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DNA recombinante

DNA recombinante

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TECNOLOSÍA DEL DNA RECOMßINANTE

INTRODUCCIÓN
Principio I970 DMA moIecuIo mos difíciI onoIizor
Enormemenfe Iorqo
Cuímicomenfe monofono
AcfuoImenfe DMA moIecuIo mos fociI de esfudior
Es posibIe seporor reqiones deferminodos deI DMA
ObfenerIos en confidodes procficomenfe iIimifodos
Deferminor su secuencio de nucIeofidos o uno
veIocidod de vorios cienfos de nucIeofidos oI dío.
Un qen puede ser oIferodo y fronsferido o ceIuIos
en cuIfivo o o Io Iíneo qerminoI de onimoIes
Impocfo en Io bioIoqío ceIuIor
Deferminor Ios funciones de muchos profeínos
De sus dominios
Desenmoroñor compIe¡os meconismos de requIocion
qenico en eucoriofos
Disponer de qrondes confidodes de profeínos
minoriforios
A niveI comercioI: produccion o qron escoIo de hormonos
pepfídicos y vocunos o bo¡o cosfe y frobo¡o
Etupus principuIes deI desurroIIo de Iu
tecnoIoqíu deI DNA Recombinunte
Nirenberq, Ochou y khorunu diIucidoron eI codiqo qenefico I9oo
AIber proporciono Io primero evidencio de Io exisfencio de Ios
nucIeosos de resfriccion deI DMA, que condu¡o o su posferior
purificocion y ufiIizocion en Io corocferizocion de Io secuencio deI
DMA por porfe de Nuthuns y H Smith
I9oZ
SeIIer descubrio Io DMA Iiqoso, Io enzimo ufiIizodo poro unir
froqmenfos de DMA.
I9o7
Se desorroIIoron Ios fecnicos de cIono¡e deI DMA en Ios
Ioboroforios de ßoyer, Cohen, ßerq y coIoborodores, en Io
Universidod de Sfonford y en Io Universidod de CoIifornio en Son
Froncisco.
I97Z-I973
Southern desorroIIo Io hibridocion y fronsferencio sobre qeI,
poro Io defeccion de secuencios específicos de DMA
I97b
Sunqer y ßurreII y Mu×um y SiIbert desorroIIoron mefodos
ropidos de secuenciocion deI DMA
I97b-I977
PuImiter y ßrinster produ¡eron un rofon fronsqenico: SprudIinq
y Rubin produ¡eron moscos deI vinoqre fronsqenicos.
I98I- I98Z
Miescher oisIo por primero vez eI DMA
MuIIis y coIoborodores invenforon Io reoccion en codeno de Io
poIimeroso (PCP, de PIomerose Choin Peocfion)
I98b
Murmur y Doty descubrieron Io renofuroIizocion deI DMA,
esfobIeciendo Io especificidod y Io posibiIidod de Ios reocciones
de hibridocion de Ios ocidos nucIeicos.
I9oI
kornberq descubrio Io DMA poIimeroso I, Io enzimo que ohoro se
ufiIizo poro producir sondos de DMA morcodos
I9b7
Wutson y Crick propusieron eI modeIo de Io dobIe heIice poro Io
esfrucfuro deI DMA, bosodos en Ios resuIfodos de royos X de
FrunkIin y WiIkins
I9b3
Avery demosfro que eI DMA y no Io profeíno confiene Io
informocion qenefico
I944
I8o9
TecnoIoqíu deI DNA Recombinunte
Se pueden oIferor secuencios de DMA produciendo
versiones modificodos de Ios qenes, Ios cuoIes se
pueden reinserfor en ceIuIos u orqonismos.
Inqenieríu qénicu
Se puede consequir que un froqmenfo de DMA se
infeqre en un eIemenfo qenico ouforepIiconfe
(pIosmidos, virus) que hobifo en uno bocferio, de foI
monero que de uno moIecuIo de DMA puede ser
reproducido qenerondo muchos miIes de miIIones de
copios idenficos.
CIonución deI DNA
Hoce posibIe IocoIizor secuencios deferminodos de
DMA o de PMA, con uno qron exocfifud y
sensibiIidod, ufiIizondo Io copocidod que fienen esfos
moIecuIos de unirse o secuencios compIemenforios de
ofros ocidos nucIeicos.
Hibridución de Ios
ácidos nucIeicos
Lo secuenciocion ropido de fodos Ios nucIeofidos de
un froqmenfo purificodo de DMA, hoce posibIe
deferminor Ios Iímifes precisos de un qen y Io
secuencio de ominoocidos que codifico.
Secuenciución
Pofuro específico deI DMA, fociIifo enormemenfe eI
oisIomienfo y Io monipuIocion de Ios qenes individuoIes
UtiIizución de
nucIeusus de
restricción
Tecnicos ufiIizodos
EndonucIeusus de restricción
Los qenes no son enfidodes independienfes
Peqiones de uno moIecuIo de DMA de qron fomoño
Froqmenfocion meconico oI ozor
Trozos pequeños
Un froqmenfo que confenqo un qen oisIodo sero
uno enfre cienfos de miIes
SoIucion: endonucIeusus de restricción
W. Arber, H. Smifh y D. Mofhons finoIes o0
8isfuríes de exquisifo presicion
Peconocen secuencios específicos en eI DMA de
dobIe heIice
Corfon ombos heIices en Iuqores concrefos
Procedencio
Enconfrodos en qron voriedod de procoriofos
Funcion bioIoqico desfruir moIecuIos de DMA exfroños
Los cenfros reconocibIes propios esfon mefiIodos
Peconocen secuencios específicos de 4-8 pores de boses
PoIíndromo
PoIobro o frose que se Iee iquoI de izquierdo o derecho,
que de derecho o izquierdo:Podor, oniIino, DoboIe orroz o
Io zorro eI obod
Enzimus utiIizudos en Iu tecnoIoqíu deI DNA recombinunte
EIiminor fosfofos ferminoIes de
exfremos b' o 3', o de ombos
Fosfofoso oIcoIino
EIiminor nucIeofidos deI exfremo b' de
un dúpIex poro exponer Ios exfremos
3' monohebro
ExonucIeoso deI bocferiofoqo
EIiminor residuos nucIeofídicos deI
exfremo 3' de uno hebro de DMA
ExonucIeoso III
Añodir coIos homopoIimericos oI qrupo
OH deI exfremo 3' de un dúpIex IineoI
Tronsferoso ferminoI
Añodir un qrupo fosfofo oI qrupo OH
deI exfremo b' de un poIinucIeofido
poro morcorIo o poro permifirIe Io
Iiqocion
PoIinucIeofido quinoso
Hocer uno copio de DMA o porfir de
uno moIecuIo de PMA
Tronscripfoso inverso
PeIIenor Ios huecos de DMA dúpIex
medionfe odicion escoIonodo de
nucIeofidos en eI exfremo 3'
DMA poIimeroso I
(E. CoIi)
Unir dos moIecuIos o froqmenfos DMA Iiqoso
Pomper DMA por secuencios
específicos
EndonucIeoso de resfriccion deI fipo
II
Funcion Enzimo(s)
Mos de 90 enzimos de resfriccion purificodos y corocferizodos
Mombre obreviofuro fres Iefros que se refiere oI orqonismo,
sequido de un número romono
EcoPI Escherichio coIi
HindIII HoemophiIus infIuenzoe
HoeIII HoemophiIus oeqypfius
Froqmenfos de resfriccion Froqmenfos de DMA qenerodos
por uno deferminodo enzimo de resfriccion
Mopo de resfriccion
Trofomienfo de uno moIecuIo de DMA con diferenfes
nucIeosos de resfriccion
Comporondo Ios fomoños de Ios froqmenfos de
resfriccion de uno reqion deferminodo
PefIe¡o Io disposicion de secuencios de nucIeofidos
específicos
Secuencius de reconocimiento puru uIqunus endonucIeusus de
restricción tipo II
FIechos: enIoces fosfodiesfer hidroIizodos por codo endonucIeoso
de resfriccion.
Asferiscos:Ios boses que esfon mefiIodos por Io correspondienfe
mefiIoso (si se conoce).
M represenfo cuoIquier bose.
EndonucIeusus de restricción tipo II
Cortun eI DNA en
secuencius de buses
puIindrómicus
Roturu de moIécuIus de DNA en fruqmentos reproducibIes
mediunte endonucIeusus de restricción
DNA cromosómico
Sifio de
rofuro
Sifio de
rofuro
Secuencio de
reconocimienfo
Exfremos cohesivos
Exfremos romos
Vecfor de
cIonocion
pIosmídico
corfodo
con EcoPI y
PvuII
Los enzimos de resfriccion soIo reconocen y corfon secuencios
específicos.
0eneron exfremos cohesivos (con monocodenos) o exfremos romos.
Lo rofuro deI DMA produce uno serie corocferísfico de froqmenfos, y
esfos se pueden Iiqor o ofros DMA, como eI vecfor de cIonocion corfodo
(pIosmido).
Lo reoccion de Iiqocion esfo fociIifodo por eI oporeomienfo de exfremos
cohesivos compIemenforios, y Ios froqmenfos de DMA con exfremos
choesivos diferenfes (no compIemenforios) no sueIen Iiqorse.
PoIiconector
PoIiconector sintético
Vecfor de cIonocion
pIosmídico corfodo con
EcoPI
Conector Froqmenfo de DMA sinfefico que confiene Io secuencio de
reconocimienfo poro uno endonucIeoso de resfriccion.
PoIiconector Froqmenfo sinfefico que confiene secuencios dionos
poro vorios endonucIeosos de resfriccion.
Sepurución de DNA de diferentes tumuños
EIecfroforesis en qeI
PoIiocriIomido froqmenfos menores de b00 pb
DiIuciones diIuidos oqoroso
EIecfroforesis en qeI de compo puIsonfe
VisuoIizocion
CoIoronfe bromuro de efidio
Morco¡e rodiocfivo (
3Z
P) onfes de eIecfroforesis
Froqmenfos de
DMA qrondes
Froqmenfos de
DMA pequeños
Tinción con bromuro de etidio
que emite fIuorescenciu cuundo
se iIuminu con Iuz uItruvioIetu
Secuenciución deI DNA
Deferminocion de Io secuencio exocfo de un ocido nucIeico
A. Moxom y W. 0iIber Por hidroIisis químico específico
Hebro de DMA morcodo en eI exfremo b' con
3Z
P
b'-
3Z
P-0CTAC0TA-3'
Rupturu en A:
3Z
P-SCT
3Z
P-SCTACST
Rupturu en S:
3Z
P-SCTAC
Rupturu en C:
3Z
P-S
3Z
P-SCTA
Rupturu en T:
3Z
P-SC
3Z
P-SCTACS
Auforodioqromo muesfro un con¡unfo de bondos sobre
eI cuoI se puede Iee direcfomenfe Io secuencio
Mefodo deI didesoxi de Sonqer Por inferrupcion confroIodo de Io
repIicocion
Se copio uno secuencio de DMA de uno hebro ufiIizondo Io
DMA poIimeroso I
Cebodor compIemenforio
Medio confiene
Los cuofro desoxirribonucIeofidos frifosfofo
(morcodos)
Los onoIoqos Z',3'-didesoxi corecen deI qrupo
hidroxiIo en 3' no se formo enIoce fosfodiesfer
Froqmenfos disfinfo Ionqifud con onoIoqos didesoxi
exfremo 3'
Secuenciución DNA método Sunqer
Hebru
cebudoru
Hebru
moIde
Cebodor
MoIde
Auforodioqromo deI
qeI de eIecfroforesis
Secuencio de Io
hebro
compIemenforio
Técnicus de Ius hueIIus de DNA
(DNA footprintinq)
Hibridución de ácidos nucIeicos
Northern y Southern
Especie I
MezcIo y
enfriomienfo
Especie Z
DúpIex híbrido
DúpIex de Io
Especie I
DúpIex de Io
Especie Z
I. Acidos nucIeicos seporodos de ocuerdo
con su fomoño, medionfe eIecfroforesis
en qeI de oqoroso
Z. Acidos nucIeicos fronsferidos o un
popeI de nifroceIuIoso por succion deI
fompon o froves deI qeI y deI popeI
3. Membrono con Ios oc. MucIeicos
hibridodos con Io sondo morcodo
4. PeveIodo medionfe mefodos de
defeccion específicos deI morco¡e
PMA o DMA
Morcodores de
fomoño
0eI de
oqoroso

CIonución de DNA
Cromosomu
eucuriótico
Vector de
cIonución
(pIásmido)
Roturu con
endonucIeusu
de restricción
Roturu con endonucIeusu
de restricción, sepurución
de Ios fruqmentos
Vector
recombinunte
Trunsformución
de Iu céIuIu
bucteriunu huésped
Propuqución ceIuIur
Tipos de vectores de cIonución utiIizudos en EcoIi
Hosfo
4b.000 pb
PepIicocion o modo
de pIosmido
CuoIquiero de Ios
mefodos onferiores,
dependiendo deI
fomoño deI froqmenfo
deI DMA inserfodo: Ios
froqmenfos Iorqos
necesifon eI
empoquefomienfo en
in vifro
Cosmidos,
consfruidos o
porfir de Ios
pIosmidos y de
qenes de
Hosfo
Z3.000 pb
PepIicocion deI foqo
Infeccion con foqos:
posferior oI
empoquefomienfo in
vifro deI vecfor
recombinonfe en
porfícuIos de foqo
8ocferiofoqo
Hosfo
Ib.000 pb
PepIicocion deI
pIosmido
Tronsformocion: Ios
ceIuIos se vueIven
compefenfes poro
incorporor eI pIosmido
recombinonfe: uno vez
fronsformodos, Ios
ceIuIos se seIeccionon
medionfe un morcodor
seIeccionobIe
PIosmidos:
modificodos por
fecnicos de
DMA
recombinonfe
Tomoño
deI
froqmenfo
de DMA
que se
puede
cIonor
Mefodo de
propoqocion
Mefodo de
infroduccion en
E.coIi
Tipo de
vecfor
PIásmidos MoIecuIos de DMA circuIor que se repIicon oporfe deI
cromosomo bocferiono
Tomoño enfre b.000 y 400.000 pores de bose
Trunsformución Proceso por eI cuoI se infroduce un pIosmido en Io
ceIuIo bocferiono.
Incubocion ceIuIos y pIosmidos o 0"C en soIucion de
CI
Z
Co.
Choque fermico (37-4b"C)
PIámido seIeccionubIe PIosmido que confenqo un qen que Io ceIuIo
huesped necesife poro crecer bo¡o cierfos condiciones.
EI qen es qeneroImenfe eI de resisfencio o un onfibiofico SoIo
oqueIIos ceIuIos que hoyon sido fronsformodos por eI pIosmido seron
resisfenfes oI onfibiofico y podro crecer en presencio deI mismo.
Curucterísticus importuntes de un vector de cIonución pIusmídico
Mecesifo un oriqen de repIicocion propoqor eI pIosmido
y monfenerIo o niveI de I0 o Z0 copios por ceIuIo.
0enes que confiere resisfencio o onfibioficos permife
Io seIeccion
Vorios secuencios únicos de reconocimienfos poro
diferenfes endonucIeosos de resfriccio n qeneror sifios
por donde se puede inserfor Ios secuencios foroneos de
DMA
Tomoño qIoboI pequeño fociIifo Io enfrodo deI pIosmido
en Io ceIuIo
AIqunos sifios de resfriccion imporfonfes
0enes de resisfencio o onfibioficos
EI oriqen de repIicocion (ori).
PIásmido pßR3ZZ
Pesisfencio o
Io ompiciIino
(omp
P
)
Oriqen
de repIicocion
(ori)
Pesisfencio o
Io fefrociIino
(fef
P
)
CIonución de un DNA foráneo en E coIi con pßR3ZZ
DMA foroneo
Tronsformocion de
ceIuIos de E. coIi
SeIeccion de Ios ceIuIos
fronsfromodos
Aqor supIemenfodo
con fefrocicIino
Todos Ios coIinios
que con fienen
pIosmidos
CoIinios con
pIosmidos
recombinonfes
CoIinios fronsferidos
poro eI ensoyo
Aqor supIemenfodo
con fefrocicIino
Aqor supIemenfodo con
fefrocicIino y ompiciIino
ßucteriófuqo
Permife cIonor seqmenfos de DMA mos Iorqos
Corocferíficos deI qenomo deI foqo:
AIrededor de un fercio deI qenomo no es
esencioI permife reempIozorIo por DMA
foroneo.
EI DMA se empoquefo en porfícuIos de foqo soIo
cuondo fenqo un fomoño enfre 40.000 y b0.000
pores de bose.
Empuquetumiento in vitro Cuondo Ios froqmenfos de DMA
foroneo de fomoño odecuodose hon Iiqodo o Ios froqmenfos deI
foqo DMA recombinonfe se empoquefo denfro de porfícuIo de
foqo oI oñodir exfrofo crudo de ceIuIos bocferionos( que confienen
fodos Ios profeínos necesorios poro ensombIor un foqo compIefo)
Cósmidos PIosmidos recombinonfes que combinon corocferísficos
úfiIes de pIosmidos y deI bocferiofoqo .
Permife Io cIonocion de froqmenfos mos Iorqos
MoIecuIos de DMA pequeños (b.000 o 7.000 pb)
Corocferísficos:
Oriqen de repIicocion pIosmídico
Uno o mos morcodores seIeccionobIes
Un número de sifios de resfriccion únicos donde se
puede inserfor eI DMA foroneo
Un sifio cos Uno secuencio de DMA deI bocferiofoqo
que se necesifo poro eI empoquefomienfo.
Mo confienen ninqún qen mos deI bocferiofoqo
Se propoqo en E. coIi como un pIosmido
Vectores de cIonución deI bucteriófuqo
DMA de reIIeno (no necesorio
en eI empoquefomienfo)
Froqmenfo de
DMA foroneo
Hon perdido DMA esencioI
y/o son demosiodo corfos y
no se empoquefon
Empoquefomienfo
in vifro
8ocferiofoqo que
confiene DMA foroneo
CIonución con cósmidos
0ron froqmenfo
de DMA foroneo
con exfremos
cohesivos
Cosmido
recombinonfe
SeIeccion de Ios ceIuIos
resisfenfes o cIoronfenicoI
Aqor confeniendo cIoronfenicoI
y subsfrofo poro -
qoIocfosidoso
CoIonios con cosmidos
recombinonfes (bIoncos)
Libreríu de DNA Uno coIeccion de Ios froqmenfos derivodos deI
qenomo de un orqonismo deferminodo inserfodo, uno por uno, en un
vecfor de cIonocion.
Pofuro deI DMA purificodo deI vecfor con uno enzimo de
resfriccion.
DMA qenomico o cIonor se reduce o froqmenfos de fomoño
opropiodo por uno enzimo de resfriccion (Io mismo que eI
vecfor).
Seporocion de froqmenfos (cenfrifuqocion isopícnico)
MezcIo de froqmenfos con eI vecfor Iineorizodo y Iiqocion.
Tronsformocion de ceIuIos bocferionos o empoquefomienfo
en porfícuIos de foqo.
ResuItudo qron pobIocion de bocferio o foqos, siendo codo
uno de eIIos porfodor de uno moIecuIo de DMA diferenfe.
Libreríu qenómicu Procficomenfe fodo eI DMA qenomico
esforo represenfodo en Io Iibrerío.
Libreríu de cDNA Librerío de DMA mos especioIizodo, soIo
incIuye oqueIIos qenes que esfon siendo expresodos en un orqonismo
deferminodo e incIuso cierfos fe¡idos o ceIuIos.
Se exfroe mPMA fofoI deI orqonismo
Se produce DNA compIementurio (cDMA) medionfe Io
fronscripfoso inverso.
Los froqmenfos de dobIe hebro se inserfon en un vecfor
odecuodo y se cIonon.
Libreríu de cDNA
EI mPMA moIde se hibrido o un
cebodor (oIiqo dT) sinfefico
Lo fronscripfoso inverso y Ios dMTP
producen Io codeno compIemenforio
Se deqrodo eI mPMA
con oIcoIi
DMA poIimeroso I y dMTP
don DMA de dobIe codeno
Identificución de un cIon con eI fruqmento de DNA deseudo
Se presiono con un popeI
de nifroceIuIoso sobre Io
pIoco de oqor
EI frofomienfo con oIcoIi rompe Ios
ceIuIos y expone eI DMA
desnofuroIizodoco de oqor
Sondo de DMA morcodo rodiocfivomenfe
Incubocion deI popeI con Io sondo
rodiocfivo y posferior Iovodo
Exposicion
deI popeI o
Io peIícuIo
de royos X
PIoco de oqor con coIonios de
bocferios fronsformodos
PopeI de nifroceIuIoso
DMA unido oI popeI
Sondo hibridodo con Ios
coIonios de inferes
AmpIificución de unu secuenciu de DNA específicu
Peoccion en codeno de Io poIimeroso (PCP)
Cebudores: Sínfesis de dos oIiqonucIeofidos
compIemenforios o uno uno secuencio corfo de uno codeno
deI seqmenfo de DMA deseodo.
DesnofuroIizocion deI seqmenfo deseodo seporocion
de Ios dos codenos por coIenfomienfo (9b"C)
Enfrior, oñodir Ios cebodores hibridon
Añodir DMA poIimeroso resisfenfe oI coIor ToqI
Añodir Ios cuofro desoxinucIeofidos frifosfofos
repIicocion seIecfivo deI seqmenfo de DMA cebodo.
Pepeficion deI proceso Zb o 30 cicIos ompIificocion
deI seqmenfo.
Suficienfemenfe sensibIe poro defecfor incIuso uno único moIecuIo
de DMA de cosi cuoIquier muesfro.
CIonor froqmenfos de DMA de momios
Pesfos de onimoIes exfinquidos como eI momuf Ionudo
Herromienfo en Io medicino forense
Defeccion de infecciones víricos onfes de que cousen
sínfomos
Dioqnosfico prenofoI de enfermedodes qenefico
AmpIificución de un fruqmento de DNA mediunte PCR
Peqion de DMA o
ompIificor
Despues de Zb cicIos Io secuencio diono
se ho ompIificodo uno I0
o
veces
CoIenfor poro seporor Ios codenos
Enfrior, oñodir Ios cebodores
oIiqonucIeofidos sinfeficos
Añodir Io DMA poIimeroso
fermoesfobIe poro cofoIizor Io
sínfesis de DMA en direccion b'3'
Pepefir Ios posos y
Lo sínfesis de DMA (poso ) esfo
cofoIizoso por Io poIimeroso
fermoesfobIe (fodovío presenfe)
Pepefir desde Ios
posos o
Nuevu urmu puru Iu medicinu forense
TrodicionoImenfe fomo de hueIIos docfiIores
Ahoro HueIIo docfiIor deI DMA o reqisfro o perfiI deI DMA
PoIimorfismo de secuencius pequeños diferencios secuencioIes
que se do enfre individuos uno vez codo pocos cienfos de pores de
boses de promedio.
PoIimorfismo en eI tumuño de Ios fruqmentos de restricción o
RFLP AIqunos combios de secuencios ofecfon o dionos de
resfriccion oriqinon diferencios en Ios fomoños de cierfos
froqmenfos de DMA diqeridos con un enzimo de resfriccion, en
individuos disfinfos.
Defeccion de PFLP por Southern bIottinq
Los secuencios de DMA qenomico usodos en esfe fesf son
reqiones que confienen DMA repefifivo, comunes en Ios qenomos
de eucoriofos.
EI número de unidodes de repeficion vorío de un individuo o ofro
(excepfo en qemeIos idenficos)
Usondo uno sondo opropiodo bondos disfinfos poro codo
individuo ensoyodo. Usondo vorios sondos fesf seIecfivo,
pudiendo indenfificor un individuo enfre fodo uno pobIocion.
Mecesifo muesfro fresco de DMA y moyor confidod de DMA deI
que hoy en Io esceno deI crimen.
Aumenfor Io sensibiIidod ocopIodo o Io PCP.
HueIIos docfiIores de DMA de:
Un peIo
Pequeño muesfro de semen
Muesfros de un mes e incIuso oños
UfiIidod en consfruir pruebos decisivos en fribunoIes de fodo eI
mundo
Método dde trunsferenciu Southern upIicudo u Iu
determinución de Iu hueIIu ductiIur de DNA
DMA cromosomico
(p.e¡. sospechoso I)
Pofuro con endonucIeosos
de resfriccion
Froqmenfos de DMA
Seporocion de Ios froqmenfos por
eIecfroforesis en qeI de oqoroso
(sin morcor)
Sondo morcodo
rodiocfivomenfe
DesnofuroIizor eI
DMA y fronsferir
o popeI de
nifroceIuIoso
Incubor con Io
sondo y posferior
Iovodo
Exponer eI popeI
o uno peIícuIo de
royos X
Productos de Iu tecnoIoqíu deI DNA recombinunte
E×presión de Ios qenes cIonudos
AIterución de Ios qenes cIonudos Mutuqénesis diriqidu
CIonución en pIuntus mediudus por purásito bucteriuno
CIonución en céIuIus unimuIes Terupiu qénicu
ImpIicuciones de estu tecnoIoqíu
E×presión de Ios qenes cIonudos:
Fin de cIonor un qen es obfener su producfo.
Profeínos de qron inferes poro proposifos comercioIes,
feropeuficos e invesfiqocion.
Vectores de e×presión Vecfores de cIonocion que confienen
Ios señoIes de fronscripcion y fronsduccion necesorios poro
requIor Io expresion de un qen cIonodo.
Mutuqénesis diriqidu:
AIferondo Io secuencio de DMA de un qen cIonodo codificonfe
poro uno profeíno se puede combior Io esfrucfuro de Io mismo.
UfiIizodo poro invesfiqocion de esfrucfuro (pIeqomienfo) y
funcion de profeínos.
Uso comercioI fobricor profeínos con ocfividod incremenfodo
o con funcionoIidod en ombienfes exfremos de oIfo femperofuro,
disoIvenfes orqonico o pH exfremos.
CIonución en pIuntus mediudu por purásitos bucteriunos:
Enorme pofencioI en oqricuIfuro cosechos mos producfivos y
obundonfes, resisfenfes o pIoqos de insecfos, enfermedodes, frío
y sequío.
Los pIonfos ferfiIes de oIqunos especies se qeneron o porfir de
uno único ceIuIo fronsformodo eI qen infroducido se fronsfiere
o qenerociones sucesivos
DificuIfod Mo se ho enconfrodo un pIosmido nofuroI en
pIonfos
Aqrobocferium fumefociens bocferio que invode o Io pIonfo
por Ios heridos
Productos de Iu tecnoIoqíu deI DNA recombinunte
CIonución en céIuIus unimuIes Terupiu qénicu
Tronsformocion de ceIuIos onimoIes imporfoncio poro eI
ovonce deI conocimienfo esfrucfuro y funcion qenomo onimoIes,
qenerocion de onimoIes con corocferes nuevos.
Mecesifo uno fuenfe de ceIuIos individuoIes cuIfivo ceIuIor.
Mefodos poro infroducir DMA en uno ceIuIo onimoI:
AsimiIución espontáneu Precipifocion deI DMA con
cIoruro de coIcio o eIectroporución (converfir Ios ceIuIos
fronsiforiomenfe permeobIe oI DMA por exposicion o
breves puIsos de voIfo¡e.
Microinyección Inyeccion direcfo deI DMA en eI núcIeo
de Io ceIuIo con oyudo de uno oqu¡o muy fino.
Vectores víricos Virus eucorioficos modificodos
infeqron o veces su DMA en eI cromosomo de Io ceIuIo
huesped.
ProbIemofico:
Insercion deI DMA foroneo en eI cromosomo en IocoIizociones
oI ozor.
Infeqrocion per¡udicioIes debido o que se producen en qenes
esencioIes, rompiendo su menso¡e.
Lo expresion de un qen infeqrodo depende de Io posicion de
infeqrocion Lo fronscripcion no es iquoI de efecfivo en
cuoIquier Iuqor deI qenomo.
EI fipo de ceIuIo o fronsformor:
Líneos qerminoIes Lo oIferocion se propoqo sucesivos
qenerociones
CeIuIos somoficos Lo oIferocion ofecforo únicomenfe oI
onimoI frofodo.
AnimuIes trunsqénicos Cuondo uno fronsformocion eficienfe, con
infeqrocion cromosomico, medionfe microinyeccion de DMA se reoIizo
en eI núcIeo de huevos de rofon ferfiIizodos.
CIonución en céIuIus de mumífero con vectores retrovíricos
0enomo refroviroI (PMA monohebro)
Lo fronscripfoso inverso convierfe
eI qenomo de PMA en DMA de dobIe
codeno
Los qenes víricos se reempIozon por
un qen foroneo
EI DMA recombinonfe se infroduce
en cuIfivos ceIuIores
Los copios de PMA de virus
recombinonfes se producen en
Ios ceIuIos que confienen un
virus coodyudonfe y se
empoquefon en porfícuIos
víricos
EI qenomo refrovírico con eI
qen foroneo se infeqro en eI
cromosomo de Io ceIuIo diono
Los porfícuIos víricos
recombinonfes infecfon uno
ceIuIo diono
Productos de Iu tecnoIoqíu deI DNA recombinunte
PIonfo de foboco que expreso eI
qen de Io Iuciferoso de Iuciernoqo
PIonfos de fomofe monipuIodos
qeneficomenfe poro ser
resisfenfes o oIqunos Iorvos de
insecfos
CIonocion en rofones. Pofon que se
Ie ho infroducido eI qen de Io
hormono de crecimienfo humono
Productos de Iu tecnoIoqíu deI DNA recombinunte
ImpIicuciones de estu tecnoIoqíu

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