UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA Instituto Politécnico de la Salud

Temas:
-Generalidades y características de Enterobacterias. -Pruebas bioquímicas Gram + y Gram ² -BLEE
Elaborado por: -Elena Manzanares -Faviola Martínez Carrera: Lic. Bioanálisis Clínico III año Managua , 24 de Julio de 2009

GENERALIDADES DE ENTEROBACTERIAS
Las Enterobacterias pueden vivir libres en la naturaleza y habitualmente forman parte de la Flora Normal del Colón Humano, en escaso porcentaje (mas del 98% de la flora intestinal son anaerobios de los géneros Bacteroides y Prevotella). Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente perianal), el tracto genital femenino y muy ocasionalmente, el tracto respiratorio superior de los individuos sanos. Las enterobacterias parecen en una mayor proporción en la flora de individuos hospitalizados, especialmente en aquellos que sufren enfermedades graves y debilitantes. Taxonómicamente las enterobacterias se le han definido mas de 25 géneros y 110 especies o grupos: sin embargo, las enterobacterias clínicamente significativas comprenden 20 a 25 especies. Entre ellas los géneros mas importaNtes son: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klepsiella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Pseudomona, Acinobacter y Yersinia, entre otras.

Las enterobacterias poseen 3 grupos de antígenos que se han usado para su clasificación: 1) flagelares ´Hµ que son termolábiles; 2) capsulares ´Kµ y 3) somáticos ´Oµ.
Factores de Patogenicidad: 1) Adhesinas, actividad presente en fimbrias, que se asocian con uropatogenicidad de E. coli y enteropatogenicidad para otros géneros de enterobacterias. También existen adhesinas afimbricas. 2) Pseudocápsula, que permite la adherencia a fómites, como sondas urinarias y catéteres. 3) Capsula, se asocia con mayor invasividad, particularmente en la Meningitis por E. coli. 4) Exotoxinas y exoenzimas: especificas para cada género y especie. 5) Endotóxinas, representada por LPS. Puede provocar el Shock endotoxico. 6) Sideróforos. 7) Plásmidos, permiten la transferencia de factores de patogenicidad y genes que otorguen resistencia antibiótica a otras bacterias.

CARACTERISTICAS DE ENTEROBACTERIAS
- Son bacilos gram (-) dotados por flagelos peritricos o carentes de motilidad.
-Crecen sobre peptonas o medios con extracto de carne sin adición de

cloruro de sodio ni otros suplementos, crecen bien en Agar MacConkey, ASC, Ach.
-No forman esporas, Son oxidasa (-), son catalasa (+), reducen los

nitratos, fermentan la glucosa en vez de oxidarla con producción de gas o sin la misma y son aerobios o anaerobios facultativos.
- Crecen a temperaturas de 30-37 grados C excepto Salmonella y

Shigella y Ph de 7.2 a 7.5

colonias no viscosas. con frecuencia motiles. . Fermentación lenta de lactosa Edwarsiella. Serratia. bacterias entéricas gram (-) Fermentación rápida de lactosa Escherichia coli: brillo metalico sobre medio diferencial: dotado de motilidad. habitualmente forman acido y gas a partir de glucosa. hidrólisis rápida de la urea (olor amoniacal). crecimiento mas viscoso. no motil. Enterobacter aerogenes: colonias elevadas. Especies de Salmonella: dotado de motilidad. Citrobacter. Erwinia. sin brillo metálico. Klepsiella pneumoniae: muy viscoso. No fermentación de lactosa Especies de Shigella: carentes de motilidad. aplanadas. crecimiento mucoide. Providencia. Especies de Proteus: swarming sobre agar. no forman gas a partir de glucosa. Especies de Pseudomonas: pigmentos solubles. fluorescencia azul-verdoza. Arizona.Características en el crecimiento Identificación presuntiva rápida. olr a taml pisque o a uva.

Pruebas Bioquímicas de las Enterobacterias Reacción bioquímica por enterobacterias comunes de importancia clínica Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Morganella Proteus Providencia Salmonella Serratia Shigella TSI HS 2 K/A +/+ + +/+/+ + +/- A/A + +/+ + + + + +/- A/A + + +/+ +/+ - A/A +/+ +/+ K/A + + + + + + - K/A + +/+ + +/+/+/+ + - K/A +/+ + + + +/+ - K/A +/+/+ + + +/+ +/- K/A +/+ + + + + + - K/A +/+/+ - Gas Lisina Fenilalanina Motilidad Indol Ornitina Citrato Malonato Ureasa VP Glucosa Arginina + - + - .

. ribosa. -Algunas seudomonas (aeruginosa) producen pigmentos difusibles en el medio de cultivo: a)piocianina(azul) b)Fluoroceina (amarilla) c)Pioverdina (verde) d)Piorrubina (roja-parda) e)Piomelanina (marron o negro) TSI :K/K LIA: K/Ac Crecimiento a 42 grados.Aerobios obligados. lactosa .Poseen flagelos polares.Citocromo-Oxidasa (+). . gluconalo).Algunas cepas son mucoides (capsula polisacárido) en pacientes con fibrosis quistica.Son gram (-). catalasa +. .5-1) .No producen fragmentacion. .Pseudomona auroginosa .Emplean pocos hidratos de carbono (glucosa. ..rectos o ligeramente curvos(0. mediante metabolismo oxidativo.

FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BACTERIOLOGICAS PARA IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: MUESTRA (medio de trasporte STUART) sembrar en: ASC/McK Observar caracteristicas morfologicas del crecimiento.UREA.MIO. Malonato.Citrato.*MIO. VP/RM y anibiograma . VP/RMy y antibiograma TSI. *LIA. sospechamos de Gram negativo Fermentador LAC+ No Fermentador LAC- Pruebas bioquimicas: *TSI. Malonato. LIA.Citrato. UREA.

¢ A/As indica que es fer entador de glucosa. sulfhídrico y de gas. hay producción de acido sulfihidrico.0 Citrato férrico a ónico 0. Incorporado en un medio de crecimiento básico. Extracto de carne 3.03 : indicador. si se observa ennegreci iento del hay producción de acido sulfhídrico   ¢ ¢   ¢ ¢   ¢ ¢ ¢   ¢ ¡ ¡ ¢ . 1 2 3 Fer entador glucosa. sulfhídrico (precipitado negro) edio.5 : fuente de azufre. sulfhídrico LC.5 Extracto de levadura 3. Alk o K : alcalinidad G: productora de gas edio Ak/Ac con o sin gas.0 Lactosa 10.0 Glucosa 1. lactosa y sacarosa. Junto con la determinación de posible producción de acido sulfhidrico H2S. es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono especifico.0 Cloruro sódico 5. lo que significa que sola ente hay fer entación de glucosa. si vira a rosáceo . productor ác. es un medio sólido y diferencial.El agar Hierro Tres Azucares (TSI).0 Tiosulfato sódico 0. de la fer entación) Interpretación: NC o SC: no ca bio o sin ca bio H2S o subíndice s: si produce ác.0 Peptona 20. lactosa y sacarosa. Si ade ás se observa ennegreci iento del edio. indica basicidad del acidificación (derivada de ác. si es a arillo indica Rojo de fenol 0. con producción o no de gas. El fundamento se basa en la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa Interpretación del TSI: Interpretación del TSI: TSI El agar Hierro Tres Azucares (TSI). las bacterias lo reducen produciendo ác. productor de gas. Fer entador glucosa.

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al activarse la desaminasa. sulfhídrico. Si es productora de ác. sulfhídrico. No utilización de la lisina: El color amarillo del fondo del tubo se debe exclusivamente a la utilización de la glucosa. . Junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico (H2S) y la capacidad enzimática para desminar en ambiente aerobio el aminoácido formando un complejo de color anaranjado que al combinarse con el púrpura del medio da un color rojo en la parte inclinada del tubo. el . al activarse la lisina s descarboxilasa en un pH acido.Este medio pone de manifiesto:descarboxilasa (LDC). El PH alcalino . cuando la lisina se descarboxila. Cualquier cambio de color en el fondo después de la producción de acido es una prueba positiva.Si es productora de ác. El fondo del tubo permanece acido (amarillo) por fermentación de la glucosa. .Si es productora de la sulfhídrico. Con consiguiente alcalinidad.Desaminación de la lisina (R/A): El inclinado del tubo se torna inicialmente alcalino por la utilización oxidativa de las peptonas.Si es productora de gas. . el color del medio se torna rojo.Si la bacteria posee la enzima .Si es productora de gas.Si la bacteria posee ác. . .enzima descarboxilasa (LDC). LIA Principio: Medir la capacidad enzimática de un microorganismo para descarboxilar un aminoácido en ambiente anaerobio para formar una amina. el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol. cuando la lisina se descarboxila.Si es productora de gas. en cuyo caso el precipitado es negro. .Descarbosilacion de la lisina (K/K o K/N) Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC) el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol. en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -. el indicador vira a purpura o conserva el color sin inocular. el medio contiene como indicador si es LDCdeo -. Este medio pone de manifiesto: . el . en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver Purpura + Bromocresol.

3. + ó -. -. R . R .  ¤  § ¥ ¤§  ©¨ §¦ ¥¤£   ©¨ § ¥ ¤§  ¥¤£ ©    § ¥ ¤§  ©¨ §¦ ¥¤£ . . -. 1. R U R U U R R Y E . .

sirve para determinar la movilidad. Movilidad: Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Por lo tanto. Producción de Indol: Si la bacteria posee la enzima triptofanasa. el aminoácido triptófano será degradado en varios productos entre los cuales esta el indol.MIO Principio: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos. un producto con Ph alcalino. Descarboxilacion de la Ornitina: Detecta la presencia de la enzima descarboxilasa de la ornitina. . descarboxilación de la ornitina y producción de Indol. Sin la presencia de la enzima y ausencia del indol. o Erlich con un color rosado intenso. el cual se hace visible al agregarle el reactivo Kovac (para dimetilaminobenzaldehido). que de estar presente desdobla la ornitina en putrescina. lo que hace intensificar el color violeta el medio. el reactivo se transparente. Este medo ayuda a diferenciar las bacterias móviles de las no móviles. así como los enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa.

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este se tornará azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradación del fosfato amónico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul. fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador. . El medio contiene citrato sódico.CITRATO Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno.

por lo que. .MALONATO Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente de carbono y la desanimación de la fenilalanina. Las enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente. en forma combinada. o se observa la utilización del malonato o la desanimación de la lisina. por lo que es posible reacciones de malonato y fenilalanina desaminasa negativas. Las bacterias que no utlizan el malonato no poseen la enzima fenilalanina desaminasa.

. Interpretación: 1-Reaccion Positiva: Rojo o rosado intenso o rosado chicha o rosado cíclame. 2.UREA Principio: Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la UREA formando 2 moléculas de amoniaco por acción de la enzima UREASA.Reacción Negativa: No se produce cambio de color es decir el medio conserva su color original de amarillo pálido o el amarillo es un poco mas intenso.

a partir de la fermentación de la glucosa.5ml. el acetilmetilcarbino (acetoina). Utilización de los reactivos: 1. Dejar descansar el tubo por lo menos 15 minutos (15-30minutos) . RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. d. 0. 3.2ml de una solucion de KOH al 40% (2gotas). 0. 2. Interpretando el resultado inmediatamente. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosferico a fin de oxidar la acetona y obtener una reaccion de color.6 ml de una solucion de alfa naftol (6gotas) b.Dividir asepticamente el medio VP/RM en dos porciones iguales de 1.Agregar al otro tubo: a.Agregar a un tubo 5 gotas de rojo de metilo.VOGES-PROSKAUER/ROJO DE METILO Principio: VP: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro. c.

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. Así mismo. el reactivo mas usado es el reactivo de kovacs oxidasa. ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. en algún microaerófilo (Vibrio fetus). este se oxida para producir un compuesto colorido llamado indofenol. la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa. algunos anaerobios facultativos y. el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios. pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.PRUEBA DE LA OXIDASA Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. que es una solución de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%. Durante al prueba la enzima oxidasa en presencia de oxigeno. excepcionalmente. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general. citrocromo C y el reactivo de la oxidasa.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod). pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso. . También se usa en algunos casos para diferenciar género y especie de otras bacterias.LA PRUEBA SE USA SOBRE TODO PARA Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.LA PRUEBA SE REALIZA: 1. Método indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. . mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Observar los cambios de color. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. 2. No inundar toda la placa y no invertirla. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos(UN COLOR VIOLETA). Método en placa directa Realización de la prueba: Método en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias.

Los estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a los antígenos de superficie (Figura 4). beta. el cuál se enfatiza aquí. la hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis completamente claro y la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. Estos grupos incluyen una o más especies. Dentro del genero las especies de importancia clínica: S. Después del crecimiento de estreptococos en agar con sangre de oveja se observan tres tipos de reacción de hemólisis (alfa. epidermidis. coagulasa+. Las agrupaciones de estreptococos más importantes son A. B. se agrupan en racimos. Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre las causas de caries dental) no pertenecen a grupos antigénicos. Entre los grupos de estreptococos. Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de pulmonía humana).saprophyticus y s. S. Micrococcus. . gamma). mientras que D es generalmente alfa o gamma. la enfermedad contagiosa (especificamente faringitis) es causada por el grupo A. Por lo tanto la reacción de hemólisis es importante para la clasificación de los estreptococos. Los estreptococos son organismos anaerobios facultativos y Gram Positivos que a menudo aparecen formando cadenas o por pares y son catalasa-negativa (los estafilococos son catalasa positivos). El genero Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo. La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la liberación de un producto de degradación de la hemoglobina llamado bili-verdina).aureus. Los estreptococos del grupo A y B son beta hemolíticos. PLanococcus y Stomacoccus) y los generos Streptococcus y Enterococcus.GRAM POSITIVOS Los cocos Gram positivos aerobios y anaerobios facultativos que están constituidos por la familia Micrococaecceae (genero Staphylococcus. catalasa+. Los Streptococcus pneumoniae y viridans ("verde") son alfa-hemolíticos. y D. La reacción de hemólisis junto con otra de las características fisiológicas es suficiente para una identificación clínica presuntiva.

Flujograma de las bacterias GRAM positivas .

ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: . esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: · Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). · Bacillus (+) de Clostridium (-). La principal excepción es Streptococcus. con las excepciones de C.haemolyticum. · Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+.pyogenes y C. Originariamente.Prueba de catalasa Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo.

· Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). · Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.1. · Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Método del portaobjetos (recomendado): · Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. . · Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Método del tubo de ensayo: · Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. · Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).2. .

. Algunos microbiólogos establecen que al coagulación del plasma ocurre en 2 etapas: Hay una reacción entre la enzima producida por la bacteria. con un factor o activador presente en el plasma para producir la coagulasa. La coagulasa real del plasma es activada por la coagulasa. resiste temperaturas arriba de 60C por 30 minutos.PRUEBA DE LA COAGULASA La prueba de la coagulasa es usada específicamente para diferenciar las especies del genero staphylococccus: La coagulasa es una enzima producida por S. aures. es relativamente estable al calor. una porción coagulasa.

Ponga una gota de la suspensión y una gota de plasma humano o de conejo sobre un portaobjetos.Tecnica en portaobjeto Prepare una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en una solución salina estéril. La prueba negativa si la aglutinación no ocurre dentro de 3-4 minutos. . Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva IN ERPRETACION: Una prueba positiva. mezclar suavemente con el asa y después por rotación. usualmente ocurre entre 5-20 segundos.

inclínelo suavemente para ver el coagulo. .Tecnica en tubo En un tubo de 13 x 100 esteril mezclar 0. Incubar a 35 grados C de 4-6 horas. PRECAUCIÓN: cuando este checando no sacude el tubo. si este no es visible al final de las 6 horas.5 ml de plasma humano o de conejo y una asada grande de la bacteria aprobar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. observe cada 30 minutos. déjelo en la incubadora por 24 hrs.

Lectura e interpretación: Una imagen similar a un apunta de flecha. .CAMP TEST Fundamento: determina la capacidad de un microorganismo de producir factor CAMP. Incubar a 35 grados por 4 horas. perpendicularmente al inoculo y sin tocarlo. trace una estria del Streptococcus beta hemolítico en estudio. el cual es un factor extracelular poducida por los Streptococos del grupo B que intensifica la lisis de los globulos rojos producida por la B lisina estafilocócica Procedimiento: con una cepa de Staphylococcus aureus conocida. haga una estria recta en un plato ASC. indica reacción positiva.

. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido. que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.Tinción Zielh Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica. un patólogo. Franz Ziehl (1859 to 1926). marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. tuberculosis y M. un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894). Las micobacterias como M. después de la tinción con colorantes básicos. La tinición fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes.

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esto es que pierden el colorante primario. Es elprocedimiento diferencial más comúnmente usado para el examen directo de gran variedad de génerosbacterianos. Divide a las bacterias en dos grupos: Microorganismos grampositivos que retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul oscuro o púrpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser decolorados.TINCION DE GRAM La tinción de Gram es la prueba más simple utilizada en el laboratorio de microbiología. . Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se mantiene hasta elmomento sin modificaciones sustanciales. Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y aparecen de color rojo o rosa.

Al mismo tiempo que se hace la mezcla. 1. 1. Una vez que el frotis esté seco.PROCEDIMIENTO: 1.1. no se requiere la solución salina.2. . Dejar que el frotis se enfríe. Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de la lámina.4. 1. Para saber la temperatura adecuada coloque inmediatamente la lámina flameada sobre el dorso de una mano. Rotular la lámina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lámina cerciórese que con la rotulación le será posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra. PREPARACIÓN DEL FROTIS: 1. divida la lámina portaobjetos en su parte posterior en 6 y o más cuadrantes y coloque una pequeña gota de solución salina en cada uno de ellos. Si son varias muestras.6. Ponga la lámina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente. Las gotas pequeñas hacen que el secado sea rápido. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las bacterias grampositivas se observarían como gramnegativas. fijar la muestra pasándola rápidamente dos veces por encima de la flama del mechero. se dispersa en un área de aproximadamente 1cm por lado. la temperatura se debe tolerar sin hacer ningún esfuerzo de resistencia al calor. 1. 1.3. Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla con la gota de solución salina.5. En caso de muestras obtenidas de caldos. según la cantidad de muestras que teñirá. El grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura de letras pequeñas a través del frotis. En estos casos.

En lo relativo a la coloración.2 2.2. Aplicar 2 ó 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lámina de tal manera que se pueda observar la decolaración. Dejar secar a temperatura ambiente. Cubrir el frotis ya fijado y frío con cristal violeta.8. dejando resbalar el agua con un chorro suave. Repita el numeral 2. empleando aceite de inmersión. Escurrir muy bien. 2. Repita el numeral 2. dejar el colorante por un minuto. 2. ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. 2.7. 2.9.2. Cubrir con lugol y dejar por un minuto. 2.10.1. Examinar en el microscopio con lente de inmersión. . 2.6.3. El tiempo adecuado es aquel en que las partes más gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo. Enjuagar.2 2.2 2. Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.5. Inmediatamente repita el numeral 2.4. TINCIÓN: 2.

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM: Cocos Bacilos Espirales .

como C. como C. aureus Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp. Tetradas: forma típica de Micrococcus sp Bacilos Gram-negativos Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae. c omo S. Coli Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma típica de Clostridium sp. como N. que puede ser Grampositivo o Gram negativo. perfringens. a menudo. pneumoniae. Acinetobacter puede ser pleomórfico. como V. como H. Gram-variable. influenzae Finos: forma típica de Listeria sp Curvados: forma usual de Vibrio sp. como E. Streptococcus grupo B Cocos Gram-positivos Racimos: forma típica de Staphylococcus sp. Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp. y a veces aparece como coco Gram-positivo. cholerae. C. como S. y Campylobacter sp.y. j Ramificados: forma típica de Actinomycetes Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp . meningitidis Gram - También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos. septicum Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp.Gram+ Cadenas: forma típica de Streptococcus sp.

Métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos Las BLEE son enzimas que son sintetizadas por los bacilos gramnegativos (enterobacterias y no fermentadores) e hidrolizan los antimicrobianos betalactámicos y por lo tanto. algunos de estos betalactámicos son resistentes a la hidrólisis: cefamicinas (cefoxitina. cefalosporinas (de primera. . segunda. meropenem y otros). cefotetan y otros) y carbapenems (imipenem. Dada su particular estructura química. tercera y cuarta generación) y monobactames. confieren resistencia a penicilinas.

La distancia recomendada debe ser entre 2 a 3 cm entre el centro de la cefalosporina y el centro del disco de AMC.1.CONFIRMACIÓN DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS ENTRE DOS DISCOS: Cuando la diferencia entre ceftacidima (o cefotaxima) y ceftacidima/ácido clavulánico (o cefotaxima/ ácido clavulánico) es >5mm se confirma la presencia de BLEE. menor inhibición de la BLEE. Por otro lado.2 Ceftriaxona (CRO)* 30 g o cefotaxima (CTX) 30 g 2. MÉTODO DEL ´HUEVOµ (DEFORMACIÓN) CON TRIPLE DISCO: 2. Amoxicilina con ácido clavulánico (AMC) 20/10 g Fundamentos fisiológicos del método: Para realizar el antibiograma se colocan en fila los tres discos anteriores teniendo cuidado de colocar el de amoxicilina/clavulánico en el centro de la fila.1 Ceftacidima (CAZ) 30 g 2. el mismo fenómeno de gradientes de concentración ocurre en los discos de las cefalosporinas puestos a los lados del disco de AMC: a mayor distancia del disco. menor concentración de clavulánico. menor concentración de la cefalosporina de tercera generación. La interacción de estos dos gradientes es la que determina la deformación del halo de inhibición (ver figura . Es decir.1.1. El efecto huevo se debe a que el inhibidor se difunde radialmente con gradientes de concentración decrecientes alrededor del disco de AMC.1. Es necesario realizar las dos pruebas para determinar si la las BLEE son ceftacidimazas.2.3. Las bacterias que se encuentran en la zona alrededor de este disco tendrán la BLEE inhibida hasta una distancia tal que el ácido clavulánico haya disminuido lo suficiente como para no seguir inhibiendo a la enzima.2.2. Discos a utilizar: 2.2. cefotaximasas o ambas. a mayor distancia del disco de AMC.

>3mm de incremento en el halo entre cefotaxima y cefotaxima/ácido clavulánico .CONTROL DE CALIDAD DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS: Escherichia coli ATCC 25922: <2mm de incremento en la zona de inhibición. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603: >5mm de incremento en el halo entre ceftacidima y ceftacidima/ácido clavulánico.

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GRACIAS POR SU ATENCION!!!!!!! .