LABORATORUL 2, 3

Examinarea viabilitii i germinaiei polenului

Polenul - Caracteristici generale

Seciunile transversale n anterele aflate n diferite stadii pun n eviden existena unei
mase de celule meristematice omogene (la nceput); diferenierea irurilor de celule
hipodermice care formeaz arhesporul (ntru-un stadiu mai avansat); diviziunea repetat a
celulelor anterei i diferenierea stratului parietal primar ca i a stratului sporogen primar.
Straturile parietale care apar puin mai trziu sunt: epiderma, endoteciu, cteva straturi
mijlocii i stratul cel mai intern numit tapet, a crui importan fiziologic este deosebit
deoarece servete la hrnirea sporilor.
Nucleul celulelor tapet se poate divide n mai multe feluri: prin mitoz normal, printrun tip de diviziune adeziv i prin endomitoz. La unele plante exist tapet glandular sau
secretor, la altele, tapet ameboid.
esutul sporogen ia natere din celulele sporogene primare. Unele din celulele
sporogene degenereaz frecvent i sunt absorbite de restul celulelor.
Diviziunile celulelor mam de microspori pot fi de tip succesiv sau de tip simultan. n
primul caz, dup prima diviziune apare o plac celular iar dup a doua diviziune meiotic
placa ecuatorial apare n fiecare din cele dou celule fiice. La tipul simultan, cnd cele
diviziuni meiotice s-au ncheiat celula mam se separ dintr-o dat n patru pri.
Microsporii rezultai n urma diviziunilor celulelor mam de microspori sunt dispui n
tetrade care pot fi de diferite tipuri.
Elementele distincte ale polenului de angiosperme sunt axa polar, axa ecuatorial i
polii.
Granulele de polen au diferite forme: sferice, ovale, ngust sau lat elipsoidale,
etc.
Membrana polenului are o alctuire complex deosebindu-se spre exterior exina
format din ectexin i endexin.
Exina poate fi neted sau acoperit de tuberculi ori fosete de forme i mrimi diferite,
la unele predominnd elementele pozitive, iar la altele cele negative.
Aperturile sau deschiderile germinative cuprind colpii i porii. Colpii au forme diferite
i se pot forma odat cu granula (avnd margini regulate) sau mai tardiv comparativ cu
granula (cu margini neregulate).
Monocotiledonatele au n general un colpus, iar dicotiledonatele au de obicei 3 colpi,
dar numrul lor poate fi cuprins intre 2 i 30. Porii pot fi acamerai (acamerai) sau camerai
(vestibulari). Principalele tipuri morfologice de polen de la angiosperme sunt: polen
inapertural, monoporat, monocolpat, tricolpat, tricolporat, tetracolporat, pericolporat.
La suprafaa exinei i chiar n coninutul ei exist substana numit sporopolenin care
d culoarea i miros polenului.
La microscopul optic se pot observa citoplasma i cei doi nuclei - unul vegetativ i
unul generativ nconjurai de o membran rezistent. Aspectul exterior al granulei de polen

este caracteristic fiecrei specii permind identificarea att a speciilor florale existente astzi
ct i acelor aparinnd unor timpuri ndeprtate.
Compoziia chimic a polenului este predominant proteic, dar n coninutul ei se afl
i glucide, lipide, vitamine, enzime, substane minerale, principii bactericide, fitohormoni i
alte substane. Concentraia acestor substane este diferit la diferite sorturi de polen.
n polen se gsesc toi aminoacizii eseniali i parial eseniali ca i majoritatea celor
neeseniali.
Glucidele se afl n polen n cantitate mare sub form de monozaharide (pentoze i
hexoze), dizaharide i polizaharide.
n cantiti variabile (1%-14,44%) au fost identificate n polen lipidele. Prin calcinarea
polenului s-au obinut toate macroelementele i majoritatea microelementelor.
Capacitatea de acumulare a srurilor n polen este legat de specie i depinde de zona
n care s-a dezvoltat planta.
Pe lng aceste componente, n polen se afl vitamine, att liposolubile ct i
hidrosolubile. Acestea au rol deosebit att pentru capacitatea de adaptare a organismului la
solicitri fiziologice ct i pentru aprarea de diferii ageni patogeni.
Enzimele, proteine dotate cu funcii catalitice specifice, sunt i ele prezente n polen,
fiind necesare metabolizrii substraturilor externe i interne, substraturi eseniale procesului
de germinare.
Ajungnd pe stigmatul florii, polenul germineaz, filamentul hialin numit tub polenic
strbate stigmatul, stilul i ajunge n cavitatea ovarian ptrunznd n sacul embrionar unde
are loc fecundaia. n urma acestui proces ovulele fecundate devin semine i se dezvolt
odat cu ovarul care formeaz fructul.

Determinarea viabilitii polenului

Principiul tehnicii :
Pentru a ne putea da seama de viabilitatea polenului, folosim substane care leag H 2
catalizat de dehidraze rezultnd o nou substan colorat (formazam) care va distinge polenul
viu de cel mort.
Materiale necesare :
- reactivul 2,3,5- trifeniltetrazol clorid (trifeniltetrazolium chloride), praf de culoare
glbuie, uor solubil n ap, otrvitor.
- amestec fosfatic (tampon) Sorensen.
Modul de preparare:
Se pregtete un amestec fosfatic tampon 0,1N cu pH = 7,2 n care se dizolv reactivul
trifeniltetrazol clorid 1mg la 1ml de amestec tampon ; se obine o soluie de 0,1%.
Soluia tampon 0,1 N se pregtete astfel :
Soluia A
- 11,8 g Na2HPO4 .2H2O se dizolv n
- 1000 ml ap distilat
Soluia B
- 13,6 g KH2PO4 se dizolv n
- 1000 ml ap distilat.
Soluiile A i B se amestec n proporie de 7 : 3 pentru a atinge pH = 7,2. Se recomand ca
amestecul s se fac n ziua pregtirii soluiei de trifeniltetrazol clorid. Aceast soluie se va
putea folosi atta timp ct i va pstra transparena.
Modul de lucru :
- pe o lam de sticl se presar puin din polenul supus controlului de viabilitate ;

cu o pipet se adaug 1 2 picturi din amestecul tampon i se las 3 4 minute n

contact ;
- amestecul tampon se absoarbe (foarte atent!) cu o hrtie de filtru ;
- se adaug 1 2 picturi din soluia de 0,1% trifeniltetrazol clorid ;
- se acoper cu lamela ;
- se introduce n termostat pentru 20 30 minute la temperatura de 370C.
Determinarea viabilitii polenului:
- se analizeaz la microscop, 3 5 preparate, cte 5 cmpuri microscopice din fiecare
preparat ;
- se numr, n cmpurile microscopice, granulele de polen roii ;
- polenul neviabil i pstreaz culoarea galben iniial.
Observaii:
- tehnica prezentat a fost folosit cu rezultate bune pentru determinarea viabilitii
seminelor i a unor esuturi ;
- soluiile A i B, nchise ermetic pot fi pstrate o perioad de cteva luni, n condiii de
laborator ;
- substana 2,3,5 trifeniltetrazol clorid se folosete n bacteriologie pentru determinarea
germenilor vii ;
- n zilele de var, cu cer senin, polenul viabil va avea un colorit mai intens dect n
zilele noroase ;
- polenul cu viabilitate parial se coloreaz n rou deschis.
Metoda cu soluie carmin acetic
Modul de lucru:
- anterele mature se strivesc pe o lam ntr-o picatur de soluie carmin acetic;
- granulele viabile se coloreaz n rou ; cele nevii apar incolore i zbrcite.

Determinarea capacitii de germinare a polenului

Materiale necesare:
- polen viabil, lame i lamele, soluie carmin acetic sau orcein- acetic.
Mod de lucru:
- se colecteaz polen n momentul nfloririi depline a florilor: se pune pe o lam ntr-o
pictur de carmin-acetic sau orcein-acetic, se las 2 3 minute pentru a se colora,
dup care se acoper cu lamela.
Observaii:
Polenul are forme diferite, de granule acoperite de verucoziti. Din loc n loc, pe suprafaa
exinei se vd ngrorile de celuloz ale intinei, care astup porii exinei.
n interior se afl dou nuclee rezultate din diviziunea nucleului iniial: unul sferic, mare,
nconjurat de citoplasm abundent, numit nucleu vegetativ, cellalt, mai mic, lenticular,
numit nucleu generativ.
Polenul fertil se coloreaz n rou; polenul steril rmne incolor sau de culoare galben i
zbrcit. Valorile obinute pot fi apreciate ca fiind orientative.

Determinarea numrului de pori germinativi

Numrul de pori germinativi constituie un criteriu pentru identificarea i delimitarea
speciilor poliploide.
Materiale necesare:
3

gruncioare de polen de la mai muli indivizi ai aceleiai specii, lame, lamele,

glicerin, acid sulfuric, acid acetic glacial.
Mod de lucru:
Polenul proaspt colectat, se pune pe lam ntr-o pictur de reactiv (acid sulfuric 1 parte +
acid acetic glacial) i albastru de metilen (sau carmin acetic) 2 pri. Se las 10 minute timp
n care se dizolv exina din dreptul porilor germinativi, delimitndu-i clar. Se analizeaz apoi
la microscop cu un obiectiv puternic. Numrul porilor germinativi la granulele de polen de la
formele diploide variaz ntre 1 3 ; la cele poliploide numrul de pori germinativi variaz
ntre 4 6.
Mediu pentru germinarea polenului
Este dependent de specia analizat:
- 0,5% agar agar
- 0,5% glucoza (pentru Solanum lycopersicon)
- 2% glucoza (Glycine max)
- 10% glucoza (Allium cepa)
- 0,01% H3BO3
Temperatura optim de germinare:
Este dependent de specia analizat:
- 300C Solanum lycopersicon
- 250C Glycine max
- 200C Allium cepa
Observaii:
- capacitatea de germinare a polenului este influenat de: t 0C, vrsta polenului, specia
de plant i mediul de cultur ;
- cantitatea de glucoz i t0C optim se stabilesc experimental.

Realizarea culturilor de tuburi polinice

Soluii nutritive:
Soluia 1:
- 10-20% zahr (se determin pentru fiecare specie)
- 100 ml ap ;
- urme de acid boric / acid citric.
Soluia 2:
- ap de robinet.
Soluia 3:
- 1 g agar agar,
- 100 ml ap ;
- urme de acid boric.
Soluia 4:
- 1,5 g gelatin ;
- 100 ml ap ;
- urme de acid boric
Modul de lucru:
- se unge o lam cu soluie nutritiv (mediile 3 i 4 se ntind la cald) ;
- se presar polen matur (granule dese) ;
- nu se acoper cu lamela!
- se controleaz la 15 30 minute (unele specii germineaz mai bine la ntuneric, altele
la lumin) ;

polenul de Impatiens sultani, de exemplu, germineaz n 30 minute ntr-o soluie de

10% zahr.
Tehnica cu celofan:
- soluia 1 sau 2 se ntinde pe lam;
- se acoper cu o foi de celofan pe care se disemineaz polen.
Examinarea tuburilor polinice:
Se examineaz, n stare vie, n contrast de faz astfel:
se coloreaz cu carmin acetic ;
- materialul se include n celodal prin adugarea acestuia peste colorant (celodalul este
n prealabil tratat cu 10% acid acetic (pn la 30%) i cu 5% acid carmin acetic;
- se aplic lamela (fr s se formeze bule de aer!) ;
Observaii:
- n soluii cu concentraii mici de zahr polenul germineaz mai devreme iar n soluii
mai concentrate tendina de plesnire a tuburilor polinice este mult mai redus;
- adugarea unei urme de acid boric sau citric accelereaz germinaia ;
- includerea n celodal pstreaz coloraia mult timp; celodalul poate fi folosit i la
permanentizarea preparatelor prin etalare.
Atenie!
- lamelele cu tuburi polinice germinate vor fi meninute permanent umede