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El sistema Rh

A)Importancia
B)Datos histricos
C) genes RH30 RHDCE y RH50
Polimorfismo del sistema Rh
El sistema Rh es el ms polimrfico de los sistemas de
grupos sanguneos y contiene cinco antgenos
principales desde el punto de vista de su
inmunognicidad (D y no D y CcEe) y unos 40
antgenos ms de baja y alta incidencia. La expresin
de tales antgenos puede variar cualitativa y
cuantitativamente debido a mltiples variaciones
fenotpicas que ocurren en forma natural . Los
antgenos D, C, c, E y e, son los ms importantes
desde el punto de vista clnico por su capacidad de
inducir la respuesta inmune y estimular la produccin
de anticuerpos hemolticos. Los otros antgenos
tambin pueden ser inmunognicos y su importancia
se incrementa en aquellos pacientes que requieren
mltiples transfusiones o en los que portan un
antgeno Rh raro o un nico fenotipo Rh.
El antgeno D es el ms inmungnico de todos los
antes expuestos. Induce una respuesta inmune en el
80% de las personas Rh neg. que se transfunden con
200 ml de sangre D positivo.
La otra forma de sensibilizacin es a travs del
embarazo. Existe aproximadamente un 16 % de
sensibilizacin en mujeres en mujeres D neg. , que
paren hijos ABO compatibles D+

NOMENCLATURAS, FENOTIPOS Y GENOTIPOS MAS


FRECUENTES DEL SISTEMA Rh.

Antgeno
D C

E
0

Fenotip
o
e

Genotipo

DCE

DCE

Rh-HR

DCcee

DCe/dce
DCe/Dce
dCe/Dce

R1r
R1Ro
r'Ro

+ +

DCCee

DCe/DCe
DCe/dCe

R1 R1
R1 r'

DccEe

DcE/dce
DcE/Dce

R2 r
R2 R0

DccEE

DcE/DcE
DcE/dcE

R2 R2
R2 r''

DCcEe

Dccee

Dc_, D_ _

R.-D r.-d

DCe/DcE
DCe/dcE
dCe/DcE
Dce/dce
Dce/Dce

R1 R2
R1 r''
r' R2
R0 r
R0 R0

DIVERSIDAD DEL RH : GENES VS FENOTIPOS

Los fenotipos de los genes variantes Rh se producen a


travs de cuatro mecanismos fundamentales: a.Rearreglo gentico entre los genes RHCE y RHD. B.mutaciones puntuales que causan cambios en aa. c.Mutaciones sin sentido d.- Delecciones de nucletidos
que causan desviaciones y codones de paradas
prematuros.

Variantes Dbiles Du
D parciales
Sndrome Rh nulo

SISTEMA Rh Y COMPLICACIONES CLINICAS

Las complicaciones clnicas resultan de la destruccin de los


eritrocitos debido a la interaccin de un aloanticuerpo
con el eritrocito que presenta el correspondiente
antgeno.

En vista de la importancia transfusional y clnica del


ag. D, su determinacin es obligatoria en cada donante
y receptor de sangre y en toda mujer embarazada y lo
que es ms que dicho tipiaje se realice e interprete
correctamente. Tambin es importante conocer la
capacidad de los diferentes reactivos en detectar las
variaciones fenotpicas.
Tipificacin del RhD. Reactivos y tcnicas.
Los primeros eran IgM (donantes sensibilizados).
Reaccionaban en salina, podran calificarse como
aceptables, pero poco prcticos, requeran de una
larga incubacin .
En 1945 Diamon y Denton desarrollaron antisueros de
tipo IgG potenciados con protenas y otras sustancias
(podan detectar a los D dbiles). Problemas deteccin
de falsos positivos.
En 1977, Romans describi un proceso qumico
mediante el cual se eliminaban los puentes disulfuros
que mantenan rgida la estructura de la IgG,
incrementndose la posibilidad de reaccionar en
salina.
Por ltimo sustitucin de los reactivos policlonales por
monoclonales. Con las ventajas de que estos ltimos
son:
Potentes , vidos y especficos, no tienen
contaminantes, no son donantes dependientes, son
siempre los mismos y se pueden obtener en
cantidades ilimitadas. Posibilidad de mezclar los de
clase IgM con IgG policlonal o monoclonal, con el fin
de detectar los D dbiles.

OBJETIVOS

1.- Al contar con la infraestructura y la experiencia


necesaria, nos hemos propuesto producir un
heterohibridoma, mediante fusin qumica, productor
de un AcMo anti-D til como reactivo hemoclasificador.
2.- Clonar el heterohibridoma una vez obtenido

3.- Caracterizar la inmunoglobulina obtenida

4.- Produccin a escala de laboratorio del AcMo Anti D.


Utilizando para este fin un equipo CELLMAX (artificial
capillary cell culture systems) de Spectrum company.

Diferencias con los ABO.


Tcnicas ensayadas.
1.-Tcnica de inmortalizacin de linfocitos B humanos
sensibilizados con el virus Epstein Barr (VEB),
utilizacin del sobrenadante de cultivo de las clulas
B95.8.- Produccin de clulas linfoblastoides,
productoras de anticuerpos.
Desventajas de esta
clulas en la produccin de anticuerpos, baja
produccin, detencin de esta, poca capacidad de
crecer a baja densidad.
2.- Formacin de hbridos fusinando clulas
linfoblastoides con celulas de mieloma humano. Los
mielomas humanos. No crecen bien, no fusionan bien,
ni tampoco clonan bien.
3.- Produccin de heterohibridomas utilizando como
pareja de fusin clulas de mieloma de ratn deficiente
de HGPRT. Mejores resultados, desventaja la
segregacin cromosmica.
4.- Produccin de triomas, utilizando linfocitos B
transformados por VEB y como pareja de fusin un
heteromieloma (clulas de lneas producto de la fusin
de linfocitos humanos con mieloma de ratn. El
objetivo de este proceder es humanizar el mieloma de
ratn de manera tal que el fenmeno de segregacin se
encuentre menos favorecido.

Empleo de la aminopterina y ouabaina


Evaluacin de sobrenadantes
Clonacin por dilucin limite
An cuando en la actualidad es incuestionable la
utilidad de estos mtodos convencionales, no es
menos cierto que resultan complejos, laboriosos y un
tanto impredecibles.
ltimamente se estn aplicando los conocimientos y
mtodos de la biologa molecular con el fin de omitir
estos inconvenientes. Ej. de ello son el clonaje de
repertorio, donde se inmortalizan los genes en vez de
la clulas de donde ellos provienen, otro Ej. es la
inmunizacin basada en ADN y la utilizacin de ratones
transgnicos.
Agentes fusgenos polietilenglicol (PEG) de diferentes
pesos moleculares, 1500, 4000 cuyo mecanismo de
accin involucra alteraciones de la estructura hdrica
que circunda la cabeza de los grupos polares de los
fosfolpidos de e las membranas celulares. El otro
agente utilizado ha sido la electricidad.
Al utilizar electricidad el fenmeno es conocido como
ELECTROFUSIN .- Es la fusin obtenida por un
campo elctrico, entendindose como tal a la
diferencia de potencial entre dos puntos (electrodos),
dividida por la distancia expresada en cm. C. A.
alineacin, C. D. de alta intensidad y de nuevo C. D.
Con la electrofusin se consigue mejorar
significativamente la eficiencia de fusin .

la

PEG E.F..-13.6x10-6 y 1x10-4ELECTROFUSION E.F..- 1X104


Y 1X10-3
Experiencia al utilizar el electrofusionador Electro Cell
Manipulator 2001 Genotronics inc BTX Instrument
Divisin, (cortesa del Dpto. de Patologa Celular y
Molecular del IVIC)
MATERIALES Y METODOS

Fuente de linfocitos
Separacin de los linfocitos
Transformacin de los linfocitos
Fusin .- El mtodo de transformacin antes descrito y
el de fusin que describiremos a continuacin han sido
una cortesa del Dr. Gregory Halverson (comunicacin
personal), del Banco de Sangre de la ciudad de Nueva
York . A diferencia del Dr. Halverson que utiliza como
pareja de fusin el mieloma mrido P3-X63.Ag8.653,
nosotros utilizaremos el heteromieloma (ratonhumano) K6H6/B5 (ATCC CRL 1823). El cual se produjo
por fusin de un mieloma de raton Balb/c, denominado
N5-1-Ag4 y clulas de un linfoma nodular humano. Es
carente de la HGPRT Y es considerada como una
excelente pareja de fusin para los linfocitos humanos.

METODO

1) Se cuentan las clulas linfoblastoides (CLB), as


como las del heteromieloma y se chequea la
viabilidad (la cual debe ser superior al 90%), las
clulas del heteromieloma se deben encontrar en
fase exponecial de crecimiento, en la tarde
anterior a la fusin se debe cambiar la totalidad
del medio en que han estado creciendo.
Las celulas se mezclaran en las relaciones 1:1, 1:2
y 1:3 (heteromilomas:CLB humanas) y se
centrifugar la mezcla a 400g durante 5 min en
tubo plstico estril de 50 ml.
2) Se desecha el sobrenadante, teniendo en cuenta
que el botn celular debe quedar lo ms seco
posible. Luego este se mezcla bien usando si es
posible un vortex.
3)Se aade 1 ml de PEG 4000 (9g de PEG 4000, 18
ml
de PBS (libre de Ca++ y Mg++), esterilizar y dejar
enfriar, aadir 2 ml deDMSO
4)Se transfiere el tubo que contiene la mezcla celular
a un bao de Mara a 370C y se mueve
constantemente por 90 seg.
5)Se aaden 2ml de PBS lentamente en un periodo
de 2 min. con agitacin constante.
6)Se aaden 2 ml de PBS en un periodo de 1 min.,
como en el paso anterior.

7)Se aaden 5 ml de PBS en un periodo de 2 min.


como en el paso anterior.

8)Se lleva el volumen hasta 20 ml con PBS


aadindolo lentamente y mezclando continuamente
9)Mantngase la mezcla a TA por 15 min
10) Centrifguese a 400g por 5 min. y elimine el
sobrenadante.
Las clulas son muy delicadas en este estadio y se
deben tener muchos cuidados con ellas , Aada medio
de cultivo al botn celular y resuspenda este lenta y
suavemente.
11)Se resuspenden las clulas en un volumen
apropiado de medio de cultivo conteniendo HAT (sin
antibitico). Las clulas se sembrarn a 2x106/ml,
depositndose 100 ul en cada pozo de las placas de
cultivo de 96 pozos.
12)Incbese a 370C en atmsfera de CO2 al 5%,
reemplace el medio de cultivo, a los 7 das por medio
que contenga HT y antibitico.
13)Aproximadamente despus de los 14 das de la
fusin se puede proceder a la deteccin de hbridos
productores de anticuerpos, mediante el mtodo de
aglutinacin en placas.

El medio de cultivo a utilizar al inicio del cultivo es M C


RPMI 1640 con SFB al 10%, 2mM de L-glutamina, 1mM

de piruvato de Na, 10-4M de hipoxantina, 1.6x10-5 de


timidina, 4x10-5 de aminopterina y 10mM de ouabaina. A
los 7 das de iniciado el cultivo, se suprime la
aminopterina y la ouabaina y se aade SNC de la
celulas
J744-2
(productoras
de
factores
de
crecimiento) al 10% y como antibitico gentamicina 5
ug/ml.
Pasadas 4-5 semanas se proceder a calcular la
eficiencia de fusin aplicando para ello la siguiente
formula.
Eficiencia de fusin = Ln (Wt / Wn)x1/N
Donde Wt.- Es el nmero total de pozos sembrados
Wn.-Es el nmero de pozos sin crecimiento de
hbridos
N .- Es el nmero de clulas sembradas en cada
pozo

Una vez obtenido el anticuerpo, se realizar su


caracterizacin inmunoqumica
a) Determinacin de la clase de Ig
Se determinar mediante ensayo inmunoenzimtico
tipo Dot Blot, utilizando como conjugado anticuerpo
anti-IgG y anti-IgM humana unida a peroxidasa.

b)Determinacin de la subclase de IgG


Se determinar mediante una tcnica de ELISA, se
usaran anti- IgG1, Anti-IgG2, anti-IgG3 y anti-IgG4 (de
ratn conjugada a biotina)

EVALUACIN
INMUNOHEMATOLOGICA
RECATIVO OBTENIDO.

DEL

Esta evaluacin se realizar siguiendo el mtodo


recomendado por la Agencia de Administracin de
Drogas y Alimentos (FDA) de los EUA, para la
evaluacin de reactivos de hemoclasificacin, DOCKET
N 845-01181, marzo de 1992

Los aspectos a evaluar sern:


A) Potencia
B) Especificidad
C) Avidez
D) Aglutinacin espontnea
E) Evaluacin del efecto prozona