1

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada perkembangan zaman ini, banyaknya metode yang digunakan untuk memisahkan
berbagai komponen dalam suatu senyawa campuran. Para peneliti juga semakin dipermudah
dengan adanya kemajuan teknologi yang digunakan pada tekhnik pemisahan ini.
Bukanhanya itu, selain alatnya yang sederhana untuk dirancang, metode yang ditemukan
juga bersifat ekonomis karena kesederhanaan dalam penggunaannya. Teknik pemisahan
yang dimaksud adalah kromatografi.
Teknik kromatografi ini sendiri telah dikembangkan dan telah digunakan untuk
memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik
komponen organic maupun komponen anorganik. Kromatografi dapat dibedakan atas
berbagai

macam

tergantung

pengelompokkannya.

Berdasarkan

pada

mekanisme

pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi kromatografi absorbs, kromatografi

partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, kromatografi size eksklusif,
serta kromatografi afinitas. (Gandjar, 2007)
Saat ini, kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan untuk bidang kimia analisis. Baik untuk melakukan analisis kuantitatif, analisis
kualitatif maupun analisis preparative dalam bidang farmasi, lingkungan, industry, dan
sebagainya. Dari berbagai metode yang digunakan, penulis tertarik untuk membahas tentang
kromatografi size eksklusi dimana pada dasarnya, pemisahan berbagai konstituen dengan
meninjau perbedaan ukuran dan geometri molekul. Adanya perbedaan ukuran tersebut,
menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari yang lainnya sehingga
menimbulkan perbedaan permukaa migrasi. Oleh karena itu, pada makalah ini akan dibahas
lebih dalam mengenai teknik kromatografi size eksklusi.
1.2 Rumusan Masalah
1

Berdasarkan latar belakang masalah di atas, penulis merumuskan rumusan masalah

sebagai berikut.:
1 Apa yang dimaksud dengan kromatografi size eksklusi?
2 Bagaimana prinsip kerja dari kromatografi size eksklusi?
3 Bagaimana prosedur pengerjaan kromatografi size eksklusi?
4 Apa saja instrument penyusun kromatografi size eksklusi?
5 Senyawa apa saja yang dapat dimurnikan oleh kromatografi size eksklusi ?
6 Bagaimana cara pengaplikasian kromatografi size eksklusi ?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah di atas, makalah tujuan makalah ini adalah sebagai berikut :
1 Untuk mengetahui tentang kromatografi size eksklusi
2 Untuk mengetahui prinsip kerja dari kromatografi size eksklusi
3 Untuk mengetahui prosedur pengerjaan kromatografi size eksklusi
4 Untuk mengetahui instrument penyusun kromatografi size eksklusi
5 Untuk mengetahui Senyawa apa saja yang dapat dimurnikan oleh kromatografi size eksklusi
6 Untuk mengetahui cara pengaplikasian kromatografi size eksklusi

1.4 Manfaat
Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik kromatgrafi size eksklusi
teoritis maupun kromatgrafi size eksklusif praktis. Kromatgrafi size eksklusi teoritis makalah ini
berguna sebagai pengembangan wawasan tentang kromatografi size eksklusi. Kromatgrafi size
eksklusi praktis makalah ini diharapkan bermanfaat bagi:
1 Penulis, sebagai sarana penambah wawasan dan pengetahuan khususnya tentang
kromatografi size eksklusi.
2 Pembaca, sebagai media informasi tentang kromatgrafi size eksklusi.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Kromatografi Size Eksklusi

Kromatgrafi size eksklusi adalah metode kromatografi molekul dalam larutan yang
dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Nama lain dari kromatgrafi size eksklusi yaitu gel
filtration

chromatography

(GFC),

gel

permeation

chromatography

(GPC),

gel

chromatography, steric exclusion chromatography, dan exclusion chromatography. Kata

gel merupakan konotasi dari fase diam yang digunakan yaitu gel organik yang semirigid

dan nonrigid, sedangakan kromatgrafi size eksklusi fase diamnya yaitu gel yang organic atau
organic yang rigid.
Kromatgrafi size eksklusi biasa digunakan dalam pemisahan molekul yang besar atau
kompleks makromolekul seperti protein. Untuk pemisahan yang biasanya makromolekul
dalam fase gerak larutan disebut Gel Filtration Chromatography sedangkan ketika pemisahan
dilakukan di dalam fase gerak non-larutan disebut Gel Permeation Chromatography.
2.2 Prinsip Kromatografi Size Eksklusi
Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase diam. Solut dengan
ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-pori adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut
dengan ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu. Berikut gambar
proses pemisahan menggunakan kromatografi size eksklusi (Sastrohamidjojo, H. 1985).

Gambar 2.1 Proses pemisahan kromatografi size eksklusi (Mori, Sadao., 1999)
2.3 Prosedur Kromatografi Size Eksklusi
Sebelum melakukan pemisahan atau pemurnian zat dilakukan terlebih dahulu dilakukan
persiapan seperti pemilihan fase gerak dan fase diam, persiapan sampel yang akan dipisahkan
setelah itu barulah dilakukan proses pemisahan menggunakan kromatografi size Eksklusi.
Berikut ini tahapa-tahapan untuk melakukan pemisahan menggunakan kromatografi size
Eksklusi :
1. Pemilihan fase gerak
Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam

b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem kromatgrafi size eksklusi sehingga
dapat dijalankan dengan range tekanan yang normal.
c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang kuat dengan fase diam
(contoh: lewat adsorpsi).
Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase gerak larutan, fase gerak organik atau
dalam larutan buffer.

2. Pemilihan fase diam

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga
solute dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.. Fase
diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:
a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel
b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak, tetapi tidak mengalami efek
pembengkakan.
c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur
d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran pori sehingga dapat
melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai.
Fase diam yang digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa, poliakrilamid atau
silika yang memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran pori yang ada pada fase diam
ini berkisar 60-4000 dengan ukuran partikel berkisar 5-10 m dengan efisiensi ribuan
theoritical plate setiap 15 cm kolom. Untuk fase gerak organik, kolom yang biasa
digunakan yaitu crosslinked (dengan difinilbenzen) gel polistiren atau trimetilsilane
turunan silika. Untuk fase gerak larutan yang digunakan yaitu crosslinked hidroksilat
polimetakrilat atau gel poli(propilen oksida) atau gliseril (diol) turunan silika. Contoh
fase diam yang dapat digunakan pada Size Exclusion Chromatography:
Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis dari
polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil menyebabkan dekstran

menjadi polar sehingga dapat direaksikan dengan epiklorhidrin CH2(O)CHCH2Cl.

Polimer yang terjadi dapat dikontrol dengan penambahan asam.

Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat dengan
kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N metal-bis-akrilamid. Senyawa ini tidak

larut dalam air maupun beberapa pelarut organik.

Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul >500.000 ,
dinamakan juga Bio-Gel A. dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga agak lunak

dan tidak tahan tekanan tinggi.

Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali dalam
air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel dibuat dari
polistiren yang tahan pada suhu di atas 150C. berat molekul senyawa yang dapat

dipisahkan antara 16.000 40.000 dalton.

3. Penyiapan sampel
Sampel harus bebas dari patikel, terutama untuk partikel yang berukuran 34 mikrometer
atau kurang; kemudian dilakukan ekstraksi clean up, sentrifugasi dan filtrasi. Campuran
ekstrak sampel kemudian difiltrasi, dimana campuran sampel terbut melewati membran filter
yang memisahkan sampel padat dari solut. Kemudian pelarut mencuci sampel dari filter ke
bejana pengumpul. Dua atau tiga kali dicuci dapat mencegah pengurangan sampel. Kemudian
sampel disentrifugasi dan ekstras didecanter dan dipisahkan. Residual sampel dicuci 2 sampai
3 kali. Buffer sampel tidak sama dengan buffer kolom. Buffer sampel yang dipilih adalah
buffer yang membantu stabilitas dan aktivitas protein. Buffer harus mempertahankan
kapasitasnya dan pH yang konstan. Buffer yang dapat digunakan yaitu 0.05 M Natrium
fosfat, 0.15 M NaCl pH 7 atau buffer sampel dimana proteinnya dapat larut dan stabil. Halhal yang perlu diperhatikan pada waktu preparasi sampel:
a. Sampel harus larut semuanya. Lakukan sentrifugasi atau filtrasi untuk memisahkan
partikel yang tidak larut.
b. Temperatur kolom dan buffer harus sama untuk menghindari masuknya udara ke dalam
kolom

c. Jika menggunakan sampel yang baru gunakan 0.55 mM Natrium Fosfat, 0.5 mM NaCl,
pH 7
d. Jika menggunakan konsentrasi yang tinggi, turunkan kecepatan sentrifugasi dan
perpanjang waktu.
4. Pemisahan Zat
Sampel diperlihatkan setelah injeksi pada kepala kolom, fase gerak melewati kolom
dengan laju aliran yang tetap, dengan tekanan gradient pada seluruh panjang kolom. Sampel
sudah masuk ke dalam kolom, partikel dari fase diam merupakan pori-pori dengan ukuran
pori yang dikontrol. Molekul yang lebih kecil mampu untuk menembus pori-pori ketika
melewati kolom, tetapi yang molekul lebih besar terlalu besar untuk masuk kedalam poripori fase diam dan hanya berada di daerah interstitial. Molekul yang lebih kecil tertahan
sebentar pada pori yang dimasuki, hingga molekul yang lain masuk ke dalam pori. Molekul
yang lebih besar mengalir lebih cepat karena mereka tidak masuk ke dalam pori-pori fase
diam. Akhirnya dua molekul tersebut dipisahkan dan menjadi 2 peak kromatogram yang
berbeda.
2.4 Instrumentasi Kromatgrafi Size Eksklusi
Kromatgrafi size eksklusi umum instrumen kromatgrafi size eksklusi yang terdiri
dari sebuah pompa untuk mendorong pelarut melalui instrumen, port injeksi dilakukakan
untuk memasukkan sampel ke kolom, dan kolom berfungsi untuk menahan fase diam,
sedangkan detektor berfungsi untuk mendeteksi komponen ketika sampel meninggalkan
kolom, kemudian software akan

berfungsi untuk mengontrol bagian-bagian yang berbeda

dari instrumen dan menghitung dan menampilkan hasil.

Gambar 2.2 Diagram sistematik perakitan khas kromatografi size eksklusi

Pengukuran kromatgrafi size eksklusi dapat dilakukan dengan pengukuran HPLC,
dimana sistem terdiri dari penghantar pelarut, sistem mekanisme, dan sistem deteksinya.
sistem penghantar pelarut adalah rangkaian reservoir pelarut, degasser dan pompa aliran
pelarut. Sistem pemisahan terdiri dari injector sampel dan kolom kromatgrafi size eksklusi.
Sistem deteksi terdiri dari detektor, perekam strip-chart dan tabung pembuangan. Sistem
penanganan data digunakan untuk menganalisis kromatgrafi size eksklusichromatogram dan
menghitung rata-rata berat molekul sampel. Pengukuran dapat digunakan di tempat perekam
strip-chart. Autosampler (autoinjector) yang digunakan untuk menyuntikkan sampel solusi
ke sistem pemisahan pada interval tertentu yang juga dapat digunakan dengan instrumen
HPLC.
Komponen yang digunakan dalam system kromatografi ini antara lain :
1.Kolom
Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul zat yang akan dipisahkan.
Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu dipisahkan jika
digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.

Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva kalibrasi
tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan dengan jelas karena
distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka akan dihasilkan kurva
dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-senyawa yang memiliki ukuran
molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang rendah jika rentang kerja BM-nya
besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka akan didapat kurva yang lebih mendatar.
Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi lebih kecil tetapi daya pisah molekul yang
memiliki ukuran hampir sama akan meningkat. Pemisahan optimum komponen-komponen
suatu senyawa sampel yang memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat diperoleh jika
kolom eksklusi memiliki rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap rangkaian kolom dapat
dihasilkan kurva kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan
menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya, kemudian
menentukan VR masing-masing. Dengan demikian, kromatgrafi size eksklusimerupakan
suatu metode cepat yang dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul
(BM) suatu sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku.
Untuk memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan
senyawa standar baku haruslah sama.
2. Fase Gerak
Fase gerak dalam kromatgrafi size eksklusiharus merupakan pelarut polimer yang baik
untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai
dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar
pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan agregat.
Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi peningkatan
tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu besar. Efek tersebut dapat diatasi
dengan cara memilih pelarut lain, atau meningkatkan temperatur kolom.

10

Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi disagregasi,
sedangkan beberapa polimer seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis pada suhu
tinggi (140-1500 C). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka fase gerak yang
bersifat toksik tidak dapat digunakan (contoh: triklorobenzen), sehingga perlu dipilih fase
gerak yang lain. Fase gerak dalam kromatgrafi size eksklusiterbagi menjadi dua bagian
besar, yaitu:
a. Fase gerak untuk protein dan polimer larut air
kromatgrafi size eksklusisering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan
agregat, desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk
mengetahui sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi,
dan sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:

Silika

Jenis kolom SW, SWxI, dan Super SW digunakan untuk menganalisis protein dan asam
nukleat, menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.

Polimetakrilat

Jenis kolom PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer karida, asam nukleat virus,
menggunakan fase gerak berupa larutan buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang
digunakan untuk menganalisis polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan
garam encer.
3. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor yang
berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis. Intensitas detektor
direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikalibrasi dengan menggunakan
polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat dilakukan dengan evaluasi berat
molekul dan distribusi berat molekul menggunakan detektor sinar menyebar (light scatter

11

detector), berat molekul polimer dapat ditentukan kromatgrafi size eksklusi langsung dan
tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu.
Untuk mendapatkan data yang tepat dan akurat dapat digunakan kromatgrafi size
eksklusi, dimana terdapat sedikit perbedaan pada alat yang digunakan dalam HPLC
konvensional. Ada beberapa ketentuan yang perlu diperhatikan dalam kromatgrafi size
eksklusi. Pertama, perlu digunakan pompa kualitas tinggi yang membuat laju alir lebih
konstan dalam memompa pelarut yang digunakan. Kedua, katup loop harus digunakan untuk
menyuntikkan larutan sampel, dan ketiga, suhu kolom harus dijaga agar konstan.
2.5 Senyawa Yang Dapat Dimurnikan Oleh Kromatografi Size Eksklusi
Kromatgrafi size eksklusiumumnya diaplikasikan untuk kompleks
olekuler seperti

protein

dan

polimer

industri

terutama

digunakan

makrom
untuk

memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot
molekul dari polimer (Mori, Sadao., 1999).
2.6 Aplikasi Kromatografi Size Eksklusi
Dalam jurnal karya Widyastuti W1., Agus Ariyanto1, Gina M1., Arina K2 , dan A.
Nawawi2, A. Mutalib yang berjudul Penandaan Falerin Dengan Iodium-131 Dan Uji
Biodistribusi Pada Mencit Yang Diinflamasi. Dalam jurnal ini dibahas tentang pengaplikasian
kromatografi size eksklusi untuk memisahkan senyawa falerin yang terkandung dalam daun
dan buah mahkota dewa. Berikut resume jurnal dalam pengamplikasian kromatografi size
eksklusi dalam memisahkan senyawa.
Falerin adalah senyawa aktif yang terkandung dalam daun dan buah mahkota
dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl) yang telah dibuktikan mempunyai efek anti
inflamasi. Penandaan falerin dengan radionuklida pemancar gama bertujuan untuk
mengamati perilaku farmakokinetika falerin di dalam tubuh khususnya untuk merunut
metabolitnya. Telah dilakukan penandaan pada falerin dengan 131I menggunakan pereaksi

12

iodogen. Hasil penandaan dikarakterisasi dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
menggunakan fasa gerak metanol 70% dan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan
sistem pengembang kloroform-metanol (9:2) dan efisiensi penandaan ditentukan dengan
kromatografi lapis tipis menggunakan eluen yang sama. Produk dimurnikan

dengan

kromatografi eksklusi ukuran menggunakan kolom sephadex G-25 dan fasa gerak larutan
dapar fosfat 0,05 M pH 7,4.
Serbuk sephadex G-25 disuspensikan dalam salin, kemudian dimasukkan ke dalam
kolom diameter 0,5 cm dan tinggi 2,5 cm yang bagian bawahnya telah ditutup dengan
kapas bebas lemak. Lapisan atas sephadex G-25 ditutup dengan kapas bebas lemak,
kemudian kolom dicuci dengan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,4. Larutan falerin hasil
penandaan dimasukkan ke dalam kolom dan dielusi dengan larutan dapar fosfat. Tiap 200
l

eluat ditampung

dalam

tabung reaksi

kecil

dan

tiap fraksi

tersebut

diukur

radioaktivitasnya dengan alat pencacah gamma. Fraksi yang memiliki radioaktivitas paling
tinggi kemudian dianalisis kemurnian radiokimianya menggunakan KLT dengan fase diam
strip TLC-SG

dan eluen campuran

kloroformmetanol

(9:2),

kemudian diukur

radioaktivitasnya dengan alat pencacah gamma.

Hasil penandaan falerin dengan 131I dimurnikan dengan kromatografi eksklusi
menggunakan kolom sephadex G-25 dan eluen larutan dapar fosfat pH 7,4 0,05 M untuk
memisahkan falerin bertanda 131I dari pengotor 131I bebas karena perbedaan berat
molekulnya. Sebagai pembanding dilakukan hal yang sama terhadap larutan Na131I, dan
falerin bertanda terelusi lebih dahulu dibandingkan dengan 131I bebas.

13

Gambar 2.3 Hasil Analisis Pemurnian Kromatografi Size Eksklusi.

Dari gambar diatas menunjukan hasil analisis pemurnian kromatografi size eksklusi,
dimana disebalah kiri adalah senyawa falerin dan sebelah kanan adalah NaI sebagai
pembanding. Hasil KLT falerin bertanda yang telah dimurnikan menunjukkan kemurnian
radiokimia 96,0 0,4% dengan pengulangan sebanyak 3 kali.

14

BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan

kromatgrafi size eksklusi adalah metode kromatografi molekul dalam larutan yang
dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Prinsip kerja dari kromatgrafi size eksklusiadalah
Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase diam. Solut dengan ukuran
kecil akan masuk ke dalam pori-pori adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut dengan
ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu. Biasanya kromatgrafi size
eksklusidigunakan dalam pemisahan molekul yang besar atau kompleks makromolekul
seperti protein.

15