dried apple samples. The Analyst, 126, 136140. p.
CASES J., WYSOCKA I. A., CAPORICCIO B., JOUY N., BESANON P., SZPUNAR J., ROUANET J. (2002):
Assessment of selenium bioavailability from high-selenium spirulina subfractions in selenium-deficient rats. Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 50, 38673873. p.
CASIOT C., SZPUNAR J., OBISKI R., POTIN-GAUTIER M. (1999): Sample preparation and HPLC separation
approaches to speciation analysis of selenium in yeast by ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14,
645650. p.
CAVALLI S., CARDELLICCHIO N. (1995): Direct determination of seleno-amino acids in biological tissues by
anion-exchange separation and electrochemical detection. Journal of Chromatography A, 706, 429436. p.
CHANG J. C., GUTENMANN W. H., REID C. M., LISK D. J. (1995): Selenium content of Brazil nuts from two
geographic locations in Brazil. Chemosphere, 30 (4) 801802. p.
CHANSLER M. W., MUTANEN M., MORRIS V. C., LEVANDER O. A. (1986): Nutritional bioavailability to rats
of selenium in Brazil nuts and mushrooms. Nutrition Research, 6 (12) 14191428. p.
CHEN C., ZHAO J., ZHANG P., CHAI Z. (2002): Speciation and subcellular location of Se-containing proteins in
human liver studied by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and hydride generation-atomic
fluorescence spectrometric detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372, 426430. p.
CHEN X. S., YANG G. Q., CHEN J. S., CHEN X. C., WEN Z. M., GE K. Y. (1980): Studies on the relations of
selenium and Keshan disease. Biological Trace Element Research, 2 (2) 91107. p.
CLARK L. C., COMBS G. F., TURNBULL B. W., SLATE E. H., CHALKER D. K., CHOW J., DAVIS L. S.,
GLOVER R. A., GRAHAM G. F., GROSS E. G., KRONGRAD A., LESHER J. L., PARK H. K., SANDERS B. B.,
SMITH C. L., TAYLOR J. R. (1996): Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with
carcinoma of the skin - a randomized controlled trial. JAMA-Journal of the American Medical Association, 276 (24)
19571963. p.
CORNELIS R., CMARA C., EBDON L., PITTS L., SPERLING M., MORABITO R., DONARD O. F. X.,
CREWS H., LARSEN E. H., NEIDHART B., ARIESE F., ROSENBERG E., BERROUIGUET O., MORRISON G.
M., CORDIER G., ADAMS F., DERO B., MARSHALL J., STOJANIK B., EKVALL A., QUEVAUVILLER P.
(2000): The EU network on trace element speciation in full swing. Trends in Analytical Chemistry, 19 (2+3) 210
214. p.
CORR J. J., LARSEN E. H. (1996): Arsenic speciation by liquid chromatography coupled with ionspray tandem
mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 11, 12151224. p.
CREWS H. M., CLARKE P. A., LEWIS D. J., OWEN L. M., STRUTT P. R., IZQUIERDO A. (1996):
Investigation of selenium speciation in in vitro gastrointestinal extracts of cooked cod by high-performance liquid
chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry and electrospray mass spectrometry. Journal of
Analytical Atomic Spectrometry, 11, 11771182. p.
CSABAI Z. (2003): Mintaelksztsi mdszerek fejlesztse szeln specicihoz. Diplomadolgozat. SZIE-K
Alkalmazott Kmia Tanszk.
DAVEY G. P., RICHARDSON B. C. (1981): Purification and some properties of diplococcin from Streptococcus
cremoris 346. Applied and Environmental Microbiology, 41 (1) 8489. p.
DEAKER M., MAHER W. (1999): Determination of arsenic in arsenic compounds and marine biological tissues
using low volume microwave digestion and electrothermal atomic absorption spectrometry. Journal of Analytical
Atomic Spectrometry, 14, 11931207. p.
DE BRTTER V. E. N., RECKNAGEL S., GAWLIK D. (1995): Speciation of Se, Fe and Zn in human milk whey:
the use of instrumental neutron activation analysis (INAA) to corroborate element profiles measured with
inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES). Fresenius' Journal of Analytical Chemistry,
353, 137142. p.
DE LA CALLE-GUNTIAS M. B., BRUNORI C., SCERBO R., CHIAVARINI S., QUEVAUVILLER P.,
ADAMS F., MORABITO R. (1997): Determination of selenomethionine in wheat samples: comparison of gas
chromatography-microwave-induced plasma atomic emission spectrometry, gas chromatography-flame photometric
detection and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 10411046. p.
DEMIRCI A., POMETTO III A. L. (1999a): Production of organically bound selenium yeast by continuous
fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 24912495. p.
DEMIRCI A., POMETTO III A. L., COX D. J. (1999b): Enhanced organically bound selenium yeast production by
fed-batch fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 24962500. p.
DERNOVICS M., STEFNKA Z., FODOR P. (2002): Improving selenium extraction by sequential enzymatic
processes for Se-speciation of selenium-enriched Agaricus bisporus. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372,
473480. p.
DILIO S., ALESSANDRELLI M., CRESTI R., FORTE G., CAROLI S. (2002): Arsenic content of various types
of rice as determined by plasmabased techniques. Microchemical Journal, 73, 195201. p.
122

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

DULIVO A. (1997): Determination of selenium and tellurium in environmental samples. The Analyst, 122, 117R
144R p.
EDMONDS J. S., FRANCESCONI K. A., CANNON J. R., RASTON C. L., SKELTON B. W., WHITE A. H.
(1977): Isolation, crystal-structure and synthesis of arsenobetaine, arsenical constituent of western rock lobster
Panulirus-longipes-cygnus george. Tetrahedron Letters, 18, 15431546. p.
EDWARDS M., PATEL S., MCNEILL L., CHEN H. W., FREY M., EATON A. D., ANTWEILER R. C.,
TAYLOR H. E. (1998): Considerations in As analysis and speciation. Journal of American Water Works
Association, 90, 103113. p.
(2003): Az egszsggyi, szocilis s csaldgyi miniszter 9/2003. (III. 13.) ESZCSM rendelete az lelmiszerek
vegyi szennyezettsgnek megengedhet mrtkrl szl 17/1999. (VI. 16) EM rendelet mdostsrl. Magyar
Kzlny, 25, 19601967. p.
EL MOLL A., HEIMBURGER R., LAGARDE F., LEROY M. J. F., MAIER E. (1996): Arsenic speciation in
marine organisms: from the analytical methodology to the constitution of reference materials. Fresenius' Journal of
Analytical Chemistry, 354, 550556. p.
ELWAER N., BELZILE N. (1995): Microwave dissolution of lake sediments and mine tailings and determination of
arsenic and selenium by atomic absorption spectrometry. International Journal of Environmental Analytical
Chemistry, 61, 189194. p.
EMTEBORG H., BORDIN G., RODRIGUEZ A. R. (1998): Speciation of organic and inorganic selenium in a
biological certified reference material based on microbore ion-exchange chromatography coupled to inductively
coupled plasma atomic emission spectrometry via a direct injection nebulizer or coupled to electrothermal atomic
absorption spectrometry. The Analyst, 123, 245253. p.
EURACHEM/CITAC GUIDE (2000): Quantifying uncertainty in analytical measurement. II. kiads. Szerk.:
ELLISON S. L. R., ROSSLEIN M., WILLIAMS A. http://www.eurachem.ul.pt/index.htm.
FAIRWEATHER-TAIT S. J. (1999): The importance of trace element speciation in nutritional sciences. Fresenius'
Journal of Analytical Chemistry, 363, 536540. p.
FAN T. W. M., LANE A. N., MARTENS D., HIGASHI R. M. (1998): Synthesis and structure characterization of
selenium metabolites. The Analyst, 123, 875884. p.
FAN T. W. M., TEH S. J., HINTON D. E., HIGASHI R. M. (2002): Selenium biotransformations into
proteinaceous forms by foodweb organisms of selenium-laden drainage waters in California. Aquatic Toxicology,
57, 6584. p.
FELDMANN J., LAI V. W. M., CULLEN W. R., MA M. S., LU X. F., LE X. C. (1999): Sample preparation and
storage can change arsenic speciation in human urine. Clinical Chemistry, 45 (11) 19881997. p.
FRANCESCONI K. A., KHOKIATTIWONG S., GOESSLER W., PEDERSEN S. N., PAVKOV M. (2000): A new
arsenobetaine from marine organisms identified by liquid chromatographymass spectrometry. Chemical
Communications, 12, 10831084. p.
GALLAGHER P. A., SHOEMAKER J. A., WEI X., BROCKHOFF-SCHWEGEL C. A., CREED J. T. (2001):
Extraction and detection of arsenicals in seaweed via accelerated solvent extraction with ion chromatographic
separation and ICP-MS detection. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 369, 7180. p.
GANONG W. F. (1990): Az orvosi lettan alapjai. Budapest: Medicina. 488 p.
GILON N., ASTRUC A., ASTRUC M., POTIN-GAUTIER M. (1995): Selenoamino acid speciation using HPLCETAAS following an enzymatic-hydrolysis of selenoprotein. Applied Organometallic Chemistry, 9 (7) 623628. p.
GILON N., POTIN-GAUTIER M., ASTRUC M. (1996): Optimization of the determination of inorganic and
organic selenium species using high-performance liquid chromatography-electrothermal atomic absorption
spectrometry. Journal of Chromatography A, 750, 327334. p.
GOESSLER W., LINTSCHINGER J., SZKOV J., MADER P., KOPECK J., DOUCHA J., IRGOLIC K. J.
(1997): Chlorella sp. and arsenic compounds: an attempt to prepare an algal reference material for arsenic
compounds. Applied Organometallic Chemistry, 11, 5766. p.
GMEZ M. M., GASPARIC T., PALACIOS M. A., CMARA C. (1998): Determination of five selenium
compounds in urine by liquid chromatography with focused microwave assisted digestion and hydride generationatomic absorption spectrometric detection. Analytica Chimica Acta, 374, 241251. p.
GMEZ-ARIZA J. L., CARO DE LA TORRE M. A., GIRLDEZ I., SNCHEZ-RODAS D., VELASCO A.,
MORALES E. (2002): Pretreatment procedure for selenium speciation in shellfish using high-performance liquid
chromatography-microwave-assisted digestion-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry. Applied
Organometallic Chemistry, 16, 265270. p.
GONG Z., LU X., CULLEN W. R., LE X. C. (2001): Unstable trivalent arsenic metabolites, monomethylarsonous
acid and dimethylarsinous acid. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 14091413. p.
GONG Z., LU X., MA M., WATT C., LE X. C. (2002): Arsenic speciation analysis. Talanta, 58, 7796. p.
GRAEME K. A., POLLACK C. V. (1998): Heavy metal toxicity, part I: arsenic and mercury. The Journal of
Emergency Medicine, 16 (1) 4556. p.
HAGMAR L., PERSSON-MOSCHOS M., KESSON B., SCHTZ A. (1998): Plasma levels of selenium,
selenoprotein P and glutathione peroxidase and their correlation to fish intake and serum levels of thyrotropin and
thyroid hormones: a study on Latvian fish consumers. European Journal of Clinical Nutrition, 52, 796800. p.
123

Dernovics Mihly

HALL G. E. M., PELCHAT J. C., GAUTHIER G. (1999): Stability of inorganic arsenic(III) and arsenic(V) in water
samples. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 205213. p.
HANAOKA K., GOESSLER W., OHNO H., IRGOLIC K. J., KAISE T. (2001): Formation of toxic arsenical in
roasted muscles of marine animals. Applied Organometallic Chemistry, 15 (1) 6166. p.
HEITKEMPER D. T., VELA N. P., STEWART K. R., WESTPHAL C. S. (2001): Determination of total and
speciated arsenic in rice by ion chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of
Analytical Atomic Spectrometry, 16, 299306. p.
HELGESEN H., LARSEN E. H. (1998): Bioavailability and speciation of arsenic in carrots grown in contaminated
soil. The Analyst, 123, 791796. p.
HUANG W., KESSON B., SVENSSON B. G., SCHTZ A., BURK R. F., SKERFVING S. (1995): Selenoprotein
P and glutathione peroxidase (EC 1.11.1.9) in plasma as indices of selenium status in relation to the intake of fish.
British Journal of Nutrition, 73, 455461. p.
HUBER R. E., CRIDDLE R. S. (1967): Comparison of the chemical properties of selenocysteine and selenocystine
with their sulfur analogs. Archives of Biochemistry and Biophysics, 122 (1) 164173. p.
IP C., LISK D. J. (1994): Characterization of tissue selenium profiles and anticarcinogenic responses in rats fed
natural sources of selenium-rich products. Carcinogenesis, 15 (4) 573576. p.
IP C., BIRRINGER M., BLOCK E., KOTREBAI M., TYSON J. F., UDEN P. C., LISK D. J. (2000): Chemical
speciation influences comparative activity of selenium-enriched garlic and yeast in mammary cancer prevention.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 20622070. p.
IPOLYI I., STEFNKA Z., FODOR P. (2001a): Speciation of Se(IV) and the selenoamino acids by highperformance liquid chromatographydirect hydride generationatomic fluorescence spectrometry. Analytica
Chimica Acta, 435, 367375. p.
IPOLYI I., CORNS W., STOCKWELL P., FODOR P. (2001b): Speciation of inorganic selenium and selenoamino
acids by an HPLC-UV-HG-AFS system. Journal of Automated Methods & Management in Chemistry, 23 (6) 167
172. p.
IPOLYI I. (2003): Gyakorlati megoldsok a specicis analitika minsgnek biztostshoz. PhD rtekezs. Szent
Istvn Egyetem, Alkalmazott Kmia Tanszk.
ISO/IEC GUIDE 30 (1992): Terms and definitions used in connection with reference materials.
ITOH K., CHIKUMA M., TANAKA H. (1988): Determination of selenium in sediments by hydride generation
atomic-absorption spectrometry - elimination of interferences. Fresenius Zeitschrift fr analytische Chemie, 330 (7)
600604. p.
JAKUBOWSKI N., STUEWER D., KLOCKOW D., THOMAS C., EMONS H. (2001): Speciation of organic
selenium compounds using reversed-phase liquid chromatography and inductively coupled plasma mass
spectrometry. Part III. Application of a sector field instrument with low and high mass resolution for selenium
speciation in herring gull eggs. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 135139. p.
JKAI ZS., HEGCZKI J., FODOR P. (1998): Stability and optimization of extraction of four arsenic species.
Microchemical Journal, 59, 117124. p.
KANNAMKUMARATH S. S., WROBEL K., WROBEL K., VONDERHEIDE A., CARUSO J. A. (2002): HPLC
ICPMS determination of selenium distribution and speciation in different types of nut. Analytical and
Bioanalytical Chemistry, 373, 454460. p.
KIRBY J., MAHER W. (2002): Measurement of water-soluble arsenic species in freeze-dried marine animal tissues
by microwave-assisted extraction and HPLC-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 17, 838843. p.
KNUDSEN M. (1925): Lemploi de leau normale dans locanographie. 46. p. In: CONSEIL PERMANENT
INTERNATIONAL POUR LEXPLORATION DE LA MER: Publications de Circonstance N 87. Koppenhga:
Andr. Fred. Hst & Fils.
KOBAYASHI Y., OGRA Y., SUZUKI K. T. (2001): Speciation and metabolism of selenium injected with (82)Seenriched selenite and selenate in rats. Journal of Chromatography B, 760, 7381. p.
KOBAYASHI Y., OGRA Y., ISHIWATA K., TAKAYAMA H., AIMI N., SUZUKI K. T. (2002): Selenosugars are
key and urinary metabolites for selenium excretion within the required to low-toxic range. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 99 (25) 1593215936. p.
KORHAMMER S., HERZIG R., SCHRAMEL P., KUMPULAINEN J., MARKERT B., MUNTAU H.,
QUEVAUVILLER P. (2000): The preparation of a cabbage reference material for environmental monitoring and
food analysis. Accreditation and Quality Assurance, 5, 238242. p.
KOTREBAI M., BIRRINGER M., TYSON J. F., BLOCK E., UDEN P. C. (1999a): Identification of the principal
selenium compounds in selenium-enriched natural sample extracts by ion-pair liquid chromatography with
inductively coupled plasma- and electrospray ionization-mass spectrometric detection. Analytical Communications,
36, 249252. p.
KOTREBAI M., BIRD S. M., TYSON J. F., BLOCK E., UDEN P. C. (1999b): Characterization of selenium species
in biological extracts by enhanced ion-pair liquid chromatography with inductively coupled plasma-mass
spectrometry and by referenced electrospray ionization-mass spectrometry. Spectrochimica Acta Part B, 54, 1573
1591. p.
124

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

KOTREBAI M., BIRRINGER M., TYSON J. F., BLOCK E., UDEN P. C. (2000): Selenium speciation in enriched
and natural samples by HPLC-ICP-MS and HPLC-ESI-MS with perfluorinated carboxylic acid ion-pairing agents.
The Analyst, 125, 7178. p.
KRAMER K. J. M., KRAMER G. N., MUNTAU H. (2003): Practical manual for the production of laboratory
reference materials. Bergen: Mermayde Publications. 2. kiads: 3638. p. Hollandia.
KROLL J., RAWEL H., KROCK R. (1998): Microwave digestion of proteins. Zeitschrift fr Lebensmitteluntersuchung und -forschung, 207 (3) 202206. p.
KRYUKOV G. V., KRYUKOV V. M., GLADYSHEV V. N. (1999): New mammalian selenocysteine-containing
proteins identified with an algorithm that searches for selenocysteine insertion sequence elements. Journal of
Biological Chemistry, 274 (48) 3388833897. p.
KUEHNELT D., GOESSLER W., IRGOLIC K. J. (1997): Arsenic compounds in terrestrial organisms I: Collybia
maculata, Collybia butyracea and Amanita muscaria from arsenic smelter sites in Austria. Applied Organometallic
Chemistry, 11, 289296. p.
LAGARDE F., AMRAN M. B., LEROY M. J. F., DEMESMAY C., OLL M., LAMOTTE A., MUNTAU H.,
MICHEL P., THOMAS P., CAROLI S., LARSEN E. H., BONNER P., RAURET G., FOULKES M., HOWARD
A., GRIEPINK B., MAIER E. A. (1999): Certification of total arsenic, dimethylarsinic acid and arsenobetaine
contents in a tuna fish powder (BCR-CRM 627). Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 363, 1822. p.
LAMBERTY A., SCHIMMEL H., PAUWELS J. (1998): The study of the stability of reference materials by
isochronous measurements. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 360, 359361. p.
LAMBLE K. J., HILL S. J. (1996): Arsenic speciation in biological samples by on-line high performance liquid
chromatography-microwave digestion-hydride generation-atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta,
334, 261270. p.
LARSEN E. H., PRITZL G., HANSEN S. H. (1993): Speciation of eight arsenic compounds in human urine by
high-performance liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection using
antimonate for internal chromatographic standardization. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 8, 557563. p.
LARSEN E. H., PEDERSEN G. A., MCLAREN J. W. (1997): Characterization of National Food Agency shrimp
and plaice reference materials for trace elements and arsenic species by atomic and mass spectrometric techniques.
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 963968. p.
LARSEN E. H. (1998a): Method optimization and quality assurance in speciation analysis using high-performance
liquid chromatography with detection by inductively coupled plasma mass spectrometry. Spectrochimica Acta Part
B, 53, 253265. p.
LARSEN E. H., HANSEN M., GSSLER W. (1998b): Speciation and health risk considerations of arsenic in the
edible mushroom Laccaria amethystina collected from contaminated and uncontaminated locations. Applied
Organometallic Chemistry, 12, 285291. p.
LARSEN E. H., HANSEN M., FAN T., VAHL M. (2001): Speciation of selenoamino acids, selenonium ions and
inorganic selenium by ion exchange HPLC with mass spectrometric detection and its application to yeast and algae.
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 14031408. p.
LARSEN E. H. (2002): Szemlyes kzls.
LARSEN E. H., SLOTH J., HANSEN M., MOESGAARD S. (2003): Selenium speciation and isotope composition
in 77Se-enriched yeast using gradient elution HPLC separation and ICP-dynamic reaction cell-MS. Journal of
Analytical Atomic Spectrometry, 18, 310316. p.
LE X. C., LI X. F., LAI V., MA M., YALCIN S., FELDMANN J. (1998): Simultaneous speciation of selenium and
arsenic using elevated temperature liquid chromatography separation with inductively coupled plasma mass
spectrometry detection. Spectrochimica Acta Part B, 53, 899909. p.
LE X. C., MA M. S., LU X. F., CULLEN W. R., APOSHIAN H. V., ZHENG B. S. (2000): Determination of
monomethylarsonous acid, a key arsenic methylation intermediate, in human urine. Environmental Health
Perspectives, 108 (11) 10151018. p.
LEVANDER O. A., BECK M. A. (1997): Interacting nutritional and infectious etiologies of Keshan disease.
Insights from Coxsackie virus B-induced myocarditis in mice deficient in selenium or vitamin E. Biological Trace
Element Research, 56 (1) 521. p.
LINDEMANN T., PRANGE A., DANNECKER W., NEIDHART B. (2000): Stability studies of arsenic, selenium,
antimony and tellurium species in water, urine, fish and soil extracts using HPLC/ICP-MS. Fresenius' Journal of
Analytical Chemistry, 368, 214220. p.
LINSINGER T. P. J., PAUWELS J., VAN DER VEEN A. M. H., SCHIMMEL H., LAMBERTY A. (2001):
Homogeneity and stability of reference materials. Accreditation and Quality Assurance, 6, 2025. p.
LINTSCHINGER J., SCHRAMEL P., HATALAK-RAUSCHER A., WENDLER I., MICHALKE B. (1998): A new
method for the analysis of arsenic species in urine by using HPLC-ICP-MS. Fresenius' Journal of Analytical
Chemistry, 362, 313318. p.
LINTSCHINGER J., FUCHS N., MOSER J., KUEHNELT D., GOESSLER W. (2000): Selenium-enriched sprouts.
A raw material for fortified cereal-based diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 53625368. p.
OBISKI R., EDMONDS J. S., SUZUKI K. T., UDEN P. C. (2000): Species-selective determination of selenium
compounds in biological materials. Pure and Applied Chemistry, 72 (3) 447461. p.
125

Dernovics Mihly

MACKEY L. N., BECK T. A. (1982): Quantitative high-performance liquid-chromatographic determination of


sulfur amino-acids in protein hydrolysates. Journal of Chromatography, 240 (2) 455461. p.
MAHAN D. C., PARRETT N. A. (1997): Evaluating the efficacy of selenium-enriched yeast and sodium selenite on
tissue selenium retention and serum glutathione peroxidase activity in grower and finisher swine. Journal of Animal
Science, 74 (12) 29672974. p.
MAHER W., DEAKER M., JOLLEY D., KRIKOWA F., ROBERTS B. (1997): Selenium occurrence, distribution
and speciation in the cockle Anadara trapezia and the mullet Mugil cephalus. Applied Organometallic Chemistry,
11, 313326. p.
MAICHIN B., KETTISCH P., KNAPP G. (2000): Investigation of microwave assisted drying of samples and
evaporation of aqueous solutions in trace element analysis. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 366, 2629. p.
MAN E. H., BADA J. L. (1987): Dietary D-amino acids. Annual Review of Nutrition, 7, 209225. p.
MANDAL B. K., SUZUKI K. T. (2002): Arsenic round the world: a review. Talanta, 58, 201235. p.
MARTENS D. A., SUAREZ D. L. (1997): Selenium speciation of soil/sediment determined with sequential
extractions and hydride generation atomic absorption spectrophotometry. Environmental Science & Technology, 31,
133139. p.
MARTIN J. L., CUMMINS L. M. (1966): Separate elution of selenocystine and selenomethionine by ion-exchange
technique. Analytical Biochemistry, 15 (3) 530532. p.
MARTN C., GMEZ M., PALACIOS M. A., CMARA C. (2001): Evaluation of different types of hydrolysis of
proteins for selenium speciation in yeast. Poszterelads a II. International Conference on Trace Element
Speciation in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences konferencin, Mnchen, Nmetorszg,
2001.05.07-10.
MASS M. J., TENNANT A., ROOP B. C., CULLEN W. R., STYBLO M., THOMAS D. J., KLIGERMAN A. D.
(2001): Methylated trivalent arsenic species are genotoxic. Chemical Research in Toxicology, 14 (4) 355361. p.
MASSUMI A., NAJAFI N. M., BARZEGARI H. (2002): Speciation of Cr(VI)/Cr(III) in environmental waters by
fluorimetric method using central composite, full and fractional factorial design. Microchemical Journal, 72, 93
101. p.
MTRAI V. (1997): A krnyezetszennyez nehzfmek s kombinciik hatsa a lipz enzim mkdsre
tolajban. Szakdolgozat. Kertszeti s lelmiszeripari Egyetem, Kmia s Biokmia Tanszk.
MATTUSCH J., WENNRICH R., SCHMIDT A. C., REISSER W. (2000): Determination of arsenic species in
water, soils and plants. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 366, 200203. p.
MATUSIEWITZ H., STURGEON R. E., BERMAN S. S. (1989): Trace element analysis of biological material
following pressure digestion with nitric acid hydrogen peroxide and microwave heating. Journal of Analytical
Atomic Spectrometry, 4, 323327. p.
MCADAM P. A., LEVANDER O. A. (1987): Chronic toxicity and retention of dietary selenium fed to rats as Dselenomethionine or L-selenomethionine, selenite, or selenate. Nutrition Research, 7 (6) 601610. p.
MCKIERNAN J. W., CREED J. T., BROCKHOFF C. A., CARUSO J. A., LORENZANA R. M. (1999): A
comparison of automated and traditional methods for the extraction of arsenicals from fish. Journal of Analytical
Atomic Spectrometry, 14, 607613. p.
MCSHEEHY S., MARCINEK M., CHASSAIGNE H., SZPUNAR J. (2000): Identification of dimethylarsinoylriboside derivatives in seaweed by pneumatically assisted electrospray tandem mass spectrometry. Analytica
Chimica Acta, 410, 7184. p.
MCSHEEHY S., POHL P., SZPUNAR J., POTIN-GAUTIER M., OBISKI R. (2001a): Analysis for selenium
speciation in selenized yeast by two-dimensional liquid chromatography with ICP-MS and electrospray MS-MS
detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 6873. p.
MCSHEEHY S., POHL P., OBISKI R., SZPUNAR J. (2001b): Investigation of arsenic speciation in oyster test
reference material by multidimensional HPLC-ICP-MS and electrospray tandem mass spectrometry (ES-MS-MS).
The Analyst, 126, 10551062. p.
MCSHEEHY S., SZPUNAR J., MORABITO R., QUEVAUVILLER P. (2003a): The speciation of arsenic in
biological tissues and the certification of reference materials for quality control. Trends in Analytical Chemistry, 22
(4) 191209. p.
MCSHEEHY S., MESTER Z. (2003b): The speciation of natural tissues by electrospray-mass spectrometry. I:
Biosynthesized species, As and Se. Trends in Analytical Chemistry, 22 (4) 210224. p.
MELTZER H. M., BIBOW K., PAULSEN I. T., MUNDAL H. H., NORHEIM G., HOLM H. (1993): Different
bioavailability in humans of wheat and fish selenium as measured by blood platelet response to increased dietary Se.
Biological Trace Element Research, 36, 229241. p.
MICHALKE B., SCHRAMEL P. (1997): Selenium speciation in human milk with special respect to quality control.
Biological Trace Element Research, 59, 4556. p.
MICHALKE B., SCHRAMEL P. (1998): Application of capillary zone electrophoresisinductively coupled plasma
mass spectrometry and capillary isoelectric focusing inductively coupled plasma mass spectrometry for selenium
speciation. Journal of Chromatography A, 807, 7180. p.
MICHALKE B. (1999): Quality control and reference materials in speciation analysis. Fresenius' Journal of
Analytical Chemistry, 363, 439445. p.
126

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

MICHALKE B., WITTE H., SCHRAMEL P. (2001): Developments of a rugged method for selenium speciation.
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 593597. p.
MICHALKE B., WITTE H., SCHRAMEL P. (2002): Effect of different extraction procedures on the yield and
pattern of Se-species in bacterial samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372, 444447. p.
MONTES-BAYN M., BHYMER C., PONCE DE LEN C., CARUSO J. A. (2001): Resolution of seleno-amino
acid optical isomers using chiral derivatization and inductively coupled plasma mass spectrometric (ICP-MS)
detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 945950. p.
MONTES-BAYN M., YANES E. G., PONCE DE LEN C., JAYASIMHULU K., STALCUP A., SHANN J.,
CARUSO J. A. (2002a): Initial studies of selenium speciation in Brassica juncea by LC with ICPMS and ES-MS
detection: an approach for phytoremediation studies. Analytical Chemistry, 74, 107113. p.
MONTES-BAYN M., LEDUC D. L., TERRY N., CARUSO J. A. (2002b): Selenium speciation in wild-type and
genetically modified Se accumulating plants with HPLC separation and ICP-MS/ES-MS detection. Journal of
Analytical Atomic Spectrometry, 17, 872879. p.
MONTPERRUS M., BOHARI Y., BUENO M., ASTRUC A., ASTRUC M. (2002): Comparison of extraction
procedures for arsenic speciation in environmental solid reference materials by high-performance liquid
chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectroscopy. Applied Organometallic Chemistry, 16,
347354. p.
MORENO P., QUIJANO M. A., GUTIRREZ A. M., PREZ-CONDE M. C., CMARA C. (2001): Fractionation
studies of selenium compounds from oysters, and their determination by high-performance liquid chromatography
coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 16, 1044
1050. p.
MORENO P., QUIJANO M. A., GUTIRREZ A. M., PREZ-CONDE M. C., CMARA C. (2002): Stability of
total selenium and selenium species in lyophilised oysters and in their enzymatic extracts. Analytical and
Bioanalytical Chemistry, 374, 466476. p.
MSZ EN ISO/IEC 17025:2001. Magyar Szabvny: Vizsgl- s kalibrllaboratriumok felkszltsgnek
ltalnos kvetelmnyei (ISO/IEC 17025:1999).
MULSPOT (1998): Hitelestsi egyttmkds az As, Hg, Sn s Se mdosulatainak a T34 (BCR-710-jellt)
osztrigaszvetben trtn meghatrozsra. EC Contract SM&T CT98-2232
MUOZ O., VLEZ D., MONTORO R. (1999a): Optimization of the solubilization, extraction and determination
of inorganic arsenic [As(III) + As(V)] in seafood products by acid digestion, solvent extraction and hydride
generation atomic absorption spectrometry. The Analyst, 124, 601607. p.
MUOZ O., VLEZ D., CERVERA M. L., MONTORO R. (1999b): Rapid and quantitative release, separation and
determination of inorganic arsenic [As(III)+As(V)] in seafood products by microwave-assisted distillation and
hydride generation atomic absorption spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 16071613. p.
MUNTAU H. (2001): Recent developments in the field of environmental reference materials at the JRC Ispra.
Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 370, 134141. p.
MLLER S., HEIDER J., BCK A. (1997): The path of unspecific incorporation of selenium in Escherichia coli.
Archives of Microbiology, 168, 421427. p.
NAGODAWITHANA T., GUTMANIS F. (1985): Method for the production of selenium yeast. United States
Patent. Patent No. 4,530,846.
NAR-20 (2002): Alkalmazsi tmutat az MSZ EN ISO/IEC 17025 szabvnyhoz (1. kiads). Nemzeti Akkreditlsi
Rendszer. Nemzeti Akkreditl Testlet, Budapest.
NAVARRO-ALARCN M., LPEZ-MARTNEZ M. C. (2000): Essentiality of selenium in the human body:
relationship with different diseases. The Science of the Total Environment, 249, 347371. p.
NING R. Y. (2002): Arsenic removal by reverse osmosis. Desalination, 143, 237241. p.
OLSON O. E. (1986): Selenium toxicity in animals with emphasis on man. Journal of the American College of
Toxicology, 5 (1) 4570. p.
ONO B., KIJIMA K., ISHII N., KAWATO T., MATSUDA A., PASZEWSKI A., SHINODA S. (1996): Regulation
of sulphate assimilation in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 12, 11531162. p.
NNING G., BERGDAHL I. A. (1999): Fractionation of soluble selenium compounds from fish using sizeexclusion chromatography with on-line detection by inductively coupled plasma spectrometry. The Analyst, 124,
14351438. p.
NNING G. (2000): Separation of soluble selenium compounds in different fish species. Food Chemistry, 68, 133
139. p.
PARDO-MARTNEZ M., VIAS P., FISHER A., HILL S. J. (2001): Comparison of enzymatic extraction
procedures for use with directly coupled high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass
spectrometry for the speciation of arsenic in baby foods. Analytica Chimica Acta, 441, 2936. p.
PARKS A. N., GALLAGHER P. A., SCHWEGEL C. A., ACKERMAN A. H., CREED J. T. (2003): The liberation
of arsenosugars from matrix components in difficult to extract seafood samples utilizing TMAOH/acetic acid
sequentially in a two-stage extraction process. Poszterelads a 2003. vi European Winter Conference on Plasma
Spectrochemistry sorn; Garmisch-Partenkirchen, Nmetorszg, janur 12-17.
PAUWELS J., VANDECASTEELE C. (1993): Determination of the minimum sample mass of a solid CRM to be
used in chemical analysis. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 345, 121123. p.
127

Dernovics Mihly

PAUWELS J., LAMBERTY A., SCHIMMEL H. (1998): The determination of the uncertainty of reference
materials certified by laboratory intercomparison. Accreditation and Quality Assurance, 3, 5155. p.
PAUWELS J., VAN DER VEEN A. M. H., LAMBERTY A., SCHIMMEL H. (2000): Evaluation of uncertainty of
reference materials. Accreditation and Quality Assurance, 5, 9599. p.
PREZ MNDEZ S., BLANCO GONZLEZ E., SANZ MEDEL A. (2000): Chiral speciation and determination of
selenomethionine enantiomers in selenized yeast by HPLC-ICP-MS using a teicoplanin-based chiral stationary
phase. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15, 11091114. p.
PIORRECK M., POHL P. (1984): Formation of biomass, total protein, chlorophylls, lipids and fatty acids in green
and blue-green algae during one growth phase. Phytochemistry, 23 (2) 217223. p.
POLYK K., HLAVAY J. (1999): Environmental mobility of trace metals in sediments collected in the Lake
Balaton. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 363, 587593. p.
PONCE DE LEON C. A., SUTTON K. L., CARUSO J. A., UDEN P. C. (2000): Chiral speciation of selenoamino
acids and selenium enriched samples using HPLC coupled to ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry,
15, 11031107. p.
PRUNK A. (2000): Szelnnel dstott leszt ellltsa laboratriumi referenciaanyagknt trtn felhasznls
cljbl. Diplomadolgozat. SZIE-K Alkalmazott Kmia Tanszk.
QUEVAUVILLER P. (1996): Improvement of quality control of speciation analysis using hyphenated techniques
a decades of progress within the European Community. Journal of Chromatography A, 750, 2533. p.
QUEVAUVILLER P. (1998): Requirements for production and use of Certified Reference Materials for speciation
analysis: A European Commission perspective. Spectrochimica Acta Part B, 53, 12611279. p.
QUEVAUVILLER P. (1999): Reference materials: an inquiry into their use and prospects in Europe. Trends in
Analytical Chemistry, 18 (2) 7685. p.
RAESSLER M., MICHALKE B., SCHULTE-HOSTEDE S., KETTRUP A. (2000): Long-term monitoring of
arsenic and selenium species in contaminated groundwaters by HPLC and HG-AAS. The Science of the Total
Environment, 258, 171181. p.
RCZ L., BUMBLOV A., HARANGOZ M., TLGYESSY J., TOMEEK O. (2000a): Determination of
cesium and selenium in cultivated mushrooms using radionuclide X-ray fluorescence technique. Journal of
Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 245 (3) 611614. p.
RCZ L., OLDAL V. (2000b): Investigation of uptake processes in a soil/mushroom system by AES and AAS
methods. Microchemical Journal, 67, 115118. p.
REILLY C. (1998): Selenium: A new entrant into the functional food arena. Trends in Food Science & Technology,
9, 114118. p.
SAB R., RUBIO R., GARCA-BELTRN L. (2001): Selenium determination in urine with atomic fluorescence
detection. Analytica Chimica Acta, 436, 215221. p.
SCHMIDT A. C., REISSER W., MATTUSCH J., POPP P., WENNRICH R. (2000): Evaluation of extraction
procedures for the ion chromatographic determination of arsenic species in plant materials. Journal of
Chromatography A, 889, 8391. p.
SCHRAUZER G. N. (2000): Anticarcinogenic effects of selenium. Cellular and Molecular Life Sciences, 57, 1864
1873. p.
SCHWARZ K., FOLTZ C. M. (1957): Selenium as an integral part of factor 3 against dietary necrotic liver
degeneration. Journal of the American Chemical Society, 79 (12) 32923293. p.
SCHWARZ K., MERTZ W. (1959): Chromium (III) and the glucose tolerance factor (Letters to the Editors).
Archives of Biochemistry and Biophysics, 85, 292295. p.
SEAS (2002): Nemzetkzi megvalsthatsgi tanulmny szeln- ill. arzntartalm LRM-ek ltrehozsra. A 2002.
vi idkzi egyeztet tancskozs kziknyve. Hozzfrhet a SZIE-K Alkalmazott Kmia Tanszkn. EC
Contract GROWTH GRD1-2000-25019.
SEAS (2003): Nemzetkzi megvalsthatsgi tanulmny szeln- ill. arzntartalm LRM-ek ltrehozsra. A 2003.
vi idkzi rtkel tancskozs kziknyve. Hozzfrhet a SZIE-K Alkalmazott Kmia Tanszkn. EC Contract
GROWTH GRD1-2000-25019.
SECOR C. L., LISK D. J. (1989): Variation in the selenium content of individual Brazil nuts. Journal of Food
Safety, 9 (4) 279281. p.
SHARMASARKAR S., VANCE G. F., CASSEL-SHARMASARKAR F. (1998): Analysis and speciation of
selenium ions in mine environments. Environmental Geology, 34 (1) 3138. p.
SHIOMI K., SUGIYAMA Y., SHIMAKURA K., NAGASHIMA Y. (1995): Arsenobetaine as the major arsenic
compound in the muscle of two species of freshwater fish. Applied Organometallic Chemistry, 9, 105109. p.
LEJKOVEC Z., VAN ELTEREN J. T., WORONIECKA U. D. (2001): Underestimation of the total arsenic
concentration by hydride generation techniques as a consequence of the incomplete mineralization of arsenobetaine
in acid digestion procedures. Analytica Chimica Acta, 443, 277282. p.
SMEDLEY P. L., KINNIBURGH D. G. (2002): A review of the source, behaviour and distribution of arsenic in
natural waters. Applied Geochemistry, 17 (5) 517568. p.
SOCHASKI M. A., JENKINS A. J., LYONS T. J., THORPE S. R., BAYNES J. W. (2001): Isotope dilution gas
chromatography/mass spectrometry method for the determination of methionine sulfoxide in protein. Analytical
Chemistry, 73 (19) 46624667. p.
128

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

STADTMAN T. C. (1996): Selenocysteine. Annual Review of Biochemistry, 65, 83100. p.


STEFNKA Z., IPOLYI I., DERNOVICS M., FODOR P. (2001): Comparison of sample preparation methods
based on proteolytic enzymatic processes for Se-speciation of edible mushroom (Agaricus bisporus) samples.
Talanta, 55, 437447. p.
STEFNKA Z. (2003a): Nagyhatkonysg mintabeviteli technikk alkalmazsi lehetsgei nyomelemek
specicis analzisnl. PhD rtekezs. Szent Istvn Egyetem, Alkalmazott Kmia Tanszk.
STEFNKA Z., DERNOVICS M., IPOLYI I., MTYS A., ABRANK L., FODOR P. (2003b): HPLC-UV-HGAFS mdszer szeleno-aminosavak s szervetlen szeln specieszek meghatrozsra. Anyagvizsglk Lapja, 13 (1)
2327. p.
STBLO M., THOMAS D. J. (1997): Binding of arsenicals to proteins in an in vitro methylation system.
Toxicology and Applied Pharmacology, 147 (1) 18. p.
STBLO M., DROBN Z., JASPERS I., LIN S., THOMAS D. J. (2002): The role of biomethylation in toxicity
and carcinogenicity of arsenic: a research update. Environmental Health Perspectives, 110 (Suppl. 5) 767771. p.
SURAI P. F., SPARKS N. H. C. (2001): Designer eggs: from improvement of egg composition to functional food.
Trends in Food Science & Technology, 12, 716. p.
SUZUKI K. T., ISHIWATA K., OGRA Y. (1999): Incorporation of selenium into selenoprotein P and extracellular
glutathione peroxidase: HPLC-ICPMS data with enriched selenite. The Analyst, 124, 17491754. p.
SZAB C. (2003): Mintaelkszts arznspeciesz meghatrozshoz. Diplomadolgozat. SZIE-K Alkalmazott
Kmia Tanszk.
SZPUNAR J. (2000): Bio-inorganic speciation analysis by hyphenated techniques. The Analyst, 125, 963988. p.
TEMPLETON D. M., ARIESE F., CORNELIS R., DANIELSSON L-G., MUNTAU H., VAN LEEUWEN H. P.,
OBISKI R. (2000): Guidelines for terms related to chemical speciation and fractionation of elements, definitions,
structural aspects, and methodological approaches (IUPAC Recommendations 2000). Pure and Applied Chemistry,
72 (8) 14531470. p.
THOMAS C., BUTH I., WALDNER H. (2001): Bioavailability investigations of selenium from foods and
supplements after enzymatic digestion using HPLC-ICP-MS with hexapole collision cell. Poszterelads a II.
International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences
konferencin, Mnchen, Nmetorszg, 2001.05.07-10.
THOMAS P., FINNIE J. K., WILLIAMS J. G. (1997): Feasibility of identification and monitoring of arsenic
species in soil and sediment samples by coupled high performance liquid chromatography inductively coupled
plasma mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 13671372. p.
THORGREN M., KESSON B. (1987): Effect of dietary fish on plasma selenium and its relation to haemostatic
changes in healthy adults. International Journal of Vitamin and Nutritional Research, 57, 429435. p.
TU H. M., GODFREY L. W., SUN S. S. M. (1998): Expression of the Brazil nut methionine-rich protein and
mutants with increased methionine in transgenic potato. Plant Molecular Biology, 37 (5) 829838. p.
TURPEINEN R., PANTSAR-KALLIO M., KAIRESALO T. (2002): Role of microbes in controlling the speciation
of arsenic and production of arsines in contaminated soils. The Science of the Total Environment, 285, 133145. p.
UDEN P. C., BIRD S. M., KOTREBAI M., NOLIBOS P., TYSON J. F., BLOCK E., DENOYER E. (1998):
Analytical selenoamino acid studies by chromatography with interfaced atomic mass spectrometry and atomic
emission spectral detection. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 362, 447456. p.
URASE T., OH J., YAMAMOTO K. (1998): Effect of pH on rejection of different species of arsenic by
nanofiltration. Desalination, 117, 1118. p.
VAN DER VEEN A. M. H., LINSINGER T., PAUWELS J. (2001): Uncertainty calculations in the certification of
reference materials. 2. Homogeneity study. Accreditation and Quality Assurance, 6, 2630. p.
VAN ELTEREN J. T., WORONIECKA U. D., KROON K. J. (1998): Accumulation and distribution of selenium
and cesium in the cultivated mushroom Agaricus bisporus a radiotracer-aided study. Chemosphere, 36 (8) 1787
1798. p.
VARSNYI I., FODRE Z., BARTHA A. (1991): Arsenic in drinking-water and mortality in the southern great
plain, Hungary. Environmental Geochemistry and Health, 13 (1) 1422. p.
VELEZ D., YBEZ N., MONTORO R. (1995): Percentages of total arsenic represented by arsenobetaine levels
of manufactured seafood products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, 12891294. p.
VERES S., SZAHL Z. (1991): Accumulation of arsenic in vegetables cultivated with arsenic containing nutrient
solutions. Magyar Kmiai Folyirat, 97 (2) 9196. p.
VERGARA GALLARDO M., BOHARI Y., ASTRUC A., POTIN-GAUTIER M., ASTRUC M. (2001): Speciation
analysis of arsenic in environmental solids Reference Materials by high-performance liquid chromatography
hydride generationatomic fluorescence spectrometry following orthophosphoric acid extraction. Analytica Chimica
Acta, 441, 257268. p.
VETTER J. (1990): Mineral element content of edible and poisonous macrofungi. Acta Alimentaria, 19 (1) 2740. p.
VETTER J. (1993): Selenium content of some higher fungi. Acta Alimentaria, 22 (4) 383387. p.
VILAN M., PADR A., RUBIO R., RAURET G. (1998): Organic and inorganic selenium speciation using highperformance liquid chromatography with UV irradiation and hydride generation quartz cell atomic absorption
spectrometric detection. Journal of Chromatography A, 819, 211220. p.
129

Dernovics Mihly

VONDERHEIDE A. P., WROBEL K., KANNAMKUMARATH S. S., BHYMER C., MONTES-BAYN M.,
PONCE DE LEN C., CARUSO J. A. (2002): Characterization of selenium species in brazil nuts by HPLC-ICPMS and ES-MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 57225728. p.
WALDOCK M. J., THAIN J. E. (1983): Shell thickening in Crassostrea gigas: organotin antifoulings or sediment
induced? Marine Pollution Bulletin, 14, 411415. p.
WANG Z., SHENMENG XIE S., PENG A. (1996): Distribution of Se in soybean samples with different Se
concentration. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 27542759. p.
WENZEL W. W., KIRCHBAUMER N., PROHASKA T., STINGEDER G., LOMBIC E., ADRIANO D. C. (2001):
Arsenic fractionation in soils using an improved sequential extraction procedure. Analytica Chimica Acta, 436, 309
323. p.
WHANGER P. D., IP C., POLAN C. E., UDEN P. C., WELBAUM G. (2000): Tumorigenesis, metabolism,
speciation, bioavailability, and tissue deposition of selenium in selenium-enriched ramps (Allium tricoccum).
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 57235730. p.
WOLF W. R., ZAINAL H., YAGER B. (2001): Selenomethionine content of candidate reference materials.
Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 370, 286290. p.
WROBEL K., WROBEL K., CARUSO J. A. (2002): Selenium speciation in low molecular weight fraction of Seenriched yeasts by HPLC-ICP-MS: detection of selenoadenosylmethionine. Journal of Analytical Atomic
Spectrometry, 17, 10481054. p.
WROBEL K., KANNAMKUMARATH S. S., WROBEL K., CARUSO J. A. (2003): Hydrolysis of proteins with
methanesulfonic acid for improved HPLC-ICP-MS determination of seleno-methionine in yeast and nuts. Analytical
and Bioanalytical Chemistry, 375 (1) 133138. p.
YAMSKOV I. A., TICHONOVA T. V., DAVANKOV V. A. (1986): Pronase-catalyzed hydrolysis of amino-acid
amides. Enzyme and Microbial Technology, 8 (4) 241244. p.
YASUMOTO K., IWAMI K., YOSHIDA M. (1983): Nutritional efficiency and chemical form of selenium, an
essential trace element, contained in soy protein. Diazu Tanpakushitu Eiyo Kenkyuukai Kaishi, 4, 3540. p.
YASUMOTO K., SUZUKI T., YOSHIDA M. (1988): Identification of selenomethionine in soybean protein.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 36, 463467. p.
YBEZ N., CERVERA M. L., MONTORO R. (1991): Comparison of dry mineralization and microwave-oven
digestion for the determination of arsenic in mussel products by platform in furnace Zeeman-effect atomic
absorption spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 6, 379384. p.
YBEZ N., VELEZ D., TEJEDOR W., MONTORO R. (1995): Optimization of the extraction, clean-up and
determination of arsenobetaine in manufactured seafood products by coupling liquid chromatography with
inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 10, 459465. p.
ZHANG Y. Q., MOORE J. N. (1997): Changes in selenium speciation in wetland Sediments induced by laboratory
testing. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 28 (3-5) 341350. p.
ZHANG Y. Q., FRANKENBERGER JR. W. T. (2001): Speciation of selenium in plant water extracts by ion
exchange chromatography-hydride generation atomic absorption spectrometry. The Science of the Total
Environment, 269, 3947. p.
ZHANG W., CAI Y., TU C., MA L. Q. (2002): Arsenic speciation and distribution in an arsenic hyperaccumulating
plant. The Science of the Total Environment, 300, 167177. p.
ZHENG J., OHATA M., FURUTA N., KOSMUS W. (2000): Speciation of selenium compounds with ion-pair
reversed-phase liquid chromatography using inductively coupled plasma mass spectrometry as element-specific
detection. Journal of Chromatography A, 874, 5564. p.
ZHENG J., SHIBATA Y., FURUTA N. (2003): Determination of selenoamino acids using two-dimensional ionpair reversed phase chromatography with on-line detection by inductively coupled plasma mass spectrometry.
Talanta, 59, 2736. p.
ZUBOR Z. (2000): Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa szeln specieszek meghatrozsra biolgiai
mintkban. Diplomadolgozat. SZIE-K Alkalmazott Kmia Tanszk.

130

Szervetlen Sevegyletek

Metilezett Sevegyletek

131
SeMet
MeSeCys
----SeHoCys
--AdoSeHcy

Se-metilszelenocisztein

-glutamil-Semetilszelenocisztein

Szelenocisztationin

Szelenohomocisztein

Szelenocisztamin

Se-adenozilszelenohomocisztein

10

11

12

13

SeCys2

Szelenocisztin

Szelenometionin

SeCys

Szelenocisztein

(CH3)2Se

DMSe

Dimetil-szelenid

Szeleno-aminosavak s szrmazkaik

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-Se-CH2-C4H5O3C5N4NH2

H2N-CH2-CH2-Se-Se-CH2-CH2-NH2

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-SeH

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-Se-CH2-CH(COOH)-H2N

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NH-CH(COOH)-CH2-Se-CH3

H2N-CH(COOH)-CH2-Se-CH3

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-Se-CH3

H2N-CH(COOH)-CH2-Se-Se-CH2-CH(COOH)-H2N

H2N-CH(COOH)-CH2-SeH

(CH3)3Se+

SeO32-

TMSe+

Trimetilszelenonium-ion

Se(IV)

Szelnessav s si, a
szelenitek

SeO42-

Kplet

Se(VI)

Szelnsav s si, a
szelentok

Rvidts

Megnevezs

A knanyagcsere
kntartalm
vegyleteinek analg,
szelntartalm
megfeleli.

Se-tartalm fehrjk nem


funkcionlis pteleme

Se-fehrjk funkcionlis
csoportja

Se-kirts metabolitja

Talaj, talajvz, ledkek,


tenger

Elforduls, szerep

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

2. MELLKLET (SZELNMDOSULATOK)

M2/1. Tblzat. A leggyakrabban vizsglt szelnmdosulatok [KOTREBAI 2000, OBISKI 2000, LARSEN
2001, KOBAYASHI 2002, WROBEL 2002 s MCSHEEHY 2003b alapjn].

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-Se+(CH3)-CH2-C4H5O3C5N4NH2
H2N-CH(COOH)-CH2-Se-CH2-CH=CH2

H2N-C(Se)-NH2

Szelenocukor,
MSeAcG

AdoSeMet
AllSeCys

SeU

1-metilszeleno-N-acetilD-galaktzamin
(Se-metil-Nacetilszeleno-hexzamin)

Se-adenozil-metionin

Se-allil-szelenocisztein

Szeleno-karbamid

17

18

19

20

(CH3)2Se+CH2-CH2-COO

DMSeP

Dimetilszelenoniumpropiont

16
HO
CH2OH

O
SeMe

OH
NHAc

132

Valsznleg csak
mestersgesesen llthat
el

A knanyagcsere
kntartalm
vegyletnek analg,
szelntartalm
megfelelje

Se-kirts metabolitja

Valsznleg csak
mestersgesesen
elllthat aminosav

H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-Se-CH2-CH3

SeEt

Szelenoetionin

15

Knanyagcsere szelnanalg intermediere

H2N-CH(COOH)-CH2-Se-CH2-CH(COOH)-H2N

---

Elforduls, szerep

Kplet

Se-lantionin

Rvidts

14

Megnevezs

Dernovics Mihly

M2/2. Tblzat. A leggyakrabban vizsglt szelnmdosulatok [KOTREBAI 2000, OBISKI 2000, LARSEN
2001, KOBAYASHI 2002, WROBEL 2002 s MCSHEEHY 2003b alapjn].

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

3. MELLKLET (ARZNMDOSULATOK)
M3. Tblzat. A biolgiai rendszerekben vizsglt legfontosabb arznmdosulatok [CORR 1996, LE 1998,
MUOZ 1999a, GALLAGHER 2001 s GONG 2002 alapjn].

Megnevezs

Kplet

Rvidts

Arznessav (arzenit)

OH-As(OH)2

As(III)

Arznsav (arzent)
Monometilarzonossav

O=As(OH)3

As(V)

CH3As(OH)2

MMA(III)

Monometil-arzonsav

CH3AsO(OH)2

MMA(V)

Dimetil-arzinessav

(CH3)2AsOH

DMA(III)

Dimetil-arzinsav

(CH3)2AsO(OH)

DMA(V)

Dimetil-arzinoil
(oxarzil) etanol
Dimetil-arzinil
ecetsav
Trimetilarzin-oxid
Tetrametilarzonium-ion
Arzeno-betain
Arzeno-betain 2,
trimetilarzoniopropiont, trimetil(2-karboxi-etil)arzonium

(CH3)2AsOCH2CH2OH
(CH3)2AsOCH2CH2COOH
(CH3)3AsO
(CH3)4As

(CH3)3As CH2COO

LD50 rtk,
mg kg-1

Jellemz elfordulsi
hely

talaj, talajvz, ledkek,


magasabb rend
20-41
nvnyek
? (valsznleg emls As-anyagcsere
igen mrgez)
metabolit
emls As-anyagcsere
700-1800
metabolit
? (valsznleg emls As-anyagcsere
igen mrgez)
metabolit
ltalnos As700-2600
detoxikci
vgtermk
14-34,5

DMAE
(DMAsEt)
DMAA
(DMAsAc)
TMAO
TMAs+
(TETRA)
AsB

?
(valsznleg
nem mrgez)

Arzenocukor
bomlstermkek

>10000
890

AsB bomlstermk

>10000
?
(valsznleg
nem mrgez,
AsB-hez
hasonlan)

As-detoxikci
vgtermke
vzillatokban

(CH3)3As CH2CH2COO

AsB-2
(TMAP)

Arzeno-kolin

(CH3)3As+CH2CH2OH

AsC

6500-6900

As-detoxikci
intermedier tengeri
llatokban

Trimetilarzin
Arzinek
(ltalnos kplet)

(CH3)3As

TMA(III)
MeXAsH3-X,
ahol x =0-3
EtXAsMe3-X,
ahol x =0-3

?
(kiemelten
mrgez)

Mestersges eredetek
vagy mikrobiolgiai
As-anyagcsere
termkei

(CH3)XAsH3-X, ahol x =0-3


(CH3CH2)XAs(CH3)3-X,
ahol x =0-3

Etil-metil-arzinek
R

CH2

CH2

CH

CH2

X
HO

Arzntartalm
ribozidok

OH

R= (CH3)2AsO-, X= -OH,
Y= -OH
R= (CH3)2AsO-, X= -OH,
Y= -OPO3HCH2CH(OH)CH2OH
R= (CH3)2AsO-, X= -OH,
Y= -SO3H
R= (CH3)2AsO-, X= -OH,
Y= -OSO3H
R= (CH3)2AsO-, X= -NH2,
Y= -SO3H
R= (CH3)3As+-, X= -OH,
Y= -OSO3H
R= (CH3)3As+-, X= -NH2,
Y= -OSO3H

Arzenocukor
A, X, 392, 11
Arzenocukor
B, XI, 328, 13
Arzenocukor
C, XII, 408, 10
Arzenocukor
D, XIII, 482, 12
Arzenocukor
E, XIV, 390
Arzenocukor
F, XV, 407
Arzenocukor
G, XVI, 406
133

?
(valsznleg nem
mrgez)

Alacsonyabb rend
nvnyi szervezetek
(moszatok, hnrok,
algk)

134

138

1922
296
2071
525
592

1180

1200-2100
48-524
0,2-1355
0,2-140
138
517

107-222
1922
296
140
112
164
900

Se-dstott leszt

Se-dst nvnyek: Indiai mustr /Brassica


juncea/
Astragalus praelongus

Se-dstott leszt
Se-dstott fokhagyma

plankton
Se-dst nvny /Astragalus praelongus/
Se-leszt tabletta

Se-dstott leszt

Se-dstott leszt
Se-dstott hagymafle /Allium tricoccum/
Se-dstott s hagyomnyos fokhagyma
Se-dstott s hagyomnyos vrshagyma
Se-dst nvny /Indiai mustr-Brassica juncea/
Se-dst nvny /Astragalus praelongus/

Se-dstott lesztbl kszlt


tpllkkiegszt tablettk

Se-dstott leszt
Se-dstott fokhagyma
Se-dstott vrshagyma

Se-dstott bzacsra
Se-dstott lucernacsra
Se-dstott napraforgcsra

BIRD
et al. [1997]

UDEN
et al. [1998]

KOTREBAI et al.
[1999a], IP et al.
[2000]

KOTREBAI
et al. [1999b]

CASIOT
et al. [1999]

KOTREBAI et al.
[2000]
WHANGER et al.
[2000]

BHYMER s
CARUSO [2000]

PONCE DE
LEON

LINTSCHINGER
et al. [2000]

et al. [2000]

1922

Se-dstott leszt

GILON
et al. [1995,1996]

517

1038

Vizsglt minta

Kzlemny

sszes Setartalom,
g g-1

protez XIV

pepszin

proteinz K

protez XIV

protez XIV
(+lipz VII)

protez XIV

protez XIV

protez XIV

protez XIV

protez XIV

Alkalmazott
enzim
citromsavfoszforsav
puffer, pH=7,5

citromsavfoszforsav
puffer, pH=7,5

HCl+NaCl,
pH=1

NaCO3-puffer,
pH=7-7,2

ioncserlt vz

pH=7,5

foszft-puffer,

ioncserlt vz

ioncserlt vz

ioncserlt vz

94

71
82
99

82
86

~52
~54

>90

80-84

Azonostsi
arny, a
kinyert Se
%-ban

62
74
100

---

12-99

~68
~62
~100

---

42-103

Azonostsi arny az sszes


Se %-ban
67-93
60-85
87-96
92-96
90
84

88

15
93
95

80-90
~100

~84
~86

90

90-92

Reakcikzeg

ioncserlt vz

Kinyersi
hatsfok az
sszes Se
%-ban

1,2
1,2
1

7,8,13,14
8,9
1,2,8,9

1, 2, 7

2,6,7,8,9,10,13,14
1,7,8,9,10
1,6,7,8,9,10
1,6,7,8,9,10
1,7,8
1,2,7,8,9,10

1, 2, 7

1, 2, 7, 8
1, 2, 7, 8
1, 2, 7

7, 13
7, 9

7, 8, 18

6, 7, 8

2, 6, 7

Azonostott
fbb Semdosulatok*

Dernovics Mihly

4. MELLKLET (SZELN-MINTAELKSZTS)

M4/1. Tblzat. Alkalmazsi pldk egylpses, fehrjebont enzimmel vgrehajtott Se-mdosulatanalitikai


mintaelksztsekre.(*=jellsek a 2. Mellklet tblzata alapjn).

426

Vizsglt minta

Se-dstott lesztbl kszlt


tpllkkiegszt tabletta

Se-dstott tejsavbaktrium

osztriga RM

6-fle di (2 hagyomnyos, 2 brazil, pekn, kasu)

Kzlemny

ZHENG
et al. [2000]

MICHALKE
et al. [2001]

MORENO et al.
[2001, 2002]

KANNAMKUMARATH et al.
[2002]

135
0,79
2,93
6,88

140
512

Se-dst nvny /Indiai mustr-Brassica juncea/

rk
kagyl
tengeri hal CRM (TORT-1)

Se-dstott tejsavbaktrium

Se-dstott lesztbl kszlt


tpllkkiegszt tabletta
hal CRM

Se-dstott leszt

MONTESBAYN
et al. [2002]

GMEZ-ARIZA
et al. [2002]

MICHALKE
et al. [2002]

ZHENG
et al. [2003]

LARSEN
et al. [2003]

1390

6,06

202

brazil di

VONDERHEIDE
et al. [2002]
35

0,1-35,1

1,22

148

sszes Setartalom,
g g-1
ammniumfoszft puffer,
pH=7,5

protez XIV

ioncserlt vz

pH=7,5

foszft-puffer,

TRIS-HCl,
pH=7,3

protez XIV
protez XIV
+lizozim
protez XIV

ioncserlt vz

ioncserlt vz

TRIS-HCl,
pH=7,5

pH=7,5

foszft-puffer,

TRIS-HCl,
pH=7,5

~26,6

~8,3

90

15,7

77

~59

94,6

93

~37,0

~91
~100
~100

60
29
44

~12,1

---

38

~43-47
(a brazil
dira)

~100

35,3

81,4

Azonostsi
arny, a
kinyert Se
%-ban

73
70

83

~60
(a brazil
dira)

29,5-35

25

74,1

Reakcikzeg

TRIS-HCl,
pH=7,3

Kinyersi
hatsfok az
sszes Se
%-ban

szubtilizin
(+lipz VII)

proteinz K
protez XIV

proteinz K

proteinz K

szubtilizin

protez XIV

protez XIV

Alkalmazott
enzim

6,7

2,6,7

1,2,6,7,19

6,7,19

2
--2,6,7

3,7

1,2,6,7,19

6,7

Azonostott
fbb Semdosulatok*

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

M4/2. Tblzat. Alkalmazsi pldk egylpses, fehrjebont enzimmel vgrehajtott Se-mdosulatanalitikai


mintaelksztsekre.(*=jellsek a 2. Mellklet tblzata alapjn).

3,2 - 118

3,8-96

10,9-30,0

11-fle hal,
osztriga, rk s
kagyl

7-fle hal

7-fle friss hal,


csiga, kagyl, rk

3-fle kalapos
gomba

zldalga LRM

Kzlemny

LARSEN
et al. [1993]

BRANCH
et al. [1994]

EL MOLL
et al. [1995]

KUEHNELT
et al. [1997]

GOESSLER
et al. [1997]

136

22,4-206

4,8

2,99-60,6

arznnel
dstott leszt

rpa

tonhal CRM

5-fle friss hal


s hal CRM

JKAI
et al. [1998]

HELGESEN
s LARSEN
1998]

LAGARDE
et al. [1999]

et al. [1999]

MCKIERNAN

23-1420

ehet kalapos
gomba

LARSEN
et al. [1998b]

0,11-1,85

42,2-43,2

rk s hal CRM

LARSEN
et al. [1997]

2480-14900

3,5-196,1

sszes Astartalom,
g g-1 vizsglt
minta

As-tartalm
minta

88-99
84,9-89,1

1:1
1.lps: aceton
(zsrtalants)
2. lps: 1:1 /m/m/

aceton;
metanol-vz

46-69

83-98

1.lps: aceton
(zsrtalants)
2. lps: 1:9

1:9

68-85

1:9

99,4

100 krl

2:3 arnyt
meghaladva
1.lps: 2:5:0
2. lps: 5:0:7

85-100

59,6-144

37-87

46-99

Kinyersi
hatsfok az
sszes As
%-ban

9:1

1:1

1.lps: 1:2:0
2. lps: 1:0:1

1.lps: 2:5:0
2. lps: 5:0:7

A felhasznlt
(esetenknt
leghatkonyabb)
oldszer V/V arny

metanol-vz

metanol-vz

aceton;
metanol-vz

metanol-vz

kloroformmetanol-vz

metanol-vz

metanol-vz

metanol-vz

kloroformmetanol-vz

kloroformmetanol-vz

Alkalmazott
oldszerek,
clean-up
nlkl

98 krl

100 krl

100 krl

100 krl

100 krl

93,2-99,0

100 krl

?-147

66-150

---

---

Azonostsi
arny, a kinyert
As %-ban

0,4-5,1

---

---

---

---

---

---

---

---

0,08-2,2

1-18

Hidrofb Asmdosulatok az
sszes As
%-ban

AsB + AsC, As(V),


MMA(V), DMA(V)

AsB, DMA(V)

As(III), As(V)

As(III), As(V),
MMA(V)

DMA(V), MMA(V),
As(V), AsB, TMAO

AsB, TETRA

As(III), As(V),
MMA(V), DMA(V)

AsB, AsC, DMA(V),


As(III), As(V), TETRA

AsB, DMA(V)

AsB, DMA(V),
As(V)

AsB, AsC, As(III),


As(V), MMA(V),
DMA(V),TMAO,
TETRA

Azonostott
fbb As-mdosulatok

Dernovics Mihly

5. MELLKLET (ARZN-MINTAELKSZTS)

M5/1. Tblzat. Alkalmazsi pldk metanol-vz oldszeres extrakcival vgrehajtott As-mdosulatanalitikai


mintaelksztsekre.

137

0,045-109,4

3-fle tengeri
hnr

7-fle rizs s
gabona CRM

MCSHEEHY
et al. [2001b]

GALLAGHER

HEITKEMPER

0,00820,0809

168-3894

3,3-23,2

3-fle alma

As-dst
pfrny

19-fle hal, rk,


osztriga s
kagyl CRM

CARUSO
et al. [2001]

ZHANG
et al. [2002]

KIRBY s
MAHER
[2002]

et al. [2001]

metanol-vz

metanol-vz

metanol-vz

aceton;
metanol-vz

metanol-vz

metanol-vz

15

osztriga CRM

SCHMIDT
et al. [1999]

metanol-vz

metanol-vz

0,093-9,90

3-fle
gyomnvny s
nvnyi CRM

ACKLEY
et al. [1999]

Alkalmazott
oldszerek,
clean-up
nlkl

0,11-0,34

2,6-19,4

4-fle friss hal


s hal CRM

Kzlemny

et al. [2001]

sszes Astartalom,
g g-1 vizsglt
minta

As-tartalm
minta

1.lps: aceton
(zsrtalants)
2. lps: 1:1

1:1

1:1

1:1

3:7

1:1

1:9

4:1

A felhasznlt
(esetenknt
leghatkonyabb)
oldszer V/V arny

58-103

60-100

60,5-97,1

31-76

25,6-77,4

53

30-100

46-100

Kinyersi
hatsfok az
sszes As
%-ban

81-100

100 krl

100 krl

100 krl

100 krl

71

100 krl

100 krl, csak


AsB-re

Azonostsi
arny, a kinyert
As %-ban

0,21-10,5

---

---

---

---

---

---

---

Hidrofb Asmdosulatok az
sszes As
%-ban

AsB, AsB-2, AsC,


As(V), MMA(V),
DMA(V),TETRA,
TMAO

As(III), As(V)

As(III), As(V),
MMA(V), DMA(V)

As(III), As(V),
DMA(V),
Arzenocukor A,B,C,D
DMA(V),
As(III)+As(V)

AsB, AsB-2, AsC,


TETRA, DMA(V),
Arzenocukor B s D

As(III), As(V),
DMA(V)

AsB

Azonostott
fbb As-mdosulatok

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

M5/2. Tblzat. Alkalmazsi pldk metanol-vz oldszeres extrakcival vgrehajtott As-mdosulatanalitikai


mintaelksztsekre.

Dernovics Mihly

6. MELLKLET (RM-ELLLTS)
Ignyek s lehetsgek
felmrse + tervezs

1-6 h

Idigny

Megfeleltek
relatv arnya

10-15%

Nyersanyag begyjtse

Relatv
kltsg

Vzeltvolts szrtssal vagy


liofilezssel
Szemcsemret-cskkents
(darls, rls)

Elzetes analitikai vizsglatok

100%

Homogenizls

4-6 h

LRM

A kvnt szemcsemret
elrsre szitlssal

Homogenits ellenrzse

10-20%

Trolsi egysgek kialaktsa,


azonost jelzsek megadsa
Sterilizls+stabilizls
-besugrzssal
Analitikai mrsek a kijellt
rtk(ek) megllaptsra

Teljes megfelelsg esetn


forgalomba hozatal

SSZESTS:

25%
5%

Kirtkels, dnts a hiteles


rtkekrl s a stabilitsrl

70-80%

Hitelestsi
(kr)elemzs

12-40 h

CRM

Trols + stabilitsi
vizsglatok

~17-52 h

M6. bra. A referenciaanyagok ellltsnak ltalnos folyamatbrja.

138

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

7. MELLKLET (RSM-TBLZAT)
M7. Tblzat. Arzntartalm halminta (SEAS) enzimes mintaelksztsnek tbbvltozs optimlsi
megkzeltse. A legkisebb ngyzetek elve alapjn vgrehajtott, polinom fggvny illesztshez az x1, x2 s y
vltozkat hasznltam fel; az utbbi adatok szmtsnl a 43,7 g As g-1 sszes As-tartalom rtkt vettem
figyelembe.

X1

Fggetlen vltozk
X2

Extrakci
idtartama,
ra
1
2,35
4
4
4
6
8
8
8
10
10
10
10
10
10
10
12
12
12
13,6
16
20

---

---

Tripszin
Minta tmege, Kinyert As,
koncentrci,
g
g
m/m %
10
0,256
9,8
10
0,253
8,8
10
0,253
9,3
5
0,253
9,7
15
0,253
9,6
10
0,250
10,0
10
0,257
10,0
2,93
0,253
10,2
17
0,257
10,1
1
0,252
9,8
3
0,253
9,9
8
0,260
10,3
10
0,255
10,4
12
0,251
9,8
10
0,255
10,4
17
0,259
10,4
10
0,251
10,3
5
0,256
9,9
15
0,256
10,1
10
0,255
10,4
10
0,258
9,9
10
0,250
9,9

139

Fgg vltozk
--Kinyert As,
g g-1 minta
38,3
34,8
36,0
38,3
37,8
39,8
39,1
40,4
39,1
38,7
39,0
39,6
40,9
38,9
40,9
40,3
40,9
38,6
39,3
40,7
38,5
39,8

Y
As-kinyersi
hatsfok,
%
87,6
79,6
82,4
87,6
86,5
91,1
89,5
92,3
89,6
88,6
89,2
90,6
93,6
89,0
93,6
92,2
93,6
88,3
90,0
93,1
88,1
91,0

Dernovics Mihly

Fehrjebonts
tripszinnel

Fehrjebonts
pepszinnel
Fehrjebonts
tripszinnel

Vizes
extrakci

Fehrjebonts
pepszinnel

Pufferes
extrakci
Pufferes
extrakci
Fehrjebonts
pronzzal

3. lps

2. lps

Vizes
extrakci

1. lps

Extrakci
jele

8. MELLKLET (FOLYAMATBRA)

M8. bra. A szelnsval kiegsztett komposzton termesztett, Se-dstott csiperkegomba mdosulatanalitikai


mintaelksztse sorn alkalmazott extrakcis eljrsok vzlatos ismertetse.

140

Mintaelksztsi mdszerek kidolgozsa


s referenciaanyagok ellltsa mdosulatanalitikai clokra

9. MELLKLET (HOMOGENITSVIZSGLAT)
M9/1. Tblzat. A referenciaanyag cljbl ksztett brazil di trolsi egysgen belli s a trolsi egysgek
kztti homogenitsnak megllaptsra vgrehajtott mdosulatanalitikai mrsek eredmnyei, mind az
sszes Se-, mind pedig a SeMet-tartalmat illeten.

Mintk
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
tlag
Szrs
Relatv szrs
Relatv szrs
bizonytalansg
(UCV)
tfedsben?

HOMOGENITSVIZSGLAT
sszes Se-tartalom
SeMet-tartalom (szelnben szmtva)
9 prhuzamos
9 fiolbl szrmaz
9 prhuzamos
9 fiolbl szrmaz
mrs egy
egyenknti
mrs egy
egyenknti
fiolbl, g g-1
mrsek, g g-1
fiolbl, g g-1
mrsek, g g-1
82,11
87,50
77,50
87,32
82,32
82,39
83,35
77,70
85,14
76,31
78,81
70,71
83,56
81,54
75,34
79,12
84,63
80,01
71,28
73,03
81,81
80,79
77,76
79,28
77,87
83,85
78,46
79,39
85,68
86,67
85,24
82,42
85,02
87,01
78,04
77,50
83,13
82,90
78,42
78,50
2,44
3,73
4,07
4,84
CVB
CVK
CVB
CVK
2,94%
4,50%
5,20%
6,16%
2,940,69%

4,501,06%

5,201,23%

IGEN

6,161,45%
IGEN

M9/2. Tblzat. Az sszes Se- s SeMet-tartalom trolsi egysgek kztti inhomogenits rtkeinek (sK)
megllaptsa. A tblzatban kzlt szrsi paramterek mrtkegysge a relatv rtkek kivtelvel
g Se g-1 brazil di minta.

Bizonytalansgi
tnyezk

sszes Se-tartalomra

SeMet-tartalomra (szelnben szmtva)

uc(K)

---

3,73

4,07

---

smdszer

2,44

----

---

4,84

sK =
(u2c(K) s2mdszer)0,5

sK = (3,732 2,442)0,5 = 2,82

sK = (4,842 4,072)0,5 = 2,62

Relatv sK
(a vonatkoz
tlag %-ban)

(2,82 / 82,90)*100% = 3,40 %

(2,62 / 78,50)*100% = 3,34 %

141

Dernovics Mihly

KSZNETNYILVNTS
Nos, br teljes mrtkben tudatban vagyok annak, hogy nem tudom felidzni az sszes j szndk embert, akik a
ngy v sorn hozzjrultak ezen rtekezs valamely szakaszhoz, mgis ksrletet teszek arra, hogy sszegyjtsem ket
egyttal elnzst krve azoktl, akik megrdemelnk, de feledkenysgem rvn kimaradtak:
elsknt felesgemnek, Szraz Leonrnak szeretnk ksznetet mondani aki trelmvel s segtsgvel vezetett t a
ngyvi munka olykor mlypontokat sem nlklz idszakn s szleimnek, akik lehetv tettk, hogy idig
eljuthassak;
tmavezetmnek, Dr. Fodor Pter professzornak, aki tanszkre meghvott s biztostotta azt az anyagi s szakismereti
htteret, melyre munkm plhetett, lehetv tve a nemzetkzi megmrettetst; aki valban 24 rs rendelkezsre
llsval, szabadidejt is rnk fordtva lendtette elre a PhD-kpzs szekert s aki elviselte olykor nfej
viselkedsemet is
a nagybets TANSZK kollginak, akik elkpzelhetetlenl sok terleten segtettk kisebb vagy nagyobb mrtkben
munkmat: (1) Dr. Fodor Mariettnak, aki annak idejn (1995-ben) a kmia tanszkhez lncolt; (2) Dr. Pais Istvn
professzornak, aki mr a diploma elksztsnl mellettem bbskodott s segtsget nyjtott az egyetemi vek
lezrsnl; (3) A Zsuzsi-triumvirtusnak: Bertnyin Divinyi Zsuzsnak, Fekete Zsuzsannnak s Firisz Zsuzsannnak,
akik a sok aprsg mellett tbb mint 2000 (!) ICP-mrst vgeztek el szmomra az vek sorn, szntelen s megbzhat
referencit jelentve ksrleteimhez; (4) Dr. Tth rpdnak, aki rendthetetlen nyugalmval s risi ltalnos kmiai
szaktudsval a legelkpzelhetetlenebb helyzetekben is kiutat mutatott; (5) Dr. Kosry Judit professzorasszonynak,
Stefanovitsn Dr. Bnyai va tanrnnek s Dr. Kiss Mrtnak, akik a biokmia fel hajl ksrleteim httert
biztostottk; (6) Szurduk Sndorn Zsfinak, Balogh Jnosnnak s Ers Juditnak, akik egytt dolgoztak velem a
legunalmasabb mintaelksztsi lpsek sorn is;
doktorandusztrsaimnak: elssorban Stefnka Zsoltnak, s a tbbieknek: Ipolyi Ildiknak, Bod Erzsbet Tndnek,
Srs Csillnak s Abrank Lszlnak, akik nlkl mdosulatanalitikai mrsek hinyban ez az rtekezs egyszeren
ltre sem jhetett volna;
a diplomz hallgatknak, nv szerint Prunk Aniknak, Zubor Zsuzsannnak, Csabai Zsuzsannnak, Szab Csillnak
s Mtys Andrsnak, akik olykor engem, PhD-hallgatt is megszgyent szorgalommal vgeztk azokat a mrseket s
ksrleteket, melyek ehhez az rtekezshez is szksgesek voltak;
Tmry Istvnnak, aki a szmtstechnika sznetmentes szrke eminencisaknt minden elkpzelhet informatikai
gondot s problmt elhrtva jrult hozz ahhoz, hogy a szmtgp valban segtknt lljon rendelkezsre s ne
rmlomknt jelenjen meg;
Dr. Woller gnesnek, aki PhD-tanulmnyaim elejn a kiindulpontknt szolgl krdsek tisztzsban jtszott
ptolhatatlan szerepet;
Dr. Mester Zoltnnak, aki szakmai tancsokkal s kzlemnyekkel tette knnyebb munkmat;
a Matematika s Informatika Tanszken Dr. Ittzs Andrsnak s Dr. Ferenczy Antalnak, akik a statisztika
tvesztjben Ariadn-fonalt adtk kezembe;
a Sr- s Szeszipari Tanszken Dr. Hoschke gostonnak, Rezessyn Dr. Szab Juditnak, Hegyesn Vecseri Betnak,
Dr. Nguyen Duc Quangnak, Bujna Eriknak, Farkas Gabriellnak s Mayer gnesnek, akik rvn sok egyb mellett
mg egy centrifugt is klcsnkrhettem a mintaelksztsi ksrleteim vgrehajtshoz, nem beszlve az anaerob
fermentcis mdszerekhez szksges segdeszkzkrl s autoklvozsi lehetsgrl;
a Mikrobiolgia s Biotechnolgia Tanszken Juhszn Dr. Romn Mariannak s Perktai Katalinnak trzsizollsi
ksrleteimben nyjtott segtsgkrt;
a Ht s llatitermk Technolgia Tanszken Dr. Balla Csabnak, Csukn Nemes Mrtnak s Psztorn Huszr
Klrnak, akik mintim liofilezsben, szakirodalom gyjtsben s szakfordtsban segtettek;
a Nvnylettani Tanszken Dr. Mszros Annamrinak, aki a folykony N2 kezelshez szksges segdeszkzket
bocstottk rendelkezsemre;
a Nyelvi Lektortuson Biharin Dr. Partos Mrinak s Uray Katalin tanrnnek, akik szakfordti segtsget
nyjtottak plyzataim elksztshez;
Szakcs Gabriellnak, aki klfldi utazsaim szervezsben (s elszmolsban) sietett segtsgemre;
a KKI Mikrobiolgiai Osztlyn Andrssy vnak s Csnyi Jliannnak, a -besugrzssal s mikrobiolgiai
vizsglatokkal kapcsolatos ksrletekrt;
az OMMI munkatrsainak a brazil di elksztse sorn nyjtott segtsgkrt,
Dr. Rcz Lszl tanr rnak, aki a csiperkemintkat biztostotta szmunkra;
ksznm Dr. R. obiski, Dr. J. Szpunar (CNRS, Pau, Franciaorszg) s Dr. B. Michalke (GSF, Mnchen,
Nmetorszg) fogadkszsgt, mellyel klfldi sztndjaim alapjt szolgltattk;
Dr. Hlavay Jzsefnek, Dr. Prokisch Jzsefnek s Dr. Nyeste Lszlnak az el- s fbrlat vllalsban s
elksztsben nyjtott segtsgket;
a Szchenyi Istvn sztndj Alaptvnynak, a hrom hnapos mncheni sztndj odatlsrt;
a Magyar sztndj Bizottsgnak s Philippe Carlevan rnak, a Francia Nagykvetsg kulturlis attasjnak, akiknek a
kt hnapos franciaorszgi sztndjamat ksznhetem;
vgl, de nem utolssorban a Magyar llami Doktori sztndjat emltem meg, mint a PhD-kpzsem anyagi httert
biztost intzmnyt.

142