Introduction

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La coloration différentielle ou coloration de gram est l’étape essentielle de l’identification bactérienne, surtout dans le domaine médical, à partir d’une culture pure (culture pure contenant une seule espèce), elle est aussi appelée coloration V.L.A.F (Violet, Lugol, Alcool, Fuschine) La coloration de gram est un caractère « Tinctorial » c’set à dire l’affinité de la cellule bactérienne à se colorer.

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui a mis au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.

But :
La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie médicale; elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (Gram -). L'intérêt de cette coloration est de donner une information rapide et médicalement importante.

Principe :
La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le cristal violet, d'iode puis d'un mélange d'alcool et d'acétone. Dans un premier temps, le colorant pénètre dans la paroi et le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode réagit avec le colorant et le rend insoluble. La perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif à l'alcool permet la décoloration. Les bactéries à Gram positif restent colorées en violet ou mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose) permet de visualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif.

Mode opératoire :
 Réactif :

- le violet phénique : violet de gentiane (Crystal de violet) + alcool absolu + eau phéniquée - liquide de Lugol : iode + iodure de potassium + eau distillée - alcool 96° (agent de décoloration) - solution de fuschine ou de safranine (colorant de contraste) : solution de fuschine saturée a l’alcool+eau distillée  Matériels :

-Microscope optique, lame, bec de bunsen, pipette pasteur, anse de platine, huile de cèdre, ainsi que le matériel habituel du laboratoire de Microbiologie.

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Préparation du Frottis :

En effectuant une fixation simple à l'eau et à la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, déposer une goutte d'eau stérile. Ajouter à l'anse de platine stérilisée une goutte de la colonie isolée. Étaler et fixer à la chaleur à environ 40°C pendant 10 à 15 minutes. Poser la lame séchée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.

Réalisation de la coloration :

1- Coloration primaire : Coloration par le violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau déminéralisée. 2- Mordançage au lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 60 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de sécurité. 3- Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange alcoolacétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée. 4- Contre-coloration à la safranine ou à la fuchsine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.

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Lugol

Décolorisation

Contre-coloration par la Safranine ou la Fuschine Les étapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de la bactérie. Le violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne. L'étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites « Gram négatives ». En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycanes - donc plus fine - qui va laisser passer l'alcool (molécule lipophile) ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites « Gram positif » la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée d'une « couche » de peptidoglycanes plus importante donc de ce fait ; plus épaisse. Elles resteront alors violettes. L'étape 4 est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries Gram négatives précédemment décolorées une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme. la coloration de Gram permet de différencier la paroi bactérienne et de scinder les bactéries en deux grand groupes: - Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes épaisse (ex : Bacillus cereus) - Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus une membrane externe lipidique (ex : Escherichia coli). Ces différences de coloration et les différences de formes (bacille ou cocci) sont à l'origine de la classification des bactéries.

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- Observer

avec une goutte d'huile à immersion objectif 100 (grossissement ×1000).

Staphylococcus (cocci) en couleur violet (Gram+) X100 a immersion

E.coli (cocco bacille) en couleur rose (Gram-) X100 a immersion

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Conclusion :

Compaaison entre les bacteries Gram+ et Gram-

La paroi des bactéries Gram positives montre un peptidoglycane épais, jusqu'à 80nm d'épaisseur, constitué par un empilement de la structure décrite précédemment. On note aussi la présence d'acides téchoïques (polymère à base de ribitol et glycérol phosphate) qui traversent le peptidoglycane. Certains sont ancrés directement dans la membrane plasmique par l'intermédiaire d'une partie lipidique et portent le nom d'acides lipotéchoïques. Ces molécules, dont la fonction reste assez floue, montrent une grande variabilité au sein du monde microbien. Ils sont utilisés, comme marqueurs antigéniques, pour la classification des streptococcus à travers la classification de Lancefield. Remarque : Une bactérie gram + qui perd son peptidoglycane (par action d'antibiotique ou du lysosyme) devient un protoplaste. La paroi des bactéries Gram- montre une structure différente de la paroi des Gram+. Elles possèdent une membrane externe en plus du peptidoglycane (structure commune aux Gram+ et Gram-) qui est ici très fin puisque sa taille moyenne n'est que de quelques nanomètres avec souvent seulement une ou deux couches de la structure montrée plus haut. La membrane externe, qui entoure la cellule (peptidoglycane compris) ressemble à une membrane biologique classique : double couche de phospholipides incluant des protéines (des porines pour le passage des nutriments par exemple); mais la couche externe de cette membrane externe contient une molécule particulière : le LPS ou LipoPolySaccharides ou encore endotoxine. Le LPS est spécifique des bactéries Gram négatives. Comme son nom le laisse penser, le LPS possède une partie lipidique : le lipide A. Cette partie hydrophobe possède aussi l'activité toxique que montre la molécule (provoque la fièvre par exemple). Le reste de la molécule est uniquement glucidique avec la partie centrale ou core (nombreux glucides rares avec 7 carbones par exemple) et la partie la plus externe ou Antigène O. L'antigène O est très variable chez les Gram-, cette diversité est par exemple utilisée pour le sérotypage des Salmonella. La membrane externe crée une barrière imperméable, comme la membrane plasmique, qui délimite, enfermé par ces 2 membranes, l'espace périplasmique. Il contient de nombreuses enzymes.

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